JP2017525976A - Ｃｎｓ由来エクソソームを富化するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液、血清、血漿、又は唾液等の生体液からのＣＮＳ由来エクソソームを富化するための方法に関する。該方法は、ＣＮＳ由来エクソソームを含有する生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップと、該生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを該免疫複合体を介して固相に結合するステップと、固相結合されたエクソソームを該生体液から分離して該ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップと、を含む。ＣＮＳ由来エクソソームからのバイオマーカーは、神経性疾患の検出、異なる神経性疾患間の鑑別、疾患進行のモニタリング又は既存及び将来の治療を客観的に評価するために測定されることができる。【選択図】 図１

Description

本発明は、血液、血清、血漿、又は唾液等の生体液におけるＣＮＳ（central nervous system：中枢神経系）由来エクソソームを富化するための方法に関する。本発明は、さらに、生体液から富化されたＣＮＳ由来エクソソームにおけるＣＮＳ由来物質（バイオマーカー）のレベルを測定することによりバイオマーカーレベルを決定するための方法に関する。

アメリカ政府利益の声明
ここで説明した作業は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＡＧ０３３３９８（ＮＩＡ支部）とともにＮＳ０５７５６７及びＮＳ０８２１３７（ＮＩＮＤＳ支部）の承認を受けてなされたものである。それゆえ、アメリカ政府は、上記承認に従って本発明に対して一定の権利を有することができる。

目標となるバイオマーカーは、ＣＮＳ障害、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、及びプリオン病の診断、鑑別診断及び疾患進行のモニタリングを援助するために最も必要とされている。今まで、最適なマーカーは、いずれも脳脊髄と直接接触する脳脊髄液（ＣＳＦ）に基づくものであるが、ＣＳＦの取得は、侵襲的手技であり、その日常応用が厳しく制限されている。その結果、ＣＮＳ疾患の末梢バイオマーカー（例えば、血液内）が切に必要とされている。しかしながら、ＣＮＳ由来物質は、血液脳関門等、厳密に調節された様々な関門のせいで、すべてが末梢体液にて検出できるとは限らないことがチャレンジとなる。例えば、ヒト脳／ＣＳＦに観察されたタンパク質のごく一部のみが血漿にて容易に検出されることができる（Pan et al, J. Proteome Res., 13:4535-4545, 2014）。これに加え、多くのＣＮＳ由来物質は他の器官系によっても生み出される。これは、実に、数十年にわたる研究がなされ、数百万ドルが使われているにもかかわらず、ＡＤ、ＰＤ又はプリオン病のための末梢バイオマーカーが確立されていないことの基本的で根本的な原因の一つである。さらに、ＡＤに関与するタンパク質であるタウやアミロイドβ（Ａβ）、及びＰＤに関与する重要なタンパク質であるα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）の従来の検定は、いずれも、ＣＮＳ由来の部分を、質量がＣＮＳよりも大量である血液成分（Barbour et al, Neurodegener Dis., 5(2):55-9, 2008）及び筋肉（Nagao et al., Muscle & nerve., 22:61-70, 1999）などの他のシステムによって生成される部分から、鑑別することができない。言い換えれば、ＣＮＳ疾患のシグナルは、既存技術で測定される場合、末梢入力から大きく影響されている。

従って、本発明の注目点となるＣＮＳ由来バイオマーカーの富化方法の提供は切実に要求されている。

（ａ）は、抗Ｌ１ＣＡＭ（神経系マーカー）が捕捉した血漿エクソソームの電子顕微鏡写真（インセット：Ｌ１ＣＡＭの免疫金標識）を示し、（ｂ）は、抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉又は正常マウスＩｇＧ捕捉によるＡｌｉｘ（一般的なエクソソームマーカー）及びＬ１ＣＡＭのウェスタンブロットを示し、（ｃ）は、正常マウスＩｇＧ捕捉（ｍＩｇＧ）サンプル又は「空」（ビード「捕捉」がない）サンプルにおけるレベルと比べた場合、抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉の血漿エクソソームのα−ｓｙｎ（ｓｙｎ）のレベルを示し、（ｄ）は、貧エクソソーム血漿ｖｓ．全血漿を用いたα−ｓｙｎ（ｓｙｎ）のレベルを示す。 臨床サンプルにおけるα−ｓｙｎ濃度の評価を示す。ルミネックスを用いてα−ｓｙｎ濃度を測定し、血漿（ａ）から単離されたＬ１ＣＡＭ含有エクソソームにおけるα−ｓｙｎ又は血漿（ｂ）における全α−ｓｙｎの比較を行った。 図３Ａ及び図３Ｂは、ＰＤ診断用α−ｓｙｎのＲＯＣ（Receiver Operating Characteristics（受信者動作特性））分析を示す。図３Ａは、全コーホート（ＰＤを持つ患者２６７名及び健常対照者２１５名）において、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎは、ＰＤが対照者に対して、０．６５４（感度＝７０．１％、特異度＝５２．９％）のＡＵＣ（曲線下面積）を提供したことを示す。図３Ｂは、利用可能なＣＳＦサンプルを有する対象のサブセット（１００名のＰＤ及び１００名の対照者）において、ＣＳＦ全α−ｓｙｎが、０．７２４（感度＝７６．８％、特異度＝５３．５％）のＡＵＣを提供したことを示し、つまり、Ｌ１ＣＡＭ富化されたエクソソームマーカー（α−ｓｙｎ）と、ＣＳＦα−ｓｙｎを測定することによって提供されたものとは、同様に優れた性能を有する。図３Ｃは、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎと、ＵＰＤＲＳ（統一パーキンソン病評価スケール）運動スコアでインデックスされた疾患重症度との間での重要な相関関係がＰＤ患者（ｒ＝０．１７６、ｐ＝０．００４、ピアソン相関）に観察されたことを示す。 図３Ａ及び図３Ｂは、ＰＤ診断用α−ｓｙｎのＲＯＣ（Receiver Operating Characteristics（受信者動作特性））分析を示す。図３Ａは、全コーホート（ＰＤを持つ患者２６７名及び健常対照者２１５名）において、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎは、ＰＤが対照者に対して、０．６５４（感度＝７０．１％、特異度＝５２．９％）のＡＵＣ（曲線下面積）を提供したことを示す。図３Ｂは、利用可能なＣＳＦサンプルを有する対象のサブセット（１００名のＰＤ及び１００名の対照者）において、ＣＳＦ全α−ｓｙｎが、０．７２４（感度＝７６．８％、特異度＝５３．５％）のＡＵＣを提供したことを示し、つまり、Ｌ１ＣＡＭ富化されたエクソソームマーカー（α−ｓｙｎ）と、ＣＳＦα−ｓｙｎを測定することによって提供されたものとは、同様に優れた性能を有する。図３Ｃは、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎと、ＵＰＤＲＳ（統一パーキンソン病評価スケール）運動スコアでインデックスされた疾患重症度との間での重要な相関関係がＰＤ患者（ｒ＝０．１７６、ｐ＝０．００４、ピアソン相関）に観察されたことを示す。 図３Ａ及び図３Ｂは、ＰＤ診断用α−ｓｙｎのＲＯＣ（Receiver Operating Characteristics（受信者動作特性））分析を示す。図３Ａは、全コーホート（ＰＤを持つ患者２６７名及び健常対照者２１５名）において、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎは、ＰＤが対照者に対して、０．６５４（感度＝７０．１％、特異度＝５２．９％）のＡＵＣ（曲線下面積）を提供したことを示す。図３Ｂは、利用可能なＣＳＦサンプルを有する対象のサブセット（１００名のＰＤ及び１００名の対照者）において、ＣＳＦ全α−ｓｙｎが、０．７２４（感度＝７６．８％、特異度＝５３．５％）のＡＵＣを提供したことを示し、つまり、Ｌ１ＣＡＭ富化されたエクソソームマーカー（α−ｓｙｎ）と、ＣＳＦα−ｓｙｎを測定することによって提供されたものとは、同様に優れた性能を有する。図３Ｃは、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎと、ＵＰＤＲＳ（統一パーキンソン病評価スケール）運動スコアでインデックスされた疾患重症度との間での重要な相関関係がＰＤ患者（ｒ＝０．１７６、ｐ＝０．００４、ピアソン相関）に観察されたことを示す。 図４Ａ及び図４Ｂは、脳室内への¹²⁵Ｉ−標識タウの注入後２，５，１０，２０，及び６０分での脳（図４Ａ）及び血漿（図４Ｂ）における放射能のレベルを示す。図４Ｃは、エクソソーム部分（ｅｘｏ）及び上澄液部分（ｓｕｐ）における放射性タウ（ｃｐｍ／μＬ血漿）を示す。示されたデータは、５つのマウスからの平均±ＳＤである。ＣＰＭ：１分間あたりの計数。 図４Ａ及び図４Ｂは、脳室内への¹²⁵Ｉ−標識タウの注入後２，５，１０，２０，及び６０分での脳（図４Ａ）及び血漿（図４Ｂ）における放射能のレベルを示す。図４Ｃは、エクソソーム部分（ｅｘｏ）及び上澄液部分（ｓｕｐ）における放射性タウ（ｃｐｍ／μＬ血漿）を示す。示されたデータは、５つのマウスからの平均±ＳＤである。ＣＰＭ：１分間あたりの計数。 図４Ａ及び図４Ｂは、脳室内への¹²⁵Ｉ−標識タウの注入後２，５，１０，２０，及び６０分での脳（図４Ａ）及び血漿（図４Ｂ）における放射能のレベルを示す。図４Ｃは、エクソソーム部分（ｅｘｏ）及び上澄液部分（ｓｕｐ）における放射性タウ（ｃｐｍ／μＬ血漿）を示す。示されたデータは、５つのマウスからの平均±ＳＤである。ＣＰＭ：１分間あたりの計数。

（定義）
「結合対」とは、ここで使用されたとおり、お互いに引かれ合い、具体的にはお互いに結合する２つの分子のことをいう。結合対として、抗原とそれに対する抗体、配位子とその受容体、核酸の相補鎖、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、レクチンと炭水化物が挙げられるが、これには限定されない。好適な結合対は、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、フルオレセインとフルオレセイン抗体、ジゴキシゲニン（digioxigenin）／ジゴキシゲニン抗体である。

「ＣＮＳ由来エクソソーム」とは、ここで使用されるように、ＣＮＳ、即ち脳及び／又は脊髄から由来する物質（例えば、タンパク質及び核酸）を含有するエクソソームのことをいう。
「エクソソーム」とは、ここで使用されたとおり、数多くの細胞型から放出される４０〜１００ｎｍの細胞外小胞であって、細胞間通信、抗原提示、タンパク質とともにｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどの核酸の転送を含む多様な細胞機能を実行する細胞外小胞のことをいう。

「固定化」とは、ここで使用されたとおり、試薬が固体表面に固定することを意味する。試薬が固体表面に固定化する場合、表面に非共有結合するか、共有結合することになる。
「Ｌ１ＣＡＭ」とは、ここで使用されたとおり、神経系で表現される細胞接着分子のことをいう。Ｌ１ＣＡＭは、膜貫通タンパク質であり、２００〜２２０ｋＤａの、Ｌ１タンパク質族のメンバーである神経細胞接着分子でありながら、治療抵抗性癌の意味合では細胞移動に加え、軸索誘導に関与する（癌細胞は、該状況とは関連がない）。Ｌ１ＣＡＭは、ＣＤ１７１（分化抗原群１７１）とも称されることがある。

発明者は、ＣＮＳ由来エクソソームが、未解明のメカニズムによって血液脳関門の多層に跨ることができることを発見した。また、発明者は、唯一且つ疾患特異的なバイオマーカーを携帯するＣＮＳ由来エクソソームが、血液及び他の末梢体液にて生体内で検出できることを発見した。
発明者は、血液、血清、血漿、唾液、又は尿液等の生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを単離し富化するための方法を発見した。発明者は、生体液におけるＣＮＳから由来する富化されたエクソソームからＣＮＳ由来神経性バイオマーカーを検出及び／又は定量することができ、その結果がＡＤ、ＰＤ及びプリオン病等の神経性疾患の検出に有益であることをも発見した。これら末梢体液に基づくＣＮＳ特異的マーカーを、鑑別診断、疾患進行のモニタリング、及び／又はＣＮＳ疾患の治療効果の客観的評価のために用いることも可能である。

本発明は、対象の生体液からのＣＮＳ由来エクソソームを富化するための方法を目指すものである。該方法は、ＣＮＳ由来エクソソームを含有する生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ａ）と、生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを該免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｂ）と、固相結合されたエクソソームを該生体液から分離して該ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｃ）と、を含む。一実施形態において、ステップ（ａ）における抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、固相上に固定化する。本発明に適合した生体液は、血液、血清、血漿、唾液、及び尿液を含む。好適な生体液は、血液、血清、血漿、又は唾液である。

生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを具体的に富化するために、本発明は、免疫親和捕捉プロトコルを用いて対象の生体液からのＬ１ＣＡＭ含有エクソソームを単離する。Ｌ１ＣＡＭは、ＣＮＳから由来するエクソソームの表面上のマーカーである（Simpson et al., Journal of Extracellular Vesicles 1:18374, 2012）。Ｌ１ＣＡＭは、神経系で特異的に表現され、血球及び血小板を含む他の器官系においては表現がない（今までの報告）。例えば、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、特異的なものであり、ＮＣＡＭの様に免疫系のＮＫおよびＮＫＴ細胞には結合しない（Fiandaca et al., Alzheimer's Dementia, S1552-5260(14)02469-8, 2014）ので、免疫細胞又は他の器官系から由来するエクソソームを非特異的に捕捉しない。

ＣＮＳ由来エクソソーム捕捉用抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、或いは、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）₂フラグメント等のＬ１ＣＡＭ抗原結合領域を含む抗体フラグメントであってもよい。
抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、固相上に固定化できる。或いは、生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームに接触して免疫複合体を形成する際に、液相中に存在し、その後、抗Ｌ１ＣＡＭ結合されたエクソソームを、抗Ｌ１ＣＡＭを捕捉可能な試薬を固定化した固相に結合する。

１つの好適な実施形態において、抗Ｌ１ＣＡＭは、生体液に接触する時、固相に結合する。試薬を固相に固定化させる方法は、免疫化学によくあるものであり、固相と試薬との間での共有、疎水又は静電結合の形成を含む。抗Ｌ１ＣＡＭは、固相上に直接固定化することができる。オプションとして、抗Ｌ１ＣＡＭは、結合対を介して固相上に間接固定化してもよい。例えば、結合対の第１メンバー（例えば、ストレプトアビジン、フルオレセイン抗体等）は、まず、固体表面への吸収により、或いは、固体表面上に被覆されたアミノプロピルシランに共有結合することにより固定化できる。それから、結合対の第２メンバー（例えば、ビオチン、フルオレセイン等）で標識された抗Ｌ１ＣＡＭは、ビオチン−ストレプトアビジン又はフルオレセインとフルオレセイン抗体（結合対）の結合により、固体表面に結合できる。

ＣＮＳ由来エクソソームがＬ１ＣＡＭと抗Ｌ１ＣＡＭの免疫複合体を介して固相によって特異的に捕捉された後、該エクソソームを生体液から分離してＣＮＳ由来エクソソームを富化する。固相結合されたエクソソームは、直接使用されてもよいし、更なる使用及び／又は測定のために、固相から溶出されてもよい。
本発明の免疫捕捉方法で調製された生体液におけるＬ１ＣＡＭ含有エクソソームは、電子顕微鏡法又は他の測定法により示したように、従来の「ゴールドスタンダード」である超遠心分離プラス密度勾配を含む他のエクソソーム単離技術によって得られたものと同品質であることが示される。超遠心分離が本プロトコルに関与しないため、本発明の方法は、更なる最適化の後、日常的臨床設定用途により適用される。そのうえ、超遠心分離は、ＣＮＳのみから由来するエクソソームについて特異性を提供していない。

発明者は、生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームに含有されるバイオマーカーの測定は、神経性疾患の検出に有益であることを発見した。該バイオマーカーはタンパク質であってもよいし、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸であってもよい。例えば、ＣＮＳ由来エクソソームにおけるα−ｓｙｎ又はリン酸化α−ｓｙｎ（例えば、セリン１２９−α−ｓｙｎ、残基セリン−１２９又はｐｓ１２９におけるα−ｓｙｎのリン酸化）はＰＤ用バイオマーカーである。ＣＮＳ由来エクソソームにおけるタウ又はリン酸化タウ、例えば、ｐ−ｔａｕ １８１は、ＡＤのバイオマーカーである。ＣＮＳ由来エクソソームにおけるプリオンタンパク質又はリン酸化プリオンタンパク質は、クロイツフェルト・ヤコブ病等のプリオン病のバイオマーカーである。

ＡＤ用バイオマーカーとしてＣＮＳ由来エクソソームに含有されるＲＮＡは、遺伝子ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＲ、ＲＧＳ２、ＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２−ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１に関連するものを含む。

また、ＰＤ用バイオマーカーとしてＣＮＳ由来エクソソームに含有されるＲＮＡは、遺伝子ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１−ＲＤＨ５に関連するものを含む。

タンパク質バイオマーカーは、固相上に捕捉される同時に、或いは、固相から溶出された後、富化されたエクソソームにて測定されることができる。エクソソームの表面上に露出するタンパク質バイオマーカーの場合、エクソソームを溶解せずに測定されることができる。エクソソーム内に含有されるタンパク質バイオマーカーの場合、エクソソームを溶解した後に測定できる。タンパク質バイオマーカーは、当業者に知られるいずれかの方法で測定できる。ＥＬＩＳＡ、ルミネックス、及びつい最近になって、クァンテリクス等の免疫検定法は、タンパク質バイオマーカーを測定するために好適な方法である。

核酸バイオマーカーの場合、捕捉されたエクソソームは、核酸バイオマーカーを測定する前に溶解される必要がある。核酸は、当業者に知られるいずれかの方法、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ検査、或いは、いずれかの既知配列測定方法で検出されることができる。

本発明は、対象における神経性疾患の検出のため、或いは、鑑別診断のための方法をも目指している。該方法は、対象からの血液、血清、血漿、唾液、又は尿液である生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ａ）と、生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを該免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｂ）と、固相結合されたエクソソームを該生体液から分離して該ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｃ）と、富化されたＣＮＳ由来エクソソームからのバイオマーカーのレベルを決定するステップ（ｄ）と、を含む。該対象におけるＣＮＳ由来エクソソームからのバイオマーカーのレベルが、正常対象（検出用）から、或いは、他の神経性疾患を持つ対象（鑑別診断用）からの対照レベルと比べて高くなる場合は、該対象が神経性疾患（例えば、ＡＤ、ＰＤ又はプリオン病）を持つことを示す。一実施形態において、該バイオマーカーはα−ｓｙｎ又はリン酸化α−ｓｙｎであり、該神経性疾患はＰＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはタウ、リン酸化タウ又はＡβ類であり、該神経性疾患はＡＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはプリオンタンパク質であり、該神経性疾患はプリオン病である。

本発明は、さらに、対象における神経性疾患の進行をモニタリングするための方法をも目指している。該方法は、対象から血液、血清、血漿、唾液、又は尿液である生体液のサンプルを異なる時点（例えば、零点、６ヶ月、１年、又は２年）で取得するステップ（ａ）と、各サンプルを抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ｂ）と、各生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを該免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｃ）と、固相結合されたエクソソームを各サンプルから分離して該ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｄ）と、各サンプルからの富化されたＣＮＳ由来エクソソームにおけるバイオマーカーのレベルを決定するステップ（ｅ）と、を含む。後時点の該サンプルのレベルが高くなることは、該疾患が進行していることを示す。一実施形態において、該バイオマーカーはα−ｓｙｎ又はリン酸化α−ｓｙｎであり、該神経性疾患はＰＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはタウ、リン酸化タウ又はＡβ類であり、該神経性疾患はＡＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはプリオンタンパク質又はリン酸化プリオンタンパク質であり、該神経性疾患はプリオン病である。

本発明は、さらに、対象における神経性疾患の薬物治療をモニタリングするための方法をも目指している。該方法は、対象から血液、血清、血漿、唾液、又は尿液である生体液のサンプルを薬物治療前および薬物治療後に取得するステップ（ａ）と、各サンプルを抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ｂ）と、各生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを該免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｃ）と、固相結合されたエクソソームを各サンプルから分離して該ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｄ）と、各サンプルからの富化されたＣＮＳ由来エクソソームにおけるバイオマーカーのレベルを決定するステップ（ｅ）と、を含む。薬物治療後のサンプルにおけるレベルが低くなる場合は、該薬物治療が有効であることを示す。一実施形態において、該バイオマーカーはα−ｓｙｎ又はリン酸化α−ｓｙｎであり、該神経性疾患はＰＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはタウ、リン酸化タウ又はＡβ類であり、該神経性疾患はＡＤである。他の一実施形態において、該バイオマーカーはプリオンタンパク質又はリン酸化プリオンタンパク質であり、該神経性疾患はプリオン病である。

本発明の対象は、ヒト、ウマ、イヌ等の哺乳類対象であり、ヒトが好適な対象である。
以下の実施例が本発明をさらに例示する。これら実施例は、本発明の一例に過ぎず、本発明を限定していると解してはならない。

実施例１：エクソソーム単離
タウロ（Tauro）ら（Methods 56: 293-304, 2012）によるプロトコルに従って、抗体被覆超常磁性マイクロビーズを用いてエクソソームをマウス又はヒト血漿から単離した。簡単にいえば、メーカーの説明に基づいて、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ^ョ抗体結合キット（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて１０μｇの抗Ｌ１ＣＡＭ抗体（クローンＵＪ１２７、アブカム、ケンブリッジ、ＭＡ、ＵＳＡ）、又は抗ＣＤ６３抗体（クローンＨ５Ｃ６、ＢＤバイオサイエンス、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）、又は正常マウスＩｇＧ（サンタクルーズバイオテクノロジー、ダラス、ＴＸ、ＵＳＡ）を陰性対照として１セット（１ｍｇ）のＭ−２７０エポキシビーズ上に被覆した。３７℃で速やかに（２分間内）解凍した後、血漿サンプル（＞３００μＬ）を２，０００×ｇにて１５分間遠心分離してから１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離し、それから上澄液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）により１：３で希釈した。１セットの抗体被覆ビーズと９００μＬの希釈血漿とを緩やかに回転させながら４℃で２４時間程度インキュベートした。そして、該ビーズを１ｍＬの０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４回洗浄して新規チューブに移す。

電子顕微鏡結像のために、６０μＬの０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と固定バッファ（４％パラホルムアルデヒド／５％グルタルアルデヒド）との１：１混合物によりエクソソームをビーズから溶出した。或いは、ルミネックス測定及び他の分析のために、ビーズを緩やかに振りながら、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）における１１０μＬの１％トリトンＸ−１００及び１０％のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ２７１４、シグマアルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ；１０ｍｌのＨ₂Ｏにて用意される）にて室温で１時間インキュベートすることにより、エクソソームを溶解した。

臨床血漿サンプルにおけるエクソソームをバッチで抽出し、ＰＤ及び対照サンプルを各バッチに分散した。３０名の健常対照者からプールされた２つの参照血漿サンプルを各バッチに加えてバッチ変動の解消を援助する。
品質管理及び検定開発のために、一部の参照血漿サンプル（年取った健常対照者からプールされた）をもＰＢＳにて希釈し、そして超遠心分離（１００，０００×ｇにて４℃で３時間）を与える。それから、ペレットを再懸濁し、ＯｐｔｉＰｒｅｐ^TM密度勾配にロードし、１００，０００×ｇにて４℃で１８時間遠心分離して、タウロらの述べたようなエクソソーム（上記参照）を取得する。２ステップの超遠心分離（１８０，０００×ｇにて４℃で３時間×２）の後にエクソソームを取り除くことで貧エクソソーム血漿サンプルを用意した。

実施例２：ヒト血漿からの抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉エクソソームの特徴付け
ルミネックスアッセイ
１００μＬのエクソソーム調剤（３００μＬの血漿から抽出された）は、既定のルミネックスプロトコル（Brain 133:713-726, 2010）によりα−ｓｙｎを定量化することに用いられる。

電子顕微鏡法
４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド及び５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドと１：１で混合した単離エクソソーム調剤は、フォルムバール／炭素被覆３００メッシュ銅グリット（ポリサイエンス、ウォリントン、ＰＡ、ＵＳＡ）に積層され、室温で２０分間乾燥することが許可された。それから、直接写像のために、グリッドを水で２分間、２回洗浄し、水における２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル（電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて室温で２０分間染色した。免疫金染色のために、１％ＢＳＡ／５％正常ヤギ血清／ＰＢＳバッファを用いて３０分間ブロッキングする前に、グリッドをＰＢＳで洗浄した。該グリッドをＰＢＳで再洗浄し、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体の１：５０希釈液（アブカム）を用い又は用いずにブロッキングバッファにて室温で２時間インキュベートし、そして、１８−ｎｍゴールドコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（アブカム）により室温で６０分間インキュベートした。該グリッドを再び洗浄して、酢酸ウラニルと対照する前に、乾燥のために室温で放置した。ＪＥＯＬ（ピーボディ、ＭＡ、ＵＳＡ）１２３０透過型電子顕微鏡で結像した。

ウェスタンブロット解析
標準プロトコルに従ってウェスタンブロッティングを実行した。エクソソームサンプル（〜１０μｇタンパク質）をポリビニルデンジフルオリドメンブレンに移転する前に、レムリサンプルバッファで可溶化し、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。該メンブレンをマウス抗ヒトＬ１ＣＡＭ（アブカム、１：５００）とマウス抗ヒトＡｌｉｘ（Ｃａｔ＃ ＡＢＣ４０、ミリポア、ビレリカ、ＭＡ、ＵＳＡ；１：１０００）といった一次抗体で探査した。
ヒト血球におけるＬ１ＣＡＭの表現を検査するために、赤血球及び血小板からの細胞溶解物（１００μｇタンパク質）とともに、対照とするヒト大脳皮質（１００μｇタンパク質）ホモジネートを用いた。メンブレンを抗Ｌ１ＣＡＭ抗体で探査した。

結果
図１（ａ）は、抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉血漿エクソソームの電子顕微鏡写真（インセット：Ｌ１ＣＡＭの免疫金標識）を示す。図１（ｂ）のウェスタンブロットは、Ａｌｉｘ（共通のエクソソームマーカーである）及びＬ１ＣＡＭは、正常ＩｇＧ捕捉よりも、抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉で富化されたことを示す。

図１（ｃ）は、抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉血漿エクソソームにおけるα−ｓｙｎレベルが、正常マウスＩｇＧ捕捉（ｍＩｇＧ）血漿エクソソーム又は「空捕捉」（ビード無し）血漿エクソソームにおけるレベルよりも高いことを示す。抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉血漿エクソソームにおけるα−ｓｙｎシグナルは、自由なα−ｓｙｎ汚物から発生するおそれがなく、正常マウスＩｇＧ捕捉又は「空捕捉」サンプルからのシグナルが最小限であることがその原因である。

α−ｓｙｎシグナルがエクソソームから発生したとさらに確認するために、超遠心分離を用いて貧エクソソーム血漿を生成した。正規の血漿と比べ、該貧エクソソーム血漿におけるＬ１ＣＡＭ含有エクソソームのα−ｓｙｎシグナルは、１０倍よりも低くなった（図１ｄ）。
血球におけるＬ１ＣＡＭ表現をも検査し、その結果から、Ｌ１ＣＡＭが赤血球及び血小板において検出不能であることが示される。

実施例３：臨床サンプルにおける血漿エクソソーム的α−ｓｙｎの評価
大集団の２６７名のＰＤと２１５名の年齢上及び性別上一致した健常対照者の血漿サンプルを集め、それらの血漿Ｌ１ＣＡＭ含有エクソソーム及び全血漿におけるα−ｓｙｎ濃度をルミネックスアッセイ（実施例１を参照）を用いて測定した。その結果を図２に示す。図２ａは、ＰＤを持つ患者は健常対照者（ｐ＜０．０００１）に比べ、血漿Ｌ１ＣＡＭ含有エクソソームにおけるα−ｓｙｎ濃度が著しく高いことを示す。
図２ｂは、ＰＤ ｖｓ．対照者（ｐ＝０．１３４、ｔ検定）における全血漿α−ｓｙｎ濃度に大差がないことを示す。

Ｌ１ＣＡＭ含有エクソソームにおける血漿α−ｓｙｎのＰＤ診断を援助する可能性をさらに評価するために、２６７名のＰＤを持つ患者及び２１５名の健常対象者について分析用ＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を生成し、それによって、ＰＤを健常対照対象から鑑別することを、それらの感度及び特異度が特徴付けた。血漿エクソソーマルα−ｓｙｎの性能が安定している（ＡＵＣ＝０．６５４、感度＝７０．１％、特異度＝５２．９％）ことを発見した（図３Ａ）。利用可能なＣＳＦサンプルを有する対象のサブセット（１００名のＰＤ及び１００名の対照者）にもＲＯＣ分析が実行された。図３Ｂは、ＣＳＦ全α−ｓｙｎが０．７２４（感度＝７６．８％、特異度＝５３．５％）のＡＵＣを提供することを示す。以上の結果から、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎと、今まで説明したＰＤの最良な分子バイオマーカーである（Mollenhauer et al., Exp Neurol 213 (2):315-325, 2008）ＣＳＦ全α−ｓｙｎとを比較する場合、本質的に同等の診断性能（感度及び特異度）を実現していることが表明される。

さらに、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎとＰＤ疾患重症度との間の相関関係を調べた。血漿Ｌ１ＣＡＭ含有エクソソームにおけるα−ｓｙｎ（ｒ＝０．１７６、ｐ＝０．００４、ピアソン相関；図３Ｃを参照）、又は血漿エクソソーマル／全α−ｓｙｎ比（ｒ＝０．１３０、ｐ＝０．０３５）とＵＰＤＲＳ運動スコアとの間で重要な相関関係が観察された。その結果から、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎが疾患重症度（ＵＰＤＲＳ運動）とは弱いものの重要な相関関係を表示していることが示され、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎが疾患進行のモニタリング又は予測に役立つことが表される。この目的のために、ＰＤ重症度に関連する該相関関係が、ＣＳＦα−ｓｙにおいては若干のグループ（例えば、Hong et al, Brain, 133:713-26, 2010）に観察されていないことが強調されるべきである。このため、ＣＳＦα−ｓｙよりも、血漿エクソソーマルα−ｓｙｎの方がより良好にＰＤ重症度に関連付けられており、ＰＤ進行にもより良好に関連付けられるかもしれない。

実施例４：抗Ｌ１ＣＡＭ富化されたエクソソームにおけるタウの測定
¹²⁵Ｉ−標識タウ２Ｎ４Ｒ（Ｉ−Ｉａｕ）をマウスに脳室内注入した。それから、注入後２，５，１０，２０，及び６０分で脳及び血漿を収集した。脳（図４Ａ）及び血漿（図４Ｂ）における放射能のレベルをガンマカウンタを用いて決定した。その結果から、タウが脳から血液に移転したことが示される。

注入後６０分で血液を収集した後、乏血小板血漿からＬ１ＣＡＭ含有エクソソームを抽出した（実施例１を参照）。全血漿、エクソソーム部分（Ｅｘｏ）、及びエクソソーム欠如部分（免疫親和捕捉後の上澄液）にて放射能のレベルを測定した。放射性タウ（ｃｐｍ／μＬ血漿）の結果がエクソソーム部分及び上澄液部分にて現れる（図４Ｃ）。この結果から、ＡＤ用の主要マーカーであるタウは、抗Ｌ１ＣＡＭで富化されたエクソソームにおいて対照エクソソーム（空エクソソーム又はマウス−ＩｇＧ接着エクソソーム）よりも良く検出可能であることが示される。タウ類はヒト血液においても容易に検出できる（データ未掲載）。

実施例５：ヒト唾液にて検出されたＬ１ＣＡＭ
デビック（Devic）らの述べた手順（Brain. 134(Pt 7):el78. doi: 10.1093/brain/awr015. Epub 2011 Feb 24）に基づいて正常対象からのヒト唾液を収集した。簡単には、既存の健康上の懸念を持たない個人から唾液サンプルを午前９時から１１時まで収集した。不溶性物質及びデブリを取り除くために、サンプルを１５，０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。１０％（ｖ／ｖ）プロテアーゼ阻害剤カクテルをすぐに上澄液に添加し、そして、氷の上にタンパク質を２０％（ｖ／ｖ）のＴＣＡで１時間沈降させた。この混合物を１５，０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。上澄液を取り除いてペレットを氷みたいに冷たいアセトンで２回洗浄した。ＢＳＡを基準としながらタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質検定用キット（サーモサイエンティフィックピアス）により検定し、そして、サンプルを分析までに−２０℃で保存した。実施例１で説明したプロトコルに基づいて、上澄液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体被覆ビーズ又は正常マウスＩｇＧ被覆ビーズ（陰性対照）でインキュベートした。

実施例２で説明したプロトコルに基づいて、捕捉されたエクソソームをウェスタンブロット分析のために溶解した。メンブレンをマウス抗ヒトＡｌｉｘで探査した。Ａｌｉｘ（共通のエクソソームマーカー）は、明らかなように抗Ｌ１ＣＡＭで捕捉されたエクソソームにて９５キロダルトン（ｋＤａ）といった予想通りの分子量で検出できたが、正常マウスＩｇＧ（陰性対照）で捕捉されたエクソソームにて検出できなかった。それぞれ５０ｋＤａと２５ｋＤａといった適切な分子量を有する既存の重鎖及び軽鎖のヒトＩｇＧを除き、非特異的バンドがほかには一切ない。

抗Ｌ１ＣＡＭ捕捉されたエクソソームにおいて、α−ｓｙｎを実施例３で説明したルミネックス方法によっても検出できるが、ヒト唾液におけるα−ｓｙｎ検定において最適化された（Devic et al Brain 2011 Jul;134(Pt 7):e178.doi 10.1093/brain/awr015. Epub 2011 Feb 24）。

実施例６：Ｌ１ＣＡＭエクソソームから抽出された核酸
ＣＮＳ由来核酸を単離するために、実施例１で説明した方法に基づいて、Ｌ１ＣＡＭエクソソームを合計７２名の対象（２４名がＡＤを持ち、２４名がＰＤを持ち、２４名が年齢上一致した健常対照者である）の血漿から富化した。ＲＮＡシーケンス分析の前に各カテゴリ（ＡＤ、ＰＤ、及び健常対照者）を３つの小プール（ｎ＝８／グループ）に分けた。

Ｌ１ＣＡＭエクソソームから核酸を抽出した。単一細胞ＲＮＡシーケンスプロトコル（Tang et al, Nat. Protoc.5, 516−535, 2010）に従って、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。これらｃＤＮＡをユニバーサルプライマーにより約５０〜８０ナノグラムに前置増幅した。
コバリスＳ２システムによるｃＤＮＡ断片化の後、断片化したｃＤＮＡをＤＮＡライブラリ構築キット（ＮＥＢ＃Ｅ７３７０Ｌ）によるライブラリ構築に応用した。

３つのプールにおいて識別された遺伝子を比較することで、ＡＤサンプルにおいて唯一に識別され、ＰＤ又は健常対照サンプルにおいて識別されなかった遺伝子が５８個ある。これら５８個の遺伝子は、それぞれ、ＵＢＡＰ２Ｌ、ＹＢＸ１、ＳＥＲＦ２、ＵＢＥ２Ｂ、ＲＰＬ１０Ａ、Ｈ３Ｆ３ＡＰ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＮＭＤ３、ＲＮＦ７、ＲＰＬＰ０、ＳＰＡＲＣ、ＷＴＡＰ、ＨＮＲＮＰＵ、ＬＩＮＣ００２６５、ＩＮＭＴ、ＳＬＣ３５Ｅ２、ＣＴ６０、ＳＹＮＣＲＩＰ、ＲＧＳ２、ＰＳＭＣ６、ＡＲＳＡ、ＳＰＤＹＥ７Ｐ、ＳＭＩＭ１７、ＴＲＡＦ３ＩＰ２−ＡＳ１、ＫＣＮＣ２、ＳＬＣ２４Ａ１、ＨＬＣＳ、ＧＯＳＲ１、ＭＮ１、ＭＧＡＴ５、ＮＢＰＦ１４、ＦＢＸＯ３１、ＷＤＲ５２、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＺＮＦ６４８、ＮＢＰＦ１６、ＰＡＧＲ１、ＡＱＰ２、ＰＲＫＣＩ、ＳＣＮ２Ｂ、ＤＰＹＳＬ３、ＴＭＥＭ２６、ＴＳＰＡＮ１１、ＥＬＬ２、ＦＡＭ１８６Ａ、ＣＤ５９、ＴＨＳＤ４、ＧＯＬＧＡ６Ｂ、ＡＲＨＧＥＦ５、ＰＫＤ１、ＢＰＴＦ、ＦＬＧ、ＰＯＭ１２１Ｌ１０Ｐ、ＮＸＰＨ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＧＧＣＸ、及びＧＲＥＢ１である。

ＰＤサンプルにおいて唯一に識別され、ＡＤ又は健常対照サンプルにおいて識別されなかった遺伝子が２５個ある。これら２５個の遺伝子は、それぞれ、ＢＬＯＣ１Ｓ１、ＵＢＥ２Ｌ３、ＲＮＦ１４９、ＦＡＭ８９Ｂ、ＬＣＥ６Ａ、ＮＴ５ＤＣ２、ＰＰＰ１ＣＣ、ＣＣＬ５、ＨＤＬＢＰ、ＨＮＲＮＰＡＢ、ＮＸＮ、ＳＬＣ９Ａ４、ＥＩＦ２ＡＫ１、ＰＡＰＯＬＡ、ＴＲＩＭ５０、ＳＩＸ４、ＲＡＢ３ＩＰ、ＶＡＮＧＬ２、ＤＨＲＳＸ、ＦＯＸＰ４、ＳＹＮＭ、ＺＮＦ５４３、ＡＴＦ６、ＬＯＣ１００１３２８３２、及びＢＬＯＣ１Ｓ１-ＲＤＨ５である。

以上で本発明の好適な実施形態について説明したこと、及び本発明の範囲から逸脱せずに本発明に対する変形が可能であることが理解されるべきである。

Claims (11)

1. ＣＮＳ由来エクソソームを含有する、血液、血清、血漿、又は唾液である生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ａ）と、
   前記生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを前記免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｂ）と、
   固相結合されたエクソソームを前記生体液から分離して前記ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｃ）と、
   を含む生体液からＣＮＳ由来エクソソームを富化する方法。
2. ステップ（ａ）における前記抗Ｌ１ＣＡＭ抗体は、固相上に固定される請求項１に記載の方法。
3. 結合されたエクソソームを前記固相から溶出するステップ（ｄ）、をさらに含む請求項１に記載の方法。
4. 血液、血清、血漿、又は唾液である生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ａ）と、
   前記生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを前記免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｂ）と、
   結合されたエクソソームを前記生体液から分離するステップ（ｃ）と、
   ステップ（ｃ）のエクソソームからのＣＮＳ由来バイオマーカーのレベルを決定するステップ（ｄ）と、を含み、
   前記バイオマーカーは核酸又はタンパク質である、体液における神経性疾患用のＣＮＳ由来バイオマーカーを検出する方法。
5. 前記神経性疾患はパーキンソン病であり、前記バイオマーカーはα−シヌクレイン又はリン酸化α−シヌクレインである請求項４に記載の方法。
6. 前記神経性疾患はアルツハイマー病であり、前記バイオマーカーはタウ又はリン酸化タウである請求項４に記載の方法。
7. 前記神経性疾患はプリオン病であり、前記バイオマーカーはプリオンタンパク質である請求項４に記載の方法。
8. 対象からの血液、血清、血漿、又は唾液である生体液を抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と接触させて免疫複合体を形成するステップ（ａ）と、
   前記生体液におけるＣＮＳ由来エクソソームを前記免疫複合体を介して固相に結合するステップ（ｂ）と、
   固相結合されたエクソソームを前記生体液から分離して前記ＣＮＳ由来エクソソームを富化するステップ（ｃ）と、
   富化されたＣＮＳ由来エクソソームからのバイオマーカーのレベルを決定するステップ（ｄ）と、を含み、
   前記対象におけるＣＮＳ由来エクソソームからの前記バイオマーカーのレベルが、前記神経性疾患を持たない対象からの対照レベルと比べて高くなる場合、前記対象は前記神経性疾患を持つことを表す、対象における神経性疾患を検出するための方法。
9. 前記神経性疾患はパーキンソン病であり、前記バイオマーカーはα−シヌクレイン又はリン酸化α−シヌクレインである請求項８に記載の方法。
10. 前記神経性疾患はアルツハイマー病であり、前記バイオマーカーはタウ又はリン酸化タウである請求項８に記載の方法。
11. 前記神経性疾患はプリオン病であり、前記バイオマーカーはプリオンタンパク質である請求項８に記載の方法。

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