ES2289344T3 - Uso de espectroscopia raman de numero de ondas elevado para la medicion de tejido. - Google Patents
Uso de espectroscopia raman de numero de ondas elevado para la medicion de tejido. Download PDFInfo
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Abstract
Instrumento para la medición de una señal Raman de tejido, comprendiendo el instrumento un láser, una unidad de detección de señales para la medición de la señal Raman, y una sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica comprende una o más fibras ópticas para dirigir luz láser sobre el tejido y para recoger luz que es dispersada por el tejido y guiar la luz recogida alejándola del tejido hacia la unidad de detección de señales, comprendiendo la fibra o fibras un núcleo, un revestimiento y opcionalmente un recubrimiento, y la fibra o fibras para recoger luz sustancialmente sin señal Raman en una o más partes de la región espectral de 2.500-3.700 cm- 1 , y donde la unidad de detección registra la señal Raman dispersada por el tejido en dicha región espectral, comprendiendo el instrumento además una unidad de análisis de señales, la cual analiza la señal Raman registrada en una o más partes de la región espectral de 2.500-3.700 cm- 1 , comprendiendo el análisis un algoritmoque da como resultado datos relativos a la composición molecular del tejido y/o la clase diagnóstica clínica a la cual pertenece el tejido.
Description
Uso de espectroscopia Raman de número de ondas
elevado para la medición de tejido.
Esta invención se refiere a un instrumento y al
uso del mismo para medir una señal Raman de un tejido,
comprendiendo un láser, una unidad de detección de señales, y una
sonda de fibra óptica.
La aterosclerosis en una causa importante de
muerte en muchas partes del mundo. En consecuencia, se han
desarrollado muchas técnicas para obtener información sobre la
placa que se desarrolla en los vasos sanguíneos. Las técnicas de
formación de imágenes tales como la angiografía, la formación de
imágenes por resonancia magnética, el ultrasonido intravascular, y
la tomografía de coherencia óptica proporcionan información con
respecto a la ubicación de una placa u obstrucción de vaso
sanguíneo y sobre la morfología o estructura interna de la placa.
No obstante, no permiten el análisis in vivo detallado de la
composición molecular de la placa. El conocimiento de la
composición molecular de una placa es importante por ejemplo para
determinar el riesgo de eventos cardíacos agudos. Se distinguen las
llamadas placa estable y placa vulnerable, donde se cree que la
placa vulnerable puede dar lugar a tales eventos agudos, a menudo
mortales. Un evento de dicho tipo es desencadenado por la ruptura
de la fina tapa fibrosa de la placa, poniendo los contenidos de la
reserva de lípidos de la placa en contacto con la corriente
sanguínea, provocando trombogénesis y oclusión de la arteria.
Los métodos basados en la fluorescencia han
demostrado que son capaces de distinguir entre pared arterial
normal y placa aterosclerótica in vitro. No obstante, los
espectros de fluorescencia son perturbados fácilmente por moléculas
que absorban luz en el tejido y en la sangre, limitando su
aplicabilidad.
De todos los métodos para obtener información
sobre la composición de la placa aterosclerótica y que puedan en
principio ser aplicados in vivo, la espectroscopia Raman
intravascular proporciona la información más detallada. En la
espectroscopia Raman, el desplazamiento de Stokes entre la luz que
es incidente sobre una muestra que es investigada y la luz que es
dispersada de manera no elástica por la muestra es expresado en
números de onda relativos (\Deltacm^{-1} = (1/\lambda_{en} -
1/\lambda_{dispersada})10^{-2} con \lambda (longitud de
onda) en metros). La región del número de ondas entre
aproximadamente 400 y 2.000 cm^{-1} del espectro Raman (la
llamada región de huella dactilar) es usada para obtener esta
información. Esta región del espectro contiene muchas bandas que
pueden ser discernidas y que individualmente y/o en combinaciones
pueden utilizarse para obtener información sobre la composición
molecular del tejido.
Los estudios en el campo de la aterosclerosis
son sólo relativos a la región de la huella dactilar, puesto que
esta región espectral es muy informativa para el análisis o
diagnóstico. Ejemplos de tales estudios se encuentran por ejemplo
en las publicaciones de H.P. Buschman, E.T. Marple, M.L. Wach, B.
Bennett, T.C. Schut, H.A. Bruining, A.V. Bruschke, A. van der Laarse
y G.J. Puppels, Anal. Chem. 72 (2.000),
3.771-3.775, el cual aborda la determinación in
vivo de la composición molecular de pared arterial mediante
espectroscopia Raman intravascular, usando una sonda de fibras
múltiples y midiendo en la región de 400-1.800
cm^{-1}; R.H. Clarke, E.B. Hanlon, J.M Isner, H. Brody, Appl.
Optics 26 (1.987), 3.175-3.177, el cual aborda la
espectroscopia Raman por láser de lesiones ateroscleróticas
calcificadas en tejido cardiovascular, también en la región de
huella dactilar, y J.F. Brennan, T.J. Romer, R.S. Lees, A.M.
Tercyak, J.R. Kramer, M.S. Feld, Circulation 96 (1.997),
99-105, el cual trata la determinación de la
composición de arterias coronarias humanas por espectroscopia Raman
en la región de la huella dactilar.
La aplicación in vivo de la
espectroscopia Raman en la mayoría de los casos requiere el uso de
un dispositivo de guía de luz flexible de diámetro pequeño. Éste
puede ser introducido por ejemplo en el lumen de una arteria. Debe
poder alcanzar e interrogar lugares con lesiones ateroscleróticas.
También puede ser usado en el canal de trabajo de un endoscopio o
dentro de una aguja de biopsia o fórceps de biopsia. La sonda de
fibra óptica (que comprende una o más fibras ópticas) debe guiar la
luz al tejido bajo investigación, recoger la luz que es difundida
por el tejido y transportar esta luz recogida alejándola del tejido
hacia un dispositivo de análisis de espectros.
Desafortunadamente, en la región espectral
400-2.000 cm^{-1}, los materiales de la fibra
óptica misma generan la señal Raman, resultando en un fondo de
señal fuerte. Además, el plegado de la fibra conduce a variaciones
en la cantidad de señal obtenida desde el núcleo, los materiales de
revestimiento y recubrimiento, complicando más la detección de
señales y el análisis de señales. Esto deteriora la
señal-ruido con la cual la señal Raman del tejido
puede ser detectada, y además por lo demás complica el análisis de
señales, y por lo tanto afecta negativamente la utilidad clínica.
Por lo tanto, es necesario usar filtros ópticos en o cerca del
extremo distal de la sonda de fibra óptica, la cual está en
contacto o en proximidad estrecha con el tejido, para suprimir
contribuciones de señal de fondo a la señal Raman del tejido
detectada. No obstante, esto necesita a su vez el uso de fibras
ópticas separadas para guiar la luz láser al tejido y para recoger
y guiar la luz difuminada alejándose del tejido. Asimismo, a menudo
necesita el uso de disposiciones de dirección de rayo o una lente o
lentes en el extremo distal de la sonda de fibra óptica para
obtener el solapamiento deseado entre el volumen de tejido iluminado
por la luz láser y el volumen de tejido del cual se puede recoger
la señal Raman. Las sondas de fibra óptica para la espectroscopia
Raman son por lo tanto complejas. Es difícil miniaturizar sondas de
fibra óptica para espectroscopia Raman y mantenerlas flexibles, lo
cual es necesario por ejemplo para uso intravascular y para uso en
el canal auxiliar de un endoscopio. La complejidad es también un
obstáculo para la producción de sondas de este tipo a un precio que
puedan ser usadas como artículos desechables en hospitales. Además,
la intensidad de señal de tejido en los 400-2.000
cm^{-1} es baja, necesitando tiempos de integración de señal
relativamente largos, los cuales pueden ser impracticables para uso
clínico. Todos los problemas y desventajas mencionados arriba
obstaculizan la implementación real de la espectroscopia Raman para
objetivos de diagnóstico clínico en general, y para uso
intravascular en particular.
La luz es guiada a través de la fibra óptica en
los llamados modos ligados. En estos modos ligados, el campo
electromagnético está situado principalmente en el núcleo de la
fibra óptica, con una parte pequeña extendiéndose al interior del
revestimiento. Los modos de orden inferior están más confinados al
núcleo que los modos de orden mayor.
La intensidad de la luz que es guiada por una
fibra óptica es atenuada. Esto es causado por absorción, por
difusión de luz (difusión de Rayleigh, difusión/reflexión en
irregularidades mayores o en lugares en los cuales el material de
fibra está dañado, y por pérdidas de micro y macroplegado.
La luz láser, que se pierde por eventos de
difusión abandona el núcleo de la fibra y pasa a través de las
capas del recubrimiento (y buffer o material que rodea a la
fibra óptica para protegerla). Las capas de recubrimiento y
buffer suelen estar hechas de silicona, o plástico o
material de polímero.
La US 5,293,872 enseña el uso de espectroscopia
Raman excitada por luz láser del infrarrojo cercano (N1 R) para
distinguir entre tejido arterial normal, placa aterosclerótica
calcificada y placa aterosclerótica fibrosa. Para mediciones in
vivo en la región 700-1.900 cm^{-1}, se
discute sobre el uso de un haz de fibras ópticas. Esto conducirá a
las mismas desventajas que se discuten arriba, por ejemplo con
respecto al ruido.
La US 5,194,913 reconoce el problema de fibras
ópticas múltiples, pero también señala que el uso de una única
fibra está prohibido por el hecho de que la señal Raman de fondo
generada en las fibras ópticas es intensa para todas salvo para las
fibras más cortas. Ésta expone un aparato de fibra óptica usando
dos fibras opuestas y usando filtros ópticos para reducir la emisión
Raman de fondo desde las fibras ópticas. Este documento está
relacionado con el problema de señales en fibra en general, y está
claro que la solución proporcionada por la US 5,194,913, es decir,
una configuración axial, no se puede usar fácilmente para
mediciones in vivo.
Una publicación de J.F. Aust, K.S. Booksh y M.L.
Myrick, Applied Spectroscopy 50 (1.996), 382-386
trata casos en los cuales la señal obtenida a partir de la muestra
es relativamente fuerte (polímero) o en los cuales se tomaron
medidas especiales, tales como el aumento del volumen de medición a
partir del cual se obtiene la señal Raman de muestra, para aumentar
la intensidad de señal de polímeros a niveles que sean mucho más
elevados que los que se obtendrían de un tejido biológico. Esta
publicación no trata la aplicabilidad del método a tejido, pero
enseña que para una buena señal, ha de usarse un tubo de teflón
especial de hasta 4 cm. sobre la punta de la sonda óptica, llenado
con el polímero, para obtener una buena señal. Tal método no suele
ser aplicable a tejido, en especial no en el caso de mediciones
in vivo.
Junto a la aterosclerosis, el cáncer es también
una importante cuestión de salud. Los mismos problemas que se
encuentran arriba se aplican para la determinación de células
tumorales por espectroscopia Raman vía fibras ópticas. La US
5,261,410 enseña a usar un haz de fibras y a medir en la región de
huella dactilar. Tal uso también conduce a una relación
señal-ruido que no es satisfactoria.
La EP 0573535 B1 expone sistemas y métodos para
diagnóstico y tratamiento espectroscópico que utilicen
espectroscopia molecular para diagnosticar con precisión la
condición de tejido. La espectroscopia Raman de infrarrojos y las
mediciones de la reflexión total atenuada infrarroja son realizadas
utilizando una fuente de radiación láser y un espectrómetro de
transformación Fourier. La información adquirida y analizada de
conformidad con la invención proporciona detalles precisos de la
composición bioquímica y la condición patológica. La EP 0573535 B1
se refiere en especial a métodos espectroscópicos vibracionales que
usan la reflexión total atenuada (RTA) infrarroja por transformada
de Fourier (FTIR) y la espectroscopia FT-Raman del
infrarrojo (IR) cercano. Estos métodos proporcionan información
extensa del nivel molecular sobre la patogénesis de la enfermedad.
Ambas de estas técnicas vibratorias son llevadas a cabo fácilmente
de manera remota usando sondas de fibra óptica. En particular, una
forma de realización preferida utiliza espectros
Raman-FT de arteria humana para distinguir tejido
normal y aterosclerótico.
La EP 0573535 B1 describe un ejemplo en el cual
con excitación de luz láser de 810 nm, preferiblemente pulsada, la
emisión de fluorescencia desde el tejido de arteria humana es
suficientemente débil para observar bandas Raman más rápidamente
con el sistema de espectrógrafo/CCD que con un sistema FT- Raman
excitado en 1.064 nm. Un método para eliminar la emisión de banda
ancha de los espectros mediante la computación de la diferencia de
dos espectros de emisión recogidos en frecuencias de excitación
levemente diferentes se empleó para aumentar la observación de las
bandas Raman. Este método se basa en las características de
estabilidad, linealidad, y ruido bajo del detector CCD. Los
resultados indican que los espectros NTR Raman de gran calidad
pueden ser recogidos en menos de un segundo con el sistema de
espectrógrafo/CCD y una sonda de fibra óptica, como se comparó con
30 minutos con el sistema FT-Raman en niveles de
potencia del láser similares, mejorando además el uso de la técnica
para aplicaciones clínicas in vivo. Se muestran los
espectros Raman en el intervalo de 0-2.000
cm^{-1}.
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A partir de lo de arriba está claro que hay una
necesidad de un instrumento para la medición de una señal Raman de
un tejido, que no tenga los problemas mencionados arriba.
La invención proporciona un instrumento, el uso
de un instrumento y un método de producción y medición de una señal
Raman de tejido según las reivindicaciones anexas.
La figura 1 muestra los resultados de un
experimento de mapeo Raman (figura 1A) en el cual fueron obtenidos
espectros Raman de una sección fina de tejido arterial en la región
de número de ondas más elevado, permitiendo la identificación de
áreas de tejido con diferente composición molecular, y los
espectros Raman correspondientes (figura 1B).
La figura 2 muestra espectros de lípidos y
proteínas que pueden estar presentes en la placa aterosclerótica y
la pared arterial: A: elastina, B: linoleato de colesteril, C:
oleato de colesteril, D: linolenato de colesteril, E: palmitato de
colesteril, F: colágeno tipo 1, G: trilinoleína, H: triolena, 1:
tripalmitina, J: colesterol.
La figura 3 proporciona una comparación de la
composición de lípidos de segmentos de arterias humanas como se
determinó por espectrografía Raman y HPTLC (cromatografía de capa
fina de alto rendimiento).
La figura 4 muestra los resultados de un
experimento de mapeo Raman en el cual fueron obtenidos espectros
Raman de una sección fina de dura humana, infiltrada por meningioma
(MG), en la región de número de ondas más elevado, permitiendo la
discriminación entre estos tejidos (figura 4A) y una sección
coloreada (figura 4B) por H y E (hematoxilina y eosina)
adyacente.
La figura 5 muestra los resultados de un
experimento de mapeo Raman (5A) en el cual se obtuvieron espectros
Raman de una sección fina de gliobastoma humano en la región de
número de ondas más elevado, permitiendo la identificación de áreas
de tumor vital (V) y de áreas de necrosis (N), cuando se compara
con la figura 5B, donde se muestra una sección coloreada por H y E
adyacente.
La figura 6 muestra esquemáticamente un sistema
para la obtención de espectros Raman en la región de números de
onda más elevado.
La figura 7 muestra un espectro (A) de una
mezcla de lípidos medido con un sistema Raman según la figura 6.
También se muestra el espectro de la sonda de fibra óptica misma
(B, obtenido sin una muestra presente en el extremo distal de la
fibra óptica) y un espectro de diferencia C
(A-B).
La figura 8 muestra espectros Raman (t) de una
pared arterial normal (A) y una pared arterial aterosclerótica (B),
de los resultados (f) de un ajuste de mínimos cuadrados de estos
espectros con el conjunto de espectros de compuestos purificados
mostrados en la figura 2 y de residuos (r) que representan la señal
contenida en los espectros del tejido que no es tenida en cuenta por
el conjunto de espectros de ajuste.
La figura 9 muestra esquemáticamente una forma
de realización en la cual la espectroscopia Raman está combinada
con fluorescencia y espectroscopia de absorción IRC.
La invención se refiere al uso de un instrumento
que comprende un láser, una unidad de detección de señales para la
medición de la señal Raman, y una sonda de fibra óptica, donde la
sonda de fibra óptica comprende una o más fibras ópticas para
dirigir la luz láser sobre el tejido y para recoger la luz que es
difundida por el tejido y guiar la luz recogida alejándola del
tejido hacia la unidad de detección de señales, comprendiendo la
fibra un núcleo, un revestimiento y opcionalmente un recubrimiento,
y teniendo la fibra o fibras para recoger luz sustancialmente
ninguna señal Raman en una o más partes de la región espectral
2.500-3.700 cm^{-1}, y donde la unidad de
detección registra la señal Raman difundida por el tejido en dicha
región espectral.
La ventaja de usar este aparato es que se
posibilita la rápida caracterización in vivo y ex
vivo de tejido, y tejido enfermo, por ejemplo placa
aterosclerótica, tumores, tejido precanceroso y lesiones tisulares
benignas con el espectrómetro Raman, y que se reduce el tiempo de
recogida de señales necesario para obtener un espectro Raman con
relación señal-ruido suficiente. Otra ventaja es
que, puesto que no se necesitan medios adicionales, como por
ejemplo filtros, que limiten el rendimiento espectral de las guías
de luz, las mediciones Raman pueden ser combinadas fácilmente con
otras técnicas informativas tales como mediciones de fluorescencia,
mediciones de absorción del infrarrojo cercano y técnicas de
formación óptica de imágenes, las cuales podrían usar las mismas
guías de luz, usando las guías de luz tanto para guiar la luz al
tejido como para recoger luz del tejido y guiarla de regreso a una
unidad de detección de fluorescencia o del infrarrojo cercano
respectivamente o usar guías de luz separadas para esto.
\newpage
La invención descrita aquí se basa en el
sorprendente descubrimiento que se podría obtener información muy
detallada sobre la composición y la heterogeneidad composicional de
una placa aterosclerótica, se podría distinguir tejido de tumor
cerebral de tejido cerebral normal y de tejido craneal, y el tejido
cerebral necrótico (tumor) podría distinguirse del tejido tumoral
vital mediante el registro y análisis de mapas espectrales Raman de
secciones transversales de tejido fino usando sólo la región
2.500-3.700 cm^{-1} de su espectro Raman.
Antes, se usaba la región de huella dactilar
Raman para detectar estos tipos de tejido (véase por ejemplo US
5,293,872; US 5,261,410; Anal. Chem. 72 (2.000),
3.771-3.775; Appl. Optics 26 (1.987),
3.175-3.177; Circulation 96 (1.997),
99-105), pero no se sabía ni se sugería que el
tejido mencionado arriba también tendría señales Raman
características y distintivas en esta región de número de ondas más
elevado. La selección de esta región tiene grandes ventajas. Para
mediciones en la región de huella dactilar del espectro Raman, es
necesario suprimir la intensidad de la luz láser difundida
elásticamente con filtros ópticos especiales que combinen una
atenuación profunda de la intensidad de la luz láser difundida
elásticamente con una transmisión elevada en longitudes de onda
cercanas a la longitud de onda del láser. No obstante, en la
presente invención existe un gran desplazamiento de longitud de onda
entre la luz láser incidente y la luz dispersada Raman en la región
de número de ondas elevado. Esto posibilita el uso de filtros de
absorción muy simples y económicos en la vía de detección de
señales para la supresión de la intensidad de luz láser difundida
elásticamente, tal como por ejemplo un filtro de vidrio de
color.
En general, la intensidad de la señal Raman de
tejido es significativamente mayor (en un factor de aproximadamente
5 o más) en esta región de número de ondas más elevado que en la
región de 400-2.000 cm^{-1} (huella dactilar),
permitiendo tiempos de recogida de señal reducidos, por ejemplo
también aproximadamente en un factor de aproximadamente 5 o más.
Otra ventaja de seleccionar esta región es que
esto permite el registro de señal Raman de tejido, usando una fibra
óptica única para iluminar el tejido y para recoger la señal Raman
del tejido, con la señal Raman de tejido siendo de intensidad
comparable o incluso intensidad más elevada que la de la señal de
fondo generada en la fibra óptica. Algunas fibras son muy adecuadas
para estos tipos de mediciones, puesto que la difusión Raman de la
fibra misma en esta región de longitud de onda es escasa o
insignificante comparada con la señal del tejido. Esto es diferente
de la región de huella dactilar donde en la misma configuración el
fondo de señal de la fibra óptica, en situaciones prácticas, usando
una fibra de varios metros de longitud, tiene una intensidad que
normalmente es más que un orden de magnitud mayor que la señal
Raman del tejido.
Además, la señal de fondo de algunos tipos de
fibra óptica en la región 2.500-3.700 cm^{-1} se
compone de sólo una señal de las cuales las variaciones de
intensidad como función del desplazamiento de número de ondas son
muy pequeñas comparadas con la de la señal Raman de tejido y, por lo
tanto, pueden distinguirse fácilmente de la señal Raman de tejido
y/o tenerse en cuenta en el análisis de señales.
Asimismo, la señal de fondo de algunos tipos de
fibra óptica en la región de 2.500-3.700 cm^{-1}
está compuesta de sólo una señal de la cual las variaciones de
intensidad como función de desplazamiento del número de ondas son
muy pequeñas comparadas con las de la señal Raman de tejido y, por
lo tanto, puede distinguirse fácilmente de la señal Raman de tejido
y/o tenerse en cuenta en el análisis de señales. En la región de
huella dactilar, la señal de fondo de la fibra tiene
características más agudas que hacen el análisis de la señal más
difícil. Por lo tanto, la relación señal a fondo en la región de
número de ondas de la invención es mucho mayor que en la región de
huella dactilar. Esto se debe al descubrimiento que la señal Raman
de la fibra está ausente o muy reducida en la región de número de
ondas más elevado del espectro Raman, mientras que en la región de
huella dactilar, como es usada en la técnica anterior, la fibra
también genera una señal Raman, perturbando o incluso superando la
señal Raman de tejido o muestra.
En especial, la región de
2.700-3.100 cm^{-1} del espectro Raman es
informativa para el tejido mencionado arriba. Por lo tanto, en una
forma de realización preferida de la invención, la unidad de
detección del instrumento registra la señal Raman en una o más
partes de la región espectral de 2.700- 3.100 cm^{-1}. Otra
ventaja es, por lo tanto, que ahora sólo una señal en una región de
número de ondas pequeño necesita ser registrada, permitiendo el uso
de un detector de luz multicanal con menos canales. Aunque la región
espectral de 2.700-3.100 cm^{-1} es especialmente
informativa para la detección, el análisis y el diagnóstico de
enfermedades en tejido, preferiblemente placa aterosclerótica y
tejido canceroso o precanceroso, la invención no excluye mediciones
fuera de las regiones espectrales mencionadas para obtener
información adicional. La invención también comprende en una forma
de realización la captación de señal Raman en otras regiones
espectrales (por ejemplo, la región de huella dactilar) además de
la región espectral de 2.700- 3.100 cm^{-1}.
Una ventaja del uso de la generación Raman y el
instrumento de detección es que la complejidad de los
espectrómetros Raman para la medición de muestras (en especial,
mediciones de tejido (in vivo)), la caracterización y/o
clasificación de tejido disminuye usando la región espectral de
número de ondas más elevado y seleccionando cuidadosamente las guías
de luz que sirven para guiar la luz láser al tejido, así como para
desviar la luz que es dispersada por el tejido. Por lo tanto, la
invención comprende el uso de un instrumento, donde la sonda de
fibra óptica comprende una fibra óptica que no sólo dirige la luz
láser sobre el tejido, sino que también capta la luz que es
dispersada por el tejido y guía la luz captada alejándola del tejido
hacia la unidad de detección de señales. Esta forma de realización
también comprende una sonda de fibra óptica con un número de fibras
que sirven para guiar la luz láser al tejido, así como para desviar
la luz que es dispersada por el tejido. Puesto que uno, un número,
o todas de tales fibras en la sonda pueden hacer esto, las
dimensiones de la sonda de fibra óptica pueden ser reducidas con
respecto a las sondas de fibra óptica del estado de la técnica para
la caracterización del tejido (las cuales comprenden diferentes
fibras para guiar la luz láser a la muestra y detectar la señal
Raman).
Otra ventaja es que el tamaño de un catéter
Raman para uso intravascular in vivo puede incluso ser
minimizado a una única fibra óptica. Esto significa que el diámetro
de, por ejemplo, la sonda de fibra óptica intravascular puede ser
reducido al máximo, y que se puede conseguir la flexibilidad máxima
de la sonda de fibra óptica, los cuales son también atributos muy
deseables de catéteres para uso intravascular. También para otras
aplicaciones, donde sean deseables sondas de fibra óptica pequeñas,
se puede usar el instrumento.
Una reducción importante de la complejidad y,
seguido a eso, una reducción del coste de producción de la fibra
óptica es otra ventaja. La fibra podría incluso usarse como
producto desechable, lo cual es muy deseable para un catéter
intravascular en uso clínico.
En otra forma de realización de la invención,
las mediciones Raman pueden ser combinadas con mediciones de la
fluorescencia y/o de la absorción del infrarrojo cercano. Por lo
tanto, la unidad de detección también comprenderá un detector para
la medición de la fluorescencia y/o un detector para la absorción
del infrarrojo cercano. En esta forma de realización, es por
ejemplo posible que las mediciones de la fluorescencia y/o de la
absorción del infrarrojo cercano usen una fibra también usada en la
obtención de señal Raman.
En otra forma de realización, se usa sólo una
única fibra óptica para dirigir la luz láser (y luz IR(C))
sobre el tejido, así como para captar señal Raman que es dispersada
por el tejido, para captar la fluorescencia y/o la señal del
infrarrojo cercano, y para desviar la luz captada desde el tejido
hacia la unidad de detección de señales, la cual comprende los
detectores respectivos.
En otra forma de realización, una pluralidad de
fibras pueden utilizarse para obtener una señal mejorada. Esta
forma de realización también comprende el uso de un instrumento en
el que mediciones Raman pueden ser combinadas con mediciones de la
fluorescencia y/o de la absorción del infrarrojo cercano, y en el
que la unidad de detección también comprende un detector para la
medición de la fluorescencia y/o un detector para la absorción del
infrarrojo cercano. En otra forma de realización, las dimensiones de
la sonda pueden reducirse más, cuando las mediciones de la
fluorescencia y/o de la absorción del infrarrojo cercano usan una
fibra también utilizada en la obtención de señal Raman. Aquí,
"una fibra" comprende una o más fibras. Tales haces de fibras
pueden usarse para la medición y/o escaneado de un área de tejido.
La ventaja es que las ubicaciones de la medición pueden estar más
juntas que en las sondas de fibra óptica del estado de la técnica,
aumentando la resolución.
El pequeño diámetro y la gran flexibilidad
proporcionan las mejores posibilidades para combinar la sonda Raman
con otras modalidades de detección (por ejemplo, ultrasonido
intravascular para uso intravascular, y la incorporación en un
endoscopio para aplicaciones oncológicas) y para la incorporación
en instrumentos para la obtención de muestras de tejido (tales como
un fórceps de biopsia o un instrumento para la obtención de
aspirados de aguja fina) o con modalidades de tratamiento (por
ejemplo, dispositivos que usan calor para coagular tejido, tales
como tejido tumoral, o instrumentos quirúrgicos). Por lo tanto, la
invención también comprende un instrumento en el que parte de la
fibra está integrada o combinada con un catéter que proporciona
información adicional sobre el tejido, o el cual comprende medios
para obtener muestras de tejido, medios para tratar tejido y/o
medios usados en procedimientos quirúrgicos.
Todos estas ventajas permiten una
instrumentación muy simplificada. El instrumento posibilita por lo
tanto el análisis y el diagnóstico ex vivo, in vitro e in
vivo de placa aterosclerótica y la detección de tejido tumoral
con grandes ventajas con respecto a la tecnología del estado de la
técnica actual.
En el contexto de esta invención, "tejido"
se refiere a tejido de origen humano, animal o vegetal, pero en
particular se entiende tejido humano o animal. Tejido incluye una
célula o células biológicas, un órgano, o parte de un cuerpo humano
o animal o una sustancia extraída de, o de una parte del cuerpo
humano o animal y puede ser, por ejemplo, hueso, sangre o cerebro.
Las muestras de tejido pueden ser medidas, es decir, las señales
Raman pueden ser medidas, las cuales son obtenidas por iluminación
con luz emitida por el láser, in vitro o in vivo. Se
considera que tejido pertenece a una clase diagnóstica clínica
particular si posee uno o más rasgos característicos, los cuales
pueden incluir pero no están limitados a características
morfológicas, químicas y genéticas. Éstas pueden ser típicas de una
cierta condición patológica.
La punta de la fibra puede estar en o sobre el
tejido, pero también puede estar en proximidad cercana, por
ejemplo, algunos mm. No obstante, la proximidad también puede ser
mayor, cuando se usa una lente para reflejar el extremo distal de
la fibra sobre el tejido. En algunos casos, la punta no puede estar
sobre la muestra, por ejemplo cuando la muestra es medida a través
de, por ejemplo, vidrio. En tal caso, la proximidad puede incluso
ser unos centímetros o más. Proximidad en esta invención comprende
las dos opciones mencionadas arriba.
El láser en esta invención es cualquier fuente
de luz monocromática con una anchura de línea suficientemente
estrecha para permitir la medición de la señal Raman deseada de una
muestra con resolución espectral suficiente, como un láser. La
anchura de línea en la mayoría de los casos está preferiblemente
por debajo de 5 cm^{-1}. El haz luminoso de tal fuente es
acoplado en una fibra, y la luz es emitida sobre una muestra. Una
señal Raman de tal muestra puede ser producida iluminándola con luz
de tal fuente láser, siempre que la muestra contenga moléculas que
tengan modos vibracionales moleculares que puedan participar en la
dispersión Raman de la luz incidente. Preferiblemente para
mediciones Raman de tejido, el láser o fuente tiene una emisión por
encima de aproximadamente 600 nm, puesto que de esta forma la
absorción de la luz láser incidente en tejido es minimizada y
también la autofluorescencia de tejido es minimizada. La
autofluorescencia puede causar una señal de fondo al espectro Raman
que deteriore la señal a ruido con la cual la señal Raman es
detectada. Ejemplos de fuentes son, por ejemplo, láseres de diodo,
láseres de He-Ne, láser de
Ti-zafiro, etc.
Con "instrumento" en la invención se
entiende un espectrómetro que comprende una combinación de un
láser, para producir una señal Raman, una fibra óptica y una unidad
de detección de señales.
El espectrómetro puede comprender un filtro para
suprimir la intensidad del componente de la luz que es guiada al
espectrómetro que tiene la misma longitud de onda que la luz láser.
Este filtro debería suprimir la intensidad de esta luz en
preferiblemente 8 órdenes de magnitud o más, mientras que se
suprime la intensidad de la luz dispersada Raman en la región de
número de ondas de interés en preferiblemente menos del 10%. Puesto
que se usa la región espectral de número de ondas más elevado,
implicando un intervalo de longitud de onda grande entre la luz
láser y la región de número de ondas de interés, esto puede ser un
simple filtro de absorción de cristal de color, tal como por
ejemplo el filtro de cristal de color RG 780 de Schott. Dos de tales
filtros en serie y de 3 mm. de grosor (ambos disponibles
comercialmente) suprimirán la luz láser por debajo de 725 nm en 10
órdenes de magnitud o más, mientras que no se causa una atenuación
importante de la señal Raman de interés distinta a las pérdidas de
reflexión en las interfaces de aire del cristal. Preferiblemente,
las caras de entrada y salida del filtro están recubiertas con un
recubrimiento antirreflexión optimizado para la región de longitud
de onda de interés, para minimizar las pérdidas de reflexión en las
interfaces de aire del cristal. De esta forma, se puede conseguir
fácilmente un rendimiento de señal Raman de más del 90%. El
espectrómetro preferiblemente no tiene partes móviles, está
optimizado para rendimiento en el IRC, y tiene una resolución de
preferiblemente al menos 8 cm^{-1}.
No obstante, en algunos casos se puede desear la
fluorescencia (ver arriba), como una fuente de información para la
caracterización del tejido y para medir simultánea o
secuencialmente, con una o con varias fibras la señal Raman y la
fluorescencia de la muestra. En tal forma de realización, la luz de
excitación de la fluorescencia puede tener longitudes de onda por
debajo de 600 nm, por ejemplo en el azul o UVA.
La unidad de detección de señales
preferiblemente comprende detectores como un detector CCD
multicanal optimizado para la detección de luz en el IRC. Un
ejemplo de tal detector es una cámara CCD retroiluminada de
depleción profunda (DU401-BRDD) de
Andor-technology (Belfast, Irlanda del Norte). La
región espectral de interés puede ser, por ejemplo, elegida mediante
una rejilla o prisma. Los espectros registrados son preferiblemente
visualizados y/o analizados mediante software especializado y un
ordenador personal en tiempo real.
En el contexto de esta invención, una fibra
óptica es definida como un dispositivo con un extremo proximal y un
extremo distal, la cual puede guiar luz desde el extremo proximal
al extremo distal. El término "una fibra" comprende una o más
fibras. El término "sonda de fibra óptica" comprende una fibra
óptica o un haz de fibras ópticas.
El extremo distal de la sonda de fibra puede
estar formado o montado con un componente microóptico fijado
físicamente a ella, para llegar a ciertas direcciones y/o ángulos
de iluminación y/o para llegar a ciertas direcciones y/o ángulos de
captación de luz y/o para determinar la superficie de la muestra que
es iluminada y/o para determinar el tamaño y/o ubicación del
volumen de la muestra del cual es detectada preferentemente la
señal Raman. En la técnica de medición de tejido con espectroscopia
Raman, estas sondas suelen contener una fibra para la excitación y
al menos una fibra, pero normalmente un número de fibras, para
guiar la señal (Raman) a un detector.
Las fibras ópticas están compuestas de un núcleo
y un revestimiento y normalmente una o más capas de recubrimiento
protector. Tal recubrimiento (que comprende uno o más
recubrimientos) puede variar ampliamente en grosor. La literatura
se refiere a la capa o capas protectoras que rodean el
revestimiento de una fibra óptica como "recubrimiento" o
"buffer". En el contexto de esta invención, se hace
referencia a todas las capas únicas o múltiples de material que
rodean el revestimiento de una fibra óptica como recubrimiento de
la fibra. A veces, se aplica una envoltura para añadir más
resistencia mecánica o para evitar el plegado demasiado tenso de la
fibra. Se define una envoltura como tubo rígido o flexible en el
cual es insertada la fibra (o fibras) óptica(s) y la cual
proporciona protección adicional de la fibra (o fibras).
Se descubrió que algunas fibras son muy
adecuadas para estos tipos de mediciones, puesto que la dispersión
Raman de la fibra misma en su región de longitud de onda es escasa
o insignificante comparada con la señal de la muestra. Por lo
tanto, el instrumento comprende una fibra que sustancialmente no
tiene señal Raman en la región espectral donde se encuentran señales
Raman.
En el contexto de la invención,
"sustancialmente" sin señal, y frases similares, significa que
dicha señal es de intensidad similar o menor que la señal de tejido
medida por el instrumento, y distinguible de la señal del tejido es
distinguible de otra señal. Por ejemplo, dicha señal está
sustancialmente ausente, o por ejemplo es de un orden de magnitud
menor.
Un ejemplo de una fibra preferida es una fibra
con un núcleo de sílice fundida y un revestimiento de sílice
fundida, como por ejemplo la fibra óptica WF200/220A de Ceramoptec
Industries Inc o la fibra FG-200-LCR
de 3M Company o fibras equivalentes. Algunas fibras son menos
preferidas, como por ejemplo la fibra óptica WF200/220N de
Ceramoptec Industries Inc o la fibra óptica
FT-200-EMR de 3M Company, que
parecen tener una señal de fondo grande en la región espectral de
interés.
Se obtienen buenos resultados con sondas de
fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica comprende al menos una
fibra con un núcleo de sílice fundida baja en OH. Tal fibra óptica
contiene cantidades muy pequeñas de OH, a través de lo cual se
minimiza la absorción de luz en la fibra en la región del
infrarrojo cercano del espectro, la cual es la región espectral
preferida para mediciones Raman de tejido. Esto puede por ejemplo
ser una sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica
comprende al menos una fibra óptica con un núcleo de sílice fundida
y un revestimiento de sílice fundida o teflón o TECS (los cuales
tienen transmisión elevada en el infrarrojo cercano), y donde las
contribuciones a la señal de fondo baja son obtenidas de un
recubrimiento, usando un material de recubrimiento en el cual es
generada intrínsecamente poca o sustancialmente ninguna señal en el
intervalo de número de ondas de 2.500-3.700
cm^{-1}, o aplicando medidas para minimizar la generación y/o la
detección de la señal del recubrimiento, o ambas.
En una forma de realización específica de la
invención, la invención se refiere a un instrumento según la
reivindicación 1 como está adjunta. Las fuentes de luz en una o más
partes de la región espectral de 2.500-3.700
cm^{-1} pueden ser la sonda de fibra óptica, por ejemplo el
núcleo, el revestimiento o el recubrimiento de la fibra de dicha
sonda de fibra óptica o de la(s) fibra(s)
óptica(s) de la misma. La frase "no mide la señal Raman"
significa que la unidad de detección no recibe dicha señal, o no
detecta dicha señal, o ambas.
En una variación en esta forma de realización,
la unidad de detección sustancialmente no mide la fluorescencia
generada por otras fuentes diferentes al tejido. Aquí, la
fluorescencia puede ser, por ejemplo, fluorescencia, por ejemplo
por el material del núcleo, revestimiento o recubrimiento.
Por ejemplo, se ha descubierto que el
recubrimiento de poliimida (por ejemplo, como se aplica en la fibra
SFS200/
210/233 RTF, vendida por Fiberguide Industries, Stirling, Nueva Jersey, EEUU) conduce a un fondo de fluorescencia fuerte, cuando se compara con la señal Raman que es obtenida de un tejido, cuando se usa una luz láser de 720 nm y una fibra óptica con una longitud de 2 m.
210/233 RTF, vendida por Fiberguide Industries, Stirling, Nueva Jersey, EEUU) conduce a un fondo de fluorescencia fuerte, cuando se compara con la señal Raman que es obtenida de un tejido, cuando se usa una luz láser de 720 nm y una fibra óptica con una longitud de 2 m.
Otro ejemplo es WF200/220 P (de Ceramoptec), que
es una fibra con un núcleo de sílice fundida, un revestimiento de
sílice fundida y un recubrimiento de poliimida y que también
muestra un fondo de fluorescencia fuerte. Por esta razón, las
fibras recubiertas de poliimida son menos adecuadas para esta
invención.
En una forma de realización, la característica
que la unidad de detección sustancialmente no mide señal Raman
generada por otras fuentes distintas al tejido puede por ejemplo
obtenerse usando una fibra o fibras para captar luz que
sustancialmente no tenga señal Raman en una o más partes de la
región espectral de 2.500-3.700 cm^{-1}. Ejemplos
de materiales del núcleo y el revestimiento adecuados son la sílice
fundida y diversas formas de sílice fundida dopada. Ejemplos de
materiales inadecuados son ZBLAN (por ejemplo, usado en los tipos
de fibra Z100FJ, Z100FV, Z120AI, vendidas por INO, Sainte- Foy,
Québec, Canadá), el cual muestra fluorescencia relativamente fuerte
cuando la luz láser roja o del infrarrojo cercano (por ejemplo, 720
nm) se desplaza a través de él, y fibras ópticas plásticas, tales
como aquellas hechas de PMMA (metacrilato de polimetilo) o
poliestireno, y otros que muestren una señal Raman fuerte en la
región de número de ondas elevado. Las fibras que están compuestas
de material del núcleo de sílice fundida y un revestimiento de
teflón (tales como las fibras tipo FLU vendidas por Polymicro,
Phoenix Arizona, EEUU) son adecuadas puesto que, como la sílice
fundida, el teflón no muestra señal Raman en la región de número de
ondas elevado. La fibra basada en zafiro es menos adecuada debido a
la contaminación de cromo que suele estar presente y la cual da
lugar a luminiscencia en la región del rojo y del infrarrojo
cercano del espectro. Tales fibras necesitan ser testadas para
determinar si la fluorescencia del material de la fibra es
suficientemente baja para permitir que se obtengan buenos espectros
Raman de tejidos.
Preferiblemente, el/los material(es) de
recubrimiento que son aplicados al revestimiento de la fibra óptica
no tienen señal Raman en la región de número de ondas elevado.
Ejemplos son formas de realización en las que el recubrimiento de la
fibra óptica comprende uno o más de recubrimientos de teflón y
recubrimientos de metal (tales como aluminio, cobre u oro). Las
fibras recubiertas de metal están disponibles comercialmente de,
por ejemplo, Fiberguide Industries (Stirling, Nueva Jersey, EEUU) y
Oxford Electronics (Four Marks, Reino Unido).
El uso de otros materiales de recubrimiento que
los mencionados arriba es posible pero por lo general requiere
medidas extra, para minimizar la intensidad de la señal Raman de
fondo que es generada en tales materiales de recubrimiento. Tales
medidas deben minimizar la cantidad de luz que deja a los modos de
fibra ligados introducirse y atravesar el material de recubrimiento,
donde la señal Raman del recubrimiento es generada y debe asegurar
que sólo la luz que emerge del núcleo de la fibra y dentro de la
apertura numérica de la fibra óptica alcanza el detector Raman. Por
lo tanto, en otra forma de realización, la característica que la
unidad de detección sustancialmente no mide señal Raman generada
por otras fuentes distintas al tejido puede por ejemplo obtenerse
usando una unidad de detección, donde la unidad de detección mide
sustancialmente sólo la señal obtenible del núcleo de la fibra
óptica.
Por ejemplo, esto se puede conseguir usando un
instrumento según la invención, donde la luz láser es acoplada en
la parte central del núcleo de la sonda óptica (sólo), y bajo una
apertura numérica que es tan pequeña como sea posible. De esta
manera, la luz láser es ligada principalmente en modos de bajo
orden de la fibra, los cuales son los que menos pérdidas tienen, y
por lo tanto conducen a la exposición mínima del material de
recubrimiento a luz láser y, en consecuencia, a la generación
mínima de señal Raman del recubrimiento.
En otra forma de realización, se usa un
instrumento donde la cara final de la fibra óptica, donde la luz
láser es acoplada en la fibra óptica, está pulida, para minimizar
las imperfecciones de la superficie, de tal forma que no queden
imperfecciones superficiales visibles microscópicamente. Esto se
puede conseguir mediante la aplicación de equipamiento de pulido de
fibras disponible comercialmente conocido de manera general. Esto
minimiza la dispersión de luz láser en la superficie de la cara
final de la fibra en direcciones en las cuales la luz láser no
puede ser guiada en un modo ligado, y de ese modo minimiza la
exposición del material de recubrimiento a luz láser.
En otra forma de realización, una medida es
aplicar una segunda capa de recubrimiento, donde la fibra comprende
un primer y un segundo recubrimiento, el primer recubrimiento como
recubrimiento sobre el revestimiento y el segundo recubrimiento
como recubrimiento sobre el primer recubrimiento, donde el segundo
recubrimiento comprende un material absorbente de luz láser. En aún
otra forma de realización, la invención se refiere a tal segundo
recubrimiento, donde la fibra comprende un primer y un segundo
recubrimiento, el primer recubrimiento como recubrimiento sobre el
revestimiento y el segundo recubrimiento como recubrimiento sobre el
primer recubrimiento, donde el segundo recubrimiento comprende un
material que tiene un índice refractivo mayor que el primer
material de recubrimiento, tal como una combinación de acrilato
como primera capa de recubrimiento y nailon negro como segunda capa
de recubrimiento (como se aplica en la fibra AS200/220/1RAN
producida por FiberTech, Berlín, Alemania). Esta medida suprime las
reflexiones múltiples de luz láser en la interfaz entre la primera
capa de recubrimiento y el aire. En su lugar, la luz entra
principalmente en la segunda capa de recubrimiento donde es
absorbida. Esto limita la longitud de la trayectoria de luz láser a
través del material de recubrimiento y de esta forma limita la
cantidad de señal Raman del recubrimiento que es generada.
Otra medida es tener cuidado en no someter la
fibra a plegado, en especial a plegado cercano al o por debajo del
radio del ángulo de plegado mínimo especificado por el fabricante.
El plegado provoca que se salga luz de los modos ligados, el cual
es un fenómeno muy conocido, pero para esta invención con el efecto
adverso adicional de la generación de señal Raman del
recubrimiento. Para conseguir el plegado mínimo de la fibra, ésta
puede ser insertada en un tubo rígido o flexible, por ejemplo,
monobobina de acero inoxidable (Fiberguide Industries, Sterling,
Nueva Jersey, EEUU), la cual limita mecánicamente el plegado. La
posibilidad de aplicar dicho tubo depende por supuesto de
restricciones potenciales dictadas por la aplicación de la
caracterización tisular particular.
La detección de señales es implementada de la
mejor forma de tal modo que la unidad de detección de señales
detecte sustancialmente señal, la cual emerge del núcleo de la
fibra óptica y bajo un ángulo que esté dentro de una apertura
numérica de la fibra. Esto se puede realizar mediante el llamado
filtrado espacial, en el cual es usado un sistema de formación de
imágenes para crear una imagen de la cara final de la fibra sobre
un diafragma, antes de que sea detectado. El tamaño del diafragma
debe ser más pequeño o igual al tamaño de la imagen del núcleo de
la fibra. De esta manera, sólo la luz que deje a la cara final de
la fibra a través del núcleo de la fibra será transmitida a través
del diafragma. Un segundo diafragma, el cual puede estar colocado
entre la cara final de la fibra y el primer elemento de formación de
imágenes, puede usarse para limitar la apertura numérica del
sistema de formación de imágenes a la apertura numérica de la fibra
óptica.
Una medida alternativa es aplicar una máscara
sobre la cara final de la fibra, la cual sólo deje el núcleo de la
fibra descubierto.
Una medida adicional es retirar el material de
recubrimiento cerca de la cara final de la fibra donde la luz láser
es acoplada en la fibra por una longitud de aproximadamente 5 mm. o
más, y para cubrir el revestimiento con epoxi negro (por ejemplo,
Epotek, Billerica, Massachussetts, EEUU). Esto absorberá cualquier
luz que se desplace en el recubrimiento de la fibra en la dirección
de la unidad de detección de señales, antes de que alcance la cara
final de la fibra. Por lo tanto, en una forma de realización, la
invención también se refiere a un instrumento y al uso del mismo,
donde la fibra óptica comprende un recubrimiento de la punta final
absorbente de luz láser, donde la punta final está dirigida hacia
la unidad de detección de señales.
En una forma de realización específica, la fibra
puede estar conectorizada (por ejemplo, con un conector FC) para
acoplar la fibra a la óptica de acoplamiento del láser y la óptica
de la detección de señales. Esto posibilita un intercambio sencillo
de fibras sin realineación del sistema. El intercambio sencillo de
fibras, así como el bajo coste, facilita la aplicación de sondas de
fibra óptica para la caracterización tisular espectroscópica Raman
de número de ondas elevado como producto desechable. Esto tiene la
ventaja que una sonda puede ser esterilizada y empaquetada sólo
para ser desempaquetada inmediatamente antes de la aplicación para
caracterización tisular. Después de la investigación, la sonda es
descartada, mediante lo cual se elimina cualquier riesgo de
reesterilización insuficiente antes de un siguiente uso.
Debido a la dispersión de Rayleigh de luz láser
en el material del núcleo y del revestimiento de la fibra óptica,
no se puede evitar por completo la exposición del material del
recubrimiento a luz láser. Los mecanismos descritos arriba,
mediante los cuales el material del recubrimiento es expuesto a luz
láser, también posibilitan que una fracción pequeña de la señal
Raman que es generada en el material de recubrimiento penetre en un
modo guiado de la fibra de nuevo, en dicho punto ya no es posible
evitar la detección de esta señal Raman de fondo de la fibra junto
con la señal Raman del tejido bajo investigación.
Por lo tanto, en general, es preferido el
material de recubrimiento en el cual no puede ser generada señal
Raman en la región de número de ondas elevado, tal como en las
fibras recubiertas de metal mencionadas arriba.
Con algunas o todas de las medidas adicionales,
las cuales se describieron arriba, se pueden usar en su lugar otros
materiales de recubrimiento. Por ejemplo, un instrumento donde el
recubrimiento de la fibra óptica comprende acrilato, Tefzel, TECS o
silicona. De esta manera, la señal Raman de fondo de la fibra en
fibras recubiertas de acrilato (tales como la fibra AS200/220/IRAN
producida por FiberTech, Berlín, Alemania, y la fibra AFS200/220 Y
vendida por Fiberguide Industries, Sterling, Nueva Jersey, EEUU)
podría reducirse por debajo del nivel de detectabilidad, usando un
láser que emita luz láser con una longitud de onda de 720 nm y 100
mW de potencia del láser, y un tiempo de captación de señal de
hasta 10 segundos.
Dicha potencia del láser y el tiempo de
captación de señal son suficientes para obtener espectros Raman de
número de ondas elevado de alta calidad de tejidos, cuando la señal
Raman emitida por la fibra óptica es acoplada en un espectrómetro
Raman con un 25% del rendimiento de la señal o mayor, el cual está
disponible comercialmente de varias compañías, y la cual emplea un
detector CCD de dispositivo acoplado por carga optimizada del
infrarrojo cercano para la detección de señal Raman (tal como una
cámara CCD de depleción profunda retroiluminada disponible de Andor
Technologies, Belfast, RU).
Otros ejemplos no limitativos de fibras
adecuadas son la FG-200-LCR (que es
una fibra con un núcleo de sílice fundida (200 micrones de
diámetro), un revestimiento de sílice fundida de 240 micrones de
diámetro, un recubrimiento de TECS de 260 micrones de diámetro y un
buffer de Tefzel de 400 micrones de diámetro), la
FT-200-EMT (también de 3M Company),
que es una fibra óptica con un revestimiento hecho de TECS, y la WF
200/240 A, que es una fibra de núcleo de sílice fundida/de
revestimiento de sílice fundida con un recubrimiento de acrilato
(de Ceramoptec).
La fibra recubierta de silicona es menos
preferible. Fueron testadas varias fibras recubiertas de silicona.
Aunque la señal de fondo de silicona puede ser reducida a un nivel
bajo, queda algo de señal de fondo de silicona. Esto puede limitar
la aplicabilidad en aplicaciones que dependan de diferencias muy
pequeñas en los espectros Raman de tejido. Ejemplos de fibras que
den lugar a señal de fondo desfavorable en el intervalo espectral
de 2.500-3.700 cm^{-1} son la WF 200/240 BN y la
WF200/240 BT, las cuales son fibras con un núcleo de sílice fundida
y un revestimiento de sílice fundida y un buffer de silicona
con un recubrimiento de nailon negro y de Tefzel negro
respectivamente (Ceramoptec).
Por lo tanto, según la invención, la provisión
de una fibra o fibras para la captación de luz que sustancialmente
no tenga señal Raman en una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1} puede realizarse con un
instrumento en el que la sonda de fibra óptica comprenda al menos
una fibra, o en el que la sonda de fibra óptica comprenda al menos
una fibra óptica con un núcleo de sílice fundida y un revestimiento
de sílice fundida o teflón o TECS, o usando un material de
recubrimiento en el que sea generada intrínsecamente poca o
sustancialmente ninguna señal en el intervalo de número de ondas de
2.500-3.700 cm^{-1}, o en el que el recubrimiento
de la fibra comprenda uno o más de recubrimientos de teflón y
recubrimientos de metal, o en el que la unidad de detección mida
sustancialmente sólo la señal obtenible del núcleo de la fibra
óptica, o en el que la fibra comprenda un primer y un segundo
recubrimiento, el primer recubrimiento como recubrimiento sobre el
revestimiento y el segundo recubrimiento como recubrimiento sobre
el primer recubrimiento, donde el segundo recubrimiento comprenda
un material absorbente de luz láser, o donde la fibra comprenda un
primer y un segundo recubrimiento, el primer recubrimiento como
recubrimiento sobre el revestimiento y el segundo recubrimiento
como recubrimiento sobre el primer recubrimiento, donde el segundo
recubrimiento comprende un material con un índice refractivo mayor
que el primer material de recubrimiento, o donde la fibra óptica
comprende un recubrimiento de la punta final absorbente de luz
láser, donde la fibra óptica comprende un recubrimiento de la punta
final absorbente de luz láser, o donde la cara final de la fibra
óptica, donde la luz láser es acoplada en la fibra óptica, está
pulida, o combinaciones de los mismos.
Es evidente que la fibra tiene también
transmisión suficiente para la luz láser y para la señal Raman de
interés. Una fibra preferida tiene una transmisión para las
longitudes de onda de la luz láser y la señal Raman de al menos el
50%, y más preferiblemente más del 90%. Para aumentar la
transmisión de la luz preferiblemente el extremo de la fibra
proximal donde la luz láser es acoplada en la fibra está recubierto
con un recubrimiento antirreflexión optimizado para regiones de
longitud de onda que comprendan la longitud de onda del láser y las
longitudes de onda en las que es medida la señal Raman.
La sonda de fibra óptica puede también
comprender un haz de fibras, donde las fibras no tengan un
recubrimiento. Las fibras pueden estar empaquetadas juntas en una
sonda de fibra óptica.
En otra forma de realización, el instrumento es
un instrumento que comprende un elemento óptico en el extremo
distal de la sonda de fibra óptica para fines de definición de la
ubicación y/o volumen de la muestra que está iluminado y/o del cual
es recogida la luz dispersada.
Con placa o placa aterosclerótica en esta
invención se entiende una condición patológica que comprende una
acumulación de materiales grasos en el revestimiento de una
arteria. Puede estar presente en cualquier arteria del cuerpo, de
la manera más frecuente en la arteria coronaria, las carótides, la
aorta, las arterias renales, y las arterias distales en las piernas.
La placa o placa aterosclerótica en y/o sobre tejido muestra una o
más señales Raman características en la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}. Tales señales Raman se
encuentran en especial en la región espectral entre 2.700 y 3.100
cm^{-1}.
En una forma de realización preferida, el
instrumento comprende una fibra que sustancialmente no tiene señal
Raman en la región espectral donde se encuentran señales Raman que
son características de la placa aterosclerótica. Tales señales
Raman se encuentran en especial en la región espectral entre 2.700 y
3.100 cm^{-1}. Esto también comprende un instrumento, donde la
fibra sustancialmente no tiene señal Raman en la región espectral
donde se encuentran señales Raman que son características de uno o
más del grupo de reservas de lípidos, tapón fibroso y/o la
presencia de macrófagos o colesterol en los mismos. Las posiciones
de las señales Raman de estos compuestos pueden ser derivadas por
un experto en la materia comparando espectros Raman de tejido que
esté sano y tejido que esté afectado y/o que contenga tales
compuestos. Con sustancialmente "ninguna señal Raman en una o más
partes de una región espectral" se quiere decir que la intensidad
de la señal de fondo detectada generada en la fibra es del mismo
orden de magnitud que la señal Raman de la muestra bajo
investigación, o menor, en al menos parte del intervalo espectral
en el cual se encuentra señal Raman caracterizadora, y que
la(s) señal(es) Raman de la muestra puede(n)
distinguirse fácilmente de esta señal de fondo. El instrumento puede
medir en la región espectral completa entre
2.500-3.700 cm^{-1}, preferiblemente 2.700 y
3.100 cm^{-1}, pero es también posible seleccionar parte o partes
de esta región espectral para mediciones y análisis y/o
diagnósticos.
En una forma de realización, el instrumento
tiene una fibra que sustancialmente no tiene señal Raman en la
región espectral donde se encuentran señales Raman que son
características de tejido canceroso o tejido precanceroso,
especialmente cáncer de cerebro. Tales señales Raman se encuentran
en la región espectral de 2.500-3.700 cm^{-1}, en
especial en la región espectral entre 2.700 y 3.100 cm^{-1}. Con
"tejido canceroso" se entiende tejido que comprende células
cancerosas. Tejido precanceroso ha de entenderse como tejido que es
anormal, el cual es un precursor de tejido canceroso.
Normalmente, para posibilitar el análisis rápido
y/o automático, el instrumento comprende además una unidad de
análisis de señales que analiza la señal Raman registrada. El
análisis comprende un algoritmo que da como resultado datos
relativos a, por ejemplo, la composición molecular de la muestra
y/o la clase diagnóstica clínica a la cual pertenece la muestra.
La determinación de la composición molecular de,
por ejemplo, pared vascular o placa aterosclerótica es realizada
mediante, por ejemplo, un procedimiento de ajuste de mínimos
cuadrados en el cual el espectro medido es ajustado con un conjunto
de espectros de compuestos, de los que se sabe que están presentes
potencialmente en la pared o placa vascular. Entonces, se obtiene
información cuantitativa relativa a la composición molecular a
partir de coeficientes de ajuste. De forma alternativa, se puede
desarrollar por ejemplo un algoritmo de mínimos cuadrados parciales
que determinará con precisión la composición molecular. Para la
detección de tejido canceroso, se pueden emplear diversos métodos
de análisis estadístico multivariado y/o de análisis de redes
neurales muy conocidos, tales como análisis discriminante lineal y
redes neurales artificiales. Estos métodos de análisis y/o de
diagnóstico son conocidos en la técnica, pero los parámetros
específicos serán adaptados al tejido o muestra respectivo bajo
investigación.
Tal instrumento, que comprende una unidad de
análisis de señales, es muy adecuado para el uso en el diagnóstico
de enfermedades, como la placa aterosclerótica y/o tejido canceroso
o tejido precanceroso. La unidad de análisis de señales puede
proporcionar información sobre la composición molecular de pared de
vaso sanguíneo normal y aterosclerótico, la clase diagnóstica
clínica de una lesión aterosclerótica, el grosor del tapón fibroso,
la presencia de macrófagos en el tapón fibroso, la presencia,
tamaño y/o composición de una reserva de lípidos, la presencia de
(ésteres de) colesterol, la presencia de tejido canceroso o
precanceroso, tumor vital o necrosis, y puede proporcionar señales
específicas para uno o más de cada.
La invención también se refiere al uso del
instrumento para la medición de una señal Raman de una muestra de
tejido antes de que sea resecada, o biopsada, o poco después de la
resección o biopsia, preferiblemente extirpada, biopsada o tomada
de un cuerpo humano o animal. En otro aspecto, se usa para
seleccionar tejido para la biopsia o resección.
En otro aspecto de la invención, comprende un
instrumento según la reivindicación 1 adjunta.
En una forma de realización, la sonda de fibra
óptica comprende una fibra óptica que dirige luz láser sobre el
tejido y capta luz que es dispersada por el tejido y guía esta luz
captada alejándola del tejido hacia la unidad de detección de
señales, y donde la fibra sustancialmente no tiene señal Raman en
una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}.
En otro aspecto de la invención, comprende un
método para la medición de una señal Raman de una muestra de
tejido, donde un instrumento según la invención se usa como según
la reivindicación 15 adjunta.
La invención también comprende un método para la
producción y la medición de una señal Raman, como según la
reivindicación 14 adjunta.
En otra forma de realización, la invención
también se refiere a un método para la producción y la medición de
una señal Raman de tejido, que comprenda la provisión de un láser,
una unidad de detección para la medición de una señal Raman, y una
sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica comprende una
o más fibras ópticas para dirigir luz láser sobre el tejido y para
recoger luz que es dispersada por el tejido y guiar la luz captada
alejándola del tejido hacia la unidad de detección de señales,
comprendiendo la fibra un núcleo, un revestimiento y opcionalmente
un recubrimiento, enviar luz láser a través de la una o más fibras
ópticas, recibir la señal Raman desde el tejido a través de la una
o más fibras ópticas y detectar la señal Raman mediante una unidad
de detección de señales, la fibra o fibras para recoger luz que
sustancialmente no tenga señal Raman en una o más partes de la
región espectral de 2.500-3.700 cm^{-1}, y donde
la unidad de detección de señales registra la señal Raman en dicha
región espectral. En una variación sobre esta forma de realización,
la invención se refiere a un método que además comprende el envío
de la luz láser a través de una misma fibra óptica, la cual también
recibe la señal Raman, usando una fibra óptica para este método que
sustancialmente no tenga señal Raman en una o más partes de la
región espectral de 2.500-3.700 cm^{-1}.
En una forma de realización específica, el
método mencionado arriba es un método para analizar tejido mediante
la medición de una señal Raman, comprendiendo el envío de luz láser
a través de un extremo de una fibra óptica, la introducción del
otro extremo de dicha fibra óptica, o la puesta en contacto con, o
en la proximidad cercana al tejido de interés, la recepción de la
señal Raman dispersada por la muestra a través de una fibra óptica
y la detección de la señal Raman por una unidad de detección de
señales, caracterizado por el envío de la luz láser a través de la
misma fibra óptica, la cual recibe también la señal Raman, y el uso
de una fibra óptica para este método que sustancialmente no tenga
señal Raman en una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}. Si es necesario, por ejemplo,
mejorar la relación señal a ruido, se realizan múltiples mediciones
Raman del tejido bajo investigación.
En el método de la invención, la señal de una
unidad de detección es enviada a una unidad de análisis de señales,
la cual analiza la señal Raman registrada, comprendiendo la unidad
de análisis un algoritmo que da como resultado datos relativos a la
composición molecular de la muestra y/o la clase diagnóstica
clínica a la cual pertenece la muestra.
Para analizar o hacer un diagnóstico, se pueden
usar diversos métodos para derivar información. Por ejemplo, la
invención comprende un método, donde antes de obtener mediciones
del área tisular de interés, se realizan mediciones de tejidos que
normalmente se encuentran en el área de interés. Pero aquella
también comprende un método en el que antes del escaneado del área
tisular de interés, se realizan mediciones de tejido o tejidos
afectados por la enfermedad específica que ha de ser detectada en
el área tisular de interés y en la misma región espectral o una
parte o partes de esta región. Por lo tanto, comprende un método
para la evaluación de la señal Raman obtenida de la región de
tejido de interés, para determinar si dicha señal Raman fue obtenida
de tejido normal o de tejido enfermo.
Un método para evaluar la idoneidad de un tipo
de fibra para la medición de la señal Raman de tejido
comprende:
- el uso de un instrumento según la
invención,
- la realización de una medición sin que esté
tejido presente en el extremo distal de la fibra,
- la realización de una medición con tejido
estando presente en el extremo distal de la fibra,
- la comparación de los espectros obtenidos con
y sin tejido estando presente
- la conclusión que la fibra es adecuada para la
medición de la señal Raman de tejido.
Una fibra es adecuada cuando la señal Raman del
tejido es distinguible de la señal Raman de la fibra (cuando dicha
señal Raman de la fibra está presente).
En un método para evaluar la idoneidad de un
tipo de fibra para la medición de la señal Raman del tejido, una
muestra de tejido es extirpada, biopsada o tomada de un cuerpo
humano o animal antes de la medición, y donde la señal Raman de la
fibra óptica es medida de la muestra y de un hueco, y donde las
señales Raman de la muestra y del hueco son comparadas.
El método de la invención puede ser usado para
el diagnóstico de tejido de pared de vaso sanguíneo humano o
animal, para el diagnóstico de tejido humano o animal sobre la
presencia de displasia, para la determinación de la composición
molecular de pared de vaso sanguíneo normal y aterosclerótico, para
la determinación de la clase diagnóstica clínica de una lesión
aterosclerótica, el grosor de tapón fibroso, la presencia de
macrófagos en el tapón fibroso, la presencia, tamaño y/o
composición de una reserva de lípidos, la presencia de (ésteres de)
colesterol, la presencia de tejido anómalo, canceroso o
precanceroso, tumor vital o necrosis.
El método de la invención también puede ser
usado para la evaluación del efecto de medicamentos, alimentos o
alimentos dietéticos, o terapia sobre tejido enfermo o sano.
El método de la invención y el instrumento de la
invención puede también ser usado para el diagnóstico de la piel, y
la clasificación de la piel, como la clasificación de la piel
objetivo. Existen diferencias importantes entre los espectros Raman
de número de ondas elevado de piel vieja, piel joven y piel
atópica. Estas diferencias son atribuibles a diferencias en las
concentraciones relativas de proteína, lípidos y agua. La
espectroscopia Raman de número de ondas elevado de la fibra óptica
posee por lo tanto el potencial para discriminar de manera objetiva
entre tipos de piel y o condiciones de piel diferentes. Esta
información es de valor para el desarrollo y testado controlado de
productos de cuidado personal y productos farmacéuticos aplicados
tópicamente, así como la selección optimizada del cliente o
paciente individual de tales productos, puesto que diferentes tipos
de piel pueden responder de manera diferente a tales productos o
pueden requerir diferentes formulaciones para obtener un efecto
deseado.
\newpage
En la invención, "luz que es dispersada por el
tejido" se refiere a la dispersión Raman por el tejido. Esto no
excluye que el tejido también muestre fluorescencia, debido a la
excitación de la luz láser.
Los resultados del uso del instrumento
generalmente no conducirán a un resultado que permita
inmediatamente que se tome una decisión y/o que se concluya un
diagnóstico. También el uso y el método de la invención no contiene
todos los pasos que se requieren para diagnosticar, y principalmente
o sólo proporcionarán resultados provisionales. Por lo tanto,
diagnóstico en esta invención puede significar análisis, el cual no
posibilite de manera inmediata un diagnóstico, o análisis, el cual
sí permita de manera inmediata dicho diagnóstico.
Este experimento describe las posibilidades de
espectroscopia Raman en la región espectral de la invención para
estudiar placa arterosclerótica.
La muestra de arteria coronaria humana usada
para crear el mapa Raman mostrado en la figura 1 fue obtenida en el
momento de la autopsia (menos de 24 horas post mórtem). Fue
congelada sobre placa fría en nieve carbónica
(snap-frozen) en nitrógeno líquido y
almacenada a -80º C hasta el uso. Para las mediciones Raman, una
criosección de 20 pm de grosor fue colocada sobre una ventana de
fluoruro de calcio (CaF_{2}) (Crystan RU) y calentada de manera
pasiva para alcanzar la temperatura ambiente. Después de las
mediciones Raman, fue coloreada con un procedimiento de coloreado
con hematoxilina y eosina estándar.
Para captar espectros Raman, se usó luz láser de
719 nm de un titanio con potencia reforzada por
argón-ion: sistema de láser de zafiro (Spectra
Physics, Mountain View, CA). El sistema de microespectrómetro Raman
que fue usado ha sido descrito con detalle en Van de Poli SWE,
Bakker Schut TC, Van der Laarse A, Puppels GJ "In Situ
Investigation of the Chemical Composition of Ceroid in Human
atherosclerosis by Raman Spectroscopy" J. Raman spectrosc.
33:544-551 (2.002). Un objetivo optimizado 80x IRC
(Olympus MIR-plan 80x/0'75, Japón) con una distancia
de trabajo de aproximadamente 1'6 mm. fue usado para focalizar la
luz láser sobre la sección arterial, y para recoger la luz que fue
dispersada por la muestra de tejido. Para el escaneado automático
de las secciones de tejido, el microscopio fue equipado con una
fase de muestra controlada por ordenador, motorizada. El área de
píxeles fue escaneada a través del foco del láser en ambas
direcciones laterales durante cada medición, para obtener un
espectro Raman medio del pixel entero. La adquisición de espectros
Raman y movimiento de fase microscópica fue controlada por el
software Grams/32 Spectral Notebase (Galactic Industries Corp.,
Salem, NH). La potencia del láser debajo del objetivo del
microscopio era aproximadamente 40 mW.
La ventana de CaF_{2} con el tejido fue
colocada debajo del microscopio. La fase de la muestra controlada
por ordenador fue movida por una rejilla bidimensional, y se
adquirieron espectros Raman con un tiempo de recogida de 1 segundo
por punto de rejilla.
La calibración del número de ondas de los
espectros fue llevada a cabo usando tres estándares de calibración
Raman conocidos (4-acetamidofenol, (Sigma),
naftaleno, ciclohexano (ICN Biochemicals)), y las líneas de emisión
de un neón y una lámpara de neón-argón. Los
espectros fueron corregidos para rayos cósmicos y corregidos para
la eficiencia de la detección de señales dependiente del número de
ondas del sistema usando una lámpara de cinta de tungsteno
calibrada de una temperatura conocida. Posteriormente, se sustrajo
la señal de fondo, originada a partir de los elementos ópticos en el
trayecto de entrega de la luz láser.
Para todo el procesamiento de datos, se usó
Matlab 6.1 versión R12 (Mathworks Inc., Natick, MA).
Se usó el análisis de componentes principales
(ACP) seguido del análisis de agrupamiento mediante
K-medias (KCA) para determinar la heterogeneidad en
los espectros Raman dentro de cada muestra de tejido, de una forma
no subjetiva y sin asumir conocimiento anterior de la morfología y
composición de las muestras de arteria. Este algoritmo de análisis
de agrupamiento fue usado para encontrar grupos de espectros con
características espectrales similares (grupos). En resumen, el
análisis se efectuó sobre primeros derivados normalizados de los
espectros (2.700 a 3.100 cm^{-1}) para reducir cualquier
influencia de variaciones en la intensidad absoluta de la señal
Raman y para corregir un fondo de señal variable de manera
ligeramente lenta debido a una leve autofluorescencia del tejido.
Primero, se realizó el ACP sobre los espectros Raman, para
ortogonalizar y reducir el número de parámetros necesarios para
representar la varianza en el conjunto de datos espectrales. Los
primeros 100 componentes principales fueron calculados, normalmente
teniendo en cuenta hasta el 99% de la varianza de la señal. Los
resultados de los CP, obtenidos para cada espectro, fueron usados
como entrada para el KCA. El número de grupos en los que los
espectros son agrupados por el KCA es definido por el usuario.
Después del KCA, se asignó un tono gris particular a cada grupo. A
cada elemento de la rejilla del mapa Raman fue asignado entonces el
tono gris del grupo particular al que pertenecía su espectro. De
esta manera, se creó una imagen de tonos grises de la sección
congelada, en la cual áreas con espectros similares tenían el mismo
tono gris. Finalmente, se calculó el espectro Raman medio de cada
grupo.
La figura 1 muestra el resultado de un
experimento de mapeo Raman en el cual se obtuvieron espectros de
una sección transversal de tejido fina de arteria aterosclerótica
humana no fija en una rejilla bidimensional de 80 x 70 puntos. Las
diferencias entre espectros obtenidos de puntos de la rejilla con
tono gris igual eran más pequeñas que entre espectros obtenidos de
puntos de la rejilla con tono gris diferente, como se determina por
un análisis de grupos mediante K-medias de los
datos. Los puntos de la rejilla de tejido con tono gris igual
tienen por lo tanto composición molecular similar. Los puntos de la
rejilla de tejido con tono gris diferente muestran diferencia
importante en la composición molecular.
- A)
- Resultado de un análisis de agrupamiento mediante K-medias de 4 grupos. El grupo 1 coincide con grasa adventicial. El grupo 2 coincide con pared arterial. Los grupos 3 y 4 coinciden con una lesión aterosclerótica.
- B)
- Espectros Raman de promedio del grupo para los grupos 1, 2, 3 y 4.
Las diferencias en los espectros de la figura
1B, al igual que la localización muy estructurada de los puntos de
la rejilla de tejido con espectros muy similares (pertenecientes a
un grupo) ilustran la sensibilidad de la espectroscopia Raman de
número de ondas elevado a la arquitectura de una placa
aterosclerótica en términos de su composición molecular. A partir de
la información de los espectros sobre la composición molecular de
puntos de la rejilla de tejido puede deducirse mediante, por
ejemplo, un procedimiento de ajuste de mínimos cuadrados clásico,
en el cual espectros del tejido son ajustados con espectros de, por
ejemplo, compuestos aislados que pueden estar presentes en
el
tejido.
tejido.
La figura 2 muestra espectros de tales
compuestos: A: elastina, B: linoleato de colesteril, C: oleato de
colesteril, D: linolenato de colesteril, E: palmitato de
colesteril, F: colágeno tipo 1, G: trilinoleína, H: triolena, 1:
tripalmitina, J: colesterol. Esta figura muestra que estos
compuestos, los cuales pueden estar presentes en placa
arterosclerótica y pared arterial, tienen señales Raman distintivas
en la región espectral de interés. Se registraron espectros Raman
de estos productos químicos usando el mismo sistema Raman como se
usó para las mediciones mostradas en la
figura 1.
figura 1.
La tabla 1 muestra el resultado de un ajuste de
mínimos cuadrados de espectros de promedio de grupo
1-4 de las figuras 1B con los espectros de
compuestos puros de la figura 2 y un polinomio de primer orden para
tener en cuenta un fondo ligeramente inclinado. Los espectros Raman
de promedio de grupo fueron ajustados con el conjunto de espectros
Raman de estos compuestos puros, usando una rutina de ajuste de
mínimos cuadrados lineales no negativos (lo cual significa que sólo
se permiten coeficientes de ajuste positivos). El polinomio de
primer orden fue incluido en el ajuste para tener en cuenta un
fondo leve (fluorescente) en los espectros Raman. La suma de las
contribuciones del ajuste de los mínimos cuadrados no negativos de
los espectros de los compuestos fue fijada al 100%.
Los porcentajes mostrados se refieren a las
contribuciones de la señal relativa de los espectros de la
proteína, el colesterol, los triglicéridos y los ésteres de
colesterol mostrados en la figura 2. Se coañadieron las
contribuciones de la señal de diferentes ésteres de colesterol
("ésteres de colesterol totales" en la tabla 1), se
coañadieron las contribuciones de la señal de diferentes
triglicéridos ("triglicéridos totales"), así como las del
colágeno y la elastina ("proteínas totales").
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La figura 3 muestra el resultado de una
comparación de la composición de lípidos de segmentos arteriales
humanos como es determinado por la espectroscopia Raman y por la
HPTLC (cromatografía de capa fina de alto rendimiento). 58
segmentos arteriales de \sim1 cm^{-2} fueron escaneados bajo un
microespectrómetro Raman, mientras que la señal Raman fue recogida
en la región de número de ondas más elevado (mismo instrumento que
para las figuras 1 y 2). Después de las mediciones Raman, los
lípidos fueron extraídos de los segmentos arteriales y analizados
mediante HPTLC. La fracción de lípidos total fue normalizada al
100%. Se desarrolló un modelo de análisis de mínimos cuadrados
parciales basado en los resultados Raman y de la HPTLC de 57
segmentos y se aplicó al 58º segmento de espectro Raman para
predecir su composición de lípidos. El resultado fue comparado con
el análisis de HPTLC del 58º segmento. Esta evaluación de "dejar
uno fuera" (leave one out evaluation) se repitió para
cada uno de los 58 segmentos. La figura 3 muestra una comparación
del método Raman de número de ondas más elevado para la
determinación de la composición de lípidos en arterias humanas
(in situ) y la HPTLC para el colesterol, los ésteres de
colesterol totales y los triglicéridos totales de fracciones de
peso relativo. Se obtuvieron coeficientes de alta correlación
(r=0'95 para el colesterol, r=0'93 para los ésteres de colesteril,
r=0'96 para los triglicéridos).
Este experimento muestra que las mediciones
Raman en la región espectral de la invención dan muy buenos
resultados e información comparable a la HPTLC, posibilitando la
espectroscopia Raman como técnica in vivo para el estudio de
la placa arterosclerótica.
Este experimento describe las posibilidades de
espectroscopia Raman en la región espectral de la invención para el
estudio de tejido canceroso.
La región de número de ondas elevado puede
también ser usada ventajosamente en diversas aplicaciones de
oncología clínica. Por ejemplo, la figura 4A muestra un mapa Raman
obtenido de una sección de tejido fina de dura humana infiltrada
por meningioma de manera similar al mapa de una lesión
aterosclerótica de la figura 1 A. Actualmente, no es posible una
buena evaluación intraoperativa de los márgenes de extirpación. No
obstante, es conocido que el tejido de meningioma que se deja
detrás puede conducir a recurrencia del tumor. La figura 4B muestra
una imagen de una sección de tejido adyacente tras la coloración
con hematoxilina y eosina (coloreada con H y E). Sorprendentemente,
la evaluación histopatológica de esta sección y su comparación con
el mapa Raman muestran que las áreas en gris claro en el mapa Raman
se corresponden con la dura, mientras que las áreas en gris oscuro
se corresponden con el meningioma (MG).
Este experimento muestra que las mediciones
Raman en la región espectral de la invención dan información
valiosa sobre el tejido canceroso del cerebro, permitiendo la
espectroscopia Raman como técnica in vivo para el estudio de
dicho tejido.
Este experimento describe las posibilidades de
espectroscopia Raman en la región espectral de la invención para el
estudio de tejido canceroso.
La figura 5A muestra un mapa Raman de una
sección fina de glioblastoma humano con áreas de tumor vital y
áreas con tejido necrótico. Sorprendentemente, la comparación del
mapa Raman con la sección adyacente coloreada con H y E evaluada
por un neuropatólogo muestra que el área en gris claro se
corresponde con el tejido de tumor vital, mientras que el área en
gris oscuro en el mapa Raman se corresponde con la necrosis.
Este experimento muestra que las mediciones
Raman en la región espectral de la invención dan información
valiosa sobre el tejido canceroso del cerebro, permitiendo la
espectroscopia Raman para discriminar entre el tejido del tumor
vital y la necrosis.
La figura 6 muestra esquemáticamente un sistema
de medición y análisis Raman característico que comprende un láser
100, la óptica de acoplamiento 110, mediante la cual luz láser que
sigue una primera vía de luz 105 es acoplada en una sonda de fibra
óptica 120, la cual guía la luz láser al tejido 130 bajo
investigación y la cual recoge luz dispersada por el tejido y la
guía de regreso a la óptica de acoplamiento 110, un filtro 140 que
crea una vía de luz 145 para luz dispersada Raman desde el tejido
130, la cual es desplazada en longitud de onda con respecto a la
luz láser del láser 100, un filtro 150 para una fuerte atenuación
de luz restante de la misma longitud de onda que la luz láser en la
vía de luz 145, una unidad de medición 160, la cual mide las
intensidades de la luz dispersada Raman en una pluralidad de
longitudes de onda, un dispositivo de almacenamiento de señales 170
que puede estar unido electrónicamente a la unidad de medición 160
y la cual almacena las intensidades medidas, y un dispositivo de
análisis de señales 180, el cual puede estar o no unido físicamente
al dispositivo de almacenamiento de señales 170 o el cual puede
coincidir con el dispositivo de almacenamiento de señales 170, y el
cual analiza las señales medidas por ejemplo para proporcionar
información sobre la composición molecular del tejido 130 o para
permitir la clasificación del tejido, por ejemplo, la determinación
de la clase diagnóstica clínica a la cual pertenece el tejido. El
sistema puede comprender una unidad que dé una señal audible o
visible cuando se encuentra cierto tejido. La invención no está
limitada a esta configuración; el experto en la materia puede
variar y/o elegir los componentes que sean según su conocimiento
deseables o necesarios.
Este experimento describe los pasos para llegar
a un análisis de tejido que use espectroscopia Raman de número de
ondas elevado. Los pasos pueden implementarse de diversas formas
(la descripción de los pasos más abajo se dan por lo tanto a modo
de ejemplo y no han de entenderse como limitativos de ninguna
forma):
- 1)
- El tejido es iluminado a través de una fibra óptica y la luz que es dispersada por el tejido es recogida por la misma fibra óptica.
- 2)
- El espectro Raman de la luz recogida es registrado en la forma de intensidades de señal frente al número de canales del detector.
- 3)
- El espectro medido es preprocesado antes del análisis final, este paso de preprocesamiento puede comprender la calibración del número de ondas de canales del detector, la corrección para la eficiencia de la detección de señales dependiente del número de ondas variable, la corrección de espectros medidos para las contribuciones a la señal de fondo, generadas en cualquier parte en el sistema de medición Raman, pero no debido al tejido bajo investigación.
- 4)
- Análisis de los espectros preprocesados. Como ejemplo, un análisis de mínimos cuadrados tradicionales puede ser usado donde el espectro medido sea ajustado con espectros de compuestos de los cuales se sabe que pueden estar presentes en el tejido en cantidades suficientes para tener una contribución detestable al espectro del tejido global y, por ejemplo, un polinomio con coeficientes que también puedan ser ajustados para tener en cuenta de manera óptima fondos variables lentamente al espectro Raman que pueden deberse a, por ejemplo, fluorescencia excitada dentro de la muestra. Cuando los espectros de los compuestos son escalados en intensidad antes del ajuste del espectro del tejido, de tal manera que los coeficientes de ajuste para los espectros de los compuestos resultantes de un ajuste de un espectro de una muestra que contiene cantidades iguales de estos compuestos serían iguales, entonces, aparte del hecho de que en la práctica pueden aplicarse rendimientos diferentes para la recogida de señal de diferentes volúmenes del tejido, y que el tejido puede ser heterogéneo en la composición molecular, los valores de los coeficientes de ajuste están relacionados directamente con los porcentajes del peso de los compuestos respectivos presentes en el tejido, a condición de que el tejido sea suficientemente homogéneo. Si éste no es el caso, la composición como se ha determinado seguirá coincidiendo cualitativa, pero no necesariamente cuantitativamente con la composición real. Por ejemplo, puesto que la pared arterial y la placa aterosclerótica no son homogéneas en la composición molecular, y puesto que dependen de la geometría de la sonda, la señal Raman es recogida con diferentes rendimientos de diferentes volúmenes del tejido, y debido a la atenuación de la señal dentro del tejido, ciertos volúmenes del tejido, con composición molecular potencialmente diferente, aportarán señal de manera más efectiva que otros. Los porcentajes de peso de compuestos presentes en el tejido pueden representar la información real buscada, o pueden usarse para tipificar el tejido y determinar su clase diagnóstica clínica. Los enfoques alternativos para la determinación de los porcentajes de peso de compuestos o grupos de compuestos específicos incluyen el análisis de mínimos cuadrados parciales muy conocidos. También pueden aplicarse otros enfoques de análisis de señales estadístico multivariado, tales como el análisis de componentes principales, el análisis discriminante lineal, el análisis de regresión logística o, por ejemplo, el análisis basado en una red neural artificial, para la determinación de la clase diagnóstica clínica de un tejido.
- 5)
- La salida de los datos deseados en una forma visible o audible, así como el almacenamiento de los datos con referencias adecuadas para la evaluación y/o remisión futuras con otros datos, tales como por ejemplo las coordenadas de la ubicación de la medición, o imágenes de la ubicación donde el espectro Raman fue medido, por ejemplo, un angiograma o imágenes de ultrasonido intravascular.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 7 muestra un espectro (A) de una
mezcla de lípidos medidos con un sistema Raman según la figura 6.
De manera específica, el láser 100 era un láser
ti-zafiro (modelo 3900S, Spectra Physics, EEUU)
emisor de luz láser a 720 nm. El filtro 140 era un filtro
dieléctrico hecho a medida (producido por Omitec, RU), el cual
transmitía luz láser de 720 nm y el cual reflejaba la luz devuelta
desde la muestra con una longitud de onda por encima de 850 nm. La
dirección de la luz láser entrante y la normal a la superficie del
filtro incluido un ángulo de 15 grados. La lente 110 era un
objetivo de microscopio para el uso en el infrarrojo cercano (x20
PL-FL Nachet, apertura numérica 0'35). La fibra
óptica 120 era una fibra óptica WF200/220A de Ceramoptec. El filtro
150 era un filtro de vidrio de color RG 780 (Schott). La luz
transmitida por el filtro 150 fue reflejada sobre una fibra óptica
con un núcleo de 1.000 micrones, la cual estaba conectada a un haz
redondo de 64 fibras ópticas con un diámetro del núcleo de 100
micrones. En el extremo dista) de este haz, las fibras estaban
dispuestas en un conjunto lineal y la luz era guiada al interior del
espectrómetro 160 de esta manera. El espectrómetro 160 era un
espectrómetro de formación de imágenes de sistema Renishaw RA 100
equipado con una cámara CCD de depleción profunda para la detección
de señal multicanal. También se muestran el espectro de la sonda de
fibra óptica misma (B, obtenido sin una muestra presente en el
extremo dista) de la fibra óptica) y un espectro de diferencia
A-B, que ilustra que con una única fibra óptica no
filtrada seleccionada adecuadamente, se pueden obtener espectros de
alta calidad de muestras de composición molecular similar como
pueden encontrarse en lesiones ateroscleróticas.
La figura 8 muestra espectros Raman (t) de una
pared arterial normal (A) y una pared arterial aterosclerótica (B),
de los resultados (f) de un ajuste de mínimos cuadrados de estos
espectros con el conjunto de espectros de compuestos purificados
mostrados en la figura 2 y de residuos (r), los cuales representan
la señal contenida en los espectros del tejido que no es tenida en
cuenta por el conjunto de espectros de ajuste. Como se puede
observar por la baja intensidad de los residuos del ajuste, el
ajuste de los espectros del tejido es muy preciso, permitiendo la
obtención de información detallada relativa a la composición
molecular de los tejidos. Este resultado es mostrado a modo de
ejemplo. Por ejemplo, el conjunto de espectros de compuestos que se
usa para ajustar los espectros del tejido, pueden estar compuestos
de otros espectros o un número diferente de espectros.
La tabla 2 muestra una tabla con porcentajes de
peso de compuestos o grupos de compuestos de las muestras
arteriales de los cuales los espectros son mostrados en las figuras
8A y 8B, como se determina a partir de los resultados del análisis
del ajuste de los mínimos cuadrados. El espectro de la arteria
normal está dominado por contribuciones a la señal de triglicéridos,
que representan las contribuciones a la señal de grasa adventicial,
no se encuentran o se encuentran contribuciones a la señal muy
pequeñas del colesterol y los ésteres de colesterol, en contraste
con la señal obtenida de la arteria aterosclerótica, la cual
contiene contribuciones a la señal significativas del colesterol y
los ésteres de colesterol.
Este experimento muestra que el espectrómetro de
la invención posibilita la espectroscopia Raman como técnica in
vivo para el estudio de la placa arterosclerótica, pero ahora
con los beneficios mencionados arriba de este espectrómetro.
La figura 9 muestra esquemáticamente una forma
de realización en la cual la espectroscopia Raman es combinada con
fluorescencia y espectroscopia de absorción IRC. Esta forma de
realización muestra una única fibra en el lado izquierdo de la
figura y luz de excitación que es acoplada vía reflectores en la
fibra. Se utiliza el mismo u otro reflector para desacoplar a
partir de la señal obtenida de la fibra la luz de fluorescencia para
la detección. Más a la derecha, otro reflector acopla luz láser en
la fibra para la producción de una señal Raman a partir de una
muestra. Se usa el mismo u otro reflector para desacoplar la señal
Raman de la fibra a un detector. En el lado derecho de la figura,
es acoplada luz IRC de una fuente IRC en la fibra, y la señal IRC
que es guiada de regreso por la misma fibra es medida por un
detector adecuado. Las mediciones se pueden hacer secuencial o
simultáneamente. La fibra mostrada también puede ser un haz de
fibras. El experto en la materia adaptará la óptica, las fuentes,
las unidades de detección, etc., a su finalidad, al tejido que ha
de medirse o la información que se desee.
Mientras que arriba se han descrito formas de
realización específicas de la invención, se considerará que la
invención se puede poner en práctica de manera diferente a como se
ha descrito. Por ejemplo, el instrumento también se puede usar para
medir moléculas biológicas, como lípidos, etc., en otras especies
diferentes al tejido, por ejemplo para el uso en el análisis de
leche, aceite, etc. La descripción y los ejemplos no están
destinados a limitar la invención.
Claims (16)
1. Instrumento para la medición de una señal
Raman de tejido, comprendiendo el instrumento un láser, una unidad
de detección de señales para la medición de la señal Raman, y una
sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica comprende una
o más fibras ópticas para dirigir luz láser sobre el tejido y para
recoger luz que es dispersada por el tejido y guiar la luz recogida
alejándola del tejido hacia la unidad de detección de señales,
comprendiendo la fibra o fibras un núcleo, un revestimiento y
opcionalmente un recubrimiento, y la fibra o fibras para recoger
luz sustancialmente sin señal Raman en una o más partes de la
región espectral de 2.500-3.700 cm^{-1}, y donde
la unidad de detección registra la señal Raman dispersada por el
tejido en dicha región espectral, comprendiendo el instrumento
además una unidad de análisis de señales, la cual analiza la señal
Raman registrada en una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}, comprendiendo el análisis un
algoritmo que da como resultado datos relativos a la composición
molecular del tejido y/o la clase diagnóstica clínica a la cual
pertenece el tejido.
2. Instrumento según la reivindicación 1, donde
la sonda de fibra óptica comprende una fibra óptica que dirige luz
láser sobre el tejido y recoge luz que es dispersada por el tejido
y guía la luz recogida alejándola del tejido hacia la unidad de
detección de señales.
3. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, donde la sonda de fibra óptica comprende al menos una
fibra con un núcleo de sílice fundida baja en OH.
4. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, donde la sonda de fibra óptica comprende al menos una
fibra óptica con un núcleo de sílice fundida y un revestimiento de
sílice fundida o teflón o TECS.
5. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, mediante el uso de un material de recubrimiento en el
cual es generada intrínsecamente poca o sustancialmente nada de
señal en el intervalo de número de ondas de
2.500-3.700 cm^{-1}.
6. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, donde la unidad de detección también comprende un
detector para la medición de la fluorescencia y/o un detector para
la absorción del infrarrojo cercano.
7. Instrumento según la reivindicación 6, donde
las mediciones de la fluorescencia y/o de la absorción del
infrarrojo cercano hacen uso de una fibra también usada en la
obtención de la señal Raman, y donde la unidad de detección
comprende también un detector para la medición de la fluorescencia
y/o un detector para la absorción del infrarrojo cercano.
8. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, donde la sonda de fibra óptica comprende un haz de
fibras para la medición y/o el escaneado de un área de tejido.
9. Instrumento según una de las reivindicaciones
anteriores, donde parte de la fibra está integrada o combinada con
un catéter que proporciona información adicional sobre el tejido o
que comprende medios para obtener muestras de tejido, medios para
tratar tejido y/o medios usados en procedimientos quirúrgicos.
10. Instrumento según una de las
reivindicaciones anteriores, donde la sonda de fibra óptica
comprende una única fibra óptica.
11. Uso de un instrumento para la medición de
una señal Raman de tejido, comprendiendo el instrumento un láser,
una unidad de detección de señales para la medición de la señal
Raman, y una sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica
comprende una o más fibras ópticas para dirigir luz láser sobre el
tejido y para recoger luz que es dispersada por el tejido y guiar la
luz recogida alejándola del tejido hacia la unidad de detección de
señales, comprendiendo la fibra o fibras un núcleo, un
revestimiento y opcionalmente un recubrimiento, y teniendo la fibra
o fibras para recoger luz sustancialmente nada de señal Raman en
una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}, y donde la unidad de
detección registra la señal Raman dispersada por el tejido en dicha
región espectral, comprendiendo el instrumento además una unidad de
análisis de señales, la cual analiza la señal Raman registrada en
una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}, comprendiendo el análisis un
algoritmo que da como resultado datos relativos a la composición
molecular del tejido y/o la clase diagnóstica clínica a la cual
pertenece el tejido.
12. Uso de un instrumento según la
reivindicación 11, donde el tejido es extirpado, biopsado o tomado
de un cuerpo humano o animal antes de la medición.
13. Uso según una de las reivindicaciones
11-12, para la medición de una señal Raman de una
muestra de tejido antes de que sea resecada, o biopsada o para la
selección de tejido para la biopsia o resección.
14. Método para la producción y la medición de
una señal Raman de tejido, comprendiendo la provisión de un láser,
una unidad de detección para la medición de una señal Raman, y una
sonda de fibra óptica, donde la sonda de fibra óptica comprende una
o más fibras ópticas para dirigir luz láser sobre el tejido y para
recoger luz que es dispersada por el tejido y guiar la luz recogida
alejándola del tejido hacia la unidad de detección de señales,
comprendiendo la fibra o fibras un núcleo, un revestimiento y
opcionalmente un recubrimiento, el envío de luz láser a través de
la una o más fibras ópticas, la recepción de la señal Raman desde
el tejido a través de la una o más fibras ópticas y la detección de
la señal Raman por una unidad de detección de señales, no teniendo
la fibra o fibras para recoger luz sustancialmente señal Raman en
una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}, y donde la unidad de
detección de señales registra la señal Raman en dicha región
espectral, comprendiendo el instrumento además una unidad de
análisis de señales, la cual analiza la señal Raman registrada en
una o más partes de la región espectral de
2.500-3.700 cm^{-1}, comprendiendo el análisis un
algoritmo que da como resultado datos relativos a la composición
molecular del tejido y/o la clase diagnóstica clínica a la cual
pertenece el tejido.
15. Método para la evaluación de una fibra
óptica para la medición de una señal Raman de tejido, donde se usa
un instrumento según una de las reivindicaciones
1-10, y donde una muestra de tejido es extirpada,
biopsada o tomada de un cuerpo humano o animal antes de la
medición, y donde la señal Raman de la fibra óptica es medida de la
muestra y de un hueco, y donde las señales Raman de la muestra y
del hueco son comparadas.
16. Método para la evaluación de la idoneidad de
un tipo de fibra para la medición de la señal Raman de tejido, que
comprende:
- uso de un instrumento según una de las
reivindicaciones 1-10
- realización de una medición sin tejido estando
presente en el extremo distal de la fibra,
- realización de una medición con tejido estando
presente en el extremo dista) de la fibra,
- comparación de los espectros obtenidos con y
sin tejido estando presente
- conclusión que la fibra es adecuada para la
medición de la señal Raman de tejido.
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