JP2017534676A - インクレチン−インスリンコンジュゲート - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、合衆国法典第35巻第119条(e)に基づき、その全文が参照によって本明細書に援用される、2014年9月24日出願の米国仮特許出願第62/054,666号の優先権を主張するものである。
電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出し、以下の通り識別される、コンピュータ可読のヌクレオチド/アミノ酸の配列リストの全文が参照によって援用される:2015年9月18日作成のファイル名「242705_SeqList_ST25.txt」の1014KBのACII(テキスト)ファイル1個。
グルカゴンは、プレ−プログルカゴンのアミノ酸33〜61に対応する29アミノ酸のペプチドであるが、GLP−1は、プレ−プログルカゴンのアミノ酸72〜108に対応する37アミノ酸のペプチドとして生成される。GLP−1(7−36)アミド(配列番号703;C末端はアルギニンアミドである)またはGLP−1(7−37)酸(配列番号704;C末端はグリシンである)は、生物学的に効力のある形態のGLP−1であり、GLP−1受容体で本質的に等価な活性を示す。
さらに、胃抑制ポリペプチド(GIP)は、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドとしても知られ、セクレチンファミリーのホルモンのメンバーである。GIPは、GIP遺伝子によりコードされる153アミノ酸のプロタンパク質から誘導され、生物学的に活性な42アミノ酸のペプチド(配列番号707)として循環する。GIP遺伝子は、小腸ならびに唾液腺中で発現され、胃酸分泌の弱い阻害因子である。胃におけるその抑制効果に加えて、グルコースの存在下で、GIPは、生理的用量で投与された場合に、膵島ベータ細胞によるインスリン放出を増強する。GIPは、膵臓インスリンの放出を刺激し、グルコース恒常性の維持において生理学的役割を果たし得る、腸因子として機能すると考えられる。
R1、R2、R3およびR4は、H、およびC1−C3アルキルからなる群から独立に選択され、
Yは、C、S、Se、またはS=Oであり、
Zは、C、S、Se、−S(C1−C3)(C5−C6アリール)−であり、またはYと組み合わせたZは、−C=C−、−O−N=、もしくは1,2,3トリアゾールであり、
nは、0または1であり、
mは、1、2または3であるが、但し、YがS=Oである場合、ZはCである)
の一般構造の連結部分を介してインスリンペプチドに連結される。一実施形態では、連結部分は、一般式:
R1、R2、R3およびR4は、HおよびC1−C3アルキルからなる群から独立に選択され、
nは0または1であり、
mは1、2または3である)
のジスルフィドリンカーである。一実施形態では、nは0であり、mは2であり、R4はHであり、R1、R2およびR3はH、およびメチルからなる群から独立に選択される。
(i)1〜3個のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列:
X1−X2−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Z(配列番号839)
であって、
X1および/またはX2が、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然(配列番号701と比較して)アミノ酸であり、
Zが、−COOH、−Asn−COOH、Asn−Thr−COOH、GPSSGAPPPS(配列番号78)およびY−COOHからなる群から選択され、Yが、1〜2個のアミノ酸であり、さらに、
(1)ラクタム架橋が、i位のアミノ酸とi+4位のアミノ酸の側鎖を接続し、iが12、16、20もしくは24であり、または
(2)インクレチンペプチドの16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3個、もしくは全部が、α,α−二置換アミノ酸で置換されており、
前記インクレチンペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
(ii)配列番号701のアミノ酸配列であって、
28位のAsnの、荷電アミノ酸での置換、
28位のAsnの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
28位の、Asn、Asp、またはGluでの置換、
28位の、Aspでの置換、
28位の、Gluでの置換、
29位のThrの、荷電アミノ酸での置換、
29位のThrの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
29位の、Asp、Glu、またはLysでの置換、
29位の、Gluでの置換、
29位の後への、1〜3個の荷電アミノ酸の挿入、
29位の後への、GluまたはLysの挿入、
29位の後への、Gly−LysもしくはLys−Lysの挿入;またはこれらの組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸改変、
ならびにグループAもしくはグループB、またはこれらの組合せから選択される少なくとも1つのアミノ酸改変を含むように改変され、
グループAは、15位のAspの、Gluでの置換、および16位のSerの、ThrまたはAIBでの置換からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
グループBは、
1位のHisの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
2位のSerの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
10位のTyrの、PheもしくはValでの置換、
12位のLysの、Argでの置換、
20位のGlnの、AlaもしくはAIBでの置換、
21位のAspの、Gluでの置換、
24位のGlnの、AlaもしくはAIBでの置換、
27位のMetの、LeuもしくはNleでの置換、
27〜29位のアミノ酸の欠失、
28〜29位のアミノ酸の欠失、
29位のアミノ酸の欠失、
またはこれらの組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
前記インクレチンペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
(iii)配列番号701のインクレチンペプチドであって、
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)(1)i位とi+4位とのアミノ酸側鎖間の、もしくはj位とj+3位とのアミノ酸側鎖間のラクタム架橋(ここで、iは12、13、16、17、20もしくは24であり、jは17である)、または
(2)類似体の16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3個、もしくは全部の、α,α−二置換アミノ酸での置換、
(c)27、28および29位のうちの1、2個または全部のアミノ酸改変、ならびに
(d)1〜6個のさらなるアミノ酸改変
を含むように改変され、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50が約10nM以下である、インクレチンペプチド、
(iv)X1X2X3GTFTSDX10SX12YLX15X16X17X18AX20X21FX23X24WLX27X28X29(配列番号1926)の配列であって、
X1が、His、D−His、(デス−アミノ)His、ヒドロキシル−His、アセチル−His、ホモ−Hisまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)、N−メチルHis、アルファ−メチルHis、およびイミダゾール酢酸からなる群から選択され、
X2が、Ser、D−Ser、Ala、D−Ala、Val、Gly、N−メチルSer、アミノイソ酪酸(Aib)およびN−メチルAlaからなる群から選択され、
X3が、Gln、Glu、OrnおよびNleからなる群から選択され、
X10が、Tyr、ValおよびTrpからなる群から選択され、
X12が、Ser、LysおよびArgからなる群から選択され、
X15が、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択され、
X16が、Ser、Gly、Glu、Gln、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択され、
X17が、Arg、Gln、Lys、Cys、Orn、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
X18が、Arg、Ala、Lys、Cys、Orn、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
X20が、Gln、Lys、Arg、Ornおよびシトルリンからなる群から選択され、
X21が、Gln、Glu、Asp、Lys、Cys、Orn、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
X23が、ValおよびIleからなる群から選択され、
X24が、Ala、Gln、Glu、Lys、Cys、Orn、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
X27が、Met、Val、LeuおよびNleからなる群から選択され、
X28が、Asn、LysおよびAspからなる群から選択され、
X29が、Thr、Gly、Lys、Cys、Orn、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択される、配列、または前記類似体が、1、2、3、5、7、10、11、13、14、17、18、19、21、24、27、28、および29位から選択される1、2もしくは3個のアミノ酸改変が配列番号1926と異なる、配列番号1926の類似体であり、前記インクレチンペプチドがGLP−1受容体の天然GLP−1の活性の少なくとも20%を表す、配列、
(v)16、20、21、および/または24位の、AIBでの1つまたは複数のアミノ酸置換を含む10個以下のアミノ酸改変、ならびにジペプチジルペプチダーゼIVによる切断に対する感受性の低減をもたらす1位および/または2位のアミノ酸改変が配列番号701と異なるアミノ酸であって、前記インクレチンペプチドが、GLP−1受容体の天然GLP−1の活性の少なくとも20%を表す、アミノ酸
を含む。一実施形態では、インクレチンペプチドは、該ペプチドがGPSSGAPPPS(配列番号820)のC末端伸長を含むようにさらに改変された、(ii)から(v)までのいずれかに記載のペプチドを含む。
を含み、
式中、
X1は、TyrまたはHisであり、
X2は、Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリン、アミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニンまたはD−アラニンであり、X2はAibであってもよく、
X3は、GluまたはGlnであり、
X7は、ThrまたはIleであり、
X10は、Lys、TyrまたはValであり、
X12は、Ser、Lys、ArgまたはIleであり、
X15は、GluまたはAspであり、
X16は、GluまたはLysであり、
X17は、GlnまたはArgであり、
X20は、GlnまたはAibであり、
X21は、GluまたはAspであり、
X24は、Asn、GlnまたはAlaであり、
X28は、Ala、Glu、Aspであり、
X29は、AlaまたはGlyである。
式中、
X4は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
X5は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
X8は、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
X9は、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X10は、イソロイシンまたはセリンであり、
X12は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
X14は、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
X17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
X25は、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29は、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34は、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42は、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
R22は、AYRPSE(配列番号14)、FVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、PGPE(配列番号11)、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびN−末端アミンからなる群から選択され、
R13は、COOHまたはCONH2である。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)からなる群から選択される配列、または1、2もしくは3個のアミノ酸置換が配列番号2、5、6もしくは9と異なるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、B鎖のN末端アルファアミンに、またはA鎖のA9、A14およびA15からなる群から選択される位置もしくはB鎖のB1、B2、B10、B24、B28もしくはB29位のアミノ酸の側鎖に、または一本鎖インスリン類似体中の連結部分のアミノ酸の側鎖に連結された親水性部分を含む。あるいは、またはさらに、親水性部分を、16、20、23、24、27、30、32、43位のいずれかのアミノ酸またはC末端領域でインクレチンペプチドに連結してもよい。一実施形態では、インクレチンペプチドの24、30もしくは40位、またはインスリンペプチドのB24、B28もしくはB29位から選択される位置の1個または2個のアミノ酸の側鎖を、親水性部分に連結する。
本発明を記載し、請求する上で、以下の用語を、以下に記載する定義に従って使用する。
本明細書で使用する「約」の語は、10パーセントで記述される値または値の範囲よりも大きい、または小さいことを意味するが、このより広い定義だけに任意の値または値の範囲を指定することを意図するものではない。用語「約」の後に続くそれぞれの値または値の範囲はまた、記述される絶対値または値の範囲の実施形態も包含することが意図される。
本明細書で使用する「非コードアミノ酸」の語は、以下の20個のアミノ酸:Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、TyrのいずれかのL−異性体ではない、あらゆるアミノ酸を包含する。
本明細書で使用する、ペプチドに対する一般参照(general reference)は、改変されているアミノ末端およびカルボキシ末端を有するペプチドを包含するものとされる。例えば、標準のアミノ酸を指定するアミノ酸配列は、N末端およびC末端の標準のアミノ酸、ならびにN末端の対応するヒドロキシル酸、および/または末端のカルボン酸の代わりにアミド基を含むように改変されているC末端の対応するアミノ酸を包含するものとされる。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」の語には、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油/水もしくは水/油エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など、標準的な製薬上の担体のいずれかが含まれる。この語はまた、米国連邦政府の監督官庁により認可されている、または米国薬局方においてヒトを含めた動物において使用するために列挙されている薬剤のいずれかも包含する。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、例示のみにより、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、それだけには限定されないが、1級、2級、および3級アミンの塩が含まれる。
本明細書で使用する「親水性部分」の語は、容易に水に溶解する、または容易に水を吸収し、毒性効果を示さずに(すなわち、生体適合性である)哺乳動物種によってin vivoで許容される任意の化合物を指す。親水性部分の例としては、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ならびにヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルスターチ、ヒドロキシエチルスターチ、またはヒドロキシエチルセルロースおよびそのコポリマーなどの誘導体化セルロースおよびスターチ、ならびに例えば、Fc、アルブミン、および他のポリペプチド、ヘパリンおよびデキストランなどの天然ポリマーが挙げられる。
本明細書で使用する「処置する」の語には、特定の障害もしくは状態の予防、または特定の障害もしくは状態に付随する症状の緩和、および/または前記症状の防止もしくは除去が含まれる。例えば、本明細書で使用する「糖尿病を処置する」の語は、全般的に、血中グルコースレベルを正常レベル付近に維持することを意味し、所与の状況に応じて血中グルコースレベルの上昇または低下を含むことができる。
「非経口」の語は、消化管を介さず、鼻内、吸入、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内など、いくつかの他の経路によるものを意味する。
本明細書で使用する「IGFB16B17類似体ペプチド」は、A鎖が配列番号19のペプチド配列を含み、B鎖が配列番号20の配列を含む、A鎖とB鎖のヘテロ二本鎖、ならびにその一本鎖インスリン類似体、ならびにA鎖および/またはB鎖の類似体が1〜3個のさらなるアミノ酸置換を含むこれらの配列の類似体を含む一般的な語であるが、但し、B鎖は配列番号2の配列を含まず、B16位にチロシンおよびB17位にロイシンを含む。
本明細書で使用する「一本鎖インスリン類似体」の語は、インスリンもしくはIGFのAおよびB鎖、またはその類似体もしくは誘導体が、互いに共有的に連結されて線状ポリペプチド鎖を形成する、構造的に関連するタンパク質の群を包含する。本明細書に開示されるように、一本鎖インスリン類似体は、連結部分を介する、B鎖のカルボキシ末端の、A鎖のアミノ末端への共有結合を含む。
本明細書で使用する「インスリンA鎖」の語は、さらなる記述言語はなく、配列番号1の21アミノ酸の配列ならびにA19インスリン類似体のA鎖およびA4、A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21から選択される位置での1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換による配列番号1の配列の改変などの、当業者には公知の他の類似体などの、その機能的類似体および誘導体を包含することが意図される。
本明細書で使用する「同一性」の語は、2つ以上の配列間の類似性に関する。同一性は、同一の残基の数を、残基の合計数によって除し、成績に100を乗じてパーセント値を実現することにより測定する。よって、正確に同じ配列の2コピーは同一性100%であるが、相互に関してアミノ酸の欠失、付加、または置換を有する2つの配列は同一性の度合いが低い。当業者であれば、BLAST(ベーシックローカルアラインメント検索ツール、Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410)などのアルゴリズムを使用するものなどの、いくつかのコンピュータプログラムが、配列同一性の決定に入手可能であることを認識されよう。
「GLP−1アゴニスト」の語は、その開示が参照によって本出願に特に援用される、公開されている2007年5月18日公開の国際出願第WO2007/056362号の例13に記載されているものなどの、確証されているin vitroのモデルアッセイを使用してcAMP生成によって測定して、GLP−1受容体活性を刺激する化合物を意味する。
本明細書で使用する「GLP−1ペプチド」の語は、天然のGLP−1、および天然のGLP−1配列に対してアミノ酸改変を1つまたは複数有する改変されている誘導体を指す総称である。
本明細書で使用する場合、第2の受容体と比較した第1の受容体に対する分子の「選択性」の語は、以下の比:第1の受容体での分子のEC50で除算した第2の受容体での分子のEC50を指す。例えば、第1の受容体で1nMのEC50および第2の受容体で100nMのEC50を有する分子は、第2の受容体と比較して第1の受容体に対する100倍の選択性を有する。
本明細書で使用する「保存的なアミノ酸置換」の語は、本明細書において以下の5つの群のうち1つ以内の交換と規定される:
I.小型の脂肪族の無極性またはわずかに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、
II.極性の負に荷電している残基、およびこれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln,システイン酸、およびホモシステイン酸:
III.極性の正に荷電している残基:
His、Arg、Lys、オルニチン(Orn)
IV.大型の脂肪族の無極性残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン(Nle)、ホモシステイン
V.大型の芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン
本明細書で使用する「リンカー」は、2つの別々の実体を相互に結合する、結合、分子、または分子の群である。リンカーは、2つの実体の最適な間隔を提供し得、または2つの実体が相互に離れているようにする不安定な連結をさらに供給し得る。柔軟な連結には、光切断性基、酸に不安定な部分、塩基に不安定な部分、および酵素切断性基が含まれる。
本明細書で使用する「ダイマー」は、リンカーによって相互に共有結合している2つのサブユニットを含む複合体である。ダイマーの語は、いかなる限定語の存在なしで使用する場合、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を包含する。ホモダイマーは同一のサブユニットを2つ含み、ヘテロダイマーは異なるサブユニットを2つ含むが、2つのサブユニットは相互に実質的に類似する。
本明細書で使用する、nが1〜6であってよい「C1−Cnアルキル」の語は、1から特定する数までの炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を意味する。典型的なC1−C6アルキル基には、それだけには限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
nが2〜6であってよい「C2−Cnアルキニル」の語は、2からn個までの炭素原子および少なくとも1つの三重結合を有する、不飽和の分枝または直鎖の基を表す。このような基の例には、それだけには限定されないが、1−プロピニル、2−プロピニル、1−ブチニル、2−ブチニル、1−ペンチニルなどが含まれる。
本明細書で使用する「ヘテロアリール」の語は、芳香環を1または2個含み、芳香環に窒素、酸素、またはイオウの原子を少なくとも1個含む、単環式または二環式環系を意味する。ヘテロアリール環のサイズ、および置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指摘することにより示される。例えば、「(C1−Cnアルキル)(C5−C6ヘテロアリール)」の語は、親部分に1員から「n」員のアルキル鎖によって結合している5または6員のヘテロアリールを意味する。
本明細書で使用する、さらなる呼称のない「患者」の語は、飼育されているあらゆる温血脊椎動物(例えば、それだけには限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットを含む)およびヒトを包含することが意図される。
本明細書で使用する、「単離された」の語は、その天然の環境から取り出されていることを意味する。一部の実施形態では、類似体を、組換え方法を介して作製し、類似体を、宿主細胞から単離する。
本明細書で使用する、「精製された」の語は、天然または自然の環境において分子または化合物と通常結合する夾雑物を実質的に含まない形態での分子または化合物の単離に関し、元の組成物の他の成分から分離される結果として、純度が増大していることを意味する。「精製されたポリペプチド」の語は、限定されるものではないが、核酸分子、脂質および炭水化物などの他の化合物から分離されたポリペプチドを記述するために本明細書で使用される。
本明細書で使用する「酸性アミノ酸」の語は、例えば、側鎖カルボン酸基またはスルホン酸基などの、第2の酸性部分(アミノ酸のアルファカルボン酸以外)を含むアミノ酸を指す。
本明細書で使用する、さらなる呼称のない「患者」の語は、飼育されているあらゆる温血脊椎動物(例えば、それだけには限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットを含む)、哺乳動物、およびヒトを包含するものとされる。
インスリン類似体は、以下のように省略される。
インスリンAおよびBは、A鎖については大文字AおよびB鎖については大文字Bで指定される。天然のインスリンおよびIGF配列から外れる改変は、AまたはB鎖の指定の後に括弧内に示され(例えば、[B1(H5,H10,Y16,L17):A1(H8,N18,N21)])、一文字のアミノ酸省略形は置換を示し、数字は天然のインスリンのナンバリングを用いた場合のそれぞれのAまたはB鎖中の置換の位置を示す。A鎖とB鎖との間のコロンは、二本鎖のインスリンを示すが、ダッシュ記号は共有結合、かくして、一本鎖類似体を示す。一本鎖類似体では、連結部分はA鎖とB鎖との間に含まれ、C1の指定は、配列番号23の天然のIGF 1Cペプチドを指す。連結部分を参照する指定「C8位」は、配列番号23の8番目のアミノ酸に対応する位置に位置するアミノ酸を指す。
患者において血糖値を低下させる活性を有する、ならびに体重減少を誘導する、インスリンペプチドとグルカゴン関連ペプチド(インクレチン)とのコンジュゲートが本明細書に開示される。インクレチン−インスリンコンジュゲート(インクレリン)を、インクレチンのカルボキシ末端が、インスリンペプチドのB鎖に連結されたペプチド融合物として形成することができる。そのような化合物は、インスリン受容体とそれぞれのインクレチン受容体の両方において活性を示すことが見出された。しかしながら、そのようなコンジュゲートは、インスリン受容体で活性が実質的に減少している(図1を参照)。
R1、R2、R3およびR4は、H、およびC1−C3アルキルからなる群から独立に選択され、
Yは、C、S、SeまたはS=Oであり、
Zは、C、S、Se、−S(C1−C3)(C5−C6アリール)−であるか、またはYと組み合わせたZは、−C=C−、−O−N=、−N−N=、もしくは1,2,3トリアゾールであり、
nは0または1であり、
mは1、2または3であり、YがS=Oである場合、ZはCである)
一実施形態では、スペーサーは、YがC、S、もしくはSeであり、ZがC、S、もしくはSeであるか、またはYと組み合わせたZが、−O−N=もしくは1,2,3トリアゾールであるが、但し、YとZが両方ともCではない、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、YがC、S=O、もしくはSeであり、ZがCであるか、またはYと組み合わせたZが−O−N=もしくは1,2,3トリアゾールである、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、YがSもしくはSeであり、ZがC、S、もしくはSeであるか、またはYと組み合わせたZが−O−N=もしくは1,2,3トリアゾールである、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Yと組み合わせたZが−O−N=または1,2,3トリアゾールである、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Yと組み合わせたZがオキシムまたはヒドラゾンを形成する、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、R1、R2、R3およびR4が、HおよびCHからなる群から独立に選択され、YがC、SまたはSeであり、ZがSeまたはSであり、nが0または1であり、mが1、2または3である、式Iの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、R1、R2、R3およびR4が、HおよびCHからなる群から独立に選択され、YおよびZがSおよびSeから独立に選択され、nが0または1であり、mが1、2または3である、式Iの一般構造を有する。
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーの(CH2)nCR1R2S部分は、インクレチンのC末端アミノ酸の側鎖を表し、一実施形態(nが0であり、R1およびR2がそれぞれHである場合)では、C末端アミノ酸はシステインである。さらに、一実施形態では、スペーサーの−SCR1R2(CH2)m部分は、インスリンB鎖の、N末端のチオール誘導化、またはアミノ酸側鎖を表す。ジスルフィド結合の形成は、誘導体化されたインスリンをインクレチンに連結させて、インクレリンを形成する。
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、R1がHまたはCH3であり、YがSであり、ZがSである、式IIIの一般構造を含む。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、以下の構造を含む。
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、一般式I、II、IIIまたはIVのスペーサーを介する、インスリンA鎖またはB鎖のアミノまたはカルボキシ末端へのインクレチンペプチドのカルボキシ末端の共有的連結を含む。別の実施形態では、インスリンペプチドのN末端またはC末端を、式I、II、IIIまたはIVのスペーサーを介して、10、20、24、28および29から選択される位置(B29位であってもよい)でインクレチンペプチドのアミノ酸の側鎖に共有的に連結する。
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号756)、
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)、
H(aib)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1932)、
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1933)、および
YaibEGTFISDYSIYLDRQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1934)からなる群から選択されるペプチド、または例えば、10位での置換(リシンでの置換であってもよい)、および/もしくは40位でのアミノ酸の付加(リシンであってもよい)などの、1、2もしくは3個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号756、1931、1932、1933もしくは1934と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、10位および/もしくは40位のリシンをアシル化する、ならびに/または40位の付加されるアミノ酸をペグ化する。一実施形態では、インクレチンペプチドは、
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号756)、
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)、および
H(aib)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1932)からなる群から選択されるペプチドである。一実施形態では、インクレチンペプチドは、
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号756)、または
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)である。一実施形態では、インクレチンペプチドは、Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号756)、または例えば、10位での置換(リシンでの置換であってもよい)、および/もしくは40位でのアミノ酸の付加などの、1、2もしくは3個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号756と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、10位のリシンをアシル化する、および/または40位の付加されるアミノ酸をペグ化する。一実施形態では、インクレチンペプチドは、H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)、または例えば、10位での置換(リシンでの置換であってもよい)、および/もしくは40位でのアミノ酸の付加などの、1、2もしくは3個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号1931と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、10位のリシンをアシル化する、および/または40位の付加されるアミノ酸をペグ化する。
R22はアミン、またはFVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、VNQ、NQおよびQからなる群から選択される1〜4アミノ酸の配列であり、
X8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
X21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
X45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである。一実施形態では、インスリンは、一般式I(本明細書で定義される)のスペーサーを介してインクレチンに連結され、インクレチンペプチドは、配列X80X81X82GTFTSDX95SX83YLX84X85X86X87AX88X89FX90X91WLX92X93X94−Z(配列番号1928)(式中、X80はHis、Tyr、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、X81は、Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリン、アミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニンまたはD−アラニンであり、X82はGlnまたはGluであり、X83はLysまたはIleであり、X84はAspまたはGluであり、X85はLys、Arg、SerまたはGluであり、X86はArgまたはGlnであり、X87はAlaまたはArgであり、X88はAib、GlnまたはLysであり、X89はAspまたはGluであり、X90はValまたはIleであり、X91はAsn、GlnまたはAlaであり、X92はLeu、ValまたはMetであり、X93はAsp、Lys AsnまたはAlaであり、X94はGlyまたはThrであり、Zは−COOH、−CONH2およびGPSSGAPPPS−CONH2(配列番号823)からなる群から選択され、X95はTyrである)を含む。一実施形態では、X80はHisまたはTyrであり、X86はaibである。
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)のB鎖配列、または1、2もしくは3個のアミノ酸置換が配列番号1および/もしくは配列番号2と異なるA鎖および/もしくはB鎖を含み、ここで、B鎖は、ジスルフィド結合を介してA鎖に連結され、
直鎖スペーサーは、式II:
の一般構造を含み、
インクレチンペプチドは、配列X80X81X82GTFTSDX79SX83YLX84X85X86X87AX88X89FX90X91WLX92X93X94−Z(配列番号1928)
(式中、
X79はC12−C18アシルまたはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、
X80はHis、Tyr、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
X81は、Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニンおよびD−アラニンであり、
X82はGlnまたはGluであり、
X83はLysまたはIleであり、
X84はAspまたはGluであり、
X85はLys、Arg、SerまたはGluであり、
X86はArgまたはGlnであり、
X87はAlaまたはArgであり、
X88はアミノイソ酪酸、GlnまたはLysであり、
X89はAspまたはGluであり、
X90はValまたはIleであり、
X91はAsn、GlnまたはAlaであり、
X92はLeu、ValまたはMetであり、
X93はAsp、Lys AsnまたはAlaであり、
X94はGlyまたはThrであり、
X95は結合またはGlyであり、Z1は−COOH、GPSSGAPPPS(配列番号820)、KRNRNNIA(配列番号821)、およびKRNR(配列番号822)からなる群から選択される)
を含む。一実施形態では、インクレチンペプチドは、配列X80X81X82GTFTSDX79SX83YLX84X85X86X87AX88X89FX90X91WLX92X93X94−Z1(配列番号1928)
(式中、
X79はC12−C18アシルもしくはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、リシンであってもよく、またはX80はHisもしくはTyr、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンもしくはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、もしくはイミダゾール酢酸であり、X81はD−セリンもしくはアミノイソ酪酸(AIB)であり、X82はGlnもしくはGluであり、X83はLysもしくはIleであり、X84はAspもしくはGluであり、X85はLys、Arg、SerもしくはGluであり、X86はArgもしくはGlnであり、X87はAlaもしくはArgであり、X88はアミノイソ酪酸、GlnもしくはLysであり、X89はAspもしくはGluであり、X90はValもしくはIleであり、X91はAsn、GlnもしくはAlaであり、X92はLeu、ValもしくはMetであり、X93はAla、Asp、Lys AsnもしくはAlaであり、X94はGlyもしくはThrであり、Z1は−COOH、GPSSGAPPPS(配列番号820)、KRNRNNIA(配列番号821)、およびKRNR(配列番号822)からなる群から選択される)
を含む。一実施形態では、Z1は配列番号820(GPSSGAPPPS)である。
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)のB鎖配列、または1、2もしくは3個のアミノ酸置換が配列番号1および/もしくは配列番号2と異なるA鎖および/もしくはB鎖を含み、ここで、B鎖は、ジスルフィド結合を介してA鎖に連結され、
直鎖スペーサーは、式II:
の一般構造を含み、
インクレチンペプチドは、配列X80X81X82GTFTSDX79SKYLX84X85X86AAX88X89FVQWLX90X91X92X93X94GPSSGAPPPS(配列番号1929)
(式中、
X79はC12−C18アシルまたはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、
X80はTyr、His、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)、N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
X81は、DPP−IV保護アミノ酸であり、アルファ、アルファ−二置換アミノ酸(例えば、AIB)であってもよく、
X82はGlu、Ala、Leu、Ile、Nle、Val、NorVal、ホモセリン、Met、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アセチル−Orn、アセチル−ジアミノブタン酸、およびアセチル−Lysからなる群から選択され、
X84は酸性アミノ酸であり、GluまたはAspであってもよく、
X85はGlu、Ala、アルファ、アルファ−二置換アミノ酸(例えば、AIB)、Hiis、Lysであり、
X86はArg、HisまたはGlnであり、
X88はアルファ、アルファ−二置換アミノ酸(例えば、AIB)またはGlnまたはHis、Lys、またはAlaからなる群から選択され、
X89は酸性アミノ酸であり、AspまたはGluであってもよく、
X90はLeu、Ala、またはNleであり、
X91はAla、Lys、または酸性アミノ酸(AspもしくはGluであってもよい)であり、
X92は脂肪族、例えば、AlaまたはGlyまたはAIBまたはValであり、
X93は低分子脂肪族アミノ酸、例えば、AlaまたはGlyであり、
X94はAlaまたは塩基性アミノ酸(ArgもしくはLysであってもよい)である)
を含む。
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)、
H(aib)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1932)、
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1933)、および
YaibEGTFISDYSIYLDRQAAaibEFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1934)からなる群から選択されるペプチドであるか、または10もしくは40位でC12−C18アシルもしくはアルキル基に共有結合したアミノ酸を含むように改変された、直前の配列の改変であってもよく、インクレチンをインスリンペプチドに結合させるスペーサーは、式II:
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、R1、R2、R3およびR4がH、およびCH3からなる群から独立に選択され、nが1であり、mが2である、式IIの一般構造を含む。一実施形態では、リンカーは、式IV:
の構造を含む。一実施形態では、リンカーは、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)
からなる群から選択されるB鎖配列とを含む。
Xが、配列
X1X2EGTFTSDX10SIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号2037)、
X1X2EGTFTSDVSIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPSX40(配列番号2038)、
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号756)、または
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS−アミド(配列番号1931)
(式中、X1はHisまたはTyrであり、X2はアミノイソ酪酸であり、X10はガンマGluリンカーを介してもよい、C16−C20アルキル基でアシル化されたLysであり、X20はアミノイソ酪酸であり、X40はガンマGluリンカーを介してもよい、C16−C20アルキル基でアシル化されたLysである)
を有するインクレチンペプチドであり、
Xが、インクレチンをインスリンペプチドに結合させ、式IIの一般構造を含むスペーサーであり、
または、スペーサーが、式IVの一般構造を含み、
Zが、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)
からなる群から選択されるB鎖配列とを含むインスリンペプチドである、インスリンアゴニスト/インクレチンコンジュゲートが提供される。
X1X2EGTFTSDX10SIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号2037)およびX1X2EGTFTSDVSIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPSX40(配列番号2038)
(式中、
X1は、HisまたはTyrであり、
X2は、アミノイソ酪酸であり、
X10は、ガンマGluリンカーを介してもよくC16−C20アルキル基でアシル化されたLysであり、
X20は、アミノイソ酪酸であり、
X40は、ガンマGluリンカーを介してもよくC16−C20アルキル基でアシル化されたLysである)
からなる群から選択されるインクレチンペプチドと、
GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21(配列番号3)のA鎖配列、および
R22−HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45(配列番号15)のB鎖配列
(式中、B鎖はジスルフィド結合を介してA鎖に連結され、
R22は、結合であるか、またはFVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号9)、VNQ、NQおよびQからなる群から選択される1〜4個のアミノ酸の配列であり、
X8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
X21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
X45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである)
を含むインスリンペプチドと、
スペーサーが、
の一般構造を含む、インクレチンをインスリンペプチドに結合させる直鎖スペーサーと
を含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。さらなる実施形態では、インスリンペプチドは、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)およびFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)からなる群から選択されるB鎖配列と
を含む。一実施形態では、インスリン成分は、二本鎖インスリンである。
の一般構造を含み、
A鎖は、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)の配列を含み、B鎖は、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)およびFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)からなる群から選択される配列を含む、または1もしくは2個のアミノ酸置換が配列番号1987、1993、2014および2015と異なるインクレチンおよび/または1もしくは2個のアミノ酸置換が配列番号1と異なるインスリンA鎖および/または1もしくは2個のアミノ酸置換が配列番号2と異なるインスリンB鎖を含む。
本開示のコンジュゲートのインスリンペプチド成分は、ヒトインスリンの天然のB鎖およびA鎖配列(それぞれ、配列番号1および2)またはヘテロ二本鎖中で互いに連結された場合、インスリンアゴニスト活性を示す任意の公知のその類似体もしくは誘導体を含んでもよい。そのような類似体は、例えば、インスリン類似体のインスリン活性を破壊しない、1つもしくは複数のアミノ酸欠失、1つもしくは複数のアミノ酸置換、および/または1つもしくはアミノ酸挿入を有することが、ヒトインスリンのA鎖およびB鎖と異なる、A鎖とB鎖とを有するタンパク質を含む。コンジュゲートのインスリンペプチド成分は、例えば、国際出願第WO96/34882号、第WO2010/080607号、第WO2010/080609号、第WO2011/159882号、第WO/2011/159895号および米国特許第6,630,348号(これらの開示は参照により本明細書に援用される)に開示された任意のインスリンペプチドを含んでもよい。
(a)B28位のアミノ酸残基がAsp、Lys、Leu、Val、またはAlaで置換され、B29位のアミノアシル残基がLysまたはProで置換される、
(b)B27、B28、B29、およびB30位のいずれかのアミノ酸残基が欠失するか、または非天然アミノ酸で置換される、
インスリン類似体である。一実施形態では、B28位で置換されたAsp、または28位で置換されたLysおよびB29位で置換されたプロリンを含むインスリン類似体が提供される。さらなるインスリン類似体は、Chanceらの米国特許第5,514,646号;Chanceらの米国特許出願第08/255,297号;Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533 (1992);Brangeらの欧州特許出願公開第214,826号(1987年3月18日公開);およびBrange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991)に開示されている。これらの開示は、参照により本明細書に明示的に援用される。
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)、
GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT(配列番号69)またはAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA(配列番号71)、またはB26、B27、B28、B29およびB30に対応する1〜5個のアミノ酸が欠失されたそのカルボキシ短縮配列、ならびに、それぞれの配列が、A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29およびB30から選択される天然のインスリン位置に対応する位置(図1に示されるペプチドアラインメントを参照されたい)に1〜5個のアミノ酸置換を含むように改変されたこれらの配列の類似体を含む。一実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望の活性に有害に影響しないこれらの位置での好適なアミノ酸置換は、例えば、Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007;88(5):687-713(この開示は参照により本明細書に援用される)に示されるように、当業者には公知である。
式中、
X4は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
X5は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
X8は、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
X9は、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X10は、イソロイシンまたはセリンであり、
X12は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
X14は、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
X17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸またはリシン、オルニチンであり、
X18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
X21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
X25は、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29は、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33は、アスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34は、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42は、アラニン、リシン、オルニチンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45は、チロシン、ヒスチジン、アスパラギンまたはフェニルアラニンであり、
R22は、AYRPSE(配列番号14)、FVNQ(配列番号12)、PGPE(配列番号11)、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸および結合からなる群から選択され、
R13は、COOHまたはCONH2である。一実施形態では、A鎖とB鎖は、天然インスリンのA鎖とB鎖との間で形成するものなどの、ジスルフィド結合により互いに連結される。代替的な実施形態では、A鎖とB鎖は、線状一本鎖インスリンペプチドとして一緒に連結される。
式中、
X8がトレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
X21がアスパラギンまたはグリシンであり、
X25がヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42がアラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45がチロシンまたはフェニルアラニンであり、
R22がFVNQ(配列番号12)、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミンおよびN−末端アミンからなる群から選択され、
Z1がアスパラギン酸−リシン、リシン−プロリン、およびプロリン−リシンからなる群から選択され、
B1がトレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される、インスリン類似体が提供される。
本明細書に開示されるように、連結部分を用いて、ヒトインスリンA鎖とB鎖、またはその類似体もしくは誘導体を連結することができ、B鎖のB25アミノ酸のカルボキシ末端を、連結部分の第1の末端に直接連結し、連結部分の第2の末端を、介在連結部分を介してA鎖のA1アミノ酸のアミノ末端に直接連結する。
を有する。一実施形態によれば、非ペプチド連結部分は、約4〜20、8〜18、8〜16、8〜14、8〜12、10〜14、10〜12または11〜13個のモノマーのポリエチレングリコールリンカーである。
式中、
X4がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
X5がグルタミンまたはグルタミン酸であり、
X8がヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
X9がアルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンから選択され、
X10がイソロイシンまたはセリンであり、
X12がセリンまたはアスパラギン酸であり、
X14がチロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X15がアルギニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
X17がグルタミン酸またはグルタミンであり、
X18がメチオニン、アスパラギンまたはトレオニンであり、
X21がアラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
X25がヒスチジンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42がアラニン、リシン、オルニチンおよびアルギニンからなる群から選択され、
R22がAYRPSE(配列番号14)、FVNQ(配列番号12)、PGPE(配列番号11)、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびN末端アミンからなる群から選択され、
R13がCOOHまたはCONH2であり、さらに、指定X45のアミノ酸が連結部分LMに直接結合する(すなわち、本明細書で用いられる指定IB−LM−IAは、B鎖のカルボキシル末端とA鎖のアミノ末端が、さらなる介在アミノ酸なしに、連結部分LMに直接連結されることを表すことが意図される)、構造IB−LM−IAを有するインスリンペプチドを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。
一実施形態では、IBが配列X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45(配列番号20)を含み、LMが配列SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK(配列番号1923)、SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR(配列番号1922)、GYGSSSRR(配列番号61)またはGAGSSSRR(配列番号1925)を含み、IAが配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18YCX21−R44(配列番号19)を含み、
式中、
X4がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
X5がグルタミンまたはグルタミン酸であり、
X8がヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
X9がセリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X10がイソロイシンまたはセリンであり、
X12がセリンまたはアスパラギン酸であり、
X14がチロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X15がグルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
X17がグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
X18がメチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
X21がアラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
X25はヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42がアラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45がチロシンまたはフェニルアラニンであり、
R22がAYRPSE(配列番号14)、FVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、PGPE(配列番号11)、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびN末端アミンからなる群から選択され、
R44がCOOHまたはCONH2である、一般式IB−LM−IAを有するインスリンペプチドを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。
新生in vivoタンパク質産生の間に、グリコシル化部位を含むインスリン類似体は、糖(グリコシル)残基を、グリコシル化として知られるプロセスにおいて酵素的に付加することができる、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを受けてもよい。共有的に連結されたオリゴ糖側鎖を担持する得られるタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質または糖タンパク質として知られる。したがって、グリコシル化部位を担持するタンパク質は、グリコシル化されている必要はない。一実施形態によれば、真核発現系において発現された場合に、高グリコシル化を受けやすいペプチド配列を含むように改変されたインスリンアゴニスト類似体が提供される。
出願人は、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートのペプチドまたはインクレチンへの親水性部分の共有的連結が、活性のより遅い開始、長い持続時間を有し、ベースプロファイルを示す類似体を提供することを発見した。一実施形態では、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートを、インクレチンペプチドの24、30もしくは40からなる群から選択される位置、および/またはA鎖のA9、A14およびA15位のアミノ酸の側鎖、B鎖のN末端アルファアミンまたはB鎖のB1、B2、B3、B10、B22、B28もしくはB29位のアミノ酸の側鎖またはインスリン一本鎖類似体中のA鎖とB鎖とを連結する連結部分の任意の位置、またはその任意の組合せに共有的に連結された親水性部分を含むようにさらに改変する。例示的な実施形態では、この親水性部分を、これらの位置のいずれかにおいてLys、Cys、Orn、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニン残基に共有的に連結する。一実施形態では、インスリンペプチドは、一本鎖類似体であり、親水性部分は、A鎖とB鎖とを結合させる連結部分のアミノ酸の側鎖に共有的に連結される。
一部の実施形態では、インスリンペプチドまたはインクレチン−インスリンコンジュゲートのインクレチンを、アシル基を含むように改変する。アシル基を、インクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に直接的に、またはインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸とアシル基との間に位置するスペーサーを介してインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に間接的に共有的に連結してもよい。インクレチン−インスリンコンジュゲートを、親水性部分が連結されるのと同じアミノ酸位置で、または異なるアミノ酸位置でアシル化してもよい。例えば、アシル化は、非アシル化インクレチン−インスリンコンジュゲートにより示される活性がアシル化時に保持されるのであれば、インクレチンペプチドの10、16、30もしくは40位のいずれかまたはA鎖もしくはB鎖の任意のアミノ酸ならびに連結部分内の位置を含む任意の位置で行ってもよい。非限定例としては、A鎖のA14およびA15位、またはB鎖のB1、B10、B22、B28もしくはB29位または連結部分の任意の位置でのアシル化が挙げられる。さらなる非限定例としては、C末端伸長インクレチンペプチドの10、16、および20、ならびに30または40位でのアシル化が挙げられる。
のアミノ酸との置換を含む。一実施形態では、nは4である。
代替の一実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、それだけには限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸を含めたあらゆる適切な胆汁酸であってよい。
一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、アルキル基を含むように改変される。アルキル基を、インスリンペプチドもしくはインクレチンペプチドのアミノ酸に直接的に、またはインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸とアルキル基との間に位置するスペーサーを介してインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に間接的に共有的に連結することができる。アルキル基を、エーテル、チオエーテル、またはアミノ結合によりインクレチン−インスリンコンジュゲートに結合することができる。例えば、インクレチン−インスリンコンジュゲートを、親水性部分が連結されるのと同じアミノ酸位置で、または異なるアミノ酸位置でアルキル化してもよい。
長鎖アルカンがインクレチン−インスリンコンジュゲートまたはスペーサーによってアルキル化されている場合、長鎖アルカンは、あらゆるサイズであってよく、あらゆる長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖でも、または分枝でもよい。ある特定の態様では、長鎖アルカンは、C4〜C30アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、C4アルカン、C6アルカン、C8アルカン、C10アルカン、C12アルカン、C14アルカン、C16アルカン、C18アルカン、C20アルカン、C22アルカン、C24アルカン、C26アルカン、C28アルカン、またはC30アルカンのいずれかであってよい。一部の実施形態では、長鎖アルカンは、C8−C20アルカン、例えば、C14アルカン、C16アルカン、またはC18アルカンを含む。
また、一部の実施形態では、アルキル化は、インスリン類似体とコレステロール部分との間に生じ得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は、長鎖アルカン上の脱離基の位置を変えて、コレステロール−インスリンペプチド生成物を形成することができる。
あるいは、本明細書に記載のインクレチン−インスリンコンジュゲートが、それが投与される体内に放出される様式が体内で時間および位置に関して制御されるように、本開示のコンジュゲートをデポー製剤に改変してもよい(例えば、米国特許第4,450,150号を参照されたい)。デポー型の本開示のコンジュゲートは、例えば、本開示のコンジュゲートと、ポリマーなどの多孔性または非多孔性材料とを含む埋込み可能な組成物であってもよく、本開示のコンジュゲートは、前記材料により包含される、または該材料を通って、および/もしくは非多孔性材料の分解により拡散する。次いで、デポーは体内の所望の位置に埋め込まれ、本開示のコンジュゲートは埋込み体から所定の速度で放出される。
R1、R2、R4およびR8は、H、C1−C18アルキル、C2−C18アルケニル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)SH、(C2−C3アルキル)SCH3、(C1−C4アルキル)CONH2、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2、(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2、(C0−C4アルキル)(C3−C6シクロアルキル)、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)、およびC1−C12アルキル(W)C1−C12アルキルからなる群から独立に選択され、WはN、SおよびOからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはR1およびR2は、それらが結合する原子と一緒になって、C3−C12シクロアルキルもしくはアリールを形成するか、またはR4およびR8は、それらが結合する原子と一緒になって、C3−C6シクロアルキルを形成し、
R3は、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、および(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)からなる群から選択されるか、またはR4およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、4、5もしくは6員の複素環を形成し、
R5は、NHR6またはOHであり、
R6は、H、C1−C8アルキルであるか、またはR6およびR2は、それらが結合する原子と一緒になって、4、5もしくは6員の複素環であり、
R7は、HおよびOHからなる群から選択される)
の一般構造を含む。一実施形態では、プロドラッグエレメントがインクレチン−インスリンコンジュゲートのN末端アミンに連結され、R4およびR3が、それらが結合する原子と一緒になって、4、5または6員の複素環を形成する場合、R1およびR2の少なくとも一方はH以外のものである。
式中、Qは、本明細書に開示されるインクレチン/インスリンコンジュゲートであり、
Aは、側鎖を含むアミノ酸またはヒドロキシル酸であり、(C1−C8アルキル)NH2であってもよく、Aの側鎖は、例えば、哺乳動物血清アルブミンなどの哺乳動物血漿タンパク質に不可逆的に結合する部分に共有的に連結される。一実施形態では、Aの側鎖は、好ましくは、少なくとも18、19、20、21または22個の炭素の長さである、脂肪酸、コール酸、胆汁塩または胆汁酸のステロイド部分などの、アシル基またはアルキル基に共有的に連結される。一実施形態では、Aの側鎖は、C16−C30アシル基またはC16−C30アルキル基に共有的に連結される。
Bは、N−アルキル化されたアミノ酸であり、
Cは、アミド結合X70またはX70X71であり、X70およびX71は、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から独立に選択されるアミノ酸であり、A−B−Cは、Qの脂肪族アミノ基を介するアミド結合によりQに連結される。
式中、
R1は、(C1−C6アルキル)NH−R9または(C1−C6アルキル)NH−S1−R9であり、
R2は、HまたはC1−C6アルキルであり、
R3は、C2−C4アルキル、C3−C8アルケニル、(C0−C4アルキル)(C4−C6シクロアルキル)、(C0−C4アルキル)(C3−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)および(C1−C4アルキル)(C6−C10複素環)であるか、またはR4およびR3は、それらが結合する原子と一緒になって、4、5もしくは6員の複素環を形成し、
R4およびR8は、H、C1−C18アルキル、C2−C18アルケニル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)SH、(C2−C3アルキル)SCH3、(C1−C4アルキル)CONH2、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2、(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2、(C0−C4アルキル)(C3−C6シクロアルキル)、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)、およびC1−C12アルキル(W1)C1−C12アルキルからなる群から独立に選択され、W1はN、SおよびOからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはR4およびR8は、それらが結合する原子と一緒になって、C3−C6シクロアルキルを形成し、
R5は、NHR6またはOHであり、
R6は、HまたはC1−C8アルキルであり、
R7は、H、OH、C1−C18アルキル、C2−C18アルケニル、(C0−C4アルキル)NH2、および(C0−C4アルキル)OHからなる群から選択され、
R9は、C18−C30アシルからなる群から選択され、
R10、R11、R12およびR13は、H、CH2、CHOH、CH2SH、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2、(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2およびCH2(C3−N2複素環)からなる群から独立に選択され、
S1は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される1個または2個の荷電アミノ酸からなるスペーサーであり、A−B−Cは、Qの脂肪族アミノ基を介するアミド結合によりQに連結される。一実施形態では、R1は、(C1−C6アルキル)NH−S1−R9であり、R3は、C2−C4アルキルからなる群から選択され、R2、R4、R11およびR13は、それぞれHであり、R5は、NH2であり、R8は、HまたはC1−C8アルキルであり、R9は、C18−C30アシルであり、R10およびR12は、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2および(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2からなる群から独立に選択され、S1はアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される1個または2個の荷電アミノ酸を含むスペーサーである。
さらなる実施形態では、直前の段落に開示されたペプチドプロドラッグエレメントA−B−Cは、保存中の、および患者への投与の前のペプチドプロドラッグエレメントの切断を防止するようにさらに改変される。一実施形態では、ペプチドプロドラッグエレメントのN末端アミンは、患者への投与までN末端に結合したままである部分に連結される。一実施形態では、式A−B−C−Qのインスリンプロドラッグは、AのN末端アミンを介してAに連結される血清酵素切断性部分をさらに含む。一実施形態では、酵素切断性部分は、例えば、Arg−Pro、Lys−ProまたはGlu−Proのジペプチドなどの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)により切断されるペプチドである。
出願人は、グルカゴン、GLP1およびGIP受容体での活性が変化したグルカゴンの類似体を発見した。これらの類似体のいずれか(一般には、インクレチンと呼ばれる)を、本明細書に記載のコンジュゲート中でグルカゴン関連ペプチドとして使用することができる。より具体的には、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載のクラス1、クラス2またはクラス3グルカゴンペプチドのいずれかであってもよい。
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびにその内容の全文が参照によって援用される、国際特許出願第PCT US2009/47437号(2009年6月16日出願)、および2008年7月17日公開の国際特許出願公開第WO2008/086086号に記載される、クラス1のグルカゴン関連ペプチドである。
クラス1グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて参照する生物学的配列(配列番号801〜915)は、国際特許出願第PCT US2009/47437号における配列番号1〜115に対応する。
クラス1グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンペプチド(配列番号801)に対してグルカゴン受容体活性を保持している。例えば、グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンの、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%の活性、80%の活性、85%の活性、または90%の活性を保持し得る(グルカゴン関連ペプチド対グルカゴンに対するEC50の逆比として計算、例えば、例7において全般的に記載するアッセイを使用したcAMP生成によって測定して)。一部の実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンと同じまたはグルカゴンを超える活性(本明細書において「作用強度」の語と同義に使用される)を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンペプチドの約100%、1000%、10000%、100000%、または1000000%以下の活性を表す。
天然グルカゴンは、特に生理学的pHの水溶液中で難溶性(poor solubility)を表し、経時的に凝集および沈澱する傾向がある。対照的に、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、一部の実施形態では、6〜8の間、または6〜9の間のpHで、例えば、pH7、25℃で24時間後に、天然グルカゴンに比べて少なくとも2倍、5倍、またはさらに高い溶解性を表す。
したがって、一部の実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr(配列番号801)の野生型ペプチドに対して、特に約5.5〜約8.0の範囲のpHの水溶液中のペプチドの溶解性を改善し、一方で天然のペプチドの生物学的活性を保持するように改変されている。
一部の実施形態では、天然の非荷電アミノ酸を、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸で置換することにより、または荷電アミノ酸をペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に加えることにより、クラス1グルカゴン関連ペプチドに電荷を加えることによって溶解性を改善する。
一部の実施形態によれば、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、荷電アミノ酸をペプチドのC末端部分に、および一部の実施形態では、配列番号801のC末端から27位の位置に導入する、アミノ酸の置換および/または付加によってペプチドが改変されている事実により、溶解性が改善されている。荷電アミノ酸1、2、または3個をC末端部分内に導入してもよく、一部の実施形態では、C末端から27位に導入してもよい。一部の実施形態によれば、28位および/もしくは29位の天然のアミノ酸(複数可)を荷電アミノ酸で置換し、ならびに/または、1〜3個の荷電アミノ酸をペプチドのC末端、例えば、27、28、もしくは29位の後に付加する。例示的な実施形態では、1、2、3個、または全ての荷電アミノ酸は負に荷電している。他の実施形態では、1、2、3個、または全ての荷電アミノ酸は正に荷電している。
例示的な一実施形態によれば、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、配列番号811のアミノ酸配列、または天然のグルカゴンに対して1〜3個のさらなるアミノ酸改変(グルカゴンアゴニストに関して本明細書に記載する)を含むその類似体、またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。配列番号811は改変されているクラス1グルカゴン関連ペプチドを表し、天然のタンパク質の28位のアスパラギン残基はアスパラギン酸で置換されている。別の例示的な実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドは配列番号838のアミノ酸配列を含み、天然のタンパク質の28位のアスパラギン残基はグルタミン酸で置換されている。他の例示的な実施形態は、配列番号824、825、826、833、835、836、および837のクラス1グルカゴン関連ペプチドを含む。
クラス1グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、25℃で24時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも95%を保持するなど、安定性の改善および/または分解の低減をさらに表し得る。クラス1グルカゴン関連ペプチドは、作用強度の増大、循環中の長時間の半減期、有効期間の増大、沈殿もしくは凝集の低減、および/または分解の低減、例えば、貯蔵後の切断もしくは化学改変の出現の低減など、薬学上の性質を変更するさらなる改変を含むことができる。
あるいは、本明細書に記載するクラス1グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、配列番号801の16位のアミノ酸を改変することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態では、16位のSerをThrもしくはAIBで置換し、またはグルカゴン受容体の作用強度を増強するクラス1グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載するアミノ酸置換のいずれかで置換する。このような改変により、Asp15−Ser16間のペプチド結合の切断は低減する。
別の実施形態によれば、グルカゴン受容体での作用強度が増強しているクラス1グルカゴン関連ペプチドを提供し、ペプチドは天然グルカゴン(配列番号801)の16位のアミノ酸改変を含む。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、16位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ4原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか1つで、もしくは少なくとも1つのヘテロ原子(例えば、N、O、S、P)を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約4(または3〜5)原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。16位のセリンのグルタミン酸での置換は、グルカゴン受容体でのグルカゴン活性を少なくとも2倍、4倍、5倍、および最高10倍大きく増強する。一部の実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する選択性を、GLP−1受容体に対して、例えば少なくとも5倍、10倍、または15倍の選択性を保持している。
一部の実施形態では、本明細書に開示するクラス1グルカゴン関連ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼIVによる切断に対する感受性を低減するために、1位または2位がさらに改変されている。より詳しくは、一部の実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドの1位および/または2位を、本明細書に記載するDPP−IV抵抗性アミノ酸(複数可)で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの2位を、アミノイソ酪酸で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの2位を、D−セリン、D−アラニン、グリシン、N−メチルセリン、およびε−アミノ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。別の実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドの2位を、D−セリン、グリシン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。一部の実施形態では、2位のアミノ酸はD−セリンではない。
グルカゴン受容体活性は、3位(野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる)のアミノ酸改変、例えば、3位の天然に存在するグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により低減することができる。例えば、3位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊する。
グルカゴン受容体の活性の維持または増強を、3位のGlnを、本明細書に記載するグルタミン類似体で改変することにより実現してもよい。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号863、配列番号869、配列番号870、配列番号871、配列番号872、配列番号873、および配列番号874のアミノ酸配列を含むことができる。
GLP−1受容体の活性の増強は、C末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。逆に、ペプチドのC末端の天然のカルボン酸を保持することで、グルカゴン受容体対GLP−1受容体に対するクラス1グルカゴン関連ペプチドの比較的高い選択性が維持される(例えば、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20倍を超える)。
クラス1グルカゴン関連ペプチドに対して、溶解性および/または安定性および/またはグルカゴン活性をさらに増大し得るさらなる改変を行ってもよい。クラス1グルカゴン関連ペプチドは、溶解性または安定性に実質的に影響を及ぼさず、グルカゴン活性を実質的に低減しない他の改変を、代替的に含むことができる。例示的な実施形態では、クラス1グルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン配列に対して、合計最高11、または最高12、または最高13、または最高14個のアミノ酸改変を含むことができる。例えば、保存的な、または非保存的な置換、付加、または欠失を、2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28、または29位のいずれかで行ってもよい。
クラス1グルカゴン関連ペプチドの例示的な改変には、それだけには限定されないが、
(a)少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で非保存的な置換、保存的な置換、付加、または欠失、例えば、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、または29位の1つまたは複数の保存的置換、10位のTyrのValまたはPheでの置換、12位のLysのArgでの置換、これらの1つまたは複数の位置のAlaでの置換、
(b)少なくとも部分的にグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で29位および/または28位の、および27位でもよいアミノ酸の欠失、
(c)分解を低減し得る、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換などによる、15位のアスパラギン酸の改変;あるいはトレオニン、AIB、グルタミン酸、もしくは長さ4原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸などによる、または代替的に、Asp15−Ser16結合の切断による分解を同様に低減し得る、グルタミン、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸のいずれか1つでの、16位のセリンの改変、
(d)溶解性および/または半減期を増大し得る、16、17、20、21、24、29、40位、またはC末端アミノ酸などの、本明細書に記載する、水溶性ポリマーのポリエチレングリコールなどの親水性部分の付加、
(e)酸化的分解を低減するための、ロイシンまたはノルロイシンでの置換などによる、27位のメチオニンの改変、
(f)Glnの脱アミドによって生じる分解を低減するための、Ser、Thr、Ala、またはAIBでの置換などによる、20位または24位のGlnの改変、
(g)環状スクシンイミド中間体を形成するためのAspの脱水および後続のイソ−アスパルテートへの異性体化によって生じる分解を低減するための、Glnでの置換などによる、21位のAspの改変、
(h)DPP−IV切断に対する抵抗性を改善する、「i」位と「i+4」位の間のラクタム架橋などの分子内架橋と組み合わせてもよい、本明細書に記載する1位または2位の改変(iは12、16、20、24などの12〜15までの整数である)、
(i)親水性部分の付加と組み合わせてもよい、さらにまたはあるいは、GLP−1ペプチドの活性を選択的に低減する改変と組み合わせてもよい、グルカゴン受容体および/もしくはGLP−1受容体での活性を増大し得、循環中の半減期を増大し得、ならびに/または作用の持続時間を延長し得、ならびに/または作用の開始を遅らせ得る、本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドのアシル化またはアルキル化;例えば、7位のThrの改変、例えば、7位のThrの、AbuまたはIleなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換;C末端アミノ酸から27位のアミノ酸の欠失(例えば、28位および29位のアミノ酸の1つまたは両方の欠失、アミノ酸の長さ27または28個のペプチドが得られる)、
(j)本明細書に記載するC末端伸長、
(k)本明細書に記載するホモ二量体化またはヘテロ二量体化;および(a)から(k)までの組合せ
が含まれる。
28位のAsnの、荷電アミノ酸での置換、
28位のAsnの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
28位の、Asn、Asp、もしくはGluでの置換、
28位の、Aspでの置換、
28位の、Gluでの置換、
29位のThrの、荷電アミノ酸での置換、
29位のThrの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
29位の、Asp、Glu、もしくはLysでの置換、
29位の、Gluでの置換、
29位の後への、1〜3個の荷電アミノ酸の挿入、
29位の後への、GluもしくはLysの挿入、
29位の後への、Gly−LysもしくはLys−Lysの挿入;またはこれらの組合せであり、
グループBは、
15位のAspの、Gluでの置換、
16位のSerの、ThrまたはAIBでの置換であり、
グループCは、
1位のHisの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
2位のSerの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
12位のLysの、Argでの置換、
20位のGlnの、Ser、Thr、Ala、またはAIBでの置換、
21位のAspの、Gluでの置換、
24位のGlnの、Ser、Thr、Ala、またはAIBでの置換、
27位のMetの、LeuまたはNleでの置換、
27〜29位のアミノ酸の欠失、
28〜29位のアミノ酸の欠失、
29位のアミノ酸の欠失、
またはこれらの組合せである。
X1−X2−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Z1(配列番号839)
[配列中、X1および/またはX2は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減(または抵抗性を増大)する、非天然のアミノ酸であり、
Z1は、−COOH(天然に存在するC末端のカルボキシレート)、−Asn−COOH、Asn−Thr−COOH、およびY−COOHからなる群から選択され、Yは、アミノ酸1〜2個であり、分子内架橋は、好ましくは共有結合であり、i位のアミノ酸とi+4位のアミノ酸の側鎖を接続し、iは12、16、20、または24である]
一部の実施形態によれば、28位および/または29位の天然のアミノ酸を、負に荷電しているアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)で置換し、負に荷電しているアミノ酸(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸)をペプチドのカルボキシ末端に付加してもよいことにより、配列番号801の天然のグルカゴンペプチドを改変する。代替的な一実施形態では、29位の天然のアミノ酸を、正に荷電しているアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン)で置換し、1または2個の正に荷電しているアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン)をペプチドのカルボキシ末端上に付加してもよいことにより、配列番号801の天然のグルカゴンペプチドを改変する。一部の実施形態によれば、28位もしくは29位の少なくとも1つのアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されており、および/またはさらなる酸性アミノ酸が配列番号834のカルボキシ末端に付加されているという前提で、溶解性および安定性が改善されているグルカゴン類似体を提供し、類似体は配列番号834のアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Xaa−Xaa−Xaa−R(配列番号834)、
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asp−Thr−R(配列番号811)および
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Xaa−Tyr−Leu−Glu−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asp−Thr−R(配列番号813)
式中、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸であり、酸性残基が28、29、または30位のうちの1つに存在するという前提で、28位のXaaはAsnまたは酸性アミノ酸であり、29位のXaaはThrまたは酸性アミノ酸であり、Rは酸性アミノ酸、COOH、またはCONH2である。一部の実施形態では、RはCOOHであり、別の実施形態では、RはCONH2である。
一部の実施形態によれば、ペグ化グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドに共有結合している2つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、グルカゴン鎖の合計分子量は約1000〜約5000ダルトンである。一部の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号806のペプチドを含み、PEG鎖は21位および24位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、2本のPEG鎖を合わせた分子量は約1000〜約5000ダルトンである。別の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号806のペプチドを含み、PEG鎖は21位および24位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、2本のPEG鎖を合わせた分子量は約5000〜約20000ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってよく、または分枝でもよい。一部の実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、約500〜約40000ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約500〜約5000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約20000〜約40000ダルトンの分子量を有する。
構造II
構造III
式中、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり、R2はNHR4またはC1-3アルキルであり、R3はC1-3アルキルであり、R4はHまたはC1-3アルキルであり、XはNH、O、またはSであり、YはNHR4、SR3、またはOR3である。一部の実施形態では、XはNHであり、またはYはNHR4である。一部の実施形態では、R1はC0-2アルキルであり、またはC1ヘテロアルキルである。一部の実施形態では、R2はNHR4またはC1アルキルである。一部の実施形態では、R4はHまたはC1アルキルである。例示的な実施形態では、構造Iの側鎖を含むアミノ酸を提供し、R1はCH2−Sであり、XはNHであり、R2はCH3であり(アセトアミドエチル−システイン、C(Acm))、R1はCH2であり、XはNHであり、R2はCH3であり(アセチルジアミノブタン酸、Dab(Ac))、R1はC0アルキルであり、XはNHであり、R2はNHR4であり、R4はHであり(カルバモイルジアミノプロパン酸、Dap(尿素))、またはR1はCH2−CH2であり、XはNHであり、R2はCH3である(アセチルオルニチン、Orn(Ac))。例示的な実施形態では、構造IIの側鎖を含むアミノ酸を提供し、R1はCH2であり、YはNHR4であり、R4はCH3である(メチルグルタミン、Q(Me))。例示的な実施形態では、構造IIIの側鎖を含むアミノ酸を提供し、R1はCH2であり、R4はHである(メチオニン−スルホキシド、M(O))。特定の実施形態では、3位のアミノ酸はDab(Ac)で置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号863、配列番号869、配列番号871、配列番号872、配列番号873、および配列番号874のアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、配列番号877を含むグルカゴン関連ペプチドの類似体は、スペーサーを介してもよい、アシル基またはアルキル基に共有結合により結合している側鎖を含むアミノ酸を含み、このアシル基またはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然である。アシル基は、一部の実施形態では、C4〜C30脂肪アシル基である。他の実施形態では、アルキル基はC4〜C30アルキルである。具体的な態様では、アシル基またはアルキル基は、10位のアミノ酸の側鎖に共有結合により結合している。一部の実施形態では、7位のアミノ酸はIleまたはAbuである。
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に、ならびにその内容が全文において参照によって援用される、国際特許出願第PCT US2009/47447号(2009年6月16日出願)、米国仮出願第61/090,448号、および米国出願第61/151,349号に記載されるクラス2グルカゴン関連ペプチドである。クラス2グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて言及する生物学的配列(配列番号1001〜1262)は、国際特許出願第PCT US2009/47447号における配列番号1〜262に対応する。
天然のグルカゴンは、GIP受容体を活性化せず、通常GLP−1受容体での天然のGLP−1の活性の約1%を有する。本明細書に記載する天然のグルカゴン配列に対する改変により、天然のグルカゴン(配列番号1001)の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なグルカゴン活性、天然のGIP(配列番号1004)の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なGIP活性、および/または天然のGLP−1の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なGLP−1活性を表し得るクラス2グルカゴン関連ペプチドが生成される。これに関して、クラス2グルカゴン関連ペプチドは、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴン/GIP共アゴニスト、グルカゴン/GIP/GLP−1トリアゴニスト、GIP/GLP−1共アゴニスト、またはGIPアゴニストグルカゴン関連ペプチドの1つであってよい。
クラス2グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する改変により、GIP活性、グルカゴン活性、および/またはGLP−1活性の増大を表すグルカゴン関連ペプチドを作り出すための、グルカゴン(配列番号1001)の操作が可能になる。
GIP受容体での活性の増強は、1位のアミノ酸改変によってもたらされる。例えば、1位のHisを大型の芳香族アミノ酸で置換し、Tyr、Phe、Trp、アミノ−Phe、ニトロ−Phe、クロロ−Phe、スルホ−Phe、4−ピリジル−Ala、メチル−Tyr、または3−アミノTyrで置換してもよい。1位のTyrを、アミノ酸12〜29に対応する領域内のアルファヘリックスの安定化と組み合わせることで、GIP受容体およびGLP−1受容体およびグルカゴン受容体を活性化するクラス2グルカゴン関連ペプチドがもたらされる。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成などにより、または12〜29位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)での置換および/もしくは挿入により安定化することができる。
GIP受容体での活性の増強は、12位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、12位を、大型の脂肪族無極性アミノ酸で置換し、Ileで置換してもよい。GIP受容体での活性の増強は、17位および/または18位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、17位を極性の残基で置換し、Glnで置換してもよく、18位を、小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Alaで置換してもよい。17位および18位のQAでの置換により、これらの位置の天然のRR配列に比べて、GIP活性の増大がもたらされる。
GIP受容体での活性の増強は、12位から29位までのアミノ酸側鎖の間の分子内架橋の形成を可能にする改変によってももたらされる。例えば、分子内架橋は、i位とi+4位の2つのアミノ酸の側鎖間の、またはj位とj+3位の間の、またはk位とk+7位の間の共有結合によって形成され得る。例示的な実施形態では、架橋は12位と16位と、16位と20位と、20位と24位と、24位と28位と、または17位と20位との間である。他の実施形態では、塩橋などの非共有結合による相互作用が、これらの位置の正に荷電しているアミノ酸と負に荷電アミノ酸との間に形成し得る。
GIP受容体活性を増大する、上記に記載した改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。GIP受容体活性を増大する改変の組合せは、単独で採用したこのような改変のいずれかよりも高いGIP活性をもたらすのが一般的である。
一部の実施形態では、グルカゴン作用強度の増強が、天然のグルカゴン(配列番号1001)の16位のアミノ酸改変によってももたらされる。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、16位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ4原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか1つで、もしくは少なくとも1つのヘテロ原子(例えば、N、O、S、P)を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約4(または3〜5)原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、GLP−1受容体に対して、グルカゴン受容体に対するオリジナルの選択性を保持する。
グルカゴン受容体活性は、3位のアミノ酸改変、例えば、天然に存在する3位のグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により、低減することができる。例えば、3位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換により、グルカゴン受容体活性は実質的に低減または破壊される。
グルカゴン受容体での活性の維持または増強は、本明細書に記載する通り、3位のGlnをグルタミン類似体で改変することにより実現され得る。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号1243〜1248、1250、1251、および1253〜1256のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
GLP−1受容体での活性の増強は、C末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。GLP−1受容体の活性の増強は、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴンのC末端部分(アミノ酸12〜29周辺)におけるアルファヘリックス構造を、2つのアミノ酸の側鎖間の分子内架橋の形成、または12〜29位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックス構造を安定化するアミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)での置換および/もしくは挿入などにより、安定化することによってももたらされる。例示的な実施形態では、12と16と、13と17と、16と20と、17と21と、20と24と、または24と28とのアミノ酸対の側鎖(i=12、16、20、または24であるアミノ酸対)が相互に連結しており、よってグルカゴンのアルファヘリックスを安定化する。一部の実施形態では、特に架橋がi位とi+4位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約8(または約7〜9)原子である。一部の実施形態では、特に架橋がj位とj+3位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約6(または約5〜7)原子である。
GLP−1受容体での活性の低減は、本明細書に記載する通り、7位のアミノ酸改変などによりもたらされる。
1位および/または2位の改変は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)の切断に対するペプチドの抵抗性を増大し得る。例えば、1位および/または2位を、本明細書に記載するDPP−IV抵抗性のアミノ酸で置換してもよい。一部の実施形態では、2位のアミノ酸をN−メチルアミンで置換する。
2位の改変(例えば、2位のAIB)および場合により1位の改変(例えば、1位のDMIA)は、時には著しく、グルカゴン活性を低減し得、驚くべきことに、グルカゴン活性におけるこの低減は、グルカゴンのC末端部分(アミノ酸12〜29周辺)におけるアルファヘリックス構造を、本明細書に記載する通り、2つのアミノ酸側鎖間に共有結合を形成することなどにより、安定化することにより回復することができる。一部の実施形態では、共有結合は、「i」位と「i+4」位、または「j」位と「j+3」位のアミノ酸間、例えば、12位と16位と、16位と20位と、20位と24位と、24位と28位と、または17位と20位との間である。例示的な実施形態では、この共有結合は、16位のグルタミン酸と20位のリシンとの間のラクタム架橋である。一部の実施形態では、この共有結合は、本明細書に記載する通り、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。
またさらなる例示的な実施形態では、クラス2グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、特に酸性またはアルカリ性バッファー中、配列番号1001の15位および/または16位のアミノ酸を改変して経時的なペプチドの分解を低減することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。このような改変により、Asp15−Ser16のペプチド結合の切断が低減する。例示的な実施形態では、15位のアミノ酸改変は、Aspの、欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換である。他の例示的な実施形態では、16位のアミノ酸改変は、Serの欠失、またはThrもしくはAIBでの置換である。他の例示的な実施形態では、16位のSerを、グルタミン酸で、もしくは長さ4原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか1つで置換する。
一部の実施形態では、20位および/または24位のGlnを、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、Glnの脱アミドによって生じる分解は低減し得る。一部の実施形態では、20位および/または24位のGlnを、Ser、Thr、Ala、またはAIBで置換する。一部の実施形態では、20位および/または24位のGlnを、Lys、Arg、Orn、またはシトルリンで置換する。
クラス2グルカゴン関連ペプチドのC末端部分(アミノ酸12〜29周辺)におけるアルファヘリックス構造の安定化により、GLP−1および/またはGIP活性の増強がもたらされ、1位および/または2位のアミノ酸改変によって低減したグルカゴン活性が回復する。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成、または12〜29位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸(例えば、α,α−二置換アミノ酸)での置換および/もしくは挿入などにより安定化することができる。GIPアゴニストのαへリックス構造の安定化は、本明細書に記載する通りに遂行することができる。
本発明の一部の実施形態によれば、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体(配列番号1001)は、(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、(b)類似体のC末端部分(アミノ酸12〜29)のアルファヘリックス構造を安定化する改変を有し、(c)1〜10個(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)のさらなるアミノ酸改変を有してもよい、配列番号1001を含む。一部の実施形態では、類似体は、GIP受容体での天然のGIPの少なくとも約1%の活性、または本明細書に記載するGIP受容体でのあらゆる他の活性レベルを表す。
ある特定の実施形態では、アルファヘリックス構造を安定化する改変は、本明細書に記載するいずれかなど、共有結合による分子内架橋などを含めた、分子内架橋を提供または導入するものである。共有結合による分子内架橋は、一部の実施形態では、ラクタム架橋である。これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、「アルファヘリックス構造の安定化」のセクションの下のラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋はi位とi+4位のアミノ酸の側鎖間、またはj位とj+3位のアミノ酸の側鎖間の架橋であってよく、式中、iは12、13、16、17、20、または24であり、jは17である。ある特定の実施形態では、ラクタム架橋は、16位と20位のアミノ酸の間であってよく、この場合、16位および20位のアミノ酸の一方がGluで置換されており、16位および20位のアミノ酸の他方がLysで置換されている。
ある特定の態様では、グルカゴンの類似体は、27、28、および29位のうちの1、2つ、または全てのアミノ酸改変を含む。例えば、27位のMetは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Leuで置換されていてもよく、28位のAsnは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Alaで置換されていてもよく、29位のThrは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Glyで置換されていてもよく、または前述の2つもしくは3つの組合せであってもよい。具体的な実施形態では、グルカゴンの類似体は、27位のLeu、28位のAla、および29位のGlyまたはThrを含む。
(a)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている2位のSer、
(b)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている10位のTyr、
(c)10位のLysに対するアシル基の連結、
(d)ArgまたはIleで置換されている12位のLys、
(e)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、またはAIBで置換されている16位のSer、
(f)Glnで置換されている17位のArg、
(g)Ala、Ser、Thr、またはGLyで置換されている18位のArg、
(h)Ser、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている20位のGln、
(i)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている21位のAsp、
(j)Ileで置換されている23位のVal、
(k)Asn、Ser、Thr、Ala、またはAIBで置換されている24位のGln、
(l)ならびに2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、8、19、20、21、24、27、28、および29位のいずれかの保存的置換
のあらゆる1つまたは組合せを含む。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)i位とi+4位のアミノ酸の側鎖間の、またはj位とj+3位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋(iは12、13、16、17、20、または24であり、jは17である)、
(c)27、28、および29位の1、2つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、27位および/または28位のアミノ酸改変、ならびに
(d)1〜9個または1〜6個のさらなるアミノ酸改変、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のさらなるアミノ酸改変、
を含み、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50は約10nM以下である。
これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、ラクタム架橋は16位と20位とのアミノ酸の間であってよく、この場合、16位および20位のアミノ酸の一方がGluで置換されており、16位および20位のアミノ酸の他方がLysで置換されている。これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号1005〜1094のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)類似体の16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3つ、または全てがα,α−二置換アミノ酸で置換されている、
(c)27、28、および29位のうちの1、2つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、27位および/または28位のアミノ酸改変、ならびに
(d)1〜9個または1〜6個のさらなるアミノ酸改変、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のさらなるアミノ酸改変
を含み、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50は約10nM以下である。
さらに他の例示的な実施形態では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体(配列番号1001)は以下の改変:
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)16位のSerの、式IVのアミノ酸でのアミノ酸置換:
(式中、nは、1〜16、または1〜10、または1〜7、または1〜6、または2〜6であり、R1およびR2の各々は、H、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、および(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)からなる群から独立に選択され、R7はHまたはOHであり、式IVのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む)
(c)20位のGlnの、アルファ,アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換、
(d)27、28、および29位のうちの1、2つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、27位および/または28位のアミノ酸改変、ならびに
(e)1〜9個または1〜6個のさらなるアミノ酸改変、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9個のさらなるアミノ酸改変
を含み、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50は約10nM以下である。
これらの実施形態の類似体のアルファ,アルファ−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸(AIB);メチル、エチル、プロピル、およびn−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸(例えば、1−アミノシクロオクタン−1−カルボン酸)を含めたあらゆるアルファ,アルファ−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、アルファ,アルファ−二置換アミノ酸はAIBである。これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号1099〜1165のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる
さらに他の例示的な実施形態では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体(配列番号1001)は、
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)伸長の少なくとも1つのアミノ酸がアシル化またはアルキル化されている、C末端から29位のアミノ酸の約1〜約21個のアミノ酸の伸長
を含み、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50は約10nM以下である。
一部の実施形態では、GIPアゴニスト活性を有する類似体は、27、28、および29位のうちの1、2つ、または全てにアミノ酸改変をさらに含み、例えば、27位および/または28位にアミノ酸改変を含む。
(i)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている2位のSer、
(ii)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている、10位のTyr、
(iii)10位のLysへのアシル基の連結、
(iv)Argで置換されている12位のLys、
(v)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、またはAIBで置換されている16位のSer、
(vi)Glnで置換されている17位のArg、
(vii)Ala、Ser、Thr、またはGlyで置換されている18位のArg、
(viii)Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている20位のGln、
(ix)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている21位のAsp、
(x)Ileで置換されている23位のVal、
(xi)Asn、Ala、Ser、Thr、またはAIBで置換されている24位のGln、ならびに
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、および29位のいずれかの保存的置換
の1つまたは複数を含むことができる。
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変をさらに含んでもよく、
(b)伸長のアミノ酸の少なくとも1つがアシル化またはアルキル化されている、C末端から29位のアミノ酸の約1〜約21個のアミノ酸伸長、ならびに
(d)最高6個のさらなるアミノ酸改変
をさらに含む、配列番号1227、1228、1229、または1230のいずれか1つによるアミノ酸配列を含み、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50は約10nM以下である。一部の態様では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、式I、II、またはIIIのアミノ酸である。より具体的な実施形態では、式Iのアミノ酸は、Dab、Orn、Lys、またはホモLysである。また、一部の実施形態では、約1〜約21個のアミノ酸は、GPSSGAPPPS(配列番号1095)もしくはXGPSSGAPPPS(配列番号1096)のアミノ酸配列を含み、Xはあらゆるアミノ酸であり、またはGPSSGAPPPK(配列番号1170)もしくはXGPSSGAPPPK(配列番号1171)もしくはXGPSSGAPPPSK(配列番号1172)を含み、XはGlyまたは小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約1〜約21個のアミノ酸は、配列番号1095、1096、1170、1171、または1172に対して1つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、C末端が伸長されている類似体の37、38、39、40、41、42、または43位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、C末端が伸長されている類似体の40位に位置する。上記の例示的な実施形態のいずれかでは、GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であってよい。
(i)2位のアミノ酸が、D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸のいずれか1つであり、
(ii)10位のアミノ酸がTyr、Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValであり、
(iii)10位のLysに対するアシル基の連結、
(iv)12位のアミノ酸がIle、Lys、またはArgであり、
(v)16位のアミノ酸が、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、またはAIBのいずれか1つであり、
(vi)17位のアミノ酸が、GlnまたはArgであり、
(vii)18位のアミノ酸が、Ala、Arg、Ser、Thr、またはGlyのいずれか1つであり、
(viii)20位のアミノ酸が、Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn、もしくはAIB、または別のアルファ,アルファ−二置換アミノ酸のいずれか1つであり、
(ix)21位のアミノ酸が、Glu、Asp、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか1つであり、
(x)23位のアミノ酸が、ValまたはIleであり、
(xi)24位のアミノ酸が、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、またはAIBのいずれか1つであり、
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、および29位のいずれかの1つまたは複数の保存的置換
の1つまたは複数をさらに含むことができる。
このような実施形態では、類似体は、(i)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、(ii)27、28、および29位のうちの1、2つ、または全てのアミノ酸改変、(iii)以下の少なくとも1つ:
(A)類似体は、i位とi+4位のアミノ酸の側鎖間に、またはj位とj+3位のアミノ酸の側鎖間にラクタム架橋を含み、iは12、13、16、17、20、または24であり、jは17であり、
(B)類似体の16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3つ、または全てがα,α−二置換アミノ酸で置換されており、あるいは
(C)類似体は、(i)16位のSerの式IVのアミノ酸でのアミノ酸置換:
(式中、
nは1から7であり、R1およびR2の各々は、H、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、および(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)からなる群から独立に選択され、R7はHまたはOHであり、式IVのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む)、および(ii)20位のGlnの、アルファ,アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換を含み、ならびに(iv)最高6個のさらなるアミノ酸改変を有する配列番号1001のアミノ酸配列を含むことができる。
これらの実施形態の類似体の式IVのアミノ酸は、nが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16である、式IVのアミノ酸などのあらゆるアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、nは2、3、4、または5であり、この場合、アミノ酸はそれぞれDab、Orn、Lys、またはホモLysである。上記の例示的な実施形態のいずれかでは、GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変は、Hisの、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換であってよい。
(i)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換されている2位のSer、
(ii)Trp、Lys、Orn、Glu、Phe、またはValで置換されている、10位のTyr、
(iii)10位のLysへのアシル基の連結、
(iv)Argで置換されている12位のLys、
(v)Glu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly、Lys、またはAIBで置換されている16位のSer、
(vi)Glnで置換されている17位のArg、
(vii)Ala、Ser、Thr、またはGlyで置換されている18位のArg、
(viii)Ala、Ser、Thr、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAIBで置換されている20位のGln、
(ix)Glu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている21位のAsp、
(x)Ileで置換されている23位のVal、
(xi)Asn、Ala、Ser、Thr、またはAIBで置換されている24位のGln、ならびに
(xii)2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、27、28、および29位のいずれかの保存的置換
の1つまたは複数を含むことができる。
一部の実施形態では、親水性部分は、類似体のLys、Cys、Orn、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合により連結している。Lys、Cys、Orn、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列(配列番号1001)に天然であるアミノ酸であってよく、または配列番号1001の天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸であってよい。親水性部分がCysに結合している一部の実施形態では、親水性部分に対する連結は以下の構造を含むことができる。
類似体がスペーサーによって類似体に結合しているアシル基またはアルキル基を含む、例示的な実施形態では、スペーサーは本明細書に記載するあらゆるスペーサーであってよい。スペーサーは、例えば、長さ3〜10原子であってよく、例えば、アミノ酸(例えば、6−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸)、ジペプチド(例えば、Ala−Ala、βAla−βAla、Leu−Leu、Pro−Pro、γGlu−γGlu)、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約14〜約28原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Gluではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Glu−γ−Gluではない。
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびに国際特許出願番号PCT/US2009/47438(2009年6月16日に出願)、2008年8月21日に公開された国際特許出願公開第2008/101017号ならびに米国仮特許出願第61/090,412号および米国特許出願第61/177,476号(これらの内容はそれらの全体が参照により組み込まれている)に記載されるクラス3グルカゴン関連ペプチドである。
クラス3グルカゴン関連ペプチドに関連して以下の項目で参照する生物学的配列(配列番号89〜108、114〜128、および146〜656)のうちいくつかは、国際特許出願第PCT/US2009/47438号における配列番号89〜108、114〜128、および146〜656に相当する。
クラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて活性の増加を示し、さらなる実施形態では、生物物理学的安定性および/または水溶性の増進を示すペプチドであり得る。さらに、一部の実施形態では、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、GLP−1受容体よりも、グルカゴン受容体についての天然グルカゴンの選択性を喪失しており、よって、これらの2つの受容体の共同アゴニストを表す。クラス3グルカゴン関連ペプチド内の選択されたアミノ酸改変は、グルカゴン受容体よりも、GLP−1受容体にてペプチドの相対的活性を制御できる。よって、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、GLP−1受容体よりも、グルカゴン受容体にてより高い活性を有するグルカゴン/GLP−1共同アゴニスト、両方の受容体にてほぼ等しい活性を有するグルカゴン/GLP−1共同アゴニスト、またはグルカゴン受容体よりも、GLP−1受容体にてより高い活性を有するグルカゴン/GLP−1共同アゴニストであり得る。共同アゴニストの後者のカテゴリーは、グルカゴン受容体にてほとんどまたは全く活性を示さないが、天然GLP−1と同じまたはよりよい有効性でGLP−1受容体を活性化する能力をまだ保持するように操作できる。これらの共同アゴニストのいずれも、生物物理学的安定性および/または水溶性の増進を与える改変も含んでよい。
グルカゴン受容体での活性の増加は、天然グルカゴン(配列番号701)の16位のアミノ酸改変によりもたらされる。一部の実施形態では、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体でのペプチドの有効性を増進するようにHis−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Asn−Thr(配列番号701)の野生型ペプチドに比べて改変されたグルカゴンアゴニストである。天然グルカゴン(配列番号701)の16位に通常存在するセリンは、検証されたin vitroモデル(例7を参照されたい)におけるcAMP合成を刺激するその能力の点でグルカゴンの有効性を増進するように選択酸性アミノ酸で置換できる。より具体的には、この置換は、類似体の有効性をグルカゴン受容体にて少なくとも2倍、4倍、5倍および10倍までより大きく増進する。この置換は、GLP−1受容体での類似体の活性も、天然グルカゴンと比べて少なくとも5倍、10倍または15倍増進するが、グルカゴン受容体についての選択性は、GLP−1受容体を超えて維持される。
GLP−1受容体での活性の増進は、C末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルのような電荷中性の基で置き換えることによりもたらされる。一部の実施形態では、これらのクラス3グルカゴン関連ペプチドは、配列番号108の配列を含み、ここで、カルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸で見出されるカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。これらのクラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびGLP−1受容体の両方で強い活性を有し、よって、両方の受容体で共同アゴニストとして働く。一部の実施形態によると、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびGLP−1受容体共同アゴニストであり、ここで、ペプチドは、配列番号108の配列を含み、28位のアミノ酸は、AsnまたはLysであり、29位のアミノ酸は、Thr−アミドである。
一部の実施形態によると、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニスト活性を示し、配列番号99、101、102および103からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、側鎖は、互いに共有結合し、一部の実施形態では、2つのアミノ酸は、互いに結合して、ラクタム環を形成する。
さらに、GLP−1受容体での活性の増進は、所望の活性を保持する位置に1または複数のα,α二置換されているアミノ酸を意図的に導入することにより、グルカゴン関連ペプチドのC末端部分(アミノ酸12〜29のあたり)のアルファへリックスを安定化することにより達成してよい。このようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠くペプチドと考えてよい。一部の態様では、アルファへリックスの安定化は、塩橋または共有結合のような分子内架橋を導入することなく、この様式で達成される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの16位、17位、18位、19位、20位、21位、24位または29位の1、2、3、4つ以上が、α,α二置換されているアミノ酸で置換される。例えば、アミノイソ酪酸(AIB)でのクラス3グルカゴン関連ペプチドの16位の置換は、塩橋またはラクタムの非存在下でGLP−1活性を増進する。一部の実施形態では、16位、20位、21位または24位の1、2、3つ以上がAIBで置換される。
GLP−1受容体での活性の増加は、配列番号78のC末端の伸長を含むクラス3グルカゴン関連ペプチドにおいて証明される。配列番号78を含むこのようなクラス3グルカゴン関連ペプチドにおけるGLP−1活性は、本明細書に記載するように、18位、28位もしくは29位、または18位および29位のアミノ酸を改変することによりさらに増加できる。GLP−1有効性のさらなる適度な増加は、10位のアミノ酸をTrpに改変することにより達成してよい。
親水性部分の付加
クラス3グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持しながら、生理的pHの水溶液中のペプチドの溶解性および安定性を改善するように、さらに改変できる。本明細書で論じる親水性部分は、本明細書でさらに論じるようにしてクラス3グルカゴン関連ペプチドに結合できる。一部の実施形態によると、配列番号97または配列番号98を含むクラス3グルカゴン関連ペプチドの17位、21位および24位での親水性基の導入は、生理的pHの溶液中の高い有効性のグルカゴン類似体の溶解性および安定性を改善することが予想される。このような基の導入は、例えば循環中の半減期の延長により測定されるように、作用の期間も増加する。
配列番号20を含むクラス3グルカゴン関連ペプチドの溶解性は、例えば、配列番号108のグルカゴン関連ペプチドのC末端部分、好ましくは27位に対してC末端の位置に1、2、3個以上の荷電アミノ酸を導入することによりさらに改善できる。このような荷電アミノ酸は、例えば28位もしくは29位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または例えば27位、28位もしくは29位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の1、2、3個または全てが負に荷電されている。グルカゴン活性をまだ保持できるようなさらなる改変、例えば保存的置換をクラス3グルカゴン関連ペプチドに作製してよい。一部の実施形態では、配列番号108のクラス3グルカゴン関連ペプチドの類似体であって、17位〜26位の1〜2アミノ酸置換が配列番号108と異なり、一部の実施形態では、20位のアミノ酸置換が配列番号108のペプチドと異なる類似体が提供される。
一部の実施形態によると、グルカゴン関連ペプチドは、アシルまたはアルキル基、例えばC4−C30アシルまたはアルキル基を含むように改変される。一部の実施形態では、本発明は、グルカゴン関連ペプチドの10位のアミノ酸と共有的に連結したアシル基またはアルキル基を含むように改変されたクラス3グルカゴン関連ペプチドを提供する。グルカゴン関連ペプチドは、クラス3グルカゴン関連ペプチドの10位のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーをさらに含んでよい。上記のクラス3グルカゴン関連ペプチドのいずれも、2個のアシル基もしくは2個のアルキル基またはそれらの組合せを含んでよい。本発明の具体的な態様では、アシル化クラス3グルカゴン関連ペプチドは、配列番号534〜544および546〜549のいずれかのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびGLP−1受容体での活性および/または有効性に影響することなく、グルカゴンペプチドのC末端(すなわち29位および/または28位)の1または2個のアミノ酸の短縮または欠失によりさらに改変される。この点で、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する1または複数の改変を含んでいてもよい、天然グルカゴンペプチド(配列番号1)のアミノ酸1〜27または1〜28を含むことができる。一部の実施形態では、短縮されたクラス3グルカゴン関連ペプチドは、配列番号550または配列番号551を含む。別の実施形態では、短縮されたグルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号552または配列番号553を含む。
一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端に第2のペプチド、例えば配列番号78、配列番号117または配列番号118を付加することにより改変される。一部の実施形態では、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号109、配列番号110、配列番号111および配列番号69からなる群から選択される配列を有するクラス3グルカゴン関連ペプチドは、第2のペプチドと結合したペプチドに共有結合し、ここで、第2のペプチドは、配列番号78、配列番号117および配列番号118からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、C末端伸長を含むクラス3グルカゴン関連ペプチドにおいて、天然グルカゴン関連ペプチドの29位のトレオニンは、グリシンで置き換えられている。29位のトレオニンについてグリシン置換を有し、配列番号78のカルボキシ末端伸長を有するクラス3グルカゴン関連ペプチドは、配列番号78のカルボキシ末端伸長を含むように改変された天然グルカゴンよりもGLP−1受容体にて4倍有効である。GLP−1受容体での有効性は、18位の天然アルギニンについてのアラニン置換によりさらに増進できる。
(A)例えば天然グルカゴンのC末端部分、好ましくは27位に対してC末端の位置に1、2、3個以上の荷電アミノ酸を導入することによる、溶解性の改善。このような荷電アミノ酸は、例えば28位もしくは29位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または27位、28位もしくは29位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の1、2、3個または全ては、負に荷電されている。他の実施形態では、荷電アミノ酸の1、2、3個または全ては、正に荷電されている。このような改変は、溶解性を増加し、例えば、約5.5から8の間の与えられたpH、例えばpH7にて、25℃にて24時間後に測定した場合に、天然グルカゴンと比べて少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍以上大きい溶解性をもたらす。
(B)本明細書に記載するように、ポリエチレングリコール鎖のような親水性部分を例えばペプチドの16位、17位、20位、21位、24位もしくは29位またはC末端アミノ酸に付加することによる、溶解性および作用の期間または循環中の半減期の増加。
(C)例えば欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸での置換による15位のアスパラギン酸の改変による、安定性の増加。このような改変は、5.5〜8の範囲内のpHにて、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液中での分解または切断を低減でき、例えば、25℃にて24時間後に元のペプチドの少なくとも75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%を保持する。
(E)2位のアミノ酸の、N−メチル−アラニンでの改変を含む、1位または2位のアミノ酸の、本明細書に記載するDPP−IV耐性アミノ酸での改変による、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)切断に対する耐性の増加。
(G)本明細書に記載するようなC末端伸長の付加。
(H)例えば本明細書に記載するようなグルカゴン関連ペプチドのアシル化またはアルキル化による、循環中の半減期の増加および/または作用の期間の延長および/または作用の開始の遅延。
(I)本明細書に記載するようなホモ二量体化またはヘテロ二量体化。
1位のHisの、大きい芳香族アミノ酸(例えばTyr)での非保存的置換を含む、GLP−1活性を有するクラス3グルカゴン関連ペプチドは、GLP−1活性を保持でき、ただし、アルファへリックスは分子内架橋、例えば本明細書に記載するものにより安定化される。
クラス3グルカゴン関連ペプチドは、コンジュゲート部分と連結でき、共有結合またはリンカーを用いてもよい。クラス3グルカゴン関連ペプチドは、融合ペプチドまたはタンパク質の一部分であることができ、ここで、第2のペプチドまたはポリペプチドは、クラス3グルカゴン関連ペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されている。より具体的には、融合クラス3グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸29と連結した配列番号78(GPSSGAPPPS)、配列番号117(KRNRNNIA)または配列番号118(KRNR)のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号72、配列番号97または配列番号98のグルカゴンアゴニストを含んでよい。一部の実施形態では、配列番号78(GPSSGAPPPS)、配列番号117(KRNRNNIA)または配列番号118(KRNR)のアミノ酸配列は、ペプチド結合によりクラス3グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸29と結合する。出願人らは、エキセンジン−4のC末端伸長ペプチド(例えば配列番号78または配列番号79)を含むクラス3グルカゴン関連ペプチド融合ペプチドにおいて、29位での天然トレオニン残基のグリシンでの置換がGLP−1受容体活性を劇的に増加することを発見した。このアミノ酸置換は、GLP−1受容体についてのグルカゴン類似体の親和性を増進するためのクラス3グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する他の改変と共に用いることができる。例えば、T29G置換は、S16EおよびN20Kアミノ酸置換と組み合わせることができ、アミノ酸16と20の間のラクタム架橋と組み合わせてもよく、本明細書に記載するようなPEG鎖の付加と組み合わせてもよい。
一部の実施形態によると、配列番号72の配列を含むグルカゴン類似体であって、前記類似体が、1位、2位、3位、5位、7位、10位、11位、13位、14位、17位、18位、19位、21位、24位、27位、28位および29位から選択される1〜3アミノ酸が配列番号72と異なり、前記グルカゴン関連ペプチドが、GLP−1受容体にて天然GLP−1の活性の少なくとも20%を示すグルカゴン類似体が提供される。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Xaa−Arg−Arg−Ala−Xaa−Asp−Phe−Val−Xaa−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号81)(ここで、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、16位のXaaは、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20位のXaaは、GlnまたはLysであり、24位のXaaは、GlnまたはGluであり、28位のXaaは、Asn、Lysまたは酸性アミノ酸であり、29位のXaaは、Thr、Glyまたは酸性アミノ酸であり、Rは、COOHまたはCONH2であるが、但し、16位がセリンである場合、20位はLysであるか、または16位がセリンである場合、24位はGluであり、20位または28位のいずれかは、Lysである)を含むグルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、グルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストは、配列番号81の配列を含み、ここで、28位のアミノ酸は、アスパラギン酸であり、29位のアミノ酸は、グルタミン酸である。別の実施形態では、28位のアミノ酸は、天然アスパラギンであり、29位のアミノ酸は、グリシンであり、配列番号79または配列番号80のアミノ酸配列は、配列番号81のカルボキシ末端と共有的に連結している。
一部の実施形態では、共同アゴニストペプチドを含むグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加されたさらなる酸性アミノ酸をさらに含む配列番号81の配列を含む。さらなる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Xaa−Arg−Arg−Ala−Xaa−Asp−Phe−Val−Xaa−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号81)(ここで、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、16位のXaaは、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20位のXaaは、GlnまたはLysであり、24位のXaaは、GlnまたはGluであり、28位のXaaは、Asn、AspまたはLysであり、Rは、COOHまたはCONH2であり、29位のXaaは、ThrまたはGlyであり、Rは、COOH、CONH2、配列番号78または配列番号79であるが、但し、16位がセリンである場合、20位はLysであるか、または16位がセリンである場合、24位はGluであり、20位もしくは28位のいずれかはLysである)からなる群から選択される改変グルカゴン関連ペプチドを含むグルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Rは、CONH2であり、15位のXaaは、Aspであり、16位のXaaは、Glu、Gln、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、20位および24位のXaaは、それぞれGlnであり、28位のXaaは、AsnまたはAspであり、29位のXaaは、Thrである。一部の実施形態では、15位および16位のXaaは、それぞれGluであり、20位および24位のXaaは、それぞれGlnであり、28位のXaaは、AsnまたはAspであり、29位のXaaは、Thrであり、Rは、CONH2である。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Xaa−Xaa−Arg−Arg−Ala−Xaa−Xaa−Phe−Val−Xaa−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号123)(ここで、15位のXaaは、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、16位のXaaは、Ser、Glu、Gln、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、20位のXaaは、Gln、Lys、Arg、Ornまたはシトルリンであり、21位のXaaは、Asp、Glu、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、24位のXaaは、GlnまたはGluであり、28位のXaaは、Asn、Lysまたは酸性アミノ酸であり、29位のXaaは、Thrまたは酸性アミノ酸であり、Rは、COOHまたはCONH2である)を含むグルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Rは、CONH2である。一部の実施形態によると、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号114、配列番号115または配列番号116のバリアントを含むグルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストであって、バリアントが、20位のアミノ酸置換が前記配列と異なるグルカゴン/GLP−1受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、20位についてLys、Arg、Ornまたはシトルリンからなる群から選択される。
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号109)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号110)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Xaa−Xaa−R(配列番号111)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Xaa−R(配列番号112)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Asn−Thr−R(配列番号104)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Thr−R(配列番号105)
NH2−His−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Glu−Arg−Arg−Ala−Lys−Asp−Phe−Val−Glu−Trp−Leu−Met−Lys−Thr−R(配列番号106)
ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を10位に含むグルカゴンペプチドは、安定化されたアルファへリックスを含む。したがって、ある特定の態様では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基と、i位のアミノ酸およびi+4位のアミノ酸(ここで、iは、12、16、20または24である)の側鎖の間に分子内架橋、例えば共有的分子内架橋(例えばラクタム架橋)とを含む。あるいはまたはさらに、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基を含み、グルカゴンペプチドの16位、20位、21位および/または24位の1、2、3個以上は、α,α二置換されているアミノ酸、例えばAIBで置換されている。一部の場合では、非天然グルカゴンペプチドは、16位にてGluおよび20位にてLysを含み、ラクタム架橋が、GluとLysを連結してもよく、グルカゴンペプチドが、17位のGln、18位のAla、21位のGlu、23位のIleおよび24位のAlaからなる群から選択される1または複数の改変をさらに含んでもよい。
また、グルカゴン関連ペプチドがアシル化またはアルキル化されたアミノ酸を10位に含む任意の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、C末端アルファカルボキシレートの代わりにC末端アミドをさらに含むことができる。
アシルまたはアルキル基と結合したアミノ酸は、本明細書に記載する任意のアミノ酸、例えば式I(例えばLys)、式IIおよび式IIIのいずれかのアミノ酸であってよい。
一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、10位のアミノ酸に直接結合する。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えば3〜10原子の長さであるスペーサー、例えばアミノ酸またはジペプチドを介して10位のアミノ酸に結合する。アシルまたはアルキル基の結合の目的のために適切なスペーサーは、本明細書に記載する。
GIP受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に関して、類似体は、1〜21アミノ酸(例えば5〜19、7〜15、9〜12アミノ酸)の伸長を含む。類似体の伸長は、伸長が1〜21アミノ酸であれば、任意のアミノ酸配列を含んでよい。一部の態様では、伸長は、7〜15アミノ酸であり、他の態様では、伸長は、9〜12アミノ酸である。一部の実施形態では、伸長は、(i)配列番号78もしくは674のアミノ酸配列、(ii)配列番号78もしくは674のアミノ酸配列と高い配列同一性(例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%)を有するアミノ酸配列、または(iii)1もしくは複数の保存的アミノ酸改変を有する(i)もしくは(ii)のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、アミノ酸に直接、例えばアミノ酸の側鎖を介して結合する。他の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー(例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー)を介してアミノ酸に結合する。ある特定の態様では、スペーサーは、3〜10原子の長さである。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Gluでない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Glu−γ−Gluでない。
一部の実施形態によると、クラス3グルカゴン関連ペプチドは、以下の改変:2位のAIB、3位のGlu、10位のLys、16位のGlu、17位のGln、18位のAla、20位のLys、21位のGlu、23位のIle、24位のAlaを含む天然グルカゴンのアミノ酸配列(配列番号701)を含み、ここで、10位のLysは、C14またはC16脂肪酸でアシル化され、C末端カルボキシレートは、アミドで置き換えられている。具体的な実施形態では、このクラス3グルカゴン関連ペプチドは、そのN末端アミノ酸を介してジペプチドD−Lys−サルコシンに結合する。
一実施形態では、キットは、インクレチン−インスリンコンジュゲートを患者に投与するためのデバイスと共に提供される。キットは、様々な容器、例えば、バイアル、チューブ、ボトルなどをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、使用のための指示書も含む。一実施形態によれば、キットのデバイスは、組成物がエアロゾルデバイス内に予め包装されるエアロゾル分注デバイスである。別の実施形態では、キットは注射筒と針とを含み、一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲート組成物は、注射筒内に予め包装される。
インクレチンまたはインスリン受容体活性を増加または減少させる上記のインクレチンペプチドまたはインスリンペプチドに対する任意の改変を、個別に、または組み合わせて適用することができる。さらに、本明細書に開示されるそれぞれの直鎖スペーサーを、任意のインクレチンまたはインスリンと組み合わせて使用して、本開示によるインクレリンを形成させることができる。また、上記の任意の改変を、溶解度および/または安定性および/または作用持続時間の増大などの他の所望の特性を付与する他の改変と組み合わせることもできる。
インスリンAおよびB鎖の合成
インスリンAおよびB鎖を、Boc化学を使用して4−メチルベンズヒドリル(methylbenzhyryl)アミン(MBHA)樹脂または4−ヒドロキシメチル−フェニルアセタミドメチル(PAM)樹脂上で合成した。0℃で1時間、HF/p−クレゾール95:5を使用して、ペプチドを樹脂から切断した。HF除去およびエーテル沈降の後、ペプチドを50%水性酢酸中に溶解し、凍結乾燥した。あるいは、ペプチドを、Fmoc化学を使用して合成した。室温で2時間、トリフルオロ酢酸(TFA)/トリイソプロピルシラン(TIS)/H2O(95:2.5:2.5)を使用してペプチドを樹脂から切断した。過剰量のジエチルエーテルの添加によりペプチドを沈降させ、ペレットを水性酸性バッファー中で可溶化した。RP−HPLCによりペプチドの品質をモニタリングし、質量分析(ESIまたはMALDI)により確認した。
合成されたAおよびB鎖を、開示が参照により本明細書に援用されるUS−2011−0257076に以前に開示されたその天然のジスルフィド結合連結により互いに連結した。それぞれのB鎖を、DMFまたはDMSO中への溶解によってCys7−Npys誘導体に活性化し、室温で、1:1のモル比で2,2’−ジチオビス(5−ニトロピリジン)(Npys)と反応させた。活性化を、RP−HPLCによりモニタリングし、生成物をESI−MSにより確認した。
また、改変されたアミノ酸(A19位の4−アミノフェニルアラニンなど)を含むインスリンペプチドを、例えば、米国特許第7,045,337号および第7,083,970号に教示されたシステムなどの、非コードアミノ酸のタンパク質への組み込みを可能にするシステムを使用してin vivoで合成することもできる。
還元的アルキル化によるアミン基(N−末端およびリシン)のペグ化
a.合成
1:2:30のモル比の、インスリン(またはインスリン類似体)、mPEG20k−アルデヒド、およびNaBH3CNを、4.1〜4.4のpHの酢酸バッファー中に溶解した。反応溶液は、0.1N NaCl、0.2N酢酸および0.1N Na2CO3から構成されていた。インスリンペプチド濃度は、約0.5mg/mlであった。反応は、室温で6時間にわたって起こる。反応の程度を、RP−HPLCによりモニタリングしたところ、反応の収率は約50%であった。
反応混合物を、0.1%TFAを用いて2〜5倍希釈し、分取RP−HPLCカラムに適用した。HPLC条件:C4カラム;流量10ml/分;Aバッファー、水中の10%ACNおよび0.1%TFA;Bバッファー、ACN中の0.1%TFA;0〜40%からの線形勾配B%(0〜80分);PEG−インスリンまたは類似体は、約35%のバッファーBで溶出された。所望の化合物を、亜硫酸分解(sulftolysis)またはトリプシン分解による化学的改変後に、MALDI−TOFによって検証した。
a.合成
インスリン(またはインスリン類似体)を、mPEG20k−NHSと共に、0.1Nビシンバッファー(pH8.0)中に、1:1のモル比で溶解した。インスリンペプチド濃度は、約0.5mg/mlであった。反応の進行を、HPLCによってモニタリングした。反応の収率は、室温で2時間後に約90%である。
b.精製
反応混合物を、2〜5倍希釈し、RP−HPLCにロードした。HPLC条件:C4カラム;流量10ml/分;Aバッファー、水中の10%ACNおよび0.1%TFA;Bバッファー、ACN中の0.1%TFA;0〜40%からの線形勾配B%(0〜80分);PEG−インスリンまたは類似体は、約35%のBで収集された。所望の化合物を、亜硫酸分解またはトリプシン分解による化学的改変後に、MALDI−TOFによって検証した。
a.合成
1:2:20のモル比のインスリン(またはインスリン類似体)、mPEG20k−ヒドラジド、およびNaBH3CNを、酢酸バッファー(4.1〜4.4のpH)中に溶解した。反応溶液は、0.1N NaCl、0.2N酢酸および0.1N Na2CO3から構成されていた。インスリンまたはインスリン類似体の濃度は、室温で24時間にわたって約0.5mg/mlであった。反応プロセスを、HPLCによりモニタリングした。反応物の変換は、約50%(HPLCにより算出)であった。
b.精製
反応混合物を2〜5倍希釈し、RP−HPLCにロードした。HPLC条件:C4カラム;流量10ml/分;Aバッファー、水中の10%ACNおよび0.1%TFA;Bバッファー、ACN中の0.1%TFA;0〜40%からの線形勾配B%(0〜80分);PEG−インスリンまたは類似体は、約35%のBで収集された。所望の化合物を、亜硫酸分解またはトリプシン分解による化学的改変後に、MALDI−TOFによって検証した。
インクレチンの一般的な合成プロトコール:
グルカゴン類似体を、改良型Applied Biosystem 430 Aペプチド合成装置上で、0.2mmolのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から出発するHBTU活性化「Fast Boc」シングルカップリングを使用して合成した。Bocアミノ酸およびHBTUは、Midwest Biotech(Fishers,IN)から取得した。使用した側鎖保護基は、Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl−Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br−Z)、およびTrp(CHO)であった。N末端His上の側鎖保護基は、Bocであった。
214nmでUVをモニタリングし、5分の画分を収集しながら、2.2x25cmのKromasil C18カラム上でのFPLC上で精製を行った。均一な画分を合わせ、凍結乾燥したところ、95%を超える生成物純度が得られた。正確な分子質量および純度を、MALDI−質量分析を使用して確認した。
一般的なインクレチンペグ化プロトコール:(Cys−マレイミド)
典型的には、グルカゴンCys類似体を、リン酸緩衝生理食塩水(5〜10mg/ml)中に溶解し、0.01Mエチレンジアミン四酢酸を添加する(全量の10〜15%)。過剰(2倍量)のマレイミドメトキシPEG試薬(Nektar)を添加し、HPLCによって反応の進行をモニタリングしながら、反応物を室温で撹拌する。8〜24時間後、反応混合物を酸性化し、0.1%TFA/アセトニトリル勾配を使用する精製のために分取逆相カラム上にロードする。適切な画分を合わせ、凍結乾燥して、所望のペグ化された類似体を得る。
グルカゴン−Cexおよび他のC末端伸長類似体の合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を、60mlの反応容器に入れ、以下の配列を入力し、FastBoc HBTU活性化シングルカップリングを使用して改良型Applied Biosystems 430Aペプチド合成装置上で実行した。
グルカゴンラクタムの合成
285mg(0.2mmol)のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂(Midwest Biotech)を、60mlの反応容器に入れ、以下の配列を、Boc DEPBT活性化シングルカップリングを使用して改良型Applied Biosystems 430Aペプチド合成装置上で集合させた:HSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT−NH2(12−16ラクタム;配列番号100)。
アシル化および/またはPEG化されたペプチドの調製
アシル化および/またはPEG化されたペプチドを、以下のように調製する。CS Bio 4886ペプチド合成装置またはApplied Biosystems 430Aペプチド合成装置のいずれかを用いて、固相支持体樹脂上でペプチドを合成する。in situ中和化学を、Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)で説明されたようにして使用する。アシル化されたペプチドについて、アシル化される標的アミノ酸残基(例えば、10位)を、Nε−FMOCリシン残基で置換する。完了したN末端BOC保護されたペプチドの、DMF中の20%ピペリジンによる30分間の処理により、FMOC/ホルミル基が除去される。10倍モル過剰のFMOC保護されたスペーサーアミノ酸(例えば、FMOC−(N−BOC)−トリプトファン−OH)またはアシル鎖(例えば、C17−COOH)と、PyBOPまたはDEPBTカップリング試薬とをDMF/DIEA中でカップリングすることにより、遊離ε−アミノLys残基へのカップリングを達成する。その後、スペーサーアミノ酸のFMOC基を除去した後、アシル鎖とのカップリングを繰り返す。100%TFAによる最後の処理は、側鎖保護基およびN末端BOC基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、5%DIEA/DMFで中和し、乾燥した後、0℃で1時間、95:5のHF/p−クレゾールを使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、5%HOAc溶液を使用して、粗ペプチドを溶媒和する。次いで、溶液の試料を検証して、ESI−MSにより正確な分子量のペプチドを含有させる。正確なペプチドを、100%CH3CN中の10%CH3CN/0.1%TFA〜0.1%TFAの線形勾配を使用するRP−HPLCにより精製する。Vydac C18 22mm×250mmのタンパク質カラムを、精製のために使用する。アシル化されたペプチド類似体は一般に、20:80のバッファー比により溶出を完了する。部分を一緒にプールし、分析的RP−HPLC上で純度についてチェックする。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドのペグ化のために、40kDaのメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド−プロピオンアミド(Chirotech Technology Ltd.)を、透明な溶液中にペプチドとPEGの両方を溶解させるのに必要とされる最少量の溶媒(一般に、2〜3mgのペプチドを使用する反応については2mL未満)を使用して、7M尿素、50mM Tris−HClバッファー中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を4〜6時間開始し、反応を分析的RP−HPLCによって分析する。PEG化された生成物は、保持時間が減少した出発材料と異なると考えられる。初期のペプチド精製について使用されたものと同様の条件を用いて、Vydac C4カラム上で精製を実施する。溶出は、典型的には、50:50のバッファー比あたりで起こる。純粋なPEG化されたペプチドの画分を収集し、凍結乾燥する。
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体に対するペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイにおいて測定した。シンチレーション近接アッセイバッファー(0.05M Tris−HCl、pH7.5、0.15M NaCl、0.1%w/vウシ血清アルブミン)中で作製されたペプチドの連続3倍希釈液を、96ウェルの白色/透明底プレート(Corning Inc.,Acton,MA)中で、0.05nMの(3−[125I]−ヨードチロシル)Tyr10グルカゴン(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)、1〜6マイクログラム/ウェル、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現する細胞から調製された細胞膜断片、および1mg/ウェルのポリエチレンイミン処理された小麦胚芽アグルチニンA型シンチレーション近接アッセイビーズ(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)と混合した。回転式振盪器上、800rpmで5分間振盪する際に、プレートを室温で12時間インキュベートした後、MicroBeta1450液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer,Wellesley,MA)上で読み取った。非特異的に結合した(NSB)放射活性を、試験試料中での最も高い濃度よりも4倍高い「冷」天然リガンド濃度を有するウェル中で測定し、総結合放射活性を、競合剤を含まないウェル中で検出した。特異的結合パーセントを、以下のように算出した:特異的結合%=((結合−NSB)/(総結合−NSB))X100。IC50値を、Originソフトウェア(OriginLab,Northampton,MA)を使用することにより決定した。
機能アッセイ−cAMP合成
cAMPを誘導するグルカゴン類似体の能力を、蛍ルシフェラーゼに基づく受容体アッセイにおいて測定した。受容体(グルカゴン受容体、GLP−1受容体またはGIP受容体)およびcAMP応答エレメントに連結されたルシフェラーゼ遺伝子を同時トランスフェクトされたHEK293細胞を、0.25%ウシ成長血清(HyClone,Logan,UT)を添加したDMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中で16時間培養することにより血清枯渇させた後、グルカゴン、GLP−1、GIPまたは新規グルカゴン類似体のいずれかの連続希釈液と共に、96ウェルのポリ−D−リシン被覆「Biocoat」プレート(BD Biosciences,San Jose,CA)中、37℃、5%CO2で5時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、100マイクロリットルのLucLite発光基質試薬(Perkin−Elmer,Wellesley,MA)を各ウェルに添加した。プレートを簡単に振盪し、暗室中で10分間インキュベートし、光出力をMicroBeta−1450液体シンチレーションカウンター(Perkin−Elmer,Wellesley,MA)上で測定した。50%有効濃度を、Originソフトウェア(OriginLab,Northampton,MA)を使用することにより算出した。
インスリン受容体結合アッセイ:
インスリンまたはIGF−1受容体に対するそれぞれのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイにおいて測定した。ペプチドの連続3倍希釈液を、Tris−Clバッファー(0.05M Tris−HCl、pH7.5、0.15M NaCl、0.1%w/vウシ血清アルブミン)中で作製し、96ウェルプレート(Corning Inc.,Acton,MA)中で、0.05nMの(3−[125I]−ヨードチロシル)A TyrA14インスリンまたは(3−[125I]−ヨードチロシル)IGF−1(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)と混合した。ヒトインスリンまたはIGF−1受容体を過剰発現する細胞から調製された細胞膜断片の1〜6マイクログラムのアリコートを、各ウェルに供し、0.25mg/ウェルのポリエチレンイミン処理された小麦胚芽アグルチニンA型シンチレーション近接アッセイビーズ(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を添加した。800rpmで5分間振盪した後、プレートを室温で12時間インキュベートし、MicroBeta1450液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer,Wellesley,MA)を用いて放射活性を測定した。非特異的に結合した(NSB)放射活性を、試験試料中での最も高い濃度よりも4倍過剰濃度「冷」天然リガンドを有するウェル中で測定した。総結合放射活性を、競合剤を含まないウェル中で検出した。特異的結合パーセントを、以下のように算出した:特異的結合%=(結合−NSB/総結合−NSB)X100。IC50値を、Originソフトウェア(OriginLab,Northampton,MA)を使用することにより決定した。
インスリン受容体リン酸化アッセイ:
インスリンまたはインスリン類似体の受容体リン酸化を測定するために、受容体をトランスフェクトされたHEK293細胞を、96ウェル組織培養プレート(Costar #3596,Cambridge,MA)中に播種し、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10mM HEPESおよび0.25%ウシ成長血清(HyClone SH30541,Logan,UT)を添加したDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)中、37℃、5%CO2および90%湿度で16〜20時間培養した。インスリンまたはインスリン類似体の連続希釈液を、0.5%ウシ血清アルブミン(Roche Applied Science #100350,Indianapolis,IN)を添加したDMEM中で調製し、接着した細胞を含むウェルに添加した。5%CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で15分間インキュベートした後、細胞を室温で20分間、5%パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝生理食塩水pH7.4で2回洗浄し、PBS中の2%ウシ血清アルブミンで1時間ブロックした。次いで、プレートを3回洗浄し、製造業者の推奨にしたがって2%ウシ血清アルブミンを含むPBS中で再構成させたホスホチロシンに対する西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗体(Upstate biotechnology #16−105,Temecula,CA)を充填した。室温で3時間インキュベートした後、プレートを4回洗浄し、0.1mlのTMB単一溶液基質(Invitrogen,#00−2023,Carldbad,CA)を各ウェルに添加した。0.05mlの1N HClを添加することにより、5分後に発色を停止させた。450nmでの吸光度を、Titertek Multiscan MCC340(ThermoFisher,Pittsburgh,PA)上で測定した。吸光度対ペプチド濃度用量応答曲線をプロットし、EC50値を、Originソフトウェア(OriginLab,Northampton,MA)を使用することにより決定した。
インクレチン−インスリン融合物(インクレリン)のための合成手順
図4Aに示されるスキーム1は、アルデヒドリンカーの合成のための手順を提供する。反応は、トリフェニルメチルチオールのアクロレインへの1ステップMichael付加を含む(Org. Biomol. Chem. 2011, 9, 3825を参照されたい)。反応は、85〜90%の収率で進行し、生成物は溶媒蒸発、次いで、ヘキサンを用いた磨砕により回収される。次いで、材料は、酢酸エチル/ヘキサンから再結晶化され、室温での保存にとって安定である。
2−チオピリジル活性化インクレチン(GLP−1、GIPまたはコアゴニスト)とのコンジュゲーションを、2つの固体を合わせ、20mg/mlの総ペプチド濃度で6Mグアニジン、pH6.0中に同時に溶解することにより達成する。反応は30〜60分で完了し、生成物は分取HPLCにより回収される(スキーム4;図4D)。
Trt−S−(CH2)2CHO(S−トリチル−3−チオプロピオンアルデヒド)1の合成
トリフェニルメタンチオール(Trt−SH)2.0mmol(553mg)を、4.0mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、3.0mmol(418μL)のトリエチルアミンをアクロレイン、2.0mmol(134μl)と共に添加し、反応物を室温で2時間撹拌した。反応を薄層クロマトグラフィー(シリカゲル、n−ヘキサン/塩化メチレン3:1)によりモニタリングしたところ、反応はこの時点で完了したことが示された。減圧下で溶媒を除去し、残留物をn−ヘキサンで磨砕した。粗固体を酢酸エチル/ヘキサンの混合物から再結晶化したところ、530mg、80%の収率が得られた。
41.3μmol(240mg)のヒトインスリン(Sigma)を、20mM NaOAcを含有するバッファー、pH4.0に調整した200mM NaClバッファー中に溶解した。1.0mlのNMP中の100μmol(33mg)のS−トリチル−3−チオプロピオンアルデヒドを、1.2μmol(75mg)のNaCNBH3と共に溶液に添加した。反応物を室温で撹拌した。0.4mlのNMP中のさらに40μmolのアルデヒドを6.0時間後に添加し、反応を一晩進行させた。LC/MS分析により、ほんの少量(5%未満)の非改変インスリンが残存していることが示された。反応混合物を遠心分離し、ペレットをアセトニトリル/H2O中に溶解し、Luna C8(2)250mm×21.2mm分取HPLCカラム上に吸着させ、90分にわたる線形10〜55%勾配で溶出させた。バッファーA:10%ACN/0.1%TFA、バッファーB:ACN/0.1%TFA、流量:15ml/分、220nmでモニタリング。選択した画分をプールし、凍結乾燥したところ、144mg、約60%のTrt−S−(CH2)3−PheB1−ヒトインスリンが得られた。2%トリイソプロピルシラン、2%水を含有する20mlのTFAで20分間、100mgの保護された誘導体を処理した後、ジエチルエーテルで沈降させ、凍結乾燥することによってトリチル基を除去したところ、95%収率のHS−(CH2)3−PheB1−ヒトインスリンが得られた。
10倍過剰のアミノ酸およびDIC/6−Cl−HOBt活性化を使用するRink ChemMatrix(供給源)樹脂から出発してApplied Biosystems 433A合成装置上、0.1mmolスケールの標準的なFmoc/tBu−法を使用して、インクレチンペプチドを合成した。以下の側鎖保護基スキームを使用した:Arg(Pbf)、Asp(OtBu)、Asn(Trt)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBut)、Tyr(tBu)。ペプチジル樹脂を、5.0mlのDMF中の10倍過剰のFmocHis(Trt)−OH、DEPBTおよび20倍過剰のDIEAで90分間処理することにより、N末端Hisカップリングを達成した。DMF中の20%ピペリジンの2回の20分間の処理により、N末端Fmoc基を除去した。樹脂からの切断および活性化された2−ジチオピリジル活性化型への同時的変換を、100μlのトリイソプロピルシラン、100μlの水および20当量の2−アルドリチオール試薬を含有する5mlのTFA中に2.0時間懸濁することにより達成した。切断されたペプチドを沈降させ、ジエチルエーテルで洗浄し、1%酢酸を含有する20%水性アセトニトリル中に溶解し、分取クロマトグラフィーにより精製した。電子スプレーイオン化またはMALDI−TOF質量分析によりペプチド分子量を確認し、直接凍結乾燥したか、または逆相クロマトグラフィーにより精製した。
3.0μmol(17.7mg)のHS−(CH2)3−PheB1−ヒトインスリンと、3.0μmol(13.5mg)の2−チオピリジルインクレチンとを小さいバイアルに入れ、pH6.0に調整した1.5mlの6.0Mグアニジンバッファー中に溶解した。反応物を1時間撹拌し、2%水性AcOHで希釈し、分取HPLCにより精製したところ、凍結乾燥後に50%の連結された材料が得られた。HPLC条件:Luna C8(2)250mm×21.2mm分取HPLCカラムおよび90分にわたる線形10〜55%勾配を用いる溶出。バッファーA:10%ACN/0.1%TFA、バッファーB:ACN/0.1%TFA、流量:15ml/分、220nmでモニタリング。
本開示によるインクレチン−インスリンコンジュゲート(インクレリン)を、本質的には例1〜7および12に記載のように合成し、GLP−1受容体、GIPおよびインスリン受容体のそれぞれにおけるアゴニスト活性について、本質的には例8〜11に記載のようにin vitroで試験した。B鎖のN末端を、アルキルチオール基を含むように誘導体化し、インクレチンは、2つのペプチドを連結するためのジスルフィド結合を可能にするためにシステインアミノ酸が付加されている。省略形C(S−S)−CH2CH2CH2−B1インスリンは、アルキルチオール基を用いてB鎖のN末端で誘導体化された天然の二本鎖ヒトインスリンを表す。省略形C(S−S)−CH2CH2CH2−B1Desdiは、アルキルチオール基を用いてB鎖のN末端で誘導体化され、B28およびB30残基が欠失し、B29がアミド結合を介してA鎖のN末端に直接連結された天然のヒトインスリンを表す(この一本鎖類似体はインスリン受容体では不活性であるが、B29 Lysアミド結合はトリプシンによる切断またはLys C切断を受けやすく、二本鎖構造および完全なインスリン活性を回復する)。かくして、酵素活性がなければ、Desdiインスリン類似体を含むインクレリンは、関連するインクレチン活性しか示さず、インスリン受容体で活性を示さない。
モデルジペプチド切断の速度の決定(PBS中)
特異的ヘキサペプチド(HSRGTF−NH2;配列番号2036)を、ジペプチドN末端伸長の切断速度を試験することができるモデルペプチドとして使用した。ジペプチド伸長モデルペプチドを、Boc保護されたサルコシンから調製し、モデルペプチド結合樹脂にリシンを連続的に付加して、ペプチドA(Lys−Sar−HSRGTF−NH2;配列番号2036)を生成した。ペプチドAを、HFにより切断し、分取HPLCにより精製した。
切断速度を、それぞれのプロペプチドについて決定した。プロペプチドおよびモデル親ペプチドの濃度を、そのそれぞれのピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数を、様々な時間間隔でのプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定した。このプロットの勾配は、速度定数「k」を提供する。様々なプロドラッグの切断に関する半減期を、式t1/2=0.693/kを使用して算出した。Lys−Sar伸長物の、このモデルペプチドHSRGTF−NH2(配列番号2036)への半減期は、14.0時間であると決定された。
オールdアイソフォームモデルペプチドを用いて決定された血漿中のジペプチド切断半減期の速度
さらなるモデルヘキサペプチド(dHdTdRGdTdF−NH2;配列番号21)を使用して、血漿中でのジペプチド切断の速度を決定した。各アミノ酸のd異性体を使用して、プロドラッグ伸長物を除くモデルペプチドの酵素的切断を防止した。このモデルd異性体ヘキサペプチドを、l異性体と同様の様式で合成した。サルコシンおよびリシンを、ペプチドAについて以前に報告されたようにN末端に連続的に付加して、ペプチドB(dLys−dSar−dHdTdRGdTdF−NH2;配列番号59)を調製した。
切断の速度を、それぞれのプロペプチドについて決定した。プロペプチドとモデル親ペプチドの濃度を、そのそれぞれのピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数を、様々な時間間隔でのプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定した。このプロットの勾配は、速度定数「k」を提供する。Lys−Sar伸長物の、このモデルペプチドdHdTdRGdTdF−NH2(配列番号21)への半減期は、18.6時間であると決定された。
モデルヘキサペプチド(HSRGTF−NH2;配列番号2036)に連結されたさらなるジペプチドに関する切断の速度を、例5に記載の手順を使用して決定した。これらの実験で得られた結果を、表2および表3に提示する。
表2:
表3B:
プロドラッグ形態のIGFB17B17誘導体ペプチドからのジペプチド切断
様々なIGF−1ペプチドからの(pNH2−Phe)アミド結合したジペプチドAibProの切断を測定して、ジペプチド切断に対するペプチド配列またはヘテロ二本鎖の影響を決定した。試験したペプチドに関する結果を、表11に示し、データは、IGF1−A鎖が単独でIGF1 B:A(YL)B16,17ペプチドのプロドラッグ半減期の試験のための良好なモデルであることを示している。
IGF1−A(pNH2−F)19ベースペプチドを使用し、A19位で4−アミノフェニルアラニンを介して連結されたジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸組成を変化させることにより、さらなるプロドラッグ誘導体ペプチドを調製した。ジペプチド半減期を、PBSおよび20%血漿/PBS(すなわち、血清酵素の存在下)の両方において異なる構築物について測定した。結果を、表13に提供する。その結果は、試験した4つのペプチドのうちの3つが血清酵素によって影響されなかったことを示す。
一本鎖インスリン類似体の生合成および精製
IGF−IC鎖により連結された天然インスリンBおよびA鎖を含むインスリン−IGF−Iミニ遺伝子(B0−C1−A0)を、Pichia pastoris酵母中での組換えタンパク質の構成的発現および精製のために、GAPプロモーター(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のプロモーター)の下で発現ベクターpGAPZαA(Invitrogenから購入)中にクローニングした。ミニ遺伝子を、組換えタンパク質の培地中への分泌のためのSaccharomyces cerevisiaeのα−接合因子リーダーシグナルをコードするN末端ペプチドに融合した。ミニ遺伝子と、リーダーα−接合因子配列との間のKex2切断部位を使用して、天然アミノ末端を有するミニ遺伝子の分泌のためにリーダー配列を切断した。単一部位アラニン突然変異を、B0−C1−A0ミニ遺伝子の1(G1A)、2(Y2A)、3(G3A)、4(S4A)、5(S5A)、6(S6A)、7(R7A)、8(R8A)、10(P10A)、11(Q11A)、および12(T12A)位でCペプチド中に導入した。
表14A:
表14B:
表13:
インスリン耐性試験
単回投与
6〜8週齢のオスのC57BL/6マウスを、23℃、一定湿度、および12時間の明暗周期で維持した。選択されたペプチドの急性in vivo効果を、生理的に緩衝化された塩水またはビヒクル対照中に溶解したペプチドを、正常または糖尿病マウスに皮下注射することによって評価した。血糖を、ペプチドの投与後24時間の経過を通して様々な時点で測定した。それぞれのマウス群は、1群あたり8匹のマウスを含んでいた。平均体重は約25gであった。ストレプトゾトシンの投与により、マウスを糖尿病にした。
ペプチドまたはビヒクル対照の毎日反復皮下投与を、5日〜2週間の期間にわたってマウスに投与した。肥満マウスには糖尿病発生食を与え、マウスは水への自由なアクセスを得て、脂肪由来の58%のカロリーを含む高脂肪食(HFD)(D12331;Research Diets,New Brunswick,NJ)を裁量で供給し、各マウス群は、1群あたり8匹の動物を含んでいた。平均体重は約50gであり、マウスは約6カ月齢のオスであった。体重および食物摂取を、ペプチドまたはビヒクル対照をマウスに投与した日に測定した。空腹時血糖値を、反復的に測定した。
カニクイザルにおける段階的グルコース輸注のための手順
12匹の非ナイーブなオスのサルをコロニーから選択し、1匹ずつ飼育し、標準的な固形飼料(Harlan)および水に自由にアクセスさせながら22℃で標準的な12:12時間の明暗周期で維持し、一致した体重(4kg)にしたがって3つの異なる処置群(n=4)にグループ化した。段階的デキストロース輸注の24時間前に、サルに、単回皮下注射によって塩水またはペプチドのいずれかを投与した。全ての試験群に由来するサルを16時間絶食させた後、段階的デキストロース輸注を開始した。デキストロース輸注の30分前に、サルをテラゾール(筋肉内、7mg/kg)で沈静化させ、デキストロース輸注のための静脈内カテーテルを、橈側皮静脈に入れた。ベースライン血液試料を、デキストロースの輸注の20、10、および0分前に、大腿動脈または静脈から取得した。0分で、1分あたり5mg/kgのデキストロース溶液の輸注を開始し、10および20分後に血液を採取した。20分の血液試料を採取した直後に、デキストロース輸注速度を1分あたり10mg/kgに増加させ、その速度での輸注の10および20分後に再度、血液試料を採取した。40分の血液試料を採取した直後、デキストロース輸注速度を1分あたり25mg/kgに増加させ、その速度での輸注の10および20分後に血液を採取した。
動物を、試験の前に12時間にわたって絶食させた。ポートにアクセスした後、手持ち式血糖値測定器を用いて血糖を測定した。全ての動物について同じ血糖値測定器を使用して、2つの読取り値を取って、値が一貫していることを確保した。動物を、グルコースレベルによって無作為化して、群間での均衡のとれた分布を達成した。それぞれの特定の時点で、約3mLの全血を、抗凝固剤としてのK3EDTAおよび100μg/mLのアプロチニンを含有する採血管に採取し、採取の直後に氷浴上に置いた。全血試料を、採取の30分以内に遠心分離し、少なくとも0.5mLの血漿を取得し、インスリンPK(ELISAに基づくアッセイ)などの将来の分析のために保存した。3mL全血試料の小部分(採血管に入れる前)を使用して、採取の直後に手持ち式の血糖値測定器を使用して血糖をチェックした。実験の結果を、図36および図37に提供する。
Claims (44)
- インクレチンペプチド、および
インスリンアゴニストペプチド
を含むインクレチン−インスリンコンジュゲートであって、インクレチンペプチドが5〜10個の原子の直鎖スペーサーによりインスリンペプチドに連結され、スペーサーが、スペーサー直鎖の主鎖内にジスルフィド、チオエーテル、チオエーテルスルホキシド、オキシム、ヒドラゾン、セレン、ジセレン、アルキル、アルケン結合を含み、前記直鎖スペーサーが、インクレチンペプチドのカルボキシ末端を、B鎖のB1、B2、B3、B22、B28もしくはB29位のアミノ酸の側鎖、B鎖のN末端アルファアミン、または一本鎖インスリン類似体のA鎖とB鎖とを連結する連結部分の任意の位置のアミノ酸の側鎖に結合させる、インクレチン−インスリンコンジュゲート。 - インクレチンペプチドのカルボキシ末端が、インスリンペプチドのB鎖のアミノ末端に共有結合により連結している、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 直鎖スペーサーが、式Iの一般構造を含む、請求項1または2に記載のコンジュゲート。
R1、R2、R3およびR4は、H、およびC1−C3アルキルからなる群から独立に選択され、
Yは、C、S、Se、またはS=Oであり、
Zは、C、Se、S、S(C1−C3)(C5−C6アリール)であり、またはYと組み合わせたZは、−O−N=、もしくは1,2,3トリアゾールであり、
nは、0または1であり、
mは、1、2または3であるが、但し、YがS=Oである場合、ZはCである) - R1、R2、R3およびR4が、HおよびCHからなる群から独立に選択され、
YがC、S、またはSeであり、
ZがSeまたはSであり、
nが0または1であり、
mが1、2または3である、
請求項3に記載のコンジュゲート。 - 直鎖スペーサーが、式IIの一般構造を含む、請求項4に記載のコンジュゲート。
- R2およびR3がHであり、
R1およびR4が独立にHまたはCH3であり、
nが0または1であり、
mが1または2である、請求項5に記載のコンジュゲート。 - 直鎖スペーサーが、式IVの一般構造を含む、請求項1または2に記載のコンジュゲート。
- R3がHである、請求項7に記載のコンジュゲート。
- インスリンペプチドがB鎖とA鎖とを含む二本鎖インスリン類似体であり、前記B鎖がジスルフィド結合により前記A鎖に連結される、請求項1から8までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- インスリンペプチドが一本鎖インスリン類似体である、請求項1から8までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、
X1X2EGTFTSDX10SIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号2037)および
X1X2EGTFTSDVSIYLDKQAAX20EFVNWLLAGGPSSGAPPPSX40(配列番号2038)
(式中、
X1は、HisまたはTyrであり、
X2は、アミノイソ酪酸であり、
X10は、ガンマGluリンカーを介してもよいC16−C20アルキル基でアシル化されたLysであり、
X20は、アミノイソ酪酸であり、
X40は、ガンマGluリンカーを介してもよいC16−C20アルキル基でアシル化されたLysである)
からなる群から選択される、請求項1から10までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - インクレチンペプチドが、
(i)1〜3個のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列:
X1−X2−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Tyr−Ser−Lys−Tyr−Leu−Asp−Ser−Arg−Arg−Ala−Gln−Asp−Phe−Val−Gln−Trp−Leu−Met−Z1(配列番号839)
であって、
X1および/またはX2が、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然(配列番号701と比較して)アミノ酸であり、
Z1が、Asn−Thr−COOH、およびY−COOHからなる群から選択され、Yが、1〜2個のアミノ酸であり、さらに、
(1)ラクタム架橋が、i位のアミノ酸とi+4位のアミノ酸の側鎖を接続し、iが12、16、20もしくは24であり、または
(2)インクレチンペプチドの16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3個、もしくは全部が、α,α−二置換アミノ酸で置換されており、
前記インクレチンペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
(ii)配列番号701のアミノ酸配列であって、
28位のAsnの、荷電アミノ酸での置換、
28位のAsnの、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
28位の、Asn、Asp、またはGluでの置換、
28位の、Gluでの置換、
29位のThrの、荷電アミノ酸での置換、
29位のThrの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
29位の、Asp、Glu、またはLysでの置換、
29位の、Gluでの置換、
29位の後への、1〜3個の荷電アミノ酸の挿入、
29位の後への、GluまたはLysの挿入、
29位の後への、Gly−LysもしくはLys−Lysの挿入;またはこれらの組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸改変、
ならびにグループAもしくはグループB、またはこれらの組合せから選択される少なくとも1つのアミノ酸改変を含むように改変され、
グループAは、16位のSerの、ThrまたはAIBでの置換からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
グループBは、
1位のHisの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
2位のSerの、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
10位のTyrの、PheもしくはValでの置換、
12位のLysの、Argでの置換、
20位のGlnの、AlaもしくはAIBでの置換、
21位のAspの、Gluでの置換、
24位のGlnの、AlaもしくはAIBでの置換、
27位のMetの、LeuもしくはNleでの置換、
またはこれらの組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
前記インクレチンペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
(iii)配列番号701のインクレチンペプチドであって、
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸改変、
(b)(1)i位とi+4位とのアミノ酸側鎖間の、もしくはj位とj+3位とのアミノ酸側鎖間のラクタム架橋(ここで、iは12、13、16、17、20もしくは24であり、jは17である)、または
(2)類似体の16、20、21、および24位のアミノ酸のうちの1、2、3個、もしくは全部の、α,α−二置換アミノ酸での置換、
(c)27、28および29位のうちの1、2個または全部のアミノ酸改変、ならびに
(d)1〜6個のさらなるアミノ酸改変
を含むように改変され、GIP受容体活性化に関する類似体のEC50が約10nM以下である、インクレチンペプチド、
(iv)配列番号1の配列であって、
(i)C4−C30脂肪酸でアシル化またはアルキル化された10位のアミノ酸、および
(ii)16位のAIB
を含む、配列、
(v)16、20、21、および/または24位の、AIBでの1つまたは複数のアミノ酸置換を含む10個以下のアミノ酸改変、ならびにジペプチジルペプチダーゼIVによる切断に対する感受性の低減をもたらす1位および/または2位のアミノ酸改変が配列番号701と異なるアミノ酸であって、前記インクレチンペプチドが、GLP−1受容体の天然GLP−1の活性の少なくとも20%を表す、アミノ酸、
(vi)29位のアミノ酸のC末端にGPSSGAPPPS(配列番号95)またはXGPSSGAPPPS(配列番号96)のアミノ酸配列(式中、Xが任意のアミノ酸であり、グリシンであってもよい)をさらに含む、(i)〜(v)のいずれかに記載の類似体、ならびに
(vii)以下のアミノ酸改変:1位のTyr、2位のAIB、10位のLys(ここで、Lysはγ−Glu−γ−GluジペプチドスペーサーによりC16脂肪アシル基に共有結合する)、12位のIle、16位のLys、17位のGln、18位のAla、20位のAIB、21位のGlu、24位のAsn、27位のLeu、28位のAla、29位のGlyを有する配列番号1のアミノ酸、次いで、29位のアミノ酸への配列番号95のアミノ酸のC末端、およびC末端のアルファカルボキシレートの代わりにC末端アミド
を含む、請求項1から10までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - 前記インスリンペプチドが、A鎖とB鎖とを含み、前記A鎖が、配列GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LX17X18YCX21−R13(配列番号19)を含み、前記B鎖が、配列:R22−X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45(配列番号20)を含み、
式中、
X4が、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
X5が、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
X8が、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
X9が、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X10が、イソロイシンまたはセリンであり、
X12が、セリンまたはアスパラギン酸であり、
X14が、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
X15が、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
X17が、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
X18が、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
X21が、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
X25が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29が、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30が、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34が、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41が、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42が、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45が、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
R22が、AYRPSE(配列番号14)、FVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、PGPE(配列番号11)、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびN末端アミンからなる群から選択され、
R13が、COOHまたはCONH2である、
請求項12に記載のコンジュゲート。 - 前記A鎖が、配列GIVEQCCX8X9ICSLYQLENYCX21−R13(配列番号73)を含み、前記B鎖が、配列R22−X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45(配列番号20)を含み、
X8が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
X9が、セリン、リシン、またはアラニンであり、
X21が、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
X25が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
X29が、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
X30が、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
X33が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
X34が、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
X41が、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
X42が、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
X45が、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
R22が、FVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミンおよびN末端アミンからなる群から選択され、
R13が、COOHまたはCONH2である、
請求項13に記載のコンジュゲート。 - 前記B鎖が、配列R22−X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45YT−Z1−B1(配列番号142)を含み、
Z1が、アスパラギン酸−リシン、リシン−プロリン、およびプロリン−リシンからなる群から選択されるジペプチドであり、
B1が、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される、
請求項13に記載のコンジュゲート。 - 前記インスリンペプチドが、
GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21(配列番号3)のA鎖配列、および
R22−HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45(配列番号15)のB鎖配列
を含み、
B鎖が、ジスルフィド結合によりA鎖に連結され、
R22が、結合であるか、またはFVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、VNQ、NQおよびQからなる群から選択される1〜4個のアミノ酸配列であり、
X8が、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
X21が、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
X45が、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである、
請求項11に記載のコンジュゲート。 - インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、以下の一般構造を含む、請求項16に記載のコンジュゲート。
- インスリンペプチドが、
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列、ならびに
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)および
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)
からなる群から選択されるB鎖配列
を含む、請求項17に記載のコンジュゲート。 - インクレチンペプチドのC末端アミノ酸が、B鎖のN末端アルファアミンで前記直鎖スペーサーによりインスリンペプチドに共有結合により連結し、
前記インスリンペプチドが、
GIVEQCCX8SICSLYQLENYCX21(配列番号3)のA鎖配列、および
R22−HLCGSHLVEALYLVCGERGFX45(配列番号15)のB鎖配列
(式中、
R22は、結合であるか、またはFVNQ(配列番号12)、FVKQ(配列番号8)、VNQ、NQおよびQからなる群から選択される1〜4個のアミノ酸配列であり、
X8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
X21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
X45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである)
を含み、B鎖は、ジスルフィド結合によりA鎖に連結されており、ならびに
前記インクレチンペプチドが、
配列X80X81X82GTFTSDYSX83YLX84X85X86X87AX88X89FX90X91WLX92X93X94−Z1(配列番号1928)
(式中、X80は、His、Tyr、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
X81は、Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニンおよびD−アラニンであり、
X82は、GlnまたはGluであり、
X83は、LysまたはIleであり、
X84は、AspまたはGluであり、
X85は、Lys、Arg、SerまたはGluであり、
X86は、ArgまたはGlnであり、
X87は、AlaまたはArgであり、
X88は、アミノイソ酪酸、GlnまたはLysであり、
X89は、AspまたはGluであり、
X90は、ValまたはIleであり、
X91は、Asn、GlnまたはAlaであり、
X92は、Leu、ValまたはMetであり、
X93は、Ala、Asp、Lys AsnまたはAlaであり、
X94は、GlyまたはThrであり、ならびにZ1は、−COOH、GPSSGAPPPS(配列番号820)、KRNRNNIA(配列番号821)およびKRNR(配列番号822)からなる群から選択される)
を含む、
請求項1から8までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - X80がHisまたはTyrであり、
X86がアミノイソ酪酸であり、
Z1がGPSSGAPPPS(配列番号820)である、
請求項19に記載のコンジュゲート。 - 前記インクレチンペプチドが、
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号756)、
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS(配列番号1931)、
H(aib)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGPSSGAPPPS(配列番号1932)、
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS(配列番号1933)、および
YaibEGTFISDYSIYLDRQAAaibEFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号1934)
からなる群から選択されるペプチドであり、
インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、式II
の一般構造を含み、
前記インスリンペプチドが、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)からなる群から選択されるB鎖配列とを含む、
請求項19に記載のコンジュゲート。 - インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、式IIの一般構造を含む、請求項19から21までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- 前記インクレチンペプチドが、配列:
Y(aib)EGTFTSDYSIYLDKQAA(aib)EFVNWLLAGGPSSGAPPPS(配列番号756)、または
H(aib)QGTFTSDYSKYLDERAAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS(配列番号1931)を含み、
前記インスリンペプチドが、GIVEQCCTSICSLYQLENYCN−R13(配列番号1)のA鎖配列と、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(配列番号2)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(配列番号9)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT(配列番号5)、およびFVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTEKT(配列番号6)からなる群から選択されるB鎖配列とを含む、
請求項1から10までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - i)インクレチンペプチドの10、16、20、30および40位から選択される位置、またはインスリンペプチドのB24、B28もしくはB29位の1個または2個のアミノ酸の側鎖が、非天然アルキルまたはアシル基をさらに含む、あるいは
ii)インクレチンペプチドの24、30もしくは40位から選択される位置、またはインスリンペプチドのB24、B28もしくはB29位の1個または2個のアミノ酸の側鎖が、親水性部分に連結され、前記親水性部分がポリエチレングリコールであってもよい、あるいは
iii)i)とii)との組合せ
である、請求項1から10まで、12から15まで、および19から23までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - i)10または40位のアミノ酸の側鎖が、非天然アルキルまたはアシル基をさらに含むか、あるいは
ii)インクレチンペプチドの24もしくは40位、またはインスリンペプチドのB28もしくはB29位のアミノ酸の側鎖が、親水性部分に連結され、前記親水性部分がポリエチレングリコールであってもよいか、あるいは
iii)i)とii)との組合せ
である、請求項24に記載のコンジュゲート。 - アシル基またはアルキル基が、インクレチンペプチドの10位のアミノ酸の側鎖に連結される、請求項25に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、式I
のアミノ酸による10位でのアミノ酸置換を含み、式Iのアミノ酸の側鎖がアシル基またはアルキル基に共有結合により連結している、請求項26に記載のコンジュゲート。 - 請求項1から27までのいずれか1項に記載のコンジュゲートのプロドラッグ誘導体であって、構造:
(式中、
R1は、(C1−C6アルキル)NH−R9または(C1−C6アルキル)NH−S1−R9であり、
R2は、HまたはC1−C6アルキルであり、
R3は、C1−C4アルキル、C3−C8アルケニル、(C0−C4アルキル)(C4−C6シクロアルキル)、(C0−C4アルキル)(C3−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)からなる群から選択されるか、またはR4およびR3はこれらが結合している原子と一緒になって、4、5または6員の複素環を形成し、
R4およびR8は、H、C1−C18アルキル、C2−C18アルケニル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)SH、(C2−C3アルキル)SCH3、(C1−C4アルキル)CONH2、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2、(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2、(C0−C4アルキル)(C3−C6シクロアルキル)、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)、およびC1−C12アルキル(W1)C1−C12アルキルからなる群から独立に選択され、W1は、N、SおよびOからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはR4およびR8は、これらが結合している原子と一緒になって、C3−C6シクロアルキルを形成し、
R10、R11、R12およびR13は、H、CH3、(C1−C4アルキル)COOH、(C1−C4アルキル)NH2、(C1−C4アルキル)NHC(NH2 +)NH2およびCH2(C3−N2複素環)からなる群から独立に選択され、
R5は、NHR6またはOHであり、
R6は、H、またはC1−C8アルキルであり、
R7は、H、OH、C1−C18アルキル、C2−C18アルケニル、(C0−C4アルキル)NH2、および(C0−C4アルキル)OHからなる群から選択され、
R9は、C20−C30アシルからなる群から選択され、
S1は、結合であるか、または1〜6個のアミノ酸からなるスペーサーであり、前記スペーサーは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、アルギニンおよびリシンからなる群から選択される1つまたは複数の荷電アミノ酸を含む) - インスリンペプチドが一本鎖インスリンであり、B鎖とA鎖とを結合させるペプチドリンカーが、SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQR(配列番号1922)、SSSSRAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQK(配列番号1923)、GAGSSSX57X58(配列番号76)、GYGSSSRR(配列番号61)およびGYGSSSX57X58APQT(配列番号77)からなる群から選択され、
X57およびX58が独立にアルギニン、リシンまたはオルニチンである、
請求項1から27までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - ペプチドリンカーが、GYGSSSRR(配列番号61)およびGAGSSSRR(配列番号1925)からなる群から選択される、請求項29に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、配列X1X2EGTFTSDX6SSYLEEQAAKEFIAWLVK−R4(配列番号1936)、またはX1X2QGTFTSDYSKYLDERX5AKDFVX3WLMN−R4(配列番号1937)
を含み、
X1=His、D−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸(DMIA)N−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
X2=Ser、D−セリン、Ala、Val、グリシン、N−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸(AIB)、N−メチルアラニンまたはD−アラニンであり、
X3=Ala、GlnまたはCys−PEGであり、
R4=Thr−CONH2またはCys−PEGまたはGGPSSGAPPPS(配列番号515)、GGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)またはGGPSSGAPPPSCK(rEC16)C(配列番号1935)であり、
X5=AlaまたはArgであり、
X6=バリン、チロシンまたはK(rEC16)Cであり、
X3がCys−PEGである場合、X4はCys−PEGまたはGGPSSGAPPPSC−PEG(配列番号516)ではなく、X2=Serである場合、X1はHisではない、
請求項1から11までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - 前記インクレチンペプチドのカルボキシ末端に連結された、配列番号78、79および80からなる群から選択されるペプチドをさらに含む、請求項1から31までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体(配列番号701)を含み、前記類似体が、以下の改変:
(a)GIPアゴニスト活性を付与する1位でのアミノ酸改変であって、1位のアミノ酸がイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であってもよい、アミノ酸改変、
(b)16位のSerの、式IVのアミノ酸でのアミノ酸置換
(式中、nは1〜7であり、R1およびR2はそれぞれ、H、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、および(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)からなる群から独立に選択され、R7はHまたはOHであり、式IVのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含み、式IVのアミノ酸は、ホモLys、Lys、Orn、または2,4−ジアミノ酪酸(Dab)であってもよい)
(c)類似体の16、20、21および24位のアミノ酸のうちの1、2、3個、または全部の、α,α−二置換アミノ酸での置換、
(d)27、28および29位のうちの1、2個または全部におけるアミノ酸改変、ならびに
(e)グルカゴン配列(配列番号701)と比較して1〜9個のさらなるアミノ酸改変
のうちの1つまたは複数を含み、
GIP受容体活性化に関する類似体のEC50が約10nM以下である、
請求項1から10までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - インクレチンペプチドが、以下の改変:(a)1位のアミノ酸が、大きい芳香族アミノ酸であり、Tyrであってもよいこと、および(b)(i)27位のMetが、大きい脂肪族アミノ酸で置換されており、Leuで置換されていてもよいこと、(ii)28位のAsnが、小さい脂肪族アミノ酸で置換されており、Alaで置換されていてもよいこと、もしくは(iii)29位のThrが、小さい脂肪族アミノ酸で置換されており、Glyで置換されていてもよいこと、を含むか、または類似体が(i)、(ii)および(iii)の組合せを含む、請求項33に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、29位のアミノ酸に対してC末端に位置する位置で前記ペプチドに連結された、GPSSGAPPPS(配列番号820)またはXGPSSGAPPPS(配列番号96)のアミノ酸配列(式中、Xが任意のアミノ酸であり、Glyであってもよい)をさらに含む、請求項33または34に記載のコンジュゲート。
- インクレチンペプチドが、以下の改変:
(a)D−Ser、Ala、D−Ala、Gly、N−メチル−Ser、AIB、Val、またはα−アミノ−N−酪酸で置換された2位のSer、
(b)Gluで置換された3位のGln、
(c)10位のアミノ酸Tyrの、アシル基またはアルキル基に共有結合により連結している側鎖を含む、式I
のアミノ酸であってもよい、アミノ酸での置換、
(d)類似体のC末端アミノ酸でアシル基またはアルキル基に共有結合により連結している側鎖を含む、式Iのアミノ酸であってもよい、アミノ酸の付加、
(e)Ileで置換された12位のLys、
(f)Glnで置換された17位のArg、
(g)Alaで置換された18位のArg、
(h)Gluで置換された21位のAsp、
(i)Asnで置換された24位のGln、および
(j)C末端アミノ酸のカルボン酸の、アミドであってもよい電荷中性基による置き換え
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項33から35までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - インクレチンペプチドが、HAEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVRGRG(配列番号700)、HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(配列番号703)、HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFICWLVKGR(配列番号717)HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(配列番号701)またはHSQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVQWLMNT(配列番号699)の配列を含み、配列番号703、配列番号717、配列番号701または配列番号699のいずれかが、GPSSGAPPPS(配列番号820)またはGGPSSGAPPPS(配列番号1096)のアミノ酸配列の末端伸長をさらに含んでもよい、請求項1から10までのいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- 構造U−Jをさらに含み、
Uがアミノ酸またはヒドロキシ酸であり、
Jが、Jのカルボキシル部分とコンジュゲートのアミンとの間のアミド結合を介して前記コンジュゲートに連結されたN−アルキル化アミノ酸であり、コンジュゲートからのU−Jの化学切断半減期(t1/2)が、生理的条件下、PBS中で少なくとも約1時間〜約1週間である、
請求項1から27まで、または29から34までのいずれか1項に記載のコンジュゲートの誘導体。 - U−Jのアミノ酸側鎖に共有結合により連結しているアシル基またはアルキル基をさらに含む、請求項38に記載のコンジュゲート。
- 前記アシル基またはアルキル基が、天然グルカゴン(配列番号701)の10位に対応するインクレチンペプチドの位置、またはインスリンペプチドのB1、B3、B28、もしくはB29から選択される1つもしくは複数の位置、または構造U−Jのアミノ酸の側鎖に共有結合により連結している、請求項39に記載のコンジュゲート。
- 2つのインクレチン−インスリンコンジュゲート間で形成される二量体であって、第1および第2のインクレチン−インスリンコンジュゲートが、請求項1から40までのいずれか1項に記載のコンジュゲートから独立に選択される、二量体。
- 請求項1から41までのいずれか1項に記載のコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項42に記載の医薬組成物、および前記組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、インスリンアゴニスト/インクレチンコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与するためのキット。
- 糖尿病の処置のための、請求項42に記載の組成物、または薬学的に許容されるその塩のコンジュゲートの使用。
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