JP2017122639A - 分離材及びカラム - Google Patents
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Description
[1] スチレン系モノマに由来する構造単位を有する重合体を含有する多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備え、被覆層が重量平均分子量の異なる水酸基を有する高分子を2種以上含む、分離材。
[2] 平均粒径が10〜300μmである、[1]に記載の分離材。
[3] 細孔径(モード径)が0.05〜0.5μmである、[1]又は[2]に記載の分離材。
[4] 空隙率が40〜70%である、[1]〜[3]のいずれかに記載の分離材。
[5] 比表面積が30m2/g以上である、[1]〜[4]いずれかに記載の分離材。
[6] 多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンに由来する構造単位をモノマ全質量基準で50質量%以上含む重合体を含有する、[1]〜[5]いずれかに記載の分離材。
[7] 多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が3〜15%である、[1]〜[6]いずれかに記載の分離材。
[8] 水酸基を有する高分子が、多糖類又はその変性体である、[1]〜[7]いずれかに記載の分離材。
[9] 水酸基を有する高分子がアガロースである、[1]〜[8]いずれかに記載の分離材。
[10] 多孔質ポリマ粒子1g当たり、30〜500mgの被覆層を備える、[1]〜[9]いずれかに記載の分離材。
[11] カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、[1]〜[10]いずれかに記載の分離材。
[12] [1]〜[11]のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、(メタ)アクリル酸とはアクリル酸又はメタクリル酸を意味し、(メタ)アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。
本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを硬化させた粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、スチレン系モノマを使用することができる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、スチレン系モノマに由来する構造単位を有する重合体を含む。具体的なモノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
1)粒子を、超音波分散装置を使用して水(界面活性剤等の分散剤を含む)に分散させ、1質量%の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
2)粒度分布計(シスメックスフロー、シスメックス株式会社製)を用いて、上記分散液中の粒子約1万個の画像により平均粒径及び粒径のC.V.を測定する。
本実施形態に係る被覆層は、重量平均分子量の異なる2種以上の水酸基を有する高分子を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となり、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることが可能となる。また、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
水酸基を有する高分子は、1分子中に2個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類又はその変性体、及び、ポリビニルアルコール又はその変性体が挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース及びキトサンが挙げられる。水酸基を有する高分子として、重量平均分子量2000〜300000の高分子を使用することが好ましく、2500〜280000の高分子を使用することがより好ましい。
本実施形態に係る被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する3次元架橋網目構造を有する。
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド(プロテインA)等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
(吸湿後分離材質量−1)g/1g×100=吸湿度(%)
500mLの三口フラスコに、純度96%のジビニルベンゼン(新日鉄住金化学株式会社製、商品名「DVB960」)14g、オクタノールを2g、過酸化ベンゾイル0.64g加えて、ポリビニルアルコール(0.5質量%)水溶液を調製した。この水溶液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液をフラスコに移し、80℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約8時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトン洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子1を得た。多孔質ポリマ粒子1の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のC.V.値、細孔径(モード径)、空隙率及び比表面積を算出した。結果を表1に示す。
市販のアガロース粒子(GEヘルスケアジャパン株式会社、商品名「Capto DEAE」)を多孔質ポリマ粒子2として使用した。
ジビニルベンゼン14gを、ジビニルベンゼン4g及びジヒドロキシプロピルメタクリレート8gに変更した以外は多孔質ポリマ粒子1の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子3を合成した。
重量平均分子量150000のアガロースを2質量%含有するアガロース水溶液100mLに水酸化ナトリウム4g及びグリシジルフェニルエーテル0.4gを投入して70℃で12時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。フェニル基が導入されたアガロースをイソプロピルアルコールで3回再沈殿して洗浄し、変性アガロース1を得た。
重量平均分子量150000のアガロースを重量平均分子量100000のアガロースに変更した以外は、変性アガロース1の合成と同様にして、変性アガロース2を得た。
重量平均分子量150000のアガロースを重量平均分子量75000のアガロースに変更した以外は、変性アガロース1の合成と同様にして、変性アガロース3を得た。
重量平均分子量150000のアガロースを重量平均分子量5000のアガロースに変更した以外は、変性アガロース1の合成と同様にして、変性アガロース4を得た。
重量平均分子量150000のアガロースを重量平均分子量3000のアガロースに変更した以外は、変性アガロース1の合成と同様にして、変性アガロース5を得た。
<被覆層の形成及び架橋>
水1mLに対して変性アガロース1を10mg含有する変性アガロース1の水溶液350mLに多孔質ポリマ粒子1を10g投入し、55℃で24時間攪拌して、多孔質ポリマ粒子1に変性アガロース1を吸着させた後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。次に、洗浄後の変性アガロース1を吸着させた多孔質ポリマ粒子1を、水1mLに対して変性アガロース2を10mg含有する変性アガロース2の水溶液350mLに投入し、55℃で24時間攪拌して、変性アガロース2を更に吸着させた後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
得られた粒子0.5gをBSA(Bovine Serum Albumin)濃度20mg/mLのリン酸緩衝液(pH7.4)50mLに投入し、24時間室温で攪拌を行った後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のBSA濃度より、粒子に吸着したBSA量を算出した。BSAの濃度は、分光光度計により280nmの吸光度から確認した。結果を表3に示す。
得られた粒子分散液から遠心分離することにより水を除去した後、20gのジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩を溶解した水溶液100mLに分散させ、70℃で10分間攪拌した。その後、70℃に加温した5MのNaOH水溶液100mLを添加し、1時間反応させた。反応終了後、ろ過し、水/エタノール(体積比8/2)の混合液で2回洗浄して、ジエチルアミノエチル(DEAE)基をイオン交換基として有する分離材を得た。得られた分離材の細孔径(モード径)、比表面積及び空隙率を水銀圧入法にて測定した。結果を表2に示す。
12時間以上水で膨潤させた分離材を0.2〜0.3g定量し、ビーカに移し、0.1Nの水酸化ナトリウム溶液20mLを加え、25℃、1時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、分離材をビーカに移し、0.1N塩酸水溶液20mLを添加し、室温で1時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の分離材を洗浄液が中性になるまで洗浄した。この洗浄液について自動電位差滴定装置を使用して0.1N水酸化ナトリウム水溶液で滴定を行うことによって、分離材のイオン交換容量(mmol/mL)を求めた。結果を表2に示す。
得られた分離材を濃度30質量%のスラリー(溶媒:メタノール)としてφ7.8×300mmのステンレスカラムにて15分充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、0.3MPa時の通液速度(線流速)を測定した。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。20mmol/LのTris−塩酸緩衝液(pH8.0)をカラムに10カラム容量通した。その後、BSA濃度2mg/mLの20mmol/LのTris−塩酸緩衝液を通し、UV測定によってカラム出口でのBSA濃度を測定した。カラム入口と出口のBSA濃度が一致するまで緩衝液を通し、5カラム容量分の1M NaCl Tris−塩酸緩衝液で希釈した。10%breakthroughにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表3に示す。
q10=cfF(t10−t0)/VB
q10:10%breakthroughにおける動的吸着量(mg/mL wet resin)
cf:注入しているBSA濃度
F:流速(mL/min)
VB:ベッド体積(mL)
t10:10%breakthroughにおける時間(min)
t0:BSA注入開始時間(min)
得られた分離材を0.5Mの水酸化ナトリウム水溶液中で24時間撹拌し、リン酸緩衝液で洗浄後、カラム特性評価と同様の条件にて充填した。BSAの10%breakthrough動的吸着量を測定し、アルカリ処理前の動的吸着量と比較した。動的吸着量の減少率が3%以下であるものを「○」、3%超20%以下であるものを「△」、20%超であるものを「×」とした。結果を表3に示す。
800cm/hの流速で水をカラムに流し、カラム圧を測定後、3000cm/hに流速を上昇させ、1h通液させた。再度800cm/hにカラム圧を下げた際に、カラム圧が初期値(3000cm/hに流速を上げる前)より10%以上上昇した場合を「×」、10%未満である場合を「○」とした。結果を表3に示す。
変性アガロース2を変性アガロース4に変更した以外は実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例1と同様に評価した。
変性アガロース1、3及び5の順に、多孔質ポリマ粒子1に吸着させて被覆層を形成した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例1と同様に評価した。
多孔質ポリマ粒子2をそのまま分離材として用い、実施例1と同様に評価した。
(多孔質ポリマ粒子6)
多孔質ポリマ粒子1を多孔質ポリマ粒子3に変更し、被覆層を形成せずにイオン交換基を導入した以外は実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例1と同様に評価をした。
変性アガロース4のみを多孔質ポリマ粒子1に吸着させて被覆層を形成した以外は、実施例1と同様にして分離材を作製し、実施例1と同様に評価した。
Claims (12)
- スチレン系モノマに由来する構造単位を有する重合体を含有する多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層と、を備え、
前記被覆層が、重量平均分子量の異なる水酸基を有する高分子を2種以上含む、分離材。 - 平均粒径が10〜300μmである、請求項1に記載の分離材。
- 細孔径(モード径)が0.05〜0.5μmである、請求項1又は2に記載の分離材。
- 空隙率が40〜70%である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離材。
- 比表面積が30m2/g以上である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記重合体が、ジビニルベンゼンに由来する構造単位をモノマ全質量基準で50質量%以上含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数が3〜15%である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子が、多糖類又はその変性体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記水酸基を有する高分子がアガロースである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の分離材。
- 前記多孔質ポリマ粒子1g当たり、30〜500mgの前記被覆層を備える、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分離材。
- カラムに充填した場合、カラム圧0.3MPaのときに通液速度が800cm/h以上である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の分離材。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
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