CN102740762A

CN102740762A - 由拉曼光谱法表征肺组织的设备和方法

Info

Publication number: CN102740762A
Application number: CN2011800065871A
Authority: CN
Inventors: 曾海山; M·绍特; S·拉姆; A·麦克威廉姆斯
Original assignee: British Columbia Cancer Agency BCCA
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2011-01-21
Publication date: 2012-10-17
Also published as: IL220789A0; EP2525704A1; EP2525704A4; JP2013517485A; US20130231573A1; CA2786740A1; WO2011088580A1

Abstract

近红外拉曼光谱能被应用于以识别支气管树中的肿瘤前损伤。使用沿着支气管镜的仪器通道向下通过的光纤导管，可以获得肺组织的实时在体拉曼光谱。使用原型设备，以分别为96％和91％的灵敏度和特异性检测肿瘤前损伤。结合其他支气管镜成像模态而使用拉曼光谱设备和方法，能够大幅降低假阳性结果的数量。

Description

由拉曼光谱法表征肺组织的设备和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2010年1月22日提交的题为ENDOSCOPICLASER RAMAN SPECTROSCOPY FOR IMPROVING LUNGCANCER DETECTION的美国专利申请No.61/297486以及2010年10月7日提交的题为LASER RAMAN SPECTROSCOPY REDUCESFALSE POSITIVE BIOPSIES OF AUTOFLUORESCENCEBRONCHOSCOPY的美国专利申请No.61/390723的优先权。对于美国而言，根据U.S.C.§119，本申请要求享有2010年1月22日提交的美国专利申请No.61/297486以及2010年10月7日提交的美国专利申请No.61/390723的权益，所述两篇文献通过引用合并在本文中。

技术领域

本发明涉及组织的表征。本发明可以应用于例如提供用于癌症的肺组织评定的方法和设备。一个示例实施例提供了内窥镜设备，其可以由医师使用以评估肺组织中损伤是癌性的可能性。

背景技术

肺癌通常是致命的。成功治疗的前景通过早期识别肿瘤前损伤（具有高度可能性发展成恶性肿瘤的损伤）而得以提升。支气管树的肿瘤前损伤包括中度和重度异生和原位癌（CIS），其具有发展成恶性肿瘤的高度可能性。在支气管镜检期间定位这些肿瘤前损伤从而可以施予进一步治疗是增加患者存活机会的关键

当前，定位肿瘤前损伤用于进一步治疗的最佳方法是组合自发荧光支气管镜检（AFB）和白光支气管镜检（WLB）。该组合在20世纪90年代被开发，并且如上所述已经对定位肿瘤前损伤作出了显著的改进，例如在Lam S、Kennedy T、Unger M等人的Localization ofbronchial intraepithelial neoplastic lesions by fluorescencebronchoscopy.Chest 1998;113:696-702以及Zellweger M、Grosjean P、Goujon D、Monnier P、van den Bergh H、Wagnieres G的In vivoautofluorescence spectroscopy of human bronchial tissue to optimize thedetection and imaging of early cancers.J.Biomed.Opt.2001;6:41-51中所述。AFB+WLB在检测前肿瘤中的灵敏度几乎是单独使用WLB的两倍。然而，WLB+AFB的平均报告特异性仅为60%，这导致了许多假阳性识别，例如在Lam S.The Role of AutofluorescenceBronchoscopy in Diagnosis of Early Lung Cancer;在Hirsch FR,BunnJr PA,Kato H,Mulshine JL,eds.IASLC Textbook for Prevention andDetection of Early Lung Cancer.英格兰伦敦;以及纽约:Taylor &Francis;2006:149-158;以及在Edell E等人的Detection andLocalization of Intraepithelial Neoplasia and Invasive Carcinoma UsingFluorescence-Reflectance Bronchoscopy.Journal of Thorac Oncology.2009;Jan;4(1):49-54中所解释的。

WLB+AFB欠佳的特异性可以部分地由以下事实所解释，即选择典型地使用WLB+AFB识别的许多组织部位中的哪一些进行活检要求支气管学家的可观技能和判断。然而，大量假阳性的主要原因是AFB固有的低特异性。良性和肿瘤前损伤均具有类似的自发荧光特征。因而，仍然需要改进的检测方法

拉曼光谱法包括将光引导至样本，其非弹性地散射入射光的一部分。与样本的非弹性相互作用可以使得散射光的波长相对于入射光的波长而位移（拉曼位移）。散射光的波长光谱（拉曼光谱）包含关于样本属性的信息。

在下列参考文献中描述了在组织研究中拉曼光谱法的使用：

a)Caspers PJ等人Raman spectroscopy in biophysics and medicalphysics.Biophys J 2003;85:572-580;

b)Huang Z等人Rapid near-infrared Raman spectroscopy systemfor real-time in vivo skin measurements.Opt Lett 2001;26:1782-1784;

c)Short MA等人Development and preliminary results of anendoscopic Raman probe for potential in vivo diagnosis of lung cancers.Opt Lettt 2008;33(7):711-713;

d)Huang Z等人Raman spectroscopy of in vivo cutaneous melanin.J of Biomed Opt 2004;9:1198-1205;

e)Huang Z等人Raman Spectroscopy in Combination withBackground Near-infrared Autofluorescence Enhances the In VivoAssessment of Malignant Tissues.Photochem Photobiol2005;81:1219-1226;

f)Molckovsky A等人Diagnostic potential of near-infrared Ramanspectroscopy in the colon:differentiating adenomatous from hyperplasticpolyps.Gastrointest Endosc 2003;57:396-402;

g)Abigail SH等人In vivo Margin Assessment during PartialMastectomy Breast Surgery Using Raman Spectroscopy.Cancer Res2006;66:3317-3322;

h)Rajadhyaksha M等人In Vivo Confocal Scanning LaserMicroscopy of Human Skin II：Advances in Instrumentation andComparison With Histology.J Invest Dermatol 1999;113:293-303;

i)Lieber CA等人In vivo nonmelanoma skin cancer diagnosisusing Raman microspectroscopy.Laser Surg Med 2008;40(7):461-467;

j)Tu AT.Raman spectroscopy in biology:principles and applicationsNew York,NY：Wiley;1982;

k)Hanlon EB等人Prospects for in vivo Raman spectroscopyPhysics in Medicine and Biology 2000;45:R1-R59;

l)Robichaux-ViehoeverA等人Characterization of Raman spectrameasured in vivo for the detection of cervical dysplasia.Appl.Spectrosc.2007;61pp.986-997.

m)Guze K等人Parameters defining the potential applicability ofRaman spectroscopy as a diagnostic tool for oral disease.J.Biomed.Opt.2009;14:0140161-9;

n)Huang Z等人Integrated Raman spectroscopy and trimodalwide-field imaging techniques for real-time in vivo tissue Ramanmeasurements at endoscopy.Opt.Lett.2009;34:758-760;

o)Huang Z等人Near-infrared Raman spectroscopy for opticaldiagnosis of lung cancer.Int.J.Cancer 2003;107:1047-1052;

p)Magee ND等人Ex Vivo diagnosis of lung cancer using a Ramanminiprobe.Journal of Physical Chemistry B 2009;113:8137-8141;

q)Short MA等人Development and preliminary results of anendoscopy Raman probe for potential in-vivo diagnosis of lung cancers.Optics Letters 2008;33(7):711-713;

r)Shim MG，et al.Study of fiber opfic probes for in vivo medicalRaman spectroscopy.Applied Spectroscopy 1999;53:619-627;

s)Yamazaki H等人The diagnoses of lung cancer using 1064nmexcited near-infrared multichannel Raman spectroscopy.RadiationMedicine 2003;21:1-6;

t)Nazemi JH等人Lipid concentrations in human coronary arterydetermined with high wavenumber Raman shifted light.J.Biomed.Opt.2007;14(3):0340091-6;

u)Koljenovíc S等人Raman microspectroscopic mapping studies ofhuman bronchial tissue.J.Biomed.Opt.2004;9:1187-1197;

v)Movasaghi Z等人Raman spectroscopy of biological tissues.Applied Spectroscopy Reviews 2007;42:493-541;and

w)Percot,A.等人Direct observation of domains in model stratumcorneum lipid mixtures by Raman spectroscopy.Biophysical Journal 2001;81:2144-2153.

所有这些参考文献通过引用合并在本文中。

在以下文献中描述了应用施加拉曼光谱法以分析通过共焦技术收集的光的光学设备的使用，其中：

x)Caspers PJ等人Automated depth-scanning confocal Ramanmicrospectrometer for rapid in vivo determination of water concentrationprofiles in human skin.J Raman Spectrosc 2000;31:813-818;

y)Caspers PJ等人In vivo confocal Raman microspectroscopy of theskin:noninvasive determination of molecular concentration profiles.JInvest Dermatol 2001;116:434-442;

z)Caspers PJ等人Monitoring the penetration enhancer dimethylsulfoxide in human stratum corneum in vivo by confocal Ramanspectroscopy.Pharm Res 2002;19:1577-1580.

所有这些参考文献通过引用合并在本文中。

用于表征疑似损伤和其他组织的敏感的、特异性的、非侵入式工具将为使用活检和对所提取组织的组织病理学检查提供有价值的备选方案。

发明内容

本发明具有许多方面。这些方面包括：有助于评定在体肺组织病理的设备；有助于评定在体肺组织病理的方法；用于处理组织拉曼光谱数据并生成光谱对应于癌症或癌前组织的可能性的测量值的设备；用于处理组织拉曼光谱数据并生成对光谱对应于癌症或癌前组织的可能性的测量值的方法；包含计算机可读指令的非暂态介质，所述指令当由数据处理器执行时，使得数据处理器执行用于处理组织拉曼光谱数据并生成对光谱对应于癌症或癌前组织的可能性的测量值的方法。

本发明的一方面是提供有助于非倾入式肺组织分析而通过检测和测量拉曼光谱进行对疾病或者生理状态的诊断。

本发明的一些实施例提供了用于采集和分析点拉曼光谱的方法和设备，以提供用于评估组织（例如在肺或支气管树的候选位置处的组织）的客观测量值。一些实施例提供了对损伤为肿瘤前、恶性或均不是的快速和客观测量。

在一些实施例中，该方法和设备适于在由正常、发炎、增生、轻度异生的类组成的组以及在由中度异生、重度异生、原位癌（CIS）和肿瘤的类组成的组之间进行区分。前四类被认为是良性的，而后四类则是恶性的。

本发明的一个方面提供了用于组织表征的设备，包括被配置为生成拉曼光谱的拉曼分光计、被配置为测量拉曼光谱的至少一个特性的光谱分析单元以及响应于所测得的特征而被驱动的反馈装置。该至少一个特性包括在1500±10cm^-1至3400±10cm^-1的相对波数范围内的一个或多个光谱特征。

在一些实施例中，设备还被配置为处理拉曼光谱以提供经平滑的二阶导数光谱。例如，这可以通过应用Savitzky-Golay六点二次多项式而实现。所述组织可以基于经平滑的二阶导数光谱中的特征而被表征。

在一些实施例中，设备被配置为通过如下表征组织：如果组织特性的后验概率小于第一阈值，则表征装置处于第一类别；如果组织特性的后验概率大于第二阈值，则表征装置处于第二类别；如果组织特性的后验概率在第一阈值和第二阈值之间，则表征装置处于第三类别。在一些实施例中，第一阈值表现为0.3±10%的截止点，而第二阈值表现为0.7±10%的截止点。例如，第一阈值可以是0.3的截止点，而第二阈值可以是0.7的截止点。

本发明的另一方面提供了一种用于组织表征的方法，包括接收肺组织的至少一个拉曼光谱，测量拉曼光谱至少一个特性，响应于所测得的特性而表征组织，以及生成对组织的表征的指示。至少部分地基于在1500±10cm^-1至3400±10cm^-1的相对波数范围内的一个或多个拉曼光谱特征，评估所述组织。

在一些实施例中，计算经平滑的二阶导数光谱。例如，这可以向每个拉曼光谱应用Savitzky-Golay六点二次多项式而进行。

在一些实施例中，表征所述组织包括：如果组织特性的后验概率小于第一阈值，则表征装置处于第一类别；如果组织特性的后验概率大于第二阈值，则表征装置处于第二类别；如果组织特性的后验概率在第一阈值和第二阈值之间，则表征装置处于第三类别。在一些实施例中，第一阈值表现为0.3±10%的截止点，而第二阈值表现为0.7±10%的截止点。例如，第一阈值可以是0.3的截止点，而第二阈值可以是0.7的截止点。

本发明的另一方面提供了一种非暂态有形计算机可读介质，其存储由至少一个数据处理器执行的指令，所述指令在由数据处理器执行时，使得数据处理器执行用于表征组织的方法，包括如下步骤：处理肺组织的至少一个拉曼光谱，响应于拉曼光谱而表征肺组织，以及生成肺组织表征的指示。至少部分地基于在1500±10cm^-1至3400±10cm^-1的相对波数范围内的一个或多个拉曼光谱特征，而表征所述组织。

本发明的其他方面以及本发明的示例实施例的特征在随后的描述中描述和/或在附图中例示。

附图说明

附图例示了本发明的非限制性实施例。

图1是根据本发明一个示例实施例的诊断设备的框图。

图2是根据本发明另一个示例实施例的设备的框图。

图2A是原型诊断设备的照片。

图3A是原始拉曼光谱的曲线图。

图3B是图3A的拉曼光谱的曲线图，其中多项式曲线拟合荧光背景。

图3C是图3A的拉曼光谱的曲线图，其中减去了荧光背景。

图4A是损伤在白光下的照片。

图4B是相同损伤的蓝光激发的荧光照片。

图4C是疑似损伤的蓝光和拉曼分光计激发的荧光照片。

图5A是来自数据集的示例平均拉曼光谱的曲线图。

图5B是来自数据集的另一示例平均拉曼光谱的曲线图。

图5C是来自数据集的又一示例平均拉曼光谱的曲线图。

图5D是损伤的各种分类的示例拉曼光谱的曲线图。

图6是预测和已知病理学的示例后验概率绘图的曲线图。

图7是示例拉曼光谱的示例接收者操作者特定的曲线图。

图8示出了用于各种参考材料的示例拉曼光谱的曲线图。

具体实施方式

在下列描述中通篇阐述了特定细节以便提供对本发明的更透彻理解。然而，可以在没有这些细节的情况下实施本发明。在其他实例中，没有示出或详细描述周知的元件，以避免不必要地模糊本发明。因此，说明书和附图应被认为是出于说明性而非限制性的意义。

图1是根据本发明一个示例实施例的设备20的框图。设备20包括拉曼分光计22，其被配置为确定小体积组织T的拉曼光谱24。组织T可以是肺组织。

肺组织的在体拉曼光谱的获取会由于一般需要光纤或其他柔性探针将光从肺组织运送至分光计这一问题而变得复杂，并且这可能导致光收集效率降低。另一个问题是频繁且不可控的肺运动使得难以维持聚焦在组织的特定区域上达数秒以上。这些问题能被如下解决：通过使用如在Shim MG等人在Study of fiber optic probes for in vivo medicalRaman spectroscopy.Applied Spectroscopy 1999;53:619-627中所述的部件以减少光纤发射，并且采取如Huang Z等人在Rapid near-infraredRaman spectroscopy system for real-time in vivo skin measurements.Optical Letters 2001;26:1782-1784中所述的步骤以增进高信噪比。Short MA等人在Development and preliminary results of an endoscopyRaman probe for potential in-vivo diagnosis of lung cancers.Optics Letters2008;33(7):711-713中描述了适于从肺组织采集拉曼光谱的原型拉曼分光计系统。

光谱分析部件26接收拉曼光谱24，并且处理拉曼光谱以获得指示其拉曼光谱24被获得的组织的病理学的测量值28。测量值28控制反馈装置29。反馈装置29可以例如包括灯、曲线图指示、声音、显示器或响应于测量值28而提供人可感知的信号的其他装置。

测量值28至少部分基于在1500cm^-1至3400cm^-1的波数范围内发现的拉曼光谱的特征。

图2是根据本发明的另一示例实施例的设备30的框图。在图2中，示出了拉曼分光计22包括光源32。光源32是单色光源，并且可以例如包括激光器。光源32例如可以包括红外激光器。在一个示例实施例中，激光器生成785nm波长的光。

需要避免将组织暴露至过量的辐射。这可以通过恰当选择光源32、控制光源和/或提供光源下游衰减而实现。

来自光源32的光由滤波器34滤波，并被耦合入光纤36。光通过分束器38进入导管40。导管40例如可以沿着支气管镜的仪器通道而向下延伸。在一个示例实施例中，导管40的直径为1.8mm，从而其可以安装通过支气管镜的直径为2.2mm的仪器孔。从导管40远端出射的光照明导管40端部附近的组织，其中部分光经历拉曼散射。拉曼散射光的一部分进入导管40，并且通过分束器38和滤波器42而传送至摄谱仪44。

摄谱仪44和检测器46一同工作以产生在摄谱仪44处入射的光的拉曼光谱。将表征拉曼光谱的信息传递至分析系统48。优选地，在诸如1秒的短数据采集时间内采集拉曼光谱。

光谱分析系统48可以包括经编程的数据处理器，诸如个人计算机、嵌入式计算机、微处理器、图形处理器、数字信号处理器、或者执行软件和/或固件指令而使得处理器从拉曼光谱提取特定光谱特性的类似处理器。在备选实施例中，光谱分析系统48包括电子电路、逻辑流水线、或被配置为提取特异性光谱特征的其他硬件，或是与硬件结合以在特定光谱特性的提取过程中执行一个或多个步骤的编程的数据处理器。

方便而非强制的是，光谱分析系统48实时或近实时地操作，从而在采集的拉曼光谱基本上同时或至少数秒之内完成对拉曼光谱的分析。

在图2中，47指示用于校准分光计的直径为50μm的光纤。

根据由光谱分析系统48从拉曼光谱提取的特定光谱特性而获得的测量值，光谱分析系统48连接以控制指示器设备49。

测得的拉曼光谱典型地将叠加在荧光背景上，其根据每个测量而变化。方便的是，光谱分析系统48处理接收到的拉曼光谱，以移除荧光背景，并且还归一化所述光谱。例如使用如在Zhao J等人在Automated Autofluorescence Background Subtraction Algorithm forBiomedical Raman Spectroscopy.Appl.Spectrosc.2007;61:1225-1232中所述的Vancouver Raman算法（温哥华拉曼算法），可以实现对荧光背景的移除，所述文献通过引用合并在本文中。Vancouver Raman算法是一种计及了噪声的迭代修改多项式曲线拟合荧光移除法。图3A、3B和3C分别示出了原始拉曼光谱、具有拟合至荧光背景的多项式曲线的图3A的拉曼光谱、以及具有通过减去的多项式曲线而被建模的荧光背景的图3A的拉曼光谱。

例如可以对每个光谱的曲线下面积（AUC）执行归一化。例如，每个光谱可以乘以被选以使得AUC等于标准值的值。为便于显示光谱，归一化的强度可以除以每个光谱中数据点的数量。

摄谱仪44和光谱分析系统48被配置为获取并分析包括1500cm^-1至3400cm^-1范围的至少部分的拉曼光谱。发明人已经确定该范围提供了特别的优点，因为其避免了在0至2000cm^-1范围内发现的非常强的肺组织自发荧光，并且仍然包含有助于组织表征的显著生物分子信息。

光谱分析系统48可以应用多变量数据分析以根据各组织在1500cm^-1至3400cm^-1范围内的拉曼光谱而对组织进行分类。例如，可以通过执行主成份分析（PCA）来分析具体光谱。可以对所采集的拉曼光谱的部分或全部范围执行PCA。

PCA包括产生一组主成份，其表示了一组训练光谱中的方差的给定比例。例如，每个光谱可被表示为一组少量PCA变量的线性组合。可以选择PCA变量，以使它们至少计及一组训练光谱的总方差的阈值量（例如，至少70%）。

主成份（PC）可以通过对标准化光谱数据矩阵执行PCA以产生PC而导出。PC通常提供了减少数量的正交变量，这些变量计及了原始光谱中总方差的大部分。

通过计算被称为PC得分的变量，可以使用PC评定新的拉曼光谱，所述PC得分表示正被分析的拉曼光谱中的一个或多个具体PC的一个或多个比重。

随后，可以使用线性判别分析（LDA）以导出指示组织是否正常的PC得分的函数（判别函数）。

判别函数可被连续应用以基于相应于未知组织的拉曼光谱的PC得分的点相对于判别函数线的位置来分类未知组织。

光谱分析系统48可被配置为对1500cm^-1至3400cm^-1范围内的拉曼光谱执行线性判别分析和/或主成份分析，以判别健康和不健康的肺组织。下面提供了这样的一个示例。

图2A是示出根据原型实施例的设备的照片。该设备安装在推车上，从而能被带到靠近患者的位置。

设备20或30的一个应用是表征已使用不同模态（例如WLB和AFB）而被识别为感兴趣的损伤。方便的是，导管40由用于识别感兴趣损伤的相同仪器（例如支气管镜）携带。这有助于在观察到损伤后立刻使用拉曼光谱法来表征该损伤。医师可以使用支气管镜，通过在一个或多个恰当成像模式下观察肺组织而识别损伤。当已经定位感兴趣的损伤时，医师可在不移动支气管镜的情况下触发对感兴趣损伤的拉曼光谱的采集和分析。这可以例如通过按下按钮或使用另一用户界面模态以命令设备采集拉曼光谱而完成。在一些实施例中，医师立即接收到拉曼光谱的自动分析结果。基于自动分析的结果，医师能够决定进一步的动作，诸如是否对感兴趣的损伤进行活检。

图4A是示出白光下成像的损伤的照片，而图4B是图4A所示相同位置观察为蓝光激发的荧光图像的照片。图4B使用加拿大温哥华的Xillix Technologies Corp.的Onco-LIFE^TM荧光内窥镜系统获得。图4B中，绿色表示正常组织，而暗红色（例如在区域60中）表示患病组织。

图4C是示出同时使用蓝光生成荧光图像以及使用来自拉曼分光计的导管40的785nm光而激发的另一疑似损伤的照片，其中基本上由区域62指示的区域是红色，而其余区域主要是绿色的。

参考下列特定示例而进一步描述本发明，这并不意味着限制本发明，而是进一步例示本发明。

例1

使用图2中例示类型的近红外拉曼系统以采集肺组织中损伤的实时在体肺光谱。肺组织来自于选自进行支气管镜检的46人的组中的26人。支气管学家使用组合的WLB和AFB来识别损伤以进行活检。在46个参与者中，发现26个具有支气管学家推选进行活检的损伤。使用本文所述的设备获得来自这些损伤的拉曼光谱。测得129个拉曼光谱。在一秒曝光中获得清楚的在体拉曼光谱。

在相同的位置进行活检，并且由病理学家进行分类。根据世界健康组织准则（参见例如，Travis WD等人登载于World HealthOrganization Pathology Panel：World Health Organization InternationalHistological Classification of Tumors,3rd ed.Berlin:Springer Verlag;1999,p.5的Histologic and graphical text slides for the histological typingof lung and pleural tumors.），使用八个分类。这八个分类是：正常上皮细胞、增生（包括杯形细胞增生和基细胞/储备细胞增生）；化生（包括不成熟的鳞状化生和鳞状化生）；轻度异生、中度异生、重度异生：CIS以及侵入式鳞状细胞癌（IC）。还对炎症变化的存在与否进行记录。在如下讨论中，≥MOD（≥中度）指的是具有中度异生或更严重病理的损伤，≤MILD（≤轻度）指的是具有轻度异生或更轻微病理的损伤。

在获取的129个拉曼光谱中，51个来自病理≥MOD的部位，其余则来自轻度异生或更轻微病理（≤MILD）的部位。

在校准系统的灵敏度作为波长函数之前，从每个光谱的原始数据中减去环境背景信号。以三种不同的方式处理每个经预处理的光谱。

通过对每个经预处理的光谱执行3点平滑操作，并对每条曲线下的面积求和且将平滑光谱中的每个变量除以该和来归一化强度变量，获得第一数据集（数据集A）。图5A示出了来自病理≤MILD（曲线51A）和≥MILD（曲线51B）的部位的数据集A的数据的平均光谱。为清楚起见，曲线51A和51B的强度标度改变。曲线51C示出了从平均≥MOD光谱减去平均≤MILD光谱的结果（不在相同的强度标度上）。水平虚线是零强度。

图5A的检查示出了对数据集A光谱的基本上自发荧光影响，其在1600、2150和2900cm^-1附近具有相对较小的拉曼峰。低强度宽峰的中心位于2150cm^-1处，而3100cm^-1以上的强发射被认定为源自水分子振动。

通过由如在Zhao J等人在Automated autoflorescence backgroundsubtraction algorithm for biomedical Raman spectroscopy.AppliedSpectroscopy 2007;61:1225-1232中描述的修改的多项式拟合例程，执行3点平滑操作并在随后减去自发荧光，获得第二数据集（数据集B）。

图5B示出了来自≤MILD损伤（曲线52A）和≥MILD（曲线52B）的数据集B的平均拉曼光谱。曲线52C示出了从平均≥MOD光谱减去平均≤MILD光谱的结果（不在相同的强度标度上）。曲线52A和52B示出了由在13个波数位置（在图中由垂直虚线所示）的t测试统计（p.0.05）确定的显著差别。这些位置对应于光谱中的峰或肩部。由于在两个范围（A和B）外侧未观察到清楚的拉曼峰，因此示出了这两个范围。使用对所有测得的参考值的最小平方加权求和，得到对每个平均光谱的近似拟合。这些拟合由实心黑线指示，并且示出了≥MOD损伤的DNA、血红蛋白、苯丙氨酸和三油酸酯相对增加，以及胶原的相对下降。

图5D示出了在体拉曼光谱被处理为用于各种分类的损伤的数据集B。由于在两个波数范围（A和B）外侧未观察到清楚的拉曼峰，因此示出了这两个范围。范围B中的光谱强度平均是范围A中的5倍。

靠近1663cm^-1的宽峰很可能对应于v（C=O）氨基化合物振动和v2水分子弯曲运动的组合。在2900cm^-1左右的宽峰则被指定为脂类（C-H）峰（2833+2886cm^-1）和普通蛋白质在2938cm^-1处的振动的组合。

附图5D示出了位于1589、1646、1698、1727、2720、2801、2863、2877和2921cm^-1处的其他小峰或肩部，其看上去对应于各种氨基酸、脂类和蛋白质的峰。在1750和2700cm^-1之间（图5D未示出的范围），除了在2150cm^-1处的宽发射之外，存在多个强度非常低的窄峰，其似乎不随肺部位的不同而改变。虽然有对一些主要归因于碳和氮模式的弱拉曼发射（其近似符合所观察得的一些非常低强度的峰）的报告，但是该光谱区域未注意到任何显著拉曼峰。

通过对每个经预处理的光谱应用Savitzky-Golay六点二次多项式以计算平滑的二阶导数光谱，而得到第三数据集（数据集C）。该技术例如在S avitzky A等人的Smoothing and differentiation of data bysimplified least squares procedure Analytical Chemistry 1964;36:627-1639中有所描述。对光谱的平方导数值求和并在随后将每个变量除以该和以用于归一化。

在图5C中示出了，在其中不同病理组之间的显著性差异（p.0.05）是显见的范围上的数据集C的二阶导数光谱。曲线53A是来自病理≤MILD的部位的平均已处理数据。曲线53B是来自病理≥MOD的部位的平均已处理数据。为清楚起见，曲线53A和53B的强度标度已被移位。曲线53C示出了从平均≥MOD光谱减去平均≤MILD光谱的结果（不在相同的强度标度上）。水平虚线是零强度。示出了两个波数范围（（A）1550-1800cm^-1和（B）2700-3100cm^-1）。仅在这些范围中观察到清楚的拉曼峰。

使用统计软件（来自美国俄克拉荷马州Tulsa的StatSoft Inc.的Stistica^TM 6.0）分别分析数据集A、B和C。计算每个数据集中的所有光谱的主成份（PC）以减少变量的数量。对计及0.1%或更大方差的PC使用Student氏t测试，以在将光谱分成≥MOD和≤MILD这两个病理组时确定最显著PC。对最显著PC使用具有使用留一法交叉验证的线性判别分析（LDA）。为了避免过拟合数据，在LDA中使用的PC数量被限为最小子组（即51个≥MOD光谱）情况下的总数的三分之一（17）。

可以使用留一法交叉验证程序以防止过度训练。留一法交叉验证包括从数据集中移除一个光谱，并且使用其余光谱的集而重复整个算法，包括PCA和LDA。随后使用得到的最佳算法分类已保留的光谱。可以重复该算法，直到每个光谱已被独立分类。

如上所述，除了从每个数据集中略去的具有IC病理（24）的所有光谱之外，对于数据集A、B和C的光谱重新进行第二次的完整分析。每个数据集中的27个光谱维持具有≥MOD的病理分类，而因而仅在LDA交叉验证模型中使用9个PC。

对来自数据集A、B和C的光谱进行的统计分析导致了能从表I中所见的显著不同的结果。来自数据集A的光谱对于预测病理≥MOD而言最差，其具有80%的灵敏度和72%的特异性。从分析中移除IC光谱得到了实质上更差的灵敏度，而特异性仅有适度的增加。如果仅在后验概率≥0.7或≤0.3时分类光谱，则获得80%的灵敏度和77%的特异性，而代价是仅能从129个光谱中分类99个（77%）。

与数据集A光谱相比，数据集B光谱的分析示出了对病理预测的改进，其具有80%的灵敏度和79%的特异性。从分析中移除IC光谱，得到实质上更好的特异性（89%），而灵敏度未改变。当使用0.7和0.3的截止线时，灵敏度和特异性分别是83%和84%，且分类了129个光谱中的80%。

通过分析使用二阶导数（数据集C）处理的光谱，获得最佳结果。图6是与已知病理学相比的预测病理的后验概率绘图。使用留一法交叉验证进行数据集C的统计分析。在LDA模型中使用17PCA成分。使用所有光谱获得90%的灵敏度和91%的特异性。在该情况下，仅分类错了三个IC光谱51（参见图6）。从分析中略去所有IC光谱，将使得灵敏度增加值96%，而特异性在91%维持不变，而当使用0.7和0.3的截止线时，灵敏度和特异性均增加且经分类的光谱为88%。

在图7中示出了所有三个数据集的接收者操作者特性（ROC）。图7示出了当在LDA后验概率绘图中将截止线从0移动至100%时的灵敏度和特异性如何改变。数据集A对应于曲线55A。数据集B对应于曲线55B。数据集C对应于曲线55C。可以清楚地发现经二阶导数处理的光谱（数据集C）的优越性。每个ROC曲线下的分数面积，对于数据集A、B和C中分析的光谱分别是0.78、0.85和0.92.

获得人上皮细胞和结缔组织的发射的主要影响的参考材料的拉曼光谱以供比较。它们是：从人胎盘提纯的DNA、来自面包酵母的RNA、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、三油酸酯（支气管粘液的丰富脂类）、人肺的胶原以及人血红蛋白。大部分参考样本获自于Sigma-AldrichCanada Ltd，参考编号DNA（D4642）、RNA（R6750）、苯丙氨酸（P2126）、酪氨酸（T3754）、色氨酸（T0254）、三油酸酯（T7140）以及人肺胶原（CH783）。血红蛋白获自于志愿者的血液样本。以所提供的状态精确地使用这些参考，而不进行进一步处理。通过支撑拉曼导管在每个样本上数毫米处，而使用与在体测量相同的仪器获得光谱。以与在体数据相同的方式预处理数据，随后如对于数据集B光谱而进一步处理。图8示出了参考材料的拉曼光谱。为清楚起见，已将光谱沿强度轴移位。该光谱的特征与文献中报告的一致。

虽然1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围未摆脱自发荧光，但是发现自发荧光比在通常的0至2000cm^-1范围内发现的自发荧光要小一个量级。而且，尽管在测量范围内存在较少的拉曼峰，并且虽然随着组织病理经过从正常到IC的各种改变而它们看上去在峰改变的趋势上并不一致（参见例如图5D），但是对于具有不同病理的部位，在光谱中具有统计上显著的差别。

数据集A的统计分析可以由下列事实解释，即部位选择处理偏向于仅选择由AFB成像识别的部位。然而，已知这导致了次于最优的特异性。由于使用WLB和AFB的组合通常并不难以识别IC，从数据分析中略去IC光谱可以改进对早期疾病的检测。在数据集A光谱的情况下，该论证证实了从识别的≥MOD部位，具有仅55%的光谱的错误。对此的明显解释是自发荧光在光谱中占优势，而该自发荧光类似于所有测得的部位，除具有IC的部位之外。

在分析中使用截止线在无法始终获得高质量光谱的情况下会是有利的。患者不自觉的移动可能是该问题的一个原因。组织表面上的大量粘液或水可能是另一个原因。

在一些实施例中，分析系统48被配置为确定所获得的光谱是否满足≥MOD或≤MILD的统计学标准，并且如果未满足该统计学标准则向用户发信号。由于该设备旨在于临床环境中使用，并且为了基本上实时地形成结果，这种实施例允许支气管学家在前一光谱不满足统计学标准（例如，超出截止线）的情况下立即获取另一光谱。可以对数次尝试之后仍然失败的任何部位进行活检。另外，截止线不应过于严格，因为这将导致减少假阳性数量的目标失败。在该工作基于的研究中，选择0.7和0.3的后验概率截止线。

数据集B光谱的分析得到优于数据集A的结果，尽管存在来自IC部位的一些光谱被误分类的情况。对于此的理由是最可能的采样错误，因为IC损伤可以包含除了组织学恶性上皮细胞（即促结缔组织增生性基质）的区域。采样相邻反应或发炎的非肿瘤组织是误分类样本的另一可能性。从分析中移除IC光谱确实使特异性增加9%，而灵敏度未变（参见表I）。后验概率截止线对灵敏度和特异性做出了适度改善。

二阶导数光谱（数据集C）对于分离≥MOD和≤MILD组织最佳，其具有90%的灵敏度和91%的特异性。略去IC光谱灵敏度增加6%，而特异性未损失。除IC光谱之外，其他误分类的部位是具有中度异生、轻度异生、化生和增生病理的部位。采样错误同样可以解释这些误分类。对于误分类的备选解释是拉曼光谱包含生物分子信息，对于损伤是否将发展成为晚期疾病并不具有明显的组织学对应物。

不完全理解为何数据集C具有改进的灵敏度和特异性值。虽然发明人不希望受任何特定理论的限制，但是一个原因是大量自发荧光的多项式拟合中的错误，将非相关方差引入数据集B。

上述的方法可以按各种方式改变。例如，可以应用其他技术来移除背景荧光。可以应用Magee ND等人在Ex Vivo diagnosis of lungcancer using a Raman miniprobe.Journal of Physical Chemistry B 2009;113:8137-8141中所述的移位减去拉曼光谱法。用于移除背景荧光的已知技术均具有优点和缺点，正如Zhao J等人在Automatedautofluorescence background subtraction algorithm for biomedical Ramanspectroscopy.Applied Spectroscopy 2007;61:1225-1232中所述。Zhao等人所述的方法趋向于在非复杂的背景荧光下工作良好，并且对于实时临床应用是快速的。生成导数光谱也是快速的处理，其可以在诊所实时进行，该组合可以是具有强荧光组织的最佳选择。

总之，可以应用如本文所述的点拉曼光谱法，以显著降低假阳性活检的数量，同时仅略微降低WLB和AFB检测肿瘤前肺组织的灵敏度。虽然可以认为具有40%的假阳性率，优于引起检测灵敏度的任何损失，但是实践中可能不会认识到与附属使用拉曼光谱法所引起的轻微损失。首先，支气管学家通常需要在使用WLB+AFB时作出关于对哪个损伤进行活检的部分主观的决定。辅助使用如本文所述的拉曼光谱法可以使得该决定处理更客观，这可以使得识别最初被否决的部位处的附加肿瘤前损伤作为活检备选。第二，如上所述，拉曼光谱法可以识别作为发展至晚期疾病的标记物的组织学肿瘤前和非肿瘤前损伤两者的生物分子改变。

本文所述的技术的应用不限于非倾入式诊断。在一些实施例中，可以在手术期间使用本文所述的设备，以分类在手术期间可到达的损伤的组织。

示例应用

支气管学家对患者执行支气管镜检，并且使用大量成像模态（例如AFB+WLB），以识别值得进一步研究的损伤。支气管学家正使用配备有如本文所述的拉曼光谱学设备的支气管镜。支气管学家将支气管镜放置为使得拉曼导管的端部邻近感兴趣的损伤，并且操作拉曼光谱设备以采集损伤中组织的一个或多个拉曼光谱。该设备实时分析所述拉曼光谱并且尝试基于所述光谱分类所述组织。该设备基于分析结果生成送至支气管学家的信号。作为简单的示例，如果分析指示≥MOD的分类，设备显示绿光，而如果分析指示≤MILD的分类，则显示红光。在一些实施例中，如果不能清楚地确定分类（例如通过适当选择的截至阈值而确定的范围之外的后验概率所确定的），那么设备可以指示黄光。

在设备指示≥MOD的分类的情况下，或者设备在两次或多次尝试之后让无法做出清楚分类的情况下，支气管学家可以选择进行活检。当设备指示≤MILD的分类时，支气管学家可以选择不进行活检，除非支气管学家注意到建议从该部位进行活检是明智的一些其他因素。

本发明的特定实现包括计算机处理器，其执行软件指令，以使得处理器执行本发明的方法。例如，在医用拉曼分光计系统中的一个或多个处理器可以通过执行处理器可访问的程序存储器中的指令，而执行本文所述的方法。本发明还可以以程序产品的形式提供。该程序产品包括任何非暂态介质，其携带一组计算机可读信息，包括当由数据处理器执行时使得数据处理器执行本发明的方法的指令。根据本发明的程序产品可以采取各种形式。例如，程序产品可以包括物理介质，诸如包括软盘、硬盘驱动器的磁性数据存储装置，包括CD ROM、DVD的光学数据存储介质，包括ROM、闪存RAM的电子数据存储介质等。程序产品上的计算机可读信号可以任选地被压缩或加密。

当部件（例如软件模块、处理器、组件、装置、电路等）涉及上述内容，除非另外指明，对于该部件的引用（包括对“装置”的引用）应当理解为包括该部件的等效功能，执行所述部件的功能的任何部件（即功能等效），包括结构不等效于执行本发明所示典型实施例中功能的所公开结构的部件。

根据前述公开内容，本领域普通技术人员将显见在实施本发明中可以具有许多改变和修改，而不脱离其精神或范围。因此，本发明的范围应根据所附权利要求所限定的实质来理解。

Claims

1.一种表征肺组织的设备，该设备包括：

拉曼分光计，被配置为在1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内生成拉曼光谱；

拉曼光谱分析单元，被配置为基于拉曼光谱的1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内的特征来表征组织；以及

反馈装置，能够响应于拉曼光谱分析单元的输出而被驱动以产生人可察觉的信号，所述信号指示由拉曼光谱分析单元对组织的表征。

2.根据权利要求1所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为处理拉曼光谱，以提供经平滑的二阶导数光谱，并且基于经平滑的二阶导数光谱中的特征来表征组织。

3.根据权利要求2所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为通过对每个光谱应用Savitzky-Golay六点二次多项式来生成所述经平滑的二阶导数光谱。

4.根据权利要求1所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为通过执行3点平滑操作来处理拉曼光谱，并且基于经3点平滑的光谱中的特征来表征组织。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为使得表征基于在1550cm^-1至1800cm^-1的第一相对波数范围内的第一特征以及2700cm^-1至3100cm^-1的第二相对波数范围内的第二特征。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为通过计算针对主成分的光谱的主成分得分并且根据基于所述主成分得分的判别函数执行判别分析来分析拉曼光谱，其中所述主成分得分从包括在1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内成分的拉曼光谱的训练集导出。

7.根据权利要求6所述的设备，其中判别分析包括线性判别分析。

8.根据权利要求6或7所述的设备，其中拉曼光谱分析单元包括数据存储装置，并且表征主成分得分的信息被存储在所述数据存储装置中。

9.根据权利要求8所述的设备，其中将判别函数存储在所述数据存储装置中。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的设备，其中拉曼光谱分析单元包括被配置为从拉曼光谱中减去荧光背景的荧光背景减去级。

11.根据权利要求10所述的设备，其中荧光背景减去级被配置为执行多项式拟合例程以评估荧光背景。

12.根据权利要求10或11所述的设备，其中拉曼光谱分析单元包括在所述荧光背景减去级之后的归一化级，该归一化级被配置为归一化拉曼光谱。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的设备，其中拉曼光谱分析单元被配置为从拉曼光谱减去环境背景信号。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的设备，包括支气管镜，其中拉曼分光计包括可插入所述支气管镜的仪器通道中的光导，用以接收包含拉曼光谱的光。

15.根据权利要求3所述的设备，其中拉曼分光计分析单元包括归一化级，该归一化级被配置为通过对每个光谱的平方导数值求和并且将每个变量除以该和，而归一化该拉曼光谱。

16.根据权利要求6所述的设备，其中拉曼分光计分析单元被配置为通过如下来表征组织：

如果组织特性的后验概率小于第一阈值，则表征组织位于第一类别；

如果组织特性的后验概率大于第二阈值，则表征组织位于第二类别；以及

如果组织特性的后验概率在第一阈值和第二阈值之间，则表征组织位于第三类别。

17.根据权利要求16所述的设备，其中第一阈值表现为0.3±10%的截止点，而第二阈值表现为0.7±10%的截止点。

18.根据权利要求16或17的设备，其中反馈装置产生人可感知的信号，其中：

如果组织处于第一分类，则所述信号是第一信号；

如果组织处于第二分类，则所述信号是第二信号；以及

如果组织处于第三分类，则所述信号是第三信号。

19.一种用于组织表征的方法，包括：

获得组织的至少一个拉曼光谱，该拉曼光谱包括在1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内的特征；

在编程的光谱分析单元中包括数据处理器以执行软件指令，以至少部分基于拉曼光谱的1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内的特征来自动表征组织；以及

控制反馈装置以产生指示组织表征的人可感知的信号。

20.根据权利要求19所述的方法，包括执行荧光减去步骤，以在表征组织之前从拉曼光谱中减去荧光背景。

21.根据权利要求20所述的方法，包括在荧光背景减去步骤之后归一化拉曼光谱。

22.根据权利要求19所述的方法，其中拉曼光谱被处理以在表征组织之前提供经平滑的二阶导数光谱，并且基于该经平滑的二阶导数光谱中的特征来表征组织。

23.根据权利要求22所述的方法，其中经平滑的二阶导数光谱通过对拉曼光谱应用Savitzky-Golay六点二次多项式而提供。

24.根据权利要求19所述的方法，其中拉曼光谱通过如下被处理：

在表征组织之前对拉曼光谱执行3点平滑操作，并且

基于经3点平滑的光谱中的特征来表征组织。

25.根据权利要求19所述的方法，其中表征组织基于的是在1550cm^-1至1800cm^-1的第一相对波数范围内的第一特征以及2700cm^-1至3100cm^-1的第二相对波数范围内的第二特征。

26.根据权利要求19所述的方法，其中拉曼光谱通过如下被处理：

计算针对主成分的光谱的主成分得分，并且

根据基于所述主成分得分的判别函数执行判别分析来分析拉曼光谱，

其中所述主成分得分从包括在1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内成分的拉曼光谱的训练集导出。

27.根据权利要求26所述的方法，其中判别分析包括线性判别分析。

28.根据权利要求27所述的方法，其中编程的拉曼光谱分析单元包括数据存储装置，并且表征主成分得分的信息被存储在所述数据存储装置中。

29.根据权利要求28所述的方法，其中判别函数被存储在所述数据存储装置中。

30.根据权利要求21所述的方法，其中执行荧光背景减去步骤的步骤包括执行多项式拟合例程以评估荧光背景。

31.根据权利要求19所述的方法，包括从拉曼光谱减去环境背景信号的步骤。

32.根据权利要求23所述的方法，包括通过对每个光谱的平方导数值求和并在随后使每个变量除以该和来归一化拉曼光谱的步骤。

33.根据权利要求26所述的方法，其中表征组织包括使用概率阈值。

34.根据权利要求26所述的方法，其中表征组织包括：

如果组织特性征的后验概率在第一阈值和第二阈值之间，则表征组织位于第三类别。

35.根据权利要求34所述的方法，其中第一阈值表现为0.3±10%的截止点，而第二阈值表现为0.7±10%的截止点。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中控制反馈装置包括：

如果组织处于第一分类，则产生第一信号；

如果组织处于第二分类，则产生第二信号；以及

如果组织处于第三分类，则产生第三信号。

37.一种非暂态有形计算机可读介质，其存储由至少一个数据处理器执行的指令，所述指令在由数据处理器执行时，使得数据处理器执行用于表征组织的方法，所述方法包括如下步骤：

接收组织的至少一个拉曼光谱，该拉曼光谱包括在1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内的特征；

至少部分基于拉曼光谱的1500cm^-1至3400cm^-1的相对波数范围内的特征来表征组织；以及

生成对组织表征的指示。

38.根据权利要求37所述的非暂态有形计算机可读介质，其中非暂态有形计算机可读介质还存储至少一个拉曼光谱。