JP2017533895A - Ｐ３８キナーゼ阻害剤としての４−（４−（４−フェニルウレイドナフタレン−１−イル）オキシピリジン−２−イル）アミノ安息香酸誘導体 - Google Patents

Abstract

式Ｉの化合物を提供し、この化合物は抗炎症作用（例えば、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素のファミリー；ＳｙｋキナーゼのメンバーおよびチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーのうち１つ以上のメンバーの阻害による）を有し、医薬品の併用を含む療法、特に、肺、眼および腸の炎症性疾患を含む炎症性疾患の治療のため使用する。

Description

本発明は、特に、抗炎症薬である化合物（例えば、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素（本明細書ではｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と呼ぶ）のファミリー、例えば、そのαキナーゼサブタイプ；Ｓｙｋキナーゼ；およびチロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの１つ以上のメンバーの阻害による）に関する。本発明は、単剤療法および併用療法を含む療法、特に、肺（喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など）、眼（ぶどう膜炎、乾性角結膜炎（眼球乾燥症としても公知のドライアイ）など）および胃腸管（クローン病および潰瘍性大腸炎など）における炎症性疾患を含む炎症性疾患の治療におけるこの化合物の使用にも関する。

本明細書中の明らかに先行出版された文書の列挙または考察は、該文書が現状技術の一部または共通の常識であるということを肯定すると必ずしも解釈されるべきでない。
４種のｐ３８ＭＡＰＫアイソフォーム（それぞれ、α、β、γおよびδ）が同定されており、それぞれ異なった組織発現のパターンを示す。ｐ３８ＭＡＰＫαおよびβアイソフォームは身体全体にわたって偏在し、多くの異なる細胞腫において存在しており、すでに報告さｒている多数の低分子量化合物により阻害される。初期に分類される阻害剤は、これらのアイソフォームが組織に広く分布しており、化合物のオフターゲット効果をもたらすことから、非常に毒性が高かった。より近年同定された阻害剤のいくつかはｐ３８ＭＡＰＫαおよびβアイソフォームに対して改良された選択性を示し、より広い安全域を有する。
ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、ヒトの疾病、例えば、重症の喘息、ＣＯＰＤおよび炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における、慢性的で持続する炎症の開始および維持にかかわるシグナリング経路の多くに中心的な役割を果たすと考えられている。現在、ｐ３８ＭＡＰキナーゼが一連の炎症性サイトカインにより活性化されること、およびその活性はさらなる炎症性サイトカインの動員および放出をもたらすことを示す多くの文献がある。実際、いくつかの臨床研究におけるデータは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を用いた治療中の患者における疾患活動性の改善を示している。例えば、Ｓｍｉｔｈは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦα（ＩＬ−８ではない）放出に対する阻害作用について記載している（Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404）。

ＣＯＰＤおよびＩＢＤの治療におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤の使用も提案されてきた。以下の炎症の様々な要因を低下させるためにｐ３８ＭＡＰＫα／βを標的とした低分子阻害剤が効果的であることが確かめられている：
−一般的に副腎皮質ステロイド非感受性であるＣＯＰＤ患者から得られた細胞および組織（Smith, S. J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149:393-404）；
−ＩＢＤ患者からの生検（Docena, G. et al., J. Trans. Immunol., 2010, 162:108-115）；および
−インビボ動物モデル（Underwood, D. C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P. et al., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544:160-167）。

Ｉｒｕｓｅｎらも、核内のグルココルチコイド受容体（ＧＲ）の結合親和性低下による副腎皮質ステロイド非感受性に対するｐ３８ＭＡＰＫα／βの関与の可能性を示唆した（Irusen, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109:649-657）。ＡＭＧ５４８、ＢＩＲＢ７９６、ＶＸ７０２、ＳＣＩＯ４６９およびＳＣＩＯ３２３を含む一連のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を用いた炎症性疾患の臨床調査について記載されている（Lee, M. R. and Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994）。しかしながら、ヒトの長期炎症性疾患の治療におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の利用を妨げる重大な障害は患者に見られる毒性であった。これは充分深刻であったので、具体的に上記した全てのものを含む、多くの進行中の化合物について進められていた臨床開発が中止された。

ＣＯＰＤは、その根本的な炎症が吸入コルチコステロイド剤の抗炎症作用に対し、実質的に耐性であることが報告されている疾患である。結果として、ＣＯＰＤ治療の優れたストラテジーは固有の抗炎症作用およびＣＯＰＤ患者の肺組織における吸入コルチコステロイド剤に対する感受性を増大する能力の両方を有する、治療介入を開発することである。Ｍｅｒｃａｄｏらの最近の出版物（2007; American Thoracic Society Abstract A56 ）は、サイレンシングｐ３８ＭＡＰＫγはコルチコステロイド剤に対する感受性を回復する可能性を有することを示している。従って、ＣＯＰＤ治療のためのｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の使用においては患者に二重の利点があり得る。

喘息またはＣＯＰＤと診断された多くの患者は制御できない症状および結果的に入院となり得るその病状の悪化に苦しめられ続ける。これは吸入コルチコステロイド剤および長期作用性βアゴニストの組合せ製剤から成る現在利用可能な最先端の治療計画の使用にもかかわらず引き起こされる。この１０年にわたって積み上げられたデータは、肺の疾患の根底にある炎症性成分を効果的に処理できていないことが、悪化が起こる最もありそうな理由であることを示している。喘息治療において抗炎症薬であるコルチコステロイド剤および特に吸入コルチコステロイド剤の確立された有効性を考慮することで、これらの発見は熱心な研究を促進した。行われた試験により、いくつかの外界からの刺激が患者の肺内のコルチコステロイド剤感受性炎症における変化を引き起こすことが確認された。例として、喘息およびＣＯＰＤ関連罹患率増加の特定の有意性を有するウイルス介在性上気道感染症（ＵＲＴＩ）に起因する応答が挙げられる。

ｃ−ＳｒｃおよびＳｙｋキナーゼの両方の活性を阻害する化合物がライノウイルス複製に対して有効な薬物であり（Charron, C.E. et al., 国際公開第２０１１／１５８０４２号）、ｐ５９−ＨＣＫを阻害する化合物がインフルエンザウイルス複製に対して有効である（Charron, C.E. et al., 国際公開第２０１１／０７０３６９号）ことが以前に開示されている。ｐ３８ＭＡＰＫの阻害とともに、これらは、慢性呼吸疾患の患者の治療を目的とする化合物における特に興味深い特性である。

特定のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は呼吸器多核体ウイルスの複製の阻害剤としても記載されている（Cass L. et al., 国際公開第２０１１／１５８０３９号）。
ＩＢＤの正確な原因は不明であるが、過剰かつ制御できない管腔ミクロフローラを構成しているものに対する粘膜炎症反応を相互作用によって促進する、遺伝的要因および環境的要因により制御されていると考えられる。この反応は炎症性好中球、樹状細胞および末梢Ｔ細胞の浸潤により介在される。ｐ３８は、炎症性細胞において広範に発現していることから、ＩＢＤモデルの研究にとって明白な標的となった。ＩＢＤの動物モデルおよびＩＢＤ患者由来のヒト生検における、ｐ３８阻害剤の有効性を調査する研究は、ｐ３８がＩＢＤ治療の標的となり得ることを示した（Hove, T. ten et al., Gut, 2002, 50:507-512, Docena, G. et al., J. Trans. Immunol,. 2010, 162:108-115）。しかしながら、これらの発見は、ｐ３８阻害剤を用いて効果がないと報告している他グループとは完全に一致していない（Malamut G. et al., Dig. Dis. Sci, 2006, 51:1443-1453）。ｐ３８α阻害剤ＢＩＲＢ７９６を用いたクローン病患者における臨床試験は、Ｃ反応性タンパク質値が改善した臨床的有用性の可能性を示した。しかしながら、この改善は一過性であり、８週間目までにベースラインに戻った（Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334）。重症クローン病患者におけるＣＮＩ−１４９３、ｐ３８およびＪｎｋ阻害剤の有効性を調査する小規模な臨床試験は、８週間にわたる臨床スコアの有意な改善を示した（Hommes, D. et al. Gastroenterology. 2002 122:7-14）。

Ｔ細胞は胃腸管における炎症の誘導において重要な役割を果たすことが公知である。Ｐｏｗｒｉｅらによる先駆的研究は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）動物へのナイーブＣＤ４＋細胞の移植が、共生細菌の存在に依存する大腸炎の発症をもたらすことを示した（Powrie F. et al. Int Immunol. 1993 5:1461-71）。さらに、ＩＢＤ患者からの粘膜の研究は、Ｔｈ１（ＩＦＮｇ／ＩＬ−２）またはＴｈ２（ＩＬ５／ＴＧＦｂ）のいずれか（該患者がクローン病であるかまたは潰瘍性大腸炎であるかによって異なる傾向があった）である、ＣＤ４＋細胞の上方制御を示した（Fuss IJ. et al. J Immunol. 1996 157:1261-70）。同様に、ベーチェット病患者の血清中のＴ細胞関連サイトカイン（ＩＬ−１７およびＩＬ−２３）値上昇を報告するいくつかの研究において、Ｔ細胞は眼の炎症性疾患で重要な役割を果たすことが公知である（Chi W. et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 49:3058-64）。これらの所見を支持して、Ｄｉｒｅｓｋｅｎｅｌｉらは、ベーチェット病患者において、末梢中のＴｈ１７細胞が増加しており、Ｔｒｅｇ細胞を減少していることを示した（Direskeneli H. et al. J Allergy Clin Immunol. 2011 128:665-6）。

Ｔ細胞活性化を阻害する１つのアプローチは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体の活性化に関連するキナーゼを標的化することである。ＳｙｋおよびＳｒｃファミリーキナーゼは、ＳｒｃファミリーキナーゼであるＦｙｎおよびＬｃｋが活性化されたＴ細胞受容体の下流となる第一シグナル伝達分子となるこの経路内で主要な役割を果たすことが公知である（Barber EK. et al. PNAS 1989, 86:3277-81）。それらは、ＳｙｋファミリーキナーゼであるＺＡＰ−７０の動員を誘導するＴ細胞受容体のチロシンリン酸化を開始する。動物実験は、ＺＡＰ−７０ノックアウトがＳＣＩＤ表現型をもたらすことを示し（Chan AC. et al. Science. 1994, 10;264(5165):1599-601）。

Ｓｙｋ阻害剤ホスタマチニブを用いた関節リウマチ患者の臨床治験において、患者が臨床成績改善ならびにＩＬ−６およびＭＭＰ−３の血清値減少を示し、Ｓｙｋが抗炎症治療の標的となるの可能性を示した（Weinblatt ME. et al. Arthritis Rheum. 2008 58:3309-18）。Ｓｙｋキナーゼは造血系細胞内、中でも注目すべきはＢ細胞および成熟Ｔ細胞内で広範に発現される。免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）との相互作用により、炎症細胞内のＴ細胞およびＢ細胞増殖制御ならびに免疫受容体シグナルの伝達に重要な役割を果たす。Ｓｙｋ活性化は、ＩＢＤおよび関節リウマチを含む炎症性疾患において増加調節されると一般的に知られている炎症性メディエーターである、ＩＬ−６およびＭＭＰ放出を誘導する（Wang YD. et al World J Gastroenterol 2007; 13: 5926-5932, Litinsky I et al. Cytokine. 2006 Jan 33:106-10）。

炎症誘発性経路の活性を制御する細胞シグナル伝達イベントにおいて主要な役割を果たすことに加えて、キナーゼ酵素はＤＮＡ完全性の維持（Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3: 155-168）および細胞分裂の複雑な過程の協調を含む、細胞機能の範囲における活性の調節もすると現在認知されている。実際、特定のキナーゼ阻害剤（いわゆる「オラハルスキー（Ｏｌａｈａｒｓｋｉ）キナーゼ」）は、インビトロにおいて小核形成の頻度を変化させることが分かった（Olaharski, A. J. et al., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446; doi: 10.1371/journal.pcbi.1000446）。小核形成は有糸分裂過程の中断に関連したりまたはそれに伴っていたりするので、望ましくない。グリコーゲン合成酵素キナーゼ３α（ＧＳＫ３α）の阻害は、小核形成を促進するキナーゼ阻害剤の可能性を増大する特に有意な要素であることが分かった。また、ＲＮＡｉとのキナーゼＧＳＫ３βの阻害は、小核形成を促進することが報告された（Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34）。

用量の最適化および／または分子の投与経路変更によりＧＳＫ３αなどのオラハルスキーキナーゼの阻害の副作用を減弱する可能性があるかもしれない一方で、ＧＳＫ３αなどのオラハルスキーキナーゼの阻害が低いまたは無視できる、および／または有糸分裂の過程の停止が低いまたは無視できる（例えば、有糸分裂アッセイで測定したとき）、さらに治療に有用な分子を同定することは有利であろう。

尿素誘導体を含む様々な化合物が１つ以上のキナーゼを阻害するものとして開示されている。このような化合物の例としては、国際公開第９９／２３０９１号、国際公開第００／０４１６９８号、国際公開第００／０４３３８４号、国際公開第００／０５５１３９号、国際公開第０１／３６４０３号、国際公開第０１／４１１５号、国際公開第０２／０８３６２８号、国際公開第０２／０８３６４２号、国際公開第０２／０９２５７６号、国際公開第０２／０９６８７６号、国際公開第２００３／００５９９９号、国際公開第２００３／０６８２２３号、国際公開第２００３／０６８２２８号、国際公開第２００３／０７２５６９号、国際公開第２００４／０１４８７０号、国際公開第２００４／１１３３５２号、国際公開第２００５／００５３９６号、国際公開第２００５／０１８６２４号、国際公開第２００５／０２３７６１号、国際公開第２００５／０４４８２５号、国際公開第２００６／０１５７７５号、国際公開第２００６／０４３０９０号、国際公開第２００７／００４７４９号、国際公開第２００７／０５３３９４号、国際公開第２０１３／０５０７５６号、国際公開第２０１３／０５０７５７号、国際公開第２０１４／０２７２０９号、国際公開第２０１４／０３３４４６号、国際公開第２０１４／０３３４４７号、国際公開第２０１４／０３３４４８号、国際公開第２０１４／０３３４４９号、国際公開第２０１４／０７６４８４号、国際公開第２０１４／１４０５８２号、国際公開第２０１４／１６２１２１号、国際公開第２０１４／１６２１２２号、国際公開第２０１４／１６２１２６号および国際公開第２０１５／０９２４２３号において見ることができる。さらなる例を以下の出版された論文で見ることができる：
−Curr. Opin. Drug Devel. (2004, 7(5), 600-616)；
−J. Med. Chem. (2007, 50, 4016-4026; 2009, 52, 3881-3891; and 2010, 53, 5639-5655)；
−Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007, 17, 354-357; 2008, 18, 3251-3255; 2009, 19, 2386-2391; and 2010, 20, 4819-4824)；
−Curr. Top. Med. Chem. (2008, 8, 1452-1467)；
−Bioorg. Med. Chem. (2010, 18, 5738-5748)；
−Eur. J. Pharmacol. (2010, 632, 93-102)；
−J. Chem. Inf. Model. (2011, 51, 115-129)；および
−Br. J. Pharmacol. (2015, 172, 3805-3816)。

国際公開第９９／２３０９１号 国際公開第００／０４１６９８号 国際公開第００／０４３３８４号 国際公開第００／０５５１３９号 国際公開第０１／３６４０３号 国際公開第０１／４１１５号 国際公開第０２／０８３６２８号 国際公開第０２／０８３６４２号 国際公開第０２／０９２５７６号 国際公開第０２／０９６８７６号 国際公開第２００３／００５９９９号 国際公開第２００３／０６８２２３号 国際公開第２００３／０６８２２８号 国際公開第２００３／０７２５６９号 国際公開第２００４／０１４８７０号 国際公開第２００４／１１３３５２号 国際公開第２００５／００５３９６号 国際公開第２００５／０１８６２４号 国際公開第２００５／０２３７６１号 国際公開第２００５／０４４８２５号 国際公開第２００６／０１５７７５号 国際公開第２００６／０４３０９０号 国際公開第２００７／００４７４９号 国際公開第２００７／０５３３９４号 国際公開第２０１３／０５０７５６号 国際公開第２０１３／０５０７５７号 国際公開第２０１４／０２７２０９号 国際公開第２０１４／０３３４４６号 国際公開第２０１４／０３３４４７号 国際公開第２０１４／０３３４４８号 国際公開第２０１４／０３３４４９号 国際公開第２０１４／０７６４８４号 国際公開第２０１４／１４０５８２号 国際公開第２０１４／１６２１２１号 国際公開第２０１４／１６２１２２号 国際公開第２０１４／１６２１２６号 国際公開第２０１５／０９２４２３号

Curr. Opin. Drug Devel. (2004, 7(5), 600-616) J. Med. Chem. (2007, 50, 4016-4026; 2009, 52, 3881-3891; and 2010, 53, 5639-5655) Bioorg. Med. Chem. Lett. (2007, 17, 354-357; 2008, 18, 3251-3255; 2009, 19, 2386-2391; and 2010, 20, 4819-4824) Curr. Top. Med. Chem. (2008, 8, 1452-1467) Bioorg. Med. Chem. (2010, 18, 5738-5748) Eur. J. Pharmacol. (2010, 632, 93-102) J. Chem. Inf. Model. (2011, 51, 115-129) Br. J. Pharmacol. (2015, 172, 3805-3816)。

にもかかわらず、新規キナーゼ阻害剤、特に、炎症治療に好適なｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤代替物の同定および開発が今だ必要とされている。現在利用可能な治療以上の治療可能性を改善するような、または、特に、優れた治療指数（例えば、少なくとも等しく有効であり、１つ以上の観点で前の薬物より関連のある治療用量において毒性がすくない）を示すような阻害剤を特に必要としている。

驚くべきことに、本発明者らは、ジアリール尿素を有する安息香酸アニリンがｐ３８ＭＡＰキナーゼ、ＳｙｋおよびＳｒｃファミリーキナーゼの１つ以上を阻害し、従って、良好な抗炎症特性を有することを発見した。

このように、本発明の第一態様に従えば、式Ｉの化合物：

またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を提供する。
この化合物を以後「本発明の化合物」と呼ぶ。

言及される薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。このような塩を、従来の方法、例えば、必要に応じて、溶媒または塩が不溶性である溶媒中、式Ｉの化合物の遊離酸または遊離塩基を適切な酸または塩基の１当量以上と反応させて、次いで、標準的方法（例えば、真空下、凍結乾燥またはろ過により）を用いて前記溶媒または前記溶媒を除去することにより製造してもよい。例えば、適切なイオン交換樹脂を用いて、塩の形態の式Ｉの化合物の対イオンを別の対イオンに交換することにより製造してもよい。

薬学的に許容可能な塩の例としては、鉱酸と有機酸から誘導された酸付加塩、および金属から誘導された塩が挙げられる。
疑義を避けるために明記すると、式Ｉの化合物は、天然同位体または非天然同位体のいずれかの所定の原子を含有してもよい。この点において、言及される本発明の実施形態としては以下のものが挙げられる：
（ａ）式Ｉの化合物は同位体が濃縮されていない、または該化合物のいずれかの原子に対して同位体で標識化されていない；および
（ｂ）式Ｉの化合物は同位体が濃縮されている、または該化合物の１つ以上の原子に対して同位体で標識化されている。

本明細書中、「同位体誘導体」と言うのはこれらの２つの実施形態の２番目に関する。本発明の特定の実施形態では、式Ｉの化合物は同位体が濃縮されているか、または１つ以上の安定な同位体で標識化（該化合物の１つ以上の原子に対して）されている。このように、言及される本発明の化合物としては、例えば、同位体が濃縮された、または重水素等のような１つ以上の原子で標識化された式Ｉの化合物が挙げられる。

式Ｉの化合物は互変異性を示してもよい。全ての互変異性体およびその混合物は本発明の範囲内に含まれる。
特に指定されない限り、本明細書中定義されるアルキル基およびアルコキシ基は直鎖であってもよく、または充分な炭素原子数（すなわち、最低３個）がある場合、分岐鎖であってもよい。言及される特定のアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、ｎ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。言及される特定のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびブトキシが挙げられる。

特に指定されない限り、本明細書中定義されるアルキレン基は直鎖であってもよく、または充分な炭素原子数（すなわち、最低２個）がある場合、分岐鎖であってもよい。本発明の特定の実施形態では、アルキレンは直鎖アルキレンを表す。

特に明記されない限り、アリール基の結合点は環構造のいずれかの原子であり得る。しかしながら、アリール基が二環式または三環式である場合、芳香環を介して分子の他の部分と結合する。Ｃ₆〜₁₄アリール基としてはフェニル、ナフチル等が挙げられる。言及される本発明の実施形態としては、アリールがフェニルであるものが挙げられる。

特に指定されない限り、「ハロ」という語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード、特に、フルオロ、クロロまたはブロモ、特に、フルオロまたはクロロを表すことを含む。

式Ｉの化合物は、４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸という名を有するが、化学名４−［［４−［［４−［［５−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（メタンスルホンアミド）−２−メトキシフェニル］−カルバモイルアミノ］−１−ナフチル］オキシ］−２−ピリジル］アミノ］−２−メトキシ安息香酸としても公知であり得る。

式Ｉの化合物の塩の例としては、これに限定されないが、ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄およびＨＢｒ塩（例えば、ＨＣｌ塩またはＨＢｒ塩）などの強鉱酸とメタンスルホン酸などの強有機酸との酸付加塩などの全ての薬学的に許容可能な塩が挙げられる。

言及される式Ｉの化合物の具体的な塩としては、塩酸塩およびナトリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、Ｎ−メチルグルカミン（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−６−（メチルアミノ）ヘキサン−１，２，３，４，５−ペントール）塩またはベネタミン（Ｎ−ベンジル−２−フェネチルアミン）塩（例えば、ナトリウムまたはアンモニウム塩）が挙げられる。

このように、言及される本発明の実施形態としては、４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸の塩酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩またはアンモニウム塩が挙げられる。

言及される式Ｉの化合物のより具体的な塩としては、塩酸塩、ナトリウム塩およびアンモニウム塩が挙げられる。
本明細書中、本発明の化合物（式Ｉの化合物）と言うのは、特に文脈上具体的に示さない限り、化合物および前記化合物の全ての薬学的に許容可能な塩、溶媒和物および／または互変異性体を言うことを含む意図がある。この点において、言及される溶媒和物は水和物を含む。

本発明の化合物（式Ｉの化合物）はｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（特に、αサブタイプの）、ＳｙｋキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼ、例えば、ＳｒｃおよびＬｃｋであり、従って、医薬分野で、特に、炎症性疾患の治療用に有用である。従って、言及される本発明のさらなる態様としては以下のものが挙げられる。

（ａ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した上記定義の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含んでなる医薬製剤。

（ｂ）以下を含んでなる組合せ製剤
（Ａ）上記定義の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、および
（Ｂ）別の治療薬、
成分（Ａ）および（Ｂ）の各々を薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合して製剤する。

本発明のこの態様では、組合せ製剤は単一（併用）医薬製剤でもパーツからなるキット（kit-of-parts）でもどちらであってもよい。
このように、本発明のこの態様は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した、上記定義の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含んでなる医薬製剤、および別の治療薬を含む医薬製剤を包含する（この製剤を以降「混合製剤」と呼ぶ）。

これは以下の成分を含んでなるパーツからなるキットも包含する。
（ｉ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した、上記定義の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含む医薬製剤；および
（ｉｉ）薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した、別の治療薬を含む医薬製剤、
成分（ｉ）および（ｉｉ）を各々、他のものと併せて投与するのに適切な形態で提供する。

従って、キット・オブ・パーツの成分（ｉ）は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した上記成分（Ａ）である。同様に、成分（ｉｉ）は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合した上記成分（Ｂ）である。

（ｃ）上記定義の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体と混合する工程を含む、上記態様（ａ）の医薬製剤の製造方法。

言及される本発明のこの態様の実施形態としては、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体が局所的に許容可能なアジュバント、希釈剤または担体（および／または該方法が局所医薬製剤、すなわち、局所投与に適合する医薬製剤である）であるものが挙げられる。

（ｄ）医薬分野での使用（または薬剤もしくは医薬としての使用）のための上記定義の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体。
（ｅ）炎症性疾患の治療または予防での使用のための、上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または医薬製剤もしくは本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤。

（ｆ）炎症性疾患の治療用薬剤もしくは予防用薬剤製造のための
上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤、
の使用。

（ｇ） 上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤、
の効果量を対象に投与することを含む、炎症性疾患の治療もしくは予防方法。

（ｈ） 上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤、
の効果量を対象に投与することを含む、コルチコステロイド剤の抗炎症作用に対する対象の感作方法。

言及される本発明のこの態様の実施形態としては、該対象がコルチコステロイド剤の抗炎症作用に対して効果がなくなったものであるものが挙げられる。
本明細書中、「炎症性疾患の予防」と言うのは、以前にかかる疾病を患った対象（例えば、その疾病のための治療、例えば、上記（ｇ）に記載の方法に従った治療を以前に受けた対象）の炎症性疾患の再発を予防（または可能性を低減）することを言うことを含む。

従って、言及される本発明のさらにさらなる態様としては以下のものが挙げられる。
（ｉ）その疾病の治療（例えば、上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤を用いた治療）を以前に受けた対象の炎症性疾患の再発の可能性を低減するのに使用するための、上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤。

（ｊ）その疾病の治療（例えば、上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤を用いた治療）を以前に受けた対象の炎症性疾患の再発の可能性を低減するための薬剤製造のための、
上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤
の使用。

（ｋ）その疾病の治療（例えば、上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤を用いた治療）を以前に受けた対象の炎症性疾患の再発の可能性の低減方法であって、前記方法が、
上記定義の式Ｉの化合物、もしくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
医薬製剤または本発明の態様（ａ）もしくは（ｂ）と関連して定義された組合せ製剤
の効果量を前記対象に投与することを含む。

製剤
上述した態様（ａ）および（ｂ）に関して、言及される希釈剤および担体としては、非経口、経口、局所、粘膜および直腸投与に適したものが挙げられる。

上記態様（ａ）および（ｂ）の医薬製剤および組合せ製剤は、例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、硝子体内、眼周囲、眼球後方、結膜下、眼球鞘下、眼局所または関節周辺の投与のために、特に液剤、エマルジョン剤または懸濁液剤の液体の形態で；経口投与のために、特に錠剤またはカプセル剤の形態で、とりわけ、結腸を標的として薬剤を放出することを目的とする技術を伴うものであり(Patel, M. M. Expert Opin. Drug Deliv. 2011, 8 (10), 1247-1258)；局所、例えば肺または鼻腔内への投与のために、特に粉末、点鼻薬、エアゾールの形態で、また経皮投与のために；眼局所投与のために、特に、液剤、エマルジョン剤、懸濁液剤、軟膏剤、移植材料／インサート、ゲル剤、ゼリー剤またはリポソーム微粒子薬剤の形態で(Ghate, D.； Edelhauser, H. F. Expert Opin. Drug Deliv. 2006, 3 (2), 275-287)；眼への投与のために、特に生分解性および非生分解性の移植材料、リポソームおよびナノ粒子の形態で (Thrimawithana, T. R. et al. Drug Discov. Today 2011, 16 (5/6), 270-277);例えばバッカル（buccal）（頬）、舌下、または膣の粘膜に対する、粘膜投与のために、および直腸投与のために、例えば座薬または浣腸の形態で、調製することができる。

上述した態様（ａ）および（ｂ）の医薬製剤および組合せ製剤は、都合のよいように、単位剤形で投与することができ、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985) に記載されているような、医薬分野で周知の方法のいずれかによって製造してもよい。非経口投与用の製剤には、賦形剤として、滅菌水または食塩水、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性油、水素化ナフタレンなどを含有してもよい。経鼻投与用の製剤は、固形でもよく、賦形剤として、例えば、ラクトースまたはデキストランを含有してもよく、あるいは点鼻薬または計量スプレーの形態で使用するために水性液剤でも油性液剤でもよい。バッカル投与では、典型的な賦形剤としては、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファデンプン等が挙げられる。

経口投与に適した医薬製剤および組合せ製剤は、１つ以上の薬学的に許容可能な、担体および／または賦形剤を含有してもよく、固形または液状であってもよい。錠剤およびカプセル剤は、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカンタ、またはポリビニルピロリドン；ラクトース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシンといった充填材；ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカといった潤滑剤；およびラウリル硫酸ナトリウムのような界面活性剤を用いて製造してもよい。液状の組成物は、懸濁剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、砂糖シロップ、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、食用油脂；レシチンまたはアカシアといった乳化剤；アーモンドオイル、ココナッツオイル、タラ肝油、またはピーナッツオイルといった植物油；ブチルヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）およびブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）といった防腐剤などの、従来の添加剤を含んでもよい。液状の組成物は、単位剤形を提供するために、例えばゼラチン中に内包されていてもよい。

固形の経口剤形としては、錠剤、ツーピースハードシェルカプセル剤および軟弾性ゼラチン（ＳＥＧ）カプセル剤が挙げられる。そのようなツーピースハードシェルカプセル剤は、例えば、ゼラチンまたはヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から製造されてもよい。

ドライシェル製剤は、典型的には、約４０〜６０％（ｗ／ｗ）の濃度のゼラチン、約２０〜３０％の濃度の可塑剤（グリセリン、ソルビトールまたはプロピレングリコールなど）、および約３０〜４０％の濃度の水から成る。防腐剤、色素、乳白剤および香料といったその他の材料が存在してもよい。液状の充填材料は、溶解、可溶化もしくは分散した固形の薬物（ミツロウ、硬化ヒマシ油またはポリエチレングリコール４０００のような懸濁剤を用いて）または鉱物油、植物油、トリグリセリド、グリコール、ポリオールおよび界面活性剤などの溶媒または溶媒の組合せ中の液体薬物を含む。

本発明の化合物は、局所的に（例えば、肺、眼または腸に）投与することもできる。従って、言及される上記態様（ａ）および（ｂ）の実施形態としては、局所投与に適合する医薬製剤および組合せ製剤が挙げられる。そのような製剤としては、賦形剤（いずれかのアジュバント、希釈剤および／または担体を含む）が局所的に許容可能であるものが挙げられる。

肺への局所投与は、エアゾール製剤を用いることによって達成し得る。エアゾール製剤は、典型的には、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などの適切なエアゾールの噴射剤に懸濁または溶解した有効成分を含んでなる。適切なＣＦＣ噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン（噴射剤１１）、ジクロロテトラフルオロエタン（噴射剤１１４）およびジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２）が挙げられる。適切なＨＦＣ噴射剤としては、テトラフルオロエタン（ＨＦＣ−１３４ａ）およびヘプタフルオロプロパン（ＨＦＣ−２２７）が挙げられる。噴射剤は、典型的には、総吸入組成物の４０重量％〜９９．５重量％、例えば４０重量％〜９０重量％を含んでなる。この製剤は、共溶媒（例えばエタノール）および界面活性剤（例えばレシチン、ソルビタントリオレエートなど）を含む賦形剤を含み得る。他の考え得る賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリン等が挙げられる。エアゾール製剤はキャニスターに包装され、適切な用量は計量バルブ（例えば、Ｂｅｓｐａｋ、Ｖａｌｏｉｓもしくは３Ｍによって供給されているもの、あるいは、Ａｐｔａｒ、ＣｏｓｔｅｒもしくはＶａｒｉによって提供されているもの）によって送達される。

肺への局所投与は、水性液剤または懸濁液剤などの加圧しない製剤を用いることによっても達成し得る。これを、ネブライザー、例えば、携帯型で持ち運びができるものや、または、家もしくは病院で使用するための（すなわち持ち運びができない）によって投与してもよい。製剤は、水、緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤および共溶媒などの賦形剤を含んでもよい。懸濁液およびエアゾール製剤（加圧されていてもいなくても）は、典型的には、例えば、Ｄ₅₀が０．５〜１０μｍ、例えば約１〜５μｍである微細粉末形態で本発明の化合物を含有する。粒径分布は、Ｄ₁₀、Ｄ₅₀およびＤ₉₀の値を用いて示し得る。粒径分布のＤ₅₀メジアン値は、その分布を２で割ったときのミクロン単位の粒径として定義される。レーザー回折から導き出される測定値は、体積分布としてより正確に記載されるので、この方法を用いて得られたＤ₅₀値は、Ｄｖ₅₀値（体積分布のメジアン）をより意味があるように示す。Ｄｖ値は、本明細書において使用するときには、レーザー回折を用いて測定された粒径分布を言う。同様に、レーザー回折に関連して用いられるＤ₁₀値およびＤ₉₀値は、Ｄｖ₁₀値およびＤｖ₉₀値を意味し、それにより、それぞれ、１０％の分布がＤ₁₀値より低く、９０％の分布がＤ₉₀値より低い粒径を表すと解釈される。

肺への局所投与は、乾燥粉末製剤を用いることによって得てもよい。乾燥粉末製剤は、典型的には１〜１０μｍの質量平均空気動力学的直径（ＭＭＡＤ）が１〜１０μｍであるか、Ｄ₅₀が０．５〜１０μｍ、例えば、約１〜５μｍの微細粉末形態である本開示の化合物を含有するだろう。微細粉末形態である本発明の化合物の散剤は、微粒子化処理または同様のサイズリダクション処理によって製造してもよい。微粒子化は、ホソカワアルピネ社製などのジェットミルを用いて行ってもよい。得られた粒径分布は、（例えば、マルバーン・マスターサイザー２０００Ｓ装置を用いて）レーザー回折を用いて測定することができる。この製剤は、通常大きな粒径である、例えば、５０μｍ以上、例えば、１００μｍ以上のＭＭＡＤまたは、４０〜１５０μｍのＤ₅₀である、ラクトース、グルコースまたはマンニトール（好ましくはラクトース）などの局所的に許容可能な希釈剤を通常含有する。「ラクトース」という語は、本明細書において使用するときには、αラクトース一水和物、βラクトース一水和物、αラクトース無水物、βラクトース無水物および非晶質ラクトースを含むラクトース含有成分をあらわす。ラクトース成分を、微粒子化、ふるい分け、製粉、圧縮、凝集またはスプレー乾燥によって処理してもよい。多様な形態の市販ラクトース、例えば、ラクトヘイル(Ｌａｃｔｏｈａｌｅ)（登録商標）（吸入グレードラクトース；ＤＦＥファーマ社）、インハラック（ＩｎｈａＬａｃ）（登録商標）７０（ふるい分けされた、乾燥粉末吸入用のラクトース；メグレ社）、ファーマトース（Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ）（登録商標） （ＤＦＥファーマ社）およびレスピトース（Ｒｅｓｐｉｔｏｓｅ）（登録商標） （ふるい分けされた吸入グレードラクトース；ＤＦＥファーマ社)の製品なども包含される。１つの実施形態では、ラクトース成分は、αラクトース一水和物、αラクトース無水物および非晶質ラクトースから成る群から選択される。好ましくは、ラクトースは、αラクトース一水和物である。

乾燥粉末製剤は、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸マグネシウムなどの他の賦形剤も含んでもよい。
乾燥粉末製剤を、典型的には、乾燥粉末吸引（ＤＰＩ）機器を用いて送達する。乾燥粉末の送達系の例としては、スピンヘイラー（ＳＰＩＮＨＡＬＥＲ）、ディスクヘイラー（ＤＩＳＫＨＡＬＥＲ）、ターボヘイラー（ＴＵＲＢＯＨＡＬＥＲ）、ディスカス（ＤＩＳＫＵＳ）およびクリックヘイラー（ＣＬＩＣＫＨＡＬＥＲ）が挙げられる。乾燥粉末の送達系の更なる例としては、エクリプス（ＥＣＬＩＰＳＥ）、ネクスト（ＮＥＸＴ）、ロタヘイラー（ＲＯＴＡＨＡＬＥＲ）、ハンディヘイラー（ＨＡＮＤＩＨＡＬＥＲ）、エアロライザー（ＡＥＲＯＬＩＳＥＲ）、シクロヘイラー（ＣＹＣＬＯＨＡＬＥＲ）、ブリーズヘイラー（ＢＲＥＥＺＨＡＬＥＲ）／ネオヘイラー（ＮＥＯＨＡＬＥＲ）、モノドース（ＭＯＮＯＤＯＳＥ）、フローキャップス（ＦＬＯＷＣＡＰＳ）、ツインキャップス（ＴＷＩＮＣＡＰＳ）、Ｘ−キャップス（Ｘ−ＣＡＰＳ）、ターボスピン（ＴＵＲＢＯＳＰＩＮ）、エルペンヘイラー（ＥＬＰＥＮＨＡＬＥＲ）、ミアトヘイラー（ＭＩＡＴＨＡＬＥＲ）、ツイストヘイラー（ＴＷＩＳＴＨＡＬＥＲ）、ノボライザー（ＮＯＶＯＬＩＺＥＲ）、プレスエアー（ＰＲＥＳＳＡＩＲ）、エリプタ（ＥＬＬＩＰＴＡ）、オリエル（ＯＲＩＥＬ）ドライパウダーインヘイラー、ミクロドース（ＭＩＣＲＯＤＯＳＥ）、プルビナル（ＰＵＬＶＩＮＡＬ）、イージーヘイラー（ＥＡＳＹＨＡＬＥＲ）、ウルトラヘイラー（ＵＬＴＲＡＨＡＬＥＲ）、タイフン（ＴＡＩＦＵＮ）、プルモジェット（ＰＵＬＭＯＪＥＴ）、オムニヘイラー（ＯＭＮＩＨＡＬＥＲ）、ジャイロヘイラー（ＧＹＲＯＨＡＬＥＲ）、テイパー（ＴＡＰＥＲ）、コニックス（ＣＯＮＩＸ）、エクセロベール（ＸＣＥＬＯＶＡＩＲ）およびプロヘイラー（ＰＲＯＨＡＬＥＲ）が挙げられる。

１つの実施形態では、例えば好適なグレードのラクトースと必要に応じてステアリン酸マグネシウムをさらに含んでおり、例えば、エアロライザー（ＡＥＲＯＬＩＳＥＲ）などの単回投与用デバイスまたはディスカス（ＤＩＳＫＵＳ）などの多数回型投与用デバイスに充填された、微粒子化した乾燥粉末製剤として、本発明の化合物を提供する。

本発明の化合物を、例えば座薬または浣腸剤の形態で直腸に投与してもよく、水性または油性液剤ならびに懸濁液剤または乳剤が挙げられる。このような組成物は、当業者に周知である以下の標準的手順で製造される。例えば、座薬は、その有効成分とカカオバターまたは他のグリセリド、例えば、サポサイアー（Ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ）などの従来の座薬基剤とを混合することによって製造できる。この場合、常温では固形であるが直腸温度では液体になることで、直腸内で溶けて薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物とを混合する。このような材料はカカオバターおよびポリエチレングリコールである。

概して、点眼薬または眼軟膏薬の形態で眼に局所投与する目的の組成物のため、阻害剤の総量は約０．０００１〜４．０％ｗ／ｗ未満となるだろう。
好ましくは、眼局所投与のため、本発明に従って投与する組成物を、液剤、懸濁液剤、エマルション剤、および他の剤形として製剤する。製剤の容易さおよび患部である眼に１〜２滴の液剤を点眼することによってこのような組成物を患者が容易に投与することができるので、水性液剤が概して好ましい。しかしながら、該組成物は、懸濁液剤、粘性もしくは半粘性ゲル剤、または他のタイプの固形もしくは半固形組成物であってもよい。懸濁液剤は、水にやや溶けにくい化合物にとって好適であり得る。

本発明に従って投与する組成物は、これらに限定されないが、等張化剤、緩衝剤、界面活性剤、安定化ポリマー、防腐剤、共溶媒および増粘剤を含む様々な他の成分も含有してもよい。本発明の好ましい医薬組成物は、等張化剤および緩衝剤とともに阻害剤を含む。本発明の医薬組成物は、界面活性剤および／または緩和剤および／または安定化ポリマーを必要に応じてさらに含有してもよい。

眼科用組成物のため、好ましくは天然の涙の張度になるように組成物の張度を調節するために様々な等張化剤を使用してもよい。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、ブドウ糖、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、および／または、糖アルコールであるマンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルチトール、マルチトール、および水素化デンプン加水分解物などの単純ポリオールをおおよそ生理的張度となるまで該組成物に添加してもよい。等張化剤のこのような量は、添加する特定の薬物に応じて異なる。しかしながら、概して、組成物は、最終的な組成物が眼に許容可能な浸透圧（概して約１５０〜４５０ｍＯｓｍ（ミリオスモル）、好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ、最も好ましくは約２９０ｍＯｓｍ）になるのに十分な量の等張化剤を含む。概して、本発明の等張化剤は、２〜５％ｗ／ｗ（例えば、２〜４％ｗ／ｗ）の範囲で存在する。本発明の好ましい等張化剤としては、単糖類またはＤ−マンニトールなどの糖アルコールが挙げられる。

保存条件下におけるｐＨのドリフトを防止するために、適切な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸）を組成物に添加してもよい。使用する薬物に応じて、特定の濃度は異なるが、好ましくは、目標とするｐＨをｐＨ５〜８、より好ましくは目標とするｐＨをｐＨ５〜７、または目標とするｐＨをｐＨ６．５〜７．６の範囲内に維持するように緩衝剤を選ぶ。

より高濃度の阻害剤を送達するために、界面活性剤を必要に応じて使用してもよい。界面活性剤は、阻害剤を可溶化し、ミセル液剤、マイクロエマルション剤、エマルション剤および懸濁液剤などコロイド分散液剤を安定化する働きをする。必要に応じて使用し得る界面活性剤の例としては、ポリソルベート、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシルヒマシ油、チロキサポール、トリトン、およびソルビタンモノラウレートが挙げられる。本発明において使用する好ましい界面活性剤は、１２．４〜１３．２の範囲の親水性／親油性／バランス値「ＨＬＢ値」を有し、トリトンＸ１１４およびチロキサポールなどの眼科用途に許容可能である。

例えば、眼局所投与のため、４−(（４−(（４−(３−(５−(ｔｅｒｔ-ブチル)−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体は以下のものを含んでいてもよい：
（ａ）水；
（ｂ）界面活性剤（例えば、ステアリン酸ポリオキシル４０）；
（ｃ）等張化剤（例えば、マンニトール）；および
（ｄ）ｐＨ６．５〜８の範囲内に目標ｐＨを維持するために選択された適切な緩衝系（例えば、一塩基性二水素リン酸塩および二塩基性一水素リン酸塩の混合物含有リン酸緩衝剤）。

このような眼局所製剤においては、以下の１つ以上（例えば、全部）が適用され得る：
（ｉ）４−(（４−(（４−(３−(５−(ｔｅｒｔ-ブチル)−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸は、０．００１〜２０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．１〜２ｍｇ／ｍＬまたは特に１ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度で存在する；
（ｉｉ）界面活性剤（例えば、ステアリン酸ポリオキシル４０）は、１〜１０％ｗ／ｗ（例えば、２．５〜４％ｗ／ｗなどの２〜５％ｗ／ｗ）または特に３％ｗ／ｗ）で存在する；
（ｉｉｉ）等張化剤（例えば、マンニトール）は、１〜１５％ｗ／ｗ（例えば、３〜６％ｗ／ｗなどの２〜１０％ｗ／ｗ）または特に４．５％ｗ／ｗ）で存在する；
（ｉｖ）該製剤の成分として使用される緩衝系は、６．５〜８．０の範囲内（例えば、７．０〜７．８または特に７．２〜７．６の範囲内）に目標ｐＨを維持するために選択された水性リン酸緩衝剤（例えば、１０ｍＭ水性リン酸緩衝剤）である。

本発明の眼科用組成物に添加し得る添加剤は、安定化ポリマーとして働く粘滑剤である。安定化ポリマーは、眼の局所用途のためにはイオン性／帯電したポリマーがまず挙げられ、より詳細には、物理的安定性のために（−）１０〜５０ｍＶのゼータ電位を呈することができるその表面上の負電荷を帯び、水中に分散可能（すなわち、水溶性）であるポリマーである。本発明の好ましい安定化ポリマーは、０．１〜０．５％ｗ／ｗであって、カルボマー、ポリカルボフィルおよびペムレン（Ｐｅｍｕｌｅｎ）（登録商標）、特にカルボマー９７４ｐ（ポリアクリル酸）などの架橋ポリアクリレートファミリーである、高分子電解質であるだろう。

担体の粘度を増加させるために、他の化合物を本発明の点眼組成物に添加してもよい。増粘剤の例としては：ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン、セルロースファミリーの様々なポリマーなどの多糖類；ビニルポリマーおよびアクリル酸ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

局所眼科用製品は、典型的には複数回投与の剤形でパッケージされる。従って、使用中の微生物汚染を防止するために防腐剤が必要とされる。適切な防腐剤としては：塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウムブロマイド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に公知の他の薬剤が挙げられる。このような防腐剤を、典型的には０．００１〜１．０％ｗ／ｖの濃度で使用する。本発明の単位用量組成物は滅菌されているが、通常貯蔵されるものではないので、このような組成物は概して防腐剤を含有しない。

開業医または他の当業者は、本発明の化合物用の適切な投薬量つまり、いずれかの特定の医薬製剤に含有されるべき本発明の化合物量（単位剤形でもそうでなくても）を決定することができる。

上記（ｂ）に記載した組合せ製剤に関連して言及される本発明の実施形態としては、他の治療薬が、炎症性疾患（例えば、後述する特定の疾病）の治療に好適であると当業者に公知である１つ以上の治療薬であるものが挙げられる。

例えば、呼吸器疾患（ＣＯＰＤまたは喘息など）治療のための、他の治療薬は、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬物である：
−ステロイド（例えばブデソニド、ベクロメタゾン二プロピオン酸塩、フルチカゾンプロピオン酸塩、フランカルボン酸モメタゾン、フランカルボン酸フルチカゾン；更なる例としては、シクレソニド）；
−βアゴニスト、特にβ２アゴニスト（例えば、テルブタリン、サルブタモール、サルメテロール、フォルモテロール；更なる例としては、ビランテロール、オロダテロール、レプロテロールおよびフェノテロール）；および
−キサンチン（例えばテオフィリン）。

例えば、呼吸器疾患（ＣＯＰＤまたは喘息など）治療のための、他の治療薬は、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬物である：
−ムスカリン拮抗剤（例えば、チオトロピウム、ウメクリジニウム、グリコピロニウム、アクリジニウムおよびダラトロピウム（daratropium）、例えば臭化物塩であるこれらのいずれかのもの）；および
−ホスホジエステラーゼ阻害剤。

更に、胃腸障害（クローン病または潰瘍性大腸炎など）の治療に対しては、他の治療剤は、例えば、以下のリストから選択される一つ以上の薬剤であってもよい：
−５−アミノサリチル酸またはそのプロドラッグ（スルファサラジン、オルサラジンまたはバルサラジドなど）；
−コルチコステロイド剤（例えば、プレドニソロン、メチルプレドニゾロンまたはブデソニド）；
−免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、アザチオプリンまたは６−メルカプトプリン）；
−抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールまたはゴリムマブ）；
−抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えば、ウステキヌマブ）または低分子ＩＬ１２／ＩＬ２３阻害剤（例えば、アプリモド）；
−抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブ）；
−Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）遮断薬（例えば、ＢＬ−７０４０：アベシア社（英国ケンブリッジ））；
−ＭＡｄＣＡＭ−１遮断薬（例えば、ＰＦ−００５４７６５９）；
−細胞接着分子α４インテグリンに対する抗体（例えば、ナタリズマブ）；
−ＩＬ２受容体αサブユニットに対する抗体（例えば、ダクリズマブまたはバシリキシマブ）
−抗Ｓｍａｄ７抗体（例えば、モンジャーセン（ＧＥＤ０３０１：ａｌｌ−Ｐ− ａｍｂｏ−２'−デオキシ−Ｐ−チオグアニリル−（３'→５'）−Ｐ−チオチミジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−５−メチル−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオグアニリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−Ｐ−チオチミジリル−（３'→５'）−Ｐ−チオチミジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐチオシチジリル−（３'→５'）−Ｐ−チオチミジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−５−メチル−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐチオグアニリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオシチジリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐチオアデニリル−（３'→５'）−２'−デオキシ−Ｐ−チオグアニリル−（３'→５'）−２'−デオキシシチジン））；
−スフィンゴシン１リン酸受容体１（Ｓ１Ｐ１）モジュレーター（例えば、オザニモド（Ozanimod）（（Ｓ）−５−（３−（１−（（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−４−イル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）−２−イソプロポキシベンゾニトリル）、アミセリモド（amiselimod）（ＭＴ１３０３；２−アミノ−２−｛２−［４−（ヘプチルオキシ）−３−（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール）またはＡＰＤ３３４ （２−［７−［４−シクロペンチル−３−（トリフルオロメチル）ベンジルオキシ］−１，２，３，４−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］インドール−３（Ｒ）−イル］酢酸）；
−ＪＡＫ阻害剤（例えば、トファシチニブ、バリシチニブ（１−（エチルスルホニル）−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−３−アゼチジンアセトニトリル）、フィルゴチニブ（Ｎ−［５−［４−［（１，１−ジオキソ−１，４−チアジナン−４−イル）メチル］フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル］シクロプロパンカルボキサミド）、ペフィシチニブ（４−（（（１Ｒ，２ｒ，３Ｓ，５ｓ，７ｓ）−５−ヒドロキシアダマンタンｎ−２−イル）アミノ）−１Ｈ− ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド）またはＲ３４８（例えば、米国特許公開第２０１４／０２０６７０８号参照））；
−ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＴＡＫ−１１４：（３Ｅ）−１−メチル−３−（２− オキソ−１Ｈ−インドール−３−イリデン）インドール−２−オン）；
−受容体共役タンパク質−１（ＲＩＰ１）キナーゼ阻害剤（例えば、ＧＳＫ２９８２７７２）；
−Ｓｙｋ阻害剤およびそのプロドラッグ（例えば、ホスタマチニブおよびＲ-４０６）；
−ホスホジエステラーゼ４阻害剤（例えば、テトミラスト）；
−ＨＭＰＬ−００４；
−プロバイオティックス；
−微生物叢モジュレーター（例えば、ＳＧＭ１０１９）；
−デルサラジン；
−セマピモド／ＣＰＳＩ−２３６４；および
−タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えば、ＡＥＢ−０７１）。

胃腸障害（クローン病または潰瘍性大腸炎など）の治療のため、他の治療薬は、例えば、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬剤であってもよい：
５−アミノサリチル酸またはそのプロドラッグ（スルファサラジン、オルサラジンまたはバルサラジドなど）；
コルチコステロイド剤（例えば、プレドニソロン、メチルプレドニゾロンまたはブデソニド）；
免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、アザチオプリンまたは６−メルカプトプリン）；
抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールまたはゴリムマブ）；
抗ＩＬ１２／ＩＬ２３抗体（例えば、ウステキヌマブ）または低分子ＩＬ１２／ＩＬ２３阻害剤（例えば、アプリモド）；
抗α４β７抗体（例えば、ベドリズマブ）；
ＭＡｄＣＡＭ−１遮断薬（例えば、ＰＦ−００５４７６５９）；
細胞接着分子α４インテグリンに対する抗体（例えば、ナタリズマブ）；
ＩＬ２受容体αサブユニットに対する抗体（例えば、ダクリズマブまたはバシリキシマブ）
ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）；
Ｓｙｋ阻害剤およびそのプロドラッグ（例えば、ホスタマチニブおよびＲ-４０６）；
ホスホジエステラーゼ４阻害剤（例えば、テトミラスト）；
ＨＭＰＬ−００４；
プロバイオティックス；
デルサラジン；
セマピモド／ＣＰＳＩ−２３６４；および
タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えば、ＡＥＢ−０７１）。

眼疾患（ブドウ膜炎および乾性角結膜炎（ドライアイ）など）の治療のため、他の治療薬は、例えば、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬物であってもよい：
コルチコステロイド剤（例えばデキサメタゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンアセトニド、ジフルプレドナートまたはフルオシノロンアセトニド）；
グルココルチコイド作動薬（例えば、マプラコラト）；
免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ボクロスポリン（voclosporin）、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチルまたはタクロリムス）；
抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ＥＳＢＡ−１０５またはゴリムマブ）；
抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えば、セクキヌマブ）；
ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス）；
ＶＧＸ−１０２７
アデノシンＡ３受容体作動薬（例えば、ＣＦ−１０１）；
リフィテグラスト；
ＩＬ１遮断薬（例えば、ＥＢＩ−００５：Hou et al. PNAS 2013, 110(10), 3913-3918）；
ＲＧＮ−２５９（チモシンβ４）；
ＳＩ−６１４；
ＯＴＸ−１０１；
ＪＮＫ阻害剤（例えば、ＸＧ−１０４）；
ＭＡＰキナーゼシグナル伝達阻害剤（例えば、ＤＡ−６０３４：｛［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５−メトキシ−４−オキソクロメン−７−イル］オキシ｝酢酸）；
ムチン刺激薬（例えば、レバミピド；２−［（４−クロロベンゾイル）アミノ］−３−（２−オキソ−１Ｈ−キノリン−４−イル）プロパン酸）；
−ＭＩＭ−Ｄ３（Ｔａｖｉｌｅｒｍｉｄｅ；例えば、米国特許公開第２０１３／０３４５３９５号）；
ＪＡＫ阻害剤（例えば、トファシチニブ、バリシチニブ（１−（エチルスルホニル）−３−［４−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−３−アゼチジンアセトニトリル）、フィルゴチニブ（Ｎ−［５−［４−［（１，１−ジオキソ−１，４−チアジナン−４−イル）メチル］フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル］シクロプロパンカルボキサミド）、ペフィシチニブ（４−（（（１Ｒ，２ｒ，３Ｓ，５ｓ，７ｓ）−５−ヒドロキシアダマンタン−２−イル）アミノ）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド）またはＲ３４８（例えば、米国特許公開第２０１４／０２０６７０８号参照））；および
タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えばＡＥＢ−０７１）。

例えば、眼疾患（ブドウ膜炎および乾性角結膜炎（ドライアイ）など）の治療のための、他の治療薬は、例えば、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬物であってもよい：
コルチコステロイド剤（例えばデキサメタゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンアセトニド、ジフルプレドナートまたはフルオシノロンアセトニド）；
グルココルチコイド作動薬（例えば、マプラコラト）；
免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ボクロスポリン（voclosporin）、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチルまたはタクロリムス）；
抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ＥＳＢＡ−１０５またはゴリムマブ）；
抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えば、セクキヌマブ）；
ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス）；
ＶＧＸ−１０２７
アデノシンＡ３受容体作動薬（例えば、ＣＦ−１０１）；
リフィテグラスト；
ＪＡＫ３阻害剤（例えばトファシチニブまたはＲ３４８）；および
タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えば、ＡＥＢ−０７１）。

特定の実施形態では、眼疾患（ブドウ膜炎および乾性角結膜炎（ドライアイ）など）の治療のため、他の治療薬は、例えば、以下のものを含むリストから選択される１つ以上の薬物であってもよい：
コルチコステロイド剤（例えばデキサメタゾン、プレドニソロン、トリアムシノロンアセトニド、ジフルプレドナートまたはフルオシノロンアセトニド）；
免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、ボクロスポリン（voclosporin）、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチルまたはタクロリムス）；
抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ＥＳＢＡ−１０５またはゴリムマブ）；
抗ＩＬ−１７Ａ抗体（例えば、セクキヌマブ）；
ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス）；
ＶＧＸ−１０２７
ＪＡＫ阻害剤（例えば、トファシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ペフィシチニブまたはＲ３４８）（例えば、トファシチニブまたはＲ３４８などのＪＡＫ３阻害剤）；および
タンパク質キナーゼＣ阻害剤（例えば、ＡＥＢ−０７１）。

医療用途
本発明の化合物は、炎症性疾患に対する単剤療法またはそのような疾患に対する併用療法で用いてもよい。

従って、言及される上記態様（ｅ）〜（ｇ）の実施形態は、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体）が、治療で利用される、単一の薬学的に許容可能な成分であるものが挙げられる。

しかしながら、上記態様（ｅ）〜（ｇ）の実施形態は、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体）をは、１つ以上の他の治療薬も投与されている対象に投与する（例えば、１つ以上の他の治療薬が、上記定義した通りに組合せ製剤と関連している場合）。

「炎症性疾患」という語は、本明細書において使用するときは、具体的には、以下のいずれか１つ以上を含む：
（ｉ）嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、または、特に、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および気腫を包含する）、喘息もしくは小児喘息などの炎症性要素を有する肺疾患または障害；
（ｉｉ）アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎または乾癬などの炎症性要素を有する皮膚疾患または障害；
（ｉｉｉ）アレルギー性鼻炎、鼻炎または副鼻腔炎などの炎症性要素を有する鼻疾患または障害；
（ｉｖ）結膜炎、アレルギー性結膜炎、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を包含する）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／または滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、術後白内障炎症、または、特に、乾性角結膜炎（ドライアイ、眼球乾燥症としても公知）、ブドウ膜炎（後部、前部および全ブドウ膜炎を包含する）、角膜移植片 および角膜輪部細胞移植拒絶反応などの炎症性要素を有する眼疾患または障害；および
（ｖ）グルテン過敏性腸疾患（小児脂肪便症）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、または、特に、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎などの炎症性要素を有する消化器疾患または障害。

本明細書において、炎症性要素を有する疾患と言うのは、該疾患の他の（非炎症性）症状または結果があるかないかにかかわらず、炎症を伴う疾患を含む。
本発明のさらなる態様に従えば、以下を含む式Ｉの化合物の製造方法を提供する：
（ａ）式ＩＩの化合物と、

と式ＩＩＩの化合物との反応であって、

ここでＺ¹およびＺ²のうち１つは式ＩＶの構造フラグメントであり、
：

Ｚ¹およびＺ²のうち他方は式Ｖの構造フラグメントであり、

上記反応を、例えば、適切な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、またはその混合物などの極性非プロトン性溶媒）の存在下で、室温（例えば、１５〜３０℃）〜約１１０℃の温度など、当業者に公知の条件下でおこなう；
（ｂ）式ＩＩａの化合物と、

（式中、Ｚ¹は、上記定義した通りである）
と好適なアジド形成剤（すなわち、好適な脱離基源およびジフェニルリン酸アジドなどの好適な活性化アジドイオン；例えば、Tetrahedron 1974, 30, 2151-2157参照）とを、アミン塩基（例えば、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどの立体障害性塩基）および好適な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１,４ジオキサンまたはそれらの混合物などの極性非プロトン性溶媒）の存在下、例えば環境より低い温度〜室温（例えば、約−５〜５℃の開始温度から反応後室温まで）などの当業者に公知の条件下で反応し、次いで、例えば、室温（１５〜３０℃など）でアシルアジド中間体（式Ｚ¹−Ｃ(Ｏ)−Ｎ₃）を分離せずに熱転位反応を（例えば、加熱下で）を行って、次いで反応系中で得た式ＩＩの化合物を、上記式ＩＩＩの化合物と反応させることで、式Ｉの化合物を得る；
（ｃ）式ＩＩｂの化合物と、

（式中、ＬＧ¹は適切な脱離基（例えば、イミダゾリル、クロロ、またはフェノキシなどのアリールオキシ）であり、Ｚ¹は上記定義した通りである）
上記式ＩＩＩの化合物とを、例えば室温（例えば、室温〜８０℃）などの当業者に公知の条件下で、必要に応じて、アミン塩基（例えば、トリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどの立体障害性塩基）および好適な有機溶媒（例えば、ジクロロメタンまたは酢酸イソプロピルなどのエステルなどの非プロトン性溶媒）の存在下で、反応させる；
（ｄ）式ＶＩの化合物と

（式中、ＬＧ²は、適切な脱離基（例えば、クロロまたはブロモなどのハロ基）である）
式ＶＩＩの化合物とを

とを、例えば高温（例えば、５０〜１１０℃）などの当業者に公知の条件下（例えば、 J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 15686-15696に記載のような）で、適切な有機溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ、１，４−ジオキサン、またはその混合物などの極性非プロトン性溶媒）および必要に応じて酸触媒（例えば、パラトルエンスルホン酸などのスルホン酸）の存在下で反応させる；
（ｅ）保護誘導体が式Ｉの化合物のＯ原子またはＮ原子上に保護基を有する場合（疑義を避けるために明記すると、式Ｉの１つの化合物の保護誘導体は、式Ｉの別の化合物であってもなくてもよい）、当業者に公知の条件下で、式Ｉの化合物の保護誘導体の脱保護を行う；
式Ｉの化合物の保護誘導体の例としては以下のものが挙げられる：
−Ｏ原子がベンジル基で保護されており、このベンジル基は、例えばパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃなど）の存在下で、水素化により除去され得るもの；
−カルボン酸のＯ原子がアルキル基（メチル、エチルまたはｔｅｒｔ−ブチル）で保護されており、このアルキル基は塩基加水分解（例えば、メチルまたはエチル基については、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を用いた加水分解反応）、または酸加水分解（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルについては、トリフルオロ酢酸などの酸を用いた加水分解反応）により除去し得るもの。

式Ｉの化合物の保護誘導体としては式ＶＩＩａの化合物

（式中、Ｑ^xは−Ｃ（Ｏ）ＯＲ^4'であり、Ｒ^4'はＣ₁〜₄アルキル基（例えば、Ｃ₄アルキル基またはメチルなどのＣ₁〜₃アルキル基）である）
も挙げられる。

式ＩＩの化合物は、当業者に公知の方法に従って、またはそれに類似した方法によって、例えば、上記定義した式ＩＩａの化合物とアジド形成剤とを反応させ、次いで、アシルアジド中間体を転位反応（上記（ｂ）に記載したように；例えば、Tetrahedron 1974, 30, 2151-2157参照）させることによって製造し得る。

式ＩＩｂの化合物は、例えば当業者に公知の条件下で、式ＶＩＩＩの化合物と、

（式中、ＬＧ¹は、上記定義の通りである）
と式ＩＸの化合物とを

（式中、Ｚ¹は上記定義の通りである）
と反応して製造することができる。
式ＩＸのアミンは、上記（ｂ）に記載の経路により、式ＩＩａのカルボン酸から製造することができ、イソシアネート中間体ＩＩが水で加水分解されて得られたカルバミン酸は二酸化炭素を失うことでＩＸを生じる。同様に、イソシアネート中間体ＩＩを、ｔ-ブタノールなどのアルコールと反応させて、保護型のＩＸを生成させることができる。

Ｚ²が式Ｖの構造フラグメントである式ＩＩＩの化合物、またはＺ¹が式Ｖの構造フラグメントである式ＩＸの化合物は、スキーム１で概説した経路を用いて合成してもよく（例えば：国際公開第２００３／０７２５６９号；および国際公開第２００８／０４６２１６号参照）、式中、ＬＧ³およびＬＧ⁴は脱離基、例えば、ハロゲンまたはメタンスルホニルであり、ＦＧは実際のまたは潜在的なＮＨ₂基、すなわち、ニトロまたは保護されたバリアントであるＮＨ−ＰＧ²などの、ＮＨ₂基に容易に転移する基であり、ＰＧ²は典型的な保護基（例えば：Greene, T. W.； Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis； Wiley, 4th revised edition, 2006； ISBN-10: 0471697540参照）、例えばカルバミン酸エステルまたはカルボキサミドである。一連の反応は、エーテルＸＩＩを得るためにＸを塩基で処理したときに生成したアロキシドによって、ＸＩのＬＧ³を塩基によりＳ_NＡｒ置換することから開始する。それから、エーテルＸＩＩに残ったハロゲンまたはメタンスルホニル置換基（ＬＧ⁴）が、（ｉ）第二のＳ_NＡｒ反応において式ＶＩＩのアミンにより、または（ｉｉ）バックワルド（Ｂｕｃｈｗａｌｄ）カップリング反応（例えば、国際公開第２００９／０１７８３８号参照）により式ＶＩＩのアミンと、置換することで、所望の化合物（ＦＧがＮＨ₂である場合）またはＸＩＩＩ（ＦＧがニトロまたはＮＨ−ＰＧ²である場合）を得る。ＦＧがＸＩＩＩのニトロ基である場合には、典型的には好適な触媒、例えば、パラジウム炭素を用いるか、または、氷酢酸中の鉄などの金属溶解条件を用いる、水素化によりおこなわれる還元反応により、ＮＨ₂基とすることができる。あるいは、ＦＧが保護基である場合には、脱保護反応によってＮＨ₂基とすることができる。この一連の反応の最終工程で起きた場合だけを示しているが、ＦＧで表される潜在的なＮＨ₂基の脱マスキングは、スキーム１に示した合成経路のいずれの段階でも行い得ることに留意されたい。

スキーム１

同様にして、Ｚ¹が式ＩＶの構造フラグメントである式ＩＸのアミンは、式ＸＩＩＩａの化合物における潜在的なＮＨ₂基を実在のＮＨ₂基へ転換することにより合成してもよい。

（式中、ＦＧ'は、ＮＨ₂でないことを除いて上記ＦＧの定義通りである）
式ＶＩの化合物は、式Ｉの化合物と同様に合成してもよい（例えば、選択肢として上記方法（ａ）〜（ｃ）参照）。例えば、式ＶＩの化合物は、式ＩＩｘの化合物と式ＩＩＩｘの化合物とを反応させることにより製造でき、式ＩＩｘおよびＩＩＩｘの化合物は、Ｚ¹およびＺ²のうち１つが上記定義した式ＩＶの構造フラグメントであり、かつ、Ｚ¹およびＺ²の他方が式Ｖａの構造フラグメントであることを除いて、式ＩＩおよびＩＩＩの化合物と同様に定義される。

式ＶＩＩａの化合物は、式Ｉの化合物の製造のための本明細書に記載と類似の方法により製造することができる（例えば、方法（ａ）および上記スキーム１参照）。
例えば、−ＣＯ₂Ｈ基を以下におけるＱ^xで置換してもよい：
−式Ｖの構造フラグメント（式Ｖｐの構造フラグメント、および式ＩＩｐ、ＩＩａｐ、ＩＩｂｐおよびＩＩＩｐの対応する化合物を得るためのものであって、Ｚ¹およびＺ²をそれぞれＺ^1pおよびＺ^2pで置換されており、ここで、Ｚ^1pおよびＺ^2pのうち１つが上記式ＩＶの構造フラグメントであり、Ｚ^1pおよびＺ^2pの他方が式Ｖｐの構造フラグメントである）；または
−式ＶＩＩの化合物（式ＶＩＩｐの化合物を得るための）。

あるいは、式ＶＩＩａの化合物を式ＸＩＩＩｂの化合物

（式中、ＦＧおよびＱ^xは上記定義の通りである）
において、ＦＧ基をＮＨ₂に転換し（例えば、スキーム１に関連して上述したようにＦＧをＮＨ₂に転換することにより）、次いで、例えば、式ＩＩｂの化合物（式中、Ｚ¹は式ＩＶの構造フラグメントである）と反応することにより製造することができる。

式ＩＩ、ＩＩｘおよびＩＩｂで表される化合物が通常反応中間体であることは、当業者であれば理解できる。これらの中間体は、反応系内で生成させることができ、分離せずに式ＩＩＩの化合物と直接反応させることで式Ｉの化合物を得ることができる。さらに、上記工程をおこなう間、適切な保護基を使用することが、化学的に感受性のある官能基、例えば、ヒドロキシル基またはアミノ官能基を有する、Ｚ¹およびＺ²基のいずれかにとって必要とされるだろうということは当業者であれば理解することができる。

スキーム中で例証した化合物の多くは、市販品から入手するか、引用した方法を用いて取得するか、または、当業者による従来行われてきた法によって容易に製造することができる。例えば、Regan, J. et al.; J. Med. Chem. 2003, 46, 4676-4686、国際公開第２０００／０４３３８４号、国際公開第２００７／０５３３４６号、国際公開第２００７／０８７４４８号、国際公開第２００７／０８９５１２号、国際公開第２００９／１１７０８０号および国際公開第２０１４／０２７２０９号を参照のこと。

本明細書に記載の新規中間体は本発明の態様を形成する。この態様では、本発明のさらなる態様は以下のものに関する：
（ｉ）式中、Ｚ¹が式Ｖの構造フラグメントである上記定義の式ＩＩ、ＩＩａもしくはＩＩｂの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体；
（ｉｉ）式中、Ｚ²が式Ｖの構造フラグメントである上記定義の式ＩＩＩの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体；
（ｉｉｉ）上記定義の式ＶＩＩａの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体；および
（ｖ）上記定義の式ＸＩＩＩもしくはＸＩＩＩｂの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体。

式ＩＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＩＩｂの化合物の保護誘導体としては、重要なＮＨ₂基（またはＦＧで表されたＮＨ₂）が保護されているものが挙げられる。この点では、このような保護誘導体としては、アミドまたは特にこれらの化合物のカルバメートが挙げられる。例えば、これらの保護誘導体としては、ＮＨ₂基のＨ原子が以下のものに置換されている化合物が挙げられる：
Ｒ'−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ'はＨ、Ｃ₁〜₈アルキル、フェニルまたはベンジルであり、これらフェニルまたはベンジルは必要に応じてハロ、ヒドロキシ、メチルおよびメトキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよい）；または
Ｒ''−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ''はｔｅｒｔ−ブチル、フェニル、ベンジルまたはフルオレニルであり、これらフェニル、ベンジルまたはフルオレニルは必要に応じてハロ、ヒドロキシ、メチルおよびメトキシから選択される１つ以上の基で置換されていてもよい）。

式中、Ｒ⁴が−ＣＯ₂Ｈである式ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩ、ＶＩＩおよびＸＩＩＩの化合物の保護誘導体としては、さらに（またはあるいは）カルボキシル部分が保護されているものが挙げられる。この点では、このような保護誘導体としては、このような化合物のエステル（例えば、エチルまたは特にメチルエステルなどのＣ₁〜₈アルキルエステル）が挙げられる。

式中、Ｚ²が式Ｖの構造フラグメントである式ＩＩＩの化合物を、重要なＮＨ₂基および／またはＲ⁴が−ＣＯ₂Ｈである場合にはそのカルボキシル部分において保護され得ることを当業者は認識することができる。この点では、例えば、Ｚ²が言及される式Ｖの構造フラグメントである式ＩＩＩの化合物の特定の保護誘導体としては以下のものが挙げられる：
４−（（４−（（４−アミノナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル；および
４−（（４−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル。

４−（（４−（（４−アミノナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチルおよび４−（（４−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチルは、共に式ＸＩＩＩｂ（式中、Ｑ^xは−ＣＯ₂ＣＨ₃であり、それぞれ、ＦＧはＮＨ₂またはＮＨ−ＰＧ²であり、ＰＧ²はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルである）の化合物でもある。

本発明の他の実施形態は以下のいずれかである化合物に関する：
（ｉ）式中、Ｚ²が式Ｖの構造断片である式ＩＩＩの化合物の保護誘導体；または
（ｉｉ）式ＸＩＩＩｂの化合物、またはその保護誘導体、
但し、前記化合物は以下のものではない：
４−（（４−（（４−アミノナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル；または
４−（（４−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル。

本発明のまたさらなる実施形態は、上記定義の式ＶＩＩａの化合物に関し、但し、前記化合物は以下のいずれかである：
（ａ）以下のものである；または
（ｂ）以下のものでない
４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル。

本明細書に記載の本発明の態様（例えば、上記化合物、組合せ、方法および使用）は、本明細書に記載の症状の治療において、これらの症状またはその他の治療用途の先行技術において公知の類似化合物、組合せ、方法（治療）または使用よりも、医師および／または患者にとって、より簡便であり、より有効であり、より毒性が少なく、より良好な選択性を有し、より広範な活性を有し、より強力であり、より副作用が少なく、より良好な薬物動態学的および／または薬力学的特性を有し、より好適な固体形態を有し、より良好長期安定性を有し、または他の有用な薬理学的特性を有し得る。

本発明の化合物は、さらに（または代わりに）；
−長期間作用性および／または作用持続性を示すことができる（例えば、ＢＩＲＢ７９６などの以前開示された他のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して）；
−Ｓｙｋの強力な阻害を示すことができる（Ｓｙｋに対するＩＣ₅₀が、５００ｎＭ以下（例えば、３５０ｎＭ以下）を示し得る）；
−ＧＳＫ３αを強く阻害しない（ＧＳＫ３αに対するＩＣ₅₀が１，０００ｎＭ以上（例えば、１，５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００ｎＭ以上）を示し得る）；
−キノームのより小さな部位を標的とする、すなわち、ＫｉｎｏｍｅＳｃａｎ選択性スコア低下が示すように、改善された選択性を有する；
−投与間の比較的高い局所薬物濃度を維持することができる（例えば、ＢＩＲＢ７９６などの以前開示された他のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して高い局所濃度）；
−局所的／局部的投与に特に適した特性（例えば、局所的／局部的投与後において、式Ｉの化合物の標的組織濃度が高く、血漿における濃度が低く、および／または、例えば、高い腎臓または肝臓による除去の結果、血漿から式Ｉの化合物が急速に除去される）を示すことができる；
−細胞内有糸分裂において、β−カテニン誘導および／または阻害をほとんどまたは全く示さない；
−インビトロ小核試験において、ヒトリンパ球における、小核を含む二核細胞が増加しない；
−チトクロームＰ４５０スーパーファミリーのメンバーについて、時間依存的な阻害をほとんどまたは全く示さない；
−例えば、ＢＩＲＢ７９６などの以前開示されたｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と比較して、水の存在下で、化学的安定性の改善を示す（例えば、高温における水性混合物中での加水分解に対する安定性）；
−患者に投与後に生じる代謝産物が、安全性（例えば、毒性）に対する懸念をほとんどまたは全く伴わない；
−前臨床における動物種およびヒトの両方において、局所投与後の、眼への刺激性または毒性の低減が示される；
−良好な水溶性および／または細胞透過性を示す；
−少量の可溶化賦形剤を用いて、ｐＨ７〜８の範囲の水性液剤により容易に配合できる；
−高い結晶化度を有する；および／または
−固体において、ほとんどまたは全く吸湿性を示さない。

実験方法
基本手順
全ての出発物質および溶媒を商業的供給源から得たか、または文献引用に従って製造した。特に明記しない限り、全ての反応は撹拌した。有機溶液を、無水硫酸マグネシウムでルーチン的に乾燥した。明記した条件下または水素バルーン下で、ターレスＨ−Ｃｕｂｅフローリアクターにより水素化を行った。ＣＥＭ ＤｉｓｃｏｖｅｒおよびＳｍｉｔｈｃｒｅａｔｏｒマイクロ波反応器内で、可変出力のマイクロ波照射を用いて一定温度まで加熱してマイクロ波反応を行った。

プレパックシリカ(２３０〜４００メッシュ、４０〜６３μｍ)カートリッジを用いたＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ＣｏｍｐａｎｉｏｎまたはＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ ＲＦシステムなどの自動フラッシュクロマトグラフィシステムでルーチン的に順相カラムクロマトグラフィーを行った。ＳＣＸをスペルコから購入し、使用前に１Ｍの塩酸で処理した。特に明記しない限り、精製される反応混合物を、最初にＭｅＯＨで希釈し、数滴のＡｃＯＨによって酸性にした。この溶液を直接ＳＣＸ上に投入し、ＭｅＯＨで洗浄した。それから、所望の材料を１％のＮＨ₃のＭｅＯＨ溶液を用いた洗浄によって溶出した。
分析方法
ウォーターズ社Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍカラムを用いて０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液のグラジエントで溶離、またはウォーターズ社Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮのグラジエントで溶離してＨＰＬＣ分析を行った。溶出ピークのＵＶスペクトルを、アジレント社１１００システムのダイオードアレイまたは可変波長検出器のいずれかを用いて測定した。

ウォーターズ社Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍカラムを用いて０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液のグラジエントで溶離、またはウォーターズ社Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍのカラムを用いて１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮのグラジエントで溶離してＬＣＭＳ分析を行った。溶出ピークのＵＶおよび質量スペクトルを、アジレント社１２００またはポジティブおよびネガティブイオンエレクトロスプレーを備えた６１２０シングル四重極質量分析計を備えたアジレント社Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２６０ＬＣＭＳのいずれかの可変波長検出器を用いて測定した。

ウォーターズ社Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍカラムを用いて０．１％ギ酸水溶液中の０．１％ギ酸ＭｅＣＮ溶液のグラジエントで溶離、またはウォーターズ社Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、５μｍ、１９×５０ｍｍのカラムを用いて１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液中のＭｅＣＮのグラジエントで溶離して分取ＨＰＬＣを行った。Ｇｉｌｓｏｎ２１５分取ＨＰＬＣまたはＶａｒｉａｎ ＰｒｅｐＳｔａｒ分取ＨＰＬＣの可変波長検出器により測定される単一波長のＵＶ、またはポジティブおよびネガティブイオンエレクトロスプレーを備えたＺＱシングル四重極質量分析計、およびウォーターズ社ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ ＬＣＭＳの二波長検出器により測定される質量および単一波長のＵＶによる検出後、フラクションを集めた。

¹Ｈ ＮＭＲ分光測定：ブルカー社ＡｖａｎｃｅＩＩＩ分光計を用いて４００ＭＨｚで、¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た。クロロホルム−ｄ、ジメチルスルホキシド−ｄ₆の中心ピークまたはトリメチルシラン内部標準のいずれかを参照として用いた。

本発明の化合物の製造
実施例１
４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸

（ｉ）ｔｅｒｔ-ブチル(４-((２-クロロピリジン-４-イル)オキシ)ナフタレン-１-イル)カルバメート
方法１
ｔ−ＢｕＯＨ(１０ｍＬ)中の４−（（２−クロロピリジン−４−イル）オキシ）ナフタレン−１−アミン （例えば、Ｉｔｏ，Ｋら．，国際公開第２０１０／１１２９３６号、２０１０年１０月７日参照;１０００ｍｇ、３．６９ｍｍｏｌ)および重炭酸ジ-ｔｅｒｔ-ブチル(７５０ｍｇ、３．４４ｍｍｏｌ)の混合物を還流下１８時間撹拌した。混合物を水(１５ｍＬ)で希釈し、ろ過により固体を集めた。固体をジエチルエーテル中で粉砕し、副題の化合物(１００２ｍｇ)を淡灰色固体として得た。
¹H NMR (DMSO-d6) 400 MHz, δ: 9.37 (s, 1H), 8.28 (d, 1H), 8.16 (d, 1H), 8.82 (dd, 1H), 7.66 (d, 1H), 7.66-7.54 (m, 2H), 7.40 (d, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.91 (dd, 1H), 1.52 (s, 9H).
LCMS m/z 371 (M+H)⁺ (ES⁺); 369 (M-H)^- (ES^-)
方法２
２−クロロ−４−フルオロピリジン（３３ｍＬ、３６５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６００ｍＬ）中のｔｅｒｔ-ブチル(４-ヒドロキシナフタレン-１-イル)カルバメート（８５ｇ、３２８ｍｍｏｌ）とＣｓ₂ＣＯ₃（１３９ｇ、４２６ｍｍｏｌ）の混合物に添加し、室温で２４時間撹拌した。水（１Ｌ）を添加し、混合物を１時間撹拌し、それから、沈殿物をろ過で取り出した。反応をさらに８５ｇスケールのナフトールで繰り返した。合わせたリンデン物を水（２Ｌ）、エーテル（４×４００ｍＬ）で洗浄し、７０℃、７２時間真空下で乾燥して、明灰色固体の副題の化合物（２０１．６ｇ）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.38 (s, 1H), 8.28 (d, 1H), 8.16 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.67-7.56 (m, 3H), 7.40 (d, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.92 (dd, 1H), 1.52 (s, 9H).
LCMS m/z 371 (M+H)⁺ (ES⁺); 369 (M-H)^- (ES^-)。

（ｉｉ）４−（（４−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル
方法１
１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）中の上記工程（ｉ）の生成物の懸濁物（２．０ｇ、５．３９ｍｍｏｌ）、４−アミノ−２−メトキシ安息香酸メチル（１．０ｇ、５．５２ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（３００ｍｇ、０．４８２ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（３．５ｇ、１０．７４ｍｍｏｌ）を窒素で１０分間脱気した。Ｐｄ₂ｄｂａ₃(２００ｍｇ、０．２１８ｍｍｏｌ)を添加し、混合物を９０℃で一夜加熱した。この混合物をジエチルエーテル(６０ｍＬ)で希釈してろ過した。それから、ろ液を水（２×１００ｍＬ）、および飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥(ＭｇＳＯ₄)し、ろ過し、減圧下で濃縮して、赤色泡状物の粗生成物を得た。この粗生成物を、Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ(８０ｇカラム、２０〜５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)クロマトグラフィーにより精製して、黄色泡状物の副題の化合物(２．３４ｇ)を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.38 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.14 (d, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.54-7.66 (m, 5H), 7.37 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 6.69 (dd, 1H), 6.15 (d, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 1.53 (s, 9H).
LCMS m/z 516 (M+H)⁺ (ES⁺)。

方法２
ＤＭＦ（３００ｍＬ）中の４−アミノ−２−メトキシ安息香酸メチル（１０．８ｇ、５９．６ｍｍｏｌ）、上記工程（ｉ）の生成物（２０．０９ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１５ｇ、１０９ｍｍｏｌ）を１０分間Ｎ₂で脱気した。ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ Ｇ３触媒前駆体（１ｇ、１．１０３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８５℃で３時間加熱した。この混合物を冷却し、それから、ＤＣＭ(５００ｍＬ)と水(８００ｍＬ)で分配した。有機層を水(５００ｍＬ)で洗浄し、乾燥 (ＭｇＳＯ₄)し、ろ過して、減圧下で蒸発させた。残渣を、エーテルで粉砕し、ろ過し、乾燥して、灰色固体の副題の化合物(２１．７ｇ)を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.38 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.14 (d, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.54-7.66 (m, 5H), 7.38 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 6.69 (dd, 1H), 6.14 (d, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 1.53 (s, 9H).
LCMS m/z 516 (M+H)⁺ (ES⁺)。

（ｉｉｉ）４−（（４−（（４−アミノナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル
ＴＦＡ（７ｍＬ、９１ｍｍｏｌ）を上記工程（ｉｉ）の生成物（２．３４ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）ＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液に添加し、反応物を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液(１００ｍＬ)とＤＣＭ(６０ｍＬ)で分配した。有機分を分離し、乾燥(ＭｇＳＯ₄)し、ろ過し、溶媒を蒸発させて、淡褐色泡状物の副題の化合物(１.５ｇ)を得た。
LCMS m/z 416 (M+H)⁺ (ES⁺)。

（ｉｖ）フェニル（５−（ｔｅｒｔ-ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）カルバメート
クロロギ酸フェニル（０．７５０ｍＬ、５．９８ｍｍｏｌ）をＮ−（３−アミノ−５−（ｔｅｒｔ-ブチル)−２−メトキシフェニル)メタンスルホンアミド（例えば、Ｃｉｒｉｌｌｏ，Ｐ．Ｆ．ら、国際公開第２００２/０８３６２８号、２００２年１０月２４日参照；１．５ｇ、５．５１ｍｍｏｌ) とＮａＨＣＯ₃（１．０ｇ、１１．９０ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（１５ｍＬ）とＤＣＭ（１５ｍＬ）との撹拌溶液に添加し、混合物を２時間撹拌した。この混合物を水（２０ｍＬ）で洗浄し、有機相を分離して、乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、ろ過し、蒸発させて褐色泡状物を得て、これをシクロヘキサン（２０ｍＬ）中で撹拌して、無色固体の副題化合物（２．０５ｇ）を得た。
LCMS m/z 393 (M+H)⁺ (ES⁺); 391 (M-H)^- (ES^-)。

（ｖ）４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル
方法１
トリエチルアミン（２０μＬ、０．１４３ｍｍｏｌ）を上記工程（ｉｖ）の生成物（３００ｍｇ、０．７６４ｍｍｏｌ）と上記工（ｉｉ）の生成物（３００ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）とのｉＰｒＯＡｃ（１５ｍＬ）溶液に６５℃（ブロック温度）で添加し、混合物を一夜撹拌した。反応物を室温に冷却し、真空で濃縮して、淡褐色泡状物を得た。この泡状物を２時間、Ｅｔ₂Ｏ（１０ｍＬ）中にスラリーにして得られた固体をろ過により集め、さらに一部のＥｔ₂Ｏで洗浄して、淡桃色固体の副題化合物（４３３ｍｇ）を得た。
LCMS m/z 358 (M+2H)²⁺ (ES⁺)。

方法２
トリエチルアミン（６００μＬ、４．３０ｍｍｏｌ）を上記工程（ｉｖ）の生成物（９．０ｇ、２２．９３ｍｍｏｌ）と上記工（ｉｉｉ）の生成物（９．０ｇ、２１．６６ｍｍｏｌ）とのｉＰｒＯＡｃ（３００ｍＬ）溶液に６５℃（ブロック温度）で添加し、混合物を２４時間撹拌した。反応物を室温に冷却し、真空で濃縮して、褐色泡状物を得た。粗生成物を、Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ(３３０gカラム、１〜５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)クロマトグラフィーにより精製して、淡桃色固体の副題の化合物(１３．２ｇ)を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.40 (s, 1H), 9.35 (s, 1H), 916 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.17-8.20 (m, 2H), 8.13 (d, 1H), 7.87 (d, 1H), 7.69-7.73 (m, 1H), 7.60-7.63 (m, 2H), 7.53 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.24 (dd, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.69 (dd, 1H), 6.17 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 1.27 (s, 9H).
LCMS m/z 714 (M+H)⁺ (ES⁺)。

（ｖｉ）４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸
方法１
水（３ｍＬ）中の水酸化リチウム一水和物（２５ｍｇ、０．５９６ｍｍｏｌ）水溶液をＴＨＦ（２ｍＬ）とメタノール（１ｍＬ）中の上記工程（ｖ）の生成物（４３３ｍｇ、０．５４０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を一夜撹拌した。水酸化リチウム一水和物（２５ｍｇ、０．５９６ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに３日間続けた。この混合物を減圧下濃縮して、ＴＨＦおよびメタノールを除去し、それから、水（２５ｍＬ）で希釈した。クエン酸一水和物（２５０ｍｇ、１．１９０ｍｍｏｌ）水（５ｍＬ）溶液を添加して得られた沈殿物をろ過により集めて淡桃色固体の表題の化合物（３６０ｍｇ）を得た。
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (br s, 1H), 9.39 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.30 (d, 1H), 8.19 (d, 1H), 8.18 (d, 1H), 8.12 (d, 1H), 7.87 (d, 1H), 7.71 (ddd, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.61 (ddd, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.22 (dd, 1H), 7.02 (d, 1H), 6.68 (dd, 1H), 6.16 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 1.27 (s, 9H). 純度90%
LCMS m/z 700 (M+H)⁺ (ES⁺)。

方法２
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の上記工程（ｖ）の生成物（３３．４ｇ、４５．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＯＨ（６Ｍ水溶液）（８５．０ｍＬ、５１０ｍｍｏｌ）を添加した。ＭｅＯＨ(６０ｍｌ)を添加し、２８時間撹拌を続けた。反応物を真空で濃縮して、黄色固体を得た。この物質を水（２００ｍＬ）中に懸濁し、６ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）で酸性にして、白色固体を沈殿させた。この固体をろ過により集めて、水で洗浄した。得られた固体を１時間フリット上で乾燥し、それから、真空下４０℃で乾燥して、白色固体の表題の化合物を塩酸塩として得た。
¹H NMR (塩酸塩; 400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.80 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.37 (d, 1H), 8.13-8.18 (m, 3H), 7.86 (d, 1H), 7.70-7.74 (m, 1H), 7.62-7.66 (m, 2H), 7.44 (d, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.10 (d, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.26 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 1.27 (s, 9H).
LCMS m/z 700 (M+H)⁺ (ES⁺)。

この塩酸塩を２．０ｇのまとまりで投入し、ＴＨＦ中に溶解し、ＳＣＸ樹脂のプレコンディショニングしたカートリッジ（樹脂２０ｇ、ＭｅＣＮ中でコンディショニング）上に投入した。この樹脂をＭｅＣＮで洗浄し、それから、この生成物を１％ＮＨ₃のＭｅＯＨ溶液中に入れた。このＮＨ₃フラクションを併せて、真空で濃縮して、淡桃色固体の化合物（３０ｇ）を遊離酸として得た。
¹H NMR (遊離酸; 400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.56 (s, 1H), 9.28 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.34 (d, 1H), 8.16-8.17 (m, 2H), 8.11 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.69-7.71 (m, 1H), 7.57-7.63 (m, 2H), 7.48 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.21 (dd, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.66 (dd, 1H), 6.16 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.09 (s, 3H), 1.27 (s, 9H).
LCMS m/z 700 (M+H)⁺ (ES⁺)。

この遊離酸（１．０ｇ、１．３８６ｍｍｏｌ）を水（２５ｍＬ）中のＮａＯＨ（０．０５７ｇ、１．４１４ｍｍｏｌ）水溶液中で懸濁した。ＭｅＯＨ（５ｍＬ）を添加し、混合物を均一になるまで撹拌した。得られた溶液をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で希釈し、真空で濃縮して、淡灰色固体を得た。この物質をＭｅＣＮ（５ｍＬ）中で懸濁し、これに水（０．５ｍＬ）を添加し、懸濁液を週末にわたって撹拌した。この懸濁液をろ過して、得られた固体をＭｅＣＮ（２×３ｍＬ）で洗浄し、真空下５０℃で乾燥して、白色固体の表題化合物をナトリウム塩（９４０ｍｇ）として得た。
¹H NMR (ナトリウム塩; 400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.68 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.35 (d, 1H), 8.08-8.13 (m, 2H), 8.02 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.64-7.68 (m, 1H), 7.57-7.61 (m, 1H), 7.37-7.43 (m, 2H), 7.30 (s, 1H), 7.11 (dd, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.61 (dd, 1H), 6.12 (d, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.96 (s, 3H), 1.25 (s, 9H).
LCMS m/z 700 (M+H)⁺ (ES⁺)。

生物学的試験実験方法
酵素結合アッセイ（Ｋｉｎｏｍｅｓｃａｎ）
本明細書で開示される化合物のキナーゼ酵素結合活性を、固定されたリガンドに対する活性部位特異的な競合的結合を測定する独占所有権のあるアッセイを使用して決定した（Fabian, M.A.et al., Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336)。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社（旧Ａｍｂｉｔ社；米国カリフォルニア州サンディエゴ）によりこれらのアッセイを行うことができる。試験化合物とのインキュベーションにより得られる阻害率は、非阻害のコントロールに対して相対的に算出することができる。

酵素阻害アッセイ
本明細書で開示される化合物の酵素阻害活性は、ドナー蛍光体およびアクセプター蛍光体（Ｚ−ＬＹＴＥ、インビトロジェン社、英国ペイズリー）により標識化された合成ペプチドを用いてＦＲＥＴにより決定される。

ｐ３８ＭＡＰＫα酵素阻害
以下の２種類のアッセイが、ｐ３８ＭＡＰＫα阻害を測定するために用いられる。
方法１
ｐ３８ＭＡＰＫαアイソフォーム（ＭＡＰＫ１４：インビトロジェン）に対する試験化合物の阻害活性を、下流分子であるＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２の活性化／リン酸化レベルを決定することにより間接的に評価する。ｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質（８０ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）を、試験化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬのいずれかを、２．５μＬ）と室温において２時間混合する。それから、ｐ３８α不活性標的ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２（インビトロジェン、６００ｎｇ／ｍＬ）およびＦＲＥＴペプチド（８μＭ；ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２のリン酸化標的）の混合溶液（２．５μＬ）を添加し、次いで、ＡＴＰ（４０μＭ、２．５μＬ）の添加によりキナーゼ反応を開始する。この混合物を室温で１時間インキュベートする。蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）による検出の１時間前に、発色試薬（プロテアーゼ、５μＬ）を添加する。

方法２
この方法は、上記の方法１と同じ工程に従うが、より高濃度のｐ３８ＭＡＰＫαタンパク質（タンパク質８０ｎｇ／ｍＬの代わりに２００ｎｇ／ｍＬのタンパク質の２．５μＬ）を試験化合物と混合するために用いる（１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬまたは０．００１μｇ／ｍＬのいずれかで試験した)。

ｐ３８ＭＡＰＫγ酵素阻害
ｐ３８ＭＡＰＫγ（ＭＡＰＫ１２：インビトロジェン）に対する本発明の化合物の阻害活性を、本明細書で上記方法と同様に評価する。酵素（８００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）を、試験化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬいずれかを２．５μＬ）と室温において２時間インキュベートする。それから、ＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）および適切なＡＴＰ溶液（２．５μＬ、４００μＭ）を酵素／化合物の混合物に添加して、この全部を１時間インキュベートする。蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）による検出の１時間前に発色試薬（プロテアーゼ、５μＬ）を添加する。

ｃ−ＳｒｃおよびＳｙｋ酵素阻害
ｃ−ＳｒｃおよびＳｙｋ酵素（インビトロジェン）に対する本発明の化合物の阻害活性を、本明細書で上記記載のものと同様に評価する。関連する酵素（それぞれ３０００ｎｇ／ｍＬまたは２０００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）を、試験化合物（１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬまたは０．００１μｇ／ｍＬのいずれかを、２．５μＬ）と室温において２時間インキュベートする。それから、ＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）および適切なＡＴＰ溶液（ｃ−Ｓｒｃについては２．５μＬ、８００μＭ、およびＳｙｋについては６０μＭのＡＴＰ）を酵素／化合物混合物に添加し、混合物を１時間インキュベートする。蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）による検出の１時間前に発色試薬（プロテアーゼ、５μＬ）を添加する。

ＧＳＫ３α酵素阻害
以下の２種類のアッセイを、ＧＳＫ３α阻害を測定するために用いられる。
方法１
ＧＳＫ３α酵素アイソフォーム（インビトロジェン）に対する本発明の化合物の阻害活性を、標的ペプチドの活性化／リン酸化のレベルを決定することにより評価する。ＧＳＫ３−αタンパク質（５００ｎｇ／ｍＬ、２．５μＬ）を、試験化合物（４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬまたは０．００４μｇ／ｍＬのいずれかを２．５μＬ）と室温において２時間混合する。それから、ＧＳＫ３αのリン酸化標的であるＦＲＥＴペプチド（８μＭ、２．５μＬ）とＡＴＰ（４０μＭ、２．５μＬ）を、酵素／化合物の混合物に添加し、得られた混合物を１時間インキュベートする。蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）による検出の１時間前に発色試薬（プロテアーゼ、５μＬ）を添加する。

いかなる場合でも、部位特異的プロテアーゼは、非リン酸化ペプチドのみを切断して、ＦＲＥＴシグナルを除去する。各反応のリン酸化レベルは、フルオレセイン発光（アクセプター）に対するクマリン発光（ドナー）の比を用いて算出されるので、高い比は高いリン酸化レベルを示し、低い比は低いリン酸化レベルを示す。各反応の阻害率を、非阻害コントロールに対して相対的に算出し、それから、濃度−反応曲線から５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀値）を算出する。

方法２
この方法は上記方法１と同じ工程に従うが、ＧＳＫ３−αタンパク質と試験化合物との混合をより短い時間（２時間の代わりに１０５分）で行う。加えて、使用する試験化合物濃度は、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬまたは０．０１μｇ／ｍＬである。

細胞アッセイ
本発明の化合物を、１つ以上の以下のアッセイを用いて試験した。
（ａ）ジャーカット細胞内のｐ３８ＭＡＰＫαおよびＬｃｋの阻害
実験前に２４時間、飢餓培地（ＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＢＳ）中でジャーカットＴ細胞を培養した。細胞を回収し、飢餓培地中に１０×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁し、それから、丸底９６ウェルプレート中に１ウェル当たり１×１０⁶個の細胞を播種した。刺激前２時間において試験化合物の一連の希釈物を添加した（ＤＭＳＯ終濃度１％）。化合物をプレインキュベーションした後、５分間、Ｈ₂Ｏ₂（終濃度０．０５％）で細胞を刺激した。２０００ｒｐｍ（３分間、４℃）で遠心分離することにより反応を停止し、それから、上清を除去し、１００μＬの冷たいｆｉｘ／ｐｅｒｍ液（ＢＤ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット＃５５４７１４）を添加した。遠心分離および供給されている１×洗浄用メディウム（ＢＤ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット＃５５４７１４）での洗浄前に、プレートを４℃で２０分間インキュベートした。セル・シグナリング・テクノロジー社より供給される（９２１１ｓ）phospho-ｐ３８α（Ｔ１８０／１８２）、またはＲ＆Ｄ（ＭＡＢ７５００）から供給されるphospho-Ｌｃｋ（Ｙ３９４）について細胞を染色した。暗所において、４℃で１時間インキュベートする前に、洗浄用メディウムで、５μｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ）、または１：２００（セル・シグナリング・テクノロジー社）に抗体を希釈した。氷冷した洗浄バッファーで３回洗浄を繰り返した後、二次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ ＃Ｆ１３６２、または抗マウスＦＩＴＣ ＃Ｆ２８８３、ともにシグマ社から）を１：１０００の希釈率で添加し、暗所において、４℃で１時間インキュベートした。細胞を冷した洗浄バッファー中で３回洗浄し、それから、冷したＰＢＳ緩衝液中で最終洗浄後、１５０μＬの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６を用いたフローサイトメトリーにより細胞を分析した。

（ａａ）ｄ−Ｕ９３７細胞内のＬＰＳ誘導性ＴＮＦα／ＩＬ−８の放出
ヒト単球細胞株であるＵ９３７細胞は、４８〜７２時間、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ；１００ｎｇ／ｍＬ）とインキュベーションすることにより、マクロファージ系細胞に分化する。細胞を終濃度の試験化合物と２時間プレインキュベートし、それから、０．１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（大腸菌：０１１１：Ｂ４、シグマ社）で４時間刺激する。サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−ｓｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）によりＴＮＦαおよびＩＬ−８の濃度を決定するために上清を集める。溶媒コントロールと比較することにより、１０μｇ／ｍＬのＢＩＲＢ７９６によりひきおこされる阻害に対する割合として、試験化合物の各濃度におけるＴＮＦα産生の阻害を算出する。相対的５０％有効濃度（ＲＥＣ₅₀）を、得られた濃度−反応曲線から決定する。ＩＬ−８産生阻害を、試験化合物の各濃度において、溶媒コントロールとの比較により算出する。５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を、得られた濃度−反応曲線から決定する。

（ｂ）ＰＢＭＣ細胞内のＬＰＳ誘導性ＴＮＦα／ＩＬ−８放出
健康な被験者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて全血から分離する。ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに播種し、通常組織培養条件（３７℃、５％ＣＯ₂）下、２４時間、１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４、シグマアルドリッチ社）を添加する前に、２時間、所望の濃度の化合物で処理する。上清をサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−ｓｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）によるＩＬ−８およびＴＮＦα濃度の決定のために回収して、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で測定する。ＩＬ−８およびＴＮＦα産生の５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を用量−反応曲線から算出する。

（ｃ）ＣＤ３／ＣＤ２８刺激されたＰＢＭＣ細胞内におけるＩＬ−２およびＩＦＮγの放出
健康な被験者からのＰＢＭＣを、密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて全血から分離する。ＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体（それぞれ、０．３μｇ／ｍＬ イーバイオサイエンス社、および３μｇ／ｍＬ ＢＤファーミンジェン社）の混合物でプレコートされた９６ウェルプレートに細胞を添加する。それから、所望の濃度の化合物をウェルに添加し、プレートを正常組織培養条件下３日間放置する。上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−ｓｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）により、ＩＬ−２およびＩＦＮγの放出を決定する。ＩＣ₅₀を用量−反応曲線から決定する。

（ｄ）ＨＴ２９細胞内のＩＬ−１β誘導性ＩＬ−８放出
ヒト結腸腺がん細胞株であるＨＴ２９細胞を、９６ウェルプレートに播種し（２４時間）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（アブカム社）を２４時間添加する前、２時間、所望の濃度の化合物で前処理する。サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−ｓｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）によるＩＬ−８の定量のために上清を回収する。ＩＣ₅₀を用量−反応曲線から決定する。

（ｅ）初代マクロファージにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ−８およびＴＮＦα放出
健康な被験者からのＰＢＭＣを、密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて全血から分離する。細胞を２時間インキュベートし、非付着性細胞を洗浄により取り除く。細胞をマクロファージに分化させるために、細胞を通常組織培養条件下、７日間、５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック社）でインキュベートする。それから、２４時間の１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによる刺激前に、試験化合物を、２時間の前処理のために所望の濃度で細胞に添加する。上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏ−ｓｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）によりＩＬ−８およびＴＮＦα放出を測定する。ＩＣ₅₀を用量−反応曲線から決定する。

（ｆ）ＢＥＡＳ２Ｂ細胞におけるポリＩ：Ｃ誘導性ＩＣＡＭ−１発現
ポリＩ：Ｃを、単純ＲＮＡウイルス模倣物質としてこれらの試験で使用する。ポリＩ：Ｃ−オリゴフェクタミン混合物（１μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ、±２％のオリゴフェクタミン，２５μＬ；それぞれインビボジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）、インビトロジェン（カリフォルニア州カールスバッド））をＢＥＡＳ２Ｂ細胞（ヒト気管支上皮細胞、ＡＴＣＣ）中にトランスフェクトする。細胞を終濃度の試験化合物と２時間プレインキュベートし、細胞表面上のＩＣＡＭ１発現レベルを細胞系ＥＬＩＳＡにより測定する。ポリＩ：Ｃトランスフェクション後１８時間目時点において、細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、それから、内在性のペルオキシダーゼをアジ化ナトリウム０．１％および過酸化水素１％含有洗浄バッファー（１００μＬ、ＰＢＳ中０．０５％ツイーン：ＰＢＳ−ツイーン）の添加によりクエンチする。細胞を洗浄バッファー（３×２００μＬ）で洗浄し、５％ミルク／ＰＢＳ−ツイーン（１００μＬ）でウェルを１時間ブロッキングした後、該細胞を１％ＢＳＡ ＰＢＳ中の抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体（５０μＬ；セル・シグナリング・テクノロジー社、マサチューセッツ州ダンバース）と４℃で一夜インキュベートする。

細胞をＰＢＳ−ツイーン（３×２００μＬ）で洗浄し、二次抗体（１００μＬ；ＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧ、ダコ社、デンマーク・グロストルプ ）とインキュベートする。それから、細胞を基質（５０μＬ）と２〜２０分間インキュベートし、次いで、反応停止液（５０μＬ、１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄）を添加する。ＩＣＡＭ−１シグナルを、分光光度計を用いて、参照波長６５５ｎｍに対する４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより検出する。それから、細胞をＰＢＳ−ツイーン（３×２００μＬ）で洗浄し、クリスタルバイオレット染色（２％ＰＢＳ溶液５０μＬ）および蒸留水中の１％ＳＤＳ溶液（１００μＬ）による溶離後、５９５ｎｍの吸光度を測定することにより各ウェル中の総細胞数を測定する。ＯＤ４５０〜６５５測定値を各ウェルのＯＤ５９５の測定値で割ることにより細胞数を補正する。溶媒コントロールとの比較することで、ＩＣＡＭ−１発現阻害を試験化合物の各濃度で算出する。５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を、得られた濃度−反応曲線から決定する。

（ｇ）細胞有糸分裂アッセイ
健康な被験者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７、シグマアルドリッチ社、英国プール）を用いて全血（Ｑｕｉｎｔｉｌｅｓ、英国ロンドン）から分離する。ＰＢＭＣ（試料当たり３百万個の細胞）を、引き続き、２％ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン、シグマアルドリッチ社、英国プール）で４８時間処理し、次いで、様々な濃度の試験化合物に２０時間曝露する。回収の２時間前、ＰＢＭＣをデメコルチン（０．１μｇ／ｍＬ；インビトロジェン、英国ペーズリー）で処理して細胞を分裂中期で停止する。有糸分裂細胞を観察するために、ＰＢＭＣをＩｎｔｒａｐｒｅｐ（５０μＬ; ベックマン・コールター社、フランス）の添加により透過処理化して固定し、前述したように、抗ホスホヒストン３（０．２６ｎｇ／Ｌ；＃９７０１；セル・シグナリング、マサチューセッツ州ダンバース）およびヨウ化プロピジウム（１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ社、英国プール）で染色する（Muehlbauer P.A. and Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130）。リンパ球をゲーティングしながら、ＡＴＴＵＮＥフローサイトメーター（インビトロジェン、英国ペーズリー）を用いて蛍光を観察する。有糸分裂の阻害率を各処理について溶媒（０．５％ＤＭＳＯ）処理と比較して算出する。

（ｈ）ライノウイルス誘導性ＩＬ−８放出およびＩＣＡＭ−１発現
ヒトライノウイルスＲＶ１６をアメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナサス）から得る。ウイルスストックを、細胞の８０％が細胞変性になるまで、ＨＲＶでＨｅＬａ細胞を感染させることにより生成する。

ＢＥＡＳ２Ｂ細胞をＭＯＩが５になるようにでＨＲＶに感染させ、吸収を促進するために穏やかに振とうしながら３３℃で２時間インキュベートする。それから、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地を加えて、該細胞をさらに７２時間インキュベートする。上清をＤｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡディベロップメントキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、ＩＬ−８濃度アッセイのために回収する。

細胞表面に発現するＩＣＡＭ−１の値をセルベースＥＬＩＳＡにより決定する。感染７２時間後において、細胞をＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定する。０．１％アジ化ナトリウムおよび１％の過酸化水素の添加による内在ペルオキシダーゼのクエンチ後、ウェルを洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．０５％ツイーン：ＰＢＳ−ツイーン）で洗浄する。５％ミルク／ＰＢＳ−ツイーンで１時間、ウェルをブロッキングした後、細胞を、５％ＢＳＡ ＰＢＳ−ツイーン（１：５００）中の抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体と一夜インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ−ツイーンで洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧ：ダコ社）とインキュベートする。基質を添加し、分光光度計を用いて６５５ｎｍの参照波長で、ＩＣＡＭ−１シグナルを４５０ｎｍにおいて測定することにより検出する。それから、ウェルをＰＢＳ−ツイーンで洗浄し、クリスタルバイオレット染色および１％ＳＤＳ溶液で溶離した後に、５９５ｎｍでの吸光度を測定することにより各ウェル中の総細胞数を決定する。ＯＤ₄₅₀〜₆₅₅測定値を各ウェルのＯＤ₅₉₅の測定値で割ることにより細胞数を補正する。ＨＲＶ感染の２時間前および、感染していないＨＲＶが洗い流される感染２時間後に化合物を添加する。

（ｉ）ＭＲＣ５細胞内におけるＨＲＶ１６誘導性細胞変性効果（ＣＰＥ）の評価
５％ＦＣＳおよび１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有するＤＭＥＭ中において、ＭＯＩが１になるように、ＭＲＣ５細胞をＨＲＶ１６に感染させ、次いで、３３℃で１時間インキュベーションして吸着を促進する。上清を吸引し、それから、新しい培地を添加し、次いで、４日間インキュベーションする。必要に応じて、細胞は、化合物またはＤＭＳＯと２時間、細胞をプレインキュベートし、ウイルスを洗い流した後、化合物およびＤＭＳＯを再び添加する。

上清を吸引し、メチレンブルー溶液（１００μＬ、２％ホルムアルデヒド、１０％のメタノールおよび０．１７５％メチレンブルー）と室温において２時間インキュベートする。洗浄後、蒸留水（１００μＬ）中１％ＳＤＳを各ウェルに添加し、プレートを、６６０ｎｍにおける吸光度を測定する前に、１〜２時間軽く振盪する。各ウェルについて阻害率を算出する。ＩＣ₅₀値を、試験化合物の連続希釈により得られる濃度−反応曲線から算出する。

（ｊ）一次気管支上皮細胞内のインビトロＲＳＶウイルス負荷
９６ウェルプレートにおいて成育した正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）を、１５ｍＭ塩化マグネシウム含有ＬＨＣ８培地：ＲＰＭＩ−１６４０（５０：５０）中、０．００１のＭＯＩにおけるＲＳＶ Ａ２（Ａ２株、ＨＰＡ、英国ソールズベリー）に感染し、吸着のために３７℃で１時間インキュベートする。この細胞をＰＢＳ（３×２００μＬ）で洗浄し、新しい培地（２００μＬ）を添加し、４日間インキュベーションする。必要に応じて、細胞を化合物またはＤＭＳＯと２時間プレインキュベートし、それから、ウイルスを洗い流した後、再び添加する。

細胞をＰＢＳ溶液（５０μＬ）中の４％ホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＷＢ（３×２００μＬ）（洗浄バッファー、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳおよび０．０５％ツイーン２０）で洗浄し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％濃縮ミルク）中で１時間インキュベートする。それから、細胞をＷＢ（３×２００μＬ）で洗浄し、ＰＢＳ−ツイーン中の５％ＢＳＡ中、抗ＲＳＶ（２Ｆ７）Ｆ融合タンパク質抗体（４０μＬ; マウスモノクローナル、ロット７９８７６０、カタログＮｏ．ａｂ４３８１２、アブカム社）と室温で１時間インキュベートする。洗浄後、細胞をＰＢＳ−ツイーン中の５％ＢＳＡ（ロット０００５３１７０、カタログＮｏ．Ｐ０４４７、ダコ社）中、ＨＲＰ結合型二次抗体溶液（５０μＬ）とインキュベートし、それから、ＴＭＢ基質（５０μＬ；基質試薬パック、ロット２６９４７２、カタログＮｏ．ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加する。この反応を２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄（５０μＬ）の添加により停止し、得られたシグナルをマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）において比色測定（ＯＤ：４５０ｎｍ、参照波長６５５ｎｍ）により測定する。

それから、細胞を洗浄し、２．５％クリスタルバイオレット溶液（５０μＬ；ロット８６５６、カタログＮｏ．ＰＬ７０００、Ｐｒｏ−Ｌａｂ Ｄｉａｎｏｓｔｉｃｓ）を３０分間適用する。ＷＢで洗浄後、１％ＳＤＳ／蒸留水（１００μＬ）を各ウェルに添加し、５９５ｎｍの吸光度を測定する前に、振盪機上でプレートを１時間軽く振とうする。ＯＤ₄₅₀〜₆₅₅の値をＯＤ₅₉₅の測定値により割ることにより、測定ＯＤ₄₅₀〜₆₅₅の測定値を細胞数について補正する。各ウェルについて阻害率を算出し、ＩＣ₅₀値を化合物の連続希釈から作成される濃度−反応曲線から算出する。

（ｋ）細胞生存率アッセイ：ＭＴＴアッセイ
分化したＵ９３７細胞を２つのプロトコール下（最初の４時間は５％のＦＣＳ ＲＰＭＩ１６４０培地中で、次の２４時間は１０％のＦＣＳ ＲＰＭＩ１６４０培地中で）で各試験化合物（下記の２００μＬ培地中、終濃度１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬ）とプレインキュベートする。上清を新しい培地（２００μＬ）と置換し、ＭＴＴ原液（１０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加する。１時間のインキュベーション後、培地を取り除き、ＤＭＳＯ（２００μＬ）を各ウェルに添加し、５５０ｎｍでその吸光度を測定する前に、プレートを１時間軽く振とうする。細胞生存率のパーセントロスを、溶媒（０．５％ＤＭＳＯ）処理と比較して各ウェルについての算出する。結果として、溶媒に対する薬物処理によるの細胞生存率の見かけの増加を、負のパーセントとして集計する。

（ｌ）ヒトの生検アッセイ
腸粘膜生検をＩＢＤ患者の結腸の炎症領域から得る。生検材料を小さな切片（２〜３ｍｍ）にカットし、無血清培地中、５％ＣＯ₂／９５％Ｏ₂雰囲気下、３７℃で、器官培養チャンバー内のスチールグリッド上に配置する。ＤＭＳＯコントロールまたは所望の濃度の試験化合物を組織に添加し、器官培養チャンバー内で２４時間インキュベートする。Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα値の決定のために上清を回収する。試験化合物によるサイトカイン放出の阻害率をＤＭＳＯコントロール（１００％）について決定したサイトカイン放出と比較して算出する。

（ｍ）ｄ−Ｕ９３７細胞内のβカテニン蓄積
ヒト単球細胞株であるＵ９３７細胞をＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）と４８〜７２時間のインキュベーションすることにより、マクロファージ型細胞に分化する。それから、細胞を終濃度の試験化合物または溶媒と１８時間インキュベートする。試験化合物によるβ−カテニン誘導を培地を４％ホルムアルデヒド溶液に置き換えることにより停止する。内在性の過酸化物の活性をクエンチングバッファー（１００μＬ、０．１％アジ化ナトリウム、０．０５％ツイーン−２０含有ＰＢＳ中の１％Ｈ₂Ｏ₂）と２０分間のインキュベートにより中和する。細胞を洗浄バッファー（２００μＬ；０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ；ＰＢＳ中の５％ミルク）と１時間インキュベートし、洗浄バッファー（２００μＬ）で再洗浄し、それから、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ＢＤ、英国オックスフォード）中の抗β−カテニン抗体溶液（５０μＬ）と一夜インキュベートする。

洗浄バッファー（３×２００μＬ；０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ）での洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ダコ社、英国ケンブリッジ）中のＨＲＰ結合型二次抗体溶液（１００μＬ）と細胞とをインキュベートし、そのシグナルをＴＭＢ基質（５０μＬ；Ｒ＆Ｄシステムズ、英国アビングドン）を用いた比色測定により決定する（ＯＤ：４５０ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。この反応を１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄溶液（５０μＬ）の添加により停止する。それから、細胞を洗浄バッファーで洗浄し、２％クリスタルバイオレット溶液（５０μＬ）を３０分間適用する。洗浄バッファー（３×２００μＬ）での洗浄後、１％ＳＤＳ（１００μＬ）を各ウェルに添加し、５９５ｎｍにおける吸光度を測定する前に、１時間軽くプレートを振とうする（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。

ＯＤ₄₅₀〜₆₅₅の測定値をＯＤ₅₉₅の測定値により割ることにより、ＯＤ₄₅₀〜₆₅₅の測定値を細胞数について補正する。各ウェルについて誘導率を溶媒と比較して算出し、参照化合物Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド（１μｇ／ｍＬ）を含む標準コントロールにより得られた誘導を一単位と定義したものと比較して、誘導比を標準化する。

（ｎ）Ｔ細胞増殖
健康な被験者からのＰＢＭＣを、密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて全血から分離する。それから、メーカーの説明書通りにネガティブ磁気細胞ソーティングを行うことよりリンパ球フラクションから、まずＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮する（Miltenyi Biotec 130-091-155）。それから、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を製造者指示書（１３０−０４５−９０１）の通りにミクロビーズを用いてＣＤ４５ＲＡ＋細胞のポジティブ磁気セレクションを使用して分離する。９６ウェル平底プレート（コーニングコースター社）上の１００μｌ ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中に、ウェル当たり２×１０⁵細胞で細胞を播種する。２５μＬの試験化合物を正常培地において適切な濃度（終濃度の８倍）に希釈し、プレート上のウェル２つずつに添加して、０．０３ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬの用量反応範囲にする。ＤＭＳＯをネガティブコントロールとして添加する。プレートを１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３； イーバイオサイエンス社）で刺激する前２時間プレインキュベートさせる。７２時間後、各ウェル内の培地を１０μＭのＢｒｄＵ （ロシェ社）含有する１５０μＬの新培地で置換する。メーカーの説明書（ロシェ社）の通りに１００μＬの固定／変性溶液を各ウェルに２０分間で添加することにより、細胞を固定する。抗ＢｒｄＵ検出抗体の添加前にＰＢＳでプレートを１回洗浄し、室温において９０分間インキュベートする。それから、プレートを供給されている洗浄バッファーで穏やかに３回洗浄し、１００μＬの基質溶液の添加により展開する。５０μＬの１ＭのＨ₂ＳＯ₄の添加により反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。ＩＣ₅₀を用量−反応曲線から決定する。

（ｏ）ＩＢＤ患者からのＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＬＰＭＣ細胞におけるＩＬ−２およびＩＦＮγの放出
以下のように、外科検体の炎症を起こしているＩＢＤ粘膜または外科検体の正常粘膜から、粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を単離して精製する：
粘膜をメスで外科検体の深層から取り出し、３〜４ｍｍの大きさの切片に切る。マグネチックスターラーを用いて撹拌しながら、ＨＢＳＳ（シグマアルドリッチ社）の１ｍＭのＥＤＴＡ（シグマアルドリッチ社、英国プール）で組織切片を３回洗浄し、各洗浄の後、上清を捨てることにより上皮組織を取り除く。その後、サンプルをタイプ１Ａコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ；シグマアルドリッチ社）を用いて３７℃で撹拌しながら１時間処理する。それから、得られた細胞懸濁液を１００μｍ細胞ストレーナーを用いてろ過し、２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマアルドリッチ社）中に再懸濁して、細胞培養のために使用する。

新しく単離したＬＰＭＣ（２×１０⁵細胞／ウェル）をＤＭＳＯコントロールまたは適切な濃度の化合物の存在下、１μｇ／ｍＬのα−ＣＤ３／α−ＣＤ２８で４８時間刺激する。４８時間後、上清を除去し、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡによりＴＮＦαおよびＩＦＮγの存在を分析する。試験化合物によるサイトカイン放出の阻害率は、ＤＭＳＯコントロール（１００％）について決定したサイトカイン放出と比較して算出する。

（ｐ）ＩＢＤ患者から単離した筋線維芽細胞からのサイトカイン放出の阻害
炎症を起こしたＩＢＤ粘膜からの筋線維芽細胞を以下のように単離する：
粘膜を切開して処分し、１ｍｍの大きさの粘膜試料を２０％のＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（インビトロジェン、英国ペーズリー）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、および１μｇ／ｍＬアンホテリシン（シグマアルドリッチ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ社）中、加湿ＣＯ₂インキュベーター内において３７℃で培養する。樹立された筋線維芽細胞のコロニーを２５ｃｍ²の培養フラスコに播種し、２０％のＦＢＳおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ中で培養し、少なくとも４回継代することで、刺激実験に用いるために十分な量を得る。

ウェルあたり３×１０⁵細胞で１２ウェルプレートに播種した筋線維芽細胞のサブコンフルエントな単層を、ＤＭＳＯコントロールまたは適切な濃度の化合物の存在下で２４時間培養する前に、３７℃、５％ＣＯ₂において２４時間無血清培地中飢餓状態にする。２４時間後、上清を除去し、Ｒ＆Ｄ ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８およびＩＬ−６の存在について分析する。試験化合物によるサイトカイン放出の抑制率をＤＭＳＯコントロール（１００％）について決定されたサイトカイン放出と比較して算出する。

（ｑ）ヒト好中球の脱顆粒
以下のようにヒト末梢血から好中球を単離する：
血液を静脈穿刺により採取し、１：１のＥＤＴＡ：滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｃａ＋／Ｍｇ＋非含有）の添加により抗凝固剤処理する。デキストラン（３％ｗ／ｖ）を添加（４部の血液に対して１部のデキストラン溶液）し、血液を室温で約２０分間放置する。上清を密度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により慎重に層状にして、遠心分離する（１５分、２０００ｒｐｍ、ブレーキなし）。上清を吸引し、（混入した赤血球を溶解するために）６０秒より長くならないように滅菌食塩水（０．２％）中に細胞ペレットを再懸濁する。それから、１０倍体積のＰＢＳを添加し、細胞を遠心分離する（５分、１２００ｒｐｍ）。細胞をＨＢＳＳ＋（サイトカラシンＢ（５μｇ／ｍＬ）および１ｍＭ ＣａＣｌ₂を含有するハンクス緩衝塩溶液（フェノールレッドなし））において再懸濁して５×１０⁶細胞／ｍＬを得る。

５×１０⁴細胞をＶ底９６穴プレートの各ウェルに添加し、適切な濃度の試験化合物（０．３〜１０００ｎｇ／ｍＬ）または溶媒（ＤＭＳＯ、終濃度０．５％）とインキュベートする（３０分、３７℃）。脱顆粒をｆＭＬＰの添加により刺激する（終濃度１μＭ）。更にインキュベート（３０分、３７℃）した後、細胞を遠心分離（５分、１５００ｒｐｍ）により取り除き、上清を平底９６ウェルプレートに移す。同容量のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、１０分後、同体積の硫酸（０．５Ｍ）の添加により反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍ（６５５ｎｍにおけるバックグラウンドを差し引く）において測定する。５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を得られた濃度−反応曲線から決定する。

（ｒ）細胞毒性アッセイ
１×１０⁵個のジャーカット細胞（不死化ヒトＴリンパ球）を１００μＬの培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ）をいれた９６ウェルプレートの適切な数のウェルに加える。１μＬのＤＭＳＯコントロール（終濃度１．０％ｖ／ｖ）または試験化合物（終濃度２０、５または１μｇ／ｍＬ）をウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートする。２４時間後、プレートを１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄する。それから、細胞をＰＢＳ中のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１５０μＬ（終濃度７．５μｇ／ｍＬ）中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ₂で１５分間インキュベートする。１５分後、細胞を、ＦＬ３ウインドウを用いてフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ）により分析する。試験ウェルにおけるＰＩネガティブ細胞の割合をＤＭＳＯコントロールによって標準化して、生存率（％）を算出する。

インビボスクリーニング：薬力学および抗炎症作用
（ｉ）マウスにおけるＬＰＳ誘導性好中球蓄積
ＬＰＳチャレンジによる炎症性反応を刺激する前に、示された時間（２〜８時間の範囲内）において、溶媒または試験物質を気管内経路により非絶食Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与する。Ｔ＝０において、マウスを暴露チャンバーに入れ、ＬＰＳ（７．０ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）に３０分間暴露する。更に８時間後に、動物を麻酔し、その気管にカニューレを挿入し、ＢＡＬＦを注入により抽出し、それから、気管カテーテルによりその肺から１．０ｍＬのＰＢＳを引き出す。ＢＡＬＦ試料の全白血球数および分化した白血球数をノイバウエル血球計算盤を用いて測定する。ＢＡＬＦ試料のサイトスピンスメアを室温において５分間の２００ｒｐｍで遠心分離することにより調製し、ディフ・クイック染色法（デイドベーリング社）を用いて染色する。細胞を、油浸顕微鏡を用いて計数する。ＢＡＬ中の好中球数データをｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値±標準誤差）として示す。好中球蓄積の阻害率を溶媒処理と比較して各処理について算出する。

（ｉｉ）タバコ煙モデル
Ａ／Ｊマウス（雄、５週齢）を小動物用タバコ煙吸入実験システム（モデルＳＩＳ−ＣＳ；柴田科学株式会社、東京）を用いて、３０分／日、１１日間、タバコ煙（空気で希釈した４％タバコ煙）に暴露する。試験物質を最後のタバコ煙暴露後、１日１回、３日間、鼻腔内投与（５０％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液３５μＬ）する。最後の投与後１２時間で、各動物を麻酔し、気管をカニューレ処置し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を集める。肺胞マクロファージおよび好中球の数を抗マウスＭＯＭＡ２抗体（マクロファージ）または抗マウス７／４抗体（好中球）を用いてＦＡＣＳ分析（ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＡＬＴＲＡＩＩ、ベックマン・コールター社、米国カリフォルニア州フラートン）により測定する。

（ｉｉｉ）マウスのＤＳＳ誘導性大腸炎
非絶食１０〜１２週齢、雄、ＢＤＦ１マウスに、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）での処理による炎症反応の刺激１日前（−１日目）に、溶媒、参照物質（５−ＡＳＡ）または試験化合物のいずれかを１日２回経管栄養補給により投与する。試験の０日目、ＤＳＳ（５％ｗ／ｖ）を飲料水で投与し、次いで、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）、参照物質（１００ｍｇ／ｋｇ）または試験化合物（５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、７日間、投与する。ＤＳＳを含む飲料水を３日毎に補充する。試験中、動物を、毎日体重を量り、そして便を観察し、便の硬さに基づいたスコアとして記録する。６日目の殺処分時に、大腸を取り出し、長さおよび重量を記録する。結腸切片を好中球の浸潤を決定するＭＰＯ分析、または疾患の重症度を決定する組織病理学スコアのために採取する。

（ｉｖ）マウスのＴＮＢＳ誘導性大腸炎
非絶食１０〜１２週齢、雄、ＢＤＦ１マウスに、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（１５ｍｇ／ｍＬ：５０％エタノール／５０％生理的食塩水）での処理による炎症反応の刺激１日前（−１日目）に、溶媒（５ｍＬ／ｋｇ）、参照物質（ブデソニド２．５ｍｇ／ｋｇ）または試験化合物（１または５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、経管栄養補給により投与する。試験０日目、ＴＮＢＳ（２００μＬ）を溶媒、参照物質または試験化合物を、プラスチック・カテーテルを経て１日２回結腸内投与し、２日または４日間続ける。試験中、動物の体重を毎日量り、そして便を観察し、便の硬さに基づいてスコアとして記録する。２日目（または４日目）の殺処分時に、大腸を取り出し、長さおよび重量を記録する。疾患の重篤度を決定する組織病理学スコアのために結腸切片を採取する。

（ｖ）マウスの養子移入
試験０日目、雌、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを殺処分し、ＣＤ４５ＲＢ^high細胞単離（ＳＣＩＤ ＩＢＤ細胞分離プロトコールを用いて）のため脾臓を得る。それから、およそ４×１０⁵細胞／ｍＬのＣＤ４５ＲＢ^high細胞を雌ＳＣＩＤ動物に腹腔内投与する（１００μＬ／マウス）。試験１４日目、マウスの体重を量り、体重に基づいた治療群にランダムに分ける。１４日目、１日２回、化合物を５ｍＬ／ｋｇの用量体積で経管栄養補給により投与する。朝の投与４時間後に動物を検死する試験４２日目まで治療を継続する。結腸長さおよび重量を記録し、結腸浮腫の測定などの試験の二次エンドポイントとして使用する。それから、結腸を６つの断面に分割し、このうち４つを組織病理学のスコアリング（主要エンドポイント）に使用し、２つはサイトカイン分析のためにホモジナイズする。示したデータは未処置動物と溶媒投動物との間の誘導域（induction window）の阻害率であり、高阻害は非疾患の、未処置、表現型に近いものを意味する。

（ｖｉ）ラットのエンドトキシン誘導性ブドウ膜炎
雄ルイスラット（６〜８週齢、英国チャールスリバー社）を１９〜２１℃、１２時間の明／暗サイクル（０７：００／１９：００）で３つのケージ内で飼育し、げっ歯類固形飼料の標準的な食事と水を自由に与える。非絶食ラットの体重を量り、永久標識を付けた尾で個々に識別し、３２ゲージ針を用いてＬＰＳ（ＰＢＳ中に調製した大腸菌０１１１：Ｂ４、シグマアルドリッチ社、英国）１００ｎｇ／動物を、右硝子体液中に（５μＬ用量体積）単回の硝子体内投与を受ける。未処置ラットにＰＢＳを注射する。試験化合物または溶媒（４％ステアリン酸ポリオキシル４０、ＰＢＳ中の４％マンニトール（ｐＨ７．４））をＬＰＳ１時間前、ＬＰＳ投与時、およびＬＰＳ投与後１、２および４時間目に、動物の右目に局所経路により投与（１０μＬ）する。投与前、投与する液剤を超音波処理して澄明な液剤を確保する。ＬＰＳ投与６時間後、ペントバルビトンを過剰投与（心穿刺により）することにより動物を安楽死させる。安楽死直後、手術用顕微鏡下３２ゲージ針を用いて前眼房の穿刺によりラットの右眼から１０μＬの眼房水を集める。眼房水を２０μＬのＰＢＳで希釈し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ 自動セルカウンター （インビトロジェン社）を用いて総細胞数を直ぐに測定する。眼房水収集後、各動物の右眼を摘出し、水晶体周りの前部（前眼部）および後部（後眼部）に解剖する。各切片の重量を量り、滅菌リン酸緩衝食塩水５００μＬ中でホモジナイズし、次いで、４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。得られた上清を３つアリコートに分け、Ｒ＆Ｄ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡによるその後のサイトカイン分析まで−８０℃で貯蔵する。

インビトロおよびインビボスクリーニング結果の要約

ＫＩＮＯＭＥスキャン（商標）技術を用いたＬｅａｄＨｕｎｔｅｒディスカバーサービス（ＤｉｓｃｏｖｅｒＲｘ社、カリフォルニア州フリーモント）により行われた試験により、実施例１の化合物が、キナーゼＢ−ＲａｆおよびＢ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）がその標準的リガンドと結合することに対する有意な効果を有しないことを究明した。さらに、この化合物は、より低い選択性スコア（表１ａ）により証明されるように、参照化合物、Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド（国際公開第２０１０／１１２９３６号）と比較して選択性改善を示した。

下表３に示すように、本発明の実施例の化合物は、ＰＢＭＣにおいて細胞分裂（有糸分裂）に対する影響を測定する上記アッセイ（ｇ）において、参照化合物（Ｎ−（４−（４−（３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−２−メトキシアセトアミド；国際公開第２０１０／１１２９３６号）よりも著しく低い活性である。同様に、本発明の実施例の化合物は、上記細胞毒性アッセイ（ｒ）において生存率増加を示す参照化合物より実質的に小さな細胞毒性である（表３）。

下表４に示すように、実施例１の化合物は硝子体内エンドトキシンＬＰＳで処置したラットの眼の前部と後部両方の低細胞数およびサイトカインＩＬ−１β値により示されるように、有意にかつ用量依存的に細胞浸潤が減少した（上記アッセイ（ｖｉ）参照）。

追加試験の概要
絶食時結腸内模擬液（ＦａＳＳＣｏＦ）の溶解性の決定
ｐＨ６．５におけるＦａＳＳＣｏＦ中の本発明の化合物の溶解性を、以前報告された方法（Vertzoni, M., et al. Pharm. Res. 2010, 27, 2187-2196）の変法を用いて決定する。元の方法で使用された胆汁酸塩抽出物（この抽出物はもはや入手できない）の代わりに、変更した方法では、タウロコール酸ナトリウム （０．１５ｇ）、グリココール酸（０．１５ｇ）、 ウルソデオキシコール酸（０．０５ｇ）、コール酸（０．０５ｇ）、およびグリコデオキシコール酸（０．０５ｇ）の混合物を使用する。これらの５つの胆汁酸をすり鉢とすりこぎを用いて一緒に粉砕して以下に概要を述べるように、ＦａＳＳＣｏＦに組み込まれる白色微粉末を得る。

ＦａＳＳＣｏＦ培地：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス；０．２７５ｇ）およびマレイン酸（０．４４ｇ）を水（３５ｍＬ）に溶解して溶液を得て、そのｐＨを０．５Ｍ ＮａＯＨ（約１２ｍＬ）で処理して６．５に調節する。それから、溶液を水で５０ｍＬにする。このトリス／マレイン酸緩衝液（約２５ｍＬ）の一部を０．５Ｌ丸底フラスコに添加した後、上記胆汁酸混合物０．００５６５ｇで処理する。ＤＣＭ（０．１５ｍＬ）中のホスファチジルコリン（０．０１１１ｇ）およびＤＣＭ（０．１５ｍＬ）中のパルミチン酸（０．００１３ｇ）の溶液を添加し、それから、有機溶媒をＤＣＭ臭を知覚せず、透明な溶液を得るまで、減圧下４０℃で蒸発して除く。蒸発した溶液体積をトリス／マレイン酸緩衝液の残りを添加することにより５０ｍＬに調節して、それから、ＢＳＡ（０．１１５ｇ）を添加後、緩やかに撹拌することにより溶解する。

溶解性決定：試験化合物をｐＨ６．５のＦａＳＳＣｏＦ培地に懸濁して２〜１０ｍｇ／ｍＬの最大終濃度を得る。懸濁液を２５℃で２４時間平衡にして後、ガラス繊維Ｃフィルターによりろ過する。それから、ろ液を注入および標準品に対するＨＰＬＣによる定量化に適するように希釈する。種々の体積の標準的な希釈および非希釈試料溶液を注入し、標準注入の主要ピークと同じ保持時間に見られるピークの積分により決定されるピーク面積を用いて溶解性を算出する。

ＦａＳＳＣｏＦ溶解性を下表５に示すが、実施例の化合物が０．０１ｍｇ／ｍＬより大きくｐＨ６．５のＦａＳＳＣｏＦ培地中の溶解性を示したことを明らかにしている。本発明の実施例の化合物のため、ｐＨ６．５ＦａＳＳＣｏＦ溶解性は、参照化合物Ａ、３−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ-ブチル）−１−（ｐ−トリル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−５−エチニル−Ｎ−（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド｛Ｆｙｆｅ、Ｍ．Ｃ．Ｔ．、国際公開第２０１４／１４０５８２号｝のものに対して優れていた。

薬物動態パラメータの決定
本発明の化合物の全身薬物動態および総結腸組織分布を調査するために、サイライフサイエンス社（ インド国プネー、ヒンジャワディ）により試験を行った。特に、化合物の単回経口投与後、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスで薬物動態試験を行った。

表６に目録したデータは、本発明の化合物が実質的結腸濃度を達成するが、対照的に、全身血漿または血液暴露は非常に低いまたは無視できることを明らかにしている。

表６の略語一覧
Ｄ＝投与化合物（投薬）
Ｍ＝測定化合物
Ｍｘ＝マトリックス
Ｐｌ＝血漿
Ｂｄ＝血液
ＴＣ＝全結腸
ｈＥＲＧ阻害試験
本発明の化合物をエッセンバイオサイエンス社（英国ウェリン・ガーデン・シティ）のＩｏｎＷｏｒｋｓ（商標）パッチクランプ電気生理法を用いてヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈＥＲＧ）の阻害について試験した。

急性眼刺激／腐食試験
急性眼刺激／腐食試験の目的は、アルビノニュージーランド白ウサギ（投与開始の１３〜１５週；投与群当たり２匹の雄および２匹の雌）の眼に眼の経路により（４０μＬ／眼／点眼の左右両側点眼）、１日４回投与（４時間間隔をおいて）で１治療日（フェーズ１）または３連続治療日（フェーズ２）の後、溶媒（４％ｗ／ｖポリオキシエチレン４０ステアレート／４％ｗ／ｖマンニトール／リン酸緩衝（ｐＨ７．４）液）と比較して、２種類の選択された用量値（０．１および１．０ｍｇ／ｍＬ）において実施例１の化合物のあり得る刺激性または腐食の可能性について評価することであった。

試験中、予定外の死はなく、試験物質関連の臨床徴候もなかった。さらに、体重に対しても摂食量に対しても影響はなかった。
フェーズ１では、いずれもの用量値においても溶媒、または試験物質、実施例１製剤の点眼後、全群において、眼の反応は主に結膜発赤（グレード１または２）ならびにたまに結膜浮腫（グレード１）および眼脂（グレード１）に限定的であった。これらのスコアは軽微から中度であった。実施例１治療動物と溶媒コントロールとの間の頻度、重症度および発症率の差はなかった。結膜発赤は最も頻発する反応であり、投与開始前でさえ存在した（グレード１）。この局所的反応は、眼の試験の間中、アルビノウサギで自然に発生することが知られており、動物で行われる多くの眼の検査に関連する。結膜浮腫および眼脂は最初の点眼後およびその後の３日間の観察期間にわたって全群で散発性に観察された。加えて、虹彩のうっ血は２つの高用量群ウサギ（１ｍｇ／ｍＬ）および１つの溶媒群雌の眼において時折および片側で観察された。ドレーズ検査は、単回治療日後角膜の完全性および対光反射が全ての場合の全動物について正常であることを確認した。従って、要約すれば、製剤の局所耐容性は単回投与日後許容可能であると見なされた。同様な局所反応が溶媒または実施例１の化合物を含有する製剤の点眼後に観察され、眼の耐容性に対して中度の溶媒関連効果を示した。

フェーズ２では、いずれもの用量値においても溶媒または試験物質製剤の点眼後、全群において、主な眼の反応は結膜発赤（グレード１）に限定的であった。このスコアは軽微であり、なお、３日の治療期間にわたって群間の発症率および頻度において有意差はなかった。試験物質治療群より溶媒群において重症度は時折高かった（グレード２）。この結膜発赤は持続性があり、翌日の最初の点眼前でも観察された。加えて、虹彩のうっ血は２つの高用量群ウサギおよび１つの溶媒群雌の眼において時折観察された。全場合においていずれの動物にも眼脂は観察されなかった。ドレーズ検査は３日治療期間中の角膜の完全性を確認した。対光反射は全場合において全動物について正常であった。従って、要約すれば、製剤の局所耐容性は３治療日の増悪なしで許容可能であると見なされた。同様な局所反応が溶媒単独または実施例１の化合物を含有する製剤の点眼後に観察され、眼の耐容性に対して中度の溶媒関連効果を示した。

変異原性評価（細菌復帰突然変異スクリーニング）
サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ＴＡ１５３５株、ＴＡ１５３７株、ＴＡ９８株およびＴＡ１００株の４種のヒスチジン依存性栄養要求変異体ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＷＰ２ ｕｖｒＡの１種のトリプトファン依存性栄養要求変異体の突然変異を誘導する能力についてインビトロでの実施例１の化合物を評価するためＳｅｑｕａｎｉ（英国、ヘレフォードシャー、レッドベリー）により試験を行った。

突然変異スクリーニングを、プレート法を用いて行い、Ｓ−９ ｍｉｘ（Ａｒｏｃｌｏｒ １２５４処置ラットの肝臓由来の肝臓ポストミトコンドリア分画）の存在下および非存在下の両方で実施した。細菌をジメチルスルホキシドに溶解した実施例１の化合物に暴露し、この溶媒をネガティブコントロールとしても使用した。ポジティブコントロールの化学薬品はＳ９ ｍｉｘの非存在下ではアジ化ナトリウム（ＴＡ１５３５およびＴＡ１００）、９−アミノアクリジン（ＴＡ１５３７）、２−ニトロフルオレン（ＴＡ９８）および４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド（ＷＰ２ ｕｖｒＡ）であり、Ｓ−９ ｍｉｘの存在下では２−アミノアントラセン（全株）であった。

プレート法条件下突然変異試験で使用した実施例１の化合物の用量は、Ｓ−９ ｍｉｘの存在下および非存在下で全株において１５、５０、１５０、５００または１５００μｇ／プレートであった。

プレート法条件下、Ｓ−９ ｍｉｘの存在下および非存在下で全株における１５００μｇ／プレートの溶解性限界まで実施例１の化合物を分析した。
Ｓ−９ ｍｉｘの存在下ＴＡ１５３７およびＴＡ９８における５００μｇ／プレートにおいて、およびＳ−９ ｍｉｘの非存在下全株における１５００μｇ／プレートにおいて沈殿が観察された。Ｓ−９ ｍｉｘの存在下ＴＡ９８における５００μｇ／プレートおよび１５００μｇ／プレートにおいてならびにＴＡ１５３５における１５００μｇ／プレートにおいて平均コロニー数の減少もあり、細菌に対する試験物質の毒性を示した。

プレート法条件下、Ｓ−９ ｍｉｘの存在下または非存在下、実施例１の化合物のいずれもの用量値で、いずれもの株において観察された復帰突然変異体数の用量関連または統計的に有意な増加はなかった。このことは、試験条件下、実施例１の化合物について変異原性効果は存在しないことを示している。

加水分解安定性試験
１ｍｇ／ｍＬの試験化合物の濃度において、ＤＭＳＯと水の混合物（３：１）中で、本発明の化合物の化学的安定性を評価できる。

一般的ＨＰＬＣ手順
アジレント社、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｃ１８、２．５μｍ、４．６×３０ｍｍカラム、４分法、５〜９５％ＭｅＣＮ／水（０．１％ギ酸）。流速２．５ｍＬ／分。カラムオーブン温度 ４０℃、検出 ２５４ｎｍ。

試料作成
試験化合物１．０ｍｇをＤＭＳＯ７５０μＬに溶解する。水（２５０μＬ）を沈殿が生じないことを確認しながら、ゆっくりと添加する。

記録安定性
試験液剤のアリコート５０μＬを取り出し、５μＬのＨＰＬＣ注入により２回繰り返して分析する。試験化合物のピーク面積を対応するＵＶトレースの手動積分後に記録する。

試験液剤を撹拌しながら６０℃まで加熱し、５および２４時間時点においてＨＰＬＣ分析用にアリコート５０μＬを取り出す。全ての場合において、５μＬ注入を使用し、試料を２回繰り返して分析する。

試験化合物のピーク面積を後続の時点と経過時間に対するピーク面積変化％から算出された分解％との双方で記録する。
参照化合物Ｂ（３−エチニル−５−（（４−（（４−（３−（３−イソプロピル−１−（ｐ−トリル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリミジン−２−イル）アミノ）−Ｎ−（２−モルホリノエチル）ベンズアミド；Ｃａｒｉｏｕ，Ｃ．Ａ．Ｍ．ら、国際公開第２０１４／０２７２０９号）を、試験を確証するためのコントロールとして各安定性試験に含める。

医薬製剤の安定性
以下のように実施例１の化合物のナトリウム（Ｎａ）および塩酸（ＨＣｌ）塩の１ｍｇ／ｍＬ保存溶液２０ｍＬを２通り製造した：各塩の適切なアリコートを４．５％マンニトールおよび３％ステアリン酸ポリオキシル４０を含有する１０ｍＭ ｐＨ７．２リン酸緩衝剤と混合した。試料を超音波処理し、以下の特性を有する透明な溶液を得た：浸透圧（ｍＯｓｍ（ミリオスモル）／ｋｇ）：３１０（Ｎａ）、３１４（ＨＣｌ）；ｐＨ：７．００（Ｎａ）、７．０５（ＨＣｌ）。保存溶液０．５ｍＬを水中の２０％ＤＭＳＯで１ｍＬまで希釈し、ＨＰＬＣによる純度分析のため注入した。それから、残りの保存溶液をＨＰＬＣバイアル中に０．５ｍＬのアリコートに分割し、２通りで様々な条件において保存した。試料を５および２５℃において保存し、１、２および４週間目でＨＰＬＣにより分析した。別の試料を４０℃において保存し、４週間目で分析した。下表に示す分析は、実施例１の化合物が５℃において溶液中で安定であることを明らかにしている。

略語
ＡｃＯＨ 氷酢酸
ａｑ 水性
５−ＡＳＡ ５−アミノサリチル酸
ＡＴＰ アデノシン−５’−三リン酸
ＢＡＬＦ 気管支肺胞洗浄液
ＢＩＤ ｂｉｓ ｉｎ ｄｉｅ （１日２回）
ＢＩＮＡＰ ２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル
ＢＯＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ｂｒ ブロード
ＢｒｄＵ ５−ブロモ−２’−デオキシウリジン
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣａｔＣａｒｔ（登録商標） 触媒カートリッジ
ＣＤＩ １，１−カルボニル−ジイミダゾール
ＣＯＰＤ 慢性閉塞性肺疾患
ｄ 二重線
ｄｂａ ジベンジリデンアセトン
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＡＤ アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥＭ ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド
ｄ−Ｕ９３７細胞 ＰＭＡ分化Ｕ−９３７細胞
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
（ＥＳ−） エレクトロスプレーイオン化、ネガティブモード
（ＥＳ＋） エレクトロスプレーイオン化、ポジティブモード
Ｅｔ エチル
Ｅｔ３Ｎ トリエチルアミン
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＥｔＯＨ エタノール
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞選別法
ＦＢＳ ウシ胎児血清
ＦＣＳ ウシ胎児血清
ｆＭＬＰ ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン
ＦＲＥＴ 蛍光共鳴エネルギー移動
ＧＳＫ３α グリコーゲン合成酵素キナーゼ３α
ＨＢＥＣ 初代ヒト気管支上皮細胞
ＨＢＳＳ ハンクス液
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＰＭＣ ヒドロキシプロピルメチルセルロース
ｈまたはｈｒ 時間
ＨＡＴＵ ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸
ＨＯＡｔ １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＲＰ ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＲＶ ヒトライノウイルス
ＩＣＡＭ−１ 細胞間接着分子１
ＩＦＮγ インターフェロンγ
ＩＬ インターロイキン
ｉＰｒＯＡｃ 酢酸イソプロピル
ＪＮＫ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ
ＬＣ 液体クロマトグラフィー
Ｌｃｋ リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ
ＬＰＳ リポ多糖
ｍ 多重線
（Ｍ＋Ｈ）＋ プロトン化分子イオン
ＭＡＰＫ マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２ マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２
ｍＣＰＢＡ メタクロロ過安息香酸
Ｍｅ メチル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＨｚ メガヘルツ
ｍｉｎまたはｍｉｎｓ 分
ＭＭＡＤ 空気動力学的中央粒子径
ＭＯＩ 感染多重度
ＭＰＯ ミエロペルオキシダーゼ
ＭＴＴ 臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム
ＭＳ 質量分析
ｍ／ｚ 質量電荷比
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリジノン（ｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｏｎｅ）
ＮＭＲ 核磁気共鳴（分光法）
ＯＤ 吸光度
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
Ｐｈ フェニル
ＰＨＡ フィトヘマグルチニン
ＰＭＡ 酢酸ミリスチン酸ホルボール
ｐＴＳＡ ４−メチルベンゼンスルホン酸（パラトルエンベンゼンスルホン酸）
ＰｙＢＯＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸
ｑ 四重線
ｒｔまたはＲＴ 室温
ＲＰ ＨＰＬＣ 逆相高速液体クロマトグラフィー
ｒｐｍ 回転数／分
ＲＰＭＩ ロズウェルパーク記念研究所
ＲＳＶ 呼吸器多核体ウイルス
ｓ 一重線
ｓａｔまたはｓａｔｄ 飽和
ＳＣＩＤ 重症複合免疫不全症
ＳＣＸ 固相カチオン交換（樹脂）
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＮＡｒ 芳香族求核置換
Ｓｙｋ 脾臓チロシンキナーゼ
ｔ 三重線
Ｔ３Ｐ １−プロパンホスホン酸環状無水物
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳ ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＣＩＤ５０ ５０％培養組織感染量
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＧＦβ トランスフォーミング増殖因子β
ＴＩＰＳ トリイソプロピルシリル
ＴＭＢ ３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン
ＴＭＳ−Ｃｌ 塩化トリメチルシリル
ＴＮＦα 腫瘍壊死因子α
接頭語ｎ−、ｓ−、ｉ−、ｔ−およびｔｅｒｔ−はその通常の意味を有する：ノーマル、セカンダリー、イソ、およびターシャリー。

Claims (18)

1. 式Ｉの化合物
   

   

   、またはその薬学的に許容可能な、塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体。
2. ４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸である、請求項１に記載の化合物。
3. 薬学的に許容可能な、アジュバント、希釈剤または担体と混合した、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な、塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体を含む、医薬製剤。
4. （Ａ）請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、および
   （Ｂ）別の治療薬
   を含んでなる組合せ製剤であって、
   成分（Ａ）および（Ｂ）の各々を薬学的に許容可能な、アジュバント、希釈剤または担体と混合して製剤する、前記組合せ製剤。
5. 医薬分野での使用のための請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な、塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体。
6. 炎症性疾患の治療もしくは予防用途に用いる、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能、な塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または請求項３に記載の医薬製剤、または請求項４に記載の組合せ製剤。
7. 前記炎症性疾患が嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺サルコイドーシス、特発性肺線維症、ＣＯＰＤ（慢性気管支炎および肺気腫を含む）、喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、接触性皮膚炎または乾癬、アレルギー性鼻炎、鼻炎、副鼻腔炎、結膜炎、アレルギー性結膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイまたは眼球乾燥症）、緑内障、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫（糖尿病性黄斑浮腫を含む）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、萎縮型および／または滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、白内障術後炎症、ぶどう膜炎（後部、前部および汎ぶどう膜炎を含む）、角膜移植および角膜縁移植片拒絶、グルテン過敏性腸症（セリアック病）、好酸球性食道炎、腸移植片対宿主病、クローン病および潰瘍性大腸炎から成るリストから選択される、請求項６に記載の使用のための化合物、製剤または組合せ製剤。
8. 前記炎症性疾患がぶどう膜炎、乾性角結膜炎（ドライアイまたは眼球乾燥症）、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項６または請求項７に記載の使用のための化合物、製剤または組合せ製剤。
9. 前記炎症性疾患が乾性角結膜炎（ドライアイまたは眼球乾燥症）である、請求項６または請求項７に記載の使用のための化合物、製剤または組合せ製剤。
10. 請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な、塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
    請求項３に記載の医薬製剤または請求項４に記載の組合せ製剤の使用であって、
    請求項６〜９のいずれか一項に記載の炎症性疾患の治療用薬剤もしくは予防用薬剤製造のための使用。
11. 請求項６〜９のいずれか一項に記載の炎症性疾患の治療方法または予防方法であって、前記方法は 請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な、塩、溶媒和物もしくは同位体誘導体、または
    請求項３に記載の医薬製剤、または請求項４に記載の組合せ製剤
    の効果量を、対象に投与することを含む前記方法。
12. 、式Ｉの化合物の製造方法であって、前記方法が：
    （ａ）式ＩＩの化合物と
    

    

    と式ＩＩＩの化合物との反応であって、
    

    

    ここでＺ¹およびＺ²のうち１つは式ＩＶの構造フラグメントであり、
    

    

    （Ｚ¹およびＺ²のうち他方は式Ｖの構造フラグメントである
    

    

    ）の構造フラグメントである；
    （ｂ）式ＩＩａの化合物
    

    

    （式中、Ｚ¹は上記定義通りである）
    と適切なアジド形成剤とを反応であって、この反応後、、中間体アシルアジド（式Ｚ¹−Ｃ（Ｏ）−Ｎ₃）を分離せずに熱転位させることで反応系中で得た式ＩＩの化合物を、次いで、この化合物を上記式ＩＩＩの化合物と反応させる；
    （ｃ）式ＩＩｂの化合物
    

    

    （式中、ＬＧ¹は脱離基であり、Ｚ¹は上記定義の通りであり、式ＩＩＩの化合物は上記定義の通りである）
    と上記定義の式ＩＩＩの化合物との反応；
    （ｄ）式ＶＩの化合物
    

    

    （式中、ＬＧ²は脱離基である）
    と式ＶＩＩの化合物：
    

    

    との反応；または
    （ｅ）Ｏ原子もしくはＮ原子上に保護基を有する、式Ｉの化合物の保護誘導体の脱保護反応を含む、前記式Ｉの化合物の製造方法。
13. 前記式Ｉの化合物の保護誘導体が、式ＶＩＩａの化合物
    

    

    （式中、Ｑ^xは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ₁〜₄アルキルである）
    である、請求項１２に記載の方法。
14. Ｚ²が請求項１２で定義された式Ｖの構造フラグメントである、請求項１２に記載の式ＩＩＩの化合物、または前記式ＩＩＩの化合物の塩もしくは保護誘導体。
15. 前記化合物または保護誘導体が、
    ４−（（４−（（４−アミノナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル；または
    ４−（（４−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチル
    である、請求項１４に記載の式ＩＩＩの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体。
16. 請求項１３に記載の式ＶＩＩａの化合物、またはその塩もしくはその保護誘導体。
17. 前記化合物が４−（（４−（（４−（３−（５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）ウレイド）ナフタレン−１−イル）オキシ）ピリジン−２−イル）アミノ）−２−メトキシ安息香酸メチルである、請求項１６に記載の式ＶＩＩａの化合物、またはその塩もしくは保護誘導体。
18. 、請求項１３に記載の式ＶＩＩａの化合物の製造方法であって、前記方法が、
    （ａ）式ＩＩｐの化合物と
    

    

    式ＩＩＩｐの化合物との反応
    

    

    （式中、Ｚ^1pおよびＺ^2pのうち１つは請求項１２に記載の式ＩＶの構造フラグメントであり、Ｚ^1pおよびＺ^2pのうち他方は式Ｖｐの構造フラグメントである）
    

    

    （式中、Ｑ^xは請求項１３に定義した通りである）；
    （ｂ）式ＩＩａｐの化合物
    

    

    （式中、Ｚ^1pは上記定義の通りである）
    と適切なアジド形成剤との反応であって、この反応後、中間体アシルアジド（式Ｚ^1p−Ｃ（Ｏ）−Ｎ₃）を分離せずに熱転位反応させることで反応系中で得た式ＩＩの化合物を、次いで、上記式ＩＩＩｐの化合物とを反応させる；
    （ｃ）式ＩＩｂｐの化合物
    

    

    （式中、ＬＧ¹は脱離基であり、Ｚ^1pは上記定義の通りである）
    と上記定義の式ＩＩＩｐの化合物との反応；
    （ｄ）請求項１２に記載の式ＶＩの化合物と式ＶＩＩｐの化合物との反応
    

    

    （式中、Ｑ^xは請求項１３に定義した通りである）
    を含む、請求項１３に記載の式ＶＩＩａの化合物の製造方法。