JP2017178899A - ニトロ化タンパク質分解剤 - Google Patents
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Abstract
Description
タンパク質のニトロ化が起きると、酵素やチロシンキナーゼ型受容体の機能低下を引き起こすことで、細胞機能に影響を及ぼすことが知られる(非特許文献3)。また、タンパク質中のニトロチロシンは加齢に伴う数々の疾患(動脈硬化や脳虚血疾患など)で蓄積することが知られており、これらの疾患に関与することが報告されている(非特許文献4)。
くすみにはさまざまな種類があり、透明感の減少によるくすみ(皮膚表面の凹凸による影によるもの、角層肥厚による光透過性の低下によるもの、皮膚表面での乱反射によるつやの低下によるものなど)、皮膚の赤みの低下によるくすみ(血行不良による)、皮膚の色ムラによるくすみ(メラニンの不均一性)、加齢に伴う皮膚の黄みの増加によるくすみなどがある(非特許文献5)。
中でも加齢に伴う皮膚色の黄み(b*)の増加は、黄ぐすみとして知られ、老化に伴う特徴的な皮膚の色調変化である。従来、黄ぐすみの主な原因は、真皮中に存在するエラスチンやコラーゲン等のタンパク質の糖化物(特許文献1)やタンパク質のカルボニル化物(特許文献2)であると考えられていた。
発明者らは、以下の方法により黄ぐすみの原因が、角層中のタンパク質がニトロ化されることにより生成されるニトロ化タンパクであることを突き止めた。
事前に測定内容に同意を得た20、30、40、50代の女性(各4−5名)を被験者に、頬部の皮膚色を分光測色計(CM−700d、コニカミノルタ)にて測定し、頬部角層の採取を行った。角層の採取は、頬部に粘着テープ(スリーエム製)を接着し、角層を採取した。角層が接着したテープを約3 mm四方に細切し、溶出バッファー(100 mM Tris/HCl (pH 8.0)、140 mM NaCl、0.1% Tween−20、10 μg/mL アプロチニン、1 mM phenylmethylsulfonyL fluoride)が入ったチューブに混合した。この混合物を超音波処理することで、テープから角層タンパク質をバッファー中に溶出した。溶出溶液を新しいチューブに移して遠心操作を行い、上清を回収したものを角層抽出物サンプルとした。
角層抽出物サンプル中の3−ニトロチロシン量はNWLSSTM Nitrotyrosine ELISA(Northwest Life Science Specialities)を用いて定量し、角層抽出物サンプルのタンパク質量はBCA法にて定量した。3−ニトロチロシン量をタンパク質量で除したものを、角層タンパク質あたりの3−ニトロチロシン量とした。
頬部の角層タンパク質あたりの3−ニトロチロシン量と皮膚色の黄み(b*値)の関係について、ピアソンの相関関係の検定を行ったところ、これらに正の相関関係にあることが明らかとなり、角層にニトロ化タンパク質が多いほど、頬部の皮膚は黄色化することが強く示された(図1)。
このことから、ニトロ化タンパクを分解できれば、肌の黄ぐすみを改善できることは勿論のこと、その素材の効果はより高い年齢層における肌の黄みの改善に期待出来ると言える。
乾燥植物原体に10倍の重量の50V/V%エタノール水溶液を加えて60℃、4時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で1:2.5:96.5となるように加えて希釈したものを被験物質とした。なお用いた茶葉は、不発酵茶(緑茶、番茶、ほうじ茶)、茶葉を酸化酵素で半発酵させた半発酵茶(ウーロン茶)、茶葉を酸化酵素で完全発酵させた発酵茶(紅茶)、茶葉を酸化酵素および微生物により発酵させた後発酵茶(プーアール茶、碁石茶)である。
ニトロ化タンパクの構成アミノ酸である3−ニトロチロシンをPBSに溶解し、0.005%(w/v)の濃度の溶液を調製した。PBSまたは3−ニトロチロシン溶液を96 well-plateに250 μLずつ分注し、被験物質および対照物質を各wellに終濃度が100 ppmになるよう添加した。37℃で72時間インキュベートしたのち、プレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。
一方、後発酵茶である碁石茶抽出物は、ニトロ化タンパクの構成アミノ酸である3−ニトロチロシン分解率は20%を超えた。以上のことから、碁石茶抽出物には、ニトロ化タンパクを分解する効果があることが示された。
DPPH試験
<DPPH溶液の調製>DPPH溶液は、以下に示す各成分を、(A):(B):(C)=1:4:3容量の割合 で混合し調製する。
(A)MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)5.52 gを水100 mLに溶か し、1N−NaOHでPH6.1に調製する。
(B)DPPH(1,1−ジフェニルー2−ピクリルヒドラジル)15.7 mgをエタノール100 mLに溶解する。
(C)精製水
<Trolox溶液の調製> Trolox 25 mgをDMSO(ジメチルスルホキシド)10mLに溶解し、10mM 溶液を作成した。
<DPPH試験>10 μLの被験物質またはTrolox溶液(0.078 mM、0.156 mM、0.313 mM、0.625 mM、1.25 mM)を96 well plateの各well中に加え、次いでDPPH溶液190 μLを迅速に加え混合する。10分後、各wellの吸光度を540 nm で測定する。Trolox濃度と540 nmの吸光度値の検量線を作成し、被験物質の540 nmの吸光度から、被験物質のTrolox当量を算出した。
碁石茶抽出物(1,3ブチレングリコール50v/v%溶媒・60℃・4時間抽出) 0.1
レゾルシン 0.5
パラジメチルアミノ安息香酸オクチル 4.0
ブチルメトキシベンゾイルメタン 4.0
ステアリルアルコール 18.0
モクロウ 20.0
グリセリンモノステアリン酸エステル 0.3
ワセリン 33.0
香料 適 量
防腐剤・酸化防止剤 適 量
精製水 残 部
合 計 100.0
碁石茶抽出物 (エタノール50v/v%水溶液溶媒・25℃・3日抽出) 5.0
卵殻カルシウム 10.0
乳糖 20.0
澱粉 7.0
デキストリン 8.0
硬化油 5.0
セルロース 残部
合計 100.0
碁石茶抽出物(水・60℃・4時間抽出) 1.0
タウリン 3.0
ピリドキシン塩酸塩 0.02
チアミン硫化物 0.01
リボフラビン 0.003
無水カフェイン 0.05
精製白糖 5.0
D−ソルビトール液 2.0
クエン酸無水物 0.2
香料 適量
精製水 残部
合計 100.0
碁石茶抽出物(エタノール溶媒・5℃・1日抽出) 0.01
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.) 1.5
1,3−ブチレングリコール 4.5
グリセリン 3.0
エタノール 2.0
ヒアルロン酸ナトリウム(1%水溶液) 5.0
エデト酸三ナトリウム 0.1
防腐剤 適量
pH調整剤 適量
精製水 残部
合計 100.0
碁石茶抽出物(エタノール溶媒・25℃・1日抽出) 0.05
タルク 5.0
セリサイト 8.0
酸化チタン 5.0
色顔料 適 量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル 3.0
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 1.5
イソノナン酸イソトリデシル 10.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
酸化防止剤 適 量
防腐剤 適 量
精製水 残 部
合 計 100.0
Claims (3)
- 碁石茶抽出物を含有するニトロ化タンパク質分解剤。
- 碁石茶抽出物を含有するニトロ化チロシン分解剤。
- 碁石茶抽出物を含有する黄ぐすみ抑制剤。
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