WO2021107155A1 - パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置 - Google Patents

パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置 Download PDF

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phosphatidylserine
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西部　隆宏
直子 今若
平安　一成
亮 請川
宏大 笹本
哲 小野寺
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富士フイルム和光純薬株式会社
富士フイルムワコーシバヤギ株式会社
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    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Definitions

  • the present invention relates to methods, biomarkers, reagent kits and devices that assist in the diagnosis of Parkinson's disease.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease in which nerve cells existing in the substantia nigra in the brain are degenerated and the striatal dopamine is deficient, resulting in the inability to move smoothly.
  • the prevalence of Parkinson's disease is as high as 100 to 150 per 100,000, and the prevalence increases with aging, so the number of patients is rapidly increasing with the aging of the population.
  • Parkinson's disease there is no cure for Parkinson's disease, but it is possible to improve motor symptoms by administering dopamine precursor therapeutic agents such as levodopa (L-Dopa) and dopamine agonists to supplement the reduced dopaminergic effect in the brain.
  • dopamine precursor therapeutic agents such as levodopa (L-Dopa) and dopamine agonists to supplement the reduced dopaminergic effect in the brain.
  • L-Dopa levodopa
  • dopamine agonists to supplement the reduced dopaminergic effect in the brain. Therefore, there is a need for a biomarker that can objectively determine the pathophysiology of Parkinson's disease.
  • Non-Patent Document 1 As a method for diagnosing Parkinson's disease, nerve-derived extracellular vesicles in blood are concentrated using an anti-NCAM antibody or an anti-L1CAM antibody, and Parkinson's disease is determined using ⁇ -synuclein or the like contained in the extracellular vesicles as an index.
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2.
  • the method of diagnosing Parkinson's disease using nerve-derived extracellular vesicles in blood as an index requires an operation of affinity-concentrating nerve-derived extracellular vesicles from a sample, which is complicated.
  • an error is likely to occur between the assays, and it is difficult to apply it to the measurement of multiple samples.
  • the present invention relates to the following methods, biomarkers, reagent kits and devices for assisting the diagnosis of Parkinson's disease.
  • the determination of Parkinson's disease is based on the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, or the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to [1], wherein the subject is determined to have Parkinson's disease when the ratio is equal to or less than a reference value.
  • the measurement of the amount of the extracellular vesicle is to measure the amount of the extracellular vesicle having the phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease by using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin as an index.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to [1] or [2], wherein the tetraspanin is selected from CD9, CD63, and CD81.
  • To measure the amount of the extracellular vesicle is to measure the amount of the extracellular vesicle having phosphatidylserine and tetraspanin. Measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin is performed using a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine and extracellularly having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin as an index, whichever is selected from [1] to [3].
  • the measurement of the amount of the extracellular vesicle is to measure the amount of the extracellular vesicle having the phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease using the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin as an index.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to any one selected from [1] to [5], wherein the biological sample is a blood sample or cerebrospinal fluid.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles is to measure the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease by using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin as an index.
  • the method of assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to [1] or [2], wherein the tetraspanin is CD9 or CD63.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles is to measure the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin. Measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin has said phosphatidylserine and tetraspanin using a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease by using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of the extracellular vesicles having tetraspanin as an index.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to any one of 1], [2] and [7].
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to [8], wherein the substance having an affinity for phosphatidylserine is a T cell immunoglobulin / mucin-containing protein.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles is to measure the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease is to determine that the subject has Parkinson's disease by using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin as an index.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease according to any one selected from [1] to [2] and [7] to [9], wherein the biological sample is a blood sample or cerebrospinal fluid.
  • the determination of Parkinson's disease is based on the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin as an index, and the subject has Parkinson's disease and cognitive symptoms.
  • the diagnosis of Parkinson's disease according to any one selected from [1] to [2] and [7] to [10], which is to determine which of the Parkinson's diseases without the disease. How to assist.
  • a reagent kit for assisting diagnosis of Parkinson's disease which comprises a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine.
  • a biomarker for assisting the diagnosis of Parkinson's disease which comprises extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • a device for assisting the diagnosis of Parkinson's disease which has a determination unit for determining that the disease is.
  • a measuring unit for measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin in a biological sample derived from a subject It has an arithmetic unit that calculates the ratio of the amount of phosphatidylserine and extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin, and phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin.
  • a device for assisting the diagnosis of Parkinson's disease which has a determination unit for determining that the subject has Parkinson's disease using the ratio of the amount of extracellular vesicles as an index.
  • a biomarker set for assisting the diagnosis of Parkinson's disease which comprises extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the diagnosis of Parkinson's disease can be easily assisted.
  • FIG. 1 is a box whiskers graph in which plasma samples derived from Parkinson's disease patients without cognitive symptoms and plasma samples derived from healthy subjects were evaluated using the amount of exosomes having phosphatidylserine and CD9 as an index.
  • FIG. 2 is a box whiskers graph evaluating plasma samples derived from Parkinson's disease patients without cognitive symptoms and plasma samples derived from healthy subjects using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of exosomes having CD9 to the amount of extracellular vesicles having CD9 as an index. is there.
  • FIG. 1 is a box whiskers graph in which plasma samples derived from Parkinson's disease patients without cognitive symptoms and plasma samples derived from healthy subjects were evaluated using the amount of exosomes having phosphatidylserine and CD9 as an index. is there.
  • FIG. 2 is a box whiskers graph evaluating plasma samples derived from Parkinson's disease patients without cognitive symptoms and plasma samples derived from healthy subjects using the ratio of the amount of phosphatid
  • FIG. 3 shows a plasma sample derived from a Parkinson's disease patient without cognitive symptoms, a plasma sample derived from a Parkinson's disease patient with cognitive symptoms, and healthy using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of exosomes having CD9 to the amount of extracellular vesicles having CD9 as an index. It is a box whiskers graph which evaluated the plasma sample derived from a person.
  • FIG. 4 is a box-and-whisker graph in which plasma samples derived from Parkinson's disease patients and plasma samples derived from healthy subjects were evaluated using the amount of exosomes having phosphatidylserine and CD9 as an index.
  • 5 is a box whiskers graph in which plasma samples derived from Parkinson's disease patients and plasma samples derived from healthy subjects were evaluated using the ratio of the amounts of phosphatidylserine and exosomes having CD9 to the amount of extracellular vesicles having CD9 as an index.
  • Extracellular vesicles are small membrane vesicles derived from cells and composed of lipid bilayer membranes.
  • the extracellular vesicle include those having a diameter of 20 nm to 1000 nm, preferably those having a diameter of 50 nm to 800 nm, more preferably 50 nm to 500 nm, and particularly preferably 50 nm to 200 nm.
  • Examples of the extracellular vesicles include Nature Reviews Immunology 9, 581-593 (March 2009), "Obesity Research" Vol. 13 No. 2 2007 Topics As described in Naoto Aoki and others, those classified in various ways according to their origin and the size of small membrane vesicles can be mentioned.
  • exosomes include exosomes, microvesicles, ectosomes, membrane particles, exosome-like vesicles, apoptotic bodies, adiposomes and the like, with exosomes and vesicles being preferred, and exosomes being more preferred.
  • the exosome is a cell-derived small membrane vesicle composed of a lipid bilayer membrane, and examples thereof include those having a diameter of 50 nm to 200 nm, preferably 50 nm to 150 nm, and 50 nm to 100 nm. The one is more preferable. Exosomes are thought to be derived from late endosomes.
  • the microvesicles are cell-derived small membrane vesicles composed of a lipid bilayer membrane, and examples thereof include those having a diameter of 100 nm to 1000 nm, preferably 100 nm to 800 nm, and 100 nm to 500 nm. Is more preferable.
  • the microvesicles are thought to be derived from the cell membrane.
  • the extracellular vesicle may be contained in a biological sample derived from a subject or isolated from a biological sample derived from a subject, and may be isolated from a biological sample derived from a subject. It is preferable that the sample is made.
  • the biological sample derived from the subject may be any biological sample that can contain extracellular vesicles, for example, blood-derived samples such as serum, plasma, whole blood, and buffy coat, cerebrospinal fluid, urine, saliva, and semen. , Chest exudate, tears, sputum, mucus, lymph, ascites, pleural fluid, sheep water, bladder lavage fluid, bronchial alveolar lavage fluid, and other body fluid samples, including blood-derived samples and cerebrospinal fluid, preferably serum, plasma, and brain. Cerebrospinal fluid is more preferable, serum and plasma are more preferable, and plasma is particularly preferable. In addition, blood-derived samples are more useful because the burden of sampling on the subject is light.
  • blood-derived samples are more useful because the burden of sampling on the subject is light.
  • the biological sample derived from the subject for example, even if it is directly collected from the subject, has undergone pretreatment such as recovery, concentration, purification, isolation, dilution with a buffer solution, and filtration sterilization. You may. These pretreatments may be appropriately performed according to a conventional method.
  • the biological sample derived from the subject may be abbreviated as "biological sample”.
  • the method for isolating extracellular vesicles from the biological sample may be carried out according to a conventional method, and is not particularly limited.
  • Examples of the method for isolating extracellular vesicles from the biological sample include an affinity method (for example, PS affinity method), a fractional centrifugation method (for example, a pellet-down method, a chromatographic method, a density gradient centrifugation method, etc.).
  • Ultracentrifugation immunoprecipitation, chromatography (eg ion exchange chromatography, gel permeation chromatography), density gradient method (eg sucrose density gradient method), electrophoresis (eg organella electrophoresis) Method), magnetic separation method (for example, magnetically activated cell sorting (MACS) method), ultracentrifugation concentration method (for example, nanomembrane ultracentrifugation concentration method), percor gradient isolation method, method using a microfluidic device. , PEG precipitation method, etc., and the affinity method is preferable because extracellular vesicles having a high degree of purification can be obtained, or the fractional centrifugation method is preferable because theoretically unbiased recovery is possible.
  • chromatography eg ion exchange chromatography, gel permeation chromatography
  • density gradient method eg sucrose density gradient method
  • electrophoresis eg organella electrophoresis
  • magnetic separation method for example, magnetically activated cell sorting (
  • the ultracentrifugation method is more preferable, and the affinity method is particularly preferable.
  • the affinity methods the PS affinity method, which is an affinity purification for phosphatidylserine, is preferable.
  • the affinity method and the fractional centrifugation method may be performed according to, for example, the method described in WO2016 / 0886689. As these isolation methods, only one kind may be used, or two or more kinds may be combined. In addition, isolation by one isolation method may be repeated twice or more.
  • the subject is not particularly limited, and for example, a person diagnosed with Parkinson's disease based on the diagnostic criteria, a person diagnosed with the risk of developing Parkinson's disease based on the diagnostic criteria, and a person diagnosed with Parkinson's disease.
  • Those who have not, those who have not been diagnosed with Parkinson's disease based on diagnostic criteria, or those who have not been diagnosed as at risk of developing Parkinson's disease based on diagnostic criteria include those who have not been diagnosed with Parkinson's disease based on diagnostic criteria.
  • People who have been diagnosed with the disease, those who have been diagnosed at risk of developing Parkinson's disease based on diagnostic criteria, and those who have not been diagnosed with Parkinson's disease are preferred.
  • the diagnostic criteria include, for example, interviews, tests for Parkinson's disease biomarkers recommended by Parkinson's disease medical treatment guidelines such as MIBG myocardial scintigraphy and dopamine transporter scintigraphy, and tests for candidate substances for Parkinson's disease biomarkers. Based on the results of the above, there are diagnostic criteria and the like used when diagnosing Parkinson's disease.
  • the present invention relates to methods, biomarkers, reagent kits and devices that assist in the diagnosis of Parkinson's disease.
  • a biomarker containing extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin is used, and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin is used as an index to determine that the subject has Parkinson's disease.
  • the first invention an extracellular vesicle having phosphatidylserine and tetraspanin, and a biomarker containing an extracellular vesicle having tetraspanin are used in combination, and the cell having the tetraspanin.
  • the subject is determined to have Parkinson's disease using the ratio of the amount of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles to the amount of external vesicles as an index (hereinafter, may be abbreviated as "second invention”). Is included.
  • the biomarker for assisting the diagnosis of Parkinson's disease in the first invention includes extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the extracellular vesicles in the PD marker are similar to those described above, as are the preferred ones.
  • the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD marker have at least one tetraspanin such as CD9, CD63, CD81, CD151 and phosphatidylserine which is a phospholipid on the membrane surface, and CD9, CD63, and CD81.
  • Those having at least one tetraspanin selected from CD9 and phosphatidylserine are preferable, those having at least one tetraspanin selected from CD9 and CD81 and phosphatidylserine are more preferable, and those having CD9 and phosphatidylserine are particularly preferable.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease in the first invention (hereinafter, may be abbreviated as "PD diagnosis assisting method”) is to measure the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample. This includes determining that the subject has Parkinson's disease by using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the biological sample as an index.
  • the biological sample, subject, and extracellular vesicle in the PD diagnosis assisting method are the same as those described above, and the preferred ones are also the same.
  • the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assisting method are the same as those described above in the PD marker, and the preferred ones are also the same.
  • the “amount” in the PD diagnosis assisting method includes mass and concentration. Further, the “amount” includes actually measured values having a correlation with mass and concentration (for example, absorbance, amount of change in absorbance, transmitted light, amount of change in transmitted light, fluorescence intensity, amount of change in fluorescence intensity, amount of light emission, change in amount of light emission). Amount, turbidity, turbidity change rate, scattered light, scattered light change rate, reflectance, reflectance change amount, refractive index, refractive index change amount, etc.) are also included.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method is only the amount of extracellular vesicles having one type of tetraspanin and phosphatidylserine (eg, extracellular vesicles having CD9 and phosphatidylserine).
  • the amount of extracellular vesicles having two or more tetraspanins and phosphatidylserine (eg, extracellular vesicles having CD9 and phosphatidylserine, and extracellular vesicles having CD81 and phosphatidylserine) May be measured, and it is preferable to measure only the amount of extracellular vesicles having one type of tetraspanin and phosphatidylserine.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assisting method is not particularly limited as long as it is a method usually performed in this field.
  • an immunological measurement method using a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine, a mass analysis method, a method combining these methods, or the like may be used.
  • an immunological measurement method using a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine is preferable.
  • the immunological measurement method includes a method using an immune reaction (antigen-antibody reaction) and a method using a binding force between two molecules other than the antigen-antibody reaction such as binding of a lectin and a protein (immunity).
  • a method based on the scientific measurement method) is also included.
  • the substance having an affinity for tetraspanin may be a substance that specifically binds to tetraspanin, for example, an antibody that specifically binds to tetraspanin or a sugar chain possessed by tetraspanin.
  • examples thereof include proteins that specifically bind to tetraspanin such as lectin that specifically binds to tetraspanin, and nucleic acids that specifically bind to tetraspanin. Proteins that specifically bind to tetraspanin are preferable, and proteins that specifically bind to tetraspanin are preferable. Antibodies that specifically bind are more preferred.
  • Examples of the antibody that specifically binds to tetraspanin include anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody, anti-CD151 antibody, and anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, and anti-CD81 antibody are preferable.
  • CD9 antibody and anti-CD81 antibody are more preferable, and anti-CD9 antibody is particularly preferable.
  • As the substance having an affinity for tetraspanin only one kind may be used, or two or more kinds may be used, and it is preferable to use only one kind.
  • the substance having an affinity for phosphatidylserine may be a substance that specifically binds to phosphatidylserine.
  • a protein that specifically binds to phosphatidylserine examples thereof include nucleic acids that specifically bind to phosphatidylserine, and proteins that specifically bind to phosphatidylserine are preferable.
  • the protein that specifically binds to phosphatidylserine include an antibody that specifically binds to phosphatidylserine and a phosphatidylserine-affinity protein, and a phosphatidylserine-affinity protein is preferable.
  • Examples of the antibody that specifically binds to phosphatidylserine include anti-phosphatidylserine antibody 1H6 (Merck Co., Ltd.).
  • Examples of the phosphatidylserine-affinitive protein include Tim1 (T-cell immunoglobulin / mutin domain-containing molecule 1, T-cell antibody / mucin-domain 1), Tim2 (T-cell immunoglobulin / mutin domain-containing molecule 2, T-cell).
  • Tim3 T-cell immunoglobulin / mutin domain-containing molecule 3, T-cell antibody-mucin-domain 3
  • Tim4 T-cell immunoglobulin / mutin domain-containing molecule 4, T-cell immunoglobulin
  • Tim protein anti-phosphatidylserine antibody
  • Annexin V Annexin V
  • Tim protein, anti-phosphatidylserine antibody are preferable, and Tim protein is more preferable.
  • Tim protein is more preferable.
  • Tim protein As the Tim protein, Tim1 and Tim4 are preferable, and Tim4 is more preferable.
  • the substance having an affinity for the phosphatidylserine only one kind may be used, or two or more kinds may be used, and it is preferable to use only one kind.
  • the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be a commercially available product or a substance appropriately prepared by a conventional method.
  • the antibody that specifically binds to the tetraspanin and the antibody that specifically binds to the phosphatidylserine may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and these may be used alone or in combination thereof. May be used.
  • the antibody that specifically binds to the tetraspanin and the antibody that specifically binds to the phosphatidylserine are not only the immunoglobulin molecule itself (intact immunoglobulin) but also a fragment thereof and the ability to bind to an antigen.
  • fragment antibodies such as Fab, F (ab') 2, F (ab'), single chain antibodies (single chain Fv), and synthetic antibodies such as diabody, tribody, and tetrabody, which are fragments having May be good.
  • these antibodies may be prepared according to the method described in, for example, "Immunoassay" (edited by Biochemical Measurement Study Group, Kodansha, 2014).
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for phosphatidylserine may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance include enzymes such as peroxidase, microperoxidase, and alkaline phosphatase, radioactive isotopes such as 99mTc, 131I, 125I, 14C, 3H, 32P, and 35S, fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 4-.
  • Fluorescent substances such as methylumveriferone, HiLyte, Alexa, CyDye or rhodamine, or derivatives thereof, luminescent substances such as luciferin, luminol, ruthenium complex, phenol, naphthol, or anthracene, or ultraviolet rays such as derivatives thereof.
  • Substances that have absorption into fluorescein substances that have properties as spin labeling agents typified by compounds having an oxyl group such as 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, gold colloids, Examples thereof include nanoparticles such as quantum dots, and enzymes and fluorescent substances are preferable.
  • the method for labeling the substance having an affinity for the tetraspanin and / or the substance having an affinity for the phosphatidylserine with the labeling substance is not particularly limited, and may be carried out according to a labeling method known per se.
  • the measurement of these labeling substances may be carried out according to a measurement method known per se according to the labeling substance.
  • the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine have either of these or one of them as the primary affinity substance, and specifically bind to the primary affinity substance 2
  • Secondary affinity substances eg, secondary antibodies
  • the secondary affinity substance may be labeled with a labeling substance, preferably labeled, and more preferably a secondary antibody labeled with the labeling substance.
  • labeling substance and the labeling method are the same as those described above, and the preferred ones are also the same.
  • labeling with a labeling substance is a substance having an affinity for the tetraspanin and / or a substance having an affinity for the phosphatidylserine to which one of avidins and biotins is bound, and a labeling substance.
  • the binding of avidins and biotins may be utilized by using the binding of the remaining one of avidins and biotins.
  • biotins include biotin, iminobiotin, desthiobiotin, biocitin, biotin sulfokide and the like, and biotin is preferable.
  • avidins include avidin, tamavidin, tamavidin 2, streptavidin and the like, and streptavidin is preferable.
  • the method of combining may be carried out according to a conventional method.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be immobilized on the solid phase, and the substance having an affinity for phosphatidylserine may be immobilized on the solid phase. It is preferably fixed.
  • solid phase examples include synthetic polymer compounds such as latex, polystyrene, polypropylene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, polyglycidyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyethylene, polychlorocarbonate, silicone resin, and silicone rubber.
  • synthetic polymer compounds such as latex, polystyrene, polypropylene, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyacrylamide, polyglycidyl methacrylate, polyvinyl chloride, polyethylene, polychlorocarbonate, silicone resin, and silicone rubber.
  • inorganic substances such as porous glass, styrene glass, ceramics, alumina, silica gel, activated carbon and metal oxides. Further, two or more of these may be used in combination.
  • the shape of the solid phase is not particularly limited, and for example, a microtiter plate (ELISA plate), beads, tubes (microtubes), particles, a dedicated tray in which a large number of tubes are integrally molded, a disk-shaped piece, a test tube, etc. Can be mentioned.
  • ELISA plate microtiter plate
  • beads beads
  • tubes microtubes
  • particles a dedicated tray in which a large number of tubes are integrally molded
  • a disk-shaped piece a test tube, etc.
  • the method for immobilizing a substance having an affinity for tetraspanin and / or a substance having an affinity for phosphatidylserine on the solid phase is not particularly limited as long as it is a method usually used in this field. You can do it according to the usual method.
  • the combination of the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine is not particularly limited, but the protein that specifically binds to the tetraspanin and the phosphatidyl are not particularly limited.
  • a combination of proteins that specifically bind to serine is preferable, and a combination of an antibody that specifically binds to the tetraspanin and an antibody that specifically binds to the phosphatidylserine or the phosphatidylserine-affinity protein is more preferable. preferable.
  • an antibody that specifically binds to the tetraspanin and an antibody that specifically binds to phosphatidylserine or a phosphatidylserine-affinitive protein for example, an antibody that specifically binds to tetraspanin and a Tim protein or Examples thereof include a combination of antibodies that specifically bind to phosphatidylserine, preferably an anti-CD9 antibody, an anti-CD63 antibody, or a combination of an anti-CD81 antibody and a Tim protein, and a combination of an anti-CD9 antibody or an anti-CD81 antibody and a Tim protein.
  • the combination of anti-CD9 antibody or anti-CD81 antibody and Tim1 or Tim4 is more preferable, the combination of anti-CD9 antibody or anti-CD81 antibody and Tim4 is particularly preferable, and the combination of anti-CD9 antibody and Tim4 is most preferable.
  • ELISA method enzyme-bound immunoassay measurement method
  • EIA method enzyme immunoassay method
  • RIA radiation immunoassay method
  • Immunoassay method such as electrophoresis, western blot method, latex immunoassay (NIA method), immunoturbidimetric method such as latex immunoassay (TIA method), fine particle counting immunoaggregation measurement method (PCIA method) Immunoaggregation method such as, surface plasmon resonance method (SPR method), AlphaLISA method, assay for detecting the presence of target molecule using fluorescence resonance energy transfer (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), etc.
  • Immunoassays and mass analyzes include enzyme-bound immunoassays (ELISA), chemoluminescent enzyme immunoassays (CLEIA), chemoluminescence immunoassays (CLIA), electrochemical luminescence immunoassays.
  • the method (ECLIA method) and capillary electrophoresis are preferable, and the enzyme-bound immunoassay measurement method (ELISA method), chemoluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method), and LBA-EATA method are more preferable, and the enzyme-bound immunoassay measurement method (ELISA method).
  • ELISA method is particularly preferable.
  • the principle for measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin is not particularly limited, and examples thereof include a sandwich method and a competitive method, and the sandwich method is preferable. Further, as the measurement principle, a homogenius method, a heterogeneous method or the like may be used, and the heterogeneous method is preferable.
  • the immunological measurement method for example, it has an affinity for the tetraspanin other than the antibody that specifically binds to the tetraspanin and the antibody that specifically binds to the phosphatidylserine.
  • examples thereof include a method of performing the immunological measurement method using a substance and a substance having an affinity for the phosphatidylserine, and the same method is also preferable.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin may be specifically measured according to the method described in WO2016 / 0886689, and all the descriptions in the publication are incorporated in the present specification.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method specifically, for example, (1) for extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample and tetraspanin.
  • an extracellular vesicle having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample a substance having an affinity for tetraspanin, and a substance having an affinity for tetraspanin.
  • a step of forming a complex containing a substance having an affinity for phosphatidylserine (hereinafter, may be abbreviated as “complex formation step”), and (2) a step of measuring the amount of the complex (2).
  • a method including (may be abbreviated as “complex amount measuring step”) is mentioned as a preferable method.
  • the order in which the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the complex formation step and the biological sample are brought into contact with each other is not particularly limited, but the affinity for the biological sample and the phosphatidylserine It is preferable to contact the substance having an affinity for tetraspanin after contacting the substance having the substance. That is, the complex formation step is composed of an extracellular vesicle in the biological sample and a substance having an affinity for phosphatidylserine by contacting the biological sample with a substance having an affinity for phosphatidylserine.
  • the first step of forming the first complex and the contact of the first complex with a substance having an affinity for tetraspanin have an affinity for the first complex and tetraspanin. It is preferable to include a second step of forming a second complex composed of the material.
  • an antibody or Tim protein (preferably Tim1 or Tim4, more preferably Tim4) that specifically binds to phosphatidylserine immobilized on a solid phase and a biological sample are used.
  • an antibody or Tim protein that specifically binds to phosphatidylserine is formed into a first complex of phosphatidylserine and tetraspanin-bearing extracellular vesicles in a biological sample, and the first complex is formed.
  • an antibody that specifically binds to tetraspanin are brought into contact with each other to form a second complex of the first complex and an antibody that specifically binds to tetraspanin.
  • washing operation (B / F separation) at least before the complex amount measuring step.
  • the washing operation may be performed after forming the first complex and / or after forming the second complex in the above method, and after forming the first complex. It is preferable to perform the cleaning operation (B / F separation), and further perform the cleaning operation (B / F separation) after forming the second complex.
  • extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, a substance having an affinity for tetraspanin, and a substance having an affinity for phosphatidylserine obtained in the complex forming step were used. Any method may be used as long as it is a step of measuring the amount of the complex contained and the amount of the complex can be measured.
  • an antibody that specifically binds to tetraspanin labeled with a labeling substance is used, or (2) "specifically binds to tetraspanin.”
  • a labeled secondary antibody labeled with a labeling substance that specifically binds to the "antibody to be used” or (3) an antibody that specifically binds to tetraspanin to which one of avidins and biotins is bound. It specifically binds to the phosphatidylserine immobilized on the solid phase obtained in the above-mentioned complex formation step by using a labeling substance in which the other one of avidins and biotins is bound.
  • Antibodies and labeling substances that specifically bind to tetraspanin and extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in biological samples with antibodies or Tim proteins (preferably Tim1 or Tim4, more preferably Tim4).
  • the labeling substance in the complex containing preferably a sex substance may be detected.
  • the complex amount measurement step it is preferable to perform a washing operation (B / F separation) before detecting the labeling substance.
  • Measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic aid method is more specifically, for example, an antibody or Tim protein that specifically binds to phosphatidylserine immobilized on a solid phase plate. (Preferably Tim1 or Tim4, more preferably Tim4) and the biological sample are brought into contact with an antibody or Tim protein that specifically binds to phosphatidylserine and extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the biological sample.
  • the first complex After forming a first complex with, and if necessary, B / F separation, (1) the first complex is brought into contact with an antibody that specifically binds to tetraspanin labeled with a labeling substance. , Forming a second complex of the first complex with an antibody that specifically binds to tetraspanin labeled with a labeling substance, (2) specific to the first complex and tetraspanin. The first complex is brought into contact with the antibody that specifically binds to form a second complex of the antibody that specifically binds to tetraspanin, and if necessary, after B / F separation, the second complex is formed.
  • the labeled secondary antibody labeled with a labeling substance that specifically binds to the "antibody that specifically binds to the tetraspanin” are brought into contact with the second complex and the labeled.
  • a third complex with the secondary antibody is formed, or (3) the first complex is brought into contact with an antibody that specifically binds to tetraspanin to which one of avidins and biotins is bound.
  • a second complex is formed between the first complex and an antibody that specifically binds to tetraspanin to which one of avidins and biotins is bound, and if necessary, after B / F separation, the said A third complex of a labeling substance (preferably an enzyme or a fluorescent substance) is formed by binding the second complex with the remaining one of avidins and biotins, and is obtained after B / F separation.
  • the labeling substance of the second complex or the third complex may be detected.
  • the amount (concentration) of the substance and the substance having an affinity for phosphatidylserine, the labeling substance, the labeling method, etc. are appropriately set according to the type of biological sample, the required measurement sensitivity, the measurement method to be used, the measurement device, and the like. do it.
  • the amount (concentration) of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample may be calculated by preparing a calibration curve using a standard product.
  • the standard product include extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnostic assist method includes determining Parkinson's disease using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin as an index.
  • the determination of Parkinson's disease includes, for example, determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease, determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease, and determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease.
  • Determining whether the subject is at high risk of developing Parkinson's disease determining whether the subject is at risk of developing Parkinson's disease, determining whether the subject is likely to have Parkinson's disease, and determining whether the subject is suffering from Parkinson's disease It is preferable to determine the presence or absence of the possibility of suffering from Parkinson's disease.
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnostic assist method is determined, for example, by measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin described above, and extracellularly having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample derived from a subject. It is done by comparing the amount of vesicles with a predetermined reference value (cutoff value). Specifically, if the amount of extracellular vesicles carrying phosphatidylserine and tetraspanin is below a predetermined reference value, it is highly likely that the subject has Parkinson's disease, or the subject has Parkinson's disease.
  • a predetermined reference value cutoff value
  • the subject is at high risk of developing Parkinson's disease, or that the subject is at high risk of developing Parkinson's disease.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin is larger than a predetermined standard value, it is unlikely that the subject has Parkinson's disease or the subject has Parkinson's disease. It can be determined that there is no possibility that the subject has Parkinson's disease, the subject has a low risk of developing Parkinson's disease, or the subject has no risk of developing Parkinson's disease.
  • the predetermined reference value is the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample, which is preset to distinguish between a Parkinson's disease patient and a healthy person.
  • the method for determining the predetermined reference value is not particularly limited, and for example, the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin contained in a biological sample obtained from a patient suffering from Parkinson's disease and a healthy person is determined.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin obtained by measurement it can be determined by statistical analysis such as ROC analysis (Receiver Operating Characteristic analysis).
  • ROC analysis Receiveiver Operating Characteristic analysis
  • the predetermined reference value can be set so that the sensitivity is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and 90% or more. More preferably, for example, the specificity can be determined to be 60% or more, 70% or more is preferable, 80% or more is more preferable, and 90% or more is further preferable.
  • the reagent kit for assisting diagnosis of Parkinson's disease in the first invention (hereinafter, may be abbreviated as "reagent kit for assisting PD diagnosis”) has an affinity for a substance having an affinity for tetraspanin and an affinity for phosphatidylserine. Includes substances with.
  • the substances having an affinity for tetraspanin and the substances having an affinity for phosphatidylserine in the reagent kit for assisting PD diagnosis are the same as those described above in the method for assisting PD diagnosis, respectively, and the preferable substances are also the same. ..
  • the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be in a solution state, a frozen state, a dried state, or a freeze-dried state, respectively. Further, the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be included in the kit as one reagent or included in the kit as separate reagents. ..
  • the combination of the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the reagent kit for assisting PD diagnosis includes the same combinations as those described above in the method for assisting PD diagnosis, and preferred combinations are also available. The same is true.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit may be immobilized on a solid phase and may be labeled with a labeling substance. May be good.
  • the solid phase, the method for immobilizing the solid phase, the labeling substance, and the labeling method are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred ones are also the same.
  • the PD diagnostic aid reagent kit is a secondary affinity substance (for example, secondary affinity substance) that specifically binds to a substance having an affinity for the tetraspanin and / and a substance having an affinity for the phosphatidylserine. Antibodies) may be further included.
  • the secondary affinity substance in the PD diagnosis assisting reagent kit is the same as that described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred one is also the same. Further, the secondary affinity substance in the PD diagnosis assisting reagent kit may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance and the labeling method are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, which is preferable. The same is true for things.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit may be a substance to which one of avidins and biotins is bound, and the avidins. And the biotins are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferable ones are also the same.
  • the PD diagnostic assisting reagent kit may further contain a labeling substance to which one of avidins and biotins is bound, and the labeling substance and labeling method are the same as those described above in the PD diagnostic assisting method. The same applies to preferred ones.
  • the concentration (amount) of the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit is within the range usually used in this field depending on the measurement method. It may be set as appropriate.
  • the substance having an affinity for tetraspanin preferably contains, for example, a concentration at the time of use, which is usually 10 to 20000 ng / mL or 100 to 10000 ng / mL when immobilized on a solid phase. When used for detection, those containing an amount of 10 to 5000 ng / mL and 100 to 500 ng / mL are usually preferable.
  • the substance having an affinity for phosphatidylserine contains, for example, a concentration at the time of use, which is usually 10 to 20000 ng / mL or 100 to 10000 ng / mL when immobilized on a solid phase. Is preferable, and when it is used for detection, it is usually preferably one containing an amount of 10 to 5000 ng / mL and 100 to 500 ng / mL.
  • reagents usually used in this field such as buffers, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, etc., are used as substances having an affinity for tetraspanin. / And may coexist with a substance having an affinity for phosphatidylserine. These concentrations and pHs may be appropriately selected from the ranges usually used in this field.
  • the PD diagnostic aid reagent kit includes substances having an affinity for tetraspanin and substances having an affinity for phosphatidylserine, as well as extracellular tetraspanin and phosphatidylserine using these affinity substances. It may be equipped with the reagents necessary to measure the amount of vesicles. Examples of such reagents include cleaning agents, sample diluents (reagents for diluting samples), reagents for detecting labeling substances, reagents for binding labeling substances to these affinity substances, and the like. Examples thereof include reagents for immobilizing the affinity substances in the solid phase, and reagents for binding avidins or biotins to these affinity substances and labeling substances. The concentration, pH, etc. of these reagents may be appropriately selected from the range usually used in this field.
  • the PD diagnostic aid reagent kit may include a standard product used to prepare a calibration curve for extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • Examples of the standard product include extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin.
  • the standard product may be in a solution state, a frozen state, a dried state, or a freeze-dried state.
  • reagents usually used in this field such as buffers, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, etc., may coexist with the standard product. These concentrations and pHs may be appropriately selected from the ranges usually used in this field.
  • the PD diagnostic aid reagent kit may include package inserts and instruction manuals.
  • the package insert and instruction manual include, for example, measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample derived from a subject and / and extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin. Examples include package inserts and instruction manuals that describe that the subject is determined to have Parkinson's disease using the amount as an index. These package inserts and instruction manuals may be described separately in a plurality of cases, or may be described collectively in one case.
  • the PD diagnostic aid reagent kit includes, for example, a substance in which either a substance having an affinity for tetraspanin or a substance having an affinity for phosphatidylserine is immobilized on a solid phase and tetraspanin.
  • the remaining one of the substance having an affinity for phosphatidylserine and the substance having an affinity for phosphatidylserine is bound to the labeling substance or the other affinity substance and the substance indirectly labeling this Examples include kits containing ingredients for binding to.
  • the PD diagnostic aid reagent kit includes a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine in which either one is immobilized on a solid phase and the following (1) to (3).
  • a kit containing any one of the above is preferred. (1) A substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine in which the remaining one is bound to a labeling substance, (2) a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine.
  • Preferred specific examples of the reagent kit for assisting PD diagnosis include a solid phase plate on which an antibody or Tim protein that specifically binds to phosphatidylserine (Tim4 or Tim1 is more preferable, Tim4 is particularly preferable) and the following.
  • Examples thereof include a kit containing any one selected from (1) to (3).
  • a solution containing the other one of an antibody or Tim protein that specifically binds to phosphatidylserine usually 10-5000 ng / mL, 100). ⁇ 500 ng / mL is preferable
  • a solution usually 10 to 5000 ng / mL, 100 to 500 ng / mL
  • a secondary affinity substance that specifically binds to the affinity substance bound to the labeling substance.
  • a solution containing an antibody preferably anti-CD9 antibody or anti-CD81 antibody, more preferably anti-CD9 antibody
  • an antibody preferably anti-CD9 antibody or anti-CD81 antibody, more preferably anti-CD9 antibody
  • a solution containing a labeling substance to which the other one of avidins and biotins is bound usually 10-5000 ng / mL, preferably 100-500 ng / mL).
  • the device for assisting diagnosis of Parkinson's disease in the first invention (hereinafter, may be abbreviated as "device for assisting diagnosis of PD”) is the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample derived from a subject. It has a measuring unit for measuring phosphatidylserine and tetraspanin, and a determining unit for determining that the subject has Parkinson's disease using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin as an index.
  • the biological sample, subject, and extracellular vesicle in the PD diagnosis assisting device are the same as those described above, and the preferred ones are also the same.
  • the measuring unit, the determination unit, and the like constituting the PD diagnosis assisting device may be arranged in the same device or may be separate from each other.
  • the measuring unit in the PD diagnostic assisting device is a site for measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the biological sample introduced into the device.
  • the size and configuration of the measuring unit are not particularly limited.
  • the measuring unit is, for example, an imaging device used for imaging using a microplate reader or CCD used in an ELISA method, an imaging device used in a method using a Western blotting method or a microarray (microchip), and a mass spectrometry method. Examples thereof include mass spectrometers, intermolecular interaction analyzers, flow cytometers used for flow cytometry, ultraviolet visible light detectors and fluorescence detectors used for HPLC methods and capillary electrophoresis methods.
  • the measurement target of the method for measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assisting device is the same as that described above in the PD diagnostic assisting method. Yes, and the preferred ones are the same.
  • the measurement of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnosis assisting device and the substances used for the measurement are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred ones and specific examples are also the same.
  • the PD diagnosis assisting device may include a calculation unit.
  • the calculation unit in the PD diagnostic assistance device is an actually measured value (for example, absorbance, change in absorbance) that correlates with the mass and concentration of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the biological sample obtained by the measurement unit. , Transmitted light, transmitted light change amount, fluorescence intensity, fluorescence intensity change amount, light emission amount, light emission amount change amount, turbidity, turbidity change rate, scattered light, scattered light change rate, absorbance, reflectance change amount, refractive index It is a part that converts (rate, amount of change in refractive index, etc.) into mass, concentration, etc.
  • the actually measured value, the mass and the concentration converted by the calculation unit, and the like may be stored in a storage device or the like provided in the device such as a memory or a hard disk.
  • the determination unit in the PD diagnosis assisting device is a site for determining Parkinson's disease using the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin obtained by the measurement unit or the calculation unit as an index.
  • the determination method of Parkinson's disease in the PD diagnosis assisting device, the predetermined reference value used for the determination, and the determination method of the predetermined reference value are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and are preferable. The same applies to specific examples.
  • the predetermined reference value in the PD diagnosis assisting device may be stored in advance in the PD diagnosis assisting device, or may be input from the input site of the PD diagnosis assisting device at the time of determination.
  • the PD diagnosis assisting device may include an output unit.
  • the output unit performs processing such as displaying or outputting the determination result on a display device such as a display or a printing device such as a printer.
  • the biomarker set for assisting the diagnosis of Parkinson's disease in the second invention includes extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and extracellular vesicles having tetraspanin. It is a combination of biomarkers.
  • the PD marker set for example, the ratio of the amount of phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin (hereinafter, may be abbreviated as "PD marker (II)").
  • PD marker (II) can be used as an index for determining that the subject has Parkinson's disease.
  • the PD marker (II) it can be used as an index for distinguishing whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the extracellular vesicles in the PD marker set are the same as the extracellular vesicles, and the preferred ones are also the same.
  • the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD marker set have at least one tetraspanin such as CD9, CD63, CD81, CD151 and phosphatidylserine which is a phospholipid on the membrane surface, and CD9, CD63, and Those having at least one tetraspanin selected from CD81 and phosphatidylserine are preferable, those having at least one tetraspanin selected from CD9 and CD63 and phosphatidylserine are more preferable, and those having CD9 and phosphatidylserine are particularly preferable.
  • tetraspanin such as CD9, CD63, CD81, CD151 and phosphatidylserine which is a phospholipid on the membrane surface
  • CD9, CD63 Those having at least one tetraspanin selected from CD81 and phosphatidylserine are preferable, those having
  • Extracellular vesicles having the PD marker set tetraspanins have at least one tetraspanin such as CD9, CD63, CD81, CD151 on the membrane surface and have at least one tetraspanin selected from CD9, CD63, and CD81. Those having at least one tetraspanin selected from CD9 and CD63 are more preferable, and those having CD9 are particularly preferable.
  • the tetraspanin in the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin of the PD marker set may be the same as or different from the tetraspanin in the extracellular vesicles having tetraspanin, and the same ones are preferable.
  • the method for assisting the diagnosis of Parkinson's disease in the second invention (hereinafter, may be abbreviated as "PD diagnosis assisting method (II)") is the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample.
  • the ratio of the amount of phosphatidylserine and extracellular vesicles with tetraspanin to the amount of extracellular vesicles with tetraspanin (PD marker (II))
  • the subject is determined to have Parkinson's disease by using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin as an index.
  • the biological sample, subject, and extracellular vesicle in the PD diagnostic assist method (II) are the same as those described above, and the preferred ones are also the same.
  • the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) are the same as those described above in the PD marker set, and the preferred ones are also the same.
  • the measurement target of the amount, the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and the substances used for the measurement are:
  • Examples of the PD diagnostic assisting method include the same as those described above, and an antibody that specifically binds to tetraspanin, and an antibody that specifically binds to tetraspanin and an antibody that specifically binds to phosphatidylserine.
  • preferable ones and specific examples are the same as those described above in the combination of phosphatidylserine-affinitive proteins.
  • Examples of the antibody that specifically binds to tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) include anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody, anti-CD81 antibody, anti-CD151 antibody, and the like, and anti-CD9 antibody and anti-CD63 antibody.
  • Anti-CD81 antibody is preferable
  • anti-CD9 antibody and anti-CD63 antibody are more preferable
  • anti-CD9 antibody is particularly preferable.
  • As the substance having an affinity for tetraspanin only one kind may be used, or two or more kinds may be used, and it is preferable to use only one kind.
  • the combination of the antibody that specifically binds to tetraspanin and the antibody that specifically binds to phosphatidylserine or the phosphatidylserine-affinitive protein in the PD diagnostic aid method (II) is, for example, specifically to tetraspanin.
  • Examples thereof include a combination of an antibody that binds and an antibody that specifically binds to Tim protein or phosphatidylserine, preferably an anti-CD9 antibody, an anti-CD63 antibody, or a combination of an anti-CD81 antibody and Tim protein, and an anti-CD9 antibody or anti-CD63.
  • the combination of antibody and Tim protein is more preferable, the combination of anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody and Tim1 or Tim4 is more preferable, the combination of anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody and Tim4 is particularly preferable, and the combination of anti-CD9 antibody and Tim4 is particularly preferable. Most preferred.
  • the extracellular vesicles having tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) are the same as those described above in the PD marker set, and the preferred ones are also the same.
  • the tetraspanin in the extracellular vesicle having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) and the tetraspanin in the extracellular vesicle having tetraspanin may be the same or different, and are the same. Those are preferable.
  • the amount of tetraspanin-bearing extracellular vesicles in the PD diagnostic aid method (II) can be measured by measuring the amount of one type of tetraspanin-bearing extracellular vesicles (for example, only extracellular vesicles having CD9).
  • the amount of two or more types of tetraspanin extracellular vesicles may be measured, and the amount of extracellular vesicles having one type of tetraspanin may be measured. It is preferable to measure only the amount.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles having the tetraspanin is not particularly limited as long as it is a method usually used in this field, and for example, an immunological measurement method using a substance having an affinity for tetraspanin, mass.
  • An analytical method and a method combining these methods can be mentioned, and an immunological measurement method using a substance having an affinity for tetraspanin is preferable.
  • the immunological measurement method includes not only a method using an immune reaction (antigen-antibody reaction) but also a method using a binding force between two molecules other than the antigen-antibody reaction such as binding of a lectin and a protein (a method using the binding force between two molecules.
  • a method similar to the immunological measurement method is also included.
  • Examples of the substance having an affinity for tetraspanin in the measurement of the amount of extracellular vesicles having tetraspanin include the same substances as those described above in the PD diagnostic assist method, and specifically bind to tetraspanin. Proteins are preferred, and antibodies that specifically bind to tetraspanin are more preferred. Examples of the antibody that specifically binds to the tetraspanin include an anti-CD9 antibody, an anti-CD63 antibody, an anti-CD81 antibody, an anti-CD151 antibody, and the like, preferably an anti-CD9 antibody and an anti-CD63 antibody, and an anti-CD9 antibody is preferable. More preferred. As the substance having an affinity for tetraspanin, only one kind may be used, or two or more kinds may be used, and it is preferable to use only one kind.
  • the substance having an affinity for tetraspanin may be a commercially available product or a substance appropriately prepared by a conventional method.
  • the antibody that specifically binds to the tetraspanin may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and these may be used alone or in combination as appropriate.
  • the antibody that specifically binds to the tetraspanin is not only the immunoglobulin molecule itself (intact immunoglobulin), but also a fragment thereof, Fab, F (ab') 2, which has an ability to bind to an antigen.
  • F (ab') and other fragment antibodies may be used.
  • single chain antibodies single chain Fv
  • diabody triabody
  • tetrabody tetrabody and other synthetic antibodies and the like
  • these antibodies may be prepared according to the method described in, for example, "Immunoassay” (edited by Biochemical Measurement Study Group, Kodansha, 2014).
  • the substance having an affinity for tetraspanin in the PD diagnostic assisting method (II) may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance and the labeling method are the same as those of the PD diagnostic assisting method and are preferable. And specific examples are the same. Further, as in the PD diagnosis assisting method, a substance having an affinity for tetraspanin is used as a primary affinity substance, and a secondary affinity substance (for example, a secondary antibody) that specifically binds to the primary affinity substance. May be further used.
  • the secondary affinity substance may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance and the labeling method are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferable substances are also the same.
  • labeling with a labeling substance is a substance having an affinity for tetraspanin bound to one of avidins and biotins, and a labeling substance to which the other one of avidins and biotins is bound. May be used to utilize the binding of avidins and biotins.
  • the method for binding avidins and biotins to the avidins, biotins, and substances having an affinity for tetraspanin is the same as that described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred ones and specific examples are also the same. is there.
  • the substance having an affinity for tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) may be immobilized on the solid phase, and the substance having an affinity for the tetraspanin is immobilized on the solid phase or the solid phase.
  • the method for assisting PD diagnosis is the same as that described above, and the preferred method and specific examples are also the same.
  • a substance having an affinity for tetraspanin used for measuring the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) and the extracellular vesicles having the tetraspanin As the substance having an affinity for tetraspanin used, a substance having an affinity for at least one identical tetraspanin (for example, a substance having an affinity for at least CD9 is used for both measurements) is used. However, substances that have an affinity for different types of tetraspanins (eg, substances that have an affinity for CD9 in one measurement and have an affinity for CD63 in the other measurement).
  • (Use) may be used, and it is preferable to use a substance having an affinity for at least one identical tetraspanin, and only a substance having an affinity for the same tetraspanin is used (for example, both). It is more preferable to use only a substance having an affinity for CD9 for the measurement of, and only one kind of substance having an affinity for the same tetraspanin (for example, only an anti-CD9 antibody is used for the measurement of both). It is particularly preferable to use.
  • the measurement and measurement principle of the amount of extracellular vesicles having tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) is the above-mentioned measurement and measurement principle of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assist method. And so is the preferred one.
  • the measurement of the amount of tetraspanin-bearing extracellular vesicles in the PD diagnostic assist method (II) specifically includes, for example, (1) affinity for tetraspanin-bearing extracellular vesicles in a biological sample.
  • a method including a step of measuring the amount of the complex (complex amount measuring step) is mentioned as a preferable method.
  • the biological sample is brought into contact with a substance having an affinity for tetraspanin to cause extracellular smallness in the biological sample.
  • the first step of forming a first complex composed of a vesicle and a substance having an affinity for tetraspanin and the contact between the first complex and a substance having an affinity for tetraspanin are brought into contact with each other.
  • the substance having an affinity for tetraspanin used for forming the first complex and the substance having an affinity for tetraspanin used for forming the second complex are the same. Those are preferable.
  • the complex formation step in the measurement of the amount of tetraspanin-bearing extracellular vesicles in the PD diagnostic aid method (II) specifically includes, for example, an antibody that specifically binds to tetraspanin immobilized on a solid phase (an antibody (II).
  • an antibody (II) specifically includes, for example, an antibody that specifically binds to tetraspanin immobilized on a solid phase (an antibody (II).
  • Anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody are preferable, anti-CD9 antibody is more preferable
  • the biological sample are brought into contact with each other to have an antibody that specifically binds to tetraspanin and phosphatidylserine and tetraspanin in the biological sample.
  • a first complex with vesicles is formed, and an antibody that specifically binds to tetraspanin (anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody is preferable, anti-CD9 antibody is more preferable) is brought into contact with the first complex.
  • the first complex is formed with a second complex of an antibody that specifically binds to tetraspanin.
  • washing operation (B / F separation) at least before the complex amount measuring step.
  • the washing operation may be performed after forming the first complex and / or after forming the second complex in the above method, and after forming the first complex. It is preferable to perform the cleaning operation (B / F separation), and further perform the cleaning operation (B / F separation) after forming the second complex.
  • the complex amount measurement step in the measurement of the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles in the PD diagnostic assistance method (II) has an affinity for tetraspanin and the tetraspanin-containing extracellular vesicles obtained in the complex formation step. Any method may be used as long as it is a step of measuring the amount of the complex containing a substance having a property and the amount of the complex can be measured. More specifically, in the complex amount measurement step, for example, (1) an antibody that specifically binds to tetraspanin labeled with a labeling substance is used, or (2) "specifically to tetraspanin".
  • Antibodies (anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody are preferable, anti-CD9 antibody is more preferable) and extracellular vesicles having tetraspanin in biological samples and antibodies that specifically bind to tetraspanin (anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody)
  • the labeling substance in the complex containing the labeling substance enzymes, fluorescent substance is preferable
  • the labeling substance preferably an anti-CD9 antibody
  • the complex amount measurement step it is preferable to perform a washing operation (B / F separation) before detecting the labeling substance.
  • the measurement of the amount of the extracellular vesicles having tetraspanin in the PD diagnostic assist method (II) is more specifically, for example, an antibody (anti-CD9) that specifically binds to tetraspanin immobilized on a solid phase plate.
  • the biological sample is brought into contact with the antibody, which specifically binds to tetraspanin, and the extracellular vesicle having tetraspanin in the biological sample.
  • Antibodies that specifically bind to the first complex and tetraspanin labeled with a labeling substance (anti-CD9 antibody, anti-CD63) after B / F separation, if necessary. Antibodies are preferred, anti-CD9 antibodies are more preferred) to form a second complex of the first complex with an antibody that specifically binds to tetraspanin labeled with a labeling substance.
  • the first complex is brought into contact with an antibody that specifically binds to tetraspanin (anti-CD9 antibody, anti-CD63 antibody is preferable, and anti-CD9 antibody is more preferable), and the first complex is combined with the first complex.
  • a second complex with an antibody that specifically binds to tetraspanin is formed, and if necessary, after B / F separation, the second complex and "an antibody that specifically binds to the tetraspanin"
  • a labeled secondary antibody labeled with a labeling substance, which specifically binds to is contacted to form a third complex of the second complex and the labeled secondary antibody, or (3).
  • a second complex is formed between the first complex and an antibody that specifically binds to tetraspanin to which one of avidins and biotins is bound, and if necessary, after B / F separation, A third complex of a labeling substance (preferably an enzyme or a fluorescent substance) in which the second complex is bound to the remaining one of avidins and biotins is formed, and after B / F separation, it is obtained. It suffices to detect the labeling substance (enzymes, fluorescent substance is preferable) of the 2nd complex or the 3rd complex to be obtained.
  • a labeling substance preferably an enzyme or a fluorescent substance
  • the amount (concentration), labeling substance, labeling method, etc. may be appropriately set according to the type of biological sample, required measurement sensitivity, measurement method to be used, measurement device, and the like.
  • the amount (concentration) of extracellular vesicles having tetraspanin in the biological sample may be calculated by preparing a calibration curve using a standard product. Examples of the standard product include extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the ratio of the amount of phosphatidylserine and extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin is the amount (A) of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and the cells having tetraspanin. It may be calculated by dividing by the amount of extracellular vesicles (B) ((A) / (B)).
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnostic assist method (II) is the ratio of the amount (B) of the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount (A) of the extracellular vesicles having tetraspanin ((A)). / (B)) is used as an index to determine Parkinson's disease.
  • the determination of Parkinson's disease includes, for example, determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease, determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease, and determination of whether or not the subject is likely to have Parkinson's disease.
  • Determining whether the subject is at high risk of developing Parkinson's disease determining whether the subject is at risk of developing Parkinson's disease, determining whether the subject is likely to have Parkinson's disease, and determining whether the subject is suffering from Parkinson's disease It is preferable to determine the presence or absence of the possibility of suffering from Parkinson's disease.
  • the ratio of the amount (B) of the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount (A) of the extracellular vesicles having tetraspanin ((() Using A) / (B)) as an index, it may include determining (distinguishing) whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the cognitive symptomatology means a state in which the cognitive function of the brain is reduced due to an acquired organic disorder.
  • Parkinson's disease with cognitive symptoms is defined as having Parkinson's disease or having the possibility of developing Parkinson's disease, and having cognitive symptoms or having the possibility of developing cognitive symptoms. It is a condition, for example, when suffering from Parkinson's disease or when there is a possibility of developing Parkinson's disease and the MMSE is 27 points or less.
  • Parkinson's disease without cognitive symptoms is defined as having Parkinson's disease or having the possibility of developing Parkinson's disease, and having no cognitive symptoms or having the possibility of developing cognitive symptoms. There is no condition, for example, if you have Parkinson's disease or if you are likely to develop Parkinson's disease and your MMSE is greater than 27 points.
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnostic assist method (II) was obtained, for example, by measuring the amount of extracellular vesicles having tetraspanin described above, and measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin described above. , The ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of phosphatidylserine and extracellular vesicles having tetraspanin to the amount (A) of extracellular vesicles having tetraspanin is set to a predetermined reference value (cut). It is done by comparing with the off value).
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin (A) is a predetermined standard. If it is below the value, the subject is likely to have Parkinson's disease, the subject is likely to have Parkinson's disease, or the subject is at high risk of developing Parkinson's disease, or the subject is It can be determined that there is a risk of developing Parkinson's disease.
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles to the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (A) is larger than a predetermined reference value. If the subject is unlikely to have Parkinson's disease, the subject is unlikely to have Parkinson's disease, or the subject is at low risk of developing Parkinson's disease, or the subject is It can be determined that there is no risk of developing Parkinson's disease.
  • the predetermined reference value (cutoff value) in the PD diagnostic assist method (II) is the amount of extracellular vesicles having tetraspanin in the biological sample, which is preset to distinguish between Parkinson's disease patients and healthy subjects.
  • the method for determining the predetermined reference value in the PD diagnostic assist method (II) is not particularly limited, and for example, extracellular vesicles having tetraspanin contained in biological samples obtained from patients suffering from Parkinson's disease and healthy subjects.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount of vesicles (A) was measured, and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin (A) was measured.
  • the ratio of the amount (B) ((A) / (B)) was calculated, and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount (A) of the obtained extracellular vesicles having tetraspanin (B).
  • ) ((A) / (B)) can be determined by statistical analysis such as ROC analysis (Receiving Operating Characticanalysis).
  • ROC analysis Receiveiving Operating Characticanalysis
  • the predetermined reference value it is preferable to consider sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, and the like.
  • the predetermined reference value can be set so that the sensitivity is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and 90% or more. More preferably, for example, the specificity can be determined to be 60% or more, 70% or more is preferable, 80% or more is more preferable, and 90% or more is further preferable.
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnosis assisting method (II) is based on the ratio of the amount (B) of the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount (A) of the extracellular vesicles having tetraspanin ((A)). / (B)) is used as an index to determine whether the subject is a healthy person, has Parkinson's disease with cognitive symptoms, or has Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • a cut-off value for distinguishing between healthy people and Parkinson's disease with cognitive symptoms (hereinafter sometimes abbreviated as "healthy person / Parkinson's disease standard value with cognitive symptoms”) and Parkinson's disease with cognitive symptoms Judgment (distingment) may be made based on a cut-off value for distinguishing Parkinson's disease without cognitive symptoms (hereinafter sometimes abbreviated as "Parkinson's disease with cognitive symptoms / Parkinson's disease standard value without cognitive symptoms") ⁇ , "Parkinson's disease with cognitive symptoms / Parkinson's disease without cognitive symptoms” is used to determine (distinguish) only whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms. You may.
  • the subject when the subject only determines whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms, the subject is diagnosed with Parkinson's disease based on the diagnostic criteria. People who have been diagnosed with Parkinson's disease based on diagnostic criteria are preferred.
  • the diagnostic criteria are the same as those described above.
  • the determination of whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms is determined, for example, by the amount of extracellular vesicles having tetraspanin described above.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount (A) of the extracellular vesicles having tetraspanin obtained by the measurement and the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin described above It is done by comparing the ratio of B) ((A) / (B)) with a predetermined “Parkinson's disease with cognitive symptom / Parkinson's disease standard value without cognitive symptom”.
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles to the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (A) is "cognitive symptoms. If a Parkinson's disease / Parkinson's disease without cognitive symptoms is below the standard value, the subject is likely to have Parkinson's disease without cognitive symptoms, or the subject is at risk of developing Parkinson's disease without cognitive symptoms. It can be determined that the subject is at high risk of developing Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles to the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (A) is "Parkinson's disease with cognitive symptoms. If it is larger than / Parkinson's disease without cognitive symptoms, the subject is likely to have Parkinson's disease with cognitive symptoms, or the subject is at high risk of developing Parkinson's disease with cognitive symptoms. Alternatively, it can be determined that the subject is at risk of developing Parkinson's disease with cognitive symptoms.
  • the method for determining "Parkinson's disease with cognitive symptoms / Criteria for Parkinson's disease without cognitive symptoms” is not particularly limited, and for example, patients suffering from Parkinson's disease with cognitive symptoms and Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the amount of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles (B) was measured with respect to the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (A) contained in the biological sample obtained from the patient, and the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (B) was measured.
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount of extracellular vesicles (B) having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of vesicles (A) was calculated, and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin obtained was calculated.
  • ROC analysis Receiveiver Operating Characticanalysis
  • the predetermined reference value can be set so that the sensitivity is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and 90% or more. More preferably, for example, the specificity can be determined to be 60% or more, 70% or more is preferable, 80% or more is more preferable, and 90% or more is further preferable.
  • the determination of whether the subject in the PD diagnostic assistance method (II) is a healthy person, Parkinson's disease with cognitive symptoms, or Parkinson's disease without cognitive symptoms is determined, for example, of the extracellular vesicle having tetraspanin.
  • the ratio ((A) / (B)) of the amount (B) of the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount (A) is "Parkinson's disease with cognitive symptoms / Parkinson's disease without cognitive symptoms reference value". If the following are the following, the subject is likely to have Parkinson's disease without cognitive symptoms, or the subject is at high risk of developing Parkinson's disease without cognitive symptoms, or the subject has Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the subject At risk of developing; if the subject has cognitive symptoms greater than "Parkinson's disease with cognitive symptoms / Parkinson's disease without cognitive symptoms” and less than or less than "healthy individuals / Parkinson's disease with cognitive symptoms” Highly likely to have Parkinson's disease, or subjects at high risk of developing cognitive Parkinson's disease, or subjects at high risk of developing cognitive Parkinson's disease; "healthy / cognitive symptoms” If it is larger than "the standard value for Parkinson's disease", the subject is unlikely to have Parkinson's disease, the subject is unlikely to have Parkinson's disease, or the subject has Parkinson's disease. It can be determined that the risk of developing Parkinson's disease is low, or that the subject is not at risk of developing Parkinson's disease.
  • the method for determining the "healthy subject / Parkinson's disease reference value with cognitive symptoms” is not particularly limited, and for example, extracellular vesicles having tetraspanin contained in biological samples obtained from healthy subjects and Parkinson's disease patients with cognitive symptoms.
  • the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount (A) of (A) was measured, and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin relative to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin (A).
  • the ratio of (B) ((A) / (B)) was calculated, respectively, and the amount of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles (B) with respect to the obtained amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles (A).
  • ((A) / (B)) can be determined by statistical analysis such as ROC analysis (Receiving Operating Characticanalysis).
  • ROC analysis Receiveiving Operating Characticanalysis
  • the predetermined reference value it is preferable to consider sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, and the like.
  • the predetermined reference value can be set so that the sensitivity is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and 90% or more. More preferably, for example, the specificity can be determined to be 60% or more, 70% or more is preferable, 80% or more is more preferable, and 90% or more is further preferable.
  • the reagent kit for assisting diagnosis of Parkinson's disease in the second invention (hereinafter, may be abbreviated as "reagent kit for assisting PD diagnosis (II)") is for a substance having an affinity for tetraspanin and phosphatidylserine. Includes substances that have an affinity for
  • the substances having an affinity for tetraspanin and the substances having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic assisting reagent kit (II) are the same as those described above in the PD diagnostic assisting method (II), and are preferable. The same is true for things.
  • the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be in a solution state, a frozen state, a dried state, or a freeze-dried state, respectively. Further, the substance having an affinity for the tetraspanin and the substance having an affinity for the phosphatidylserine may be included in the kit as one reagent or included in the kit as separate reagents. ..
  • the combination of the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic assisting reagent kit (II) is the same as the combination described above in the PD diagnostic assisting method (II). The same applies to the preferred combinations.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit (II) may be immobilized on a solid phase and labeled with a labeling substance. It may have been done.
  • the solid phase, the method for immobilizing the solid phase, the labeling substance, and the labeling method are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred ones are also the same.
  • the PD diagnostic aid reagent kit (II) is a secondary affinity substance (eg,) that specifically binds to a substance having an affinity for the tetraspanin and / or a substance having an affinity for the phosphatidylserine. Secondary antibody) may be further included.
  • the secondary affinity substance in the PD diagnostic assisting reagent kit (II) is the same as that described above in the PD diagnostic assisting method, and the preferred one is also the same.
  • the secondary affinity substance in the PD diagnosis assisting reagent kit (II) may be labeled with a labeling substance, and the labeling substance and the labeling method are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method. Yes, and the preferred ones are the same.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and / and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit (II) may be a substance in which one of avidins and biotins is bound, and the avidin.
  • the types and biotins are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and the preferred ones are also the same.
  • the PD diagnostic assisting reagent kit (II) may contain a labeling substance to which one of avidins and biotins is bound, and the labeling substance and labeling method are the same as those described above in the PD diagnostic assisting method. The same applies to the preferred ones.
  • the concentration (amount) of the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the PD diagnostic aid reagent kit (II) is usually used in this field depending on the measurement method. It may be set appropriately within the range.
  • the substance having an affinity for tetraspanin preferably contains, for example, a concentration at the time of use, which is usually 10 to 20000 ng / mL or 100 to 10000 ng / mL when immobilized on a solid phase. When used for detection, those containing an amount of 10 to 5000 ng / mL and 100 to 500 ng / mL are usually preferable.
  • the substance having an affinity for phosphatidylserine contains, for example, a concentration at the time of use, which is usually 10 to 20000 ng / mL or 100 to 10000 ng / mL when immobilized on a solid phase. Is preferable, and when it is used for detection, it is usually preferably one containing an amount of 10 to 5000 ng / mL and 100 to 500 ng / mL.
  • the substance having an affinity for tetraspanin and the substance having an affinity for phosphatidylserine in the reagent kit (II) for assisting PD diagnosis may coexist with reagents usually used in this field.
  • the reagent is the same as the reagent kit for PD diagnosis assistance.
  • the PD diagnostic aid reagent kit (II) includes substances having an affinity for tetraspanin and substances having an affinity for phosphatidylserine, as well as tetraspanin and phosphatidylserine using these affinity substances.
  • the reagents necessary for measuring the amount of extracellular vesicles having and / and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine may be provided.
  • Such a reagent is the same as that of the PD diagnosis assisting reagent kit.
  • the PD diagnostic aid reagent kit (II) may include a standard product used to prepare a calibration curve for extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin, and the standard product is for PD diagnostic aid. Similar to the reagent kit.
  • the PD diagnostic aid reagent kit (II) may contain a standard product used for preparing a calibration curve for extracellular vesicles having tetraspanin, and the standard product includes extracellular vesicles having tetraspanin. Vesicles are mentioned.
  • the standard product may be in a solution state, a frozen state, a dried state, or a freeze-dried state.
  • reagents usually used in this field such as buffers, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, etc.
  • concentrations and pHs may be appropriately selected from the ranges usually used in this field.
  • the PD diagnostic aid reagent kit (II) may include package inserts and instruction manuals.
  • the attached documents and instruction manuals include, for example, measuring the amount of extracellular vesicles having tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample derived from a subject, and / and. Using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin as an index, it is possible to determine that the subject has Parkinson's disease (for example, PD diagnostic assist method (II)). Examples include the attached documents and instruction manuals described. These package inserts and instruction manuals may be described separately in a plurality of cases, or may be described collectively in one case.
  • the remaining one of the substances having an affinity is bound to the labeling substance, or the other affinity substance and the component (B) that indirectly binds the affinity to the labeling substance have an affinity for tetraspanin.
  • kits (II) for example, a kit containing the following (C) and (D) is preferable.
  • C) One of a substance having an affinity for tetraspanin and a substance having an affinity for phosphatidylserine immobilized on a solid phase, and one selected from the following (1) to (3).
  • One of the substances having an affinity for phosphatidylserine and one of the substances having an affinity for phosphatidylserine is bound to one of avidins and biotins, and the other of avidins and biotins is bound to a labeling substance (D).
  • a substance having an affinity for tetraspanin is a labeling substance.
  • Preferred examples of the PD diagnostic assist reagent kit (II) include the following.
  • a kit containing a solid phase plate on which an anti-CD9 antibody is particularly preferable) and any one selected from the following (1) to (3) can be mentioned.
  • a solution containing a tetraspanin antibody (anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody is more preferable, anti-CD9 antibody is particularly preferable) bound to a labeling substance (usually 10 to 5000 ng / mL, 100 to 500 ng / mL is preferable).
  • a labeling substance usually 10 to 5000 ng / mL, 100 to 500 ng / mL is preferable.
  • a solution containing a tetraspanin antibody (anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody is more preferable, anti-CD9 antibody is particularly preferable) (usually 10 to 5000 ng / mL, 100 to 500 ng / mL is preferable), and the tetraspanin antibody.
  • a solution containing a secondary affinity substance specifically bound to the labeling substance (usually 10 to 5000 ng / mL, preferably 100 to 500 ng / mL), (3) one of avidins and biotins
  • a solution (usually 10-5000 ng / mL, preferably 100-500 ng / mL) containing an antibody that specifically binds to bound tetraspanin (preferably anti-CD9 antibody or anti-CD63 antibody, more preferably anti-CD9 antibody).
  • a solution containing a labeling substance to which the other one of avidins and biotins is bound (usually 10 to 5000 ng / mL, preferably 100 to 500 ng / mL).
  • the device for assisting the diagnosis of Parkinson's disease in the second invention (hereinafter, may be abbreviated as "device for assisting the diagnosis of PD (II)”) is an extracellular sample having phosphatidylserine and tetraspanin in a biological sample derived from a subject.
  • a measuring unit that measures the amount of vesicles and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin, and the ratio of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin.
  • the subject has Parkinson's disease using the calculation unit and the ratio of the amount of phosphatidylserine and tetraspanin-containing extracellular vesicles in the biological sample to the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles in the biological sample as an index. It has a determination unit for determining.
  • the measurement unit, calculation unit, determination unit, etc. constituting the PD diagnosis assisting device (II) may be arranged in the same device or may be separate from each other.
  • the measuring unit in the PD diagnostic assisting device (II) is a site for measuring the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin in the biological sample introduced into the device. Is.
  • the size and configuration of the measuring unit are not particularly limited.
  • the measuring unit is, for example, an imaging device used for imaging using a microplate reader or CCD used in an ELISA method, an imaging device used in a method using a Western blotting method or a microarray (microchip), and a mass spectrometry method. Examples thereof include mass spectrometers, intermolecular interaction analyzers, flow cytometers used for flow cytometry, ultraviolet visible light detectors and fluorescence detectors used for HPLC methods and capillary electrophoresis methods.
  • the subjects, biological samples, and extracellular vesicles in the PD diagnostic assisting device (II) are the same as those described above, and the preferred ones are also the same.
  • the measurement target of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnostic assisting device (II) is the same as that described above in the PD diagnostic assisting method. Yes, and the preferred ones are the same.
  • the measurement of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin in the PD diagnosis assisting device (II) and the substances used for the measurement are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method, and are preferable or specific. The example is similar.
  • the measurement target of the amount of the extracellular vesicle having tetraspanin and the extracellular vesicle having tetraspanin in the PD diagnosis assisting device (II) is the same as that described above in the PD diagnosis assisting method (II), which is preferable. The same is true for things.
  • the measurement of the amount of tetraspanin-containing extracellular vesicles in the PD diagnostic assisting device (II) and the substances used for the measurement are the same as those described above in the PD diagnostic assisting method (II), and preferred ones and specific examples. Is the same.
  • the calculation unit in the PD diagnostic assist device (II) is based on the amount of extracellular vesicles having tetraspanin and the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin obtained in the measuring unit, and the extracellular vesicles having tetraspanin. It is a site for calculating the ratio of the amount of extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin to the amount of vesicles.
  • the size and configuration of the measuring unit are not particularly limited.
  • the calculation unit in the PD diagnostic assisting device (II) is the mass of the extracellular vesicles having phosphatidylserine and tetraspanin and the extracellular vesicles having tetraspanin in the biological sample obtained by the measuring unit in the PD diagnostic assisting device.
  • Measured values that correlate with the concentration and concentration for example, absorbance, change in absorbance, transmitted light, change in transmitted light, fluorescence intensity, change in fluorescence intensity, emission amount, change in emission amount, turbidity, turbidity change rate, After converting scattered light, scattered light change rate, reflectance, reflectance change amount, refractive index, refractive index change amount, etc.) into mass, concentration, etc., phosphatidylserine and tetraspanin with respect to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin. You may calculate the proportion of the amount of extracellular vesicles having.
  • the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of the extracellular vesicles having tetraspanin, such as the measured value and the mass and concentration converted by the calculation unit, is determined in a device such as a memory or a hard disk. It may be stored in a provided storage device or the like.
  • the determination unit in the PD diagnostic assisting device (II) determines Parkinson's disease using the ratio of the amount of phosphatidylserine and the amount of extracellular vesicles having tetraspanin to the amount of extracellular vesicles having tetraspanin calculated by the calculation unit as an index. It is a part to be used. Further, the determination unit in the PD diagnosis assisting device (II) may be a site for distinguishing whether the subject has Parkinson's disease with cognitive symptoms or Parkinson's disease without cognitive symptoms.
  • the determination of Parkinson's disease in the PD diagnosis assisting device (II), the predetermined reference value used for the determination, and the determination method of the predetermined reference value are the same as those described above in the PD diagnosis assisting method (II). The same applies to preferable ones and specific examples.
  • the predetermined reference value in the PD diagnosis assisting device (II) may be stored in advance in the PD diagnosis assisting device (II), or may be stored in advance from the input site of the PD diagnosis assisting device (II) at the time of determination. It may be entered.
  • the PD diagnosis assisting device (II) may include an output unit.
  • the output unit performs processing such as displaying or outputting the result of the determination on a display device such as a display or a printing device such as a printer.
  • data (determination result) for assisting a doctor's diagnosis of Parkinson's disease can be obtained.
  • the doctor relates to, for example, a biomarker for Parkinson's disease recommended in the Parkinson's disease medical treatment guidelines such as interview, MIBG myocardial scintigraphy, and dopamine transporter scintigraphy.
  • the test and the test using the candidate substance of the biomarker of Parkinson's disease may be further performed, and the subject can make a diagnosis of Parkinson's disease in consideration of these results and the like.
  • a drug for Parkinson's disease drug or therapeutic drug for delaying the progression of Parkinson's disease
  • a drug for Parkinson's disease drug or therapeutic drug for delaying the progression of Parkinson's disease
  • L-dopa levodopa
  • a drug that may adversely affect cognitive symptoms such as an anticholinergic drug, and for example, dementia such as a cholinesterase inhibitor or mild cognitive impairment. It is preferable to administer drugs for cognitive impairment (drugs and therapeutic agents that slow the progression of dementia and mild cognitive impairment) and perform surgery.
  • determining (distinguishing) whether a subject has Parkinson's disease without cognitive symptoms or Parkinson's disease with cognitive symptoms is useful for a doctor to determine a treatment policy or make a diagnosis.
  • the method, biomarker, reagent kit and device for assisting the diagnosis of Parkinson's disease of the present invention are useful in the field of clinical examination because they can assist the diagnosis of Parkinson's disease. According to the present invention, it is possible to assist in the diagnosis of Parkinson's disease with high accuracy.
  • Example 1 Evaluation of Parkinson's disease specimens (MMSE greater than 27) using the amount of exosomes having PS and CD9 as an index
  • the exosomes were measured by the sandwich ELISA method of Tim protein-anti-CD9 antibody, and the AUC and p values were calculated.
  • MagCapture registered trademark
  • Exosome Solution Kit PS manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter referred to as "A kit”
  • the protein concentration in the obtained exosome solution was measured by the BCA method (bicinchoninic acid method).
  • the obtained exosome solution was measured by the BCA method using the Reaction Buffer attached to PS Capture Exosome ELISA Kit, Streptavidin HRP (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter referred to as "B kit").
  • the reagents attached to the B kit were used.
  • the Washing Buffer (10 ⁇ ) attached to the B kit was diluted 10-fold with purified water (distilled water), and then the Exosome Binding Enhancer (100 ⁇ ) attached to the B kit was obtained with respect to the diluted solution. 1/100 amount was added. The obtained solution is referred to as "cleaning solution (1x)".
  • cleaning solution (1x) the Exosome Binding Enhancer
  • the reaction solution was discarded, and each well was washed 3 times with 300 to 350 ⁇ L of the washing solution ( ⁇ 1). Then, using the Reaction Buffer included in the B kit, the biotin-labeled anti-CD9 mouse monoclonal antibody was diluted to a final concentration of 250 ng / mL to obtain a biotin-labeled antibody reaction solution. 100 ⁇ L of the obtained biotin-labeled antibody reaction solution was dispensed into each well, a plate seal was attached, and the reaction was carried out at room temperature for 1 hour while stirring at about 500 rpm using a microplate shaker.
  • reaction solution was discarded, and each well was washed 3 times with 300 to 350 ⁇ L of the washing solution ( ⁇ 1).
  • Reaction Buffer included in the B kit 1/100 amount of HRP-conjuged Streptavidin (100 ⁇ ) was added and mixed well to prepare an HRP-labeled streptavidin reaction solution (1 ⁇ ).
  • 100 ⁇ L of the obtained HRP-labeled streptavidin reaction solution (1 ⁇ ) was dispensed into each well, a plate seal was attached, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours while stirring at about 500 rpm using a microplate shaker.
  • reaction solution was discarded, and each well was washed 5 times with 300 to 350 ⁇ L of the washing solution (1 ⁇ ).
  • 100 ⁇ L of the TMB (3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine) Solution attached to the B kit returned to room temperature was dispensed into each well, and the mixture was stirred for about 1 minute using a microplate shaker. After that, a plate seal was attached and the mixture was allowed to stand for 30 minutes at room temperature (20 to 25 ° C.). Then, 100 ⁇ L of Stop Solution attached to the B kit returned to room temperature was added to each well, and after stirring for about 5 seconds using a microplate shaker, a 96-well microplate reader (Tecan, Safari2) was immediately used.
  • the absorbance at 450 nm and the absorbance at the sub-wavelength of 620 nm were measured using the mixture.
  • the value obtained by subtracting the sub-wavelength 620 nm absorbance value from the 450 nm absorbance value was defined as the "absorbance value”, and the value obtained by subtracting the blank absorbance value from the absorbance value of the sample diluent for measurement was calculated as the "corrected sample absorbance value”. ..
  • a standard curve was created from the value obtained by subtracting the blank absorbance value from the absorbance value of the exosome dilution series (calibrator) derived from the COLO201 cell culture supernatant and the protein concentration of the calibrator.
  • the corrected sample absorbance value was converted into a protein concentration using a standard curve, and the value obtained by multiplying the obtained conversion value by the sample dilution rate was taken as the “sample measurement value” [ng / mL].
  • (4) Calculation of AUC Based on the sample measurement value obtained in (3), Wilcoxon / Kruskal-Wallis test (registered trademark) 11 (SAS Institute Inc., Carry, NC, USA) was used. The p-value was calculated by performing a significant difference test between Parkinson's disease patients and healthy subjects. Further, based on the sample measurement value obtained in (3), a logistic regression analysis was performed using JMP (registered trademark) 11 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), and the obtained receiver operating characteristics were obtained.
  • JMP registered trademark
  • the area under the curve (AUC) was calculated from the curve (ROC curve). The obtained results are shown in Table 1 below.
  • a box-and-whisker graph created based on the sample measurement values is shown in FIG. In the figure, the vertical axis shows the sample measurement value, the horizontal axis shows the result of a healthy person, and PD shows the result of a Parkinson's disease patient (MMSE is larger than 27).
  • Comparative example 1 Evaluation of Parkinson's disease specimen (MMSE greater than 27) using the amount of exosomes having CD9 as an index Anti-CD9 antibody was immobilized on the solid phase in place of Tim4 protein, and the same method as in Example 1 was used. Exosomes were measured by the CD9 antibody-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method, and a significant difference test was performed between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects, and AUC and p values were calculated. A plate on which the anti-CD9 antibody was immobilized on a solid phase was prepared by the following method.
  • Anti-CD9 mouse monoclonal antibody (1K) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was diluted with 50 mM MOPS (pH 7.5) to a concentration of 10 ⁇ g / mL, and 100 ⁇ L was added to the wells of a 96-well microplate (Nunc). Then, it was incubated overnight in a refrigerator. Wells were washed 3 times with TBST (Tris Buffered Saline, pH 7.4), 300 ⁇ L of TBS (Tris Buffered Saline, pH 7.4) containing 10 mg / mL block ace was added, and the cells were incubated overnight in a refrigerator and antibody-solidified. Used as a companion plate.
  • TBST Tris Buffered Saline, pH 7.4
  • TBS Tris Buffered Saline, pH 7.4
  • Example 2 As the anti-CD9 antibody of the detection antibody, a biotin-labeled antibody was used in the same manner as in Example 1. The obtained results are shown in Table 1 below.
  • a box-and-whisker graph created based on the sample measurement values is shown in FIG. In the figure, the vertical axis shows the sample measurement value, the horizontal axis shows the result of a healthy person, and PD shows the result of a Parkinson's disease patient (MMSE is larger than 27).
  • Example 2 Evaluation of Parkinson's disease sample (MMSE is greater than 27) using the amount of exosomes having PS and CD63 as an index
  • Tim protein-anti-CD63 antibody sandwich ELISA method was used to measure exosomes, and a significant difference test was performed between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects to calculate AUC and p values.
  • the anti-CD63 antibody of the detection antibody the biotin-labeled anti-CD63 antibody attached to PS Capture Exosome ELISA Kit, Streptavidin HRP (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., the above “B kit”) was used. The obtained results are shown in Table 1 below.
  • Comparative example 2 Evaluation of Parkinson's disease specimen using CD63 as an index Comparison except that anti-CD63 mouse monoclonal antibody (3-13) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was immobilized on the solid phase instead of anti-CD9 antibody and used as a detection antibody. Exosomes were measured by the anti-CD63 antibody-anti-CD63 antibody sandwich ELISA method in the same manner as in Example 1, and a significant difference test was performed between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects, and the AUC and p values were determined. Calculated. A plate on which the anti-CD63 antibody was immobilized on a solid phase was prepared by the same method as in Comparative Example 1.
  • the anti-CD63 antibody of the detection antibody As the anti-CD63 antibody of the detection antibody, the biotin-labeled anti-CD63 antibody attached to PS Capture Exosome ELISA Kit, Streptavidin HRP (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., the above “B kit”) was used. The obtained results are shown in Table 1 below.
  • Example 3 Evaluation of Parkinson's Disease Dementia Specimen Using the Amount of Exosomes Having PS and CD81 as an Index
  • An anti-CD81 mouse monoclonal antibody (17B1) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used instead of the anti-CD9 antibody as a detection antibody.
  • Exosomes were measured by the sandwich ELISA method of Tim protein-anti-CD81 antibody by the same method as in Example 1, and a significant difference test was performed between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects. The p value was calculated.
  • As the anti-CD81 antibody of the detection antibody a biotin-labeled antibody was used in the same manner as in Example 1. The obtained results are shown in Table 1 below.
  • Example 4 Evaluation of Parkinson's disease sample (MMSE is greater than 27) using the ratio of the amount of PS and the amount of exosomes having CD9 to the amount of exosomes having CD9 Obtained in Example 1 (Tim protein-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method). Divide the obtained “sample measurement value” (value (A)) by the “sample measurement value” (value (B)) obtained in Comparative Example 1 (anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method). (A) / (B) (hereinafter referred to as "corrected sample measurement value”) was obtained.
  • FIG. 2 shows a box-and-whisker graph created based on the corrected sample measurement values.
  • the vertical axis shows the adjusted sample measurement values ((A) / (B))
  • the horizontal axis shows the results of healthy subjects
  • PD shows the results of Parkinson's disease patients (MMSE is larger than 27).
  • Example 5 Evaluation of Parkinson's disease sample (MMSE is greater than 27) using the ratio of the amount of PS and the amount of exosomes having CD63 to the amount of exosomes having CD63 Obtained in Example 2 (Tim protein-anti-CD63 antibody sandwich ELISA method). Divide the obtained "sample measurement value" (value (A)) by the “sample measurement value” (value (B)) obtained in Comparative Example 2 (anti-CD63 antibody-anti-CD63 antibody sandwich ELISA method). (A) / (B) (corrected sample measurement value) was obtained.
  • Parkinson's disease was evaluated using plasma from patients with Parkinson's disease (MMSE greater than 27) without cognitive symptoms and plasma from healthy subjects, respectively, and the amount of tetraspanin-bearing exosomes of CD9, CD63, or CD81 as an index.
  • the AUC was 0.855, 0.848, and 0.642, respectively.
  • the amount of exosomes having phosphatidylserine to which tetraspanin and Tim protein of CD9, CD63, or CD81 bind is used as an index.
  • the AUCs were 0.929, 0.899, and 0.916, respectively, and it was found that Parkinson's disease (particularly Parkinson's disease without cognitive symptoms) can be detected with high accuracy.
  • the corrected sample measurement value ((value (B)) obtained by dividing the sample measurement value (value (A)) of the exosome having phosphatidylserine and CD63 by the sample measurement value (value (B)) of the exosome having CD63.
  • the AUC was 0.892, and it was found that Parkinson's disease (particularly Parkinson's disease without cognitive symptoms) could be detected with high accuracy.
  • the corrected sample measurement value ((value (B)) obtained by dividing the sample measurement value (value (A)) of the exosome having phosphatidylserine and CD9 by the sample measurement value (value (B)) of the exosome having CD9.
  • the AUC was 0.973, and it was found that Parkinson's disease (particularly Parkinson's disease without cognitive symptoms) can be detected with extremely high accuracy.
  • Example 6 Evaluation of Parkinson's disease specimens (MMSE 27 or less) using the ratio of the amount of PS and CD9 exosomes to the amount of CD9 exosomes "8 Parkinson's disease patients (MMSE 27 or less) purchased from PrecisionMed", Exosomes were measured by the sandwich ELISA method of Tim tan parkin-anti-CD9 antibody by the same method as in Example 1 except that "EDTA plasma of 30 healthy subjects” was used, and "sample measurement value” (sample measurement value) Value (A)) was obtained. In addition, anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody by the same method as in Comparative Example 1 except that "8 samples of Parkinson's disease patients (MMSE of 27 or less) and 30 samples of healthy subjects purchased from PrecisionMed" were used.
  • FIG. 3 shows a box-and-whisker graph created based on the corrected sample measurement values.
  • the vertical axis is the sample measurement value
  • the horizontal axis is the result of healthy subjects
  • PD MMSE is 27 or less
  • PD MMSE is greater than 27
  • the results are shown respectively.
  • Example 7 Evaluation of Parkinson's disease specimens (MMSE greater than 27) using the amount of exosomes with PS and CD9 as an index "8 Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) purchased from PrecisionMed, 30 healthy subjects with EDTA plasma Exosomes were measured by the sandwich ELISA method of Tim protein-anti-CD9 antibody by the same method as in Example 1, and a significant difference between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects. The test was performed and the AUC and p values were calculated. The obtained results are shown in Table 3 below.
  • Comparative example 4 Evaluation of Parkinson's disease specimens (MMSE greater than 27) using the amount of exosomes having CD9 as an index "8 Parkinson's disease specimens (MMSE greater than 27) purchased from PrecisionMed, 30 healthy subjects of EDTA plasma" Exosomes were measured by the anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method in the same manner as in Comparative Example 1 except that they were used, and a significant difference test between Parkinson's disease patients (MMSE greater than 27) and healthy subjects was tested. Was performed, and the AUC and p values were calculated. The obtained results are shown in Table 3 below.
  • Example 8 Evaluation of Parkinson's disease sample (MMSE greater than 27) using the ratio of the amount of PS and the amount of exosomes having CD9 to the amount of exosomes having CD9 Obtained in Example 7 (Tim protein-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method) Divide the obtained "sample measurement value" (value (A)) by the “sample measurement value” (value (B)) obtained in Comparative Example 4 (anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method). (A) / (B) (hereinafter referred to as "corrected sample measurement value”) was obtained.
  • FIG. 3 shows a box-and-whisker graph created based on the corrected sample measurement values.
  • Example 9 Evaluation of Parkinson's disease specimens (MMSE is 27 or less) and Parkinson's disease specimens (MMSE is greater than 27) using the ratio of the amount of PS and the amount of exosomes having CD9 to the amount of exosomes having CD9 "Parkinson purchased from PrecisionMed" Tim protein-anti-CD9 by the same method as in Example 1 except that 8 samples of diseased patients (MMSE of 27 or less) and 8 samples of Parkinson's disease patients (MMSE of greater than 27) purchased from PrecisionMed were used. Exosomes were measured by the antibody sandwich ELISA method to obtain "sample measurement values" (values (A)).
  • FIG. 3 shows a box-and-whisker graph created based on the corrected sample measurement values.
  • Example 10 Evaluation of Parkinson's disease specimens using the amount of exosomes having PS and CD9 as an index "16 Parkinson's disease patients purchased from PrecisionMed (8 specimens with MMSE of 27 or less and 8 specimens with MMSE greater than 27), 30 healthy subjects Exosomes were measured by the sandwich ELISA method of Tim protein-anti-CD9 antibody by the same method as in Example 1 except that "EDTA plasma” was used, and a significant difference test between Parkinson's disease patients and healthy subjects was performed. And the p value were calculated. The obtained results are shown in Table 5 below.
  • a box-and-whisker graph created based on the sample measurement values is shown in FIG. In the figure, the vertical axis shows the sample measurement value, the horizontal axis shows the result of a healthy person, and PD shows the result of a Parkinson's disease patient.
  • Comparative example 7 Evaluation of Parkinson's disease specimens using the amount of exosomes having CD9 as an index "16 Parkinson's disease patients purchased from PrecisionMed (8 specimens with MMSE of 27 or less and 8 specimens with MMSE greater than 27), 30 healthy subjects with ELISA plasma Exosomes were measured by the sandwich ELISA method of anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody by the same method as in Comparative Example 1, and a significant difference test between Parkinson's disease patients and healthy subjects was performed. The p value was calculated. The obtained results are shown in Table 5 below.
  • Example 11 Evaluation of Parkinson's disease sample using the ratio of the amount of PS and the amount of exosomes having CD9 to the amount of exosomes having CD9 "Sample measurement value" obtained in Example 10 (Tim protein-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method). By dividing (value (A)) by the “sample measurement value” (value (B)) obtained in Comparative Example 7 (anti-CD9 antibody-anti-CD9 antibody sandwich ELISA method), (A) / ( B) (hereinafter referred to as "corrected sample measurement value”) was obtained. Based on the obtained adjusted sample measurement values, a significant difference test between Parkinson's disease patients and healthy subjects was performed by the same method as in Example 1 (4), and AUC and p values were calculated.
  • FIG. 5 a box-and-whisker graph created based on the sample measurement values is shown in FIG.
  • the vertical axis shows the adjusted sample measurement value
  • the horizontal axis shows the result of a healthy person
  • PD shows the result of a Parkinson's disease patient.
  • the samples of Parkinson's disease patients with cognitive symptoms (MMSE of 27 or less) and plasmas derived from healthy subjects are used as samples, and the sample measurement values (values (A)) of exosomes having phosphatidylserine and CD9 have CD9.
  • the AUC is 0.804, which is a high accuracy. It was found that Parkinson's disease (particularly Parkinson's disease with cognitive symptoms) can be detected.
  • the sample measurements (value (A)) of exosomes having phosphatidylserine and CD9 were taken from Parkinson's disease patients without cognitive symptoms (MMSE greater than 27) and plasma from healthy subjects, respectively, and CD9 was used.
  • the corrected sample measurement value ((A) / (B)) obtained by dividing by the sample measurement value (value (B)) of the exosome possessed is evaluated, the AUC is 0.950, which is extremely high accuracy. It was found that Parkinson's disease (particularly Parkinson's disease without cognitive symptoms) can be detected.
  • the correlation coefficient between the corrected sample measurement value ((A) / (B)) and the MMSE was 0.7833, and a high correlation was observed.
  • Parkinson's disease is evaluated using plasma derived from Parkinson's disease patients (including Parkinson's disease patients with cognitive symptoms and Parkinson's disease patients without cognitive symptoms) and healthy subjects as samples, and the amount of exosomes having CD9 as an index.
  • AUC was obtained by dividing the sample measurement value (value (A)) of an exosome having 0.764, phosphatidylserine and CD9 by the sample measurement value (value (B)) of an exosome having CD9.
  • the corrected sample measurement values ((A) / (B)) were evaluated, the AUC was 0.877, and it was found that Parkinson's disease could be detected with high accuracy.

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Abstract

本発明の課題は、簡便にパーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置を提供することである。　本発明は、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又はホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量又は前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することを含む、パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置に関する。

Description

パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置
　本発明は、パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置に関する。
　パーキンソン病（ＰＤ）とは、脳内の黒質に存在する神経細胞が変性し、線条体のドパミンが欠乏することでスムーズに体が動かせなくなる神経変性疾患である。パーキンソン病の有病率は１０万人あたり１００～１５０人と高く、加齢により有病率が上がることから、高齢化に伴い急速に患者数が増加している。
　現在パーキンソン病の根治療法はないが、レボドパ（Ｌ－Ｄｏｐａ）などドパミン前駆物質治療薬やドパミンアゴニストを投与し、脳内で減少したドパミン作用を補充することで運動症状を改善することができることが知られている。その為、パーキンソン病の病態を客観的に判定できるバイオマーカーが求められている。
　パーキンソン病の診断方法としては、抗ＮＣＡＭ抗体や抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いて血液中の神経由来細胞外小胞を濃縮し、当該細胞外小胞に含まれるαシヌクレイン等を指標として、パーキンソン病を判定する方法が報告されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２）。
特願２０１６－５５０６７３ 特願２０１７－５２０７６０
Ｃ．Ｎ．　Ｗｉｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　／　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　＆　Ｄｅｍｅｎｔｉａ：　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　＆　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　（２０１６）　３　：６３－７２ Ｍｕｓｔａｐｉｃ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．　Ｆｒｏｎｔ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　（２０１７）　１１：２７８
　しかし、血液中の神経由来細胞外小胞を指標としてパーキンソン病を診断する方法は、検体から神経由来細胞外小胞をアフィニティー濃縮する操作が必要であり、操作が煩雑である。また、検体を直接測定することができない為、アッセイ間での誤差が生じやすく、多検体測定への適用は困難である。
　前述の状況に鑑み、本発明は、簡便にパーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置の提供を課題とする。
　本発明者らは、特定の細胞外小胞がパーキンソン病の診断を補助する為のバイオマーカーとなり得るかについて検討した。
　その結果、本発明者らは、細胞外小胞のうち、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する特定の細胞外小胞がパーキンソン病の診断補助用バイオマーカーとなることを新たに見出し、発明を完成するに至った。
　本発明は、以下のパーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置に関する。
［１］被験者に由来する生体試料中の、
　ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は
　ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること、
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することを含む、
　パーキンソン病の診断を補助する方法。
［２］前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合が基準値以下の場合に、被験者がパーキンソン病であると判定することである、［１］に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［３］前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
　前記テトラスパニンが、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１から選ばれるものである、［１］又は［２］に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［４］前記細胞外小胞の量を測定することが、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定が、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いて前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することである、［１］～［３］から選ばれるいずれか一つに記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［５］前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、［４］に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［６］前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
　前記生体試料が、血液試料又は脳脊髄液である、［１］～［５］から選ばれるいずれか一つに記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［７］前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
　前記テトラスパニンが、ＣＤ９又はＣＤ６３である、［１］又は［２］に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［８］前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することが、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いて前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することが、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質を用いて前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することである、［１］、［２］及び［７］から選ばれるいずれか一つに記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［９］前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、［８］に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［１０］前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
　前記生体試料が、血液試料又は脳脊髄液である、［１］～［２］及び［７］～［９］から選ばれるいずれか一つに記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［１１］前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者が認知症状のあるパーキンソン病と認知症状のないパーキンソン病のいずれの疾患に罹患しているのかを判定することである、［１］～［２］及び［７］～［１０］から選ばれるいずれか一つに記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
［１２］テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を含む、パーキンソン病の診断補助用試薬キット。
［１３］ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を含む、パーキンソン病の診断補助用バイオマーカー。
［１４］被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する測定部、及び
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する、パーキンソン病の診断補助用装置。
［１５］被験者に由来する生体試料中の、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する測定部、
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を算出する演算部、及び
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する、パーキンソン病の診断補助用装置。
［１６］ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞を含む、パーキンソン病の診断補助用バイオマーカーセット。
　本発明によれば、簡便に、パーキンソン病の診断を補助することができる。
図１はホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの量を指標として認知症状のないパーキンソン病患者由来血漿検体及び健常者由来血漿検体を評価した箱ひげグラフである。 図２はＣＤ９を有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標として認知症状のないパーキンソン病患者由来血漿検体、健常者由来血漿検体を評価した箱ひげグラフである。 図３はＣＤ９を有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標として認知症状のないパーキンソン病患者由来血漿検体、認知症状のあるパーキンソン病患者由来血漿検体、健常者由来血漿検体を評価した箱ひげグラフである。 図４はホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの量を指標としてパーキンソン病患者由来血漿検体及び健常者由来血漿検体を評価した箱ひげグラフである。 図５はＣＤ９を有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標としてパーキンソン病患者由来血漿検体及び健常者由来血漿検体を評価した箱ひげグラフである。
　本明細書において、範囲の上限と下限を示す場合、特別に記載した場合を除き、Ａ～ＢはＡ以上Ｂ以下であることを示す。
　細胞外小胞は、細胞に由来する、脂質二重膜で構成される小型膜小胞である。当該細胞外小胞は、例えば、２０ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有するものが挙げられ、５０ｎｍ～８００ｎｍのものが好ましく、５０ｎｍ～５００ｎｍのものがより好ましく、５０ｎｍ～２００ｎｍのものが特に好ましい。前記細胞外小胞としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９，　５８１－５９３　（Ａｕｇｕｓｔ　２００９）、「肥満研究」Ｖｏｌ．１３　Ｎｏ．２　２００７　トピックス　青木直人等に記載の通り、その発生起源や小型膜小胞の大きさ等により様々に分類されるものが挙げられる。具体的には、エクソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エクソソーム様小胞、アポトーシス小体、アディポソーム等が挙げられ、エクソソーム及び微小胞が好ましく、エクソソームがより好ましい。
　前記エクソソームは、細胞に由来する、脂質二重膜で構成された小型膜小胞であり、例えば、５０ｎｍ～２００ｎｍの直径を有するものが挙げられ、５０ｎｍ～１５０ｎｍのものが好ましく、５０ｎｍ～１００ｎｍのものがより好ましい。なお、エクソソームは、後期エンドソームに由来すると考えられている。
　前記微小胞は、細胞に由来する、脂質二重膜で構成された小型膜小胞であり、例えば、１００ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有するものが挙げられ、１００ｎｍ～８００ｎｍのものが好ましく、１００ｎｍ～５００ｎｍのものがより好ましい。なお、微小胞は、細胞膜に由来すると考えられている。
　前記細胞外小胞は、被験者に由来する生体試料に含有されるものであっても、被験者に由来する生体試料から単離されたものであってもよく、被験者に由来する生体試料から単離されたものが好ましい。
　前記被験者に由来する生体試料としては、細胞外小胞を含みうるものであれば何れでもよく、例えば血清、血漿、全血、バフィーコート等の血液由来試料、脳脊髄液、尿、唾液、精液、胸部滲出液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の体液試料が挙げられ、血液由来試料、脳脊髄液が好ましく、血清、血漿、脳脊髄液がより好ましく、血清、血漿が更に好ましく、血漿が特に好ましい。また、被験者への試料採取の負担が軽いことから血液由来試料がより有用である。
　前記被験者に由来する生体試料は、例えば、被験者から直接採取されたものであっても、回収、濃縮、精製、単離、緩衝液等による希釈、ろ過滅菌等の前処理を行ったものであってもよい。これら前処理は、常法に従い適宜行えばよい。以下、前記被験者に由来する生体試料を「生体試料」と略記する場合がある。
　前記生体試料から細胞外小胞を単離する方法としては、常法に従い行えばよく、特に限定されない。前記生体試料から細胞外小胞を単離する方法としては、例えば、アフィニティー法（例えば、ＰＳアフィニティー法）、分画遠心分離法（例えば、ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等の超遠心法）、免疫沈降法、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル浸透クロマトグラフィー法）、密度勾配法（例えば、ショ糖密度勾配法）、電気泳動法（例えば、オルガネラ電気泳動法）、磁気分離法（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法）、限外濾過濃縮法（例えば、ナノ膜限外濾過濃縮法）、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法、ＰＥＧ沈殿法等が挙げられ、高い精製度の細胞外小胞を得られることからアフィニティー法、又は理論的に偏りの無い回収が可能であることから分画遠心分離法が好ましく、アフィニティー法又は超遠心法がより好ましく、アフィニティー法が特に好ましい。アフィニティー法の中でも、ホスファチジルセリンに対するアフィニティー精製であるＰＳアフィニティー法が好ましい。アフィニティー法及び分画遠心分離法は、例えば、ＷＯ２０１６／０８８６８９に記載の方法に準じておこなえばよい。
　これらの単離方法は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせてもよい。また、１種の単離方法による単離を２回以上繰り返してもよい。
　前記被験者としては、特に限定されず、例えば、診断基準に基づいてパーキンソン病と診断されたヒト、診断基準に基づいてパーキンソン病を発症するリスクがあると診断されたヒト、パーキンソン病の診断を受けていないヒト、診断基準に基づいてパーキンソン病であると診断されなかったヒト、又は診断基準に基づいてパーキンソン病を発症するリスクがあると診断されなかったヒトが挙げられ、診断基準に基づいてパーキンソン病と診断されたヒト、診断基準に基づいてパーキンソン病を発症するリスクがあると診断されたヒト、パーキンソン病の診断を受けていないヒトが好ましい。
　前記診断基準としては、例えば、問診、ＭＩＢＧ心筋シンチグラフィー、ドパミントランスポーターシンチグラフィー等のパーキンソン病診療ガイドラインで推奨されているパーキンソン病のバイオマーカー等に関する検査、パーキンソン病のバイオマーカーの候補物質に関する検査等の結果に基づいて、パーキンソン病であると診断する際に用いられる診断基準等が挙げられる。
　本発明は、パーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置に関する。
　本発明には、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を含むバイオマーカーを使用し、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定する場合（以下、「第１発明」と略記する場合がある）と、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、テトラスパニンを有する細胞外小胞を含むバイオマーカーを組み合わせて使用し、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定する場合（以下、「第２発明」と略記する場合がある）が含まれる。
　１．第１発明
　＜パーキンソン病の症診断補助用バイオマーカー＞
　第１発明におけるパーキンソン病の診断補助用バイオマーカー（以下「ＰＤマーカー」と略記する場合がある）は、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を含む。
　ＰＤマーカーにおける細胞外小胞は、前記のものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤマーカーにおけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１等の少なくとも一つのテトラスパニン及びリン脂質であるホスファチジルセリンを膜表面に有しており、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニン並びにホスファチジルセリンを有するものが好ましく、ＣＤ９及びＣＤ８１から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニン並びにホスファチジルセリンを有するものがより好ましく、ＣＤ９及びホスファチジルセリンを有するものが特に好ましい。
　＜パーキンソン病の診断を補助する方法＞
　第１発明におけるパーキンソン病の診断を補助する方法（以下「ＰＤ診断補助方法」と略記する場合がある）は、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること、当該生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することを含む。
　ＰＤ診断補助方法における、生体試料、被験者、細胞外小胞は、それぞれ前記のものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＰＤマーカーにおいて前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法における「量」としては、質量や濃度が挙げられる。また、前記「量」には、質量や濃度と相関関係を有する実測値（例えば、吸光度、吸光度変化量、透過光、透過光変化量、蛍光強度、蛍光強度変化量、発光量、発光量変化量、濁度、濁度変化率、散乱光、散乱光変化率、反射率、反射率変化量、屈折率、屈折率変化量等）も含まれる。
　ＰＤ診断補助方法におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、１種のテトラスパニン及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量のみ（例えば、ＣＤ９及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞のみ）を測定対象としても、２種以上のテトラスパニン及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量（例えば、ＣＤ９及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞、並びにＣＤ８１及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞）を測定対象としてもよく、１種のテトラスパニン及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量のみを測定対象とするのが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、通常この分野でなされる方法であれば、特に限定されない。当該測定は、例えば、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いた免疫学的測定方法、質量分析法、これらを組み合わせた方法等を用いればよく、中でも、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いた免疫学的測定方法が好ましい。なお、当該免疫学的測定方法には、免疫反応（抗原抗体反応）を利用する方法の他、例えばレクチンとタンパク質の結合等の抗原抗体反応以外の２分子間における結合力を利用する方法（免疫学的測定方法に準じた方法）も含まれる。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質としては、テトラスパニンに対して特異的に結合する物質であればよく、例えば、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体やテトラスパニンが有する糖鎖に対して特異的に結合するレクチン等のテトラスパニンに対して特異的に結合するタンパク質、テトラスパニンに対して特異的に結合する核酸等が挙げられ、テトラスパニンに対して特異的に結合するタンパク質が好ましく、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体がより好ましい。テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体としては、例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ１５１抗体等が挙げられ、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ８１抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい。前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、１種のみを用いても、２種以上を用いても何れでもよく、１種のみを用いるのが好ましい。
　前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質としては、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する物質であればよく、例えば、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合するタンパク質、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する核酸等が挙げられ、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合するタンパク質が好ましい。ホスファチジルセリンに対して特異的に結合するタンパク質としては、例えば、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体やホスファチジルセリン親和性タンパク質が挙げられ、ホスファチジルセリン親和性タンパク質が好ましい。ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体としては、例えば抗ホスファチジルセリン抗体１Ｈ６（メルク（株））等が挙げられる。ホスファチジルセリン親和性タンパク質としては、例えば、Ｔｉｍ１（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子１、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｍｕｃｉｎ－ｄｏｍａｉｎ　１）、Ｔｉｍ２（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子２、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｍｕｃｉｎ－ｄｏｍａｉｎ　２）、Ｔｉｍ３（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子３、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｍｕｃｉｎ－ｄｏｍａｉｎ　３）、Ｔｉｍ４（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４、Ｔ－ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｍｕｃｉｎ－ｄｏｍａｉｎ　４）等のＴｉｍタンパク質；抗ホスファチジルセリン抗体；Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ；ＭＦＧ－Ｅ８等が挙げられ、Ｔｉｍタンパク質、抗ホスファチジルセリン抗体が好ましく、Ｔｉｍタンパク質がより好ましい。また、Ｔｉｍタンパク質としては、Ｔｉｍ１、Ｔｉｍ４が好ましく、Ｔｉｍ４がより好ましい。
　前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、１種類のみを用いても、２種類以上を用いてもよく、１種類のみを用いるのが好ましい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、市販品でも常法により適宜調製されたものでもよい。また、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体や前記ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いてもよい。また、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体や前記ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体は、免疫グロブリン分子そのもの（ｉｎｔａｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のみならず、その断片であって抗原への結合能を有する断片であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）等のフラグメント抗体や一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等の合成抗体等を用いてもよい。また、これらの抗体を調製する場合は、例えば「免疫測定法」（生物化学的測定研究会編集、講談社、２０１４）等に記載の方法に従っておこなえばよい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、標識物質により標識されたものであってもよい。当該標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素類、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位元素、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、４－メチルウンベリフェロン、ＨｉＬｙｔｅ、Ａｌｅｘａ、ＣｙＤｙｅ又はローダミン、或いはこれらの誘導体等の蛍光性物質、ルシフェリン、ルミノール、ルテニウム錯体等の発光性物質、フェノール、ナフトール、又はアントラセン、或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、４－アミノ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子等が挙げられ、酵素類、蛍光性物質が好ましい。当該標識物質で前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を標識する方法は、特に制限されず、自体公知の標識方法に従って行えばよい。これらの標識物質の測定は、標識物質に応じた自体公知の測定方法に従って行えばよい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、これら又はいずれか一方を一次親和性物質とし、当該一次親和性物質に対して特異的に結合する２次親和性物質（例えば、２次抗体）をさらに用いてもよい。当該２次親和性物質は、標識物質により標識されたものであってもよく、標識されたものが好ましく、標識物質により標識された２次抗体がより好ましい。また、当該標識物質や標識方法は前記したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　また、標識物質による標識は、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質にアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたもの、並びに標識物質にアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させたものを用いて、アビジン類とビオチン類の結合を利用してもよい。ビオチン類としては、ビオチン、イミノビオチン、デスチオビオチン、ビオシチン、ビオチンスルホキド等が挙げられ、ビオチンが好ましい。アビジン類としては、アビジン、タマビジン、タマビジン２、ストレプトアビジン等が挙げられ、ストレプトアビジンが好ましい。前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質にアビジン類及びビオチン類の一方を結合させる方法、標識物質にアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させる方法は、常法に従って行えばよい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は固相に固定化されていてもよく、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が固相に固定化されているのが好ましい。
　前記固相としては、例えばラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス、スリガラス、セラミックス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の無機物質等が挙げられる。また、これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記固相の形状は特に限定されず、例えば、マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ビーズ、チューブ（マイクロチューブ）、粒子、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、ディスク状片、試験管等が挙げられる。
　前記固相にテトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を固定化する方法としては、通常この分野で用いられる方法であれば特に限定されず、常法に従って行えばよい。
　ＰＤ診断補助方法において、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の組み合わせは特に限定されないが、前記テトラスパニンに対して特異的に結合するタンパク質と前記ホスファチジルセリンに対して特異的に結合するタンパク質の組み合わせが好ましく、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体と前記ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又は前記ホスファチジルセリン親和性タンパク質の組み合わせがより好ましい。
　当該テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はホスファチジルセリン親和性タンパク質の組み合わせとしては、例えば、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とＴｉｍタンパク質又はホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体の組み合わせが挙げられ、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、又は抗ＣＤ８１抗体とＴｉｍタンパク質の組み合わせが好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体とＴｉｍタンパク質の組み合わせがより好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体とＴｉｍ１又はＴｉｍ４の組み合わせが更に好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体とＴｉｍ４の組み合わせが特に好ましく、抗ＣＤ９抗体とＴｉｍ４の組み合わせが最も好ましい。
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、具体的には、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光酵素免疫法（ＦＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）、免疫複合体転移法、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ法）、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＯＣＩ法）、Ｌｉｑｕｉｄ－ｐｈａｓｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓｓａｙ－ＥｌｅｃｔｒｏＫｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｔｅ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　Ａｓｓａｙ（ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法）、レクチン電気泳動法等のキャピラリー電気泳動法、ウエスタンブロット法、ラテックス免疫比ろう法等の免疫比ろう法（ＮＩＡ法）、ラテックス免疫比濁法等の免疫比濁法（ＴＩＡ法）、微粒子計数免疫凝集測定法（ＰＣＩＡ法）等の免疫凝集法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を用いて目的分子の存在を検出するアッセイ等の自体公知の免疫学的測定法や質量分析法が挙げられ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）、キャピラリー電気泳動法が好ましく、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ＬＢＡ－ＥＡＴＡ法がより好ましく、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）が特に好ましい。
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定原理は特に限定されず、例えば、サンドイッチ法、競合法等が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。また、当該測定原理として、ホモジアニス法、ヘテロジニアス法等を用いてもよく、ヘテロジニアス法が好ましい。
　前記免疫学的測定法に準じた方法としては、例えば、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体や前記ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体以外の前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質や前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いて、前記免疫学的測定法を行う方法等が挙げられ、好ましい方法も同様のものが挙げられる。
　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、具体的には、ＷＯ２０１６／０８８６８９に記載の方法に準じておこなえばよく、当該公報のすべての記載は本明細書に組み込まれる。
　ＰＤ診断補助方法におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、具体的には、例えば、（１）生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させ、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを含む複合体を形成させる工程（以下、「複合体形成工程」と略記する場合がある）、及び（２）当該複合体の量を測定する工程（以下、「複合体量測定工程」と略記する場合がある）を含む方法が好ましい方法として挙げられる。
　テトラスパニンに対して親和性を有する物質と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質及びその組み合わせ等の具体例、好ましい例は前記のものと同様である。
　複合体形成工程におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質と生体試料とを接触させる順序は特に限定されないが、生体試料とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させた後にテトラスパニンに対して親和性を有する物質を接触させるのが好ましい。
　すなわち、複合体形成工程は、生体試料とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させて生体試料中の細胞外小胞とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とから構成される第１の複合体を形成させる第１手順と、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とを接触させて、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とから構成される第２の複合体を形成させる第２手順を含むのが好ましい。
　複合体形成工程は、具体的には、例えば、固相に固定化したホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍ１又はＴｉｍ４が好ましく、Ｔｉｍ４がより好ましい）と生体試料とを接触させて、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質と生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞との第１の複合体を形成させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とを接触させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させる。
　複合体を形成させた後、少なくとも複合体量測定工程の前に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　具体的には、例えば、上記方法において第１の複合体を形成させた後又は／及び第２の複合体を形成させた後に洗浄操作を行えばよく、第１の複合体を形成させた後に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行い、更に第２の複合体を形成させた後に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　複合体量測定工程は、複合体形成工程で得られた、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を含む複合体の量を測定する工程であり、当該複合体の量が測定できる方法であれば、いずれの方法であってもよい。
　複合体量測定工程は、より具体的には、例えば、（１）標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体を用いるか、（２）「テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体」に対して特異的に結合する、標識物質により標識された標識２次抗体を用いるか、（３）アビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させた標識物質を用いるか等して、前述の複合体形成工程で得られた、固相に固定化したホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍ１又はＴｉｍ４が好ましく、Ｔｉｍ４がより好ましい）と生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体と標識物質（酵素類、蛍光性物質が好ましい）を含む複合体における標識物質を検出すればよい。
　複合体量測定工程において、標識物質を検出する前に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、より具体的には、例えば、固相プレートに固定化したホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍ１又はＴｉｍ４が好ましく、Ｔｉｍ４がより好ましい）と生体試料とを接触させて、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質と生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞との第１の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離後、（１）当該第１の複合体と標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とを接触させ、当該第１の複合体と標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させる、（２）前記第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とを接触させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離後、当該第２の複合体と「当該テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体」に対して特異的に結合する、標識物質により標識された標識２次抗体とを接触させ、当該第２の複合体と当該標識２次抗体との第３の複合体を形成させる、或いは（３）前記第１の複合体とアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とを接触させ、当該第１の複合体とアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離後、当該第２の複合体とアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させた標識物質（酵素類、蛍光性物質が好ましい）の第３の複合体を形成させ、Ｂ／Ｆ分離の後、得られる第２の複合体又は第３の複合体の標識物質を検出すればよい。
　生体試料の量や生体試料中のタンパク質の量（濃度）、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（濃度）や粒子数、これらと反応させるテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の量（濃度）、標識物質や標識方法等は、生体試料の種類、要求される測定感度、用いる測定方法や測定装置などに応じて適宜設定すればよい。
　また、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（濃度）等は、標準品を用いて検量線を作成することにより算出してもよい。当該標準品としては、例えば、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞等が挙げられる。
　ＰＤ診断補助方法におけるパーキンソン病の判定は、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、パーキンソン病を判定することを含む。
　当該パーキンソン病の判定としては、例えば、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性の有無の判定、被験者がパーキンソン病を発症するリスクが高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病を発症するリスクの有無の判定が挙げられ、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性の有無の判定が好ましい。
　ＰＤ診断補助方法におけるパーキンソン病の判定は、例えば、前述のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定により得られた、被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を、予め定めた基準値（カットオフ値）と比較することによりなされる。
　具体的には、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量が予め定めた基準値以下の場合は、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者がパーキンソン病に罹患している可能性がある、或いは被験者がパーキンソン病を発症するリスクが高い、又は被験者がパーキンソン病を発症するリスクがあると判定できる。
　また、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量が予め定めた基準値より大きい場合は、被検者がパーキンソン病に罹患している可能性が低い又は被検者がパーキンソン病に罹患している可能性がない、或いは被験者がパーキンソン病を発症するリスクが低い、又は被験者がパーキンソン病を発症するリスクがないと判定できる。
　前記予め定めた基準値（カットオフ値）は、パーキンソン病患者と健常者とを区別するために予め設定される、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量である。
　前記予め定めた基準値の決定方法は、特に限定されず、例えば、パーキンソン病に罹患している患者及び健常者から取得した生体試料に含まれるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定し、得られたホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を用いて、ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）等の統計解析により定めることができる。前記予め定めた基準値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。前記予め定めた基準値は、例えば、感度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましく、例えば、特異度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましい。
　＜パーキンソン病の診断補助用試薬キット＞
　第１発明におけるパーキンソン病の診断補助用試薬キット（以下、「ＰＤ診断補助用試薬キット」と略記する場合がある）は、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を含む。
　ＰＤ診断補助用試薬キットにおける、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、それぞれＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　当該テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及び当該ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、それぞれ溶液状態であっても、凍結状態や乾燥状態、凍結乾燥状態であってもよい。また、当該テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及び当該ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、一つの試薬としてキットに含まれていても別々の試薬としてキットに含まれていてもよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キットにおけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の組み合わせは、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様の組み合わせが挙げられ、好ましい組み合わせも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キットにおけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、固相に固定化されていてもよく、また標識物質により標識されていてもよい。当該固相や固相への固定化方法、当該標識物質や標識方法としては、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キットは、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質に対して特異的に結合する２次親和性物質（例えば、２次抗体）をさらに含んでいてもよい。ＰＤ診断補助用試薬キットにおける当該２次親和性物質は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。また、ＰＤ診断補助用試薬キットにおける２次親和性物質は、標識物質により標識されたものであってもよく、当該標識物質や標識方法はＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キットにおける前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、アビジン類及びビオチン類の一方が結合したものでもよく、当該アビジン類及びビオチン類としては、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キットは、さらにアビジン類及びビオチン類の一方が結合した標識物質を含んでいてもよく、当該標識物質や標識方法としては、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キットにおけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の濃度（量）は、測定方法に応じて、通常この分野で用いられている範囲で適宜設定されればよい。テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、例えば、使用時の濃度として、固相に固定化する場合は、通常１０～２００００ｎｇ／ｍＬ、１００～１００００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましく、検出に用いる場合は、通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましい。また、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、例えば、使用時の濃度として、固相に固定化する場合は、通常１０～２００００ｎｇ／ｍＬ、１００～１００００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましく、検出に用いる場合は、通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましい。
　また、通常この分野で用いられる試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等を、テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質と共存させてもよい。これらの濃度、ｐＨも通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよい。
　さらに、ＰＤ診断補助用試薬キットは、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の他に、これらの親和性物質を用いたテトラスパニン及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量を測定する為に必要な試薬を備えていてもよい。このような試薬としては、例えば、洗浄剤、試料希釈液（試料を希釈する為の試薬）、標識物質を検出する為の試薬、これらの親和性物質に標識物質を結合させる為の試薬、これらの親和性物質を固相に固定化する為の試薬、これらの親和性物質や標識物質にアビジン類又はビオチン類を結合させるための試薬等が挙げられる。これらの試薬の濃度、ｐＨ等も通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キットは、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞について検量線を作成するために用いられる標準品を含んでいてもよい。当該標準品としては、例えば、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞が挙げられる。当該標準品は、溶液状態であっても、凍結状態や乾燥状態、凍結乾燥状態であってもよい。また、通常この分野で用いられる試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等を、当該標準品と共存させてもよい。これらの濃度、ｐＨも通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キットには、添付文書や取扱説明書が含まれていてもよい。当該添付文書や取扱説明書としては、例えば、被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること又は／及びホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することが記載された添付文書や取扱説明書等が挙げられる。これらの添付文書や取扱説明書は、複数のものに分かれて記載されたものであっても、一つのものに纏めて記載されたものであってもよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キットは、具体的には、例えば、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質のいずれか一方が固相に固定化されたものとテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方が、標識物質と結合しているもの又は当該残りの一方の親和性物質とこれを間接的に標識物質と結合する為の成分を含むキットが挙げられる。
　ＰＤ診断補助用試薬キットは、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質のいずれか一方が固相に固定化されたものと下記（１）～（３）から選ばれるいずれか１つを含むキットが好ましいものとして挙げられる。
　（１）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方が標識物質と結合したもの、（２）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方、並びに当該親和性物質に対して特異的に結合する２次親和性物質が標識物質と結合したもの、（３）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方がアビジン類及びビオチン類の一方と結合したもの、並びにアビジン類及びビオチン類の残りの一方が標識物質と結合したもの
　ＰＤ診断補助用試薬キットの好ましい具体例としては、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍ４又はＴｉｍ１がより好ましく、Ｔｉｍ４が特に好ましい）が固定化された固相プレートと下記（１）～（３）から選ばれるいずれか１つを含むキットが挙げられる。
　（１）ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい）又はＴｉｍタンパク質の残りの一方が標識物質と結合したものを含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、（２）ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質の残りの一方を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、並びに当該親和性物質に対して特異的に結合する２次親和性物質が標識物質と結合したものを含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、（３）アビジン類及びビオチン類の一方が結合したテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、並びにアビジン類及びビオチン類の残りの一方が結合した標識物質を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）。
　＜パーキンソン病の診断補助用装置＞
　第１発明におけるパーキンソン病の診断補助用装置（以下、「ＰＤ診断補助用装置」と略記する場合がある）は、被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する測定部、及び前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する。
　ＰＤ診断補助用装置における生体試料、被験者、細胞外小胞は、それぞれ前記のものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用装置を構成する測定部、判定部等は同一の装置内に配置されていても、それぞれ別体となっていてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置における測定部は、装置に導入された生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する部位である。当該測定部の大きさや構成は特に限定されない。当該測定部としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法に用いられるマイクロプレートリーダー又はＣＣＤを用いて撮像するイメージング装置、ウエスタンブロット法又はマイクロアレイ（マイクロチップ）を利用した方法に用いられるイメージング装置、質量分析法に用いられる質量分析装置、分子間相互作用解析装置、及びフローサイトメトリーに用いられるフローサイトメーター、ＨＰＬＣ法やキャピラリー電気泳動法に用いられる紫外可視光検出器や蛍光検出器等が挙げられる。
　ＰＤ診断補助用装置におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、量、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定方法の測定対象は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用装置におけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の測定や当該測定に用いられる物質は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助用装置は、演算部を備えていてもよい。ＰＤ診断補助用装置における演算部は、前記測定部で得られた生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の質量や濃度と相関関係を有する実測値（例えば、吸光度、吸光度変化量、透過光、透過光変化量、蛍光強度、蛍光強度変化量、発光量、発光量変化量、濁度、濁度変化率、散乱光、散乱光変化率、反射率、反射率変化量、屈折率、屈折率変化量等）を、質量や濃度等に換算する部位である。
　なお、当該実測値、演算部により換算された質量や濃度等は、メモリやハードディスクなど装置に備えられた記憶装置等に記憶されてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置における判定部は、前記測定部又は前記演算部で得られたホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、パーキンソン病を判定する部位である。
　ＰＤ診断補助用装置におけるパーキンソン病の判定や当該判定に用いられる予め定められた基準値、予め定められた基準値の決定方法は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助用装置おける予め定められた基準値は、ＰＤ診断補助用装置に予め記憶されていてもよいし、判定の際にＰＤ診断補助用装置の入力部位から入力されてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置は、出力部を備えていてもよい。出力部では、判定の結果をディスプレイなどの表示装置やプリンターなどの印刷装置に表示又は出力させるなどの処理が行われる。
　２．第２発明
　＜パーキンソン病の診断補助用バイオマーカーセット＞
　第２発明におけるパーキンソン病の診断補助用バイオマーカーセット（以下、「ＰＤマーカーセット」と略記する場合がある）は、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、テトラスパニンを有する細胞外小胞を含むバイオマーカーの組み合わせである。
　ＰＤマーカーセットによれば、例えば、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合（以下「ＰＤマーカー（ＩＩ）」と略記する場合がある）を求めることができ、当該割合は、被験者がパーキンソン病であると判定する為の指標として用いることができる。
　また、ＰＤマーカー（ＩＩ）によれば、被験者が、認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかを区別する為の指標として用いることもできる。
　ＰＤマーカーセットにおける細胞外小胞は、前記細胞外小胞と同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤマーカーセットにおけるホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１等の少なくとも一つのテトラスパニン及びリン脂質であるホスファチジルセリンを膜表面に有しており、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニン並びにホスファチジルセリンを有するものが好ましく、ＣＤ９及びＣＤ６３から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニン並びにホスファチジルセリンを有するものがより好ましく、ＣＤ９及びホスファチジルセリンを有するものが特に好ましい。
　ＰＤマーカーセットのテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１等の少なくとも一つのテトラスパニンを膜表面に有しており、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニンを有するものが好ましく、ＣＤ９及びＣＤ６３から選ばれる少なくとも一つのテトラスパニンを有するものがより好ましく、ＣＤ９を有するものが特に好ましい。
　ＰＤマーカーセットのホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞におけるテトラスパニンは、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞におけるテトラスパニンと同一のものであっても異なるものであってもよく、同一のものが好ましい。
　＜パーキンソン病の診断を補助する方法（ＩＩ）＞
　第２発明におけるパーキンソン病の診断を補助する方法（以下、「ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）」と略記する場合がある）は、生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、及び生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合（ＰＤマーカー（ＩＩ））を算出すること、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することを含む。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における生体試料、被験者、細胞外小胞は、それぞれ前記のものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＰＤマーカーセットにおいて前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における、量、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定対象、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定や当該測定に用いられる物質は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様のものが挙げられ、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体、並びにテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はホスファチジルセリン親和性タンパク質の組み合わせ以外は、好ましいものや具体例もＰＤ診断補助方法において前述したものと同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体としては、例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ１５１抗体等が挙げられ、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、１種のみを用いても、２種以上を用いても何れでもよく、１種のみを用いるのが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はホスファチジルセリン親和性タンパク質の組み合わせとしては、例えば、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とＴｉｍタンパク質又はホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体の組み合わせが挙げられ、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、又は抗ＣＤ８１抗体とＴｉｍタンパク質の組み合わせが好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体とＴｉｍタンパク質の組み合わせがより好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体とＴｉｍ１又はＴｉｍ４の組み合わせが更に好ましく、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体とＴｉｍ４の組み合わせが特に好ましく、抗ＣＤ９抗体とＴｉｍ４の組み合わせが最も好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞は、ＰＤマーカーセットにおいて前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞におけるテトラスパニンと前記テトラスパニンを有する細胞外小胞におけるテトラスパニンは同一のものであっても異なるものであってもよく、同一のものが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、１種のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（例えば、ＣＤ９を有する細胞外小胞のみ）を測定対象としても、２種以上のテトラスパニン細胞外小胞の量（例えば、ＣＤ９を有する細胞外小胞、及びＣＤ６３を有する細胞外小胞）を測定対象としてもよく、１種のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量のみを測定対象とするのが好ましい。
　当該テトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、通常この分野で用いられる方法であれば、特に限定されず、例えば、テトラスパニンに対して親和性を有する物質を用いる免疫学的測定方法、質量分析法、これらを組み合わせた方法が挙げられ、テトラスパニンに対して親和性を有する物質を用いる免疫学的測定方法が好ましい。なお、当該免疫学的測定方法には、免疫反応（抗原抗体反応）を利用する方法だけでなく、例えばレクチンとタンパク質の結合等の抗原抗体反応以外の２分子間における結合力を利用する方法（免疫学的測定方法に準じた方法）も含まれる。
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質としては、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様のものが挙げられ、テトラスパニンに対して特異的に結合するタンパク質が好ましく、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体がより好ましい。当該テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体としては、例えば、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ１５１抗体等が挙げられ、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい。前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、１種のみを用いても、２種以上を用いてもよく、１種のみを用いるのが好ましい。
　前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、市販品でも常法により適宜調製されたものでもよい。また、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いてもよい。また、前記テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体は、免疫グロブリン分子そのもの（ｉｎｔａｃｔ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のみならず、その断片であって抗原への結合能を有する断片であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）等のフラグメント抗体や一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等の合成抗体等を用いてもよい。また、これらの抗体を調製する場合は、例えば「免疫測定法」（生物化学的測定研究会編集、講談社、２０１４）等に記載の方法に従っておこなえばよい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質は、標識物質によって標識されたものであってもよく、標識物質や標識方法は、ＰＤ診断補助方法と同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　また、ＰＤ診断補助方法と同様、テトラスパニンに対して親和性を有する物質を一次親和性物質とし、当該一次親和性物質に対して特異的に結合する２次親和性物質（例えば、２次抗体）をさらに用いてもよい。当該２次親和性物質は、標識物質により標識されたものであってもよく、当該標識物質や標識方法はＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　さらに、標識物質による標識は、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質にアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたもの、並びに標識物質にアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させたものを用いて、アビジン類とビオチン類の結合を利用してもよい。当該アビジン類や当該ビオチン類、テトラスパニンに対して親和性を有する物質にアビジン類やビオチン類を結合させる方法は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質は、固相に固定化されていてもよく、当該固相や固相に前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質を固定化する方法は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を測定する為に用いられるテトラスパニンに対して親和性を有する物質と、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞を測定する為に用いられるテトラスパニンに対して親和性を有する物質は、少なくとも一つの同一のテトラスパニンに対して親和性を有する物質（例えば、両者の測定に少なくともＣＤ９に対して親和性を有する物質を使用する）を用いても、異なる種類のテトラスパニンに対して親和性を有する物質（例えば、一方の測定にＣＤ９に対して親和性を有する物質を使用し、残りの一方の測定にＣＤ６３に対して親和性を有する物質を使用する）を用いてもよく、少なくとも一つの同一のテトラスパニンに対して親和性を有する物質を使用するのが好ましく、同一のテトラスパニンに対して親和性を有する物質のみを使用する（例えば、両者の測定にＣＤ９に対して親和性を有する物質のみを使用する）のがより好ましく、同一のテトラスパニンに対して親和性を有する物質を一種類のみ（例えば、両者の測定に抗ＣＤ９抗体のみを使用する）を使用するのが特に好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定、測定原理は、ＰＤ診断補助方法においてホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定、測定原理として前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、具体的には、例えば、（１）生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質とを接触させ、生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質を含む複合体を形成させる工程（複合体形成工程）、及び（２）当該複合体の量を測定する工程（複合体量測定工程）を含む方法が好ましい方法として挙げられる。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定における複合体形成工程は、生体試料とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とを接触させて生体試料中の細胞外小胞とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とから構成される第１の複合体を形成させる第１手順と、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とを接触させて、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して親和性を有する物質とから構成される第２の複合体を形成させる第２手順を含むのが好ましい。
　当該第１の複合体を形成させる際に使用するテトラスパニンに対して親和性を有する物質と当該第２の複合体を形成させる際に使用するテトラスパニンに対して親和性を有する物質とは、同一のものが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定における複合体形成工程は、具体的には、例えば、固相に固定化したテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）と生体試料とを接触させて、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体と生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞との第１の複合体を形成させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）を接触させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させる。
　複合体を形成させた後、少なくとも複合体量測定工程の前に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　具体的には、例えば、上記方法において第１の複合体を形成させた後又は／及び第２の複合体を形成させた後に洗浄操作を行えばよく、第１の複合体を形成させた後に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行い、更に第２の複合体を形成させた後に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定における複合体量測定工程は、複合体形成工程で得られた、テトラスパニンを有する細胞外小胞と、テトラスパニンに対して親和性を有する物質を含む複合体の量を測定する工程であり、当該複合体の量が測定できる方法であれば、いずれの方法であってもよい。
　当該複合体量測定工程は、より具体的には、例えば、（１）標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体を用いるか、（２）「テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体」に対して特異的に結合する、標識物質により標識された標識２次抗体を用いるか、（３）アビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体とアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させた標識物質を用いるか等して、前述の複合体形成工程で得られた固相プレートに固定化したテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）と生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）と標識物質（酵素類、蛍光性物質が好ましい）を含む複合体における標識物質を検出すればよい。
　複合体量測定工程において、標識物質を検出する前に洗浄操作（Ｂ／Ｆ分離）を行うのが好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定は、より具体的には、例えば、固相プレートに固定化したテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）と生体試料とを接触させて、テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体と生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞との第１の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離の後、（１）当該第１の複合体と標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）とを接触させ、当該第１の複合体と標識物質により標識されたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させる、（２）前記第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）とを接触させ、当該第１の複合体とテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離後、当該第２の複合体と「当該テトラスパニンに対して特異的に結合する抗体」に対して特異的に結合する、標識物質により標識された標識２次抗体とを接触させ、当該第２の複合体と当該標識２次抗体との第３の複合体を形成させる、或いは（３）前記第１の複合体とアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）とを接触させ、当該第１の複合体とアビジン類及びビオチン類の一方を結合させたテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体との第２の複合体を形成させ、要すればＢ／Ｆ分離後、当該第２の複合体とアビジン類及びビオチン類の残りの一方を結合させた標識物質（酵素類、蛍光性物質が好ましい）の第３の複合体を形成させ、Ｂ／Ｆ分離の後、得られる第２の複合体又は第３の複合体の標識物質（酵素類、蛍光性物質が好ましい）を検出すればよい。
　生体試料の量や生体試料中のタンパク質の量（濃度）、生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（濃度）や粒子数、これらと反応させるテトラスパニンに対して親和性を有する物質の量（濃度）、標識物質や標識方法等は、生体試料の種類、要求される測定感度、用いる測定方法や測定装置などに応じて適宜設定すればよい。
　また、生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（濃度）等は、標準品を用いて検量線を作成することにより算出してもよい。当該標準品としては、例えば、テトラスパニンを有する細胞外小胞等が挙げられる。
　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合は、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）を、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）により除すること（（Ａ）／（Ｂ））により算出すればよい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるパーキンソン病の判定は、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を指標として、パーキンソン病を判定することを含む。
　当該パーキンソン病の判定としては、例えば、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性の有無の判定、被験者がパーキンソン病を発症するリスクが高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病を発症するリスクの有無の判定が挙げられ、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高いか否かの判定、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性の有無の判定が好ましい。
　また、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるパーキンソン病の判定は、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を指標として、被験者が、認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかを判定する（区別する）ことを含みうる。
　本明細書において、認知症状とは、脳の認知機能が後天的な器質的障害によって低下した状態を意味する。具体的には、例えば、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）において３０満点中２７点以下の場合に認知症状があると判断され、例えばアルツハイマー型認知症や軽度認知障害を発症している可能性が考えられる。本明細書において、認知症状があるパーキンソン病とは、パーキンソン病に罹患している又はパーキンソン病を発症する可能性がある、且つ、認知症状を発症している又は認知症状を発症する可能性がある状態であり、例えば、パーキンソン病に罹患している又はパーキンソン病を発症する可能性があり、且つＭＭＳＥが２７点以下の場合である。
　本明細書において、認知症状がないパーキンソン病とは、パーキンソン病に罹患している又はパーキンソン病を発症する可能性がある、且つ、認知症状を発症していない又は認知症状を発症する可能性がない状態であり、例えば、パーキンソン病に罹患している又はパーキンソン病を発症する可能性があり、且つＭＭＳＥが２７点より大きい場合である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるパーキンソン病の判定は、例えば、前述のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定、前述のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定により得られた、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を、予め定めた基準値（カットオフ値）と比較することによりなされる。
　具体的には、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））が予め定めた基準値以下の場合は、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者がパーキンソン病に罹患している可能性がある、或いは被験者がパーキンソン病を発症するリスクが高い、又は被験者がパーキンソン病を発症するリスクがあると判定できる。
　また、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））が予め定めた基準値より大きい場合は、被検者がパーキンソン病に罹患している可能性が低い又は被検者がパーキンソン病に罹患している可能性がない、或いは被験者がパーキンソン病を発症するリスクが低い、又は被験者がパーキンソン病を発症するリスクがないと判定できる。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における予め定めた基準値（カットオフ値）は、パーキンソン病患者と健常者とを区別するために予め設定される、生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における予め定めた基準値の決定方法は、特に限定されず、例えば、パーキンソン病に罹患している患者及び健常者から取得した生体試料に含まれるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）を測定し、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））をそれぞれ算出し、得られたテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を用いて、ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）等の統計解析により定めることができる。当該予め定めた基準値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。前記予め定めた基準値は、例えば、感度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましく、例えば、特異度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）におけるパーキンソン病の判定は、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を指標として、被験者が、健常者であるか、認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかを複数のあらかじめ定めた基準値｛カットオフ値、例えば健常者と認知症状のあるパーキンソン病を区別するためのカットオフ値（以下「健常者／認知症状のあるパーキンソン病基準値」と略記する場合がある）と認知症状のあるパーキンソン病と認知症状のないパーキンソン病を区別するためのカットオフ値（以下「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」と略記する場合がある）｝により判定（区別）してもよく、「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」により、被験者が認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかのみを判定（区別）してもよい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において、被験者が認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかのみを判定する場合における被験者は、診断基準に基づいてパーキンソン病と診断されたヒト、診断基準に基づいてパーキンソン病を発症するリスクがあると診断されたヒトが好ましい。当該診断基準としては、前記のものと同様である。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における、被験者が認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかの判定は、例えば、前述のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定、前述のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定により得られた、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を、予め定めた「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」と比較することによりなされる。
　具体的には、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））が「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」以下の場合は、被験者が認知症状のないパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者が認知症状のないパーキンソン病を発症するリスクが高い、或いは被験者が認知症状のないパーキンソン病を発症するリスクがあると判定できる。
　また、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））が「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」より大きい場合は、被検者が認知症状のあるパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者が認知症状のあるパーキンソン病を発症するリスクが高い、或いは被験者が認知症状のあるパーキンソン病を発症するリスクがあると判定できる。
　「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」の決定方法は、特に限定されず、例えば、認知症状のあるパーキンソン病に罹患している患者及び認知症状のないパーキンソン病に罹患している患者から取得した生体試料に含まれるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）を測定し、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））をそれぞれ算出し、得られたテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を用いて、ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）等の統計解析により定めることができる。当該予め定めた基準値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。前記予め定めた基準値は、例えば、感度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましく、例えば、特異度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましい。
　ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）における被験者が健常者か、認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかの判定は、例えば、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））が、「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」以下の場合は、被験者が認知症状のないパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者が認知症状のないパーキンソン病を発症するリスクが高い、或いは被験者が認知症状のないパーキンソン病を発症するリスクがある；「認知症状のあるパーキンソン病／認知症状のないパーキンソン病基準値」より大きく「健常者／認知症状のあるパーキンソン病基準値」以下である場合は、被験者が認知症状のあるパーキンソン病に罹患している可能性が高い、又は被験者が認知症状のあるパーキンソン病を発症するリスクが高い、或いは被験者が認知症状のあるパーキンソン病を発症するリスクがある；「健常者／認知症状のあるパーキンソン病基準値」より大きい場合は、被検者がパーキンソン病に罹患している可能性が低い又は被検者がパーキンソン病に罹患している可能性がない、或いは被験者がパーキンソン病を発症するリスクが低い、又は被験者がパーキンソン病を発症するリスクがないと判定できる。
　「健常者／認知症状のあるパーキンソン病基準値」の決定方法は、特に限定されず、例えば、健常者および認知症状のあるパーキンソン病患者から取得した生体試料に含まれるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）を測定し、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））をそれぞれ算出し、得られたテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ａ）に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量（Ｂ）の割合（（Ａ）／（Ｂ））を用いて、ＲＯＣ解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）等の統計解析により定めることができる。当該予め定めた基準値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。前記予め定めた基準値は、例えば、感度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましく、例えば、特異度が６０％以上となるように定めることができ、７０％以上となるものが好ましく、８０％以上となるものがより好ましく、９０％以上となるものが更に好ましい。
　＜パーキンソン病の診断補助用試薬キット（ＩＩ）＞
　第２発明におけるパーキンソン病の診断補助用試薬キット（以下、「ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）」と略記する場合がある）は、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を含む。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、それぞれＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。当該テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及び当該ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、それぞれ溶液状態であっても、凍結状態や乾燥状態、凍結乾燥状態であってもよい。また、当該テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及び当該ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、一つの試薬としてキットに含まれていても別々の試薬としてキットに含まれていてもよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の組み合わせは、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において前述した組み合わせと同様の組み合わせが挙げられ、好ましい組み合わせも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、固相に固定化されていてもよく、また標識物質により標識されていてもよい。当該固相や固相への固定化方法、当該標識物質や標識方法は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及び前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質に対して特異的に結合する２次親和性物質（例えば、２次抗体）をさらに含んでいてもよい。ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）における当該２次親和性物質は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。また、ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）における２次親和性物質は、標識物質により標識されたものであってもよく、当該標識物質や標識方法はＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質又は／及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、アビジン類及びビオチン類の一方が結合したものでもよく、当該アビジン類及びビオチン類としては、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、アビジン類及びビオチン類の一方が結合した標識物質を含んでいてもよく、当該標識物質や標識方法としては、それぞれＰＤ診断補助方法において前述したものと同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の濃度（量）は、測定方法に応じて、通常この分野で用いられている範囲で適宜設定されればよい。テトラスパニンに対して親和性を有する物質は、例えば、使用時の濃度として、固相に固定化する場合は、通常１０～２００００ｎｇ／ｍＬ、１００～１００００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましく、検出に用いる場合は、通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましい。また、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、例えば、使用時の濃度として、固相に固定化する場合は、通常１０～２００００ｎｇ／ｍＬ、１００～１００００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましく、検出に用いる場合は、通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬとなる量が含まれるものが好ましい。
　また、ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）におけるテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質は、通常この分野で用いられる試薬類と共存させてもよく、当該試薬としてはＰＤ診断補助用試薬キットと同様である。
　さらに、ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の他に、これらの親和性物質を用いたテトラスパニン及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量又は／及びホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の量を測定する為に必要な試薬を備えていてもよい。このような試薬としては、ＰＤ診断補助用試薬キットのものと同様である。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞について検量線を作成するために用いられる標準品を含んでいてもよく、当該標準品としては、ＰＤ診断補助用試薬キットと同様である。
　また、ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、テトラスパニンを有する細胞外小胞について検量線を作成するために用いられる標準品を含んでいてもよく、当該標準品としては、テトラスパニンを有する細胞外小胞が挙げられる。当該標準品は、溶液状態であっても、凍結状態や乾燥状態、凍結乾燥状態であってもよい。また、通常この分野で用いられる試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等を、当該標準品と共存させてもよい。これらの濃度、ｐＨも通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）には、添付文書や取扱説明書が含まれていてもよい。当該添付文書や取扱説明書としては、例えば、被験者に由来する生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること又は／及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定すること（例えば、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ））が記載された添付文書や取扱説明書等が挙げられる。これらの添付文書や取扱説明書は、複数のものに分かれて記載されたものであっても、一つのものに纏めて記載されたものであってもよい。
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、具体的には、例えば、下記（Ａ）及び（Ｂ）を含むキットが挙げられる。
（Ａ）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質のいずれか一方が固相に固定化されたものとテトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方が標識物質と結合しているもの又は当該残りの一方の親和性物質とこれを間接的に標識物質と結合させる成分
（Ｂ）テトラスパニンに対して親和性を有する物質が固相に固定化されたものとテトラスパニンに対して親和性を有する物質が標識物質と結合しているもの又は当該親和性物質とこれを間接的に標識物質と結合させる成分
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）は、例えば下記（Ｃ）及び（Ｄ）を含むキットが好ましいものとして挙げられる。
（Ｃ）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質のいずれか一方が固相に固定化されたものと下記（１）～（３）から選ばれるいずれか一つ
（１）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方が標識物質と結合したもの、（２）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方、並びに当該親和性物質に対して特異的に結合する２次親和性物質が標識物質と結合したもの、（３）テトラスパニンに対して親和性を有する物質及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質の残りの一方がアビジン類及びビオチン類の一方と結合したもの、並びにアビジン類及びビオチン類の残りの一方が標識物質と結合したもの
（Ｄ）テトラスパニンに対して親和性を有する物質が固相に固定化されたものと下記（４）～（６）から選ばれるいずれか一つ
（４）テトラスパニンに対して親和性を有する物質が標識物質と結合したもの、（５）テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びテトラスパニンに対して親和性を有する物質に対して特異的に結合する２次親和性物質が標識物質と結合したもの、（６）テトラスパニンに対して親和性を有する物質がアビジン類及びビオチン類の一方と結合したもの、並びにアビジン類及びビオチン類の残りの一方が標識物質と結合したものから選ばれるいずれか一つ
　ＰＤ診断補助用試薬キット（ＩＩ）の好ましい例として、例えば以下のものが挙げられる。
　例えば、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合する抗体又はＴｉｍタンパク質（Ｔｉｍ４又はＴｉｍ１がより好ましく、Ｔｉｍ４が特に好ましい）が固定化された固相プレート、テトラスパニン抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい）が固定化された固相プレートと下記（１）～（３）から選ばれるいずれか１つを含むキットが挙げられる。
　（１）テトラスパニン抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい）が標識物質と結合したものを含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、（２）テトラスパニン抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体がより好ましく、抗ＣＤ９抗体が特に好ましい）を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、並びに当該テトラスパニン抗体に対して特異的に結合する２次親和性物質が標識物質と結合したものを含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、（３）アビジン類及びビオチン類の一方が結合したテトラスパニンに対して特異的に結合する抗体（抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体が好ましく、抗ＣＤ９抗体がより好ましい）を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）、並びにアビジン類及びビオチン類の残りの一方が結合した標識物質を含む溶液（通常１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、１００～５００ｎｇ／ｍＬが好ましい）
　＜パーキンソン病の診断補助用装置（ＩＩ）＞
　第２発明におけるパーキンソン病の診断補助用装置（以下、「ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）」と略記する場合がある）は、被験者に由来する生体試料中の、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定を測定する測定部、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を算出する演算部、及び前記生体試料中のテトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）を構成する測定部、演算部、判定部等は同一の装置内に配置されていても、それぞれ別体となっていてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における前記測定部は、装置に導入された生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する部位である。当該測定部の大きさや構成は特に限定されない。
　当該測定部としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法に用いられるマイクロプレートリーダー又はＣＣＤを用いて撮像するイメージング装置、ウエスタンブロット法又はマイクロアレイ（マイクロチップ）を利用した方法に用いられるイメージング装置、質量分析法に用いられる質量分析装置、分子間相互作用解析装置、及びフローサイトメトリーに用いられるフローサイトメーター、ＨＰＬＣ法やキャピラリー電気泳動法に用いられる紫外可視光検出器や蛍光検出器等が挙げられる。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における、被験者、生体試料、細胞外小胞は、それぞれ前記のものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、量、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定対象はＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定や当該測定に用いられる物質は、ＰＤ診断補助方法において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　また、ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定対象は、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において前述したものと同様であり、好ましいものも同様である。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）におけるテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の測定や当該測定に用いられる物質は、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における演算部は、測定部で得られたテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、及びホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量に基づき、テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を算出する部位である。当該測定部の大きさや構成は特に限定されない。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における演算部は、ＰＤ診断補助用装置における測定部で得られた生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の質量や濃度と相関関係を有する実測値（例えば、吸光度、吸光度変化量、透過光、透過光変化量、蛍光強度、蛍光強度変化量、発光量、発光量変化量、濁度、濁度変化率、散乱光、散乱光変化率、反射率、反射率変化量、屈折率、屈折率変化量等）を質量や濃度等に換算した後、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を算出してもよい。
　なお、当該実測値、演算部により換算された質量や濃度等、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合は、メモリやハードディスクなど装置に備えられた記憶装置等に記憶されてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における判定部は、演算部で算出したテトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、パーキンソン病を判定する部位である。
　また、ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における判定部は、被験者が認知症状のあるパーキンソン病であるか、或いは、認知症状のないパーキンソン病であるかを区別して判定する部位であってもよい。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）におけるパーキンソン病の判定や当該判定に用いられる予め定められた基準値、予め定められた基準値の決定方法は、ＰＤ診断補助方法（ＩＩ）において前述したものと同様であり、好ましいものや具体例も同様である。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）における予め定めた基準値は、ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）に予め記憶されていてもよいし、判定の際にＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）の入力部位から入力されてもよい。
　ＰＤ診断補助用装置（ＩＩ）は、出力部を備えていてもよい。出力部では、前記した判定の結果をディスプレイなどの表示装置やプリンターなどの印刷装置に表示又は出力させるなどの処理が行われる。
　本発明によれば、医師による被験者のパーキンソン病に関する診断を補助する為のデータ（判定結果）が得られる。
　医師は、本発明により被験者がパーキンソン病と判定された場合には、例えば、問診、ＭＩＢＧ心筋シンチグラフィー、ドパミントランスポーターシンチグラフィー等のパーキンソン病診療ガイドラインで推奨されているパーキンソン病のバイオマーカー等に関する検査、パーキンソン病のバイオマーカーの候補物質を用いた検査をさらに行ってもよく、これらの結果等を考慮し、被験者のパーキンソン病に関する診断をすることができる。
　また、本発明により被験者がパーキンソン病と判定された場合には、レボドパ（Ｌ－ｄｏｐａ）等のパーキンソン病の薬（パーキンソン病の進行を遅らせる薬や治療薬）を投与したり、手術を行ったりしてもよい。
　被験者が認知症状のあるパーキンソン病と判定された場合には、例えば、抗コリン薬等の認知症状に悪影響を及ぼし得る薬は投与されないことが好ましく、また例えば、コリンエステラーゼ阻害剤等の認知症や軽度認知障害の薬（認知症や軽度認知障害の進行を遅らせる薬や治療薬）の投与や手術を行うことが好ましい。
　被験者が認知症状のないパーキンソン病と判定された場合には、例えば、抗コリン薬等の認知症状に悪影響を及ぼし得る薬であっても投与することができる。
　従って、被験者が認知症状のないパーキンソン病であるか、認知症状のあるパーキンソン病であるかを判定（区別）することは、医師による治療方針の決定や診断に有用である。
　本発明のパーキンソン病の診断を補助する方法、バイオマーカー、試薬キット及び装置は、パーキンソン病の診断を補助することが可能であることから、臨床検査の分野において有用である。本発明によれば、高い正確度で、パーキンソン病の診断を補助することができる。
　以下、実施例および比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されない。実施例および比較例において、「パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）」は認知症状のないパーキンソン病患者の検体、「パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）」は認知症状のあるパーキンソン病患者の検体である。
実施例１．ＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームの測定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
（１）キャリブレーターの調製
　ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ（登録商標）Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＰＳ（富士フイルム和光純薬（株）製、以下「Ａキット」とする）を用いて、当該キットに添付された取扱説明書に従って、ＣＯＬＯ２０１細胞培養上清からエクソソームを単離し、当該キットに付属の溶出液を用いてエクソソームを溶出した。プロテインアッセイＢＣＡキット（富士フイルム和光純薬（株）製）を用いて、得られたエクソソーム溶液中のタンパク質濃度をＢＣＡ法（ビシンコニン酸法）により測定した。
　次いで、得られたエクソソーム溶液を、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＨＲＰ（富士フイルム和光純薬（株）製、以下「Ｂキット」とする）に付属のＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて、ＢＣＡ法で測定したタンパク質濃度をもとに、０．１５６、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５０、５．００、１０．０、２０．０　ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ希釈し、８点の濃度からなるＣＯＬＯ２０１細胞培養上清由来エクソソーム希釈系列（以下、「キャリブレーター」とする）を得た。
（２）測定用検体の前処理
　ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）８検体、健常者３７検体のＥＤＴＡ血漿を、それぞれ１０，０００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を回収した。得られた上清を、前記Ａキットに付属のＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて、それぞれ１００倍希釈し、「測定用検体希釈液」とした。
（３）ＥＬＩＳＡ法による測定
　（２）で調製した測定用検体希釈液を、Ｔｉｍ４タンパク質を固相に固定化し抗ＣＤ９抗体を検出用抗体としたＴｉｍ４タンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。具体的には、抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体（１Ｋ、富士フイルム和光純薬（株）製）を、１．６ｍＭ　ＤＴＴで還元後、Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＡＣ５－ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（（株）同仁化学研究所製）と３７℃で１．５時間反応させ、ビオチン標識抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体を作製した。検出用抗体以外は、前記Ｂキットに付属の試薬を用いた。
　まず、Ｂキットに付属のＷａｓｈｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）を、精製水（蒸留水）で１０倍に希釈した後、Ｂキットに付属のＥｘｏｓｏｍｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（１００×）を得られた希釈液に対して１／１００量添加した。得られた溶液を、「洗浄液（１×）」とする。次いで、Ｂキットに付属の「Ｔｉｍ４タンパク質が固相に固定化された９６ウェルプレート」の各ウェルを、洗浄液（１×）３００～３５０μＬでそれぞれ３回洗浄した。
　次いで、（２）で調製したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の測定用検体希釈液（８検体　ｎ＝２、１６ウェル）、健常者検体の測定用検体希釈液（３７検体　ｎ＝２、７４ウェル）、（２）で調製したキャリブレーター（８点分　ｎ＝２、１６ウェル）、及びブランクとしてＢキットに付属のＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｎ＝２、２ウェル）をプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。次いで、プレートにプレートシールを貼り、マイクロプレート振とう器を用いて約５００ｒｐｍで撹拌しながら室温で２時間反応させた。反応後、反応液を捨て、各ウェルを洗浄液（×１）３００～３５０μＬで３回洗浄した。　次いで、Ｂキットに付属のＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて、ビオチン標識抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体を終濃度が２５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ビオチン標識抗体反応液を得た。得られたビオチン標識抗体反応液を、各ウェルに１００μＬずつ分注し、プレートシールを貼り、マイクロプレート振とう器を用いて約５００ｒｐｍで撹拌しながら室温で１時間反応させた。反応後、反応液を捨て、各ウェルを洗浄液（×１）３００～３５０μＬで３回洗浄した。
　Ｂキットに付属のＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに対して、１／１００量のＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１００×）を添加して、よく混合し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応液（１×）を調製した。得られたＨＲＰ標識ストレプトアビジン反応液（１×）を各ウェルに１００μＬずつ分注し、プレートシールを貼り、マイクロプレート振とう器を用いて約５００ｒｐｍで撹拌しながら室温で２時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルを洗浄液（１×）３００～３５０μＬで５回洗浄した。
　次いで、室温に戻したＢキットに付属のＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬずつ各ウェルに分注し、マイクロプレート振とう器を用いて約１分間撹拌した後、プレートシールを貼り、室温（２０～２５℃）で３０分間静置反応させた。その後、室温に戻したＢキットに付属のＳｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬずつ各ウェルに添加し、マイクロプレート振とう器を用いて約５秒間撹拌後、速やかに９６ウェルマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、Ｓａｆｉｒｅ２）を用いて４５０ｎｍの吸光度と副波長６２０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定した。４５０ｎｍ吸光度値から副波長６２０ｎｍ吸光度値を差し引いた値を「吸光度値」とし、測定用検体希釈液の吸光度値からブランクの吸光度値を差し引いた値を「補正後検体吸光度値」として、それぞれ算出した。そして、ＣＯＬＯ２０１細胞培養上清由来エクソソーム希釈系列（キャリブレーター）の吸光度値からブランクの吸光度値を差し引いた値とキャリブレーターのタンパク質濃度から標準曲線を作成した。標準曲線を用いて、補正後検体吸光度値をタンパク質濃度に換算し、得られた換算値に検体希釈率を乗じた値を「検体測定値」［ｎｇ／ｍＬ］とした。
（４）ＡＵＣの算出
　（３）で得られた検体測定値を基に、ＪＭＰ（登録商標）１１（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓの検定（順位和）により、パーキンソン病患者と健常者の有意差検定を行い、ｐ値を算出した。また、（３）で得られた検体測定値を基に、ＪＭＰ（登録商標）１１（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いてロジスティック回帰分析をおこない、得られた受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）から、曲線下面積値（ＡＵＣ）を算出した。
　得られた結果を下記表１に示す。また、検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図１に示す。図中、縦軸は検体測定値、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤはパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の結果をそれぞれ示す。
比較例１．ＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　Ｔｉｍ４タンパク質の代わりに抗ＣＤ９抗体を固相に固定化した以外は、実施例１と同様の方法により、抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームを測定し、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　抗ＣＤ９抗体を固相に固定したプレートは、以下の方法により調製した。抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体（１Ｋ）（富士フイルム和光純薬（株）製）を５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）で１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）のウェルに１００μＬ添加し、冷蔵で一晩インキュベーションした。ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）でウェルを３回洗浄後、１０ｍｇ／ｍＬブロックエース含有ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、冷蔵で一晩インキュベーションしたものをそれぞれ抗体固相化プレートとして使用した。
　検出抗体の抗ＣＤ９抗体は、実施例１と同様の方法によりビオチン標識したものを用いた。
　得られた結果を下記表１に示す。また、検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図１に示す。図中、縦軸は検体測定値、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤはパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の結果をそれぞれ示す。
実施例２．ＰＳ及びＣＤ６３を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　検出抗体として抗ＣＤ９抗体の代わりに抗ＣＤ６３抗体を使用した以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ６３抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームを測定し、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　検出抗体の抗ＣＤ６３抗体は、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＨＲＰ（富士フイルム和光純薬（株）製、上記「Ｂキット」）に付属のビオチン標識された抗ＣＤ６３抗体を用いた。
　得られた結果を下記表１に示す。
比較例２．ＣＤ６３を指標とするパーキンソン病検体の評価
　抗ＣＤ９抗体の代わりに抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体（３－１３）（富士フイルム和光純薬）を固相に固定化し、また検出抗体として用いた以外は、比較例１と同様の方法により、抗ＣＤ６３抗体－抗ＣＤ６３抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームを測定し、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　抗ＣＤ６３抗体を固相に固定したプレートは、比較例１と同様の方法により調製した。検出抗体の抗ＣＤ６３抗体は、ＰＳ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＨＲＰ（富士フイルム和光純薬（株）製、上記「Ｂキット」）に付属のビオチン標識された抗ＣＤ６３抗体を用いた。
　得られた結果を下記表１に示す。
実施例３．ＰＳ及びＣＤ８１を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病認知症検体の評価
　検出抗体として抗ＣＤ９抗体の代わりに抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体（１７Ｂ１）（富士フイルム和光純薬（株）製）を使用した以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ８１抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームを測定し、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　検出抗体の抗ＣＤ８１抗体は、実施例１と同様の方法によりビオチン標識したものを用いた。
　得られた結果を下記表１に示す。
比較例３．ＣＤ８１を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　抗ＣＤ９抗体の代わりに抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体（１７Ｂ１）（富士フイルム和光純薬（株）製）を固相に固定化し、また検出抗体として用いた以外は、実施例１と同様の方法により、抗ＣＤ８１抗体－抗ＣＤ８１抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりエクソソームを測定し、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　抗ＣＤ８１抗体を固相に固定したプレートは、比較例１と同様の方法により調製した。
　検出抗体の抗ＣＤ８１抗体は、実施例１と同様の方法によりビオチン標識したものを用いた。
　得られた結果を下記表１に示す。
実施例４．ＣＤ９を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　実施例１（Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ａ））を、比較例１（抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（以下、「補正後検体測定値」とする）を得た。
　得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表１に示す。また、補正後検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図２に示す。図中、縦軸は補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤはパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の結果をそれぞれ示す。
実施例５．ＣＤ６３を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ６３を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　実施例２（Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ６３抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ａ））を、比較例２（抗ＣＤ６３抗体－抗ＣＤ６３抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（補正後検体測定値）を得た。
　得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、認知症状のないパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者由来の血漿をそれぞれ試料とし、ＣＤ９、ＣＤ６３、又はＣＤ８１のテトラスパニンを有するエクソソームの量を指標としてパーキンソン病を評価した場合、ＡＵＣはそれぞれ０．８５５、０．８４８、０．６４２であった。
　他方、認知症状のないパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者由来の血漿をそれぞれ試料とし、ＣＤ９、ＣＤ６３、又はＣＤ８１のテトラスパニン及びＴｉｍタンパク質が結合するホスファチジルセリンを有するエクソソームの量を指標としてパーキンソン病を評価した場合、ＡＵＣはそれぞれ０．９２９、０．８９９、０．９１６であり、いずれも高い正確度でパーキンソン病症（特に認知症状のないパーキンソン病）を検出できることが判った。
　また、ホスファチジルセリン及びＣＤ６３を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ６３を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を指標としてパーキンソン病を評価した場合、ＡＵＣは０．８９２であり、高い正確度でパーキンソン病（特に認知症状のないパーキンソン病）を検出できることが判った。また、ホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を指標としてパーキンソン病を評価した場合、ＡＵＣは０．９７３であり、極めて高い正確度でパーキンソン病（特に認知症状のないパーキンソン病）を検出できることが判った。
実施例６．ＣＤ９を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７以下）の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）８検体、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンいパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、「検体測定値」（値（Ａ））を得た。
　また、「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）８検体、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、比較例１と同様の方法により、抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、「検体測定値」（値（Ｂ））を得た。
　「検体測定値」（値（Ａ））を「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（以下、「補正後検体測定値」とする）を得た。得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表２に示す。また、補正後検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図３に示す。図中、縦軸は検体測定値、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤ（ＭＭＳＥが２７以下）はパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）、ＰＤ（ＭＭＳＥが２７より大きい）はパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の結果をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例７．ＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）８検体、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表３に示す。
比較例４．ＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）８検体、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、比較例１と同様の方法により、抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表３に示す。
実施例８．ＣＤ９を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　実施例７（Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ａ））を、比較例４（抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（以下、「補正後検体測定値」とする）を得た。
　得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表３に示す。また、補正後検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例９．ＣＤ９を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７以下）とパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）８検体と、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）８検体」を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、「検体測定値」（値（Ａ））を得た。
　また、「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）８検体、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）８検体」を用いた以外は、比較例１と同様の方法により、抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、「検体測定値」（値（Ｂ））を得た。
　「検体測定値」（値（Ａ））を「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（以下、「補正後検体測定値」とする）を得た。得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）とパーキンソン病検体（ＭＭＳＥが２７より大きい）の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表４に示す。また、補正後検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１０．ＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者１６検体（ＭＭＳＥが２７以下８検体とＭＭＳＥが２７より大きい８検体）、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、実施例１と同様の方法により、Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、パーキンソン病患者と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表５に示す。また、検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図４に示す。図中、縦軸は検体測定値、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤはパーキンソン病患者の結果をそれぞれ示す。
比較例７．ＣＤ９を有するエクソソームの量を指標とするパーキンソン病検体の評価
　「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ社より購入したパーキンソン病患者１６検体（ＭＭＳＥが２７以下８検体とＭＭＳＥが２７より大きい８検体）、健常者３０検体のＥＤＴＡ血漿」を用いた以外は、比較例１と同様の方法により、抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にてエクソソームの測定を行い、パーキンソン病患者と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表５に示す。
実施例１１．ＣＤ９を有するエクソソームの量に対するＰＳ及びＣＤ９を有するエクソソームの量の割合を指標とするパーキンソン病検体の評価
　実施例１０（Ｔｉｍタンパク質－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ａ））を、比較例７（抗ＣＤ９抗体－抗ＣＤ９抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ法）で得られた「検体測定値」（値（Ｂ））で除することにより、（Ａ）／（Ｂ）（以下、「補正後検体測定値」とする）を得た。
　得られた補正後検体測定値に基づいて、実施例１（４）と同様の方法により、パーキンソン病患者と健常者の有意差検定を行い、ＡＵＣ及びｐ値を算出した。
　得られた結果を下記表５に示す。また、検体測定値を基に作成した箱ひげグラフを図５に示す。図中、縦軸は補正後検体測定値、横軸のＣｏｎｔｒｏｌは健常者の結果、ＰＤはパーキンソン病患者の結果をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表２より、認知症状のあるパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）と健常者由来の血漿をそれぞれ試料とし、ホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を評価した場合、ＡＵＣは０．８０４であり、高い正確度でパーキンソン病（特に、認知症状のあるパーキンソン病）を検出できることが判った。
　表３より、認知症状のないパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）と健常者由来の血漿をそれぞれ試料とし、ホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を評価した場合、ＡＵＣは０．９５０であり、極めて高い正確度でパーキンソン病（特に、認知症状のないパーキンソン病）を検出できることが判った。
　表４より、認知症状のあるパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）と認知症状のないパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）の血漿をそれぞれ試料とし、ホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を評価した場合、ＡＵＣは０．８４４であり、高い正確度で認知症状のあるパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７以下）と認知症状のないパーキンソン病患者（ＭＭＳＥが２７より大きい）を区別して検出できることが判った。また、補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））とＭＭＳＥの相関係数は、０．７８３３であり、高い相関関係がみられた。
　表５より、パーキンソン病患者（認知症状のあるパーキンソン病患者と認知症状のないパーキンソン病患者を含む）と健常者由来の血漿をそれぞれ試料とし、ＣＤ９を有するエクソソームの量を指標としてパーキンソン病を評価した場合、ＡＵＣは０．７６４、ホスファチジルセリン及びＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ａ））を、ＣＤ９を有するエクソソームの検体測定値（値（Ｂ））で除することにより得られた補正後検体測定値（（Ａ）／（Ｂ））を評価した場合、ＡＵＣは０．８７７であり、高い正確度でパーキンソン病を検出できることが判った。

Claims (15)

  1. 　被験者に由来する生体試料中の、
    　ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は
    　ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定すること、
    　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は
    　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することを含む、
    　パーキンソン病の診断を補助する方法。
  2. 　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、又は前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合が基準値以下の場合に、被験者がパーキンソン病であると判定することである、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  3. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
    　前記テトラスパニンが、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１から選ばれるものである、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  4. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することが、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いて前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することである、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  5. 　前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、請求項４に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  6. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
    　前記生体試料が、血液試料又は脳脊髄液である、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  7. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
    　前記テトラスパニンが、ＣＤ９又はＣＤ６３である、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  8. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することが、テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を用いて前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することが、前記テトラスパニンに対して親和性を有する物質を用いて前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することである、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  9. 　前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、請求項８に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  10. 　前記細胞外小胞の量の測定が、前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定することであり、
    　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者がパーキンソン病であると判定することであり、
    　前記生体試料が、血液試料又は脳脊髄液である、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  11. 　前記パーキンソン病の判定が、前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として、被験者が認知症状のあるパーキンソン病と認知症状のないパーキンソン病のいずれの疾患に罹患しているのかを判定することである、請求項１に記載のパーキンソン病の診断を補助する方法。
  12. 　テトラスパニンに対して親和性を有する物質、及びホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を含む、パーキンソン病の診断補助用試薬キット。
  13. 　ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞を含む、パーキンソン病の診断補助用バイオマーカー。
  14. 　被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する測定部、及び
    　前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を指標として被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する、パーキンソン病の診断補助用装置。
  15. 　被験者に由来する生体試料中の、ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量、並びにテトラスパニンを有する細胞外小胞の量を測定する測定部、
    　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対する前記ホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を算出する演算部、及び
    　前記テトラスパニンを有する細胞外小胞の量に対するホスファチジルセリン及びテトラスパニンを有する細胞外小胞の量の割合を指標として被験者がパーキンソン病であると判定する判定部を有する、パーキンソン病の診断補助用装置。
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