DE69231614T2

DE69231614T2 - Molekularspektroskopieverfahren und -einrichtungen zur gewebediagnose

Info

Publication number: DE69231614T2
Application number: DE69231614T
Authority: DE
Inventors: J. Baraga; S. Feld; P. Rava
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 2001-05-03
Anticipated expiration: 2012-01-18
Also published as: US20040186383A1; EP0573535B1; EP0573535A1; CA2104960A1; US6697665B1; US6690966B1; JPH06505183A; ATE198375T1; DE69231614D1; WO1992015008A1; CA2104960C

Description

In den Vereinigten Staaten sind Herzanfälle, welche nahezu vollständig der Koronar-Atherosklerose zuzuordnen sind, für 20 bis 25% aller Todesfälle verantwortlich. Es stehen verschiedene medizinische und chirurgische Therapien für die Behandlung der Atherosklerose zur Verfügung; aber derzeit gibt es keine in situ Verfahren, um Information im voraus zu darüber zu erhalten, welche krankhaften Veränderungen bzw. Läsionen sich trotz einer speziellen medizinischen Therapie weiter ausbreiten.
Objektive klinische Befundungen atherosklerotischer Gefäße werden derzeit nahezu ausschließlich durch Angiographie durchgeführt, welche eine anatomische Information bezüglich der Belags- bzw. Plaquegröße und Form sowie den Grad der Gefäßverengung liefert. Die Entscheidung, ob eine Interventionsprozedur erforderlich ist, und die Auswahl einer angemessenen Behandlungsmodalität basiert üblicherweise auf dieser Information. Die histologische und biochemische Zusammensetzung von atherosklerotischen Plaques variiert jedoch erheblich in Abhängigkeit von dem Stadium des Plaques und reflektiert vielleicht auch das Vorhandensein mehrerer Ursachen. Diese Variation kann sowohl die Prognose einer gegebenen Läsion als auch den Erfolg einer gegebenen Behandlung beeinflussen. Solche Daten können, wenn sie zur Verfügung stehen, erheblich zu einer geeigneten klinischen Behandlung atherosklerotischer Plaques, sowie zu der Entwicklung eines grundlegenden Verständnisses der Pathogenese der Atherosklerose Beitragen.
Derzeit können biochemische und histologische Daten bezüglich der Plaquezusammensetzung nur nach einer Behandlung durch Analyse entfernten Materials oder bei einer Autopsie erhalten werden. Eine Plaquebiopsie ist aufgrund der Begleitrisiken bei der Entfernung von ausreichend arteriellem Gewebe für die Laboranalyse kontraindiziert. Angesichts dieser Einschränkung haben eine Reihe von Forschern optospektrokopische Verfahren als ein Mittel zur Befundung von Plaqueablagerungen untersucht. Solche "optische Biopsien" sind nichtdestruktiv, da sie keine Entfernung von Gewebe erfordern, und rasch mit optischen Fasern und Arterienkathetern durchgeführt werden können. Mit diesem Verfahren kann der Arzt mit geringem zusätzlichem Risiko für die Patienten die Information erhalten, die erforderlich ist, um vorherzusagen, welche Läsionen fortschreiten können, und um die beste Behandlung für eine gegebene Läsion auszuwählen.
Unter den optischen Verfahren hat sich die meiste Aufmerksamkeit auf die ultraviolette und/oder sichtbare Fluoreszenz konzentriert. Die Fluoreszenz-Spektroskopie wird bereits zur Diagnose von Krankheiten in einer Reihe von menschlichen Geweben, einschließlich der Arterienwand, eingesetzt. Bei der Arterienwand liefert die Fluoreszenz des Gewebes die Charakterisierung einer normalen und einer atherosklerotischen Arterie. Die bereitgestellte Information ist jedoch aufgrund der großen Linienbreite der Fluoreszenzemissionssignale beschränkt. Ferner liefern Fluoreszenz-basierende Verfahren zum größten Teil Information über die elektronische Struktur der Bestandteilsmoleküle der Probe. Es besteht ein Bedarf nach nicht-destruktiven Echtzeit-Biopsie-Verfahren, welche eine vollständigere und genauere biochemische und molekulare Diagnoseinfomation liefern. Dieses gilt sowohl für Atherosklerose als auch andere Krankheiten, welche andere Organe des Körpers betreffen.
Ein Artikel mit dem Titel "Applications of Near-Infrared Fourier Transform Raman Spectroscopy in Biology and Medicine", in Spectroscopy, vol. 5 No. 24 (1990) von Nie et al. offenbart ein spektroskopisches Diagnosesystem und ein Verfahren einer spektroskopischen Analyse gemäß den Präambeln von Anspruch 1 bzw. 5.
Ein Artikel mit dem Titel "Medical Application of Raman Spectroscopy", in Applied Spectroscopy Reviews, 24 (3 and 4), 259-312 (1988) von Ozaki stellt fest, daß "zur zufriedenstellenden Messung der Raman-Spektren von Zellen, Geweben und Organen, jedoch zwei Hauptprobleme umgangen werden müssen. Diese sind Fluoreszenz von Proben und/oder Verunreinigungen, welche intrinsisch schwächere Ramanstreuung maskieren, und die Beschädigung von Proben durch eine starke Laserbeleuchtung. Biologische Materialien, insbesondere absterbende emittieren oft eine starke Fluoreszenz. Daher ist die Lösung des Fluoreszenz-Problems der Schlüssel zur Erzielung großer Fortschritte in der Raman-Untersuchung biomedizinischer Materialien. Die beste Lösung zur Elimination der Fluoreszenz biomedizinischer Materialien liegt wahrscheinlich in der Verschiebung der Anregungswellenlänge weiter in den roten Bereich. Diesbezüglich wären die Entwicklung von Detektoren mit hoher Empfindlichkeit im Roten, und Fortschritte der Raman-Spektroskopie im nahen Infrarotbereich (89) und der Fourier-Transformations-Raman-Spektroskopie [90, 91] sehr zu wünschen".
Ein Artikel mit dem Titel "Near-Infrared Raman Spectroscopy with a 783-nm Diode Laser and CCD Array Detector", in Applied Spectroscopy 43 (1989) January, No. 1, by Williamson, et al. offenbart eine Vorrichtung, welche einen bei 783 nm arbeitenden GaAlAs-Diodenlaser kombiniert mit einem nicht verstärkenden Ladungsverschiebeelement-(CCD)-Detektor aufweist, und einen Eingitter-Spektrographen, der für die Erzielung von nahem Infrarot (NIR) Raman-Spektren verwendet wird. Der Artikel vertritt die Meinung, daß das Laserdioden/CCD- System einen Kompromiß darstellt, welcher eine reduzierte Fluoreszenz-Rückstrahlung im Vergleich zu der FT-Raman- Spektroskopie mit 1064 nm Anregung aufweisen sollte, aber größere Gewinne in der Empfindlichkeit und Einfachheit ermöglichen sollte.
Das System und Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die Merkmale der kennzeichnenden Abschnitte der Ansprüche 1 bzw. 5 gekennzeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Schwingungs-Spektroskopie-Systeme für und Verfahren einer nahen Infrarot (NIR) FT-Raman-Spektroskopie, welche eine ausführliche Information auf Molekularebene über die Pathogenese von Krankheiten liefern kann. Diese Schwingungstechnik ist leicht fernbedient unter Verwendung von faseroptischen Sonden auszuführen. Insbesondere nutzt eine bevorzugte Ausführungsform FT-Raman- Spektren zur Unterscheidung von normalem oder atherosklerotischem Gewebe. Die FT-Raman-Spektroskopie in nahen Infrarotbereich kann Informationen über den Gewebezustand liefern, welche aus den Fluoreszenz-Verfahren nicht erhältlich ist. In situ Schwingungs-Spektroskopie-Techniken erlauben die Sondierung von Veränderungen auf molekularer Ebene, welche während des Krankheitsfortschritts stattfinden. Die gelieferte Information wird zur der Wahl der korrekten Behandlungsmodalität genutzt.
Diese Verfahren beinhalten die Schritte einer Bestrahlung des zu diagnostizierenden Gewebes mit Strahlung in dem infraroten Bereich des elektromagnetischen Spektrums, die Detektion von dem Gewebe emittierten Lichts bei derselben Frequenz, oder alternativ innerhalb eines Bereichs von Frequenzen an einer oder beiden Seiten des Bestrahlungslichts, und die Analyse des detektierten Lichts, um dessen Zustand zu diagnostizieren. Das Raman-Verfahren basiert auf der Basis der Erfassung von Information über molekulare Schwingungen, welche in dem Bereich von Wellenlängen zwischen 3 und 300 um auftreten. Man beachte, daß bezüglich der Nutzung von Raman-verschobenem Licht Anregungswellenlängen im ultravioletten, sichtbaren und infraroten Bereich alle diagnostisch nützliche Information erzeugen können. Die FT-Raman-Spektroskopie im nahen Infrarotbereich ist ideal für die Untersuchung von menschlichem Gewebe geeignet.
Die Raman-Spektroskopie ist ein wichtiges Verfahren bei der Untersuchung biologischer Proben im allgemeinen wegen der Fähigkeit dieses Verfahrens, schwingungsspektroskopische Information aus einem jedem Probenzustand (gasförmig, flüssig oder fest) und der schwachen Überlagerung aus dem Wasser- Raman-Signal in dem "Fingerabdruck"-Spektralbereich zu erhalten. Das FT-Spektrometer stellt einen hohen Durchsatz und eine hohe Wellenlängengenauigkeit bereit, welche erforderlich sein könnten, um Signale aus Gewebe zu erhalten, und kleine Frequenzverschiebungen, die auftreten, zu messen. Letztlich können standardmäßige optische Quarzfasern zur ferngesteuerten Anregung und Sammlung von Signalen verwendet werden.
Die FT-Raman-Spektroskopie im nahe Infrarotbereich stellt die Fähigkeit bereit, biologische Bestandteile viele hundert um unterhalb der Gewebeoberfläche zu untersuchen. Insbesondere werden bei atherosklerotischem Gewebe kalzifizierte Ablagerungen unterhalb der Gewebeoberfläche leicht unterschieden. Somit wird es möglich, pathologische Bedingungen zu detektieren, welche unter Anwendung angioskopischer Verfahren nicht sichtbar sind, sowie die detaillierte molekulare Grundlage der Pathologie zu untersuchen.
Im Gegensatz zu elektronischen Verfahren sind die Bänder in dem Schwingungsspektrum relativ schmal und leicht aufzulösen. Schwingungsbänder sind individuellen Molekulargruppen unmittelbar zugeordnet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wendet zwei oder mehr Diagnoseprozeduren an, die entweder gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden, um eine vollständigere Diagnose bereitzustellen. Diese Verfahren können die Verwendung von Fluoreszenz von endogenen Gewebe, Raman-verschobenen Messungen und/oder ATR-Messungen beinhalten.
Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet Laserlicht in dem Bereich von 810 nm, um das Gewebe zu bestrahlen und dadurch Raman-Spektren mit Frequenzkomponenten in einem Bereich zu erzeugen, der für die Detektion durch das CCD geeignet ist. Weitere Wellenlängen können verwendet werden, um die diagnostische Information abhängig von der speziellen Art des Gewebes und der Art und dem Stadium der Krankheit oder Abnormalität zu optimieren. Raman-Spektren können von dem CCD bei zwei leicht unterschiedlichen Beleuchtungsfrequenzen gesammelt werden, und werden voneinander subtrahiert, um breitbandige Fluoreszenz-Lichtkomponenten zu entfernen, und dadurch ein hochqualitatives Raman-Spektrum zu erzeugen. Die hohe Empfindlichkeit des CCD-Detektors in Verbindung mit der Spektrensubtraktionstechnik ermöglicht die Erzeugung hochqualitativer Raman-Spektren in weniger als einer Sekunde mit einer Laserbeleuchtungsintensität ähnlich der für das hierin ebenfalls beschriebene FT-Raman-System.
Fig. 1A und 1C sind schematische Darstellungen von Systemen, welche nicht der vorliegenden Erfindung entsprechen, aber für das Verständnis der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Fig. 1B ist eine axiale Querschnittsdarstellung eines Katheters, welcher in der vorliegenden Erfindung nützlich ist.
Fig. 2 stellt graphisch FT-Raman-Spektren der menschlichen Aorta dar: a) normale Arterie b) atheromatöser Plaque; c) FT-Raman-Spektrum von festem Cholesterol (Sigma).
Fig. 3 stellt graphisch FT-Raman-Spektren der menschlichen Aorta dar: a) beleuchtet von der intimalen Seite (Spektrum multipliziert mit 3); und b) beleuchtet von der adventitialen Seite (primäres adipöses Gewebe); c) NIR FT-Raman- Spektrum von Triglycerid, Triolein.
Fig. 4 stellt graphisch FT-Raman-Spektren der menschlichen Aorta dar: a) fibröser Plaque, und b) atheromatöser Plaque; c) FT-Raman-Spektrum von Cholesterolmonohydratpulver.
Fig. 5 stellt graphisch FT-Raman-Spektren der kalzifizierten menschlichen der Aorta dar: a) kalzifiziert mit einer fibrösen Abdeckung; b) herausgeschnittene Kalzifikation aus einem anderen Plaque; c) Spektren desselben Gewebes wie in a) entnommen aus der adventitialen Seite.
Fig. 6 stellt graphisch FT-Raman-Spektren der kalzifizierten menschlichen Aorta dar: a) kalzifiziert mit einer fibrösen Abdeckung (Spektrum multipliziert mit 8); und b) freigelegte Kalzifikation.
Fig. 7 stellt graphisch die gemessene NIR-Raman-Intensität des 960 cm&supmin;¹ Bandes (A(960 cm&supmin;¹) gibt die Fläche dieses Bandes an) in einer kalzifizierten Ablagerung als eine Funktion der Tiefe unterhalb der beleuchteten Oberfläche dar. Die gestrichelte Kurve entspricht der Anpassung einer Exponentialfunktion an die Daten mit einem Exponenten von 2,94 mm&supmin;¹.
Fig. 8 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (4000-700 cm&supmin;¹) einer (a) normalen Aorta, intimale Oberfläche; und (b) einer gepufferten Salzlösung (0,14M NaCl, pH 7,4) dar.
Fig. 9 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (1800-800 cm&supmin;¹) nach Wassersubstraktion dar: (a) normale Aorta, intimale Oberfläche; (b) subadventiales Fett; (c) von der intimalen Oberfläche einer normalen Aorta abgespülte Salzlösung.
Fig. 10 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (1800-800 cm&supmin;¹) nach Wassersubstraktion dar: (a) zwei aufeinanderfolgende Wasser-subtrahierte Spektren der normalen Aorta, intimale Oberfläche, gesammelt unmittelbar nach der Anordnung eines ATR-Elements (durchgezogene Linie) und zehn Minuten später (gestrichelte Linie); (b) dieselben zwei Spektren wie in (a) nach einer Lipidsubtraktion so skaliert, daß sie gleiche Maxima aufweisen.
Fig. 11 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (1800-800 cm&supmin;¹) Wasser- und Lipidsubtrahiert dar: (a) normale Aorta, Media-Schicht; (b) atherosklerotischer Plaque, intimale Oberfläche; (c) atheromatöser Plaque mit intakter fibröser Abdeckung, intimale Oberfläche dar.
Fig. 12 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (1800-800 cm&supmin;¹) dar: (a) nekrotischer Kern von atheromatösem Plaque, Wasser- und Lipid-subtrahiert; (b) Trockenfilm aus Cholesterol.
Fig. 13 stellt graphisch eine Streuungsaufzeichnung für alle Proben der Fläche A(1050), des 1050 cm&supmin;¹ Cholesterolbandes (integriert von 1075 bis 1000 cm&supmin;¹) im Verhältnis zu der Fläche, A(1550) des 1548 cm&supmin;¹ Proteinamid II Bandes (integriert von 1593 bis 1485 cm&supmin;¹) dar. Die Intensitäten wurden aus den Wasser- und den Lipid-subtrahierten Spektren berechnet. NORMAL bezeichnet normale Aortenproben, intimale Seite, FIBRÖS beinhaltet atherosklerotische und atheromatöse Plaques mit intakten fibrösen Abdeckungen, und NEKROTISCH beinhaltet offenliegende nekrotische Atheromkerne und von atheromatösen Plaques isoliertes nekrotisches Material.
Fig. 14 stellt graphisch FT-IR ATR-Spektren (1800-800 cm&supmin;¹) dar: (a) eine zweite Ableitung des Spektrums eine normalen Aortenintima (Fig. 8a); (b) ein Wasser-subtrahiertes Spektrum desselben normalen Aortenintimaprobe (dieselbe wie in Fig. 9a).
Fig. 15 stellt graphisch ein Streuungsdiagramm für alle Proben der Fläche, A(1050), des 1050 cm&supmin;¹ Cholesterolbandes aufgetragen über der Fläche, A(1382), des 1382 cm&supmin;¹ Cholesterolbandes dar. Beide Cholesterolbänder wurden auf die Fläche, A (1050) des Proteinamid II Bandes normiert. Alle Bandintensitäten wurden aus den Wasser- und Lipid-subtrahierten Spektren berechnet. Die Gewebekategorien sind dieselben wie in Fig. 13. Die durchgezogene Linie stellt eine lineare Anpassung nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate an die Daten dar.
Fig. 16A und Fig. 16B sind zusätzliche Ausführungsformen von ATR-Sonden, welche wiederum nicht der vorliegenden Erfindung entsprechen.
Fig. 17 ist eine schematische Darstellung des Systems von Fig. 1M, das für die Verwendung des Spektographen- und CCD- Raman-Detektors der vorliegenden Erfindung modifiziert.
Fig. 18 ist eine schematische Darstellung eines bevorzugten Systems für die Implementierung des Spektographen- und CCD-Raman-Detektors der vorliegenden Erfindung.
Fig. 19 stellt graphisch Spektrographen- und CCD-Raman- Spektren der normalen menschlichen Aorta dar: A) Raman- plus Fluoreszenzspektrum, erzeugt durch Beleuchtung der Gewebeprobe mit 810 nm Laserlicht; B) Raman-Differenzspektrum, erzeugt durch Subtraktion von Spektren, die durch Beleuchtung der Gewebeprobe mit Laserlicht von 810 und 812 nm erzeugt wurden; C) resultierendes Raman-Spektrum, erzeugt durch Integration des Raman-Differenzspektrums von B).
Fig. 20 stellt graphisch Spektrographen- und CCD-Raman- Spektren eines atherosklerotischen Plaques mit einer an der Oberfläche offenliegenden kalzifizierten Abscheidung dar: A) Raman- plus Fluoreszenzspektrum, erzeugt durch Beleuchtung der Gewebeprobe mit 810 nm Laserlicht; B) Raman-Differenz- Spektrum, erzeugt durch Subtraktion von Spektren die durch Beleuchtung der Gewebeprobe mit Laserlicht von 810 und 812 nm erzeugt wurden; C) resultierendes Raman-Spektrum, erzeugt durch Integration des Raman- Differenzspektrums von B).
Fig. 21 stellt graphisch ein Spektrographen/CCD-Raman- Spektrum von adventitialen adipösen Gewebe dar.
Die spektroskopischen Verfahren, welche nicht der vorliegenden Erfindung entsprechen, können in einem System wie z. B. dem für eine Laserbehandlung einer Atherosklerose, welches in Fig. 1 dargestellt ist, durchgeführt werden. Fig. 1 enthält getrennte Blockdiagramme für das System der Erfindung, welches Laserlicht sowohl für die spektroskopische Diagnose als auch für die Behandlung und/oder Entfernung von Gewebe verwendet. Der Abtragslaser 225, der Impulsverlängerer 229 und der Impulsfüller/Multiplexer 231, 233 erzeugen einen Laserausgabe-Abtragsimpuls mit ausreichender Energie und Intensität um Gewebe zu entfernen und ausreichender Impulsdauer, um sich durch ein faseroptisches Laser-Katheterzuführungssystem fortzupflanzen, ohne die Fasern zu beschädigen. Diese Systeme und Verfahren sind vollständiger in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung U.S. Serial No. 07/644,202, eingereicht am 22. Januar 1991 beschrieben.
Zur Plaqueentfernung wird eine Vorrichtung 219 verwendet, um das Gewebe zu berühren, wie z. B. ein Mehrfachfaser-Laserkatheter 10 von Fig. 1B mit einem optischen Schild. Der Katheter 10 wird in die Arterie eingeführt, und das distale Ende des Katheters mit der Läsion in Kontakt gebracht. Anschließend wird eine Bestimmung des Gewebetyps durchgeführt, auf welche jede einzelne optische Faser 20a-c' zielt. Nur auf krankes Gewebe zielende Fasern werden aktiviert. Somit wird eine selektive Gewebeentfernung erzielt. Ferner ist diese Technik auch für die Steuerung chirurgischer Prozeduren in anderen Organen und Geweben, wie z. B. im Dickdarm und Blase, anwendbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft Systeme und Verfahren zur Durchführung von Spektraldiagnosen, um das Gewebe vor jeder Faser zu untersuchen. In einer bevorzugten Anordnung ist eine Laserlichtquelle 207 mit den Fasern verbunden. Das Diagnoselicht wird durch den optischen Faserselektor 207 zu der Faser der Wahl übertragen.
Das Diagnoselicht tritt aus der gewählten optischen Faser aus, und fällt auf das Gewebe. Das Gewebe absorbiert das Licht und ein Teil des absorbierten Lichts wird durch Rayleigh-Fluoreszenz, Raman- oder andere elastische oder inelastische Lichtstreuungsprozesse re-emittiert. Dieses Licht kehrt zu den optischen Fasern zurück und tritt aus dem Selektor 217 aus und wird von einer Photodiode, Photomultiplier oder einem anderen Detektor 203 detektiert. Das zurückkehrende Licht könnte andere optische Fasern als die für die Beleuchtung verwendeten nutzen. Ein Diagnosesubsystem erzeugt das gesamte spektrale Signal, welches in den Computer 80 eingegeben wird.
Der Computer speichert die Information in einem Speicher als ein Spektrum, welches ein Graph der Lichtintensität über der Wellenlänge ist. Dieses kann unmittelbar auf der Videoanzeigeeinrichtung 82 dargestellt oder mit einem in dem Computer gespeicherten existierenden Spektrum verglichen und die Differenz auf der Spektralanzeigeeinrichtung 86 dargestellt werden. Eine Kurzzeitanzeigeeinrichtung 88 kann Korrekturen darstellen, welche für die Wellenlängen abhängige Empfindlichkeiten der Quelle durchgeführt werden. Information aus der Kurzzeit- oder Spektralanzeigeeinrichtung kann in dem Computer 80 gespeichert werden. Die Vergleichsdaten werden auf der numerischen Anzeigeeinrichtung 84 dargestellt, um ein quantitatives Maß für die Gesundheit des beobachteten Gewebes bereitzustellen.
Mit einem Mehrkanaldetektor und einem Computer, oder geeigneten Mehrfachfiltern und Detektoren ist es möglich, diese Information in einem Bruchteil einer Sekunde zu erhalten. Somit wird eine spektrale oder numerische Anzeigeeinrichtung bereitgestellt, welche den Gewebetyp anzeigt, auf welchem die interessierende Faser zielt. Wenn das Gewebe Plaque ist, und entfernt werden soll, richtet dann der Faserselektor 217 diese Faser zu dem Ausgangsstrahl des Hochleistungslasers 225 aus. Dann wird der Hochleistungslaser 225 eingeschaltet und ein entsprechender Leistungspegel für eine vorbestimmte Zeitdauer gewählt, um eine bestimmte Menge erkranktes Gewebe zu entfernen. Der Strahl des Lasers 225 wird zu dem Impulsverlängerer 229 und dem Impulsfüller/Multiplexer 231, 233 übertragen, um den Strahlfluß korrekt einzustellen.
Die Prozedur wird für unterschiedliche Fasern wiederholt. Wo erkranktes Gewebe detektiert wird, wird dieses schnell entfernt. Der Laserkatheter 10 trägt den Plaque ab und läßt die gesunde Arterienwand intakt.
Wenn die Arterie 30 eine Biegung 31 gemäß Darstellung in Fig. 1B macht, berührt der Laserkatheter tendenziell die Arterienwand 32 an der Außenwand der Biegung. Um zu verhindern, daß der Katheter die Arterienwand berührt, wird die optische Faser 20c nicht aktiviert. Die Läsion wird asymmetrisch entfernt. Dieses ermöglicht dem Laserkatheter dem Lumen 39, 39a um die Biegung zu folgen. Somit wird die Arterienwand 32 nicht bestrahlt und nicht perforiert. Zusätzliche Details dieses faseroptischen Katheters sind in dem U.S. Patent Nr. 4,913,142 beschrieben.
Sowohl bei dem Raman- als auch dem ATR-Verfahren ist Information in den Spektrallinien enthalten, welche in ihren Intensitäten beobachtet werden, und auch in deren Linienbreiten und Mittenfrequenzen, (und in deren Veränderung in unterschiedlichen Umgebungen). Ferner weisen Raman- und Infrarot- ATR-Verfahren unterschiedliche "Selektionsregeln" auf. Einige Schwingungen, die im Infrarotbereich zu sehen sind, tauchen im Raman-Spektrum nicht auf und umgekehrt. In anderen Fällen kann dieselbe Schwingung mittels beider Techniken detektiert werden, jedoch mit unterschiedlichen relativen Intensitäten (eine starke Raman-Linie ist beispielsweise in ATR schwach). Somit liefern die zwei Techniken in diesem Sinne komplementäre Information und die Kombination der zwei Techniken (oder die Verwendung einer oder beider zusammen mit Laserinduzierter Fluoreszenz) ist bei der Diagnose des Krankheitsbilds wertvoll.
Die Verfahren können eine Fourier-Transformations-Detektion zur Beobachtung der Strahlen anwenden und dadurch verbessertes Signal/Rausch-Verhältnisse bereitstellen. Weitere Techniken (z. B. Diodenarray-Detektion und CCD-Detektion) können ebenfalls angewendet werden.
Wie nachstehend detaillierter beschreiben, können Beiträge von größeren Gewebebestandteilen "heraussubtrahiert" werden, um die Information von Molekülen aufzudecken, welche nur in kleinen Konzentrationen vorhanden sind. Beispielsweise werden in der ATR Wasserbeiträge entfernt, bevor die "trockenen" Gewebebestandteile untersucht werden können. Ferner wird auch eine ableitende Spektroskopie eingesetzt, um Hintergrundsignale zu eliminieren und niedrige Frequenzen auszufiltern. Man beachte, daß diese Techniken die beobachteten Spektren in ihre individuellen Bestandteile entfaltet, ein wesentlicher Schritt zur optimalen Extraktion der Diagnoseinformation.
Während Raman tief in das Gewebe hinein abtasten kann, tastet ATR nur eine sehr dünne Schicht (einige wenige um) ab. Somit ist ATR "natürlich" zur Sondierung von Oberflächenkrankheiten, wie z. B. der oberflächlichen Krebse der Blase und des Magen-Darmtrakts geeignet, während Raman gut für die Bereitstellung von Information tief innerhalb vom Gewebe (wie z. B. von Brustkrebs oder Steinen) geeignet ist. Dieses ist für eine 3D-Bildgebung wichtig. Ferner kann die ATR-Gewebe- Abtasttiefe durch eine korrekte Anpassung des Sondenoberflächenmaterials auf den Gewebetyp gesteuert werden. Im allgemeinen ist das ATR-Signal sehr empfindlich gegenüber der Oberfläche des Wellenleiters oder der Sonde. Beispielsweise können, wenn die Sondenoberfläche eine Affinität für Lipide in den Geweben aufweist, Lipide zu der Sonnenoberfläche wandern und eine dünne Lipidschicht aufbauen und ein großes Signal erzeugen. Dieses kann ein Problem sein, (es kann eine irreführende Information geben, wenn dieses nicht einwandfrei erkannt und verhindert wird). Umgekehrt kann diese auch als Vorteil genutzt werden. Es können Sonden mit speziellen Oberflächen entwickelt werden, um diesen Effekt zu verhindern oder zu fördern, um bestimmte Substanzen in dem Gewebe zu suchen.
In einem bevorzugten Verfahren kann man die Abtasttiefe durch ATR einstellen, indem man den Brechungsindex der ATR- Sonde verändert. Alternativ kann man, wie nachstehend diskutiert, eine "Wellenleiternadel" verwenden, um eine Information unterhalb der Oberfläche zu erhalten.
Raman-Diagnoseverfahren ermöglichen eine Einstellung der Raman-Tiefe durch Veränderung der Wellenlänge. Die Eindringtiefe ist wellenlängenabhängig und kann durch Wahl unterschiedlicher Anregungswellenlängen zwischen etwa λ = 700 nm und 2 um verändert werden. Eine weitere potentiell wichtige Einstellungsmöglichkeit der Raman-Tiefe besteht in der Veränderung des Sammelwinkels. Im nahen IR wird das einfallende (anregende) Licht stark aus der Vorwärtsrichtung in größere Winkel gestreut, so saß in kleineren Winkel gesammelte Signale aus Gewebe näher an der Oberfläche kommen. Daher kann die Raman-Abtasttiefe in einem großen Umfang durch die Sondenauslegung gesteuert werden.
Die Tiefeninformation ist wichtig, wenn man eine Bildgebung durch Erzeugung von 3D-Abbildungen kleiner Tumore im Gehirn oder in der Brust erzeugen will. Differentialtechniken basierend auf den Ideen des vorstehenden Kapitels können eine genaue Lokalisierung solcher Tumore in drei Abmessungen ermöglichen. Ein Raman-Verfahren im nahen Infrarotbereich kann mit einer Schallwellentechnik (Laufzeit oder in dem Gewebe erzeugten stehenden Wellen) kombiniert werden, wobei die Schallwelle das von einem Punkt in dem Gewebe ausgehende Raman-Signal modulieren würde, wenn es diesen Punkt passiert, und das modulierte Signal zur Feststellung der Tiefe des das Signal erzeugenden Gewebes verwendet werden könnte.
Ein für die Sammlung von Raman-Spektraldaten von herausgeschnittenen Gewebeproben verwendetes System ist in Fig. 1C dargestellt. FT-Raman-Spektren wurden von 0-4000 cm&supmin;¹ unterhalb der Laseranregungsfrequenz mit einem FT-IR-Interferometer 40 gemessen, das mit einem FT-Raman-Zusatz ausgestattet ist. Der Zusatz verwendet bei 180 eine Rückstreuungsgeometrie und einen gekühlten (77K) InGaAs-Detektor 42.
Ein 1064 nm CW Nd : YAG-Laser 44 kann zur Bestrahlung einer Probe 46 verwendet werden, indem 500 mW bis 1 W Laserleistung in einem Punkt von 1,0 bis 2,5 mm bei der Probe 46 zur Sammlung von Raman-Daten verwendet wird. Alternativ kann eine gepulste Laserquelle ebenfalls verwendet werden. Der Laser 44 erzeugt einen Strahl 46 der durch ein Plasmafilter 48, Spiegel 50, 52, eine Fokussierungslinse 54 und Spiegel oder ein Prisma 56 vor der Beleuchtung der Probe 46 geführt wird. Die von der Probe 46 empfangene Strahlung unterliegt verschiedenen Mechanismen von Absorption, Reflexion und Streuung einschließlich der Raman-Streuung. Ein Teil des von dem Gewebe emittierten Lichts wird auf die Linse 60 geleitet, und dann durch ein oder mehrere Rayleigh-Filter 62 geleitet. Die Sammellinse 60 sammelt dieses zurückgestreute Licht 64 und kollimiert es. Die Rayleigh-Filter 62 entfernen das elastisch gestreute Licht und übertragen das inelastisch gestreute, frequenzverschobene (Raman-)Licht. Das Raman-gestreute Licht tritt in das Interferometer 40 ein. Unter diesen Bedingungen wurde keine sichtbare Probenzerstörung beobachtet.
Eine entfernte menschliche Aorta wurde als atherosklerotisches Arteriengewebe gewählt. Die Proben wurden zum Zeitpunkt der Obduktion gewonnen, mit isotonischer Salzlösung (gepuffert bei pH 7,4) gespült in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -85ºC bis zur Verwendung gelagert. Vor der spektroskopischen Untersuchung wurden die Proben passiv auf Raumtemperatur erwärmt und mit der isotonischen Salzlösung feucht gehalten. Normale und atherosklerotische Bereiche des Gewebes wurden durch eine allgemeine Überprüfung identifiziert, getrennt und in etwa 8 · 8 mm Stücke geschnitten.
Die Gewebeproben wurden in eine Suprasil-Quarzküvette mit einer kleinen Menge isotonischer Salzlösung zur Feuchthaltung des Gewebes eingebracht, wobei eine Oberfläche in Berührung stand und mit dem Laser 44 bestrahlt wurde. Die in Fig. 2 bis 6 dargestellten Spektren wurden mit 512 Scans mit 8 cm&supmin;¹ Auflösung (etwa 35 Minuten Gesamtsammlungszeit) gesammelt.
Die menschliche Aorta besteht aus drei unterschiedlichen Schichten: Intima, Media, Adventitia. Die Intima, normalerweise weniger 300 um dick, ist die innerste Schicht und stellt eine nicht thrombogene Oberfläche für den Blutstrom zur Verfügung. Sie besteht hauptsächlich aus Kollagenfasern und einer Grundsubstanz. Die mediale Schicht, typischerweise 500 um dick, ist ziemlich elastisch und dient zur Glättung der pulsierenden Blutströmung aus dem Herzen. Das Strukturprotein Elastin ist die Hauptkomponente der Aortenmedia, wobei aber auch einige glatte Muskelzellen vorhanden sind. Die äußerste, adventitiale Schicht dient als ein Bindegewebenetz, welches das Gefäß lose in seiner Lage verankert, und besteht hauptsächlich aus Lipiden, Lipoproteinen und Kollagen. Während des atherosklerotischen Prozesses verdickt sich die Intima aufgrund einer Kollagenvermehrung und es sammeln sich Fette, nekrotische Ablagerungen unter und innerhalb der kollagenen Intima an, und schließlich baut sich Kalzium auf, was zu Kalziumhydroxyapatitablagerungen in der Arterienwand führt.
Fig. 2a stellt das FT-Raman-Spektrum eines vollständigen Dickenschnittes einer Aorta dar, welche angenähert als normal identifiziert wurde. Die Laserbestrahlung erfolgte auf der intimalen Seite. Die dominanten Bänder erscheinen bei 1669 cm&supmin;¹ und 1452 cm&supmin;¹ und können einer Amid I Hauptketten- und ebenen C-H Biegeschwingung aus Proteinen zugeordnet werden.
Schwächere Bänder bei 1331 und 1255 cm&supmin;¹ werden der C-H Schwenkbewegung und Amid III Schwingungen aus Proteinen zugeordnet. Die Frequenzen von Amid I und III sind mit den bei erkrankten Proteinen beobachteten konsistent.
Ein weiteres Beispiel eines typischen NIR FT-Raman-Spektrums einer normalen Aorta ist in Fig. 3 dargestellt. Von der intimalen Seite aus bestrahlt, Fig. 3a, sind die größeren in einer normalen Aorta beobachteten Schwingungsbänder alle Proteinschwingungen zuzuordnen: das Band bei 1658 cm&supmin;¹ ist der Amid I Schwingung der Polypeptidkette zugeordnet, das 1453 cm&supmin;¹ Band ist einem CH-Biegemodus von Proteinen zugeordnet, und das 1252 cm&supmin;¹ Band ist der Amid III Schwingung zugeordnet. Das Spektrum einer normalen Aorta ist mindestens 25% schwächer als das aller pathologischen Proben. Die Spitzenfrequenz des C-H Biegebandes, welche für alle normalen Proben durchschnittlich 1651±1 cm&supmin;¹ ist für den Protein C-H Biegemodus spezifisch (Siehe nachstehend). Das schwache Band in der Nähe von 1335 cm&supmin;¹, welches als eine Schulter in vielen von den normalen Proben auftritt, scheint für das Elastin spezifisch zu sein, und das schwache Band bei 1004 cm&supmin;¹ beruht wahrscheinlich auf Phenylalaninrückständen. Im allgemeinen erscheinen die relativen Intensitäten der Bänder in dem Bereich zwischen 1250 und 1340 cm&supmin;¹ sehr ähnlich denen, die in dem FT- Raman-Spektrum von Elastin beobachtet werden. Diese Beobachtung ist mit der dünnen kollagenen Intima in der normalen Aorta, der elastischen Natur der Media der Aorta und der tiefen Eindringtiefe der 1064 nm Strahlung konsistent. Bandzuordnungen für alle hierin dargestellten Gewebearten sind in der Tabelle 2 aufgelistet.
Fig. 3b stellt das NIR-Raman-Spektrum der adventitialen Seite einer normalen Aorta dar. In diesem Falle bestand die bestrahlte adventitiale Oberfläche aus einigen mm sichtbaren adipösen Gewebes. Im Gegensatz zu dem von der intimalen Seite gesammelten Spektrum erscheinen die in diesem adipösen Material beobachteten Bänder hauptsächlich auf Lipid und insbesondere Triglycerid, und nahezu keinem Beitrag von Protein zu beruhen. Dieses ist nicht unerwartet, da der Triglyceridanteil des adipösen Gewebes in der Größenordnung von 60% liegt. Das steile Band bei 1655 cm&supmin;¹ beruht auf der Streckung von C=C Gruppen in ungesättigten Fettsäureketten. Dieses Band wird von Amid I durch seine Spitzenfrequenz und seine Breite unterschieden, welche in diesem Falle 17 cm&supmin;¹ FWHM ist. Das Amid I Band ist im Gegensatz dazu angenähert 60 cm&supmin;¹ breit. Das dominante C-H Biegeband ist charakteristisch für Lipide auf 1440 cm&supmin;¹ verschoben. Dieses Band ist in adipösem Gewebe etwa 3-mal so intensiv wie in der normalen Intima, wahrscheinlich eine Folge der größeren Anzahl von C-H Gruppen pro Volumeneinheit in den Triglyceriden. Die Bänder bei 1301/1267 cm&supmin;¹ und 1080 cm&supmin;¹ sind C-H Biege- bzw. C-C Streckschwingungen von Fettsäuren zugeordnet.
Das dem C=O Streckmodus von Triglyceridester-Verbindungen zugeordnete 1746 cm&supmin;¹ Band zeigt, daß der größte Teil des in dem adventitialen Gewebe beobachteten Lipids in Form von Triglycerid vorliegt. Insbesondere ist die integrierte Intensität dieses Bandes im Bezug auf das C-H Biegeband bei 1440 cm&supmin;¹ gleich 0,103, während dasselbe Verhältnis für Triolein 0,136 ist, was anzeigt, daß angenähert 75% des C-H Bandes auf Triglycerid beruhen. Das NIR FT-Räman-Spektrum von Triolein (ein Triglycerid, das Fettsäureketten mit 18 Kohlenstoff- und einer einzelnen Doppelbindung enthält) ist zum Vergleich in Fig. 3c dargestellt. Zusätzliche molekulare Information bezüglich des Zustands der Fettsäureketten ist leicht von dem adventitialen adipösen Spektrum abzuleiten. Beispielsweise zeigt die relative Intensität des C=C Bandes bei 1655 cm&supmin;¹, daß im Durchschnitt etwa 0,7 ungesättigte Doppelbindungen pro Fettsäurekette vorhanden sind, wenn 16 bis 18 Kohlenstofffettsäuren angenommen werden. Zusätzlich lassen die Frequenzen und Strukturen der C-H Biege- und C-C Streckbänder vermuten, daß sich die meisten der Fettsäureketten sich in der windschiefen (gauche) Konfiguration befinden. Das steile 1129 cm&supmin;¹ Band, das für all-trans-Ketten charakteristisch ist, wird in dem Spektrum nicht beobachtet.
Das von einer erkrankten Arterie, einem atheromatösen Plaque, mit einer dicken fibrösen Bindegewebsabdeckung und einem darunter liegenden nekrotischen Kern erhaltene FT- Raman-Spektrum ist in Fig. 2 dargestellt. Der nekrotische Kern eines atheromatösen Plaques enthält Zelltrümmer, sowie große Ansammlungen von oxidierten Lipiden und Cholesterol. Das Band in dem Amid I Bereich mit der Spitze bei 1665 cm&supmin;¹ ist in diesem Spektrum im Vergleich zur normalen Aorta deutlich schmäler. Zusätzlich ist die ebene C-H Biegeschwingung bei 1444 cm&supmin;¹ relativ intensiver und weist eine erkennbare Schulter bei einer höheren Frequenz auf. Die zwei schwächeren Bänder bei 1307 und 1267 cm&supmin;¹ sind in der Frequenz von dem in einer normalen Aorta gefundenen Spektrum verschoben. Die Bandfrequenzen und Formen in dem in Fig. 2 dargestellten FT- Raman-Spektrum von Cholesterol stimmen mit einigen von denen überein, die in dem atheromatösen Plaque beobachtet werden, was mit der erwarteten Zusammensetzung des nekrotischen Kerns konsistent ist.
Die NIR FT-Raman-Spektren weiterer fibröser Plaqueproben weisen einen Bereich von Merkmalen gemäß Darstellung in Fig. 4 und 5 auf. Fig. 4a stellt ein repräsentatives Spektrum von einem Typ fibröser Beläge dar. Diese Spektren von fibrösem Plaque ähneln sowohl hinsichtlich ihrer relativen als auch absoluten Bandintensitäten den Spektren einer normalen Aorta ziemlich. Die deutlichsten Unterschiede bestehen darin, daß das C-H Biegeband, das im Mittel bei 1448 cm&supmin;¹ eine Spitze aufweist, um 2 cm auf eine etwas niedrigere Frequenz verschoben ist. Dieses kann das Ergebnis eines kleinen Anstiegs im Lipidgehalts dieser Plaques in Bezug auf eine normale Aorta sein. Zusätzlich ist das Band in der Nähe von 1340 cm&supmin;¹, das dem Elastin in der normalen Aorta zugeordnet ist, in Bezug auf das Amid III bei 1265 cm&supmin;¹ verkleinert. Die mutmaßliche Erklärung ist, daß die kollagene Intima in diesen Proben verdickt ist, so daß der spektrale Beitrag aus der elastischen Media in Bezug auf den der normalen Aorta verringert ist.
Die NIR FT-Raman-Spektren weiterer fibröser Plaqueproben schienen den Spektren (Fig. 2) atheromatöser Plaques ähnlich zu sein. Diese unterscheiden sich wesentlich entweder von der normalen Aorta oder adipösen Gewebe. In diesen Fällen erscheint das intensive C-H Biegeband bei 1440 cm&supmin;¹, das für lipides Material charakteristisch ist. Dieses Band ist angenähert zweimal so intensiv wie das C-H Biegeband in der normalen Aorta. Das vollständige Fehlen eines Bandes bei 1746 cm&supmin;¹ zeigt, daß dieses Lipid kein Triglyzerid ist. In der Tat scheint dieses Lipid vorherrschend aus Cholesterolen, identifiziert durch das steile, charakteristische Band bei 700 cm&supmin;¹ und den Vergleich mit dem in Fig. 4c dargestellten Cholesterolspektrum, zu bestehen. Wiederum ist dieses nicht überraschend, da sich Cholesterole in hohen Konzentrationen in atherosklerotischen Läsionen akkumulieren, Einige von den Bändern zwischen 1000 und 500 cm&supmin;¹ sind Schwingungsmoden der Sterolringe zuzuordnen. Zu diesen zählen die Bänder bei 959, 882, 844, 805, 700, 605 und 546 cm&supmin;¹. Zusätzlich ist das 1666 cm&supmin;¹ Band zum Teil der C=C Streckschwingung des Steroidnucleus zugeordnet.
Das Vorhandensein von Fettsäureketten in dem atheromatösen Plaquespektren wird durch Bänder bei 1300/1262 cm&supmin;¹ und 1130/1088 cm&supmin;¹ aufgrund von C-H Biege- bzw. C-C Streckschwingungen bewiesen. Diese Bänder können auch Beiträge von Cholesterol enthalten. Die relativen Intensitäten des Fettsäurebandes bei 1300 cm&supmin;¹ und des Sterolbandes lassen ein Gemisch von freiem Cholesterol und Colesterol/Fettsäure-Estern vermuten. Ferner zeigen die relativen Intensitäten der 1130 cm&supmin;¹ C-C Streck- und der 700 cm&supmin;¹ Sterolbänder an, daß sich der Großteil der Fettsäureketten in der windschiefen Konfiguration befinden, was mit dem Vorherrschen ungesättigter Fettsäureketten in den Cholesterolestern dieser Plaques konsistent ist. Es ist insbesondere bei den atheromatösen Plaques bemerkenswert, daß die Cholesterolablagerungen durch Material unter einer dicken fibrösen Abdeckung detektiert wird, was die Fähigkeit des NIR FT-Raman-Verfahrens zeigt, Materialien einige hundert um unter der Gewebeoberfläche zu sondieren.
Zusätzlich zu den Cholesterol- und Cholesterolesterbändern enthielten die NIR FT-Raman-Spektren von einigen fibrösen Plaques zwei einzigartige Bänder bei 1519 und 1157 cm&supmin;¹. Die Intensitäten dieser Bänder sind stark korreliert, was die Vermutung nahelegt, daß sie auf einer einzigen Komponente beruhen. Diese Bänder, welche bereits in sichtbar erregten Ramen-Spektren von atherosklerotische Plaques beobachtet wurden, sind Karotinoiden zugeordnet. Die Menge von Karotinoiden in diesen Plaques ist wahrscheinlich wesentlich kleiner als die Mengen von Cholesterolen oder Proteinen, kann aber aufgrund einer Vör-Resonanz stark verstärkt sein (14). Die Karotinoidbänder werden nur in dieser Untergruppe von fibrösen Plaques beobachtet.
In einem fortgeschrittenen Plaque kann eine Akkumulation von Kalzium beginnen, was zu der Ausbildung von Kalziumhydroxyapatit-Kristallen in dem Gewebe gemäß Darstellung durch die Spektren von Fig. 5 und 6 führt. Das FT-Ramän-Spektrum von kalzifiziertem Plaque mit einer über einer kalzifizierten Ablagerung liegenden (einige hundert um) dicken fibrösen Bindegewebsabdeckung ist in Fig. 5a dargestellt. Das Spektrum zeigt deutlich Bänder bedingt durch das Protein in der fibrösen Abdeckung, und zwar Amid I und III bei 1665 bzw. 1255 cm&supmin;¹. Es werden jedoch zusätzliche Bänder zwischen 1250 und 1350 cm&supmin;¹ und um 1100 cm&supmin;¹ herum, sowie ein eindrucksvoll steiles Band bei 961 cm&supmin;¹ beobachtet. Das letztere ist leicht der symmetrischen Phospat-Streckschwingung zuzuordnen, welche Phosphatgruppen in dem Kalziumhydroxyapatit-Ablagerungen zugeordnet ist, während das Band um 1100 cm&supmin;¹ eine asymmetrische Phosphatstreckung ist. Diese Zuordnungen wurden durch das Herausschneiden des festen "Steins" aus einem unterschiedlich kalzifizierten Plaque und Erzeugen dessen Spektrums gemäß Darstellung in Fig. 5b bestätigt. Ein starkes Raman-Signal aus der Phosphatstreckschwingung in festen Kalzifikationen in fortgeschrittenen atherosklerotischen Plaques kann auch unter Verwendung einer standardmäßigen Raman-Meßgeräteausrüstung im sichtbaren Bereich beobachtet werden. Die Fähigkeit die Kalzifikationen einige hundert um unter der Gewebeoberfläche unter Anwendung der FT-Raman-Spektroskopie in nahen IR-Bereich zu detektieren, ist jedoch eine diagnostische Messung, welche zur Steuerung der Behandlung genutzt werden kann.
Es wurde ein Meßversuch unternommen, um zu ermitteln, ob die Kalzifikation auch detektiert werden könnte, wenn das Gewebe von der adventitialen Seite bestrahlt wird. Das sich ergebende FT-Raman-Spektrum ist in Fig. 5c dargestellt. Es ist kein Beweis für die starke Phosphatschwingung vorhanden. Im Gegensatz dazu werden steile Schwingungsbänder bei 1745, 1656, 1444, 1303, 1267, und 1082 cm&supmin;¹ beobachtet, welche hauptsächlich dem Lipidmaterial zugeordnet sind, das den Großteil der Adventitia bildet.
Das NIR FT-Raman-Spektrum von kalzifiziertem Plaque, welcher eine unter der Oberfläche liegende kalzifizierte Ablagerung und eine darüberliegende weiche fibröse Abdeckung enthält, zeigt ein intensives, steiles neues Band bei 960 cm&supmin;¹ (Fig. 6a). Dieses Band, das für kalzifiziertes Gewebe spezifisch ist, ist der symmetrischen Streckschwingung von Phosphatgruppen (15) zugeordnet, welche in hohen Konzentrationen in den festen Kalziumsalzen vorhanden sind. Die schwächere antisymmetrische Phosphatstreckung ist ebenfalls bei 1072 cm&supmin;¹ vorhanden. Eine symmetrische Streckschwingung von Karbonatgruppen kann ebenfalls zu diesem letzteren Band beitragen. Die Phosphatschwingungen sind leicht von Ablagerungen unterhalb der Oberfläche in den kalzifizierten Plaques zu beobachten; das 960 cm&supmin;¹ Band kann bei dem derzeitigen Signal/Rausch- Pegel (siehe nachstehend) von Ablagerungen bis zu 1,5 mm unter der weichen Gewebeabdeckung beobachtet werden. Der kalzifizierte Plaque zeigt auch Proteinschwingungen aus der fibrösen Gewebeabdeckung. Diese enthalten Bänder von Amid I bei 1664 cm&supmin;¹ und Amid II in der Nähe von 1257 cm&supmin;¹. Das C-H Biegeband bei 1447 cm&supmin;¹ läßt eine Mischung von Protein und Lipid vermuten, und das schwache Band bei 699 cm&supmin;¹ beruht wahrscheinlich auf Cholesterol, das entweder in der fibrösen Abdeckung, in der kalzifizierten Ablagerung oder in beiden vorliegt.
Die NIR FT-Raman-Spektren offenliegender Kalzifikationen (Fig. 6b) zeigen einen Bereich von Merkmalen. In allen Fällen beruhen die Hauptbänder auf Kalziumsalzen. Zu diesen zählen die 960 cm&supmin;¹ Phosphat- und 1072 cm&supmin;¹ Phosphat/Karbonat-Bänder sowie das Band bei 587 cm&supmin;¹, welches einem weiteren Phospatschwingungsmodus zugeordnet ist. Andererseits sind mehrere Unterschiede in den schwächeren Bänder erkennbar, welche wahrscheinlich auf weichen Gewebekomponenten beruhen, die der Kalzifikation eingelagert sind. In einigen (nicht dargestellten) Fällen erscheint das C-H Band bei 1450 cm&supmin;¹ und das Band bei 1663 cm&supmin;¹ ist für einige von den Kalzifikationen, die Proteinschwingungsmoden anzeigen, von der Form her dem Amid I ähnlich. In weiteren kalzifizierten Plaques, wie z. B. dem in Fig. 5b, tritt das C-H Biegeband bei 1440 cm&supmin;¹ auf, und das 1667 cm&supmin;¹ Band, welches wesentlicher steiler ist, beruht wahrscheinlicher auf C=C Streckschwingungen. In diesem Plaque beruhen die Bänder auf Lipid, insbesondere Cholesterolen, wie es durch die 700 cm&supmin;¹ und 1300 cm&supmin;¹ Bänder bewiesen wird.
In unseren histologischen Untersuchungen der Aorta wurden zwei unterschiedliche Typen offenliegender Kalzifikationen erkannt. In dem einen Typ ist die fibröse Gewebeabdeckung kalzifiziert. In dem anderen ist der nekrotische Kern eines atheromatösen Plaques kalzifiziert, und die kalzifizierte Ablagerung durch Ulzeration der weichen Gewebeabdeckung offengelegt. Eine positive Erklärung für die zwei Spektrumstypen offenliegender Kalzifikationen besteht darin, daß die Proben, welche Proteinbänder zeigen, von ersterem histologischen Typ sind, während die Proben, welche Lipidbänder zeigen, von letzteren Typ sind.
Die vorliegenden Verfahren stellen eine IR FT-Raman-Technik zur Differenzierung verschiedener Stadien der Atherosklerose in der menschlichen Aorta bereit. Sie demonstrieren, daß Information auf molekularer Ebene unter Anwendung dieser Verfahren verfügbar ist. Diese Information ist für die Verfolgung der Pathogenese der Krankheit und die Steuerung der Behandlung unterschiedlicher Läsionen nützlich. Das FT-Raman- Verfahren in nahen Infrarotbereich, welches eine relativ tiefe Eindringtiefe aufweist, ist in der Lage, spektroskopische Signale aus einem Bereich unter der Gewebeoberfläche zu erzielen, was Details über das atheromatöse nekrotische Gewebe und Kalzifikationen unter der Oberfläche liefert. Diese Signale können mittels Bildgebungssystemen auf der Basis optischer Fasern genutzt werden, um den Anteil und die Zusammensetzung von unterschiedlichen atherosklerotischen Plaques in vivo zu ermitteln.
Mit der Beobachtung, daß einige von den in dem atherosklerotischen Prozeß wichtigen biochemischen Spezies, die Cholesterol und Kalziumhydroxyapatit mit umfassen, leicht unter der Gewebeoberfläche detektiert werden können, wollten wird die Tiefengrenze der Detektion bei Anwendung der NIR FT- Raman-Technik ermitteln. Zur Bearbeitung dieser Frage wurden zehn 200 um dicke Abschnitte aus der Aortenmedia geschnitten und jeweils über eine große kalzifizierte Ablagerung (6 · 6 · 3 mm) gelegt und die FT-Raman-Spektren des 960 cm&supmin;¹ Bandes als ein Funktion der Tiefe unter der Oberfläche beobachtet. Wie durch die in Fig. 7 dargestellte Kurve der FT-Raman-Intensität abhängig von der Tiefe angezeigt, war das Signal von der kalzifizierten Ablagerung detektierbar, solange die Ablagerung weniger als 1,6 mm unter der bestrahlten Oberfläche lag. Sogar etwas tiefere Tiefen konnten sondiert werden, wenn der Fokus der Sammeloptik in das Gewebe verlegt wurde.
Die zweidimensionale Auflösung des NIR FT-Raman-Signals für Material unterhalb der Gewebeoberfläche wurde dann getestet, indem 1 mm Aortenmediagewebe über einem weiteren kalzifizierten Abscheidungsmaterial plaziert wurde und das Gewebe quer in zwei Dimensionen quer zum Laserstrahl und der Sammellinse bewegt wurde. Es wurde beobachtet, daß das FT-Raman- Signal rasch abfiel als der Strahl und die Sammeloptik sich von der kalzifizierten Ablagerung weg bewegte. Das detektierte FT-Raman-Signal folgte der Geometrie der kalzifizierten Ablagerung unter der Oberfläche trotz der erheblichen Streuung der darüberliegenden Gewebeschicht genau. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, daß das Raman-gestreute Licht für die Bildgebung von Objekten unterhalb der Gewebeoberfläche mit minimaler Bildverwischung aufgrund elastischer Streuung in dem Gewebe verwendet werden kann.
Es wird auch ein zweites spektroskopisches Verfahren zur Erzielung einer molekularen Schwingungsinformation, die abgeschwächte Totalreflexion (ATR- Atttenuated total reflective) von Infrarotlicht angewendet.
Die menschliche Aorta wurde als ein Beispiel zur Darstellung der Diagnose einer atherosklerotischen Arteriengewebes gewählt. Wie bei den für die Raman-Spektralmessungen erhaltenen Proben wurden menschliche Aortaproben für die ATR- Messungen zum Zeitpunkt der Obduktion erhalten. Die Probenlagerungs- und Vorbereitungsprozeduren sind mit den für die Raman-Spektralmessungen beschriebenen identisch. Diese Reflexionsmessungen können durch sich selbst verwendet werden, um diagnostische Daten in Verbindung, entweder mit den vorstehend beschriebenen Raman-spektroskopischen Messungen oder mit Fluoreszenzmessungen oder mit beiden Meßarten zu erzeugen, um die Diagnose für spezielle Anwendungen zu verbessern.
Die Mediaschichten einer normalen Arterie und die nekrotischen Kerne von atheromatösen Plaques wurden durch stumpfe Sezierung freigelegt und spektroskopisch untersucht. ATR- Spektren wurden auch von einigen gereinigten Gewebekomponenten, einschließlich Kollagen, Elastin und Cholesterol gesammelt, um zur Analyse der Spektren beizutragen.
ATR-Spektren im mittleren Infrarot wurden von 4000 bis 7000 cm&supmin;¹ mit einem im Handel erhältlichen FT-IR-Spektrometer und einem horizontalen ATR-Zusatzgerät gemessen. Der Probenbereich wurde mit trockenem Stickstoffgas gespült, um die Hintergrundabsorption von atmosphärischem Wasserdampf und CO&sub2; zu kontrollieren. Die Spektren wurden mit einer Auflösung von 4 cm&supmin;¹ über 50 Scans gesammelt. Die physiologisch mit isotonischer Salzlösung (gepuffert bei pH 7,4) feucht gehaltenen Arterienproben wurden mit dem ATR-Element (ZnSe-Kristall 45 Enden) in Kontakt gebracht. Ein auf der Gewebeprobe plaziertes Gewicht von 5 Gramm stellte einen gleichmäßigen Probenkontakt mit dem ATR-Element sicher. Ein ATR-Spektrum der Salzlösung mit einem Absorptionsmaß ähnlich der der Arterienproben wurde ebenfalls erhalten und zur Subtraktion wasserbedingter Spektralkomponenten verwendet. Kollagen (Calbiochem: Typ I, Rinderachillessehne) und Elastin (Sigma: Rindernackenkreuzband) wurden als Salzlösungsaufschlämmungen hergestellt. Cholesterol (Sigma) wurde als ein Trockenfilm auf dem ATR-Element durch Aufdampfung einer Benzollösung erzeugt. Diese Elemente können deutlich in den sich ergebenden Spektren identifiziert werden.
Der ATR-Abtastkristall ist ein Stab mit hohem Brechungsindex, welcher als ein Wellenleiter für den infraroten Abtaststrahl dient. Dieser Wellenleiter kann in der Form einer Nadel vorliegen, die für ein Eindringen in das zu untersuchende Gewebe angepaßt ist. Alternativ weist die Sonde eine Geometrie auf, wie für die Berührung der Oberfläche offenliegender Gewebestellen, oder für die Berührung interner Stellen mit einem Katheter geeignet ist.
Die in Fig. 16A und 16B dargestellten Vorrichtungen veranschaulichen Sonden, die für ATR-Diagnosemessungen innerhalb des menschlichen Körpers angepaßt sind. In Fig. 16A ist eine einendige Sonde 100 dargestellt, in welcher eine oder mehrere optische Fasern 102 sowohl das einfallende Licht zu dem ATR- Element 104 hin, als auch das übertragene (reflektierte Licht) abführen. Ein 100% Infrarot-Reflektor 106, wie z. B. Gold, ist an der distalen Oberfläche 108 des ATR-Elements 104 angeordnet, und hat die Funktion, das übertragene Licht durch dieselbe Faser zurückzuführen, sowie auch eine Doppeldurchtrittsabtastung bereitzustellen. Das ATR-Element 104 kann eine getrennte Komponente sein, die optisch an den optischen Fasern 102 befestigt ist, oder kann alternativ aus dem Ende der optischen Faser aufgebaut sein, indem das Mantelmaterial entfernt ist. Eine Abtastung wird erzeugt, indem das ATR- Element mit dem interessierten Gewebe 110 in Kontakt gebracht wird. Die Strahlung wird ausgesendet 112 und in einer radialen Richtung von dem Element 104 gesammelt 114. Die Sonde kann entweder über ein Standard-Endoskop oder einen Katheter eingeführt werden, um ein Hohlorgan abzutasten oder, wenn sie mit einer ausreichend dünnen optischen Faser hergestellt wurde, in ein festes Organ wie in dem Falle einer Nadelbiopsie eingeführt werden. In dieser speziellen Ausführungsform liegt die distale Spitze 108 in der Form einer Nadel vor. Die Konus- oder Nadelkonfiguration an dem des Katheters kann lang oder flach sein.
Eine doppelendige Sonde ist in Fig. 16B dargestellt. Der einfallende IR-Strahl aus dem FT-IR wird über die IR-optische Faser 122 zu dem ATR-Element 128 übertragen, das an dem distalen Ende des Katheterkörpers 120 angeordnet ist. Das ATR- Element wird mit der zu abzutastenden Gewebeoberfläche 126 in Kontakt gebracht. Das übertragene Licht wird durch eine zweite IR-optische Faser 124 zu einem IR-Detektor zurückgeleitet. Das ATR-Element kann eine getrennte Komponente sein, die optisch an den zwei optischen Fasern 122, 124 befestigt ist, oder es kann einfach ein Bereich einer einzelnen optischen Faser sein, in welcher das Fasermantelmaterial entfernt worden ist. Die gesamte Vorrichtung kann über ein Standard- Endoskop oder einen Außenkatheter eingeführt werden.
Bei Verfahren zur Messung herausgeschnittener Proben wird die zu untersuchende Probe mit der Oberfläche des Wellenleiters oder des ATR-Elements in optischen Kontakt gebracht. Die abklingende Welle, welche sich außerhalb der Wellenleiteroberfläche erstreckt, wird von der Probe proportional zu ihrem Absorptionskoeffizienten absorbiert. Die Eindringtiefe der abklingenden Welle in die Probe hängt von der Wellenlänge der infraroten Strahlung und den Brechungsindizes des Wellenleiters und der Probe ab; für eine ZnSe/Wasser-Schnittstelle beträgt diese Tiefe angenähert 1 um von 1800 bis 700 cm&supmin;¹. Die 1/e-Eindringtiefe der abklingenden Welle in die Probe ist durch λ/π(nzsin²θ-nw²)n gegeben, wobei λ die Wellenlänge, θ der Einfallswinkel und nz und nw die Brechungsindizes von ZnSe bzw. Wasser sind. Demzufolge wird nur Gewebe, das in gutem Kontakt mit dem ATR-Element steht, abgetastet. Zusätzlich können einzelne Komponenten in der Probe unterschiedliche Affinitäten zu den Wellenleitermaterial (ZnSe in diesem Falle) aufweisen, welche die relativen Konzentrationen der Komponenten an der Wellenleiteroberfläche beeinflussen können. Trotz relativ hoher Konzentrationen in dem Volumengewebe können Komponenten mit schlechtem optischen Kontakt in dem ATR- Spektrum schwierig zu messen sein.
Fig. 8 stellt FT-IR ATR-Spektren von (a) einer normalen Aorta (intimale Seite) und (b) einer gepufferten Salzlösung dar. Ein Vergleich dieser Spektren zeigt, daß ein Großteil der IR-Absorption der normalen Intima Wasser zugeordnet werden kann, welches angenähert 80 Gewichtsanteile des Gewebes bildet. Die großen, breiten Bänder mit Spitzen bei 3300 cm&supmin;¹ und 1636 cm&supmin;¹ beruhen auf den O-H Streck- bzw. H-O-H Biegeschwingungen von Wasser, und das schwache Band bei 2120 cm&supmin;¹ beruht auf einer Wasserkombinationsschwingung. Die 3300 cm&supmin;¹ und 1636 cm&supmin;¹ Bänder enthalten auch Beiträge von der N-H Streck- und Amid I Schwingung. Die relativ flache Absorption zwischen 1500 und 900 cm&supmin;¹ und die ansteigende Absorption unterhalb 900 cm&supmin;¹ beruht ebenfalls hauptsächlich auf Wasser; wobei jedoch in der Intima eine Anzahl sehr schwacher Bänder aufgrund anderer Gewebekomponenten ebenfalls in diesem Bereich vorhanden sind.
Die meisten Biomoleküle lassen die IR-Absorptionsbänder zwischen 1800 und 700 cm&supmin;¹ ansteigen, was als der "Fingerabdrucksbereich" oder primäre Absorptionsbereich bekannt ist. Die dominante Absorption von Gewebewasser in diesem Bereich verdeckt die Absorptionsbänder von anderen Gewebekomponenten. Um die IR-Bänder von diesen Konzentrationen zu beobachten, muß man die Wasserbeeinflussung eliminieren. Bei dem ATR- Verfahren ist die spektrale Entfaltung oder Subtraktion der Wasserkomponente besonders einfach. Durch die Verwendung des 2120 cm&supmin;¹ Bandes, welches ausschließlich auf Wasser beruht, als interner Intensitätsstandard kann das Spektrum der gepufferten Salzlösung (Fig. 8b) genau und zuverlässig von dem Spektrum der Aortenintima (Fig. 8a) subtrahiert werden, was ein Wasser-subtrahiertes Spektrum der Intima (Fig. 9a) ergibt.
In dem Wasser-subtrahierten Spektrum können die zuvor schwachen Bänder leicht beobachtet werden. Die Bandzuordnungen auf der Basis der Spektren der Hauptgewebekomponenten sind in Tabelle I aufgelistet. Tabelle I. Vorläufige Zuordnungen von IR-Absorptionsspitzen in den ATR-Spektren einer normalen Aortenintima Tabelle II Spitzenfrequenzen selektierter Bänder in einer normalen und atherosklerotischen Aorta
Spitzenfrequenzen von typischen Proben, auf ±1cm&supmin;¹ genau. Abkürzungen: vs = sehr starke, s = starke, m = mittlere und w = schwache Bandintensität. * Adventitiaprobe ist hauptsächlich adipöses Gewebe.
Der Großteil der in dem Spektrum der normalen Intima beobachteten Schwingungsbänder (Fig. 9a) kann in zwei breite Kategorien eingeteilt werden: Lipid-zugeordnete Bänder und Protein-zugeordnete Bänder. Alle von diesen starken Bändern in der normalen Intima sind einer von diesen Gruppen zugeordnet (siehe Tabelle I). Dieses kann als eine einfache Folge der großen Konzentrationen dieser zwei Materialien gesehen werden. Abgesehen von dem Wasser kann ein großer Anteil des Gewebes in eine von diesen zwei Gruppen eingeteilt werden. Ferner enthalten sowohl Protein- als auch Lipidkomponenten sich wiederholende molekulare Einheiten, welche allen Elementen der Gruppe gemeinsam sind. Für Protein ist die Polypeptidhauptkette sich wiederholender Amidgruppen das dominante Element. In Lipiden ist die sich wiederholende Kohlenwasserstoffkette die definierende Qualität. Das Endergebnis besteht darin, daß diese molekularen Einheiten in sehr großen Konzentrationen vorhanden sind, und deren Schwingungsbänder das Spektrum tendenziell dominieren. Man beachte, daß dieses nicht bedeutet, daß keine weiteren Detailpegel aus dem IR- Spektrum des Gewebes ableitbar sind. Beispielsweise sind die Frequenzen der Amidgruppenschwingungen gegenüber der Proteinkonfiguration und -konformation empfindlich. Daher kann erwartet werden, daß Verschiebungen im Proteinaufbau beobachtbare Veränderungen in den Amidbändern erzeugen.
Das in Fig. 9b deutlicher dargestellte Wassersubtrahierte Spektrum von subadventialem Fett, veranschaulicht die Unterteilung der Bänder in Lipid- und Nicht-Lipid-Kategorien. Dieses Fett kann als ein Modell der Lipidkomponente betrachtet werden. Proteinbeiträge, erkannt aus den Intensitäten der Amid I und II Bänder sind für die Zwecke dieses Modells vernachlässigbar. Alle in dem Fettspektrum beobachteten Bänder können der Lipidkomponente zugeordnet werden. Zu diesen zählen die starken Bänder bei 1744 cm&supmin;¹ (C=O Streckung), 1465 cm&supmin;¹ (C-H Biegung), 1161 cm&supmin;¹ (CH&sub2; Schwenkung, C-O-C Streckung), sowie die schwächeren Bänder bei 1378 cm&supmin;¹, 1329 cm&supmin;¹, 1118 cm&supmin;¹, 1099 cm&supmin;¹, 966 cm&supmin;¹ und 722 cm&supmin;¹.
Die in dem Wasser-subtrahierten Spektrum der Intima beobachteten Bänder stellen weniger als 30% der Gesamtabsorption dar, während der Rest auf Wasser beruht. Alle Schlußfolgerungen bezüglich dieser schwachen Bänder hängen kritisch von der Genauigkeit der Wassersubtraktion ab. Die Genauigkeit dieser Subtraktion kann aus der Reproduzierbarkeit der Spektren bewertet werden, die nacheinander von derselben Probe erhalten werden. Zwei aufeinanderfolgende Wasser-subtrahierte Spektren, die in einem Abstand von 10 Minuten von einer Probe einer normalen Aorta (intimale Seite) gesammelt wurden, sind in Fig. 10a (durchgezogene und unterbrochene Kurven) dargestellt. Die meisten IR-Bänder zeigten einen erheblichen Anstieg des Absorptionsmaßes mit der Zeit. Dieser Trend setzt sich für nachfolgende Spektren fort, die mehr als eine Stunde nach der Plazierung der Probe auf dem ATR-Element gesammelt wurden. Es verändern sich aber nicht alle Bänder um denselben Anteil, so daß sich die relativen Intensitäten zwischen aufeinanderfolgenden Spektren unterscheiden. Beispielsweise ist in Fig. 10a das C=O Band bei 1744 cm&supmin;¹ relativ konstant, während die Amidbänder bei 1650 cm&supmin;¹ und 1547 cm&supmin;¹ um 50% in dem letzteren Spektrum ansteigen. Obwohl diese Veränderungen anzuzeigen scheinen, daß die Wassersubtraktion ungenau ist, sind die zeitlichen Veränderungen systematisch und vorhersagbar, was die Vermutung nahelegt, daß sich der optische Kontakt zwischen der Probe und dem das ATR-Element regelmäßig mit der Zeit verändert.
Tatsächlich zeigen die Konstanz des 1744 cm&supmin;¹ C=O Bandes, welches allein auf Lipid beruht, und die Anstiege in den Amidbändern, welche auf Protein beruhen, an, daß die Lipidbeiträge zu der IR-Absorption unverändert bleiben, während die Nicht-Lipidbeiträge zwischen aufeinanderfolgenden Scans ansteigen. Dieses wird durch die Subtraktion des Spektrums von Lipid (Fig. 9b) von den Wasser-subtrahierten Spektren der Aortenintima (Fig. 10a) unter Verwendung des 1744 cm&supmin;¹ Bands zur Normierung bestätigt. Die sich ergebenden Lipid-subtrahierten Spektren der Aortenintima sind auf das Spitzenabsorptionsmaß normiert in Fig. 10b dargestellt. Wie man sehen kann, sind die relativen Spitzenabsorptionsmaße und spektralen Bandformen in den Lipid-subtrahierten Spektren gut reproduzierbar, was die Genauigkeit sowohl der Wasser- als auch der Lipid-Subtraktionsprozeduren widerspiegelt.
Die Konstanz der Lipidbänder und die Variation der Nicht- Lipidbänder kann etwas verwirrend erscheinen. Eine Erklärung dieser offensichtlichen Anomalie kann aus einem Wassersubtrahierten Spektrum einer Salzlösung abgeleitet werden, welche von der Oberfläche des Gewebes abgespült wird (Fig. 9c). Dieses Spektrum stimmt neben dem schwachen Amid I und II Bändern ziemlich gut mit dem von adventitialen Fett überein. Die in diesem Gewebe beobachteten Lipidkomponenten scheinen auf freien Lipidpartikeln zu beruhen, die in einem Gleichgewichtszustand mit dem Gewebeoberflächenwasser stehen und einen dünnen Wasser/Lipid-Film auf der Gewebeoberfläche bilden, welcher unmittelbar nach der Plazierung der Gewebeprobe auf dem Kristall in einem vollen optischen Kontakt mit dem ATR- Element steht. Die Gewebekomponenten unterhalb dieses Films erreichen vermutlich einen besseren optischen Kontakt mit dem ATR-Kristall, wenn sich die Probe anpaßt. Demzufolge kann der Anteil von Lipid in einem Spektrum der Aortenintima oder - media von dem Vorhandensein von subadventialem Fett in der Probe beeinflußt werden, und die relativen Lipid/Protein- Absorptionsmaße sind mit der vorliegenden experimentellen Konstruktion bestenfalls bis auf 50% genau. Aus diesem Grunde sind alle dargestellten restlichen Spektren sowohl Wasser- als auch Lipid-subtrahiert.
Mit entfernten Lipid-Bändern ist die Befundung der Nicht- Lipidbänder in dem Spektrum der normalen Aortenintima (Fig. 10) stark vereinfacht. Die Hauptbänder in dem Spektrum können Proteinhauptkettenschwingungen zugeordnet werden. Zu diesen zählen die Bänder bei 1648 cm&supmin;¹ (Amid I), 1549 cm&supmin;¹ (Amid II), 1455 cm&supmin;¹ (C-H Biegung), 1401 cm&supmin;¹ (Amid C-N Streckung) und 1244 cm&supmin;¹ (Amid III). Die Frequenz der Amid I Spitze (1648 cm&supmin;¹), welche gegenüber einer Proteinsekundärstruktur empfindlich ist, kann Anteile von α-Helix, erkrankten und Kollagenhelix-Konformationen anzeigen. Dieses Band zeigt ebenfalls eine Schulter in der Nähe von 1634 cm&supmin;¹, welche auf den β- Schichtbereichen von Proteinen oder Wasser beruhen kann. Das Protein C-H Biegeband bei 1455 cm&supmin;¹ unterscheidet sich von der entsprechenden Schwingung in Lipid, welches als ein Doppelspitzenband bei 1465/1457 cm&supmin;¹ auftritt. Man beachte, daß all diese Bänder auch Beiträge von den anderen Einheiten enthalten können. Beispielsweise kann die symmetrische Streckung von Karboxylatgruppen und die antisymmetrische Streckung von Phosphatgruppen auch zu dem 1401 cm&supmin;¹ bzw. dem 1244 cm&supmin;¹ Band beitragen. Diese Korrelation von Komponenten ist in der vorstehenden Tabelle I zusammengefaßt.
Ein typisches Spektrum der Mediaschicht einer normalen Aorta ist in Fig. 11a dargestellt. Ein Vergleich dieses Spektrums mit dem einer normalen Intima (Fig. 10b) zeigt keinerlei signifikante Unterschiede. Dieses Ergebnis ist etwas überraschend, wenn man überlegt, daß die normale Aortenintima und -media deutliche unterschiedliche Zusammensetzungen aufweisen. Typische Spektren eines atherosklerotischen Plaques und eines nicht-ulzerierten atheromatösen Plaques sind in Fig. 11b bzw. 11c dargestellt. Bei diesen Plaques wird nur die intakte fibröse Abdeckung an der intimalen Oberfläche aufgrund der geringen Eindringtiefe (1 um) des Strahls sondiert. Jedes nekrotische atheromatöse Material unterhalb dieser fibrösen Abdeckung wird nicht erfaßt. Trotzdem ist bekannt, daß sich die fibrösen Abdeckungen dieser Plaques von der Zusammensetzung her von der normalen Intima unterscheiden, so daß man erwarten könnte, daß diese Unterschiede in dem IR ATR-Spektrum wiedergegeben werden. Jedoch werden wie in dem Falle der Media keine konsistenten Unterschiede in den Spektren dieser Plaques (Fig. 11b und 11c) und der normalen Intima (Fig. 10b) beobachtet. Dieses Problem wird in der nachstehenden Diskussion vertieft.
Andererseits sind erhebliche Unterschiede in dem Spektrum des nekrotischen atheromatösen Kerns eines atheromatösen Plaque s(Fig. 12a) im Vergleich zu den entsprechenden Spektren einer normalen Intima (Fig. 10b) sowie denen von intakten atherosklerotischen (Fig. 11b) und atheromatösen (Fig. 11c) Plaques offensichtlich. In diesem Falle war der nekrotische Kern vermutlich in vivo im fortgeschrittenem Krankheitsstadium durch Ulzeration der darüberliegenden intimalen fibrösen Gewebeabdeckung offengelegt worden. (Das Spektrum eines nekrotischen Kerns, der durch Wegschneiden der fibrösen Abdeckung eines nicht-ulzerierten atheromatösen Plaques freigelegt wird, ist ähnlich). Ein neues Band erscheint bei 1050 cm&supmin;¹ mit einer sekundären Spitze bei 1023 cm&supmin;¹. Zusätzlich zeigt das nekrotische Kernspektrum eine Zunahme und Frequenzverschiebung in dem 1466 cm&supmin;¹ Band im Vergleich zu dem 1455 cm&supmin;¹ Proteinband in der normalen Intima sowie eine Gruppe eindeutiger Bänder in der Nähe von 1382 cm&supmin;¹. Diese charakteristischen Bänder sind in den Spektren aller offenliegenden nekrotischen Kernproben und in keinen anderen Proben (siehe nachstehend) zu finden.
Die Quelle dieser eindeutigen Bänder in den nekrotischen Kernspektren kann Cholesterol sein, welches sich bekanntermaßen in großen Mengen in atheromatösen Kernen ansammelt. Ein ATR-Spektrum von Cholesterol (Trockenfilm) ist in Fig. 12b dargestellt. Die drei für den nekrotischen Kern eindeutigen Hauptbänder in der Nähe von 1463 cm&supmin;¹, 1382 cm&supmin;¹ und 1050 cm&supmin;¹ stimmen gut von der Position und den relativen Intensitäten mit den drei Haupt-Cholesterolbändern bei 1466 cm&supmin;¹, 1377 cm&supmin;¹ und 1056 cm&supmin;¹ überein. Jedes von den Haupt-Cholesterolbändern weist eine sekundäre Spitze auf, welche scheinbar auch in den nekrotischen Kernbändern vorhanden ist. Diese sekundären Spitzen treten bei 1455/1436 cm&supmin;¹ und 1023 cm&supmin;¹ in dem Cholesterolspektrum und bei 1441 cm&supmin;¹, 1367 cm&supmin;¹ und 1023 cm&supmin;¹ in dem nekrotischen Kernspektrum auf. Zusätzlich sind einige von den schwachen Bändern in dem nekrotischen Kernspektrum zu denen die Spitzen bei 1334 cm&supmin;¹, 1109 cm&supmin;¹, 954 cm&supmin;¹, und 797 cm&supmin;¹ zählen, den schwächeren Cholesterolbändern in der Nähe dieser Frequenzen zugeordnet. Weitere Komponenten in dem nekrotischen Kern können ebenfalls zu einigen dieser unterschiedlichen Bänder beitragen.
Die Konsistenz der spektralen Differenzen, welche dem Cholesterol zugeordnet sind, zwischen nekrotischen Kernproben und dem normalen, atherosklerotischen und nicht ulzerierenden atheromatösen Proben sind in der Streuungsdiagramm in Fig. 13 dargestellt. Diese Diagramm stellt die integrierten Intensitäten (Flächen) des 1050 cm&supmin;¹ Cholesterolbandes im Verhältnis zu dem Gesamtproteinanteil, gemessen durch die Fläche des Amid II Bandes bei 1548 cm&supmin;¹ dar. Das 1050 cm&supmin;¹ Band wurde von 1075 bis 1000 cm&supmin;¹ integriert, und die Grundlinie unter Verwendung dieser Endpunkte subtrahiert, und das Amid II Band wurde von 1593 bis 1485 cm&supmin;¹ mit einer ähnlichen Basisliniensubtraktion integriert. Dieses Verhältnis ist ein Maß für den relativen Cholesterolanteil zu dem Spektrum und ist unter der Annahme, daß die Fläche 1050 cm&supmin;¹ Bandes allein auf dem Cholesterol beruht, proportional zu der relativen Cholesterolkonzentration der Probe. Wie man in Fig. 13 sehen kann, ist dieses Verhältnis für alle offenliegenden nekrotischen Kernproben höher als für alle anderen Proben. Die konsistenten Ergebnisse in dieser Probenanalyse, welche aufgrund der Trennung und molekularen Identifikation der Bänder möglich ist, zeigen das Potential der IR-Spektrokopie für die Gewebecharakterisierung.
Untersuchungen von menschlichen Arterien und der Atherosklerose durch Spektroskopie im mittleren IR-Bereich sind bis heute beschränkt. Es wurde berichtet, daß ATR-Spektren neben anderen Geweben von teilweise getrockneten menschlichen Arterien aufgezeichnet wurden. Beim Vergleich einer normalen Aorta eines Kindes mit einem atherosklerotischen Plaque bei einem Erwachsenen wurden Anstiege in einigen Bändern in der atherosklerotischen Aorta beobachtet. Die meisten dieser Bänder waren Lipiden und Lipoproteinen zugeordnet. Die IR-Spektroskopie wurde bereits zur Ermittlung der chemischen Zusammensetzung kalzifizierter atherosklerotischer Ablagerungen verwendet. Eine detailliertere IR-Untersuchung einer atherosklerotischen Aorta umfaßt aufgezeichnete IR-Übertragungsspektren aus dünnen Schichten, die in unterschiedlichen Tiefen in die Arterienwand geschnitten waren. Die Ergebnisse zeigen einen Anstieg der Absorption in der Nähe von 1739 cm&supmin;¹ in den fetten (atheromatösen) Bereichen des Plaques, was der Absorption durch Cholesterolester in dem Plaque zuzuordnen war. IR-Spektren aus der fibrösen Gewebeabdeckung an der Oberfläche der Plaques waren denen der normalen Intima ähnlich.
Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Messung von Spektren im mittleren Infrarot-Bereich von intaktem menschlichem Gewebe ist die intensive Wasserabsorption, welche die Absorption von anderen interessierenden Gewebekomponenten dominiert und verdeckt. In den meisten der vorstehend zitierten Untersuchungen war die Wasserabsorption nicht eliminiert, was die Qualität und Menge der aus dem Spektrum erhältlichen Information beschränkt. Bei dem ATR-Abtastverfahren ist diese Wasserbeeinflussung leicht zu entfernen (siehe Fig. 9). Das ATR- Verfahren ist natürlich ebenfalls für die Abtastung mit faseroptischen Sonden in vivo einsetzbar. Die Wasserbeeinflussung in den ATR-Spektren von faseroptischen Sonden von wässrigen Proteinlösungen wurde genau mit einer Wassersubtraktionsprozedur ähnlich der in der vorliegenden Untersuchung verwendeten eliminiert.
Obwohl das ATR-Verfahren gut für eine in vivo Abtastung und eine genaue Subtraktion des Wassersignals geeignet ist, sind mit dem ATR-Verfahren gesammelte Spektren nicht zu IR- Absorptionsspektren äquivalent, sondern hängen von Eigenschaften des ATR-Materials und der Probe zusätzlich zu dem Proben-Absorptionskoeffzienten ab. Beispielsweise hängt die Eindringtiefe der abklingenden Abtastwelle von den Brechungsindizes des ATR-Materials und der Probe ab. Es wird jedoch erwartet, daß sich die Brechungsindizes sowohl von ZnSe als auch menschlichem Gewebe langsam in der Frequenz zwischen 1800 und 700 cm&supmin;¹ verändern, und daß solche Veränderungen die relativen Intensitäten von Bändern bei unterschiedlichen Frequenzen am meisten betreffen. Die gesamte in dem Gewebespektrum beobachtete Struktur ist Absorptionsbändern in dem Gewebe zugeordnet.
Die in einem ATR-Spektrum beobachteten Komponentenabsorptionen hängen auch von dem optischen Kontakt der Probe und des ATR-Elements ab. Die kleine Eindringtiefe der abklingenden Welle in die Gewebeprobe bringt mit sich, daß nur eine 5 um dicke Schicht, und bevorzugt etwa 1 um des Materials an der Oberfläche beobachtet wird. Dieses wird für die Zwecke dieser Anmeldung als der Oberflächen-nahe Bereich des Gewebes bezeichnet. Gewebe tiefer als 5 um von der Oberfläche entfernt ist als Suboberflächenbereich definiert. Diese dünne abgetastete Oberflächen-nahe Schicht kann sich in der Zusammensetzung von der Volumenprobe unterscheiden. Zum Beispiel kann ein Film aus freiem Wasser an der Oberfläche von feuchtem Gewebe mit unterschiedlichen Werten einiger molekularer Spezies des Gewebes im Bezug auf ihre Konzentration in dem Volumengewebe vorhanden sein. Zusätzlich können die veränderlichen Affinitäten für das ATR-Material von unterschiedlichen Einheiten in dem Gewebe eine wichtige Rolle in den Intensitäten der beobachteten Bänder spielen.
Diese Betrachtungen können das Fehlen wesentlicher Unterschiede zwischen den ATR-Spektren der normalen Intima, der fibrösen Plaqueabdeckung und Media erschweren. Beispielsweise besteht die normale Aortenintima aus angenähert 25% Kollagen (Trockengewicht) und 20% Elastin, während die Aortenmedia 20% Kollagen und 50% Elastin aufweist. Die (nicht dargestellten) ATR-Spektren von gereinigtem Kollagen und gereinigtem Elastin unterscheiden sich erheblich. Insbesondere tritt Amid I/II bei 1657/1556 cm&supmin;¹ in hydriertem Kollagen (Typ I) und bei 1653/1543 cm&supmin;¹ bei hydriertem Elastin (Spektren nicht dargestellt) auf.
Man könnte erwarten, daß diese Unterschiede in den ATR- Spektren der Intima und Media wiedergegeben werden. Eine mögliche Erklärung dafür, daß dieses nicht der Fall ist, besteht darin, daß die dünne Schicht in optischem Kontakt mit dem ATR-Element sich von der Zusammensetzung her von dem Volumenmaterial unterscheidet, und Kollagen und Elastin nur einen kleineren Beitrag zu den IR ATR-Bändern dieser Schicht beitragen. Ein solcher Effekt kann auch das Fehlen deutlicher Unterschiede der ATR-Spektren zwischen der fibrösen Plaqueabdeckung der Intima und der normalen Intima erklären. In aus anderen Substanzen hergestellten ATR-Elementen mit unterschiedlichen biochemischen Affinitäten können die spektralen Differenzen zwischen diesen Geweben erheblich in Abhängigkeit von dem Gewebetyp verbessert sein.
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, daß hochqualitative Wasser-subtrahierte Spektren ohne weiteres mittels der ATR-Technik von menschlichem Gewebe erzielt werden können. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits in anderen Brustgeweben erzielt. Eine genaue Entfernung der Wasserbeeinflussung ist entscheidend, um die relativ schwachen Gewebeabsorptionsbänder von Lipid-Protein sowie von weiteren Gewebekomponenten zu isolieren. Es ist bemerkenswert, daß die Beobachtung dieser relativ schwachen Bänder mittels spektraler Subtraktion vollständig von der Qualität des Gewebe- und des Salzlösungsspektrums abhängt. Beispielsweise beträgt das Absorptionsmaß der normalen Intimaprobe (Fig. 8a) zwischen 1500 und 900 cm&supmin;¹ etwa 0,06. In dem Wasser-subtrahierten Spektrum (Fig. 9a) reichen die Spitzenabsorptionsmaße von 0,018 (30%) für die stärksten Bänder bis 0,003 (5%) für die schwächsten. Die Detektion einer Absorptionsmaßspitze von 0,003 in einem subtrahierten Spektrum mit einem Absorptionsmaßhintergrund von 0,06 erfordert ein Signal/Rausch-Verhältnis von 700 oder besser in der 100% Basislinie. Ein solches Signal/Rausch- Verhältnis ist leicht mit einem FT-Spektrometer zu erzielen. Die hohe Linearität, Basislinienstabilität und Wellenlängengenauigkeit des FT-Spektrometers sind ebenfalls für eine genaue Hintergrundsubtraktion kritisch.
Während die Wassersubtraktion mit ATR relativ leicht und genau ist, kann sie bei anderen klinisch anwendbaren Abtasttechniken, wie z. B. bei der diffusen Reflexions- oder photoakustischen Abtastung wesentlich schwieriger sein. Diese alternativen Abtastverfahren sind jedoch wegen ihrer höheren Gewebeeindringtiefen (angenähert 10 um) klinisch nützlich. Als eine Alternative zur Wassersubtraktion kann man die Eigenschaften der spektralen Linienform von Wasser verwerten, um das Wassersignal mittels anderer Berechnungsverfahren zu eliminieren. Insbesondere verändert sich die spektrale Linienform von Wasser ziemlich langsam mit der Frequenz über einen großen Teil des interessierenden Bereichs, insbesondere zwischen 1500 und 700 cm&supmin;¹. Daher kann jedes Verfahren, welches diese langsamere Veränderung filtert, und die stärkeren Merkmale der Nicht-Wasserbänder beläßt, die Wasser- und Nicht-Wasserkomponenten voneinander trennen.
Ein solches Verfahren ist die Spektroskopie der zweiten Ableitung. Eine Differentiation des Spektrum wird normalerweise angewendet, um Absorptionsbänder zu verschmälern, und überlappende Spitzen aufzulösen. Die Differentiation tendiert auch dazu, breite Bänder in Bezug auf schärfere weniger zu betonen. In IR-Spektren der Arterie kann die breite, merkmalslose Absorption von Wasser zugunsten der Nicht-Wasserbänder nahezu eliminiert werden, indem die zweite Ableitung der Spektren berechnet wird. Dieses ist deutlich in Fig. 14 dargestellt, welches die zweite Ableitung eines Spektrums einer normalen Aortenintima (Fig. 14a) zusammen mit dem Wassersubtrahierten Spektrum derselben Probe (Fig. 14b) darstellt. Im wesentlichen bleibt nur das 1633 cm&supmin;¹ Wasserband erhalten, welches teilweise das Amid I Band verdeckt. Ansonsten ist in diesem Spektrum der Wasserbeitrag minimal. Alle in dem Wassersubtrahierten Spektrum identifizierten Bänder sind leicht in dem Spektrum der zweiten Ableitung zu beobachten.
Zusätzlich zu der Elimination der Wasserbeeinflussung erscheinen einige der nicht aufgelösten Doppelspitzen und Schultern in dem Wasser- subtrahierenden Spektrum als einzelne Spitzen in dem Spektrum der zweiten Ableitung. Beispielsweise weist das Amid II Band in einer normalen Intima (14b) eine sehr schwache Schulter in der Nähe von 1518 cm&supmin;¹ auf, und der C=H Biegebereich in der Nähe von 1468 cm&supmin;¹ scheint zwei überlappende Spitzen zu enthalten. In dem Spektrum der zweiten Ableitung (Fig. 14a) ist das 1518 cm&supmin;¹ Band deutlich sichtbar, und der C-H Bereich zeigt zwei getrennte Spitzen bei 1469 und 1456 cm&supmin;¹. Ferner ermöglicht das Spektrum der zweiten Ableitung durch eine Versteilerung der Bänder eine genauere Ermittlung von Spitzenfrequenzen, so daß relativ kleine Frequenzverschiebungen zu beobachten sind. Solche Frequenzverschiebungen können bei der Detektion und Charakterisierung feiner molekularer Veränderungen, die unter bestimmten Gewebebedingungen auftreten, wichtig sein.
Die Beobachtung individueller, aufgelöster Bänder in den IR ATR-Spektren von Arterien ist von erheblichem Interesse, da die Trennung von Bändern der erste Schritt für die Bestimmung der Zusammensetzung einer Probe aus ihrem Spektrum ist. Sobald ein Band isoliert ist, ist dessen integrierte Intensität zu der Konzentration der für dieses Band verantwortlichen Einheit proportional. Insbesondere können, da die Amid I und II Bänder vollständig auf Protein beruhen, diese Bänder verwendet werden, um den Gesamtproteingehalt in dem Spektrum zu isolieren. Das steile, gut aufgelöste 1744 cm&supmin;¹ C=O Esterband scheint ausschließlich auf Lipid zu beruhen, und die integrierte Intensität des Bandes sollte zu dem relativen Lipidgehalt proportional sein. Diese Technik sollte die Ungenauigkeiten im großen Umfang eliminieren. Schließlich sei angemerkt, daß der relative Wasseranteil der Gewebeprobe automatisch aus dem 2120 cm&supmin;¹ Band in dem Wassersubtraktions- Algorithmus berechnet wird. Jedoch muß, wie vorstehend erwähnt, die von einem ATR-Spektrum ermittelte Zusammensetzung von Gewebe, nicht genau mit der Zusammensetzung des Volumengewebes identisch sein.
Die Gewebezusammensetzung kann auch aus überlappenden Bändern durch eine erste Entfaltung des interessierenden Bandes in seine individuellen Komponenten ermittelt werden. Dieses ist besonders leicht, wenn eine Komponente ein zusätzliches isoliertes Band irgendwo anders in dem Spektrum aufweist. Ein Beispiel ist der 1465 cm&supmin;¹ C-H Biegebereich, welcher auf unterschiedlichen Gewebekomponenten mit bestimmten spektralen Eigenschaften in diesem Bereich beruht. In dem normalen Intimaspektrum (Fig. 9a) ist dieses Band einer Kombination von Lipid- und Proteinkomponenten zugeordnet. Da die Lipidkomponente auch das isolierte 1744 cm&supmin;¹ Band erhält, kann dieses Band zur Subtraktion der Lipid C-H Biegekomponente und zur Isolation der Protein C-H Biegekomponente bei 1455 cm&supmin;¹ (Fig. 10b) verwendet werden, was dieses Band effektiv entfaltet. Man beachte, daß diese Entfaltung auch davon abhängt, ob ein zuverlässiges Spektrum von einer der individuellen Komponenten zur Verfügung steht, welches in diesem Beispiel das Lipidspektrum in Fig. 9b ist.
Die Detektion von bestimmten Cholesterol im nekrotischen Kern zugeordneten Bändern kann ein nützliches Mittel für die Bestimmung von Cholesterolkonzentrationen in vivo bereitstellen. Sowohl das 1050 cm&supmin;¹ als auch das 1382 cm&supmin;¹ Cholesterolband erscheinen in dem nekrotischen Kernspektrum nach der Lipidsubtraktion ziemlich gut isoliert. Wenn diese zwei Bänder auf einer einzigen Komponente beruhen, nämlich dem Cholesterol, müßte das Verhältnis ihrer integrierten Intensitäten für alle Proben konstant sein. Die Basislinien-subtrahierte Fläche des 1050 cm&supmin;¹ Bandes, A(1050), ist über der des 1382 cm&supmin;¹ Bandes, A(1382), für alle Proben normiert auf den Proteingehalt in Fig. 15 aufgetragen. Wie in dem Diagramm zu sehen, besteht ein angenähert linearer Zusammenhang zwischen A (1050) und A (1382). Eine lineare Anpassung nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate an diese Daten ergibt die in der Darstellung gezeigte Linie mit einem hohen Regressionskoeffizienten von r = 0,967. Die Steigung dieser Linie ist 2,8 während das Verhältnis A(1050)/A(1382) für das reine Cholesterol ATR-Spektrum 2, 3 ist. Die vernünftige Übereinstimmung zwischen diesen zwei Zahlen liefert einen zusätzlichen Beweis für die Zuordnung dieser Bänder zu Cholesterol. Ferner zeigt sie, daß der relative Spektralanteil zu Cholesterol angemessen durch die integrierten Intensitäten dieser beiden Bänder angenähert wird. Fig. 15 zeigt auch, daß die ATR-Spektren aller anderen Proben außer dem offenliegenden nekrotischen Kern nahezu keine Intensität sowohl in den 1050 als auch 1382 cm&supmin;¹ Bändern im Gegensatz zu den nekrotischen Proben zeigen, von denen all deutliche Bänder bei beiden Frequenzen aufweisen.
Die vorliegenden Systeme und Verfahren zeigen, daß IR- Spektren von feuchten Volumengeweben zuverlässig mittels der ATR-Technik erzielt werden können. Obwohl Wasser der dominante Absorber über einen großen Teil des mittleren Infrarot- Bereichs ist, erlauben die mittels der FT-IR ATR-Technik erzielten hochqualitativen Spektren eine genaue Subtraktion des Wassersignals. Die Elimination der Wasserbeeinflussung ist für die Identifikation und Zuordnung der Absorptionsbänder zu anderen Gewebespezies kritisch. Die Isolation und Kennzeichnung dieser relativ steilen Bänder liefert ein Mittel für eine nicht-destruktive spektroskopische Analyse der Zusammensetzung von Arteriengewebe. Diese Verfahren sind auch für die Untersuchung und Diagnosen anderer Gewebe und Gewebebedingungen wie z. B. der Neoplasie anwendbar.
Die Beobachtung sowohl von Lipiden als auch von Cholesterol in den Spektren nekrotischer, atheromatöser Kernproben ist besonders erfreulich, da man glaubt, daß Lipide und Cholesterol Hauptrollen in der Pathogenese der Atherosklerose spielen. Die spektrale Beobachtung dieser Komponenten, insbesondere Cholesterol, stellt ein zuverlässiges Mittel zur Detektion und Charakterisierung fortgeschrittener atheromatöser Plaques bereit, in welchen eine Ulzeration der fibrösen Abdeckung (wie in Fig. 13 und 15 demonstriert) aufgetreten ist. Intimale Akkumulationen von Lipid und Cholesterol treten früh in dem atherogenen Prozeß auf. Daher könnte die ATR-Technik im mittleren IR-Bereich auch bei der Detektion und Untersuchung einer frühen Fettstreifen-Läsion nützlich sein.

VORLIEGENDE ERFINDUNG

Spektrograph/CCD-System für NIR-Raman-Spektren

Die NIR-Raman-Spektroskopie unter Verwendung eines einstufigen Spektrographen und eines Ladungsverschiebeelementes (CCD) bietet eine überlegene Empfindlichkeit gegenüber dem Nd : YAG-erregten FT-Raman-System von Fig. 1A und 1C. Durch die Verschiebung der Wellenlänge der Lasererregung von 1064 nm in den 800-900 nm Bereich kann ein CCD zur Detektion der Ramangestreuten Signale und unter gleichzeitiger Vermeidung einer Fluoreszenzanregung in den meisten Molekülen verwendet werden. Das System kann nützlich in dem Bereich von 750 nm bis 1050 nm arbeiten. Obwohl die Fluoreszenzemission von Gewebe bei einer Anregung mit 810 nm deutlich höher als bei einer Anregung mit 1064 nm ist, sind die Raman-Signale deutlich beobachtbar. Dieses beruht darauf, daß die dominante Rauschquelle in dem Spektrographen- und CCD-System der Fluoreszenzemission zugeordnetes Schrotrauschen ist, welches zwei bis drei Größenordnungen kleiner als das Dunkelstromrauschen des InGaAS-Detektors ist, welcher die dominante Rauschquelle in dem FT-Raman-System ist.
Fig. 17 stellt das Laserdiagnose- und Behandlungssystem von Fig. 1A, modifiziert für die Verwendung des Spektrographen- und CCD-Systems dieser Erfindung dar. Das Diagnosesubsystem 201' enthält einen einstufigen Spektrographen 310 und einen Ladungsverschiebeelement-(CCD)-Detektor 312 zur Sammlung der Raman-Spektren im nahen Infrarot-Bereich (NIR) von intakten humanen Arteriengewebe. Bei einer bevorzugt gepulsten Laserlichtanregung mit 810 nm ist die Fluoreszenzemission aus dem menschlichen Arteriengewebe ausreichend schwach, um Raman-Bänder rascher mit dem Spektrographen- und CCD- System als mit dem mit 1064 nm erregten FT-Raman-System von Fig. 1A und 1C zu beobachten. Ein Verfahren zum Entfernen der breitbandigen Emission aus den Spektren mittels Berechnung der Differenz von zwei bei leicht unterschiedlichen Anregungsfrequenzen gesammelten Emissionsspektren wurde zur Verbesserung der Beobachtung der Raman-Bänder verwendet. Dieses Verfahren beruht auf der Stabilität, Linearität und den rauscharmen Eigenschaften des CCD-Detektors. Die Ergebnisse zeigen, daß hochqualitative Raman-Spektren in weniger als einer Sekunde mit dem Spektrographen- und CCD-System und einer optischen Fasersonde im Vergleich zu 30 Minuten bei dem FT- Raman-System bei ähnlichen Laserleistungspegeln gesammelt werden können, und ferner die Anwendung der Technik für klinische in vivo Anwendungen verbessert werden kann.
Eine für die Sammlung von Raman-Spektraldaten im nahen Infrarot-Bereich (NIR) aus angeregten Gewebeproben eingesetzte bevorzugte Ausführungsform eines Spektrographen- und CCD- Systems 300, das einen Spektrographen und eine Ladungsverschiebeelement-(CCD)-Anordnung verwendet, ist in Fig. 18 dargestellt. NIR-Raman-Spektren wurden von 100 bis 2000 cm&supmin;¹ unter der Laseranregungsfrequenz mit einem einstufigen Spektrographen 310 (Acton, Modell ARC275, 0,25 m, F/3,8) und einer CCD-Anordnung 312 (Princeton Instruments EEV, Modell 88130) gemessen.
Das System 300 kann einen mit 10 Hz arbeiteten NIR 810 nm Nd : YAG-gepumpten Impulsfarbstofflaser 314 zur Bestrahlung einer Probe 46 verwenden. Alternativ kann eine CW- oder Diodenlaserquelle ebenfalls verwendet werden. Der Laser 314 erzeugte einen Laserstrahl 316, welcher von einem Spiegel 318 durch eine Fokussierungsoptik 320 gelenkt wird, um auf eine hinter einem transparenten Fenster 321 befestigte Probe 46 aufzutreffen. Der Laserstrahl war auf die Probe mit einem Einfallswinkel von 70º fokussiert, was eine Beleuchtungspunktgröße von 0,7 · 2 mm auf der Gewebeoberfläche ergibt. Die gemittelte einfallende Leistung bei der Probe wurde auf 20 mW gehalten, um übermäßige Spitzenintensitäten während eines einzelnen Impulses zu vermeiden. Es wurde beobachtet, daß die spektralen Signale über einen Bereich mittlerer Einfallsleistungen von 2 bis 20 mW linear waren.
Ein Teil des von der Probe 46 emittierten Streulichts 322 wurde von einer Sammeloptik 324 in einem 90º Winkel bezogen auf den einfallenden Laserstrahl gesammelt. Die Sammeloptik 423 kollimiert das gesammelte Licht und paßt dessen Brennpunkt F für den Spektrographen 310 an. Vor dem Eintritt in den Eingangsschlitz des Spektrographen 10 wurde das gesamte Licht durch eine Reihe von Schott-Glasfiltern 326 geführt, welche die elastisch gestreute Komponente des gesammelten Lichts abschwächten. Die kombinierte Wirkung der Schott-Glasfilter erzeugte eine optische Dichte von 7 bei 810 nm, eine Transmission von 20% bei 850 nm (580 cm&supmin;¹ von 810 nm) und eine Transmission von 85% über 900 nm (1200 cm&supmin;¹).
Der verwendete Spektrograph 310 verwendete eine Schlitzbreite von 200 um und ein 600-Furchen/mm Gitter mit einer maximalen Intensität bei 1 um und konnte gescannt werden, um eine spektrale Abdeckung über unterschiedliche Wellenlängenbereiche zu erzeugen. Die 200 um Schlitzbreite erzeugte eine Auf lösung von etwa 15 cm&supmin;¹.
Die CCD-Anordnung 312 bestand aus 298 (Spalten) · 1152 (Zeilen) Pixelelementen mit einem gesamten aktiven Fläche von 6,7 mm · 26 mm, wobei die kurze Achse parallel zu dem Schlitz lag. Die CCD-Anordnung war auf -110ºC gekühlt, um den Dunkelstrom zu eliminieren. Jede Pixelzeile war in sich abgeschlossen, um das Auslöserauschen zu reduzieren. Im Handel erhältliche CCD-Detektoren bieten ein extrem niedriges Detektorrauschen und nutzbare Quantenwirkungsgrade bis zu 1050 nm und bieten erhebliche Vorteile gegenüber InGaAS- und andere NIR- Detektoren. Diese Vorteile wiegen den niedrigeren Durchsatz des Gitterspektrographen unter Voraussetzung auf, daß die breitbandige Fluoreszenzbeeinflussung bei den kürzeren Anregungswellenlängen nicht zu groß ist.
Herausgeschnittene menschliche Aortenproben 46, die bei der Obduktion erhalten wurden, wurden mit einer (bei pH 7,4 gepufferten isotonischen Salzlösung gespült, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -85ºC gelagert. Vor der spektroskopischen Untersuchung wurden die Proben passiv auf Raumtemperatur erwärmt und mit der Salzlösung feucht gehalten. Normale und atherosklerotische Bereiche des Gewebes wurden durch eine allgemeine Überprüfung identifiziert, getrennt und in etwa 8 · 8 mm Stücke geschnitten.
Die Gewebeproben 46 wurden in eine Suprasil-Quarzküvette mit einer kleinen Menge isotonischer Salzlösung zur Feuchthaltung des Gewebes eingebracht, wobei eine Oberfläche mit dem transparenten Fenster 321 in Kontakt stand und durch den Laser 314 bestrahlt wurde.
Raman-Spektren wurden typischerweise zwischen 100 cm&supmin;¹ und 2000 cm&supmin;¹ unterhalb der Laseranregungsfrequenz gemessen. Jedes Spektrum wurde Hintergrund-subtrahiert um den Gleichspannungsoffset des A/D-Wandlers der CCD-Steuerung zu entfernen. Zusätzlich wurden heiße Pixel aufgrund hochenergetischer Strahlungsereignisse aus dem aufgezeichneten Spektrum durch Anwendung eines Mittelwertfilters mit einem 7 Pixel breiten Fenster bei jedem Spektrum entfernt. Die Raman-Frequenzen wurden mit den Spektren von Benzol und Bariumsulfatpulver kalibriert und sind auf ±5 cm&supmin;¹ genau. Die Spektren wurden nicht bezüglich des Wellenlängen-abhängigen Verhaltens der Filter, des Spektrographen und des CCD-Detektors korrigiert. Für jedes in den nachstehenden Figuren dargestellte Spektrum wurden die Raman-Signale über 5 Minuten akkumuliert. Wesentlich kürzere Sammelzeiten können ebenfalls wie hierin beschreiben verwendet werden.
Fig. 15A zeigt die Raman-Spektren einer normalen Aortenprobe, angeregt mit einem Laserlicht von 810 nm und gesammelt von dem Spektrographen- und CCD-System 300. In diesem Falle ist die breitbandige Hintergrundemission, welche vermutlich auf Gewebefluoreszenz beruht, angenähert 5-mal intensiver als die stärksten Raman-Bänder bei 1650, 1451, 1330 und 1253 cm&supmin;¹. Im Gegensatz dazu zeigte die in Fig. 2a dargestellte FT- Raman-Untersuchung bei 1064 nm einer normalen menschlichen Aorta Raman-Signale mit den Spitzenintensitäten der stärksten Bänder, Amid I bei 1650 cm&supmin;¹ und C-H Biegung bei 1451 cm&supmin;¹, ungefähr dreimal größer als die Hintergrundemission. Diese Hintergrundemission ist jedoch in dem Spektrographen- und CCD-System bezüglich der Raman-Signale relativ schwach (d. h., in der Größenordnung der Raman-Signale) und deshalb ist das der Detektion dieser Hintergrundemission zugeordnete Schrotrauschen wesentlich kleiner als die Raman-Signale, was es ermöglicht, die Raman-Bänder nach der Entfernung der Hintergrundemissionssignale durch Filterung oder Subtraktion unterscheidbar zu machen. Das Schrotrauschen ist typischerweise ein eine Poisson-Verteilung aufweisendes Zufallsrauschen und ist dem Detektor und/oder der Hintergrundemission selbst zugeordnet.
Im Gegensatz dazu ist bei sichtbaren Anregungen die Fluoreszenzhintergrundemission von den beschriebenen pathologischen Arteriengewebetypen 3 bis 4 Größenordnungen größer als die Raman-Signale, und das dieser stärkeren Hintergrundemission zugeordnete Schrotrauschen verdeckt die Raman-Bänder sogar nach der Entfernung der Hintergrundemissionen. Jedoch zeigen andere Gewebetypen, wie z. B. Dickdarm und Blase nicht solch hohe Werte von Fluoreszenzreaktionen bei sichtbaren Anregungsfrequenzen und können daher wahrscheinlich mit sichtbaren Anregungen arbeiten.
Das Signal/Rausch-Verhältnis des mit dem Spektrographen- und CCD-System 300 mit 20 mW Einfallsleistung und 5 Minuten Sammeldauer (Fig. 19A) gesammelten Spektrums einer normalen Aorta ähnelt dem, das mit dem FT-Raman-System von Fig. 1C mit 500 mW Einfallsleistung und 35 Minuten Sammelzeit erzielt wurden. Da die beobachteten spektralen Signal/Rausch-Verhältnisse ähnlich sind, schätzen wir, daß der mit dem CCD-Detektor 312 von Fig. 18 beobachtete Rauschpegel angenähert 3400-fach geringer als der mit dem InGaAS-Detektor 42 von Fig. 1C beobachtete ist. Für den InGaAS-Detektor ist das Schrotrauschen des Dunkelstroms die Hauptrauschquelle, während bei dem CCD-Detektor das Schrotrauschen der Breitbandgewebeemission die dominante Rauschquelle ist, da der Dunkelstrom, und die Anzahl der Ausleseelektronen der CCD wesentlich niedriger als diese Emission sind.
Diese einfache Analyse hat mehrere wichtige Folgen. Erstens ist, da die von dem Spektrographen- und CCD-System angetroffene Hauptrauschquelle Schrotrauschen aus der Breitbandemission durch die Gewebeprobe ist, ist das spektrale Signal/Rausch-Verhältnis proportional zu der Quadratwurzel des Produkts der einfallenden Intensität und der Sammelzeit. Das FT-Raman- und das Spektrographen- und CCD-System können wie folgt verglichen werden. Für das FT-Raman-System beträgt die einfallende Intensität 640 mW/mm². Der Quantenwirkungsgrad des InGaAS-Detektors bei 1200 nm ist 0,7, und der Durchsatz des FT-Spektrometers ist 1,1 mm²sr, und der Transmissionswirkungsgrad des FT-Spektrometers und der Filter ist angenähert 0,062. Für das Spektrographen- und CCD-System beträgt die Einfallsintensität 14 mW/mm². Der Quantenwirkungsgrad ist 0,15 bei 900 nm, der Durchsatz des Spektrographen ist 0,043 mm²sr und der Transmissionswirkungsgrad des Spektrographen und der Filter ist 0,24. Bei einer Kombination dieser Faktoren und Berücksichtigung der v4-Abhängigkeit der Raman-Querschnitte wird der von dem FT-Raman-Spektrum gemessene Signalpegel etwa 3400-fach größer als der des Spektrographen- und CCD-Systems geschätzt.
Daher könnte, wenn die Laserintensität auf den von den FT-Raman-Experimenten verwendeten Pegel erhöht wird, die Sammelzeit um ein Faktor von 40 auf 8 Sekunden ohne Veränderung des spektralen Signal/Rausch-Verhältnisses reduziert werden. Zweitens kann der Rauschpegel weiter unter Verwendung längerer Anregungswellenlängen reduziert werden, welche die Fluoreszenzemission durch Gewebe minimieren. Solche Reduzierungen in der Fluoreszenzemission müssen jedoch gegenüber dem kleiner werdenden Quantenwirkungsgrad des CCD's bei längeren Wellenlängen berücksichtigt werden, und die optimale Anregungswellenlänge hängt auch von dem Fluoreszenz-Anregungsprofil des Gewebes ab. Für Gewebetypen, die wenig Fluoreszenzemission bei sichtbaren Wellenlängen zeigen, wie z. B. Dickdarm- und Blasengewebe, kann das CCD bei sichtbaren oder nahen sichtbaren Wellenlängen betrieben werden, um den Vorteil eines vergrößerten Quantenwirkungsgrads der CCD bei diesen Wellenlängen zu nutzen. Schließlich ist der Durchsatz einer Quarzglas- Optofaser mit einem Kern von 500 um, einer numerischen Apertur von 0,2 gleich 0,3 mm²sr, was in etwa derselbe wie der des Spektrographen- und CCD-Systems ist. Dieses bedeutet, daß das vorliegende Linsensammelsystem ohne zusätzliche Signalverluste durch eine faseroptische Sonde ersetzt werden kann, wie sie für einen in vivo Betrieb erforderlich ist.
Fig. 19A zeigt, daß obwohl das Schrotrauschen aufgrund der breitbandigen Gewebeemission relativ klein ist, die abfallende breitbandige Fluoreszenzemission immer noch die steileren Raman-Signale verdeckt und die Ermittlung der Spitzenfrequenzen und die Identifikation schwacher Bänder erschwert. Ferner ist es bei der gegebenen Komplexität von menschlichem Gewebe wahrscheinlich, daß diese breitbandige Emission über den gesamten Nutzbereich der CCD signifikant sein wird. Jede quantitative Analyse der Raman-Bänder in Fig. 19A erfordert, daß diese breitbandige Emission aus dem Spektrum entfernt wird. Die Standardverfahren zur Entfernung von Fluoreszenzemission aus Raman-Spektren nutzen mathematische Filter, welche darauf beruhen, daß die Fluoreszenzemission relativ merkmalslos ist. In einem alternativen Verfahren wird die Anregungsfrequenz über einen schmalen Bereich (10-30 cm&supmin;¹) verändert. Die Raman-Bandpositionen verändern sich direkt mit der Anregungsfrequenz während die Fluoreszenzemission bei solch kleinen Veränderungen in der Anregungsfrequenz ziemlich konstant bleibt, was es ermöglicht, diese effizient heraus zu subtrahieren. Im Gegensatz zu mathematischen Filtern erfordert diese Operation keine Annahmen bezüglich der Emissionslinienform.
Zur Implementierung dieses Verfahrens wird das Raman- Spektrum der normalen Aortaproben mit Anregungswellenlängen von 810 nm (Fig. 19A) und 812 nm aufgezeichnet. Die Raman- Bänder verschieben sich mit der Anregungsfrequenz um 30 cm&supmin;¹, während die Fluoreszenzemission relativ konstant bleibt. Durch Subtraktion dieser zwei Spektren wird die Breitbandemission stark reduziert, und die Raman-Bänder werden leichter beobachtbar (Fig. 19B). Diese Operation entspricht mathematisch der Bildung der Ableitung des Raman-Spektrums, so daß das ursprüngliche Raman-Spektrum durch Integration des Differenzspektrums gemäß Darstellung in Fig. 19C zurückgewonnen werden kann. Der Fluoreszenzhintergrund ist in Fig. 19C im Vergleich zu Fig. 19A stark reduziert, was eine leichtere Identifizierung der Raman-Bänder und deren Spitzenfrequenzen erlaubt. Die Integration glättet auch das Raman-Spektrum über einer Bandbreite ähnlich der der Anregungsfrequenzverschiebung und bewirkt auch eine gewisse Linienverbreiterung, wie es aus Fig. 19C ersichtlich ist. Man beachte, daß die Genauigkeit dieses Verfahrens von der hohen Linearität und Stabilität der CCD-Anordnung abhängt.
Das NIR-Raman-Spektrum eines atherosklerotischen Plaques mit einer offen an der Oberfläche liegenden kalzifizierten Ablagerung, gesammelt mit dem Spektrographen- und CCD-System ist in Fig. 20A dargestellt. In diesem Falle ist die Breitbandemission nahezu 10-mal größer als die in einer normalen Aorta beobachtete (Fig. 19A) was zu einem erhöhten Rauschen führt. Jedoch ist die intensive Phosphat-Streckschwingung bei 960 cm&supmin;¹ aufgrund der kalzifizierten Salze leicht zu identifizieren. Dieses Band ist ausreichend intensiv, um in Echtzeit beobachtet zu werden, und wurde zur Ausrichtung der Sammeloptik verwendet. Einige schwächere Bänder können ebenfalls identifiziert werden, wie z. B. die Phophat/Karbonat-Bänder bei 1070 cm&supmin;¹, obwohl diese von dem großen Fluoreszenzhintergrund verdeckt werden. Durch Heraussubtrahieren dieser Fluoreszenz (Fig. 20B), wie vorstehend beschrieben, sind diese Bänder wesentlich leichter unterscheidbar. Das durch Integration des Differenzspektrums erhaltene Raman-Spektrum ist in Fig. 20 dargestellt. Die Breitbandemission ist um einen Faktor von 50 bezüglich der Raman-Bänder reduziert, und einige schwächere Bänder sind leicht erkennbar. Dieses Spektrum ist deutlich dem von Fig. 5a ähnlich, welches mit dem FT-Raman- System und mit 1064 nm Anregung beobachtet wurde.
Als ein weiteres Beispiel der Empfindlichkeit des Spektrographen- und CCD-Systems 300 wird das Raman-Spektrum eines adventitialen adipösen Gewebes in Fig. 21 dargestellt, welches mit dem in Fig. 5c dargestellten FT-Raman-Spektrum verglichen werden kann. Die Breitbandemission ist ähnlich dem einer normalen Aorta während die Raman-Bänder hauptsächlich wegen Triglyceriden in dem Gewebe sehr stark sind, was zu einem ausgezeichneten spektralen Signal/Rausch-Verhältnis führt.
Somit bietet das Spektrographen- und CCD-System mit 810 nm Anregung eine schnellere Alternative zu der FT-Raman- System mit 1064 nm Anregung und weist eine größere Empfindlichkeit auf. Sogar in komplexen Gemischen, wie z. B. menschlichem Gewebe, ist der mit 810 nm Anregung beobachtete Hintergrundemissionspegel niedrig genug, um die Raman-Signale zu beobachten. Diese Fluoreszenzemission verschlechtert das Signal/Rausch-Verhältnis nicht übermäßig. Durch die Subtraktion von zwei bei leicht unterschiedlichen Anregungswellen gesammelten Spektren und eine anschließende Integration des Differenzspektrums wird diese Breitbandemission unterdrückt, was hochqualitative Raman-Spektren ergibt. Entfaltungstechniken können ebenfalls angewendet werden, um selektiv Raman-, Fluoreszenz-, oder Störlichtkomponenten zu entfernen oder zu reduzieren.
Verbesserungen, wie z. B. die Verwendung eines CW-Lasers, zur Erhöhung der Einfallsintensität und eines Rückseitenverdünnten CCD's mit einem besseren Verhalten im Roten erlauben das Sammeln von Raman-Spektren von intakten menschlichem Gewebe unter 1 Sekunde. Längere Anregungswellenlängen können die Hintergrundemission weiter reduzieren. Die Implementation des Spektrographen- und CCD-Systems mit einem Hochleistungs- Diodenlaser und einer faseroptischen Sonde stellen ein kompaktes, mobiles System für die rasche ferngesteuerte Erfassung von NIR-Raman-Spektren von menschlichen Geweben bereit, und stellen auch ein leistungsfähiges Werkzeug für klinische in vivo Anwendungen bereit.

Claims

1. Spektroskopisches Diagnosesystem aufweisend:

eine Laserlichtquelle (207) zum Emittieren von Strahlung

einer Optokabel-Sondeneinrichtung (20a-c) zum Einführen in ein Gefäßlumen, die optisch mit der Laserlichtquelle (207) verbunden ist, um die Strahlung an ein distales Ende der Optokabel-Sondeneinrichtung (20a-c) zu liefern; und

einem Spektralanalysator zum Empfangen und Detektieren von Raman-verschobener Strahlung,

dadurch gekennzeichnet, daß:

der Spektralanalysator ein Spektrograph und ein CCD- System ist;

die Laserlichtquelle (207) Strahlung in dem infraroten Spektrum bei einer Anregungswellenlänge zwischen 750 nm und 1050 nm emittiert;

die Optokabel-Sondeneinrichtung (20a-c) ein faseroptisches Kabel enthält, um Laserstrahlung an eine Diagnosestelle innerhalb des Gefäßlumens zu liefern und die Raman-verschobene Strahlung aus dem Gewebe oder Material an der Diagnosestelle zu sammeln; und

das System ein programmierbares Steuerungssystem (215, 217) enthält, das mit der Laserlichtquelle (207) und dem Spektralanalysator verbunden und dafür eingerichtet ist:

a) die Lieferung der Laserstrahlung zum Bestrahlen eines Abschnittes des Gewebes mit einer ersten Frequenz zu steuern und dann denselben Abschnitt des Gewebes mit einer von der ersten Frequenz verschobenen zweiten Frequenz zu bestrahlen; und

b) Licht zu detektieren, das von dem Gewebe als Reaktion auf die Bestrahlung mit der ersten Frequenz emittiert wird, um ein erstes Spektrum emittierter Lichtfrequenzkomponenten zu erzeugen, licht zu detektieren, das von dem Gewebe als Reaktion auf die Bestrahlung mit der zweiten Frequenz emittiert wird, um ein zweites Spektrum emittierter Lichtfrequenzkomponenten zu erzeugen;

wobei das System ferner eine Einrichtung enthält, die dafür eingerichtet ist, die Raman-verschobene Strahlung zu analysieren, um die Feststellung zu ermöglichen, ob das Gewebe oder Material an der Diagnosestelle normales Gefäßgewebe oder anormales Gewebe oder Material ist, indem ein Differenzspektrum aus dem ersten Spektrum und dem zweiten Spektrum durch Subtraktion voneinander erzeugt wird, wobei das Differenzspektrum die Raman-verschobenen Frequenzkomponenten enthält.

2. Spektroskopisches System nach Anspruch 1, wobei die Laserlichtquelle (207) dafür eingerichtet ist, Strahlung mit ersten und zweiten Bestrahlungsfrequenzen mit einer ersten Wellenlänge zwischen 750 nm und 900 nm zu liefern, und die zweite Frequenz von der ersten Frequenz um weniger als 50 cm&supmin;¹ verschoben ist.

3. Spektroskopisches System nach Anspruch 1 oder 2, welches ferner einen Abtragslaser (225) aufweist, der für die Entfernung von ausgewähltem Gewebe von einer Stelle geeignet ist.

4. Spektroskopisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Spektralanalysator ein Filter (62) aufweist, das zwischen dem Gewebe und dem Detektor angeordnet ist, um Strahlung aus dem Gewebe optisch zu filtern.

5. Spektroskopisches Analyseverfahren mit den Schritten:

Bestrahlen eines Abschnittes einer biologischen Probe eines Gefäßlumens, die mittels Laserstrahlung aus einer Laserlichtquelle zu untersuchen ist, indem Licht, das von dem Abschnitt der Probe als Reaktion auf die Bestrahlung emittiert wird, mittels eines Detektors detektiert wird, wobei das Licht eine von der Bestrahlungsfrequenz unterschiedliche Raman-verschobene Frequenz aufweist; und

Analysieren des detektierten Lichts, um einen Zustand des Abschnittes der biologischen Probe festzustellen;

dadurch gekennzeichnet, daß:

die Laserstrahlung eine Frequenz innerhalb des Infrarotbereichs und eine Anregungswellenlänge zwischen 750 und 1050 nm aufweist;

der Detektor einen Spektrographen und ein CCD-System aufweist;

die Laserlichtquelle (207) und der Detektor von einem programmierbaren Steuerungssystem gesteuert werden, das dafür eingerichtet ist, die Lieferung der Laserstrahlung auf die biologische Probe und den Empfang von Daten aus dem Detektor über ein faseroptisches Kabel zu steuern;

wobei das Verfahren ferner den Schritt der Analyse der Daten aus der Raman-verschobenen Frequenz enthält;

der Bestrahlungsschritt ferner die Bestrahlung eines Abschnittes des Gewebes mit einer ersten Frequenz und dann die Bestrahlung desselben Abschnitts mit einer von der ersten Frequenz verschobenen zweiten Frequenz umfaßt; und

der Detektionsschritt ferner die Detektion von Licht, das von dem Gewebe als Reaktion auf die Bestrahlung mit der ersten Frequenz emittiert wird, um ein erstes Spektrum emittierter Lichtfrequenzkomponenten zu erzeugen, die Detektion von Licht, das von dem Gewebe als Reaktion auf die Bestrahlung mit der zweiten Frequenz emittiert wird, um ein zweites Spektrum emittierter Lichtfrequenzkomponenten zu erzeugen, und das Erzeugen eines Differenzspektrums aus dem ersten Spektrum und dem zweiten Spektrum durch Subtraktion voneinander umfaßt, wobei das Differenzspektrum die Raman-verschobenen Frequenzkomponenten enthält.

6. Spektroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 5, welches ferner die Einkopplung einer Strahlung aus einer Strahlungsquelle in ein faseroptisches Kabel umfaßt, um die Strahlung auf den Abschnitt des Gewebes zu übertragen, wobei das faseroptische Kabel z. B. einen Katheter zum Einführen in Körperlumina umfaßt, und das faseroptische Kabel bevorzugt von dem Gewebe emittiertes Licht empfängt und das emittierte Licht an das Spektroskop überträgt, und beispielsweise ferner das Einführen des Katheters in das Gefäßsystem mit umfaßt.

7. Spektroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 5, wobei die ersten und zweiten Bestrahlungsfrequenzen Wellenlängen zwischen 750 nm und 900 nm aufweisen und die zweite Frequenz von der ersten Frequenz um weniger als 50 cm&supmin;¹ verschoben ist.

8. Spektroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 5, wobei der Detektionsschritt ferner die Erzeugung des ersten Spektrums und des zweiten Spektrums der emittierten Frequenzkomponenten mit dem Spektroskop und die Detektion des ersten und zweiten Spektrums mit der ladungsgekoppelten Vorrichtung umfaßt.

9. Spektroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 8, wobei das Spektroskop ein einstufiges Spektroskop aufweist.

10. Spektroskopisches Analyseverfahren nach Anspruch 8, wobei das Differenzspektrum elektronisch aus dem mit der ladungsgekoppelten Vorrichtung detektierten ersten und zweiten Spektrum erzeugt wird.