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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Bilderzeugung und ein System hierfür. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Abbildung einer Probe mittels zweier mikroskopischer Bildgebungsverfahren, wobei für zumindest eines der Bildgebungsverfahren ein hochauflösendes Mikroskop, wie beispielsweise ein Elektronenmikroskop, verwendet wird.
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Stand der Technik
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In diesem Zusammenhang ist beispielsweise die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM = „Correlative Light-Electron Microscopy“) bekannt, bei der eine Probe zunächst mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht wird, um potentiell interessierende Bereiche der Probe erkennen und markieren zu können. Die Probe wird anschließend in ein Elektronenmikroskop verbracht, in dem die markierten Bereiche der Probe mit einer vielfach erhöhten Auflösung im Nanometerbereich abgebildet werden. Da die elektronenmikroskopische Untersuchung im Vakuum stattfindet, muss die Probe vakuumstabil sein. Außerdem muss in der Regel die Probe mit einer sehr dünnen Edelmetallschicht (beispielsweise Platin) versehen und/oder mit Kohlenstoff bedampft werden. Biologische Proben werden häufig cyro-fixiert. Hierbei wird die Probe beispielsweise in flüssigem Ethan bei unter -135° C schockgefroren. Dabei kristallisiert das Wasser nicht aus, sondern bildet sogenanntes vitrifiziertes (glasartiges) Eis. Da die Probe für die jeweiligen Bildgebungsverfahren in der Regel von einem ersten Mikroskop (beispielsweise Fluoreszenzmikroskop) in ein zweites Mikroskop (beispielsweise Elektronenmikroskop) verbracht werden muss, ist darauf zu achten, dass sich die Probe bei dem Transferprozess möglichst nicht verändert. Bei bereits cryo-fixierten Proben ist sicherzustellen, dass auch der Probentransfer unter kryogenen Bedingungen stattfindet. Bei der CLEM-Methode wird das erste mittels des Lichtmikroskops (beispielsweise Fluoreszenzmikroskop) gewonnene Bild der Probe mit dem zweiten durch das zweite Mikroskop (Elektronenmikroskop) gewonnene Bild überlagert. Dabei werden sogenannte Stützpunkte in dem ersten Bild mit den korrespondierenden Stützpunkten im zweiten Bild durch Skalierungsprozesse zur Deckung gebracht, sodass beide Bilder maßstabsgerecht übereinander gelagert betrachtet werden können.
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Besonders nachteilig wirkt sich bei dieser CLEM-Methode die sequentielle Beobachtung aus. Wegen der hohen Vergrößerung mit solchen Mikroskopen und den damit verbundenen gewaltigen Dimensionen des Nanokosmos und den in der Praxis meist begrenzten Betriebszeiten muss sich der Benutzer bei der Auswahl der zu visualisierenden Areale beschränken. Im ersten Mikroskop (beispielsweise Fluoreszenzmikroskop) werden Areale der Probe gesucht und eingehend visualisiert, an denen zu erwarten ist, dass sich nach Bildgebung durch das zweite Mikroskop (beispielsweise Elektronenmikroskop) neue Zusammenhänge erschließen lassen. Für die Auswahl der Areale muss folglich eine auf Erfahrung beruhende mehr oder weniger zutreffende Vermutung getroffen werden. Zum Teil stellen sich aber die ausgewählten Areale im zweiten Mikroskop als uninteressant heraus. Auf der anderen Seite können Zusammenhänge unentdeckt bleiben, die in Arealen liegen, die aufgrund der Bildgebung im ersten Mikroskop als uninteressant eingestuft wurden. Ein weiterer Nachteil ist neben dem bereits angesprochenen Probentransfer auch der hiermit verbundene Zeitaufwand für den Benutzer, der zwei Mal hintereinander dieselben Areale betrachten muss. Schließlich muss die Probe für die Rahmenbedingungen beider Mikroskope resistent sein, wodurch sich häufig Einschränkungen bei der Art der Proben ergeben. Der bereits angesprochene Transfer der Probe zwischen den beiden Mikroskopen ist aufwändig und zudem mit der Gefahr von Beschädigungen verbunden.
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Aus dem Stand der Technik sind auch integrierte CLEM-Systeme, siehe bspw. Liv, N., Zonnevylle, A. C., Narvaez, A. C., Effting, A. P., Voorneveld, P. W., Lucas, M. S., Hardwick, J. C., Wepf, R. A., Kruit, P., Hoogenboom, J. P. (2013) „Simultaneous correlative scanning electron and high-NA fluorescence microscopy“, PloS one, 8(2), e55707, bekannt, bei denen unter Raumtemperatur eine Probe gleichzeitig mit Hilfe eines Elektronenstrahls als auch mit Hilfe eines optischen Lichtstrahls mikroskopisch abgebildet wird. Hierzu weisen beide Mikroskope eine gemeinsame Probenkammer auf. Der Aufwand des Probentransfers und die damit verbundenen Gefahren der Beschädigung und/oder der Veränderung der Probe sind in einem solchen System beseitigt. Allerdings muss die Probenkammer derart gestaltet sein, dass die Bedürfnisse der beiden vereinten Mikroskope erfüllt sind. Dabei müssen technische Kompromisse eingegangen werden, die die Möglichkeiten der einzelnen High-End Mikroskope deutlich unterschreiten. Da eine nachträgliche Integration zweier solcher Mikroskope nicht möglich ist, muss der Benutzer bzw. das Labor ein neues Kombigerät kaufen. Wiederum muss die Probe resistent sein für die Rahmenbedingungen der vereinten Mikroskope. Folglich bleiben auch bei einem integrierten CLEM-System Nachteile bestehen.
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Aus der
EP 0799434 B1 ist ein Verfahren zum Überlagern eines mikroskopischen Bildes mit einem weiteren Bild unter Verwendung einer adaptiven Regeleinrichtung bekannt.
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Gemäß der
DE 112010005353 T5 wird eine optische Abbildungsvorrichtung in die Vakuum-Probenkammer eines Elektronenmikroskops integriert.
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Insgesamt besteht der Bedarf nach höherer Flexibilität, sei es hinsichtlich der eingesetzten mikroskopischen Bildgebungsverfahren, sei es hinsichtlich der zu untersuchenden Proben. Hierbei soll der Vorteil einer simultanen insbesondere auch Live-Betrachtung der Bildinformationen zweier Mikroskope erhalten bleiben, da durch das gleichzeitige Sehen aller Informationen sich auf einfache und zeitsparende Weise neue Zusammenhänge entdecken lassen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die genannte Aufgabe wird durch ein Verfahren sowie ein System gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
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Offenbarung der Erfindung
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Dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Abbildung mindestens eines Teils einer Probe mittels zweier mikroskopischer Bildgebungsverfahren liegt der Gedanke zugrunde, eine Oberfläche der Probe mittels eines ersten mikroskopischen Bildgebungsverfahrens abzubilden und für ein zweites mikroskopisches Bildgebungsverfahren eine Replik dieser Oberfläche der Probe zu verwenden, sodass die mikroskopische Untersuchung dieser Replik räumlich unabhängig und getrennt von der mikroskopischen Untersuchung der Oberfläche der Probe erfolgen kann. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß zunächst eine Replik der zu untersuchenden Probenoberfläche hergestellt. Anschließend wird diese Replik mittels eines zweiten mikroskopischen Bildgebungsverfahrens abgebildet, wobei das erste und das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren simultan erfolgen. Sodann werden die beiden durch das erste und das zweite Bildgebungsverfahren erzeugten Abbildungen via Datentransfer zusammengeführt und maßstabsgetreu überlagert.
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Der Betrachter der Abbildungen kann einen solchen insbesondere live und simultan mit zwei Mikroskopen beobachteten Ausschnitt der Probe durch zum Beispiel Verschieben oder Vergrößern frei wählen. Im Rahmen der Erfindung kann aber auch auf die Live-Beobachtung verzichtet werden, um damit auch zeitlich unabhängige mikroskopische Untersuchungen zu ermöglichen.
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Prinzipiell kommen für das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren sämtliche bekannte lichtmikroskopische oder elektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren in Frage. Für das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren kommen prinzipiell wieder sämtliche bekannte licht- oder elektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren in Frage, wobei insbesondere ein anderes Bildgebungsverfahren als das erste zum Einsatz kommen sollte, um einen entsprechenden Informationsgewinn zu verzeichnen. Bei Einsatz zweier gleicher mikroskopischer Bildgebungsverfahren können diese ihre Performance vergleichen. Eines der beiden insbesondere nicht gleichen mikroskopischen Bildgebungsverfahren sollte insbesondere höher auflösend sein als das andere. Im Besonderen kommt für das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren, das die Replik untersucht, vorliegend ein elektronenmikroskopisches Bildgebungsverfahren, insbesondere unter Verwendung eines Transmissions-Elektronenmikroskops (TEM), zum Einsatz, wie im Einzelnen weiter unten erläutert.
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Es sei auch betont, dass mehr als zwei mikroskopische Bildgebungsverfahren bei der Erfindung zum Einsatz kommen können. So können auch weitere Bildgebungsverfahren zur Abbildung der Probe und/oder der Replik eingesetzt werden, um bspw. genauere oder zusätzliche Informationen über die Oberflächen zu erhalten. Der Begriff „mikroskopische Bildgebungsverfahren“ umfasst im Rahmen dieser Anmeldung auch bildverarbeitende oder bildoptimierende Methoden, die ggf. noch auf die mikroskopischen Rohbilder angewendet werden. Hier könnten ggf. auch Informationen aus weiteren mikroskopischen Verfahren miteinfließen, bspw. aus einer Kombination aus verschiedenen mikroskopischen Verfahren. Der Begriff „mikroskopisches Bildgebungsverfahren“ soll also ganz allgemein als Kombination eines oder mehrerer mikroskopischer Bildgebungsverfahren mit ggf. bildverarbeitenden Methoden und potentiell auch noch weiteren Zusatzinformationen verstanden werden.
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Außerdem müssen im Rahmen der Erfindung die durch die jeweiligen mikroskopischen Bildgebungsverfahren erzeugten Abbildungen nicht identische Oberflächenbereiche abbilden, sondern können auch unterschiedliche, aber überlappende Oberflächenbereiche abbilden, die dann zumindest im Bereich der Überlappung erfindungsgemäß überlagert werden.
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Anstelle eines Elektronenmikroskops oder zusätzlich zu diesem können im Rahmen dieser Anmeldung auch eines oder mehrere anderer hochauflösenden (licht-)mikroskopischen Verfahren, wie STED (Stimulated Emission Depletion)-, GSD (Ground State Depletion)- oder RESOLFT (Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions)-Mikroskopie, zum Einsatz kommen.
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Die Replik der Oberfläche der Probe wird zweckmäßigerweise aus einer zu dieser Oberfläche der Probe komplementären Probenoberfläche hergestellt. Eine solche komplementäre Probenoberfläche lässt sich beispielsweise aus einem Abdruck (oder einem gleichwertigen Verfahren) der Oberfläche der Probe gewinnen. Andererseits kann die Oberfläche der Probe auch Punkt für Punkt vermessen bzw. abgerastert werden, um beispielsweise mittels eines additiven Fertigungsverfahrens eine Replik bzw. ein Duplikat dieser Oberfläche der Probe zu erhalten. Eine weitere, in vorliegender Anmeldung besonders bevorzugte Art zur Herstellung sowohl der Oberfläche der Probe als auch der Replik der Oberfläche der Probe ist die des Brechens. Bei dem Brechen eines Objekts in zwei Objektteile entstehen entlang der Bruchstelle zwei zueinander komplementäre Oberflächen. Eine dieser beiden Oberflächen bildet im vorliegenden Fall die abzubildende Oberfläche der Probe; die zu dieser Oberfläche komplementäre Probenoberfläche kann mit Vorteil zur Herstellung der Replik der Oberfläche der Probe verwendet werden und wird dabei zum Ablösen der Replik im Normalfall samt Probe in Säure aufgelöst.
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In der
US 4 967 825 A sind Verfahren zur Herstellung hochauflösender Repliken für die Elektronenmikroskopie beschrieben.
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Das hier beschriebene Brechen des Objekts wird insbesondere in einer an sich bekannten Gefrierbruchmaschine vorgenommen. In dieser Maschine wird ein Objekt an einer interessierenden Stelle entlang einer Bruchlinie unter kryogenen Bedingungen in zwei Teile gebrochen. Typische Temperaturen betragen hierbei zwischen -100°C bis -200°C, vorzugsweise im Bereich von -130°C bis -150°C. Durch Beschichtung der komplementären Probenoberfläche kann auf einfache Weise eine Replik der Oberfläche der Probe gewonnen werden. Hierbei wird die komplementäre Probenoberfläche mit einem Edelmetall, insbesondere Platin, beschichtet. Typische Schichtdicken betragen etwa 2nm. Zum Schutz kann zusätzlich eine Kohlenstoff-Schicht aufgetragen werden (typische Schichtdicke etwa 20nm). Derart hergestellte Repliken lassen sich in bekannter Weise transmissions-elektronenmikroskopisch untersuchen und abbilden. Zur Kontrasterhöhung ist es hierbei beispielsweise bekannt, die Beschichtung durch schräges Bedampfen aufzubringen. Die transmissions-elektronenmikroskopische Abbildung kann bei Raumtemperatur erfolgen. Insbesondere kann diese zweite mikroskopische Bildgebung räumlich getrennt von (aber im Datentransfer verbunden mit) der ersten mikroskopischen Bildgebung erfolgen, sodass hier größtmögliche Flexibilität gegeben ist. Als Proben eignen sich alle Proben, deren abzubildende Oberfläche für die Herstellung einer Replik geeignet ist. Insofern ist auch bezüglich der Auswahl der Proben eine hohe Flexibilität gewährleistet.
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Wie bereits erwähnt, ist es vorteilhaft, als das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren ein lichtmikroskopisches, insbesondere fluoreszenzmikroskopisches Bildgebungsverfahren oder ein elektronenmikroskopisches, insbesondere rasterelektronenmikroskopisches Bildgebungsverfahren einzusetzen. Die abzubildende Oberfläche der Probe wird gleichartig beschichtet wie die für das zweite Bildgebungsverfahren, unterschiedlich beschichtet oder nicht beschichtet, je nach den für dieses erste Bildgebungsverfahren optimierten Prozessparametern.
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Zur Herstellung der Replik durch Brechen eines Objekts in zwei Teile muss die Probe bzw. das Objekt spröde sein. Wenn ein Objekt bei Raumtemperatur spröde genug ist, zu brechen, ist ein Kryo-Bruch nicht notwendig und eine mikroskopische Untersuchung bei Raumtemperatur möglich. Bei wasser- bzw. eislosen Proben kann man bspw. auch kryogen brechen und bei Raumtemperatur mikroskopisch untersuchen. Bei wasser- oder eishaltigen Proben wird die nötige Sprödigkeit in der Regel nur unter kryogenen Bedingungen erreicht, und die Probe wird dann in der Regel auch unter kryogenen Bedingungen mikroskopisch angeschaut.
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Beispielsweise ist es zweckmäßig, eine vitrifizierte Probe bzw. die Oberfläche dieser Probe nach Einfärbung fluoreszenzmikroskopisch zu untersuchen und abzubilden. Parallel wird die Replik dieser Oberfläche, wie oben ausführlich erläutert, hergestellt und anschließend vorzugsweise transmissions-elektronenmikroskopisch untersucht und abgebildet. Diese beiden in ihrem Informationsgehalt unterschiedlichen Abbildungen werden maßstabsgetreu überlagert und können einem Benutzer auf einem Bildschirm beispielsweise als Live-Bild dargeboten werden. Hierbei wird vorzugsweise über den jeweils (live) betrachteten Ausschnitt der fluoreszenzmikroskopisch abgebildeten Probenoberfläche der entsprechende Ausschnitt der transmissions-elektronenmikroskopischen Abbildung gelegt. Auf diese Weise kann ein Betrachter simultan die Informationsgehalte beider Abbildungen beurteilen bzw. bewerten, ohne dass dies zeitlich hintereinander erfolgen müsste.
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Wird beispielsweise das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren bei Raumtemperatur, das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren hingegen bei Tieftemperaturen bzw. kryogenen Temperaturen vorgenommen, ist es zweckmäßig, die aufgrund der Temperaturunterschiede erfolgte Größenänderung über Dehnung einer der beiden Abbildungen vor deren Überlagerung zu kompensieren. Andererseits ist es auch möglich, die maßstabsgetreue Überlagerung der beiden Abbildungen mittels des bekannten Ansatzes der eingangs erläuterten CLEM-Methode auszuführen.
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Bei der transmissions-elektronenmikroskopischen Abbildung der Replik kann eine Spiegelung der Replik, also die Abbildung der gewendeten Seite der Replik, sinnvoll sein, um eine Abbildung zu erhalten, die der ursprünglichen Oberfläche der Probe, wie sie durch das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren abgebildet ist, besser entspricht.
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Die Erfindung betrifft außerdem ein System zur Abbildung zumindest eines Teils einer Probe mittels zweier mikroskopischer Bildgebungsverfahren, wobei dieses System aufweist: ein erstes Mikroskop eingerichtet zur Erzeugung einer ersten Abbildung einer Oberfläche der Probe durch ein erstes mikroskopisches Bildgebungsverfahren, wobei das System zur Herstellung einer Replik der durch das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren abzubildenden Oberfläche der Probe eingerichtet ist; ein zweites Mikroskop eingerichtet zur Erzeugung einer zweiten Abbildung der Replik der Oberfläche der Probe durch ein zweites mikroskopisches Bildgebungsverfahren, wobei das System so eingerichtet ist, dass das erste und das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren simultan, also zeitgleich, erfolgen, und ein Bildüberlagerungssystem eingerichtet zur maßstabsgetreuen Überlagerung der beiden durch das erste und das zweite mikroskopische Bildgebungsverfahren erzeugten Abbildungen. Insbesondere ist das erfindungsgemäße System zur Durchführung des oben ausführlich geschilderten erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet.
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Elemente und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Systems und seiner Komponenten ergeben sich aus der obigen Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens in völlig analoger Weise. Um Wiederholungen zu vermeiden, werden im Folgenden lediglich die wesentlichen Komponenten sowie etwaige optionale Komponenten eines solchen Systems näher erläutert.
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Es ist vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße System eine Bruchmaschine, insbesondere eine Gefrierbruchmaschine, umfasst, die zum Brechen eines Objektes eingerichtet ist. Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße System eine Beschichtungseinrichtung umfasst.
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Mittels einer Bruchmaschine kann, wie bereits oben erläutert, ein Objekt in zwei Objektteile gebrochen werden. Hierdurch entstehen zwei einander gegenüberliegende, durch einen Brechspalt voneinander getrennte Oberflächen. Die erste dieser Oberflächen entspricht dann der durch das erste mikroskopische Bildgebungsverfahren abzubildenden Oberfläche der Probe. Die zweite Oberfläche stellt eine zu der ersten Oberfläche komplementäre Probenoberfläche dar. Letztere kann mittels einer Beschichtungseinrichtung zur Herstellung einer Replik der abzubildenden Oberfläche der Probe, wie bereits oben ausführlich erläutert, eingesetzt werden. Bei der Herstellung der Replik geht in der Regel die zweite Oberfläche bzw. das zweite Objektteil verloren.
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Prinzipiell können das erste und das zweite Mikroskop gleichen oder unterschiedlichen Typs sein. Bevorzugt ist das zweite Mikroskop von einem anderen Typ und höherauflösend als das erste. Es ist vorteilhaft, wenn das erste Mikroskop des erfindungsgemäßen Systems als Lichtmikroskop, insbesondere als Fluoreszenzmikroskop, oder als Elektronenmikroskop, insbesondere als Rasterelektronenmikroskop, ausgebildet ist. Auf die oben genannten anderen Bildgebungsverfahren sei hier nochmals verwiesen.
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Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn das zweite Mikroskop des erfindungsgemäßen Systems als Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM), insbesondere als Raumtemperatur-Transmissions-Elektronenmikroskop, ausgebildet ist.
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Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen Systems, wie oben erläutert, zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.
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Figurenliste
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- 1 zeigt in schematischer Darstellung ein Verfahren und ein System gemäß Erfindung zur mikroskopischen Bilderzeugung zumindest eines Teils einer Probe.
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Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel weist das System zur Abbildung zumindest eines Teils einer Probe mittels zweier mikroskopischer Bildgebungsverfahren ein erstes Mikroskop 100, hier ein Fluoreszenzmikroskop, sowie ein zweites Mikroskop 200, hier ein Raumtemperatur-Transmissions-Elektronenmikroskop auf. Weiterhin umfasst das System ein Bildüberlagerungssystem 500. Eine Gefrierbruchmaschine als weitere optionale Komponente des Systems ist mit 300 bezeichnet. Eine Beschichtungseinrichtung 400 kann in der Gefrierbruchmaschine 300 integriert oder getrennt von dieser ausgebildet sein. Die einzelnen Komponenten des in 1 schematisch dargestellten Systems sind jeweils an sich aus dem Stand der Technik bekannt und sollen daher im Folgenden nicht detailliert beschrieben werden.
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Das Verfahren zur Abbildung zumindest eines Teiles einer Probe mittels zweier mikroskopischer Bildgebungsverfahren, hier folglich einem fluoreszenzmikroskopischen und einem transmissions-elektronenmikroskopischen Bildgebungsverfahren, soll im Folgenden näher erläutert werden. Zunächst wird ein Objekt (hier nicht als Ganzes dargestellt) in die Gefrierbruchmaschine 300 eingebracht, wodurch die tiefgefrorene Probe bei Temperaturen im Bereich von -150°C bis -130°C auseinandergebrochen wird, sodass ein erstes Objektteil 10 und ein zweites Objektteil 20 entstehen. Beide Objektteile 10 und 20 besitzen zueinander komplementäre Oberflächen. Die beiden Objektteile 10 und 20 werden üblicherweise von getrennten nebeneinanderliegenden Minihaltern (nicht dargestellt) gehalten. Die im Folgenden mittels des ersten mikroskopischen Bildgebungsverfahrens abzubildende Oberfläche der Probe ist mit 11 bezeichnet. Die hierzu komplementäre Probenoberfläche ist mit 21 bezeichnet.
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In einem zweiten Schritt wird zumindest die komplementäre Probenoberfläche 21 beschichtet. Die entsprechende Beschichtungseinrichtung 400 ist in der Regel in der Gefrierbruchmaschine 300 integriert. Unter kryogenen Bedingungen wird die komplementäre Probenoberfläche 21 beispielsweise mit Platin mit einer geringen Schichtdicke von etwa 2nm beschichtet. Zum Schutz kann zusätzlich eine dünne Kohlenstoff-Schicht aufgetragen werden. Die Beschichtung ist mit 23 in 1 bezeichnet. Die Oberfläche der Probe 11 des ersten Objektteils 10 kann je nach den für dieses erste Bildgebungsverfahren optimierten Prozessparametern gleichartig beschichtet (Beschichtungseinrichtung 400) oder nach Abdeckung der jeweils anderen Probenoberfläche unterschiedlich beschichtet oder aber gar nicht beschichtet werden (wie in 1 dargestellt). In letzterem Fall wird die Oberfläche 11 beispielsweise eingefärbt, um Strukturen in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar machen zu können. Im Rasterelektronenmikroskop hingegen erweisen sich meist dünne (z.B. 2nm Pt) Metallschichten als günstig für das Bildgebungsverfahren, um Aufladung zu vermeiden und den Kontrast zu erhöhen.
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In einem dritten Schritt werden die beiden Objektteile 10 und 20 voneinander getrennt. Der erste Objektteil 10 wird beispielsweise unter Beibehaltung der Kryobedingungen aus der Gefrierbruchmaschine 300 ausgeschleust und in ein kryogenes erstes Mikroskop, hier ein Fluoreszenzmikroskop 100 eingeschleust. Der andere, zweite Objektteil 20 wird ebenfalls aus der Gefrierbruchmaschine 300 ausgeschleust und der Replikherstellung zur Verfügung gestellt. Der zweite Objektteil 20 selbst wird bei der Replikherstellung üblicherweise aufgelöst. Die Replik 25 wird in ein Raumtemperatur-Transmissionselektronenmikroskop 200 eingeschleust und kann daraufhin wie gewohnt in diesem zweiten Mikroskop 200 betrachtet werden. Die Replik 25 wird dabei von einer Seite her durchleuchtet und gibt mit höchster Genauigkeit die gespiegelte oder nicht gespiegelte Oberfläche 11 des ersten Objektteils 10 wieder (gleichzeitig die nicht gespiegelte oder gespiegelte Oberfläche 21 des zweiten Objektteils 20), je nach dem, von welcher Seite her die Replik 25 durchleuchtet wird.
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In einem vierten Schritt erfolgt die Visualisierung der Oberfläche 11 der Probe, indem die Daten beider simultan erzeugten Abbildungen, also der ersten Abbildung durch das erste Mikroskop 100 und der zweiten Abbildung durch das zweite Mikroskop 200, zusammengeführt und die Abbildungen softwaregestützt, insbesondere live auf einem Monitor maßstabsgerecht, das heißt proportional richtig, übereinander gelegt und angezeigt werden. Die entsprechende Bildverarbeitung erfolgt in einem Bildüberlagerungssystem 500. Prinzipiell ist die maßstabsgerechte Überlagerung zweier mikroskopischer Abbildungen beispielsweise aus der Technologie der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) bekannt. Diese Technologie kann auch vorliegend eingesetzt werden. Optional können durch die unterschiedlichen thermischen Ausdehnungen entstehende Dimensionsänderungen auch gesondert durch eine entsprechende Skalierung (in Form einer Dehnung oder Dilatation bzw. einer Kontraktion) kompensiert werden. Bei Bedarf, je nach dem, von welcher Seite her die Replik 25 durchleuchtet wird, kommt auch eine softwareunterstützte Spiegelung der Replik 25 zum Einsatz, um damit die Oberfläche 11 abbilden zu können.
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Das oben geschilderte Verfahren und System haben den großen Vorteil, dass, obwohl das Bild ein und derselben Oberfläche 11 der Probe abgebildet wird, beide mikroskopische Bildgebungsverfahren voneinander unabhängig durchlaufen werden, sodass auch räumlich voneinander getrennte Mikroskope zum Einsatz kommen können. Besonders bevorzugt ist die Erfassung von Livebildern durch das Fluoreszenzmikroskop 100 oder allgemeiner durch das erste Mikroskop 100, denen die hochauflösenden proportional richtigen TEM-Bilder überlagert werden. Für das Verfahren und das System können unterschiedlichste Proben bzw. Objekte verwendet werden, solange es möglich ist, von der abzubildenden Oberfläche der Probe eine Replik herzustellen. Im Übrigen muss die Probe nur resistent für die Untersuchungsbedingungen des ersten Mikroskops 100 sein. Im Gegensatz zur bekannten CLEM-Technologie kann das vorliegende Verfahren und System auch die Abbildungen zweier Elektronenmikroskope miteinander korrelieren. Ein aufwendiger Probentransfer entfällt.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- erstes Objektteil, Probe
- 11
- Oberfläche der Probe
- 20
- zweites Objektteil
- 21
- komplementäre Probenoberfläche
- 23
- Beschichtung
- 25
- Replik
- 100
- erstes Mikroskop
- 200
- zweites Mikroskop
- 300
- Gefrierbruchmaschine
- 400
- Beschichtungseinrichtung
- 500
- Bildüberlagerungssystem