JP2017524666A - Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを精製するための方法 - Google Patents

Abstract

Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを精製するための方法であって、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを、ＤＭＳＯ、またはＤＭＳＯと好ましくは水、アルコール、ハロゲン化溶媒、エーテル、エステルおよび／もしくはアミドから選択される少なくとも１種の他の溶媒との混合物から結晶化させる方法が記載される。そのような方法により、９９．５％超、好ましくは９９．７％超、さらにより好ましくは９９．９％以上の純度を有するＬ−α−グリセロホスホリルコリンを得ることができる。また、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定するための方法であって、アミノ固定相を有するＨＰＬＣカラムを通すＬ−α−グリセロホスホリルコリンの溶離と、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン自体、およびその任意の不純物の、蒸発光散乱検出器型の手段によるその後の検出とを含む方法が記載される。

Description

本発明の対象は、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを精製するための方法であって、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを、ＤＭＳＯ、またはＤＭＳＯと好ましくは水、アルコール、ハロゲン化溶媒、エーテル、エステルおよび／またはアミドから選択される少なくとも１種の他の溶媒との混合物から結晶化させる方法である。そのような方法によって、９９．５％超、好ましくは９９．７％超、さらにより好ましくは９９．９％以上の純度を有する、同じく本発明の対象を構成するＬ−α−グリセロホスホリルコリンを得ることができ、特に、それによって、β−ＧＰＣ異性体での汚染が０．１％未満である、および／または環式種ｃＧＰでの汚染が０．１％未満であるＧＰＣを得ることができる。

本発明のさらなる対象は、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定するための方法であって、アミノ固定相を有するＨＰＬＣカラムを通すＬ−α−グリセロホスホリルコリンの溶離と、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン自体、およびその任意の不純物の、蒸発光散乱検出器型の手段によるその後の検出とを含む方法により代表される。

現在の経済的および人口統計学的傾向により、人々の全体的な高齢化が生じているが、この現象は、世界の最富裕地域において特に顕著である。

したがって、高齢化による個々の能力の減退が非常に重要な問題となっており、この減退の緩和を助ける方法を特定することが、ますます必要となっている。

特に、知的能力の低下は、高齢化の最も好ましくない結果の１つであり、それと闘うための効果的な治療法を発見するべく、多くの研究努力がなされている。

この領域において、最も注目されている生成物は、構造が以下に示されるＬ−α−グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）である。

ＧＰＣは、認知障害の分野において治療薬剤として十分確立された用途を有し、医療業務および多くの臨床試験における効用の幅広い立証に基づいて、その世界的な消費が定着している。ＧＰＣの調製方法は、２つの主要な種類に分けることができる：天然起源のホスファチジルコリンの脱アセチル化反応に基づく方法、および化学的中間体の市場において市販されている原材料からＧＰＣが合成される方法。

第１の種類の方法は、食品産業において既に広く使用されており、その取り扱いによっていかなる特定の安全性リスクも生じないことを特徴とする、大豆レシチン等の原材料生成物を使用するという利点を有する。

一方、ＧＰＣ合成手法に基づく手順は、使用される物質、特にキラル合成前駆体の管理における懸念をもたらし得る。これらは、主にＲ−グリシドールおよびＲ−クロロプロパンジオール（それぞれ以下で概説される構造ＩおよびＩＩ）であり、いずれの場合においても、これらは著しい毒性特性を有するアルキル化分子である。したがって、微量残留物がある場合、またはそれらの毒性特性を維持する他の種（例えば、中間体もしくは副生成物）が存在する場合、それらの使用が、使用および取り扱いの間の危険性の問題を、さらにはこれらから得られたＧＰＣの消費の危険性をいかにもたらし得るかは明白である。

ＧＰＣの調製方法が何であれ、その精製および単離に関連する部分は、生成物の品質に大きな影響を有し、特にその化学的純度は、その毒性および治療プロファイルに影響し得る。そのような純度は、従来、「薄層クロマトグラフィー」（ＴＬＣ）により検証される。この種の分析は、良好な多用途特性を有し、最も極性の高いものから最も極性の低いものまでの全ての成分が同時に視認され得るため、試料を全体的に評価することができる。しかしながら、この分析技術は、任意の不純物の定量的決定、および同様の構造的特徴を有する種、例えば同等の極性を有する異性体等の分離に関して、完全には満足に足るものではない。

ＨＰＬＣは、これらのＴＬＣの欠点を克服するために最も頻繁に採用される分析技術であるが、ＧＰＣの場合、ＨＰＬＣの使用は、固定相との相互作用を制限する分析物の高い極性特性、およびＵＶ検出器、すなわち品質管理実験室におけるより一般的な検出器の使用を可能にする発色団が存在しないことに起因して、通常よりも容易ではなかった。公開されている方法は、感度に関して、および広がった、または非対称のピークを有するクロマトグラフィー信号の形状に関して満足に足るものではなく、これらの条件下では、分離力の低減が見られ、またある特定の種に対応する信号が、他のクロマトグラフィー信号の下に隠され、任意の存在する不純物を明らかにする能力が失われてしまうリスクがある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３を参照されたい。

この状況は、人間に対する使用が意図された活性成分の生成における不純物プロファイルの詳細な説明を提供する、製薬分野における現在のガイドラインにあまり関連づけられていない。

米国特許第６２２９６０５号明細書 国際公開第９０１３５５２号 欧州特許第５７５７１７号明細書

Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（２０１２）８９：１１５５−１１６３ Ｔａｌａｎｔａ（２０１２）９４：２２−２９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ（２０１２）１２２０：１０８−１１４ 「ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎｓ ＹＭＣ Ｃｌａｓｓｉｃｓ」ＹＭＣ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ（１９９７）６９：５６１Ａ−５６３Ａ

したがって、ＧＰＣの異なる調製物の品質を決定するための新たな分析技術の開発、ならびに、ＧＰＣの調製物中の不純物の存在がそのような分析技術により明らかにされた場合、ＧＰＣの純度の新たな基準の定義、および現在の品質基準に従うＧＰＣの生成を可能とするための新たな精製手順が最も重要である。

ここで、我々は、予想外にも、ＧＰＣのＨＰＬＣ分析において、アミノＨＰＬＣクロマトグラフィーカラム型、すなわちアミノ官能基が固定相の表面に結合したカラムを好適に使用することにより、上述の問題を克服することが可能であることを見出した。

手順１により得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例２から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例１（比較）から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 手順２により得られたＧＰＣの³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 実施例３から得られたＧＰＣの³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。 手順１により得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例３から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 手順３により得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例４から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例５（比較）から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 手順４により得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例６から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。 実施例７（比較）から得られたＧＰＣのＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムである。

ここで、我々は、予想外にも、ＧＰＣのＨＰＬＣ分析において、アミノＨＰＬＣクロマトグラフィーカラム型、すなわちアミノ官能基が固定相の表面に結合したカラムを好適に使用することにより、上述の問題を克服することが可能であることを見出した。この種のいくつかのカラム、例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ（商標）ＬＣ−ＮＨ₂、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ（商標）アミノ、Ｚｏｒｂａｘ（登録商標）ＮＨ₂、ＹＭＣ（商標）Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ＩＩ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ（登録商標）ＮＨ₂、Ｌｕｎａ（登録商標）ＮＨ₂が市販されている。固定相は、アミノ基、好ましくは第２級および第３級アミノ基を含有するポリマーコーティングからなるコーティングを有する保持体、例えばシリカ等の粒子からなってもよい。この種の固定相の説明は、参照により本明細書に組み込まれる、ＹＭＣ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨによる出版物である非特許文献４の２２頁および２３頁に報告されている。

同時に、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）型が使用される必要があるだろう。

そのような検出器は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献５および特許文献１において説明されている。これらは、溶離液を蒸発チャンバ内に送り、そこで溶媒を蒸発させて、光線を散乱させる微小試料粒子のミストを残すツールである。検出器応答は、存在する試料の量に依存する拡散に比例し、このシステムは、非定組成溶離法を使用しながら、ＧＣＰ等の発色団を含まない種の検出を可能にする。

固定相および検出器のこの組合せにより、様々な溶離液を使用してもよく、特に、水性緩衝系から好適になる系、例えば酢酸アンモニウム緩衝液等を、場合により、例えばメタノールおよび／またはアセトニトリル等の有機溶媒と組み合わされてもよい。そのような溶離液系は、定組成モードで、すなわちクロマトグラフィー工程の期間全体にわたり同じ溶離液を保持することにより、または、所定のプログラムに従ってクロマトグラフィーの間、溶離液の組成が変化する勾配モードで使用され得る。分析方法の最適化は、本技術分野の教示に従って行われる。

したがって、本発明の対象は、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定するための方法であって、アミノ固定相を有するＨＰＬＣカラムを通すＬ−α−グリセロホスホリルコリンの溶離と、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン自体、およびその任意の不純物の、蒸発光散乱検出器型の手段によるその後の検出とを含む方法である。

溶離液相は、水溶液、極性有機溶媒、またはそれらの混合物からなってもよく、水溶液は、好ましくは３から６、さらにより好ましくは４から５の範囲のｐＨを有する。極性有機溶媒は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコール、アセトニトリル、またはそれらの混合物であってもよく、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコールは、好ましくはメタノールである。

この組合せにより、ＧＰＣに対応するクロマトグラフィーピークの広がりの欠陥を克服することができると同時に、高い感度でＧＰＣ濃度の決定を行うことができる。

同時に、大豆レシチンから出発するＧＰＣの調製プロセスから得られる他の種の存在を、ＧＰＣ調製物において検出することが可能であることが見出された。

これらの種には、Ｌ−α−グリセロホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）、糖、および、ＧＰＣ生成プロセスにおいて原材料として使用される大豆レシチンにおけるその存在、またはその前駆体の１つの存在から生じる、それらの類似体が含まれる。

この重要な結果を得た上で、以前よりも高感度および選択的な様式で、人間に対する使用のための医薬品に最も好適な生成方法により得られたＧＰＣの試料中の不純物プロファイル（存在する場合）を検証することに、すぐに関心が持たれた。

この目的のために、完全合成手順において使用されるグリシドールまたはクロロプロパンジオール等の極めて有毒な原材料による潜在的な汚染を鑑み、完全合成手順は人間に対する使用のためのＧＰＣの生成には不適切であると判断されることから、大豆レシチン脱アシル化に基づく半合成プロセスが主に考慮された。完全合成経路によるＧＰＣの生成に関連した上記禁忌を考慮しながら、この手法で生成された中国製のＧＰＣ試料を、完全な評価のために新たな分析手順に提出した。

半合成手順から得られる試料は、特許文献２（具体的には実施例２）および特許文献３（具体的には実施例１）において報告されている手順に従って生成された。これらの文献には、イオン交換樹脂によるＧＰＣの精製に基づく手順が報告されており、それらは、塩化カドミウムとの付加物（ＧＰＣ・ＣｄＣｌ₂）としてのＧＰＣの沈殿およびシリカクロマトグラフィーを含まず、したがってこれらは、有毒のカドミウム塩および低い生産性を特徴とする手順の使用を回避しながら、ＧＰＣの大量生成に実際に適用可能な方法である。

分析結果は、全ての試料において、ＧＰＣの保持時間の前およびそれに非常に近い保持時間で溶離するピークの存在を示し、ＲＲＴ（相対保持時間）は、約０．９４に等しかった。著しい強度のこの信号は、グリセロール、ＧＰＥ、グリセロリン酸、またはスクロース等の、調製プロセスを鑑みて合理的に予測されるような種に対応しない。

新たに検出された種のクロマトグラフィー挙動が、これまで明らかにされていなかったようにＧＰＣのそれと非常に類似していること、および本発明の対象である新たなＨＰＬＣ法を用いてもＧＰＣのそれとほとんど異ならなかったことを考慮した結果、我々は、それがその位置異性体に対応すると仮定した。

ＧＰＣのベータ異性体（β−ＧＰＣ）の化学構造は以下に記載される。

β−ＧＰＣ
β−ＧＰＣは、市販されておらず、β−ＧＰＣが新たな方法により検出可能な種であり得ることを確認するために、以下に示されるスキームに従ってその合成を行った。

このようにして得られたβ−ＧＰＣを、ＮＭＲにより分析して構造を確認し、またＨＰＬＣにより分析して、その純度が高いことだけでなく、その保持時間が、異なるＧＰＣ試料の分析により明確化された未知の種の保持時間と適合することを示した。したがって、未知の信号にβ−ＧＰＣ構造への対応を帰属させることが可能であり、この帰属をＨＰＬＣ「スパイク」実験により確認したが、ＨＰＬＣにおいて約０．９４のＲＲＴを有する種の存在を示すＧＰＣ試料に対して、較正された量のβ−ＧＰＣを添加し、それに対応して約０．９４のＲＲＴを有する信号が分裂することなく増加することが観察された。

構造帰属のさらなる確認として、³¹Ｐ−ＮＭＲ実験を行い、これにより、約０．９４のＲＲＴを有する種の存在がより高い試料において約−０．６ｐｐｍの信号を同定することができた。上に記載されたスキームに従って合成されたβ−ＧＰＣの信号は、同じフィールド値に現れた。

したがって、³¹Ｐ−ＮＭＲ法は、ＨＰＬＣ手順の可能な代替法であるが、そのより低い感度、および品質管理実験室におけるＨＰＬＣ機器のより広い利用可能性に起因して、本発明の対象であるＨＰＬＣ法は、約０．９４のＲＲＴを有する種（β−ＧＰＣ）の決定に依然として好ましい。

また、³¹Ｐ−ＮＭＲ分析を用いて、特許文献３に従って得られた生成物のスペクトルにおいて、約１８．４ｐｐｍの追加的な信号を同定することも可能であった。これらの値は、以下でナトリウム塩の形態で示される環式ホスフェートｃＧＰの値に適合する。

ｃＧＰ（ナトリウム塩）
この環式ホスフェートの形成は、特許文献３の手順に従うＧＰＣの単離の条件において想定されるものである。この仮説を裏付けるため、以下に示されるスキームに従ってｃＧＰの基準試料を調製した。

この生成物の³¹Ｐ−ＮＭＲ分析によって割当てが確認され、約１８．４ｐｐｍの同じ信号を示し、また適切なスパイク実験において信号の分割は見られなかった。

本発明の一実施形態を表す新規な分析法で判明したことを鑑みて、我々は、既知のＧＰＣ精製法が明らかにされた不純物を適正に除去し得るか否かを実験的に検証した。

既に示された理由から、塩化カドミウムとの錯化およびシリカでのクロマトグラフィーによる精製を除き、我々は、先行技術において報告されているもののうち（例えば特許文献２を参照されたい）、産業上の利用可能性の点で、エタノールからの結晶化を最善の手順として特定した。特許文献２の手順に従って得られた試料をエタノールから結晶化させたが、ＨＰＬＣ分析では、精製が部分的のみであり、大量のベータ異性体（０．４８％）が依然として生成物中に存在することが示された。以下の表１は、異なる調製手順に従って得られたＧＰＣ試料の分析結果を要約している。

ここで、ＧＰＣを精製するための新たなシステムが特定され、この発見もまた、本発明の実施形態を表す。

新たな精製法は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用に基づく。本発明の実現のために、この溶媒は、異なる条件および精製されるＧＰＣに対する異なる量比で使用され得る。

本発明の実施形態において、ＤＭＳＯに加え、中間的極性の極性溶媒または非極性溶媒等の他の溶媒が存在してもよい。これらの追加的な溶媒は、これらに限定されないが、ハロゲン化溶媒、アルコール、エーテル、エステルおよびアミド等の異なるクラスの溶媒に属してもよい。

本発明の実現のための使用され得る溶媒の例は、これらに限定されないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、およびＤＭＦである。

本発明の態様によれば、ＤＭＳＯは、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの１重量部当たり２から１００容量部、好ましくは３から７０容量部の範囲の量で、より好ましくは４から３０の範囲の比率で、より好ましくは５から１５容量部の範囲の比率で使用される。

本発明のさらなる態様によれば、任意の溶媒または任意の追加的な溶媒は、ＤＭＳＯの容量当たり０．０１から１０容量の範囲の量で、好ましくは０．０５から５、より好ましくは０．１から１の範囲の比率で使用される。

プロセスパラメータに依存して、ＧＰＣの適切な結晶化を得ることができ、または、不純物を含有するＧＰＣ結晶の精製もまた、それらをＤＭＳＯ中に懸濁させ、時間および温度の好適な組合せを使用し、次いで結晶を液相から分離することにより行うことができ、またこの場合、ＤＭＳＯと組み合わせて他の溶媒が存在してもよい。

精製は、異なる温度で行われてもよく、通常通り、精製プロセスの異なる段階で異なる温度を採用し、ＧＰＣの最後の単離段階においてより低い温度を有することが好都合となり得る。

精製の実行に好適な温度は、１００℃から０℃の間、好ましくは７０℃から５℃の間、より好ましくは５０℃から１５℃の間であってもよい。

温度を選択する際、ＤＭＳＯの凍結温度を考慮することが好ましく、それは追加的な溶媒の存在、ならびにＧＰＣおよび存在する他の種の濃度に主に依存して変動し得る。ＧＰＣの単離のために、閉鎖型または開放型の遠心分離機または濾過システム等の当業者に知られている機器が使用され得る。結晶は、精製に使用される同じ溶媒または同じ溶媒混合物を使用した洗浄手順に直接供されてもよく、あるいは、生成物の洗浄のために、結晶化または懸濁ステップにおいて使用されるもの以外の溶媒または溶媒混合物が使用されてもよい。

本発明の対象である精製プロセスにおいて使用されるＧＰＣの量と比較して使用されるＤＭＳＯの比は、大きく変動し得、本技術分野の教示に従って好都合に選択され得る。実際には、プロセス生産性を必要以上に低減しないために、過度に多量のＤＭＳＯを使用しないことが好都合であり、一方、これらの量は、結晶化した生成物の分離操作を困難とするのを回避するために、過度に低減されるべきではない。重量部（ｋｇ）当たり２から１００容量部（リットル）の範囲のＤＭＳＯおよびＧＰＣの比率、より好ましくは、ＧＰＣの重量部当たり３から７０容量部の範囲の比率、より好ましくは４から３０容量部の範囲の比率、より好ましくは５から１５容量部の範囲の比率が、この実施形態において好都合であると考えられ得る。

本発明を実行するための特に有利な様式は、水または他の溶媒または溶媒混合物中の溶液からのＧＰＣの結晶化である。そのような溶液にＤＭＳＯを添加することにより、ＧＰＣの沈殿が同時に生じることなく蒸留操作を実行するのに十分な期間安定である溶液が得られることが判明した。したがって、一般的に使用される他の溶媒と比較してより高いＤＭＳＯの沸点を利用して、生成物の同時の沈殿により引き起こされる障害なしに、結晶化を行うために使用される溶媒の混合物の組成を変更することが可能である。

溶媒混合物の組成が達成されたら、誘発因子として機能する一定量の結晶化したＧＰＣの添加により、ＧＰＣの結晶化を誘引することが可能である。この選択肢は、必要であるようには思われないが、その適用が望ましい場合、使用される誘発因子の品質と、精製の最後に単離されるＧＰＣ結晶の品質との間の密接な依存性は観察されていないため、必ずしも特に高い純度を有する必要のないＧＰＣ結晶の試料が、誘発因子として使用され得る。

前述のものを含む大量の他の分子種を含有する調製物からであっても、ＤＭＳＯを使用したこれらの精製手順によっていかにして高純度ＧＰＣを得ることができるかが観察されるのは、驚くべきことであった。

特に、ＧＰＣベータ異性体は、高純度での単離が求められる生成物の化学−物理学的特性と非常に類似したそれらの特性を有するため、本発明の対象である精製システムのＧＰＣベータ異性体を除去する能力は有意義であり、予想外であると思われる。

エタノールからの結晶化とは異なり、本発明の対象である精製法によって、レシチンから得られたＧＰＣ調製物中に最も頻繁に見られる種のいくつかからＧＰＣを精製することができることも判明した。

特に、本発明の実施形態において、スクロースおよびＧＰＥ等のＧＰＣ不純物を効果的に除去することが可能であることが判明した。

以下の表２は、これらの実験において達成された主な結果の、結晶化溶媒としてエタノールを使用して行われた比較実験に関連する結果との比較を要約している。

表２に示される結果は、ＧＰＣの精製における本発明の実施形態の有用性を明らかにしている。これに関して、実施例６の場合のように、本発明の実現は、糖、この場合スクロースの存在下であってもＧＰＣを結晶化させる可能性を、およびこれらの場合であっても達成可能な高い精製効率を実証していることが注目に値する。逆に、エタノールからのＧＰＣ結晶化では、スクロースの満足に足る除去が得られなかった。

加えて、ＧＰＣ、さらにはスクロース等の糖は、結晶化溶媒としてエタノールが使用される場合結晶化の阻害剤として挙動し、その結果、これらの場合では結晶化収率が低いため、ＧＰＣの工業生産のためのプロセスにおいてはこの手順は非現実的となる。

本発明のさらなる実施形態は、純度が９９．５％超、好ましくは９９．７％超である、さらにより好ましくは９９．９％以上の純度を有するＧＰＣにある。

特定の特徴は、β−ＧＰＣ異性体での汚染が０．１％未満であるＧＰＣ、および環式種ｃＧＰでの汚染が０．１％未満であるＧＰＣにより表される。

本発明の目的のために、上で示された純度は、ＨＰＬＣ法および／または³¹Ｐ−ＮＭＲにより、好ましくは、それぞれ実施例８および９において説明ならびに例示されるＨＰＬＣ法および／または³¹Ｐ−ＮＭＲにより、面積パーセントとして測定される。

以下の実施例は、決して本発明を限定することなく、本発明の方法のいくつかを例示することを意図する。

手順１
特許文献２の実施例２に従うＧＰＣの調製
１２５ｇの大豆レシチンに、５００ｍＬのメタノールを添加し、完全に溶解するまで撹拌下で保持する。メタノール中３０％のナトリウムメチレート２０ｍＬを添加する。室温で３時間撹拌を継続する。濾過後、残渣をメタノールで洗浄する（３×１０ｍＬ）。氷酢酸で濾液を中和し（約６のｐＨ）、次いでそれを約１２５ｍＬの残留量まで濃縮し、上部の油相を分離する。濃縮された下部相を、メタノール中に含浸させたＡｍｂｅｒｌｙｓｔ １５樹脂（酸形態）１４０ｍＬを含有するカラムで溶離する。溶離は、３７５ｍＬのメタノール、続いて３００ｍＬの水で進行させる。

このように調製された以下の３つの一連のクロマトグラフィーカラムで、水性溶離液を溶離する：水中に含浸させたＯＨ−形態のＩＲ９３樹脂３０ｍＬを有する第１のカラム、水中に含浸させたＯＨ−形態のＩＲ４０１樹脂３０ｍＬを有する第２のカラム、水中に含浸させた酸形態のＩＲＣ５０樹脂１２ｍＬを有する第３のカラム。

最終的な溶離液を、１５％に等しい含水量を有する残留粘稠性流体まで濃縮する。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．８％（面積パーセント）に等しいβ−ＧＰＣの含量が示された。

手順２
特許文献３の実施例１に従うＧＰＣの調製
大豆レシチンの抽出により商業的に得られたホスファチジルコリンが濃縮された２００ｇの分画を、６００ｍＬのメタノールに溶解する。得られた溶液を、メタノール中に含浸させた塩基形態のＤｕｏｌｉｔｅ Ａ１４７樹脂を含有するクロマトグラフィーカラムで溶離する。濃縮された溶液を投入した後、メタノールでＧＰＣ溶離を完了させる。溶離液を酢酸で中和し、３００ｍＬの残留量まで濃縮し、２つの相の明確な成層を得る。濃縮された下部相を分離し、メタノールで希釈し、２００ｍＬのｎ−ヘプタンで２回抽出する。

８００ｍＬのｎ−ブタノールを濃縮された下部相に添加し、溶液を約３００ｍＬの残留量まで濃縮し、約５℃の温度まで冷却し、濾過する。ＧＰＣ結晶を３０ｍＬの脱塩水に溶解し、溶液を、１５％に等しい残留水含量を有する粘稠性液体まで濃縮する。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．１％（面積パーセント）に等しいβ−ＧＰＣ含量が示された。³¹Ｐ−ＮＭＲ分析では、０．２％（面積パーセント）に等しいｃＧＰ含量が示された。

手順３
ＧＰＥで汚染されたＧＰＣの調製
結晶のＧＰＥを、水中のＧＰＣの溶液に添加し、溶液を、１５％に等しい残留水含量を有する粘稠性液体まで濃縮する。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．２％（面積パーセントとして）に等しいＧＰＥ含量が示された。

手順４
スクロースで汚染されたＧＰＣの調製
結晶のスクロースを、水中のＧＰＣの溶液に添加し、溶液を、１５％に等しい残留水含量を有する粘稠性液体まで濃縮する。ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、２％（面積パーセントとして）に等しいスクロース含量が示された。

実施例１（比較）
エタノールからの結晶化を使用した、手順１により得られたＧＰＣの精製
粘稠性流体の形態の２．５ｇのＧＰＣ（手順１により得られた）を、撹拌下、約５０℃の温度で５ｍＬのエタノールに溶解する。溶液を約１０℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発すると、数分で沈殿物の形成が観察される。これを約５℃の温度まで冷却し、０℃から５℃の間で１．５時間撹拌下で保持し、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、１．４ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．４８％（面積パーセントとして）に等しいβ−ＧＰＣ含量が示された。

実施例２
ＤＭＳＯからの結晶化を使用した、手順１により得られたＧＰＣの精製。
粘稠性流体の形態の２．５ｇのＧＰＣ（手順１により得られた）に、１４ｍＬのＤＭＳＯを添加し、混合物を撹拌下で約５０℃の温度まで加温し、約２５℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発する。これを２０℃から２５℃の間で１６時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、１．９ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．１６％（面積パーセント）に等しいβ−ＧＰＣ含量が示された。

実施例３
ＤＭＳＯからの結晶化を使用した、手順２により得られたＧＰＣの精製。
粘稠性流体の形態の１１．２ｇのＧＰＣ（手順２により得られた）に、６０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、混合物を撹拌下で約５０℃の温度まで加温し、約２５℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発する。これを２０℃から２５℃の間で１６時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、８．２ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、β−ＧＰＣが存在しないことが示された。

³¹Ｐ−ＮＭＲ分析では、ｃＧＰが存在しないことが示された。

実施例４
ＤＭＳＯからの結晶化を使用した、ＧＰＣ（ＧＰＥで汚染された）の精製。
粘稠性流体の形態の１０．７ｇのＧＰＣ（手順３により得られた）に、２０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、混合物を撹拌下で約７０℃の温度まで加温し、８０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、約２５℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発する。これを２０℃から２５℃の間で１６時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、８．７ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、ＧＰＥが存在しないことが示された。

実施例５（比較）
エタノールからの結晶化を使用した、ＧＰＣ（ＧＰＥで汚染された）の精製
粘稠性流体の形態の１１．２ｇのＧＰＣ（手順３により得られた）を、撹拌下、約４５℃の温度で２０ｍＬのエタノールに溶解する。溶液を約５℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発する。これを０℃から５℃の間で３時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察され、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、３．４ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．０２％（面積パーセントとして）に等しいＧＰＥ含量が示された。

実施例６
ＤＭＳＯからの結晶化を使用した、ＧＰＣ（スクロースで汚染された）の精製
粘稠性流体の形態の１１ｇのＧＰＣ（手順４により得られた）に、２０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、混合物を撹拌下で約７０℃の温度まで加温し、８０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、約２５℃の温度まで冷却すると、この期間中、沈殿物の形成が観察される。これを２０℃から２５℃の間で１６時間撹拌下で保持し、ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、７．８ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、スクロースが存在しないことが示された。

実施例７（比較）
エタノールからの結晶化を使用した、ＧＰＣ（スクロースで汚染された）の精製
粘稠性流体の形態の１１．０ｇのＧＰＣ（手順４により得られた）を、撹拌下、約４５℃の温度で２０ｍＬのエタノールに溶解する。溶液を約５℃の温度まで冷却し、いくつかのＧＰＣ結晶で誘発する。これを約５℃の温度まで冷却し、０℃から５℃の間で２．５時間撹拌下で保持すると、この期間中、沈殿物の形成が観察される。ブフナー漏斗を通して結晶を濾過し、エタノールで洗浄する。真空下で乾燥させた後、１．１ｇのＧＰＣが得られる。

ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析では、０．１４％（面積パーセントとして）に等しいスクロース含量が示された。

実施例８
ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤによるＧＰＣ分析法。
操作パラメータ：
ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣ（商標）Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ ＩＩ ２５０×４．６ｍｍ（５μｍ）
炉内温度：３５℃
流量：０．７ｍＬ／分
溶離液相：相Ａ：８５％（アセトニトリル７５％、メタノール２５％）
１５％（５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５）
相Ｂ：６５％（アセトニトリル７５％、メタノール２５％）
３５％（５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５）
勾配プログラム：

検出器 ＥＬＳＤ
検出器パラメータ：窒素流量＝１．４ｍＬ／分；温度＝９０℃；ゲイン＝１
試料調製：メタノール中約２０ｍｇ／ｍＬへのＧＰＣ試料の希釈。
注入容量：２０〜４０μＬ
備考：ＲＴ約５分までに観察されるベースライン変動が、ブランクにおいて存在する（試料中に存在する物質に起因するものではない）。

以下の表において、対象となる種の溶離に対する基準値が示されている。

この方法を使用して分析された不純物の検出限界（ＬＯＤ）は、ＧＰＣに対して０．０１％未満である。

実施例９
³¹ Ｐ−ＮＭＲによるＧＰＣ分析法
機器 ＮＭＲ Ｖａｒｉａｎ ＶＸＲ−２００または少なくとも同等の機器
試料調製 分析される０．８ｇのＧＰＣを、０．８ｍＬのＤ₂Ｏに溶解し、溶液をＮＭＲ管に入れる
温度 周囲温度
取得数 ４００以上
以下の表において、対象となる種の化学シフトに対する基準値が示されている。

この方法を使用して分析される不純物の検出限界（ＬＯＤ）は、ＧＰＣに対して０．０１％未満である。

Claims (15)

1. Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを精製するための方法であって、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンを、ＤＭＳＯ、またはＤＭＳＯと少なくとも１種の他の溶媒との混合物から結晶化させることを特徴とする方法。
2. 前記少なくとも１種の他の溶媒は、水、アルコール、ハロゲン化溶媒、エーテル、エステルおよび／またはアミドから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノールおよび／またはｎ−ブタノールであり、前記ハロゲン化溶媒は、塩化メチレンであり、前記エーテルは、テトラヒドロフランであり、前記エステルは、酢酸エチルであり、前記アミドは、ＤＭＦであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ＤＭＳＯは、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの重量部当たり、２から１００容量部の間、好ましくは５から１５容量部の間に含まれる量で使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも１種の他の溶媒は、ＤＭＳＯの容量当たり、０．０１から１０容量の間、好ましくは０．１から１容量の間に含まれる量で使用されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記結晶化は、０℃から１００℃、好ましくは１５℃から５０℃の範囲の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ９９．５％超、好ましくは９９．７％超、さらにより好ましくは９９．９％以上の純度を有することを特徴とするＬ−α−グリセロホスホリルコリン。
8. ０．１％未満のそのβ異性体および／またはｃＧＰの含量を有することを特徴とするＬ−α−グリセロホスホリルコリン。
9. Ｌ−α−グリセロホスホリルコリンの純度を決定するための方法であって、アミノ固定相を有するＨＰＬＣカラムを通すＬ−α−グリセロホスホリルコリンの溶離と、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン自体、およびその任意の可能な不純物の、蒸発光散乱検出器型の手段によるその後の検出と含むことを特徴とする方法。
10. 前記固定相は、第２級および第３級アミノ基を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記固定相は、アミノ基、好ましくは第２級および第３級アミノ基を含有するポリマーコーティングを有する保持体、好ましくはシリカの粒子からなることを特徴とする請求項９に記載の方法。
12. 溶離液相は、水溶液、極性有機溶媒、またはそれらの混合物からなることを特徴とする請求項９に記載の方法。
13. 前記水溶液は、３から６、好ましくは４から５の範囲のｐＨを有することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記極性有機溶媒は、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコール、アセトニトリル、またはそれらの混合物であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 前記Ｃ₁〜Ｃ₄アルコールは、メタノールであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。