JP2017067746A - 相関顕微鏡 - Google Patents

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Abstract

【課題】 光学顕微鏡と電子顕微鏡において高い精度で同一位置での観察が行える相関顕微鏡を提供する。
【解決手段】 ２つの顕微鏡１，２にそれぞれ位置決めされたときの同一の試料台６の画像及び試料７の観察対象組織３５を含む第１領域抽出窓３７と第１試料台座標３１と第２試料台座標３２と第２領域抽出窓３８の座標とをそれぞれ取得し、第１試料台座標と第２試料台座標との差を基に第２試料台座標を補正して、第２領域抽出窓の補正後の座標を取得し、補正後の座標を基に、第２位置決め部を、第２非観察位置から、第１領域抽出窓の座標位置に対応する位置に第２領域抽出窓が位置している第２観察位置に移動させる。
【選択図】図４

Description

本発明は、電子顕微鏡とレーザ顕微鏡とを非同軸に配置した状態で搬送装置により試料を両顕微鏡にそれぞれ搬送して観察することができる相関顕微鏡に関する。
疾病診断方法の開発等の医療バイオ分野では、生体組織を蛍光色素で免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察している。しかし、この方法では１０００倍程度の解像度が限界である。それに対し、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を高倍率で観察する方法として、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという。）の電子線を試料に照射して蛍光を発生させ（カソードルミネッセンス）、その蛍光を観察する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。
また、半導体ウェハ等の分析に関するものではあるが、荷電粒子による試料励起と光による試料励起を一つの装置で行うようＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、試料の分析点のＸ線分光スペクトルと蛍光スペクトルとを測定する表面分析装置も提案されている（例えば、特許文献２）。
このように、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を即座にＳＥＭで観察することにより、その分析点の形態的特徴から対象物を短時間で同定できることが期待できる。
しかしながら、この場合、ＳＥＭと光学顕微鏡とに同一試料をそれぞれ搬送して同一箇所を観察しようとしても、搬送による位置決め精度が悪く、高い精度で同一箇所を観察することができなかった。
そこで、半導体素子に関するものではあるが、走査型電子顕微鏡に試料を搬送する搬送装置としては、特許文献３及び４のような構成が知られている。
特開平１１−２６０３０３号公報 特開平５−１１３４１８号公報 特開２０１４−８６４１９号公報 特開平８−２７３５７２号公報
しかしながら、前記従来の公報においては、オリフラを基準に位置決めされるため、生体試料に対しては、そのようなオリフラによる位置決め方法を適用することができず、高い精度で同一位置での観察が行える相関顕微鏡の開発が望まれていた。
従って、本発明の目的は、前記問題を解決することにあって、高い精度で同一位置での観察が行える相関顕微鏡を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は以下のように構成する。
本発明の第１の態様によれば、第１顕微鏡と、
前記第１顕微鏡とは光軸が非同軸で配置された第２顕微鏡と、
試料が保持された試料台を試料台位置決め保持部に位置決め保持した状態で前記第１顕微鏡から前記第２顕微鏡へ前記試料台を搬送する搬送装置と、
前記第１顕微鏡に配置されて、少なくとも第１観察位置と第１非観察位置との間で移動可能でかつ前記試料台を位置決め保持する第１位置決め部を有するとともに、前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１位置決め部と前記搬送装置の前記試料台位置決め保持部との間で前記試料台を受渡しする第１位置決め装置と、
前記第１位置決め部が前記第１観察位置及び前記第１非観察位置にそれぞれ位置したとき、前記第１位置決め部に位置決めされた前記試料台の画像を取得して、前記試料台の前記試料の観察対象組織を含む第１領域抽出窓の画像を取得する第１画像取得部と、
前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得した画像を基に、前記第１位置決め部に位置決めされた前記試料台の第１試料台座標の座標位置を取得する第１座標取得部と、
前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得した前記第１領域抽出窓の画像と前記第１座標取得部で取得した前記試料台の前記第１試料台座標の座標位置とに基づいて、前記第１試料台座標における前記第１領域抽出窓の座標位置を取得する第１抽出窓座標取得部と、
前記第２顕微鏡に配置されて、少なくとも第２観察位置と第２非観察位置との間で移動可能でかつ前記試料台を位置決め保持する第２位置決め部を有するとともに、前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２位置決め部と前記搬送装置の前記試料台位置決め保持部との間で前記試料台を受渡しする第２位置決め装置と、
前記第２位置決め部が前記第２観察位置及び前記第２非観察位置にそれぞれ位置したとき、前記第２位置決め部に位置決めされた前記試料台の画像を取得して、前記試料台の前記第１領域抽出窓に対応する第２領域抽出窓の画像を取得する第２画像取得部と、
前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得した画像を基に、前記第２位置決め部に位置決めされた前記試料台の第２試料台座標の座標位置を取得する第２座標取得部と、
前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得した前記第２領域抽出窓の画像と前記第２座標取得部で取得した前記試料台の前記第２試料台座標の座標位置とに基づいて、前記第２試料台座標における前記第２領域抽出窓の座標位置を取得するとともに、前記第１座標取得部で取得した前記第１試料台座標の前記座標位置と前記第２座標取得部で取得した前記第２試料台座標の前記座標位置との差を取得して、取得した差を基に、前記第２試料台座標の前記座標位置を補正して、前記第１領域抽出窓に対応する前記第２領域抽出窓の補正後の座標位置を取得する第２抽出窓座標取得部とを備えて、
前記第２位置決め装置は、前記第２抽出窓座標取得部で取得した前記第２領域抽出窓の補正後の座標位置に基づいて、前記第２位置決め部を、前記第２非観察位置から、前記第１領域抽出窓の前記座標位置に対応する位置に前記第２領域抽出窓が位置している前記第２観察位置に移動させるとともに、
前記第１顕微鏡と前記第２顕微鏡とは、いずれか一方の顕微鏡が光学顕微鏡であり、他方の顕微鏡が電子顕微鏡である、相関顕微鏡を提供する。
また、本発明の第２の態様によれば、第１の態様において、前記第１位置決め部が前記第１観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得された前記第１領域抽出窓の画像から抽出された前記観察対象組織の複数個の特徴部に基づき、前記第１位置決め部が前記第１観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得された前記第１領域抽出窓の前記画像と前記第２位置決め部が前記第２観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得された前記第２領域抽出窓の画像とのパターンマッチングを行う画像処理部と、
前記画像処理部での前記パターンマッチングの結果と、前記第１座標取得部で取得した前記第１試料台座標の座標位置と、前記第２抽出窓座標取得部で取得した第２領域抽出窓の前記補正後の座標位置とを基に、前記第１領域抽出窓の画像と前記第２領域抽出窓の画像とを重ね合わせる画像合成部とをさらに備えることもできる。
本発明の前記第１の態様によれば、２つの顕微鏡にそれぞれ位置決めされたときの同一の試料台の画像及び試料の観察対象組織を含む第１領域抽出窓と第１試料台座標と第２試料台座標と第２領域抽出窓の座標とをそれぞれ取得し、第１試料台座標と第２試料台座標との差を基に第２試料台座標を補正して、第２領域抽出窓の補正後の座標を取得し、補正後の座標位置を基に、第２位置決め装置は、第２位置決め部を、第２非観察位置から、第１領域抽出窓の座標位置に対応する位置に第２領域抽出窓が位置している第２観察位置に移動させる。この結果、高い精度で同一位置での観察を行うことができる。
また、本発明の前記第２の態様によれば、第１領域抽出窓画像に対応する第２領域抽出窓画像に対してパターンマッチングを行い、第１領域抽出窓画像と第２領域抽出窓画像とを重ね合わせた合成画像を生成することができる。この結果、高い精度で同一位置での合成画像を取得して観察することができる。
本発明の１つの実施形態にかかる相関顕微鏡の概略正面図 実施形態にかかる相関顕微鏡の平面図 相関顕微鏡の正面図 相関顕微鏡のブロック図 相関顕微鏡の試料台の平面図 相関顕微鏡の試料台の底面図 相関顕微鏡の試料台の斜視図 相関顕微鏡の搬送装置の部分の平面図 相関顕微鏡の搬送装置の部分の斜視図 相関顕微鏡の搬送装置の試料台位置決め保持部付近の斜視図 相関顕微鏡の搬送装置の周辺の斜視図 相関顕微鏡の第１位置決め装置の斜視図 相関顕微鏡の第１顕微鏡、搬送装置、及び試料台投入装置の平面図 相関顕微鏡の第１位置決め装置の第１位置決め部の拡大平面図 相関顕微鏡の第１位置決め装置での第１試料台座標と第２位置決め装置での第２試料台座標との関係及びテンプレートマッチングを説明するための説明図 相関顕微鏡の第２顕微鏡及びロードロック室ユニットの平面図 相関顕微鏡のロードロック室内での受渡しを説明するための拡大平面図 相関顕微鏡の回転搬送装置の斜視図 相関顕微鏡の回転搬送装置の平面図 相関顕微鏡のロードロック室ユニット及び第２顕微鏡の真空室内の斜視図 相関顕微鏡の第２位置決め装置の第２位置決め部の拡大平面図 相関顕微鏡の搬送装置の搬送動作のフローチャート 相関顕微鏡の試料の第１例にかかる合成前後の画像の説明図 相関顕微鏡の試料の第２例にかかる合成前後の画像の説明図 相関顕微鏡の試料の第３例にかかる合成前後の画像の説明図 相関顕微鏡の試料の第４例にかかる合成前後の画像の説明図 従来の２つの顕微鏡間での位置合わせの状態を説明するための説明図 実施形態にかかる相関顕微鏡での位置合わせの状態を説明するための説明図 前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台の平面図 前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台の正面図 前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台の斜視図 前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台に挿入可能な標準試料台の斜視図 前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台に標準試料台が挿入された状態での斜視図
以下、図面を参照して本発明における第１実施形態を詳細に説明する。
図１は、本発明の第１の実施形態にかかる相関顕微鏡１０の概略構成図である。図２及び図３は、一例として、相関顕微鏡１０の配置を示す平面図及び正面図である。
本発明の第１の実施形態にかかる相関顕微鏡１０は、図１〜図３に示すように、少なくとも、第１顕微鏡１と、第２顕微鏡２と、搬送装置５と、第１位置決め装置８と、第２位置決め装置９と、制御部１１と備えている。必要に応じて、相関顕微鏡１０は、モニタ４、記憶部５０、試料台投入装置６９、免振台３なども備えている。モニタ４は、観察結果を表示するディスプレイである。記憶部５０は、制御部１１の各部又は各種検出部又はリニアスケールなどで取得した情報を記憶する。試料台投入装置６９は試料台６を投入のため準備する装置である。免振台３は、各種装置等を載置して、相関顕微鏡１０の外部から相関顕微鏡１０に伝達される振動を防止するための装置である。
第１顕微鏡１と第２顕微鏡２とは、いずれか一方の顕微鏡が光学顕微鏡であり、他方の顕微鏡が電子顕微鏡である。一例として、この第１実施形態では、第１顕微鏡１は、光学顕微鏡の一例である共焦点顕微鏡とする。また、第２顕微鏡２は、電子顕微鏡の一例である走査型電子顕微鏡とし、共焦点顕微鏡１とは光軸が非同軸で配置されている。以下の説明では、第１顕微鏡１の例である共焦点顕微鏡に最初に試料台６を搬送したのち、第２顕微鏡２の例である走査型電子顕微鏡に試料台６を搬送しているが、この順序に限定されるものではなく、逆の順序で試料台６を搬送してもよい。
図４に示すように、詳しくは後述するが、制御部１１は、少なくとも、第１座標取得部２１と、第２座標取得部２２と、第１抽出窓座標取得部２３と、第２抽出窓座標取得部２４と、第１画像取得部４１と、第２画像取得部４２と、画像処理部４６と、画像合成部４７とを備えている。制御部１１の動作制御部４９は、第１顕微鏡１と、第２顕微鏡２と、搬送装置５と、第１位置決め装置８と、第２位置決め装置９と、ロードロック室ユニット６０と、回転搬送装置６６となどの各種駆動装置、及び、制御部１１の第１座標取得部２１から画像合成部４７までのそれぞれの動作を制御している。
第１顕微鏡１と第２顕微鏡２との間で搬送装置５により試料台６が搬送されている。試料台６には、試料７が保持されている。
図５Ａ〜図５Ｃに示すように、試料台６は、例えば銅などの非磁性体の円板状部材で構成されている。試料台６の表面には、試料載置領域６ａと、試料載置領域６ａの近傍でかつ試料載置領域６ａ外に２つの基準点６ｂ，６ｃが配置されている。各基準点６ｂ，６ｃは、例えば、直径１ｍｍ程度の小さな円形凹部で形成されている。試料台６は、その側面に、９０度毎に周囲の四隅に湾曲した切欠部６ｄ，…，６ｄを有するとともに、隣接する２つの切欠部６ｄ，６ｄの中間に円形の位置決め切欠６ｅを有する。また、試料台６の裏面中央には、円形の位置決め凹部６ｆを有している。試料台６の全周囲の側面下部には、上向き傾斜防止用の鍔部６ｈを有している。試料載置領域６ａには、観察対象組織３５を含む生体試料７が両面接着テープなどにより固定されている。観察対象組織３５の例は、１つの細胞又は器官、又は、１つの細胞又は器官の一部などである。
搬送装置５は、少なくとも試料台位置決め保持部２５を有して、試料台６を試料台位置決め保持部２５に位置決め保持した状態で、第１顕微鏡１から第２顕微鏡２へ試料台６を搬送する。具体的には、図６〜図９に示すように、搬送装置５は、モータなどで正逆回転駆動される回転装置５ａと、回転装置５ａで正逆回転する搬送アーム５ｂと、搬送アーム５ｂの先端に取り付けられた試料台位置決め保持部２５と、試料台位置決め保持部２５を搬送アーム５ｂの軸方向に進退させる進退装置５ｃと、搬送アーム５ｂを上下動させる昇降装置５ｄとを備えている。進退装置５ｃと昇降装置５ｄとは、それぞれ、例えば、案内機構で案内しつつ正逆回転モータなどで１つの軸方向に進退駆動させる公知の駆動装置である。よって、試料台位置決め保持部２５を回転装置５ａの回転軸の周りに正逆回転させるとともに、昇降装置５ｄで搬送アーム５ｂを上下動させ、進退装置５ｃで試料台位置決め保持部２５を搬送アーム５ｂの軸方向に進退可能として、第１位置決め装置８及び第２位置決め装置９に対して、試料台６を自在に位置調整可能としている。
試料台位置決め保持部２５は、図８に示すように、搬送アーム５ｂの先端に固定されたＬ字状の保持枠部２５ａと、保持枠部２５ａの下部中央部に立設した第１位置決めピン２５ｂと、第１位置決めピン２５ｂの両側に張り出して試料台６の裏面を支持する一対の支持台部２５ｃと、保持枠部２５ａの基端側で一方の支持台部２５ｃから立設した第２位置決めピン２５ｄとを備えている。よって、第１位置決めピン２５ｂは、試料台６の裏面中央の位置決め凹部６ｆに嵌合するとともに、第２位置決めピン２５ｄは、試料台６の位置決め切欠６ｅに嵌合して、試料台６を試料台位置決め保持部２５に対して位置決めした状態で、一対の支持台部２５ｃで試料台６の裏面を支持して保持できるようにしている。
第１位置決め装置８は、第１顕微鏡１の下部に配置されている。図１０に示すように、第１位置決め装置８は、例えば、ＸＹＺステージ８ａと、リニアスケール８ｂと、第１位置決め制御部８ｇとで構成されている。
ＸＹＺステージ８ａは、Ｘ軸ステージ８ｘとＹ軸ステージ８ｙとＺ軸ステージ８ｚとで構成されている。ＸＹＺステージ８ａは、Ｘ軸ステージ８ｘでＸ軸方向に進退可能であり、Ｙ軸ステージ８ｙでＹ軸方向に進退可能であり、Ｚ軸ステージ８ｚでＺ軸方向に進退可能である。
リニアスケール８ｂは、ＸＹＺステージ８ａのＸ軸ステージ８ｘとＹ軸ステージ８ｙとＺ軸ステージ８ｚとの各軸に配置されて、リニアエンコーダとも呼ばれ、ｎｍオーダの測長器であり、これを用いてＰＩＤ制御によりＸＹＺステージ８ａの位置決めを行っている。各リニアスケール８ｂは、固定側エンコーダヘッドから可動側ガラススケールにレーザが照射され、可動側ガラススケールで反射されて受光される光を基に可動側ガラススケールの目盛を固定側エンコーダヘッドでｎｍ精度で取得する。すなわち、各軸の位置座標を固定側エンコーダヘッドでｎｍ精度で取得できるように構成している。従って、第１顕微鏡１のＸＹＺステージ８ａのステージ座標系分解能と位置精度、すなわち、第１顕微鏡１のＸＹＺステージ８ａの後述する装置座標（ＸＹ座標）５８と装置座標原点５８ｏとがｎｍ精度で繰り返し一致するような、ＸＹ座標５８と装置座標原点５８ｏとを有している。
第１位置決め制御部８ｇは、リニアスケール８ｂの情報を基に、各ステージのモータなどの駆動装置８ｘａ，８ｙａ，８ｚａを駆動制御する。すなわち、第１位置決め制御部８ｇにより、リニアスケール８ｂの情報を基に、Ｘ軸ステージ８ｘとＹ軸ステージ８ｙとＺ軸ステージ８ｚとは、互いに直交するＸ軸とＹ軸とＺ軸とにｎｍ精度例えば１０ｎｍ分解能のサーボ制御にて移動可能としている。
第１位置決め装置８は、試料台６を位置決め保持する第１位置決め部２８を有するとともに、第１位置決め部２８が受渡し位置Ｉに位置したのち、第１位置決め部２８と搬送装置５の試料台位置決め保持部２５との間で試料台６を受渡しする。第１位置決め部２８は、試料台６の受渡しを行う受渡し位置Ｉの他に、座標位置を取得する第１基準マーク撮像基準位置と、観察を行う単数又は複数の第１観察位置とにそれぞれ移動可能としている。本実施形態では、受渡し位置Ｉと第１基準マーク撮像基準位置とが第１非観察位置の例である。非観察位置とは、観察位置以外の位置であって、試料台６の受渡し動作又は装置座標等を取得する動作を行うための位置である。第１位置決め部２８の第１基準マーク撮像基準位置は、第１位置決め装置８において予め決められており、例えば、座標計算を簡単にするため、２つの基準点６ｂ，６ｃの中間にＹ軸が位置し、Ｘ軸が試料載置領域６ａを横切るような位置（図１３の左側の座標を参照）などに決めればよい。
第１位置決め部２８は、図１１及び図１２に示すように、第１位置決め部２８に対する搬送装置５による搬入方向（図１２の左方向）の先端の一対の切欠部６ｄにそれぞれ係合可能な一対の位置決め突起２８ａと、試料台６の搬入方向と交差する方向の一対の端部の裏面を支持する一対の支持部２８ｂ，２８ｃと、搬入方向の後端の１つの切欠部６ｄに係合可能なロック部２８ｄ先端に有して支持軸２８ｆ周りに正逆回転可能なレバー２８ｅと、レバー２８ｅを正逆回転駆動するモータなどのロック部駆動装置２８ｈと、試料台位置決め保持部２５による試料台搬入搬出用の開口部２８ｇとを有している。
よって、試料台位置決め保持部２５から第１位置決め部２８に試料台６を渡すときは、以下のように動作する。
まず、第１位置決め部２８が受渡し位置Ｉに位置したのち、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５の第１位置決めピン２５ｂと第２位置決めピン２５ｄとで位置決めされつつ支持台部２５ｃで下から支持されている状態の試料台６が、試料台位置決め保持部２５と共に搬入方向から第１位置決め部２８の上方まで進退装置５ｃで移動する。
次いで、昇降装置５ｄで試料台６と共に試料台位置決め保持部２５が下降して、試料台位置決め保持部２５が開口部２８ｇ内に入るとともに、試料台６の搬入方向と交差する方向の一対の端部の裏面を、第１位置決め部２８の一対の支持部２８ｂ，２８ｃで支持したのち、昇降装置５ｄによる試料台位置決め保持部２５の下降を停止する。
次いで、第１位置決め部２８のレバー２８ｅをロック部駆動装置２８ｈにより一点鎖線の退避位置から反時計周りに回転させて、搬入方向の後端の１つの切欠部６ｄに係合させるとともに、第１位置決め部２８の一対の位置決め突起２８ａを、試料台６の搬入方向の先端の一対の切欠部６ｄに係合させる。この結果、試料台６を第１位置決め部２８に位置決め保持する。
次いで、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５を搬送装置５の昇降装置５ｄによりさらに下降させて、支持台部２５ｃによる試料台６の支持を解除したのち、進退装置５ｃで試料台位置決め保持部２５を第１位置決め部２８の開口部２８ｇから反搬入方向に退避することにより、試料台６を試料台位置決め保持部２５から第１位置決め部２８に渡すことができる。
その後、第１位置決め装置８の駆動により、まず、第１基準マーク撮像基準位置に第１位置決め部２８を位置決めして、第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像を第１画像取得部４１で取得したのち、第１位置決め部２８を第１観察位置まで移動させて、第１顕微鏡１で観察を行う。
逆に、第１位置決め部２８から試料台位置決め保持部２５に試料台６を受け取るときは、以下のように動作する。
まず、第１位置決め装置８の駆動により、第１位置決め部２８を試料台受渡し位置Ｉまで移動させたのち、進退装置５ｃで試料台位置決め保持部２５を第１位置決め部２８の下方まで搬入方向に移動させる。
次いで、昇降装置５ｄで試料台位置決め保持部２５を上昇させて開口部２８ｇ内に入り込ませて、支持台部２５ｃにより試料台６を下から支持する。
次いで、第１位置決め部２８のレバー２８ｅをロック部駆動装置２８ｈにより切欠部６ｄに係合した位置から一点鎖線の退避位置まで時計周りに回転させて、係合解除する。
次いで、さらに、昇降装置５ｄで試料台６と共に試料台位置決め保持部２５を上昇させれば、試料台６を第１位置決め部２８の位置決め保持状態から解除することができる。
次いで、進退装置５ｃで試料台６と共に試料台位置決め保持部２５を第１位置決め部２８の開口部２８ｇから反搬入方向に退避することにより、試料台６を第１位置決め部２８から試料台位置決め保持部２５に受け取ることができる。
なお、試料台位置決め保持部２５の支持台部２５ｃは、試料台６の裏面の搬入方向の前後の端部を支持する一方、支持部２８ｂ，２８ｃは、搬入方向と交差する方向の一対の端部を支持するため、支持台部２５ｃと支持部２８ｂ，２８ｃとが当接することなく、試料台６を第１位置決め部２８と試料台位置決め保持部２５との間で円滑に受渡しすることができる。
第１画像取得部４１は、蛍光選択フィルタ（不図示）と観察用カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）とを有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出してデジタル信号を取得する。第１位置決め部２８が第１基準マーク撮像基準位置に位置決めされたとき、及び、第１位置決め部２８が単数又は複数の第１観察位置に位置決めされたとき、第１画像取得部４１は、取得したデジタル信号を基に、第１位置決め部２８に位置決めされた試料台６の画像をそれぞれ取得して、試料台６の試料載置領域６ａに載置された試料７の観察対象組織３５を含む第１領域抽出窓３７の画像をそれぞれ取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。ここで、第１領域抽出窓３７は、試料載置領域６内に位置し、かつ、単数又は複数の観察対象組織３５を含むように、ユーザが、キーボード又はマウス又は音声入力などの入出力装置４８により設定できる。第１領域抽出窓３７の一例としては、４個の頂点の座標位置を指定することにより定義できる、四角形の仮想の領域抽出窓である。実際の例としては、ユーザに、第１領域抽出窓３７を設定するように促す抽出窓設定部７０を制御部１１に備えるようにしてもよい。第１位置決め部２８が第１基準マーク撮像基準位置に位置決めされたときには、第１位置決め装置８の装置座標原点５８ｏに対する装置座標５８を取得するための試料台６の画像と共に、第１基準マーク撮像基準位置での第１領域抽出窓３７の画像も第１画像取得部４１で取得する。
第１座標取得部２１は、第１画像取得部４１で取得した第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像から、試料台６の第１試料台座標３１の座標位置を取得する。具体的には、第１座標取得部２１においては、第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像から、パターンマッチングなどにより、試料台６の２つの基準点６ｂ，６ｃの位置を抽出して、抽出した２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置を求める。ここでの座標位置は、図１３に示すように、第１位置決め装置８の装置座標原点５８ｏに対する装置座標５８の座標位置である。なお、装置座標５８はｘ軸５８ｘ及びｙ軸５８ｙで構成されている。これらの２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置のうち、一方の基準点（例えば、搬入方向先端側の基準点）６ｂの座標位置を第１試料台座標３１の原点位置３１ｏとし、２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置を結ぶ線３１ｘを第１試料台座標３１のｘ軸とする。第１試料台座標３１の原点位置３１ｏを通りかつ第１試料台座標３１のｘ軸３１ｘと直交する軸が、第１試料台座標３１のｙ軸３１ｙとなる。このようにして、原点位置３１ｏとｘ軸３１ｘとｙ軸３１ｙとにより第１試料台座標３１が定義できる。取得した第１試料台座標３１の座標位置などの情報は、記憶部５０に記憶する。
第１抽出窓座標取得部２３は、第１画像取得部４１で取得した第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像、及び、例えば、ユーザが指定した第１領域抽出窓３７の４個の頂点の位置を基に、第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の第１試料台座標３１における試料台６の試料７の第１領域抽出窓３７の４個の頂点の座標位置を取得する。取得した情報及び設定した情報は、記憶部５０に記憶する。
共焦点顕微鏡は、大気中で試料７を観察可能であるが、走査型電子顕微鏡は、真空中で試料７を観察するため、気圧調整のためのロードロック室ユニット６０と回転搬送装置６６とが必要となる。この実施形態では、第２顕微鏡２の一例が走査型電子顕微鏡であるため、図２、図３、及び図１４に示すように、第２顕微鏡２に隣接してロードロック室ユニット６０と回転搬送装置６６とを配置している。詳しくは以下に詳述するが、ロードロック室ユニット６０内には、搬送部材６１を備えて、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５と搬送部材６１との間で試料台６を受渡しし、ロードロック室ユニット６０のロードロック室６０ａを大気圧から真空圧まで減圧したのちは、搬送部材６１と回転搬送装置６６との間で試料台６を受渡しするとともに、第２顕微鏡２の真空室２ａ内の回転搬送装置６６の回転搬送アーム６７と第２顕微鏡２の第２位置決め装置９との間で試料台６を受渡しする。
ロードロック室ユニット６０は、図１４及び図１５に示すように、搬送部材６１と、搬送部材駆動装置６２と、真空吸引装置６３と、大気側の第１開閉装置６４と、真空側の第２開閉装置６５とを備えている。搬送部材６１は、ロードロック室６０ａ内で、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５との間で試料台６を受渡し可能とするとともに、後述する回転搬送アーム６７との間でも試料台６を受渡し可能としている。搬送部材駆動装置６２は、搬送部材６１を長手軸方向沿いに進退駆動する、エアシリンダ又はモータとギヤとの組み合わせなどで構成される。
搬送部材６１は、先端部が二股部６１ａに分岐して、分岐した隙間６１ｂに、試料台位置決め保持部２５の第１位置決めピン２５ｂ及び回転搬送アーム６７の第１位置決めピン６１ｂがそれぞれ挿入可能としている。
よって、試料台位置決め保持部２５から搬送部材６１に試料台６を渡すときは、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａ内に入って後述する受渡し位置ＩＩＩに位置したのち、搬送部材６１が退避位置から受渡し位置ＩＩＩに移動して、搬送部材６１の二股部６１ａが試料台位置決め保持部２５の試料台６と試料台位置決め保持部２５との隙間内に入り込み、搬送部材６１の分岐した隙間６１ｂに試料台位置決め保持部２５の第１位置決めピン２５ｂが挿入される。その後、試料台位置決め保持部２５が下降する。すると、搬送部材６１の二股部６１ａで試料台６の裏面が支持可能となり、試料台位置決め保持部２５から試料台６を回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａに受け取ることができる。その後、試料台６を支持した搬送部材６１が退避位置まで移動したのち、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａから退避する。
一方、搬送部材６１から回転搬送アーム６７に試料台６を渡すときは、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａ内に入ってきて、受渡し位置ＩＩＩに位置した搬送部材６１の下方に、回転搬送アーム６７の第１位置決めピン６７ｂが位置したのち、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａが上昇すると、搬送部材６１の分岐した隙間６１ｂに回転搬送アーム６７の第１位置決めピン６７ｂが挿入される。すると、二股部６１ａで支持されていた試料台６の裏面を、回転搬送アーム６７の一対の支持台部６７ｃで支持可能となり、搬送部材６１から試料台６を回転搬送アーム６７に受け取ることができる。その後、搬送部材６１が退避位置まで移動したのち、試料台６を支持した試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａから退避する。
逆に、回転搬送アーム６７から搬送部材６１が試料台６を受け取るときは、搬送部材６１が退避位置に位置した状態で、試料台６を支持した回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａ内に入ってきて、受渡し位置ＩＩＩに位置する。次いで、搬送部材６１が退避位置から受渡し位置ＩＩＩに移動して、搬送部材６１の二股部６１ａで試料台６の裏面を支持したのち、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａが下降する。すると、試料台６は搬送部材６１の二股部６１ａでのみ支持された状態となり、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａはロードロック室６０ａから退避する。
さらに、搬送部材６１から試料台位置決め保持部２５に試料台６を渡すときは、試料台６を支持した搬送部材６１が退避位置に位置した状態で、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａ内に入ってきて、受渡し位置ＩＩＩでかつ搬送部材６１の下方に位置する。次いで、試料台位置決め保持部２５が上昇して、試料台位置決め保持部２５で試料台６を支持する。その後、搬送部材６１が退避位置に移動すると、試料台位置決め保持部２５でのみ試料台６を支持することになる。その後、試料台６を支持した試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａから退避する。
搬送部材駆動装置６２は、搬送部材６１を長手方向に進退駆動させて、搬送部材６１の先端部に支持した試料台６の、試料台位置決め保持部２５との受渡し位置ＩＩＩと、回転搬送アーム６７との受渡し位置ＩＩＩと、退避位置とに搬送部材６１がそれぞれ移動可能としている。この例では、試料台位置決め保持部２５との受渡し位置ＩＩＩと回転搬送アーム６７との受渡し位置ＩＩＩとは同一位置としているが、異なる位置としてもよい。搬送部材６１の退避位置では、搬送部材６１が試料台位置決め保持部２５及び回転搬送アーム６７と接触しない位置としている。
ロードロック室６０ａの搬送装置側すなわち大気側の第１開閉ドア６４ａを第１開閉装置６４で開閉可能としている。また、ロードロック室６０ａの搬送アーム側すなわち真空側の第２開閉ドア６５ａを第２開閉装置６５で開閉可能としている。
ロードロック室６０ａの大気側の第１開閉ドア６４ａを開閉するときは、搬送部材６１を受渡し位置ＩＩＩ又は退避位置に位置させた状態で、ロードロック室６０ａの圧力を大気圧まで上昇させたのち、大気側の第１開閉ドア６４ａを開ける。その後、ロードロック室６０ａの大気側の第１開閉ドア６４ａを開けた状態で、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａ内に入り込んで試料台６を受渡しし、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａから取り出されたのち、大気側の第１開閉ドア６４ａを閉じる。その後、ロードロック室６０ａを真空にするときは、真空吸引装置６３を駆動する。真空になったのちは、ロードロック室６０ａの真空側の第２開閉ドア６５ａを開けて、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａ内に入り込んで、搬送部材６１を受渡し位置ＩＩＩに位置させた状態で試料台６を受渡しし、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａと共に試料台６がロードロック室６０ａから取り出されたのち、真空側の第２開閉ドア６５ａを閉じる。
逆に、真空から大気圧にするときは、図示しない開放弁を動作制御部４９で動作制御して、大気圧に開放する。
回転搬送装置６６は、図１６〜図１７に示すように、Ｃ字状に屈曲した回転搬送アーム６７と、回転搬送アーム６７を正逆回転する回転搬送駆動装置６８とで構成されている。回転搬送駆動装置６８は、正逆回転駆動するモータ６８ａと、ウォーム６８ｂと、ギア６８ｃと、回転軸６８ｄと、昇降装置６８ｅとで構成されている。モータ６８ａが正逆回転駆動されると、モータ６８ａの回転軸に固定されたウォーム６８ｂが正逆回転し、ウォーム６８ｂと噛み合ったギア６８ｃに固定された回転軸６８ｄが正逆回転する。
回転搬送アーム６７は、Ｃ字状の保持枠部６７ａと、保持枠部６７ａの下部中央部に立設した第１位置決めピン６７ｂと、第１位置決めピン６７ｂの両側に張り出して試料台６の裏面を支持する一対の支持台部６７ｃとを備えている。
よって、第１位置決めピン６７ｂは、試料台６の裏面中央の位置決め凹部６ｆに嵌合した状態で、一対の支持台部６７ｃで試料台６の裏面を支持して保持できるようにしている。
回転搬送アーム６７は、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａ内に入り込んで搬送部材６１との間で試料台６を受渡しする位置と、第２顕微鏡２の第２位置決め装置９との間で試料台６を受渡しする位置との間で回転移動可能としている。昇降装置６８ｅは、エアシリンダ等で構成され、回転搬送アーム６７を回転軸方向沿いに昇降可能としている。
第２位置決め装置９は、第２顕微鏡２の下部に配置されている。図１８に示すように、第２位置決め装置９は、例えば、ＸＹＺステージ９ａと、リニアスケール９ｂと、第２位置決め制御部９ｇとで構成されている。
ＸＹＺステージ９ａは、Ｘ軸ステージ９ｘとＹ軸ステージ９ｙとＺ軸ステージ９ｚとで構成されている。ＸＹＺステージ９ａは、Ｘ軸ステージ９ｘでＸ軸方向に進退可能であり、Ｙ軸ステージ９ｙでＹ軸方向に進退可能であり、Ｚ軸ステージ９ｚでＺ軸方向に進退可能である。
リニアスケール９ｂは、ＸＹＺステージ９ａのＸ軸ステージ９ｘとＹ軸ステージ９ｙとＺ軸ステージ９ｚとの各軸に配置されて、リニアエンコーダとも呼ばれ、ｎｍオーダの測長器であり、これを用いてＰＩＤ制御によりＸＹＺステージ９ａの位置決めを行っている。各リニアスケール９ｂは、固定側エンコーダヘッドから可動側ガラススケールにレーザが照射され、可動側ガラススケールで反射されて受光される光を基に可動側ガラススケールの目盛を固定側エンコーダヘッドでｎｍ精度で取得する。すなわち、各軸の位置座標を固定側エンコーダヘッドでｎｍ精度で取得できるように構成している。従って、第２顕微鏡２のＸＹＺステージ９ａのステージ座標系分解能と位置精度、すなわち、第２顕微鏡２のＸＹＺステージ９ａの後述する装置座標（ＸＹ座標）５９と装置座標原点５９ｏとがｎｍ精度で繰り返し一致するような、ＸＹ座標５９と装置座標原点５９ｏとを有している。
よって、第１顕微鏡１のＸＹＺステージ８ａの装置座標（ＸＹ座標）５８と装置座標原点５８ｏとに対する試料台６の２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置は、第２顕微鏡２のＸＹＺステージ９ａの装置座標（ＸＹ座標）５９と装置座標原点５９ｏとに対する試料台６の２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置とｎｍ精度で一致させれば、後は、装置座標（ＸＹ座標）５８と装置座標原点５８ｏに対する第１領域抽出窓３７の座標位置と、装置座標（ＸＹ座標）５９と装置座標原点５９ｏに対する第２領域抽出窓３８の座標位置とをｎｍ精度で一致させるように位置制御すれば、同一観察位置を観察することが可能になる。
第１位置決め制御部９ｇは、リニアスケール９ｂの情報を基に、各ステージのモータなどの駆動装置９ｘａ，９ｙａ，９ｚａを駆動制御する。すなわち、第１位置決め制御部９ｇにより、リニアスケール９ｂの情報を基に、Ｘ軸ステージ９ｘとＹ軸ステージ９ｙとＺ軸ステージ９ｚとは、互いに直交するＸ軸とＹ軸とＺ軸とにｎｍ精度例えば１０ｎｍ分解能のサーボ制御にて移動可能としている。
第２位置決め装置９は、試料台６を位置決め保持する第２位置決め部２９を有するとともに、第２位置決め部２９が受渡し位置ＩＩに位置したのち、第２位置決め部２９と搬送装置５の試料台位置決め保持部２５との間で試料台６を受渡しする。第２位置決め装置９の一例としては、第１位置決め装置８と同様なＸＹＺステージである。第２位置決め部２９は、試料台６の受渡しを行う受渡し位置ＩＩの他に、座標位置を取得する第２基準マーク撮像基準位置と、観察を行う単数又は複数の第２観察位置とにそれぞれ移動可能としている。本実施形態では、受渡し位置ＩＩと第２基準マーク撮像基準位置とが第２非観察位置の例である。第２位置決め部２９の第２基準マーク撮像基準位置は、第２位置決め装置９において予め決められており、例えば、座標計算を簡単にするため、第１基準マーク撮像基準位置と同様に、２つの基準点６ｂ，６ｃの中間にＹ軸が位置し、Ｘ軸が試料載置領域６ａを横切るような位置などに決めればよい。
第２位置決め部２９は、図１４及び図１９に示すように、一対の位置決め突起２９ａをＣ字状先端に有するスライド板部材２９ｄと、スライド板部材２９ｄの先端に対向する３枚の屈曲した係止面２９ｃと、試料台６の一対の端部の裏面を支持する一対の支持部２９ｂと、スライド板駆動装置２９ｅと、回転搬送アーム６７による試料台搬入搬出用の開口部２９ｇを有している。スライド板部材２９ｄは、超音波モータやシールド型磁気モータなどのスライド板駆動装置２９ｅにより長手軸方向沿いに退避位置と係合位置との間で進退駆動される。
受渡し位置ＩＩの第２位置決め部２９に対して、試料台６を保持した回転搬送アーム６７の下降により試料台６が搬入されるとき、試料台６の回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向（図１９の左右方向）の一対の端部の裏面は、一対の支持部２９ｂで支持される状態となる。この状態で、回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向（例えば、図１９の左方向に）にスライド板部材２９ｄが退避位置から係合位置に向けて移動すれば、一対の位置決め突起２９ａが、試料台６の片側の一対の（図１９では右側の一対の）切欠部６ｄにそれぞれ係合するとともに、回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向（図１９の左方向に）に試料台６をスライド板部材２９ｄで押すことができる。この押す動作により、試料台６の他方の片側の鍔部６ｈが、屈曲した係止面２９ｃに向かって押し付けられて係止される。３枚の屈曲した係止面２９ｃは、平面的にはスライド板部材２９ｄの中心軸に対して線対称に配置され、等脚台形の上底と一対の斜辺である脚とを構成するように平面的に配置され、かつ、上下方向に対しては、回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向（図１９の左方向に）に向かうに従い下向きに傾斜する傾斜面で構成されている。従って、スライド板部材２９ｄで試料台６を押すと、試料台６の鍔部６ｈが屈曲した係止面２９ｃのうちの中央を除く両側の２枚の係止面２９ｃに押し当てられて、平面的には２枚の係止面２９ｃでセンタリングされることになり、常に一定位置に試料台６が位置決めされる一方、２枚の係止面２９ｃで鍔部６ｈが下向きに押し付けられて、スライド板部材２９ｄでの押圧時に、回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向に対して鍔部６ｈが上向きに跳ね上がるのを防止することができる。
よって、搬送アーム６７から第２位置決め部２９に試料台６を渡すときは、以下のように動作する。
まず、第２位置決め部２９が受渡し位置ＩＩに位置したのち、搬送アーム６７の第１位置決めピン６７ｂで位置決めされつつ支持台部６７ｃで下から支持されている状態の試料台６が、保持枠部６７ａと共に第２位置決め部２９の上方まで回転搬送駆動装置６８により回転移動する。
次いで、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａが試料台６と共に昇降装置６８ｅにより下降して、保持枠部６７ａが開口部２９ｇ内に入り、試料台６の回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向の一対の端部の裏面を、第２位置決め部２９の一対の支持部２９ｂで支持したのち、昇降装置６８ｅによる下降を停止する。
次いで、第２位置決め部２９のスライド板部材２９ｄをスライド板駆動装置２９ｅにより退避位置から係合位置に向けて移動させて、一対の位置決め突起２９ａを回転搬送アーム６７の先端軸方向において片端側の一対の切欠部６ｄに係合させるとともに、スライド板部材２９ｄで試料台６を押す。この結果、回転搬送アーム６７の先端軸方向において他方の片端側の試料台６の鍔部６ｈを係止面２９ｃに向かって押し付けてセンタリングしつつ係止する。この状態で、試料台６は、係止面２９ｃと一対の位置決め突起２９ａとの間で位置決め保持されている。
次いで、昇降装置６８ｅによる搬送アーム６７のさらなる下降により、支持台部６７ｃでの試料台６の支持を解除し、搬送アーム６７の保持枠部６７ａが第２位置決め部２９の開口部２９ｇから離れる方向に回転移動させることにより、試料台６を搬送アーム６７から第２位置決め部２９に渡すことができる。
その後、第２位置決め装置９の駆動により、まず、第２基準マーク撮像基準位置に第２位置決め部２９を位置決めして、第２基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像を第２画像取得部４２で取得したのち、第２位置決め部２９を第２観察位置まで移動させて、第２顕微鏡２で観察を行う。
逆に、第２位置決め部２９から搬送アーム６７に試料台６を受け取るときは、以下のように動作する。
まず、第２位置決め装置９の駆動により、第２位置決め部２９を試料台受渡し位置ＩＩまで移動させたのち、搬送アーム６７の保持枠部６７ａを第２位置決め部２９の下方まで回転移動させる。
次いで、搬送アーム６７の保持枠部６７ａを昇降装置６８ｅで上昇させて開口部２９ｇ内に入り込ませて、支持台部６７ｃにより試料台６を下から支持する。
次いで、第２位置決め部２９のスライド板部材２９ｄをスライド板駆動装置２９ｅにより係合位置から退避位置に向けて移動させて、一対の位置決め突起２９ａを回転搬送アーム６７の先端軸方向において片端側の一対の切欠部６ｄから係合解除させる。
次いで、さらに、試料台６と共に保持枠部６７ａを昇降装置６８ｅで上昇させれば、試料台６を第２位置決め部２９の位置決め保持状態から解除することができる。
次いで、回転搬送駆動装置６８により試料台６と共に搬送アーム６７の保持枠部６７ａを第２位置決め部２９の開口部２９ｇから退避するように搬送アーム６７を回転移動することにより、試料台６を第２位置決め部２９から保持枠部６７ａに受け取ることができる。
なお、搬送アーム６７の保持枠部６７ａの支持台部６７ｃは、試料台６の裏面の回転搬送アーム６７の先端軸方向と交差する方向の前後の端部を支持する一方、第２位置決め部２９の支持部２９ｂは、回転搬送アーム６７の先端軸方向の一対の端部を支持するため、支持台部６７ｃと支持部２９ｂとが当接することなく、試料台６を第２位置決め部２９と保持枠部６７ａとの間で円滑に受渡しすることができる。
第２画像取得部４２は、一例として、第２位置決め部２９に位置決めされた試料台６に対して電子線を走査制御して得られた二次電子等を検出部（不図示）で検出して、Ｉ−Ｖアンプ（不図示）にて電気信号に変え、Ａ・Ｄコンバータ（不図示）で変換して、ＳＥＭ画像を取得する。第２位置決め部２９が第２基準マーク撮像基準位置に位置決めされたとき、及び、第２位置決め部２９が単数又は複数の第２観察位置に位置決めされたとき、第２画像取得部４２は、さらに、取得した試料台６の画像を基に、試料台６の第１領域抽出窓３７に対応する第２領域抽出窓３８の画像をそれぞれ取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。ここで、第２領域抽出窓３８は、第１領域抽出窓３７と同じ大きさで、試料台６に対して第１領域抽出窓３７と同じ位置に位置している。第２位置決め部２９が第２基準マーク撮像基準位置に位置決めされたときには、第２基準マーク撮像基準位置での第２領域抽出窓３８の座標位置を第２画像取得部４２で取得する。
第２座標取得部２２は、第２画像取得部４２で取得した第２基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像から、試料台６の第２試料台座標３２の座標位置を取得する。具体的には、第２座標取得部２２においては、第１座標取得部２１と同様に、第２基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像から、パターンマッチングなどにより、試料台６の２つの基準点６ｂ，６ｃの位置を抽出して、抽出した２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置を求める。ここでの座標位置は、図１９に示すように、第２位置決め装置９の装置座標原点５９ｏに対する装置座標５９の座標位置である。なお、装置座標５９はｘ軸５９ｘ及びｙ軸５９ｙで構成されている。これらの２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置のうち、一方の基準点（例えば、搬入方向先端側の基準点）６ｂの座標位置を第２試料台座標３２の原点位置３２ｏとし、２つの基準点６ｂ，６ｃの座標位置を結ぶ線３２ｘを第２試料台座標３２のｘ軸とする。第２試料台座標３２の原点位置３２ｏを通りかつ第２試料台座標３２のｘ軸３２ｘと直交する軸が、第２試料台座標３２のｙ軸３２ｙとなる。このようにして、原点位置３２ｏとｘ軸３２ｘとｙ軸３２ｙとにより第２試料台座標３２が定義できる。取得した第２試料台座標３２の座標位置などの情報は、記憶部５０に記憶する。
第２抽出窓座標取得部２４は、記憶部５０に記憶されかつ第１座標取得部２１で取得した第１試料台座標３１の座標位置と第２座標取得部２２で取得した第２試料台座標３２の座標位置との差を記憶部５０からそれぞれ取得する。このとき、第１試料台座標３１のｘ軸３１ｘと第２試料台座標３２のｘ軸３２ｘとでなす回転角度θも求めて、第１試料台座標３１に対する第２試料台座標３２の回転角度も、差の一部とする。取得した差を基に、第２試料台座標３２の座標位置を補正して、第１領域抽出窓３７に対応する第２領域抽出窓３８の補正後の座標位置を取得する。取得した情報は、記憶部５０に記憶する。
特徴部記憶部４５は、第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像のうちの観察対象組織３５の複数個の特徴部４４を記憶する。特徴部４４の例としては、ユーザが指定する組織３５の部分的な外形形状、全体的な形状、濃度などが例示できる。抽出した情報は、記憶部５０に記憶する。
画像処理部４６は、特徴部記憶部４５に記憶した複数個の特徴部４４を持つテンプレート３３を作成し、このテンプレート３３に基づき、第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像でパターンマッチングを行う。パターンマッチングでテンプレート３３が第２領域抽出窓３８の画像中の組織３５ｂに一致すると判定されると、その結果情報は、記憶部５０に記憶する。
画像合成部４７は、画像処理部４６でのパターンマッチングの結果を基に、第１領域抽出窓３７の画像のうちの観察対象組織３５と第２領域抽出窓３８の画像中の組織３５ｂとが一致するように、第１領域抽出窓３７の画像と第２領域抽出窓３８の画像とを重ね合わせて合成する。合成した画像情報は、記憶部５０に記憶する。
必要に応じて、動作制御部４９は、合成した画像をモニタ４に表示する。表示された画像は、形状が明瞭でかつ蛍光部分が重ねて合成されて表示されている。この結果、組織の輪郭等の形状の明確な把握と、蛍光部分による組織の機能評価とが同時に行うことができる。
試料７の例としては、以下の試料７を使用することができる。
試料作製 参考例
（試料作製）
ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PB(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した（３時間）。
２）20%シュークロースを含む0.1M PBで洗浄した（４℃、一晩）。
３）ａ．カミソリによる切断、ｂ．ＳＥＭ用凍結割断、ｃ．ビブラトーム切片（１００μｍ厚）などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。
４）0.1M PB洗浄（５分×３回）
５）0.8% fish gelatin、１％ 牛血清アルブミン, 0.2%Triton X-100を含む0.1M PBS(PBSTBF)でブロッキングした（室温、１時間）。
６）抗グリア線維性酸性蛋白Glial fibrillary acidic protein (GFAP)マウスモノクローナル抗体(1: 20,000; Sigma) in PBSTBF（４℃、１４時間）。コントロールはPBSTBFのみでインキュベートした。
７）0.1M PB洗浄（５分×３回）
８）ビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF（室温、９０分）
９）0.1M PB洗浄（５分×３回）
１０）Fluolid-labeled streptavidin in 10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3), 室温, 90分AMCA(7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid)標識ストレプトアビジン(1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, 室温,９０分。
但し、希釈倍率はFluolidの製作過程により変動する。
１１)0.1M PB洗浄（５分×３回）
なお、本参考例及び以下の参考例中、Fluolidとは、国際公開第２００８／０１３２６０号パンフレットに記載された蛍光色素を指す。
参考例３）ｃ．ビブラトーム切片による試料
（試料作製）
ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドin PBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３) Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水 （50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約２μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を３ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチング（真空デバイス社製ＰＩＢ−１０）を用い、ソフトモードで３分、ハードモードで３分を３回で行った。
１１）試料をオスミウムプラズマコーター（真空でバイス社製：HCP1SW）にて２．５ｎｍ厚の金属コーティング行った。
試料台投入装置６９は、開口部６９ｂを挟んで一対の支持部６９ａを有して、試料台６の裏面の一対の端部を支持している。開口部６９ｂには、搬送装置５の搬送アーム５ｂの試料台位置決め保持部２５が挿入可能である。ユーザが、試料７を固定した試料台６を一対の支持部６９ａで、試料台６の４つの切欠き部６ｄを利用しつつ位置決め支持するように、試料台投入装置６９にセットする。
このようにセットされると、一対の支持部６９ａで試料台６の裏面の一対の端部を支持している状態となっており、試料台位置決め保持部２５が開口部６９ｂの下方に移動して、昇降装置５ｄで上昇すると、試料台位置決め保持部２５の保持枠部２５ａの第１位置決めピン２５ｂと第２位置決めピン２５ｄとで位置決めしつつ一対の支持台部２５ｃで、一対の支持部６９ａで支持されていない試料台６の裏面の端部を支持する。さらに、昇降装置５ｄで上昇すると、一対の支持部６９ａでの支持が解除されて、試料台位置決め保持部２５で試料台６が保持されることになる。その後、第１及び第２顕微鏡１，２に対して搬送を開始する。第１及び第２顕微鏡１，２での観察が終了すると、搬送装置５により、試料台投入装置６９に試料台６を戻す。
試料台投入装置６９に試料台６を戻すときは、試料台位置決め保持部２５と共に試料台６が開口部６９ｂの上方に位置したのち、下降する。すると、一対の支持部６９ａで試料台６の裏面の一対の端部が支持されるようになり、さらに下降すると、一対の支持台部２５ｃでの支持が解除されて、試料台位置決め保持部２５から試料台投入装置６９に試料台６を戻すことができる。
以下、前記構成にかかる相関顕微鏡１０の動作について、説明する。なお、ユーザの動作を除く以下の動作は、動作制御部４９で全て動作制御される。
まず、最初に、試料７を両面テープなどで試料台６の試料載置領域６ａに貼り付けた試料台６を、ユーザが試料台投入装置６９にセットする（図２０のステップＳ１参照）。
次いで、ユーザが、第１顕微鏡１と第２顕微鏡２との観察順序に基づく搬送ルートを選択して、入出力装置４８で動作制御部４９に入力する（図２０のステップＳ２参照）。ここでは、搬送ルートは、第１顕微鏡１から第２顕微鏡２に向かう第１搬送ルートと、第２顕微鏡２から第１顕微鏡１に向かう第２搬送ルートとのいずれかを選択する。
次いで、搬送装置５の搬送アーム５ｂの試料台位置決め保持部２５が、試料台投入装置６９から試料台６を取り出して、搬送ルートに基づいて顕微鏡に向かう。ここでは、第１顕微鏡１に最初に搬送すると決定されたと仮定して、第１顕微鏡１に向けて搬送する。
次いで、搬送装置５の搬送アーム５ｂの試料台位置決め保持部２５に保持された試料台６を、第１顕微鏡１の第１位置決め装置８の第１位置決め部２８に受け渡す。このとき、第１位置決め部２８は、受渡し位置Ｉまで予め移動して待機している。第１位置決め部２８の受渡し位置Ｉの上方に搬送装置５の試料台位置決め保持部２５を位置させたのち下降して、搬送装置５の試料台位置決め保持部２５から第１位置決め部２８に試料台６を渡して、試料台６を第１位置決め部２８で位置決め保持する。その後、試料台位置決め保持部２５は第１位置決め装置８から退避する。
次いで、第１位置決め装置８の駆動により、第１位置決め部２８で位置決め保持された試料台６を、まず、受渡し位置Ｉから第１基準マーク撮像基準位置に位置決めしたのち、第１画像取得部４１で第１位置決め部２８に位置決めされた試料台６の画像を取得して、試料台６の試料載置領域６ａに載置された試料７の観察対象組織３５を含む第１領域抽出窓３７の画像を取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。
その後、第１画像取得部４１で取得した試料台６の画像から、試料台６の第１試料台座標３１の座標位置を第１座標取得部２１で取得し、記憶部５０に記憶する。
次いで、ユーザが指定した第１領域抽出窓３７の４個の頂点の位置を基に、第１基準マーク撮像基準位置での試料台６の第１試料台座標３１における試料台６の試料７の第１領域抽出窓３７の４個の頂点の座標位置を第１抽出窓座標取得部２３で取得し、記憶部５０に記憶する。
これらの試料７の第１領域抽出窓３７の頂点の座標位置の取得動作の後に、又は、座標位置の取得動作と同時的に、第１位置決め装置８の駆動により、第１位置決め部２８で位置決め保持された試料台６を、第１基準マーク撮像基準位置から、ユーザが所望する第１観察位置まで移動させたのち、第１顕微鏡１で観察を行う（図２０のステップＳ３参照）。観察時、第１画像取得部４１で第１位置決め部２８に位置決めされた試料台６の画像を取得して、試料台６の試料載置領域６ａに載置された試料７の観察対象組織３５を含む第１領域抽出窓３７の画像を取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。必要に応じて、複数枚の画像取得を行う。異なる第１観察位置毎に、観察及び画像取得を繰り返す。
次いで、第１顕微鏡１での観察終了後、第２顕微鏡２に向けて試料台６の搬送を行う（図２０のステップＳ４及びステップＳ５参照）。すなわち、まず、第１位置決め部２８は、受渡し位置Ｉまで移動して待機する。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台位置決め保持部２５を、第１位置決め部２８の受渡し位置Ｉの下方に位置させたのち上昇させて、第１位置決め部２８の受渡し位置Ｉで、第１位置決め部２８から搬送装置５の試料台位置決め保持部２５に試料台６を渡して、試料台位置決め保持部２５で試料台６を位置決め保持する。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台位置決め保持部２５が第１位置決め装置８から退避する。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａに向かい、ロードロック室６０ａの大気側の第１開閉ドア６４ａを第１開閉装置６４で開けたのち、ロードロック室６０ａ内に入る。
次いで、ロードロック室６０ａ内で、試料台６を支持している試料台位置決め保持部２５を受渡し位置ＩＩＩに位置させたのち、搬送部材６１を退避位置から受渡し位置ＩＩＩに移動させる。その後、試料台位置決め保持部２５を下降させて、試料台位置決め保持部２５から搬送部材６１に試料台６を渡す。その後、試料台位置決め保持部２５をロードロック室６０ａ内から退避させる。
次いで、ロードロック室６０ａの大気側の第１開閉ドア６４ａを第１開閉装置６４で閉じたのち、真空吸引装置６３を駆動してロードロック室６０ａ内を真空にする。
次いで、ロードロック室６０ａの真空側の第２開閉ドア６５ａを開けて、第２顕微鏡２の真空室２ａ内から回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａ内に入り込んで受渡し位置ＩＩＩに位置したのち、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａが上昇して、受渡し位置ＩＩＩの搬送部材６１から回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａに試料台６を渡す。
次いで、搬送部材６１が退避位置に移動し、試料台６を支持した回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａから取り出されたのち、真空側の第２開閉ドア６５ａを閉じる。
次いで、第２顕微鏡２の真空室２ａ内で、試料台６を支持した回転搬送アーム６７が回転して、その保持枠部６７ａが第２位置決め装置９の第２位置決め部２９に向かう。
次いで、回転搬送アーム６７に支持された試料台６を、第２顕微鏡２の第２位置決め装置９の第２位置決め部２９に受け渡す。このとき、第２位置決め部２９は、受渡し位置ＩＩまで予め移動して待機している。第２位置決め部２９の受渡し位置ＩＩの上方に回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａを位置させたのち下降して開口部２９ｇ内に入り、保持枠部６７ａから第２位置決め部２９に試料台６を渡して、試料台６を第２位置決め部２９で位置決め保持する。その後、保持枠部６７ａは第２位置決め装置９から退避する。
次いで、第２位置決め装置９の駆動により、第２位置決め部２９で位置決め保持された試料台６を、まず、受渡し位置ＩＩから第２基準マーク撮像基準位置に位置決めしたのち、第２画像取得部４２で第２位置決め部２９に位置決めされた試料台６の画像を取得して、試料台６の試料載置領域６ａに載置された試料７の観察対象組織３５を含む第２領域抽出窓３８の画像を取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。
その後、第２画像取得部４２で取得した第２基準マーク撮像基準位置での試料台６の画像から、試料台６の第２試料台座標３２の座標位置を第２座標取得部２２で取得し、記憶部５０に記憶する。
次いで、第１顕微鏡１のＸＹＺステージ８ａの装置座標（ＸＹ座標）５８と装置座標原点５８ｏと、第２顕微鏡２のＸＹＺステージ９ａの装置座標（ＸＹ座標）５９と装置座標原点５９ｏとが同じであると仮定し、第２抽出窓座標取得部２４は、記憶部５０に記憶されかつ第１座標取得部２１で取得した第１試料台座標３１の座標位置と第２座標取得部２２で取得した第２試料台座標３２の座標位置との差を記憶部５０からそれぞれ取得する。このとき、第１試料台座標３１のｘ軸３１ｘと第２試料台座標３２のｘ軸３２ｘとでなす回転角度θも求める。この結果、取得した差として、第１試料台座標３１の座標位置と第２試料台座標３２の座標位置との差、及び、第１試料台座標３１に対する第２試料台座標３２の回転角度を基に、第２試料台座標３２の座標位置を補正して、第１領域抽出窓３７に対応する第２領域抽出窓３８の座標を第２抽出窓座標取得部２４で取得し、記憶部５０に記憶する。前記差に関する情報も、記憶部５０に記憶する。
記憶部５０に記憶された情報を基に、第２位置決め装置９の第２位置決め制御部９ｇの駆動制御により、第２位置決め部２９で位置決め保持された試料台６を、第２基準マーク撮像基準位置から、第１位置決め装置８の装置座標５８に対する第１領域抽出窓３７とほぼ同じ位置に、第２位置決め装置９の装置座標５９に対して第２領域抽出窓３８が位置するように、ｎｍ精度で位置制御する。この位置制御動作により、第１顕微鏡１で観察した第１観察位置に非常に近い位置まで第２領域抽出窓３８が自動的に移動することになる。従って、ユーザは、容易に、第１顕微鏡１で観察した第１観察位置と同一位置又は第１顕微鏡１で観察した第１観察位置のｎｍオーダで非常に近い位置の第２観察位置で、第２顕微鏡２による観察を行うことができる（図２０のステップＳ３参照）。観察時、第２画像取得部４２で第２位置決め部２９に位置決めされた試料台６の画像を取得して、試料台６の試料載置領域６ａに載置された試料７の観察対象組織３５を含む第２領域抽出窓３８の画像を取得する。取得した画像は、記憶部５０に記憶する。必要に応じて、複数枚の画像取得を行う。異なる第２観察位置毎に、観察及び画像取得を繰り返す。
次いで、第２顕微鏡２での観察終了後、試料台投入装置６９に向けて試料台６の搬送を行う（図２０のステップＳ４及びステップＳ６参照）。すなわち、まず、第２位置決め部２９は、受渡し位置ＩＩまで移動して待機する。
次いで、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａが開口部２９ｇ内に入ったのち上昇して、第２位置決め部２９から保持枠部６７ａに試料台６を渡す。その後、回転搬送アーム６７が回転して、その保持枠部６７ａがロードロック室６０ａに向かう。
次いで、ロードロック室６０ａの真空側の第２開閉ドア６５ａを開けたのち、保持枠部６７ａが受渡し位置ＩＩＩに位置したのち、搬送部材６１が退避位置から受渡し位置ＩＩＩに位置して、試料台６を支持する。
次いで、回転搬送アーム６７の保持枠部６７ａがロードロック室６０ａから取り出されたのち、真空側の第２開閉ドア６５ａを閉じる。
次いで、ロードロック室６０ａの真空を開放して大気圧としたのち、ロードロック室６０ａの大気側の第１開閉ドア６４ａを第１開閉装置６４で開ける。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａ内に入って受渡し位置ＩＩＩに位置したのち、受渡し位置ＩＩＩに位置した搬送部材６１から試料台位置決め保持部２５に試料台６を渡す。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台６を支持した試料台位置決め保持部２５がロードロック室６０ａ内から取り出されたのち、第１開閉ドア６４ａを第１開閉装置６４で閉める。
次いで、搬送装置５の駆動により、試料台６を支持した試料台位置決め保持部２５が試料台投入装置６９に移動して、試料台６を試料台投入装置６９に支持させる。
これで、相関顕微鏡１０の一連の動作が終了する。
前記観察の結果として取得した画像については、以下のように処理を行う。この処理は、前記動作と同時的に行うことも可能である。
まず、第１位置決め部２８が第１観察位置に位置したときに第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像のうちの観察対象組織３５の複数個の特徴部４４を特徴部記憶部４５に記憶する。一例として、具体的には、観察対象組織３５の特徴的な部分的な外形形状、全体的な形状、又は、濃度などをユーザが入出力装置４８を利用して複数個指定することにより、複数個の特徴部４４を特徴部記憶部４５に記憶することができる。
次いで、画像処理部４６は、特徴部記憶部４５に記憶した複数個の特徴部４４を持つテンプレート３３を作成する（図１３参照）。このテンプレート３３に基づき、第２位置決め部２９が第２観察位置に位置したときに第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像でパターンマッチングを行って、複数個の特徴部４４を持つ組織３５ｂを探し出す。パターンマッチングでテンプレート３３が第２領域抽出窓３８の画像中の組織３５ｂに一致すると判定されると、その結果情報は、記憶部５０に記憶する。もし、一致しない判定されたときは、特徴部４４の個数又は特徴部４４自体を再検討して、パターンマッチングを行い、第２領域抽出窓３８の画像中の組織３５ｂに一致するとの判定を取得する。
次いで、画像処理部４６でのパターンマッチングの一致判定結果と、第１座標取得部２１で取得した第１試料台座標３１の座標位置と、第２抽出窓座標取得部２４で取得した第２領域抽出窓３８の補正後の座標位置とを基に、画像合成部４７により、第１領域抽出窓３７の画像のうちの観察対象組織３５と第２領域抽出窓３８の画像中の組織３５ｂとが一致するように、第１領域抽出窓３７の画像と第２領域抽出窓３８の画像とを重ね合わせて合成する。合成した画像情報は、記憶部５０に記憶する。
次いで、モニタ４に合成した画像を表示する。
試料７の第１例として、図２１に、合成前後の画像を示す。図２１の（ａ）は、第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像であって、蛍光顕微鏡で取得した画像である。（ｂ）は、第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像であって、電子顕微鏡で取得した画像である。（ｃ）は（ａ）の画像と（ｂ）の画像とを合成した合成画像である。（ａ）の蛍光顕微鏡で取得した画像のうち、白い部分は、蛍光色素で標識された生体組織の部分である。（ｂ）の電子顕微鏡で取得した画像では、組織の輪郭が明確に把握できる。これらを合成した（ｃ）の合成画像では、輪郭が明確に把握できる組織において、蛍光部分を明確に把握することができる。
また、試料７の第２例として、図２２に、腎臓の尿細管の組織の合成前後の画像を示す。図２２の（ａ）は、第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像であって、蛍光顕微鏡で取得した画像である。（ｂ）は、第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像であって、電子顕微鏡で取得した画像である。（ｃ）は（ａ）の画像と（ｂ）の画像とを合成した合成画像である。（ａ）の蛍光顕微鏡で取得した画像のうち、白い部分は、蛍光色素で標識された生体組織の部分である。特に、太くて短い白の矢印で示した部分は、蛍光色素で標識された生体組織（腎臓の尿細管内の刷子縁）の部分である。細くて長い白の矢印部分は、各図で同一の組織を示す。（ｂ）の電子顕微鏡で取得した画像では、組織の輪郭が明確に把握できる。これらを合成した（ｃ）の合成画像では、輪郭が明確に把握できる組織において、蛍光部分を明確に把握することができる。
また、試料７の第３例として、図２３に、人工繊維とゲルとの合成前後の画像を示す。図２３の（ａ）は、第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像であって、蛍光顕微鏡で取得した画像である。（ｂ）は、第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像であって、電子顕微鏡で取得した画像である。（ｃ）は（ａ）の画像と（ｂ）の画像とを合成した合成画像である。（ａ）の蛍光顕微鏡で取得した画像のうち、白い部分は、水で大きくなるゲルを示しているが、人工繊維が映っていないため、人工繊維との関係が不明瞭である。（ｂ）の電子顕微鏡で取得した画像では、人工繊維は明確に把握できるが、水で大きくなるゲルは全く把握できない。（ｃ）の合成画像では、人工繊維と水で大きくなるゲルとの両方が明確に把握でき、人工繊維に対して、どの部分に水で大きくなるゲルが存在するかがわかる。特に、白の矢印で示した部分は、水で大きくなるゲルである。（ｂ）では、同じ場所を白の矢印で示しても、全くわからない状態である。
また、試料７の第４例として、図２４に、マウスの尾骨の組織の合成前後の画像を示す。図２４の（ａ）は、第１画像取得部４１で取得された第１領域抽出窓３７の画像であって、蛍光顕微鏡で取得した画像である。（ｂ）は、第２画像取得部４２で取得された第２領域抽出窓３８の画像であって、電子顕微鏡で取得した画像である。（ｃ）は（ａ）の画像と（ｂ）の画像とを合成した合成画像である。（ａ）の蛍光顕微鏡で取得した画像のうち、白の矢印で示した白い部分は、蛍光色素で標識された生体組織の部分である。（ｂ）の電子顕微鏡で取得した画像では、組織の輪郭が明確に把握できるが、蛍光色素で標識された生体組織は全くわからない。これらを合成した（ｃ）の合成画像では、輪郭が明確に把握できる組織において、蛍光部分を明確に把握することができる。（ｄ）は拡大前の電子顕微鏡で取得した画像である。
前記実施形態によれば、２つの顕微鏡１，２にそれぞれ位置決めされたときの同一の試料台６の画像及び試料７の観察対象組織３５を含む第１領域抽出窓３７と第１試料台座標３１と第２試料台座標３２と第２領域抽出窓３８の座標とをそれぞれ取得し、第１試料台座標３１と第２試料台座標３２との差を基に第２試料台座標３２を補正して、第２領域抽出窓３８の補正後の座標位置を取得し、補正後の座標位置を基に、第２位置決め装置９は、第２位置決め部２９を、第２非観察位置から、第１領域抽出窓３７の座標位置に対応する位置に第２領域抽出窓３８が位置している第２観察位置に移動させる。この結果、高い精度で同一位置での観察を行うことができる。
また、第１領域抽出窓画像に対応する第２領域抽出窓画像に対してパターンマッチングを行い、第１領域抽出窓画像と第２領域抽出窓画像とを重ね合わせた合成画像を生成することができる。この結果、高い精度で同一位置での合成画像を取得して観察することができる。
すなわち、前記実施形態によれば、以下の優れた効果を奏することができる。
蛍光標識された試料７について光学顕微鏡で例えば数百倍程度の観察倍率で観察を行うことにより、機能情報が得られ、さらに所望の試料領域について走査型電子顕微鏡を用いてさらに高倍率の観察を行うことにより、形態情報が得られる。これらの情報を両方含んだ正確に合成した画像を生成することができる。この結果、完全同一の組織（細胞、器官、細胞又は器官の一部など）において、形態と機能とを明確に特定することができる。すなわち、高い精度（すなわち、ｎｍ精度）で同一位置での観察が行える相関顕微鏡を提供することができる。
一般に、試料７中には、多数の類似する細胞があり、かつ、それらの細胞には、観察対象組織の一例である細胞３５と、変形により酷似する細胞３５ｈ（図１３参照）とを含むことが多い。例えば、観察対象の細胞は、観察する度に異なり、観察対象の１つの細胞３５と類似する細胞３５ｈが、数千個も含まれる場合がある。また、生体組織ゆえ、観察途中で変形してしまい、観察対象では無かった細胞が、観察対象の細胞と酷似するように変形する場合もある。よって、試料７の全体の画像において、単にパターンマッチングを行うだけでは、間違った数千個の細胞を抽出してしまうこともある。
また、図２５に示すように、２つの位置決め装置間の座標の位置合わせの精度が悪い場合には、（ａ）の蛍光顕微鏡で見たときの画像エリアと、（ｂ）の電子顕微鏡で見たときの画像エリアとは、全く異なる位置となってしまい、試料７のどの位置を観察しているか不明となってしまう。これに対して、本実施形態では、２つの位置決め装置８，９間の座標の位置合わせの精度が非常に良い場合には、（ａ）の蛍光顕微鏡で見たときの画像エリアと、（ｂ）の電子顕微鏡で見たときの画像エリアとはナノオーダレベルで一致し、同一の観察が行える。
すなわち、前記実施形態では、座標同士の位置関係をサブミクロンオーダで正確に位置合わせすることができる上に、試料７の全体の画像ではなく、試料７中に予め設定した小さな抽出窓３７，３８内での観察対象組織３５を指定し、その指定した組織３５から複数の特徴部４４を抽出し、抽出した複数の特徴部４４を基に、抽出窓３７，３８内でパターンマッチングを行うことにより、間違って数千個の細胞を抽出するような課題を解消している。
さらに、このように精度良く抽出作業を行うことにより、一つの細胞の内外の蛍光状態すなわち機能情報を把握できるような合成画像が取得でき、細胞の内外での例えば試薬の効果の違い等を明確に把握することができる（図２２参照）。
これに対して、従来は、組織等の同一位置での比較を行うことができず、互いに類似している細胞から電子顕微鏡用の試料と、光学顕微鏡用の試料とをそれぞれ別箇に用意して、それぞれ観察したのち、両者の観察結果を比較検討していた。これでは、それぞれの試料を用意するのが煩雑であり、かつ、１００％同一の細胞又は細胞の部分ではないので、確実性に欠けるとの指摘があった。
本実施形態は、これらの課題を全て解決できる優れた効果を有するものである。
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、その他種々の態様で実施できる。
例えば、図１及び図２に一点鎖線で示すように、相関顕微鏡１０の全てをクリーンルームの暗室５５内に配置するようにしてもよい。モニタ４以外の相関顕微鏡１０の全体をクリーンルームの暗室５５内に配置するとともに、試料台投入装置６９へ試料台６をセットするための開閉ドア５５ａを設けるようにしてもよい。このように構成すれば、その暗室５５から一度も一般環境に暴露することなく、試料台搬送を実現することができる。
また、試料台６は、９０度毎に周囲の四隅に湾曲した切欠部６ｄ，…，６ｄを有しているが、これに限られるものではない。例えば、試料台６は、３か所又は５カ所以上に切欠部６ｄを有していてもよい。
また、本実施形態では、受渡し位置Ｉと第１基準マーク撮像基準位置とが第１位置決め部２８の第１非観察位置の例であるとともに、受渡し位置ＩＩと第２基準マーク撮像基準位置とが第２位置決め部２９の第２非観察位置の例としているが、これに限られるものではなく、受渡し位置Ｉと第１基準マーク撮像基準位置とを一つの位置とし、当該位置を第１位置決め部２８の第１非観察位置の例とするとともに、受渡し位置ＩＩと第２基準マーク撮像基準位置とを一つの位置とし、当該位置を第２位置決め部２９の第２非観察位置の例とするようにしてもよい。
また、試料台は、１つの部材で構成されるものに限らず、前記実施形態の変形例として、以下のような複数の部材で構成してもよい。すなわち、図２７Ａ〜図２７Ｃは、それぞれ、前記実施形態の変形例にかかる相関顕微鏡の試料台６Ｄの平面図、正面図、及び、斜視図である。図２７Ｄは、試料台６Ｄの試料台枠体６Ｂに挿入可能な標準試料台の一例としての試料載置台６Ｃの斜視図である。図２７Ｅは、試料台６Ｄの試料台枠体６Ｂに試料載置台６Ｃが挿入された状態での斜視図である。なお、試料台枠体６Ｂの底面図は、図５Ｂの相関顕微鏡の試料台６の底面図と同じであるため、図示を省略する。
試料台６Ｄは、試料台枠体６Ｂと、試料載置台６Ｃとで構成している。
試料台枠体６Ｂは、切欠部６ｄと切欠６ｅと鍔部６ｈとなどの外形形状は図５Ａの試料台６と同様であるが、試料載置領域に、大略円筒状の側壁６Ｂｄで囲まれた、有底の円形凹部６Ｂａを有している点が異なっている。
試料載置台６Ｃは、試料台枠体６Ｂの円形凹部６Ｂａに着脱可能に挿入される円柱体であって、その上面に、試料７として生体組織を載置する円形の試料載置領域６ａを有している。試料載置領域６ａには、観察対象組織３５を含む生体試料７を両面接着テープなどにより固定することができる。試料載置領域６ａの高さは、側壁６Ｂｄの高さと同じか、側壁６Ｂｄよりも少し高くなっている。
側壁６Ｂｄには、一カ所、貫通したネジ穴６Ｂｇを有して、このネジ穴６Ｂｇにネジ６Ｂｈをねじ込み可能としている。よって、円形凹部６Ｂａに試料載置台６Ｃを挿入したのち、ネジ６Ｂｈをねじ込んで試料載置台６Ｃを係止することにより、試料載置台６Ｃを円形凹部６Ｂａ内に固定するようにしている。
なお、側壁６Ｂｄには、側壁６Ｂｄの上端面から下向きに延びた１個又は複数個の切欠きを形成して、切欠き内にピンセットなどを挿入可能として、円形凹部６Ｂａに対して試料載置台６Ｃを着脱しやすくするようにしてもよい。
このように試料台６Ｄを、標準試料台の一例としての試料載置台６Ｃと、試料台枠体６Ｂとの複数の部材で構成することにより、汎用されている標準試料台を使用することができ、汎用性に富んだものとすることができる。よって、複数の試料を観察するときに、複数の特別な試料台６を予め用意するのではなく、標準試料台の一例としての試料載置台６Ｃのみを複数個用意して、試料台枠体６Ｂに対して試料載置台６Ｃのみを交換すればよく、より利便性の高いものとすることができる。
この結果、ユーザは、先の実施形態にかかる専用の試料台６と、標準試料台を使用可能な変形例にかかる試料台６Ｄとのいずれかを１つを選択して、相関顕微鏡に使用することができる。
なお、前記様々な実施形態又は変形例のうちの任意の実施形態又は変形例を適宜組み合わせることにより、それぞれの有する効果を奏するようにすることができる。また、実施形態同士の組み合わせ又は実施例同士の組み合わせ又は実施形態と実施例との組み合わせが可能であると共に、異なる実施形態又は実施例の中の特徴同士の組み合わせも可能である。
本発明にかかる相関顕微鏡は、共焦点レーザ顕微鏡と走査型電子顕微鏡との両方で高い精度で同一位置で観察を行うことができ、蛍光試薬などの開発において使用される相関顕微鏡等として有用である。
１ レーザ顕微鏡
２ 電子顕微鏡
２ａ 真空室
３ 免振台
４ モニタ
５ 搬送装置
５ａ 回転装置
５ｂ 搬送アーム
５ｃ 進退装置
５ｄ 昇降装置
６ 試料台
６Ｂ 試料台枠体
６Ｂａ 円形凹部
６Ｂｄ 側壁
６Ｂｇ ネジ穴
６Ｂｈ ネジ
６C 試料載置台
６D 試料台
６ａ 試料載置領域
６ｂ，６ｃ ２つの基準点(円形凹部)
６ｄ 切欠部
６ｅ 位置決め切欠
６ｆ 位置決め凹部
６ｈ 鍔部（上向き傾斜防止用）
７ 試料
８ 第１位置決め装置
８ａ ＸＹＺステージ
８ｂ リニアスケール
８ｇ 第１位置決め制御部
９ 第２位置決め装置
９ａ ＸＹＺステージ
９ｂ リニアスケール
９ｇ 第２位置決め制御部
１０ 相関顕微鏡
１１ 制御部
２１ 第１座標取得部
２２ 第２座標取得部
２３ 第１抽出窓座標取得部
２４ 第２抽出窓座標取得部
２５ 試料台位置決め保持部
２５ａ 保持枠部
２５ｂ 第１位置決めピン
２５ｃ 支持台部
２５ｄ 第２位置決めピン
２８ 第１位置決め部
２８ａ 位置決め突起
２８ｂ，２８ｃ 支持部
２８ｄ ロック部
２８ｅ レバー
２８ｆ 支持軸
２８ｇ 開口部
２８ｈ ロック部駆動装置
２９ 第２位置決め部
２９ａ 位置決め突起
２９ｂ 支持部
２９ｃ 係止面
２９ｄ スライド板部材
２９ｅ スライド板駆動装置
２９ｇ 開口部
３１ 第１試料台座標
３１ｏ 第１試料台座標の原点位置
３１ｘ 第１試料台座標のｘ軸
３１ｙ 第１試料台座標のｙ軸
３２ 第２試料台座標
３２ｏ 第２試料台座標の原点位置
３２ｘ 第２試料台座標のｘ軸
３２ｙ 第２試料台座標のｙ軸
３３ テンプレート
３５ 試料の観察対象組織
３５ａ 第２領域抽出窓内での観察対象組織
３７ 第１領域抽出窓
３８ 第２領域抽出窓
４１ 第１画像取得部
４２ 第２画像取得部
４４ 特徴部
４５ 特徴部記憶部
４６ 画像処理部
４７ 画像合成部
４８ 入出力装置
４９ 動作制御部
５０ 記憶部
５５ 暗室
５５ａ 開閉ドア
５８ 第１位置決め装置の装置座標
５８ｏ 装置座標原点
５８ｘ 装置座標のｘ軸
５８ｙ 装置座標のｙ軸
５９ 第２位置決め装置の装置座標
５９ｏ 装置座標原点
５９ｘ 装置座標のｘ軸
５９ｙ 装置座標のｙ軸
６０ ロードロック室ユニット
６０ａ ロードロック室
６１ 搬送部材
６１ａ 二股部
６１ｂ 第１位置決めピン
６２ 搬送部材駆動装置
６３ 真空吸引装置
６４ 第１開閉装置
６４ａ 第１開閉ドア
６５ 第２開閉装置
６５ａ 第２開閉ドア
６６ 回転搬送装置
６７ 回転搬送アーム
６７ａ 保持枠部
６７ｂ 第１位置決めピン
６７ｃ 支持台部
６８ 回転搬送駆動装置
６８ａ モータ
６８ｂ ウォーム
６８ｃ ギア
６８ｄ 回転軸
６８ｅ 昇降装置
６９ 試料台投入装置
６９ａ 支持部
６９ｂ 開口部
７０ 抽出窓設定部

Claims (6)

  1. 第１顕微鏡（２，１）と、
    前記第１顕微鏡とは光軸が非同軸で配置された第２顕微鏡（１，２）と、
    試料（７）が保持された試料台（６）を試料台位置決め保持部（２５）に位置決め保持した状態で前記第１顕微鏡から前記第２顕微鏡へ前記試料台を搬送する搬送装置（５）と、
    前記第１顕微鏡に配置されて、少なくとも第１観察位置と第１非観察位置との間で移動可能でかつ前記試料台を位置決め保持する第１位置決め部（２８）を有するとともに、前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１位置決め部と前記搬送装置の前記試料台位置決め保持部との間で前記試料台を受渡しする第１位置決め装置（８）と、
    前記第１位置決め部が前記第１観察位置及び前記第１非観察位置にそれぞれ位置したとき、前記第１位置決め部に位置決めされた前記試料台の画像を取得して、前記試料台の前記試料の観察対象組織（３５）を含む第１領域抽出窓（３７）の画像を取得する第１画像取得部（４１）と、
    前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得した画像を基に、前記第１位置決め部に位置決めされた前記試料台の第１試料台座標（３１）の座標位置を取得する第１座標取得部（２１）と、
    前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得した前記第１領域抽出窓の画像と前記第１座標取得部で取得した前記試料台の前記第１試料台座標の座標位置とに基づいて、前記第１試料台座標における前記第１領域抽出窓の座標位置を取得する第１抽出窓座標取得部（２３）と、
    前記第２顕微鏡に配置されて、少なくとも第２観察位置と第２非観察位置との間で移動可能でかつ前記試料台を位置決め保持する第２位置決め部（２９）を有するとともに、前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２位置決め部と前記搬送装置の前記試料台位置決め保持部との間で前記試料台を受渡しする第２位置決め装置（９）と、
    前記第２位置決め部が前記第２観察位置及び前記第２非観察位置にそれぞれ位置したとき、前記第２位置決め部に位置決めされた前記試料台の画像を取得して、前記試料台の前記第１領域抽出窓に対応する第２領域抽出窓（３８）の画像を取得する第２画像取得部（４２）と、
    前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得した画像を基に、前記第２位置決め部に位置決めされた前記試料台の第２試料台座標（３２）の座標位置を取得する第２座標取得部（２２）と、
    前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得した前記第２領域抽出窓の画像と前記第２座標取得部で取得した前記試料台の前記第２試料台座標の座標位置とに基づいて、前記第２試料台座標における前記第２領域抽出窓の座標位置を取得するとともに、前記第１座標取得部で取得した前記第１試料台座標の前記座標位置と前記第２座標取得部で取得した前記第２試料台座標の前記座標位置との差を取得して、取得した差を基に、前記第２試料台座標の前記座標位置を補正して、前記第１領域抽出窓に対応する前記第２領域抽出窓の補正後の座標位置を取得する第２抽出窓座標取得部（２４）とを備えて、
    前記第２位置決め装置は、前記第２抽出窓座標取得部で取得した前記第２領域抽出窓の補正後の座標位置に基づいて、前記第２位置決め部を、前記第２非観察位置から、前記第１領域抽出窓の前記座標位置に対応する位置に前記第２領域抽出窓が位置している前記第２観察位置に移動させるとともに、
    前記第１顕微鏡と前記第２顕微鏡とは、いずれか一方の顕微鏡が光学顕微鏡であり、他方の顕微鏡が電子顕微鏡である、相関顕微鏡。
  2. 前記第１位置決め部が前記第１観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得された前記第１領域抽出窓の画像から抽出された前記観察対象組織（３５）の複数個の特徴部（４４）に基づき、前記第１位置決め部が前記第１観察位置に位置したときに前記第１画像取得部で取得された前記第１領域抽出窓の前記画像と前記第２位置決め部が前記第２観察位置に位置したときに前記第２画像取得部で取得された前記第２領域抽出窓の画像とのパターンマッチングを行う画像処理部（４６）と、
    前記画像処理部での前記パターンマッチングの結果と、前記第１座標取得部で取得した前記第１試料台座標の座標位置と、前記第２抽出窓座標取得部で取得した第２領域抽出窓の前記補正後の座標位置とを基に、前記第１領域抽出窓の画像と前記第２領域抽出窓の画像とを重ね合わせる画像合成部（４７）とをさらに備える、
    請求項１に記載の相関顕微鏡。
  3. 前記試料の前記観察対象組織（３５）を含む前記第１領域抽出窓（３７）を設定する抽出窓設定部（７０）を有する、
    請求項１又は２に記載の相関顕微鏡。
  4. 前記試料台は、前記試料として生体組織を載置する試料載置領域（６ａ）と、前記試料載置領域以外の領域に配置された２つの基準点（６ｂ，６ｃ）とを有し、
    前記第１座標取得部は、前記第１位置決め部が前記第１非観察位置に位置するときの前記試料台の前記第１試料台座標の前記座標位置として、前記第１位置決め装置の装置座標原点に対する前記試料台の前記２つの基準点のそれぞれの座標位置を取得し、
    前記第２座標取得部は、前記第２位置決め部が前記第２非観察位置に位置するときの前記試料台の前記第２試料台座標の前記座標位置として、前記第２位置決め装置の装置座標原点に対する前記試料台の前記２つの基準点のそれぞれの座標位置を取得するとともに、前記第１座標取得部で取得した前記２つの基準点のそれぞれの座標位置を結ぶ線と、前記第２座標取得部で取得した前記２つの基準点のそれぞれの座標位置を結ぶ線とでなす角度も、前記第１試料台座標に対する前記第２試料台座標の回転角度として取得して、
    前記第１座標取得部で取得した前記第１試料台座標の前記座標位置と第２座標取得部で取得した前記第２試料台座標の前記座標位置との前記差として、前記第１座標取得部で取得した前記２つの基準点のそれぞれの座標位置と前記第２座標取得部で取得した前記２つの基準点のそれぞれの座標位置との差と、前記回転角度とを基に、前記第２試料台座標の前記座標位置を補正して、前記第１領域抽出窓に対応する前記第２領域抽出窓の補正後の座標位置を取得する、
    請求項１〜３のいずれか１つに記載の相関顕微鏡。
  5. 前記第１位置決め装置及び前記第２位置決め装置は、それぞれ、ＸＹＺステージであり、
    各ＸＹＺステージは、Ｘ軸ステージ（８ｘ，９ｘ）とＹ軸ステージ（８ｙ，９ｙ）とＺ軸ステージ（８ｚ，９ｚ）との各軸にｎｍ精度で位置検出可能なリニアスケール（８ｂ，９ｂ）が配置されているとともに、
    前記第２位置決め部を前記第２観察位置に位置させるとき、前記第２位置決め装置は、前記第２抽出窓座標取得部で取得した前記第２領域抽出窓の前記補正後の座標位置に前記第２領域抽出窓が位置するように位置制御する、
    請求項１〜４のいずれか１つに記載の相関顕微鏡。
  6. 前記試料台は、
    前記試料載置領域に凹部（６Ｂａ）を有する試料台枠体（６Ｂ）と、
    前記試料台枠体の前記凹部に着脱可能に挿入され、前記試料載置領域を上面に有する試料載置台（６Ｃ）とで構成される、
    請求項４に記載の相関顕微鏡。
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