JP2017061527A - ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤およびｍＴＯＲ阻害剤の組み合わせ - Google Patents
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Abstract
【課題】哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯ0Ｒ）依存性疾患、特に、癌の治療に有用な新規組み合わせ薬剤の提供。【解決手段】ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）に代表される、式（Ａ）で表される２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体と、ｂ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物。前記ｍＴＯＲ阻害剤としては、エベロリムス（ＲＡＤ００１）等のラパマイシン系化合物が好ましい。【選択図】なし
Description
本発明は、２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体であるホスファチジルイノシト
ール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩および少な
くとも１つの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤または薬学的に許容
されるその塩を含む薬学的組み合わせ、そのような組み合わせを含む医薬組成物ならびに
増殖性疾患、より具体的には、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ
依存性疾患の治療へのそのような組み合わせの使用に関する。
ール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩および少な
くとも１つの哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤または薬学的に許容
されるその塩を含む薬学的組み合わせ、そのような組み合わせを含む医薬組成物ならびに
増殖性疾患、より具体的には、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ
依存性疾患の治療へのそのような組み合わせの使用に関する。
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の阻害が、癌細胞においてＡＫＴ活性
化をもたらす上流のインスリン様増殖因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）シグナル伝達を
誘導する可能性があることが示されてきた。この現象がｍＴＯＲ阻害に対する細胞応答の
減衰に関与すると示唆され、それが、ｍＴＯＲ阻害剤の臨床活性を弱める場合もある。例
えば、進行性腫瘍を患う患者の第Ｉ相臨床試験において全患者の腫瘍のおよそ５０％にお
いてｐＡＫＴの増加が見られた（Tabernoら、Journal of Clinical Oncology、26（2008
年）、1603〜1610ページ）。
化をもたらす上流のインスリン様増殖因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）シグナル伝達を
誘導する可能性があることが示されてきた。この現象がｍＴＯＲ阻害に対する細胞応答の
減衰に関与すると示唆され、それが、ｍＴＯＲ阻害剤の臨床活性を弱める場合もある。例
えば、進行性腫瘍を患う患者の第Ｉ相臨床試験において全患者の腫瘍のおよそ５０％にお
いてｐＡＫＴの増加が見られた（Tabernoら、Journal of Clinical Oncology、26（2008
年）、1603〜1610ページ）。
増殖性疾患患者に対して数々の治療選択肢があるにもかかわらず、有効で安全な治療用
薬剤の必要性およびそれらの併用療法への優先的な使用の必要性が未だに存在している。
本明細書中に記載されるとおりであり、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−
アミド１−（４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−
エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル）−アミドなどの式（Ａ）の化
合物は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のアルファアイソフォー
ムの高度選択的阻害剤である。驚くべきことに、有効量の少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害
剤との有効量の式（Ａ）のアルファ−特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物の組み合わせが哺乳類ラ
パマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性疾患、特に、癌の治療に予想外の相乗的改
善をもたらすことがわかった。同時に、順次または単独で投与されると、このアルファ−
特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物と本発明のｍＴＯＲ阻害剤とが相互に作用して細胞増殖を強力
に阻害する。この有益な相互作用により、各化合物の必要とされる用量が低減でき、副作
用の緩和および治療における化合物の長期的な臨床効果の向上につながる。
薬剤の必要性およびそれらの併用療法への優先的な使用の必要性が未だに存在している。
本明細書中に記載されるとおりであり、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−
アミド１−（４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−
エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル）−アミドなどの式（Ａ）の化
合物は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のアルファアイソフォー
ムの高度選択的阻害剤である。驚くべきことに、有効量の少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害
剤との有効量の式（Ａ）のアルファ−特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物の組み合わせが哺乳類ラ
パマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性疾患、特に、癌の治療に予想外の相乗的改
善をもたらすことがわかった。同時に、順次または単独で投与されると、このアルファ−
特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物と本発明のｍＴＯＲ阻害剤とが相互に作用して細胞増殖を強力
に阻害する。この有益な相互作用により、各化合物の必要とされる用量が低減でき、副作
用の緩和および治療における化合物の長期的な臨床効果の向上につながる。
本発明によると、式（Ａ）のアルファ−アイソフォーム特異的ホスファチジルイノシト
ール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩は、ｍＴＯＲ
阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を低減または阻止することがわかった。した
がって、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも
１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせに関する
。
ール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害化合物または薬学的に許容されるその塩は、ｍＴＯＲ
阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を低減または阻止することがわかった。した
がって、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも
１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせに関する
。
好適な実施形態において、本発明の式（Ａ）の化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２
−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ
−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミ
ド）（「化合物Ｉ」又は「化合物１」）である。
−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ
−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミ
ド）（「化合物Ｉ」又は「化合物１」）である。
好適な実施形態において、本発明のｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤラパマイシン（シロリム
ス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタ
ロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナロ
グ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−０
０６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０
８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ
−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１になどのその誘導体／類似体から選
択される。
ス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタ
ロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナロ
グ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−０
０６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０
８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ
−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１になどのその誘導体／類似体から選
択される。
一態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用する
ための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴ
ＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
ための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴ
ＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する。
別の態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防のための
薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なく
とも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なく
とも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩およ
び少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによ
ってｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
び少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによ
ってｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナー
ゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物と
、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロ
リムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイ
シン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６
９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３
８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、Ｘ
Ｌ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１な
どのその誘導体／類似体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との
組み合わせを提供し、ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に
許容される塩の形態で存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含
む。
ゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物と
、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロ
リムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイ
シン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６
９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３
８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、Ｘ
Ｌ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１な
どのその誘導体／類似体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との
組み合わせを提供し、ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に
許容される塩の形態で存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含
む。
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそ
れを必要とする温血動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン
酸化および活性化を低減または阻止するための方法を提供する。
れを必要とする温血動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン
酸化および活性化を低減または阻止するための方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容
されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つの
ｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリ
ン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治療する方法を提供する。
されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つの
ｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリ
ン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治療する方法を提供する。
さらに別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的
に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも
１つのｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つように
なったか、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐
性は、例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも
１つのｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つように
なったか、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐
性は、例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩およ
び少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせを
それを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤
または薬学的に許容されるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法
を提供する。
び少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせを
それを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤
または薬学的に許容されるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法
を提供する。
一態様において、本発明は、式（Ａ）のＰＩ３Ｋ阻害化合物または薬学的に許容される
その塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む医
薬組成物を提供する。
その塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む医
薬組成物を提供する。
本発明は、（ａ）本明細書中で定義されるとおりの式（Ａ）の化合物または薬学的に許
容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容される
その塩を含む薬学的組み合わせに関する。
容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容される
その塩を含む薬学的組み合わせに関する。
別に指定がない限り、以下の一般的定義を本明細書では適用する。
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と
いう用語は、本明細書中では、別に記載がない限り、制約のない、非限定的な意味で使用
される。
いう用語は、本明細書中では、別に記載がない限り、制約のない、非限定的な意味で使用
される。
「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の表示は、本発明を説
明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書中で別
に指示がある場合または文脈から明らかに矛盾している場合を除いて、単数および複数の
両方を対照として含むものと解釈されるべきである。化合物、塩および同種のものに対し
て複数形が使用される場合、１つの化合物、塩または同種のものも意味することになる。
明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）は、本明細書中で別
に指示がある場合または文脈から明らかに矛盾している場合を除いて、単数および複数の
両方を対照として含むものと解釈されるべきである。化合物、塩および同種のものに対し
て複数形が使用される場合、１つの化合物、塩または同種のものも意味することになる。
「組み合わせ」は、固定の組み合わせの１単位剤形または併用投与用の要素のキットの
いずれかを指し、キットの場合、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナー（例えば
、以下に説明されるとおりの別の薬物、「組み合わせパートナー」または「治療用薬剤」
としても言及される）は、独立に同時にまたは、特に、組み合わせパートナーが、協同的
な、例えば、相乗効果を示す時間間隔で単独で投与されてもよい。
いずれかを指し、キットの場合、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナー（例えば
、以下に説明されるとおりの別の薬物、「組み合わせパートナー」または「治療用薬剤」
としても言及される）は、独立に同時にまたは、特に、組み合わせパートナーが、協同的
な、例えば、相乗効果を示す時間間隔で単独で投与されてもよい。
本明細書中で使用される場合、「薬学的組み合わせ」とは、２つ以上の活性成分を混合
または組み合わせることにより得られ、固定および非固定の両方の活性成分の組み合わせ
を含む製品を意味する。「固定の組み合わせ」または「固定用量」という用語は、活性成
分、例えば、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の要素または投
薬の形態で患者に同時に投与されることを意味する。「非固定の組み合わせ」という用語
は、活性成分、例えば、式（Ｉ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が個別の要
素として、ともに同時にまたは特定の時間制限なく順次、患者に投与されることを意味し
、そのような投与により、治療有効レベルの２つの化合物がそれを必要とする温血動物の
体にもたらされる。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用
する。
または組み合わせることにより得られ、固定および非固定の両方の活性成分の組み合わせ
を含む製品を意味する。「固定の組み合わせ」または「固定用量」という用語は、活性成
分、例えば、式（Ａ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が単一の要素または投
薬の形態で患者に同時に投与されることを意味する。「非固定の組み合わせ」という用語
は、活性成分、例えば、式（Ｉ）の化合物および組み合わせパートナーの両方が個別の要
素として、ともに同時にまたは特定の時間制限なく順次、患者に投与されることを意味し
、そのような投与により、治療有効レベルの２つの化合物がそれを必要とする温血動物の
体にもたらされる。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用
する。
「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」という用語は、本明細書中では、
ＰＩ３−キナーゼを標的とする、低下させるか、または阻害する化合物を指すものと定義
される。ＰＩ３−キナーゼ活性は、インスリン、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖
因子、上皮増殖因子、コロニー刺激因子および肝細胞増殖因子などのいくつかのホルモン
ならびに増殖因子の刺激に応じて増すことが示されてきており、細胞増殖およびトランス
フォーメーションに関連する過程に関わってきた。
ＰＩ３−キナーゼを標的とする、低下させるか、または阻害する化合物を指すものと定義
される。ＰＩ３−キナーゼ活性は、インスリン、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖
因子、上皮増殖因子、コロニー刺激因子および肝細胞増殖因子などのいくつかのホルモン
ならびに増殖因子の刺激に応じて増すことが示されてきており、細胞増殖およびトランス
フォーメーションに関連する過程に関わってきた。
「医薬組成物」という用語は、本明細書中では、温血動物を冒す特定の疾患もしくは状
態を予防もしくは治療するために温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトに投与される
、少なくとも１つの活性成分または治療用薬剤を含む組み合わせあるいは溶液を指すもの
と定義される。
態を予防もしくは治療するために温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトに投与される
、少なくとも１つの活性成分または治療用薬剤を含む組み合わせあるいは溶液を指すもの
と定義される。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書中では、適切な医学的判断の範囲内で
、過度の毒性、刺激症状アレルギー反応およびその他の問題となる障害がなく、適度に利
益／リスクの割合が釣り合った、温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトの組織との接
触に適した化合物、材料、組成物および／または剤形を指すものと定義される。
、過度の毒性、刺激症状アレルギー反応およびその他の問題となる障害がなく、適度に利
益／リスクの割合が釣り合った、温血動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトの組織との接
触に適した化合物、材料、組成物および／または剤形を指すものと定義される。
「治療有効量」という語句は、本明細書中では、必要とする温血動物の活性、機能およ
び反応における臨床的に重篤な欠陥を少なくとも約１５パーセント、好ましくは、少なく
とも５０パーセント、より好ましくは、少なくとも９０パーセント低減するのに十分な量
、最も好ましくは、それを予防するのに十分な量の意味で使用される。あるいは、治療有
効量とは、それを必要とする温血動物の臨床的に重篤な状態／症状を改善させるのに十分
な量である。
び反応における臨床的に重篤な欠陥を少なくとも約１５パーセント、好ましくは、少なく
とも５０パーセント、より好ましくは、少なくとも９０パーセント低減するのに十分な量
、最も好ましくは、それを予防するのに十分な量の意味で使用される。あるいは、治療有
効量とは、それを必要とする温血動物の臨床的に重篤な状態／症状を改善させるのに十分
な量である。
本明細書中で使用される場合、「治療すること」または「治療」という用語は、対象の
少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは緩和するか、または疾患の進行の遅延をもた
らす治療を含む。例えば、治療は、癌などの障害の１つもしくはいくつかの症状の減少ま
たは障害の完全な根絶であってもよい。本発明の意図において、「治療する」という用語
は、発症（すなわち、疾患の臨床病態より前の期間）を阻止する、遅延させるかつ／また
は疾患を起こすリスクまたは悪化させるリスクを低減することも指す。「保護する」とい
う用語は、本明細書中では、対象の疾患の発症もしくは継続もしくは悪化を予防する遅延
させるもしくは治療する、または適切な場合はそれらすべての意味で使用される。
少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは緩和するか、または疾患の進行の遅延をもた
らす治療を含む。例えば、治療は、癌などの障害の１つもしくはいくつかの症状の減少ま
たは障害の完全な根絶であってもよい。本発明の意図において、「治療する」という用語
は、発症（すなわち、疾患の臨床病態より前の期間）を阻止する、遅延させるかつ／また
は疾患を起こすリスクまたは悪化させるリスクを低減することも指す。「保護する」とい
う用語は、本明細書中では、対象の疾患の発症もしくは継続もしくは悪化を予防する遅延
させるもしくは治療する、または適切な場合はそれらすべての意味で使用される。
本明細書中で使用される場合、「予防する」、「予防すること」または「予防」という
用語は、予防対象の状態、疾患または障害に関連するか、またはそれが原因の少なくとも
１つの症状の予防を含む。
用語は、予防対象の状態、疾患または障害に関連するか、またはそれが原因の少なくとも
１つの症状の予防を含む。
本明細書中で使用される場合、「共同で治療的に有効な」（jointly therapeutically
active）または「共同治療効果」（joint therapeutic effect）という用語は、治療対象
の温血動物、特に、ヒトに好まれ、依然として（好ましくは、相乗的な）相互作用（共同
治療効果）を示すような時間間隔で治療用薬剤が単独（経時的に差を設ける様式、特に、
順序が特定的な様式）で与えられてもよいことを意味する。それがそのケースであるか否
かは、とりわけ、少なくとも特定の時間間隔の間は両化合物が治療対象のヒトの血液中に
存在することを示す血中濃度を追跡することによって確認できる。
active）または「共同治療効果」（joint therapeutic effect）という用語は、治療対象
の温血動物、特に、ヒトに好まれ、依然として（好ましくは、相乗的な）相互作用（共同
治療効果）を示すような時間間隔で治療用薬剤が単独（経時的に差を設ける様式、特に、
順序が特定的な様式）で与えられてもよいことを意味する。それがそのケースであるか否
かは、とりわけ、少なくとも特定の時間間隔の間は両化合物が治療対象のヒトの血液中に
存在することを示す血中濃度を追跡することによって確認できる。
ＷＯ２０１０／０２９０８２は、ＰＩ３−キナーゼ（ホスファチジルイノシトール３−
キナーゼ）に対する阻害活性を有することがわかった特異的２−カルボキサミドシクロア
ミノ尿素誘導体について記載している。これらの特異的ホスファチジルイノシトール３−
キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、有利な薬理学的特性を有し、ベータおよび／またはデル
タおよび／またはガンマサブタイプと比較した場合にＰＩ３−キナーゼアルファに対して
改善された選択性を示す。本発明に適した特異的２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘
導体、それらの調製およびそれらを含む適した製剤について、ＷＯ２０１０／０２９０８
２に記載されており、それは、式（Ａ）の化合物
キナーゼ）に対する阻害活性を有することがわかった特異的２−カルボキサミドシクロア
ミノ尿素誘導体について記載している。これらの特異的ホスファチジルイノシトール３−
キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、有利な薬理学的特性を有し、ベータおよび／またはデル
タおよび／またはガンマサブタイプと比較した場合にＰＩ３−キナーゼアルファに対して
改善された選択性を示す。本発明に適した特異的２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘
導体、それらの調製およびそれらを含む適した製剤について、ＷＯ２０１０／０２９０８
２に記載されており、それは、式（Ａ）の化合物
Ａは、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記
置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロま
たは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（
２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数
、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、
メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合に
より置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以
下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ
、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される
）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒド
ロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、
フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、
１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）
アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される
）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは
、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換
基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重
水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つの
オキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の
置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表
し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フ
ルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（
ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−
アミド）を除く化合物、または薬学的に許容されるその塩を含む。
式（Ａ）の化合物の定義に使用されるようなラジカルおよび記号は、ＷＯ２０１０／０
２９０８２に開示されるとおりの意味を持ち、この公報全体を参照によって本出願に組み
込んだものとする。
２９０８２に開示されるとおりの意味を持ち、この公報全体を参照によって本出願に組み
込んだものとする。
本発明の好適な化合物は、ＷＯ２０１０／０２９０８２に具体的に記載されている化合
物である。本発明の非常に好適な化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸
２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメ
チル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ
）または薬学的に許容されるその塩である。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸
２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメ
チル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）の合成につ
いては、ＷＯ２０１０／０２９０８２に実施例１５として記載されている。
物である。本発明の非常に好適な化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸
２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメ
チル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ
）または薬学的に許容されるその塩である。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸
２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメ
チル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）の合成につ
いては、ＷＯ２０１０／０２９０８２に実施例１５として記載されている。
本発明の薬学的組み合わせは、セリン／セロニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的
とする、低下させるか、または阻害する少なくとも１つの化合物を含む。そのような化合
物は、「ｍＴＯＲ阻害剤」と称され、以下に限定されるものではないが、ｍＴＯＲキナー
ゼファミリーのメンバーの活性／機能を標的とする／阻害する化合物、タンパク質もしく
は抗体、例えば、ＲＡＤラパマイシン（ラパミューンの名称でも知られているシロリムス
）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのその誘導体／類似体
または酵素のＡＴＰ−結合溝（ATP-binding cleft）に直接結合することによってｍＴＯ
Ｒのキナーゼ活性を阻害する化合物を含む。エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、サーティ
カンまたはアフィニトールの名称でも知られている。
とする、低下させるか、または阻害する少なくとも１つの化合物を含む。そのような化合
物は、「ｍＴＯＲ阻害剤」と称され、以下に限定されるものではないが、ｍＴＯＲキナー
ゼファミリーのメンバーの活性／機能を標的とする／阻害する化合物、タンパク質もしく
は抗体、例えば、ＲＡＤラパマイシン（ラパミューンの名称でも知られているシロリムス
）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのその誘導体／類似体
または酵素のＡＴＰ−結合溝（ATP-binding cleft）に直接結合することによってｍＴＯ
Ｒのキナーゼ活性を阻害する化合物を含む。エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、サーティ
カンまたはアフィニトールの名称でも知られている。
適したｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：
Ｉ．ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によって産
生される免疫抑制性ラクタムマクロライドであるラパマイシン。
Ｉ．ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によって産
生される免疫抑制性ラクタムマクロライドであるラパマイシン。
ＩＩ．ラパマイシン誘導体、例えば：
ａ．置換ラパマイシン、例えば、ＵＳ５，２５８，３８９、ＷＯ９４／０９０１０、Ｗ
Ｏ９２／０５１７９、ＵＳ５，１１８，６７７、ＵＳ５，１１８，６７８、ＵＳ５，１０
０，８８３、ＵＳ５，１５１，４１３、ＵＳ５，１２０，８４２、ＷＯ９３／１１１３０
、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５およびＷＯ９５／１４０２３などに記載
されている４０−Ｏ−置換ラパマイシン。これらすべての文献を参照によって本明細書に
組み込んだものとする。
ａ．置換ラパマイシン、例えば、ＵＳ５，２５８，３８９、ＷＯ９４／０９０１０、Ｗ
Ｏ９２／０５１７９、ＵＳ５，１１８，６７７、ＵＳ５，１１８，６７８、ＵＳ５，１０
０，８８３、ＵＳ５，１５１，４１３、ＵＳ５，１２０，８４２、ＷＯ９３／１１１３０
、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５およびＷＯ９５／１４０２３などに記載
されている４０−Ｏ−置換ラパマイシン。これらすべての文献を参照によって本明細書に
組み込んだものとする。
ｂ．例えば、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９５／１６６９１およびＷＯ９６／４１８０
７に開示されるような１６−Ｏ−置換ラパマイシン。これらの文献の内容を参照によって
本明細書に組み込んだものとする。
７に開示されるような１６−Ｏ−置換ラパマイシン。これらの文献の内容を参照によって
本明細書に組み込んだものとする。
ｃ．例えば、参照によって本明細書に組み込んだものとするＷＯ９６／４１８０７およ
びＵＳ５ ２５６ ７９０に記載されるような３２−水素化ラパマイシン。
びＵＳ５ ２５６ ７９０に記載されるような３２−水素化ラパマイシン。
ｄ．好適なラパマイシン誘導体は、式（Ｂ）の化合物
Ｒ１は、ＣＨ３もしくはＣ３〜６アルキニルであり、
Ｒ２は、Ｈもしくは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル
）−２−メチル−プロパノイルまたはテトラゾリルであり、Ｘは、＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）もし
くは（Ｈ，ＯＨ）であるが、
Ｘが＝Ｏであり、Ｒ１がＣＨ３である場合、Ｒ２は、Ｈ以外である化合物、
またはＲ２が−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨである場合は、そのプロドラッグ、例えば、生理学
的に加水分解可能なそのエーテルである。
式（Ｂ）の化合物は、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６
６９１またはＷＯ９６／４１８０７において開示されている。これらの文献を参照によっ
て本明細書に組み込んだものとする。式（Ｂ）の化合物は、これらの参考文献に開示され
るとおりに、またはそれらに記載されている手順の類似法によって調製されてもよい。
６９１またはＷＯ９６／４１８０７において開示されている。これらの文献を参照によっ
て本明細書に組み込んだものとする。式（Ｂ）の化合物は、これらの参考文献に開示され
るとおりに、またはそれらに記載されている手順の類似法によって調製されてもよい。
好適な化合物は、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３
２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−
ラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（
２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンであり、より好ましくは、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９
４／０９０１０に実施例８として開示されている４０−０−（２−ヒドロキシエチル）−
ラパマイシンである。
２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−
ラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（
２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンであり、より好ましくは、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９
４／０９０１０に実施例８として開示されている４０−０−（２−ヒドロキシエチル）−
ラパマイシンである。
式（Ｂ）の特に好適なラパマイシン誘導体は、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−
ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパ
ノアート］−ラパマイシン（ＣＣＩ７７９とも称される）、４０−エピ−（テトラゾリル
）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも称される）、３２−デオキソラパマイシン、１６−
ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシンまたはＴＡＦＡ−９３で
ある。
ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパ
ノアート］−ラパマイシン（ＣＣＩ７７９とも称される）、４０−エピ−（テトラゾリル
）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも称される）、３２−デオキソラパマイシン、１６−
ペンタ−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシンまたはＴＡＦＡ−９３で
ある。
ｅ．ラパマイシン誘導体としては、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９８／０２４４１およ
びＷＯ０１／１４３８７において開示されているような、例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ
２３４６４またはＡＰ２３８４１などのいわゆるラパログも挙げられる。
びＷＯ０１／１４３８７において開示されているような、例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ
２３４６４またはＡＰ２３８４１などのいわゆるラパログも挙げられる。
ラパマイシンおよびその誘導体は、観察される活性、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４
／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１またはＷＯ９６／４１８０７に記載されるようなマ
クロフィリン（macrophilin）−１２（ＦＫ−５０６結合タンパク質またはＦＫＢＰ−１
２としても知られている）に対する結合などに基づき、例えば、急性移植片拒絶の治療の
際の免疫抑制剤として有用であることがわかった。
／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１またはＷＯ９６／４１８０７に記載されるようなマ
クロフィリン（macrophilin）−１２（ＦＫ−５０６結合タンパク質またはＦＫＢＰ−１
２としても知られている）に対する結合などに基づき、例えば、急性移植片拒絶の治療の
際の免疫抑制剤として有用であることがわかった。
ＩＩＩ．ＦＫ５０６のエチルアナログであるアスコマイシン。
ＩＶ．酵素のＡＴＰ−結合溝に直接結合することによってｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻
害する化合物であるＡＺＤ０８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）およびＯＳＩ−０２７
（ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
害する化合物であるＡＺＤ０８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）およびＯＳＩ−０２７
（ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。
Ｖ．ＳＡＲ５４３、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９、Ａｒｉａｄ／
Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）、ＡＰ２３８４１（Ａｒｉａｄ）、ＫＵ−００６３７９４（
ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｋｕｄｏｓ）、ＩＮＫ−１２８（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）、
ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＷＹＥ−１２５１３２（Ｗｙｅｔｈ）、Ｘ
Ｌ７６５（Ｅｘｅｌｉｓｉｓ）、ＮＶ−１２８（Ｎｏｖｏｇｅｎ）、ＷＹＥ−１２５１３
２（Ｗｙｅｔｈ）、ＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１（Ｅｍｉｌｉｅｍ）。
Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）、ＡＰ２３８４１（Ａｒｉａｄ）、ＫＵ−００６３７９４（
ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｋｕｄｏｓ）、ＩＮＫ−１２８（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）、
ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＷＹＥ−１２５１３２（Ｗｙｅｔｈ）、Ｘ
Ｌ７６５（Ｅｘｅｌｉｓｉｓ）、ＮＶ−１２８（Ｎｏｖｏｇｅｎ）、ＷＹＥ−１２５１３
２（Ｗｙｅｔｈ）、ＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１（Ｅｍｉｌｉｅｍ）。
本発明に好適なｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムス（ＲＡＤ００１）である。エベロリム
ス（ＲＡＤ００１）は、化学名（（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９
Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−
ジヒドロキシ−１２−｛（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ
エトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１９，３０−ジメト
キシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４
−アザ−トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６
，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオン）を有する。エベロリムス
および類似体については、米国特許第５，６６５，７７２号の、第１欄、３９行目から第
３欄、１１行目に記載されている。
ス（ＲＡＤ００１）は、化学名（（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９
Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−
ジヒドロキシ−１２−｛（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ヒドロキシ
エトキシ）−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル｝−１９，３０−ジメト
キシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−１１，３６−ジオキサ−４
−アザ−トリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６
，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオン）を有する。エベロリムス
および類似体については、米国特許第５，６６５，７７２号の、第１欄、３９行目から第
３欄、１１行目に記載されている。
コード番号、一般名または商標名によって特定される活性剤の構造は、規格便覧（stan
dard compendium）「The Merck Index」の現行版またはデータベース、例えば、Patents
International（例えば、IMS World Publication）から得てもよい。それらの対応する内
容を参照により本明細書に組み込んだものとする。
dard compendium）「The Merck Index」の現行版またはデータベース、例えば、Patents
International（例えば、IMS World Publication）から得てもよい。それらの対応する内
容を参照により本明細書に組み込んだものとする。
上で開示した化合物（すなわち、式（Ａ）の化合物およびｍＴＯＲ阻害剤）の、そこで
開示されるその薬学的に許容される塩、対応するラセミ体、ジアステレオ異性体、鏡像異
性体、互変異性体ならびに対応する結晶変態、存在する場合、例えば、溶媒和物、水和物
および多形体がさらに含まれる。本発明の組み合わせに活性成分として使用される化合物
は、それぞれ引用文献に記載されるとおりに調製および投与できる。また、３つ以上の個
別の上記のような活性成分の組み合わせは本発明の範囲内であり、すなわち、本発明の範
囲内の薬学的組み合わせは、３つ以上の活性成分を含んでもよい。
開示されるその薬学的に許容される塩、対応するラセミ体、ジアステレオ異性体、鏡像異
性体、互変異性体ならびに対応する結晶変態、存在する場合、例えば、溶媒和物、水和物
および多形体がさらに含まれる。本発明の組み合わせに活性成分として使用される化合物
は、それぞれ引用文献に記載されるとおりに調製および投与できる。また、３つ以上の個
別の上記のような活性成分の組み合わせは本発明の範囲内であり、すなわち、本発明の範
囲内の薬学的組み合わせは、３つ以上の活性成分を含んでもよい。
一実施形態において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリ
ジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−
トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−
イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１
つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する
。
ジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−
トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−
イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１
つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組み合わせを提供する
。
一実施形態において、本発明は、発明は提供する式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−
（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チ
アゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩およ
びｍＴＯＲ阻害剤であるエベロリムス（ＲＡＤ００１）または薬学的に許容されるその塩
を含む薬学的組み合わせを提供する。
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−
（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チ
アゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩およ
びｍＴＯＲ阻害剤であるエベロリムス（ＲＡＤ００１）または薬学的に許容されるその塩
を含む薬学的組み合わせを提供する。
本発明の薬学的組み合わせは、それを必要とする温血動物のｍＴＯＲキナーゼ依存性疾
患の治療または予防に有用である。このように、一態様において、本発明は、ｍＴＯＲキ
ナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特
に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［
２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］
−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組
み合わせを提供する。
患の治療または予防に有用である。このように、一態様において、本発明は、ｍＴＯＲキ
ナーゼ依存性疾患の治療または予防に使用するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特
に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［
２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］
−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）または薬学的に許容されるその塩
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組
み合わせを提供する。
「ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患」という用語には、それらに制限されるものではないが
、以下の症状が含まれる：
・臓器または組織移植拒絶反応、例えば、心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚
もしくは角膜移植などのレシピエントの、例えば、治療；骨髄移植後などの移植片対宿主
病；
・再狭窄
・結節性硬化症またはカウデン病などの過誤腫症候群（Hamartoma syndromes）
・リンパ脈管筋腫症
・網膜色素変性（Retinitis pigmentosis）
・脳脊髄炎、インスリン依存性糖尿病、ループス、皮膚筋炎、関節炎およびリウマチ性疾
患などの自己免疫疾患
・ステロイド抵抗性急性リンパ芽球性白血病
・強皮症、肺線維症、腎線維症、嚢胞性線維症などの線維性疾患
・肺高血圧症
・免疫修飾
・多発性硬化症
・ＶＨＬ症候群
・カーニー複合
・家族性アデノナムトスポリポーシス
・若年性ポリポーシス症候群（Juvenile polyposis syndrome）
・バート・ホッグ・デューク症候群
・家族性肥大型心筋症
・ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群
・パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病およびタウ変異によって引き起こ
される認知症、脊髄小脳失調症３型、ＳＯＤ１変異によって引き起こされる運動ニューロ
ン疾患、神経セロイドリポフスチン症／バッテン病（小児神経変性）などの神経変性障害
・滲出型および乾燥型黄斑変性
・筋消耗（萎縮、悪液質）およびダノン病などのミオパチー。
・結核菌、Ａ群連鎖球菌、ＨＳＶ１型、ＨＩＶ感染症などの細菌性およびウイルス性感染
症
・神経線維腫症１型などの神経線維腫症、
・ポイツ・ジェガース症候群
、以下の症状が含まれる：
・臓器または組織移植拒絶反応、例えば、心臓、肺、心肺同時、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚
もしくは角膜移植などのレシピエントの、例えば、治療；骨髄移植後などの移植片対宿主
病；
・再狭窄
・結節性硬化症またはカウデン病などの過誤腫症候群（Hamartoma syndromes）
・リンパ脈管筋腫症
・網膜色素変性（Retinitis pigmentosis）
・脳脊髄炎、インスリン依存性糖尿病、ループス、皮膚筋炎、関節炎およびリウマチ性疾
患などの自己免疫疾患
・ステロイド抵抗性急性リンパ芽球性白血病
・強皮症、肺線維症、腎線維症、嚢胞性線維症などの線維性疾患
・肺高血圧症
・免疫修飾
・多発性硬化症
・ＶＨＬ症候群
・カーニー複合
・家族性アデノナムトスポリポーシス
・若年性ポリポーシス症候群（Juvenile polyposis syndrome）
・バート・ホッグ・デューク症候群
・家族性肥大型心筋症
・ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群
・パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病およびタウ変異によって引き起こ
される認知症、脊髄小脳失調症３型、ＳＯＤ１変異によって引き起こされる運動ニューロ
ン疾患、神経セロイドリポフスチン症／バッテン病（小児神経変性）などの神経変性障害
・滲出型および乾燥型黄斑変性
・筋消耗（萎縮、悪液質）およびダノン病などのミオパチー。
・結核菌、Ａ群連鎖球菌、ＨＳＶ１型、ＨＩＶ感染症などの細菌性およびウイルス性感染
症
・神経線維腫症１型などの神経線維腫症、
・ポイツ・ジェガース症候群
さらに、「ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患」としては、癌およびその他の関連する悪性腫
瘍などの増殖性疾患が挙げられる。病理学的なｍＴＯＲシグナルカスケードに関連する癌
の非限定的一覧には、乳癌、腎細胞癌、胃腫瘍、神経内分泌腫瘍、リンパ腫および前立腺
癌が含まれる。
瘍などの増殖性疾患が挙げられる。病理学的なｍＴＯＲシグナルカスケードに関連する癌
の非限定的一覧には、乳癌、腎細胞癌、胃腫瘍、神経内分泌腫瘍、リンパ腫および前立腺
癌が含まれる。
増殖性疾患についての例は、例えば、良性または悪性腫瘍、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀
胱、乳房、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣もしくは甲状腺の癌、
肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結腸直腸腺腫または頭
頸部腫瘍、上皮過剰増殖（epidermal hyperproliferation）、乾癬、前立腺肥大症、新形
成、上皮性新形成（neoplasia of epithelial character）、リンパ腫、乳癌あるいは白
血病である。
胱、乳房、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣もしくは甲状腺の癌、
肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結腸直腸腺腫または頭
頸部腫瘍、上皮過剰増殖（epidermal hyperproliferation）、乾癬、前立腺肥大症、新形
成、上皮性新形成（neoplasia of epithelial character）、リンパ腫、乳癌あるいは白
血病である。
別の態様において、本発明は、ｍＴＯＲキナーゼ依存性疾患の治療または予防のための
薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，
２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオ
ロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−ア
ミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻
害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，
２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオ
ロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−ア
ミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻
害剤または薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジ
ン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−ト
リフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イ
ル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍ
ＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによってｍＴＯＲキナーゼ
依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
ン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−ト
リフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イ
ル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍ
ＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによってｍＴＯＲキナーゼ
依存性疾患を治療または予防する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナー
ゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物、
すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メ
チル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン
−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）と、ＲＡＤラパマイシン
（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７
９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエ
チルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１
、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８
、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２
８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似
体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを提供し、
ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に許容される塩の形態で
存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含む。
ゼ依存性疾患の治療に対して同時、個別または逐次使用するための、式（Ａ）の化合物、
すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メ
チル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン
−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ｉ）と、ＲＡＤラパマイシン
（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７
９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエ
チルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１
、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８
、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２
８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似
体からなる群から選択される少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせを提供し、
ここで、その活性成分は、それぞれの場合、遊離型または薬学的に許容される塩の形態で
存在し、場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体も含む。
本発明は、式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血
動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を
低減または阻止するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療有効
量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投
与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその
塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治
療する方法を提供する。
動物に投与するステップを含む、ｍＴＯＲ阻害剤によるＡＫＴのリン酸化および活性化を
低減または阻止するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、治療有効
量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩をそれを必要とする温血動物に投
与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその
塩による治療中にもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖性疾患を治
療する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容
されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つの
ｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つようになった
か、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐性は、
例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
されるその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つの
ｍＴＯＲ阻害剤もしくは薬学的に許容されるその塩による治療に耐性を持つようになった
か、またはそれに対する感受性が低下した増殖性疾患を治療する方法に関する。耐性は、
例えば、ＡＫＴのリン酸化および活性化によるものである。
別の態様において、本発明は、式（Ａ）の化合物、すなわち、特に、（Ｓ）−ピロリジ
ン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−ト
リフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イ
ル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍ
ＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせをそれを必要とする温血
動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容さ
れるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法を提供する。
ン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−ト
リフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イ
ル｝−アミド）（化合物Ｉ）または薬学的に許容されるその塩および少なくとも１つのｍ
ＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む組み合わせをそれを必要とする温血
動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容さ
れるその塩による増殖性疾患の治療の有効性を改善するための方法を提供する。
本発明に従って使用されるｍＴＯＲ阻害剤は、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）なら
びにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス
（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デ
フェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７
９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５
、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５
１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択されても
よい。特に好適な本発明によるｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムスおよび／またはエベロリム
スである。
びにエベロリムス（ＲＡＤ００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス
（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デ
フェロリムス（ＡＰ２３５７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７
９４、ＩＮＫ−１２８、ＥＸ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５
、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５
１３２およびＥＭ１０１／ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択されても
よい。特に好適な本発明によるｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムスおよび／またはエベロリム
スである。
本発明による医薬組成物または組み合わせは、臨床試験において試験されてもよい。適
した臨床試験は、例えば、増殖性疾患の患者における非盲検用量漸増試験であってもよい
。当該試験は、特に、本発明の組み合わせの活性成分の相乗作用について試験する。増殖
性疾患に対して有益な効果は、それ自体が当業者に既知のこうした試験の結果から直接確
認できる。そのような試験は、この活性成分を使用した単剤療法の効果と本発明の組み合
わせの効果とを比較するのに特に適している場合がある。好ましくは、最大許容用量に達
するまで薬剤（ａ）の用量が漸増され、薬剤（ｂ）は、固定用量で投与される。あるいは
、薬剤（ａ）が固定用量で投与され、薬剤（ｂ）の用量を漸増させてもよい。各患者は、
毎日または断続的のいずれかで各用量の薬剤（ａ）を投与されてもよい。治療の有効性は
、そのような試験において、例えば、１２週、１８週または２４週間後の６週毎に症状ス
コアを評価することによって確認できる。
した臨床試験は、例えば、増殖性疾患の患者における非盲検用量漸増試験であってもよい
。当該試験は、特に、本発明の組み合わせの活性成分の相乗作用について試験する。増殖
性疾患に対して有益な効果は、それ自体が当業者に既知のこうした試験の結果から直接確
認できる。そのような試験は、この活性成分を使用した単剤療法の効果と本発明の組み合
わせの効果とを比較するのに特に適している場合がある。好ましくは、最大許容用量に達
するまで薬剤（ａ）の用量が漸増され、薬剤（ｂ）は、固定用量で投与される。あるいは
、薬剤（ａ）が固定用量で投与され、薬剤（ｂ）の用量を漸増させてもよい。各患者は、
毎日または断続的のいずれかで各用量の薬剤（ａ）を投与されてもよい。治療の有効性は
、そのような試験において、例えば、１２週、１８週または２４週間後の６週毎に症状ス
コアを評価することによって確認できる。
本発明の薬学的組み合わせの投与は、有益な効果、例えば、症状を緩和する、症状の進
行を遅延するか、または症状を抑制することなどに関する相乗的な治療効果をもたらすだ
けでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えば、本発明の組み合わせに使用される薬学的
活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して副作用の軽減、クオリティオブライフ
の改善または罹患率の低下をもたらす場合もある。
行を遅延するか、または症状を抑制することなどに関する相乗的な治療効果をもたらすだ
けでなく、さらに驚くべき有益な効果、例えば、本発明の組み合わせに使用される薬学的
活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比較して副作用の軽減、クオリティオブライフ
の改善または罹患率の低下をもたらす場合もある。
さらなる利益は、本発明の組み合わせの活性成分はより低用量で使用されてもよく、例
えば、投薬量が少量しか必要でないことが多いだけでなく、少ない頻度で適用されてもよ
く、これにより、副作用の発生率または重症度を低減することができる場合もある。これ
は、治療対象の患者の要望および要求に合致する。
えば、投薬量が少量しか必要でないことが多いだけでなく、少ない頻度で適用されてもよ
く、これにより、副作用の発生率または重症度を低減することができる場合もある。これ
は、治療対象の患者の要望および要求に合致する。
本発明の一目的は、温血動物の哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存性
疾患を標的とするか、または予防することに対して共同で治療効果のある量の（ａ）式（
Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻
害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容
される担体を含む医薬組成物を提供することである。本組成物において、組み合わせパー
トナー（ａ）および（ｂ）は、一緒に、一方の後にもう一方を、または単独で、１つの組
み合わされた単位剤形でまたは２つの個別の単位剤形で投与されてもよい。この単位剤形
は、固定の組み合わせであってもよい。
疾患を標的とするか、または予防することに対して共同で治療効果のある量の（ａ）式（
Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻
害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容
される担体を含む医薬組成物を提供することである。本組成物において、組み合わせパー
トナー（ａ）および（ｂ）は、一緒に、一方の後にもう一方を、または単独で、１つの組
み合わされた単位剤形でまたは２つの個別の単位剤形で投与されてもよい。この単位剤形
は、固定の組み合わせであってもよい。
一態様において、本発明は、（ａ）式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩
および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに
場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一実
施形態において、本医薬組成物は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存
性疾患に対して共同で治療効果のある量の式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴ
ＯＲ阻害剤を含む。
および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩ならびに
場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。一実
施形態において、本医薬組成物は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）依存
性疾患に対して共同で治療効果のある量の式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴ
ＯＲ阻害剤を含む。
別の態様において、本発明は、同時、個別または逐次使用のための、（ａ）式（Ａ）の
化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤ま
たは薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容される
担体を含む薬学的組み合わせを提供する。組み合わせパートナー（ａ）および（ｂ）は、
一緒にまたは単独でそれを必要とする温血動物に投与されてもよい。
化合物または薬学的に許容されるその塩および（ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤ま
たは薬学的に許容されるその塩ならびに場合により少なくとも１つの薬学的に許容される
担体を含む薬学的組み合わせを提供する。組み合わせパートナー（ａ）および（ｂ）は、
一緒にまたは単独でそれを必要とする温血動物に投与されてもよい。
本発明によれば、組み合わせパートナー（ａ）および組み合わせパートナー（ｂ）の個
別投与のためまたは固定の組み合わせ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせパートナ
ー（ａ）および（ｂ）を含む単一の生薬組成物で投与するための、治療有効量の少なくと
も１つの薬理学的に活性な、例えば、上記のような組み合わせパートナーのみを含むか、
または、特に、経腸もしくは非経口適用に適した１つもしくは複数の薬学的に許容される
担体もしくは希釈剤をともに含む医薬組成物は、それ自体が既知の手法で調製されてもよ
く、ヒトを含む哺乳動物（温血動物）に経口または経直腸などの経腸および非経口投与に
適したものである。
別投与のためまたは固定の組み合わせ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせパートナ
ー（ａ）および（ｂ）を含む単一の生薬組成物で投与するための、治療有効量の少なくと
も１つの薬理学的に活性な、例えば、上記のような組み合わせパートナーのみを含むか、
または、特に、経腸もしくは非経口適用に適した１つもしくは複数の薬学的に許容される
担体もしくは希釈剤をともに含む医薬組成物は、それ自体が既知の手法で調製されてもよ
く、ヒトを含む哺乳動物（温血動物）に経口または経直腸などの経腸および非経口投与に
適したものである。
「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤また
はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水ならびに石油、動物、植物または合成由来
のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油および同種のものを含む油などの
殺菌した液体であってもよい。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水ならびにデキス
トロースおよびグリセロール水溶液が、特に、注射可能な溶液用の担体として利用される
。適した医薬担体については、E． W． Martinの「Remington's Pharmaceutical Science
s」に記載されている。
はビヒクルを指す。そのような医薬担体は、水ならびに石油、動物、植物または合成由来
のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油および同種のものを含む油などの
殺菌した液体であってもよい。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水ならびにデキス
トロースおよびグリセロール水溶液が、特に、注射可能な溶液用の担体として利用される
。適した医薬担体については、E． W． Martinの「Remington's Pharmaceutical Science
s」に記載されている。
経腸または非経口投与のための併用療法用の医薬調製物は、例えば、糖衣錠、錠剤、カ
プセル剤もしくは座剤などの単位剤形またはアンプルの状態のものである。別に示されて
いない場合、これらは、それ自体が既知の手法で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶
解または凍結乾燥プロセスによって調製される。当然のことながら、必要な有効量は、複
数の投薬単位の投与によって達成されてもよいため、各剤形の個々の用量に含まれる組み
合わせパートナーの単位量は、それ自体で有効量となる必要はない。
プセル剤もしくは座剤などの単位剤形またはアンプルの状態のものである。別に示されて
いない場合、これらは、それ自体が既知の手法で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶
解または凍結乾燥プロセスによって調製される。当然のことながら、必要な有効量は、複
数の投薬単位の投与によって達成されてもよいため、各剤形の個々の用量に含まれる組み
合わせパートナーの単位量は、それ自体で有効量となる必要はない。
適した医薬組成物は、例えば、約０．１％から約９９．９％、好ましくは、約１％から
約６０％の（１つまたは複数の）活性成分を含んでもよい。本発明に従って投与される式
（Ａ）の化合物およびｍＴＯＲ阻害剤の実際の量は、治療される疾患の重症度、年齢およ
び対象の相対的な健康、使用される化合物の効能、投与経路および形態などの数々の要素
ならびにその他の要素によって決まる。本薬物は、１日に２回以上投与でき、好ましくは
、１日に１回または２回である。こうした要素のすべては、主治医の技術範囲内にある。
約６０％の（１つまたは複数の）活性成分を含んでもよい。本発明に従って投与される式
（Ａ）の化合物およびｍＴＯＲ阻害剤の実際の量は、治療される疾患の重症度、年齢およ
び対象の相対的な健康、使用される化合物の効能、投与経路および形態などの数々の要素
ならびにその他の要素によって決まる。本薬物は、１日に２回以上投与でき、好ましくは
、１日に１回または２回である。こうした要素のすべては、主治医の技術範囲内にある。
式（Ａ）の化合物は、１日にレシピエントの体重１キログラムあたり約０．０５から約
５０ｍｇの範囲にわたる治療有効量、好ましくは、約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、より
好ましくは、約０．５から１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与されてもよい。したがって、７０ｋ
ｇのヒトに対する投与の場合、投薬量範囲は、最も好ましくは、１日に約３５〜７００ｍ
ｇになる。
５０ｍｇの範囲にわたる治療有効量、好ましくは、約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、より
好ましくは、約０．５から１０ｍｇ／ｋｇ／日で投与されてもよい。したがって、７０ｋ
ｇのヒトに対する投与の場合、投薬量範囲は、最も好ましくは、１日に約３５〜７００ｍ
ｇになる。
ｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、毎日、０．５から１０００ｍｇの
投薬量範囲、好ましくは、０．５ｍｇから１５ｍｇの範囲、最も好ましくは、０．５ｍｇ
から１０ｍｇの範囲でヒトに投与されてもよい。
投薬量範囲、好ましくは、０．５ｍｇから１５ｍｇの範囲、最も好ましくは、０．５ｍｇ
から１０ｍｇの範囲でヒトに投与されてもよい。
特に、治療有効量の本発明の組み合わせの組み合わせパートナーのそれぞれは、同時に
または順次に任意の順序で投与されてもよく、構成成分は、単独でまたは固定の組み合わ
せとして投与されてもよい。例えば、本発明に従い増殖性疾患を予防または治療する方法
は、同時または任意の順序で順次、共同で治療有効量、好ましくは、相乗的有効量で、例
えば、毎日または断続的に本明細書に記載される量に相当する投薬量での（ｉ）遊離型ま
たは薬学的に許容される塩の状態の第１の薬剤（ａ）の投与および（ｉｉ）遊離型または
薬学的に許容される塩の状態の薬剤（ｂ）の投与を含んでもよい。本発明の組み合わせの
個々の組み合わせパートナーは、療法の過程中単独でさまざまな時点で、または分離した
組み合わせ形態もしくは単一の組み合わせ形態で同時に投与されてもよい。さらに、投与
することという用語は、インビボにおいて組み合わせパートナーそれ自体に変わる組み合
わせパートナーのプロドラッグの使用も包含する。本発明は、このように同時または交代
治療のそのような投与計画のすべてを包含するものと解釈されるべきであり、「投与する
こと」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
または順次に任意の順序で投与されてもよく、構成成分は、単独でまたは固定の組み合わ
せとして投与されてもよい。例えば、本発明に従い増殖性疾患を予防または治療する方法
は、同時または任意の順序で順次、共同で治療有効量、好ましくは、相乗的有効量で、例
えば、毎日または断続的に本明細書に記載される量に相当する投薬量での（ｉ）遊離型ま
たは薬学的に許容される塩の状態の第１の薬剤（ａ）の投与および（ｉｉ）遊離型または
薬学的に許容される塩の状態の薬剤（ｂ）の投与を含んでもよい。本発明の組み合わせの
個々の組み合わせパートナーは、療法の過程中単独でさまざまな時点で、または分離した
組み合わせ形態もしくは単一の組み合わせ形態で同時に投与されてもよい。さらに、投与
することという用語は、インビボにおいて組み合わせパートナーそれ自体に変わる組み合
わせパートナーのプロドラッグの使用も包含する。本発明は、このように同時または交代
治療のそのような投与計画のすべてを包含するものと解釈されるべきであり、「投与する
こと」という用語は、それに応じて解釈されるべきである。
本発明の組み合わせに利用される組み合わせパートナーのそれぞれの有効な投薬量は、
利用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療される状態、治療される状態
の重症度に応じて変化する場合もある。このように、本発明の組み合わせの投薬計画は、
投与経路ならびに患者の腎機能および肝機能などのさまざまな要素に従って選択される。
通常の技術を有する臨床医または内科医であれば、状態の進行を緩和、逆行または阻止す
るために必要とされる各活性成分単独の有効量を容易に決定および処方することができる
。最適な精度で毒性がなく効力をもたらす範囲内の活性成分濃度を得るには、標的部位に
対する活性成分の利用能についての動態学に基づく投与計画が必要である。
利用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療される状態、治療される状態
の重症度に応じて変化する場合もある。このように、本発明の組み合わせの投薬計画は、
投与経路ならびに患者の腎機能および肝機能などのさまざまな要素に従って選択される。
通常の技術を有する臨床医または内科医であれば、状態の進行を緩和、逆行または阻止す
るために必要とされる各活性成分単独の有効量を容易に決定および処方することができる
。最適な精度で毒性がなく効力をもたらす範囲内の活性成分濃度を得るには、標的部位に
対する活性成分の利用能についての動態学に基づく投与計画が必要である。
本発明は、以下の実施形態をさらに含む。
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞モデルまたは
ＢＴ−４７４乳癌細胞モデルにおける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３３０ｎＭ〜３
μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するた
めの相乗的組み合わせ。
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞モデルまたは
ＢＴ−４７４乳癌細胞モデルにおける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３３０ｎＭ〜３
μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するた
めの相乗的組み合わせ。
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、Ｔ４７−Ｄ乳癌細胞モデルにおける
相乗的組み合わせ範囲であるおよそ１２ｎＭ〜１００ｎＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭ
に相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、Ｔ４７−Ｄ乳癌細胞モデルにおける
相乗的組み合わせ範囲であるおよそ１２ｎＭ〜１００ｎＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭ
に相当する組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
・遊離型またはその塩の形態の（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＺＲ−７５−１乳癌細胞モデルにお
ける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する
組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル
）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である式（Ａ）の化合物
および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤をそれぞれ、ＺＲ−７５−１乳癌細胞モデルにお
ける相乗的組み合わせ範囲であるおよそ３μＭおよびおよそ１ｎＭ〜２７ｎＭに相当する
組み合わせ範囲で含む、ヒトに投与するための相乗的組み合わせ。
以下の実施例は、説明のためのものにすぎず、限定の意図はない。
ウエスタンブロット分析によって検出されたＢＴ４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳
腺腫瘍細胞におけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果。
材料および方法
化合物の調製：化合物、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒ
ｍａ ＡＧによって合成されたものである。ＤＭＳＯ中の２０ｍＭの原液を調製し、−２
０℃で保存する。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２
−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチ
ル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ
」）の原液を調製し、−２０℃で保存する。
腺腫瘍細胞におけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果。
材料および方法
化合物の調製：化合物、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒ
ｍａ ＡＧによって合成されたものである。ＤＭＳＯ中の２０ｍＭの原液を調製し、−２
０℃で保存する。ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２
−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチ
ル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ
」）の原液を調製し、−２０℃で保存する。
細胞および細胞培養条件：ヒト乳癌ＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）および
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２０）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ、米国）から入手する
。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２０）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ、米国）から入手する
。
ＢＴ４７４細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを加えた
Ｈｙｂｒｉ−Ｃａｒｅ培地（ＡＴＣＣ）中に維持する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１
０％ｖ／ｖウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（
Ａｍｉｍｅｄ、アルシュヴィル、スイス）中で増殖させる。すべての培地に１００μｇ／
ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２中に維持する
。
Ｈｙｂｒｉ−Ｃａｒｅ培地（ＡＴＣＣ）中に維持する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１
０％ｖ／ｖウシ胎仔血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（
Ａｍｉｍｅｄ、アルシュヴィル、スイス）中で増殖させる。すべての培地に１００μｇ／
ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２中に維持する
。
細胞処理および細胞抽出：ＢＴ４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をそれぞれ、細
胞３．３×１０４個／ｃｍ２および細胞１．６×１０４個／ｃｍ２の密度で播き、ＤＭＳ
Ｏビヒクル、２０ｎＭのＲＡＤ００１および／または各種濃度の化合物Ｉによる２４時間
の処理に先だって、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
胞３．３×１０４個／ｃｍ２および細胞１．６×１０４個／ｃｍ２の密度で播き、ＤＭＳ
Ｏビヒクル、２０ｎＭのＲＡＤ００１および／または各種濃度の化合物Ｉによる２４時間
の処理に先だって、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。
細胞溶解物を以下のとおり調製する。培養プレートを、１ｍＭのＰＭＳＦを含む氷冷Ｐ
ＢＳで一度洗浄し、氷冷抽出バッファで一度洗浄する［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．
４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのβ−グリセロリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、５ｍ
ＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのＰＰｉ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリ
ウム、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、ロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）、アプロチ
ニン（１０μｇ／ｍＬ）、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＰＭＳＦ］。プロテアーゼ阻害
剤は、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、Ｍｏから購入する。この細胞を、
１％ＮＰ−４０（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む同じバッファ中で抽出する。
この抽出物を、均質化し、遠心分離によって澄ませ、分取し、−８０℃で冷凍する。ＢＣ
Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ、米国）により
タンパク質濃度を測定する。
ＢＳで一度洗浄し、氷冷抽出バッファで一度洗浄する［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．
４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのβ−グリセロリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、５ｍ
ＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのＰＰｉ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリ
ウム、１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウム、ロイペプチン（１０μｇ／ｍＬ）、アプロチ
ニン（１０μｇ／ｍＬ）、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＰＭＳＦ］。プロテアーゼ阻害
剤は、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、Ｍｏから購入する。この細胞を、
１％ＮＰ−４０（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む同じバッファ中で抽出する。
この抽出物を、均質化し、遠心分離によって澄ませ、分取し、−８０℃で冷凍する。ＢＣ
Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ、米国）により
タンパク質濃度を測定する。
イムノブロッティング：２０マイクログラムの細胞抽出物を、ウェットブロッティング
（１時間、２５０ｍＡ）によって１２％変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動的に分離し、ポリフッ化ビニリデンフィルター（
ＰＶＤＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード、ＭＡ、米国
）に転写し、以下の一次抗体により４℃で一晩調べる。
（ａ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）（クローン１４−０５；１：２０
００）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５％ｖ／ｖＴ
ｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｂ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（クローンＥＣＡ２
９７；１：５０）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５
％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｃ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）（カタログ＃９
１５４；１：１０００）をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入
手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｄ）ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ（カタログ＃ＭＡＢ１５０１；１：２０，０００）をＣｈｅ
ｍｉｃｏｎ（ビルリカ、ＭＡ、米国）から入手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ中
で薄める。
（１時間、２５０ｍＡ）によって１２％変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で電気泳動的に分離し、ポリフッ化ビニリデンフィルター（
ＰＶＤＦ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ベッドフォード、ＭＡ、米国
）に転写し、以下の一次抗体により４℃で一晩調べる。
（ａ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）（クローン１４−０５；１：２０
００）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５％ｖ／ｖＴ
ｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｂ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（クローンＥＣＡ２
９７；１：５０）をＤＡＫＯ（グロストルプ、デンマーク）から入手し、ＰＢＳ、０．５
％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｃ）ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７／Ｓ２２１）（カタログ＃９
１５４；１：１０００）をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入
手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ、０．５％ｗ／ｖ牛乳中で薄める。
（ｄ）ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ（カタログ＃ＭＡＢ１５０１；１：２０，０００）をＣｈｅ
ｍｉｃｏｎ（ビルリカ、ＭＡ、米国）から入手し、ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ中
で薄める。
（上で挙げたような）適切な一次抗体とともにインキュベーションした後、一次抗体の
付いたタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロ
ブリン、その後、高度化学発光（ＥＣＬ Ｐｌｕｓキット；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バッキンガムシャー、英国）を使用して明らかにし、Ｑｕ
ａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ミュンヘン、ドイツ）を使
用して定量する。
付いたタンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロ
ブリン、その後、高度化学発光（ＥＣＬ Ｐｌｕｓキット；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バッキンガムシャー、英国）を使用して明らかにし、Ｑｕ
ａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ミュンヘン、ドイツ）を使
用して定量する。
以下に記載されるように逆相タンパク質アレイ方法論によってそれぞれの細胞抽出物を
さらに定量する。
さらに定量する。
それぞれの細胞抽出物をＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）ＰＷＧタンパク質マイクロア
レイチップ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）に圧電性マイクロディ
スペンスベースの、非接触Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ２．１（ＧｅＳｉＭ、グローセルク
マンスドルフ、ドイツ）によりスポットする。ＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）タンパク
質マイクロアレイにスポット後、チップを、３７℃で１時間インキュベートする。均等な
ブロッキング結果を得るために、ＣｅＬｙＡブロッキングバッファＢＢ１（Ｚｅｐｔｏｓ
ｅｎｓ、カタログＮｏ．９０４０）を超音波ネブライザーにより施す。３０分間のブロッ
キング後、このチップを、徹底的に脱イオン化水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質、１８ＭΩ×ｃｍ
）ですすぎ、窒素気流中で乾燥する。
レイチップ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）に圧電性マイクロディ
スペンスベースの、非接触Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ２．１（ＧｅＳｉＭ、グローセルク
マンスドルフ、ドイツ）によりスポットする。ＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）タンパク
質マイクロアレイにスポット後、チップを、３７℃で１時間インキュベートする。均等な
ブロッキング結果を得るために、ＣｅＬｙＡブロッキングバッファＢＢ１（Ｚｅｐｔｏｓ
ｅｎｓ、カタログＮｏ．９０４０）を超音波ネブライザーにより施す。３０分間のブロッ
キング後、このチップを、徹底的に脱イオン化水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質、１８ＭΩ×ｃｍ
）ですすぎ、窒素気流中で乾燥する。
サンプルをスポットし、ブロッキングする手順の後、ＺｅｐｔｏＭＡＲＫ（登録商標）
チップを６つのフローセルが個々にチップの６つのアレイに向けられるＺｅｐｔｏＣＡＲ
ＲＩＥＲ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．１１００）に移し、２００μｌのＣＡＢ
１ ＣｅＬｙＡアッセイバッファ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．９０３２）で２
回洗浄する。そのアッセイバッファをその後吸引し、それぞれの区画を１００μｌの一次
標的抗体（ｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３：ＣＳＴ＃４０６０；ｐＡｋｔ Ｔｈｒ３０８：ＣＳ
Ｔ＃２９６５、Ａｋｔ１ ｐａｎ：Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ ＃１０８５−１）とともにＲＴ
で一晩インキュベートする。インキュベーション後、一次抗体を除去し、アレイをＣＡＢ
１バッファで２回洗浄し、１００μｌのＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７−標識抗ウサギ
ＩｇＧ Ｆｉｂフラグメント（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｚ２５３０５）とともにＲＴの暗所
でさらに１時間インキュベートする。インキュベーション後、アレイを２００μｌのＣＡ
Ｂ１バッファで２回洗浄した。標的結合Ｆｉｂフラグメントの蛍光を、レーザー（励起波
長が６３５ｎｍ）およびＣＣＤカメラを使用したＺｅｐｔｏＲｅａｄｅｒ（Ｚｅｐｔｏｓ
ｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により読み取る。蛍光シグナルを、シグナルの強
度に応じて１、３、５および１０秒の照射時間で評価した。
チップを６つのフローセルが個々にチップの６つのアレイに向けられるＺｅｐｔｏＣＡＲ
ＲＩＥＲ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．１１００）に移し、２００μｌのＣＡＢ
１ ＣｅＬｙＡアッセイバッファ（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、カタログＮｏ．９０３２）で２
回洗浄する。そのアッセイバッファをその後吸引し、それぞれの区画を１００μｌの一次
標的抗体（ｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３：ＣＳＴ＃４０６０；ｐＡｋｔ Ｔｈｒ３０８：ＣＳ
Ｔ＃２９６５、Ａｋｔ１ ｐａｎ：Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ ＃１０８５−１）とともにＲＴ
で一晩インキュベートする。インキュベーション後、一次抗体を除去し、アレイをＣＡＢ
１バッファで２回洗浄し、１００μｌのＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７−標識抗ウサギ
ＩｇＧ Ｆｉｂフラグメント（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｚ２５３０５）とともにＲＴの暗所
でさらに１時間インキュベートする。インキュベーション後、アレイを２００μｌのＣＡ
Ｂ１バッファで２回洗浄した。標的結合Ｆｉｂフラグメントの蛍光を、レーザー（励起波
長が６３５ｎｍ）およびＣＣＤカメラを使用したＺｅｐｔｏＲｅａｄｅｒ（Ｚｅｐｔｏｓ
ｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により読み取る。蛍光シグナルを、シグナルの強
度に応じて１、３、５および１０秒の照射時間で評価した。
それぞれのアレイについての蛍光画像を、ＺｅｐｔｏＶＩＥＷ Ｐｒｏ ２．０ソフト
ウェア（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により分析し、それぞれの
シグナルについてのＲＦＩを算出する。この実験に使用される抗体および抗体希釈：
ウェア（Ｚｅｐｔｏｓｅｎｓ、ヴィッタースヴィル、スイス）により分析し、それぞれの
シグナルについてのＲＦＩを算出する。この実験に使用される抗体および抗体希釈：
結果：
ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組
み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析によって確
認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７
／Ｓ２２１）のリン酸化レベルおよび全アクチンレベルを図１に示す。
ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組
み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析によって確
認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＭＥＫ１／２（Ｓ２１７
／Ｓ２２１）のリン酸化レベルおよび全アクチンレベルを図１に示す。
ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉと組
み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによって定量
したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベルを
それぞれ図２から４に示す。
み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによって定量
したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴレベルを
それぞれ図２から４に示す。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析に
よって確認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のリン酸化レベル
および全アクチンレベルを図５に示す。
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウエスタンブロット分析に
よって確認したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のリン酸化レベル
および全アクチンレベルを図５に示す。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによ
って定量したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴ
レベルをそれぞれ図６から８に示す。
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによ
って定量したＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルおよび全ＡＫＴ
レベルをそれぞれ図６から８に示す。
図９に示されるような、ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（Ｒ
ＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウ
エスタンブロット分析によって確認し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを
使用して定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベルおよび全
ＡＫＴレベル。
ＡＤ００１）および化合物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下でウ
エスタンブロット分析によって確認し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを
使用して定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化レベルおよび全
ＡＫＴレベル。
ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳腺腫瘍細胞において、エベロリムス（ＲＡＤ００１）および化合
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによ
って定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸
化レベルおよび全ＡＫＴレベルをそれぞれ図１０から１２に示す。
物Ｉと組み合わせたエベロリムス（ＲＡＤ００１）の存在下で逆相タンパク質アレイによ
って定量した、実験の第２のセットのＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ（Ｔ３０８）のリン酸
化レベルおよび全ＡＫＴレベルをそれぞれ図１０から１２に示す。
ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉと
の組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎから購入する。ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株は、ＨＥＲ２増幅されている。Ｓ
ＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）または
１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウム
を加えたその他の推奨されている培地中、３７℃において５％ＣＯ２のインキュベーター
で培養する。
の組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎから購入する。ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株は、ＨＥＲ２増幅されている。Ｓ
ＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）または
１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウム
を加えたその他の推奨されている培地中、３７℃において５％ＣＯ２のインキュベーター
で培養する。
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌ
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数（Combination Index）により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている
場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとし
てグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要
素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面（highest-single-agent s
urface）間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も
算出する。
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数（Combination Index）により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている
場所を捕らえられるよう、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとし
てグラフ化できる。組み合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要
素ｆＸ、ｆＹについて正規化したデータおよび最高単独薬剤面（highest-single-agent s
urface）間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も
算出する。
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。細胞は、トリプリケートで１ウェルあたり３０００の細胞を３８４ウェルプレ
ートに蒔き、測定前に７２時間化合物により処理する（図１３）。この「用量マトリック
ス」試験では、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、高用量が２７ｎＭであり、低用量が１
ｎＭである４用量に３倍段階希釈され、化合物Ｉは、高用量が３μＭであり、低用量が約
４ｎＭである７用量に３倍段階希釈される。
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。細胞は、トリプリケートで１ウェルあたり３０００の細胞を３８４ウェルプレ
ートに蒔き、測定前に７２時間化合物により処理する（図１３）。この「用量マトリック
ス」試験では、エベロリムス（ＲＡＤ００１）は、高用量が２７ｎＭであり、低用量が１
ｎＭである４用量に３倍段階希釈され、化合物Ｉは、高用量が３μＭであり、低用量が約
４ｎＭである７用量に３倍段階希釈される。
この試験の結果を図１３に示す。化合物Ｉ単独では、Ａｍａｘ、阻害の最大割合＝０．
４０（ＤＭＳＯ対照と比較して４０％の増殖阻害）の細胞増殖の濃度依存性阻害がもたら
され、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えても細胞増殖に対して
同様のレベルの弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ＝０．
３２である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単
独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６３である（エ
ベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３２、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．４０）。
用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用
量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、化合物Ｉについては高用量範囲の部分（３３０ｎＭ〜３μＭ
）で向上した相乗作用が観察される。化合物Ｉが比較的低濃度においては（４ｎＭ〜３７
ｎＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（Ｒ
ＡＤ００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
４０（ＤＭＳＯ対照と比較して４０％の増殖阻害）の細胞増殖の濃度依存性阻害がもたら
され、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えても細胞増殖に対して
同様のレベルの弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ＝０．
３２である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単
独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６３である（エ
ベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３２、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．４０）。
用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用
量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、化合物Ｉについては高用量範囲の部分（３３０ｎＭ〜３μＭ
）で向上した相乗作用が観察される。化合物Ｉが比較的低濃度においては（４ｎＭ〜３７
ｎＭ）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（Ｒ
ＡＤ００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
ＢＴ−４７４乳腺腫瘍細胞におけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの組み
合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−４７４をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎから購入する。ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞株には、ＰＩＫ３ＣＡ変異およびＨＥ
Ｒ２増幅の両方が含まれる。ＢＴ−４７４乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ
＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１
％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％Ｃ
Ｏ２インキュベーターで培養する。
合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−４７４をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎから購入する。ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞株には、ＰＩＫ３ＣＡ変異およびＨＥ
Ｒ２増幅の両方が含まれる。ＢＴ−４７４乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ
＃３０−２００１）または１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１
％のピルビン酸ナトリウムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％Ｃ
Ｏ２インキュベーターで培養する。
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌ
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１４）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１４）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
この試験の結果を図１４に示す。化合物Ｉ単独では、ＩＣ５０がおよそ３μＭであり、
Ａｍａｘがおよそ０．５３（ＤＭＳＯ対照と比較して５３％の増殖阻害）の細胞増殖の濃
度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換え
ても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ
＝０．３６である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いず
れの単独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６６であ
る（エベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３６、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．５
３）。用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべ
ての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、高用量の化合物Ｉ（３３０ｎＭ〜３μＭ）で向上した
相乗作用が観察される。化合物Ｉがより低濃度においては（４ｎＭ〜３７ｎＭ）、本組み
合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）の
処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
Ａｍａｘがおよそ０．５３（ＤＭＳＯ対照と比較して５３％の増殖阻害）の細胞増殖の濃
度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換え
ても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、Ａｍａｘ
＝０．３６である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いず
れの単独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６６であ
る（エベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．３６、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．５
３）。用量マトリックス全体にわたって、エベロリムス（ＲＡＤ００１）についてはすべ
ての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、高用量の化合物Ｉ（３３０ｎＭ〜３μＭ）で向上した
相乗作用が観察される。化合物Ｉがより低濃度においては（４ｎＭ〜３７ｎＭ）、本組み
合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）の
処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉとの
組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株Ｔ４７−Ｄを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎから購入する。Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞株は、ＰＩＫ３ＣＡ変異を含む。Ｔ４７
−Ｄヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）または１０％
のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加え
たその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで培養する
。
組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株Ｔ４７−Ｄを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎから購入する。Ｔ４７−Ｄヒト乳癌細胞株は、ＰＩＫ３ＣＡ変異を含む。Ｔ４７
−Ｄヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）または１０％
のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを加え
たその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで培養する
。
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌ
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１５）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１５）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
この試験の結果を図１５に示す。化合物Ｉ単独では、ＩＣ５０がおよそ３３０ｎＭおよ
びＡｍａｘがおよそ０．６７（ＤＭＳＯ対照と比較して６７％の増殖阻害）の有意な細胞
増殖の濃度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に
置き換えても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、
Ａｍａｘ＝０．３７である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理
により、阻害の最大レベルは増大せず、Ａｍａｘ＝０．６８であり、化合物Ｉの単独薬剤
処理と同等（Ａｍａｘ＝０．６７）である。用量マトリックス全体にわたって、エベロリ
ムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、相対的用量の化
合物Ｉ（１２ｎＭ〜１００ｎＭ）でわずかに向上した弱い相乗作用が観察される。化合物
Ｉが高低両限界濃度においては（４ｎＭ、３３０ｎＭ〜３μＭ）、本組み合わせは、この
実験の単独薬剤処理の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）と比較して付
加的な利益を呈していないようである。
びＡｍａｘがおよそ０．６７（ＤＭＳＯ対照と比較して６７％の増殖阻害）の有意な細胞
増殖の濃度依存性阻害がもたらされ、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に
置き換えても細胞増殖に対して弱い増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０は達成されず、
Ａｍａｘ＝０．３７である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理
により、阻害の最大レベルは増大せず、Ａｍａｘ＝０．６８であり、化合物Ｉの単独薬剤
処理と同等（Ａｍａｘ＝０．６７）である。用量マトリックス全体にわたって、エベロリ
ムス（ＲＡＤ００１）についてはすべての用量（１ｎＭ〜２７ｎＭ）で、相対的用量の化
合物Ｉ（１２ｎＭ〜１００ｎＭ）でわずかに向上した弱い相乗作用が観察される。化合物
Ｉが高低両限界濃度においては（４ｎＭ、３３０ｎＭ〜３μＭ）、本組み合わせは、この
実験の単独薬剤処理の場合の化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ００１）と比較して付
加的な利益を呈していないようである。
ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ００１）の化合物Ｉ
との組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＺＲ−７５−１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎから購入する。ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株は、ＰＴＥＮ変異を含む。Ｚ
Ｒ−７５−１ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）また
は１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウ
ムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで
培養する。
との組み合わせの効果
材料および方法
ヒト乳癌細胞株ＺＲ−７５−１を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎから購入する。ＺＲ−７５−１ヒト乳癌細胞株は、ＰＴＥＮ変異を含む。Ｚ
Ｒ−７５−１ヒト乳癌細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ ＃３０−２００１）また
は１０％のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウ
ムを加えたその他の推奨されている培地中３７℃において５％ＣＯ２インキュベーターで
培養する。
細胞増殖アッセイ：細胞生存率は、製造業者の手順に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌ
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
ｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙアッセイ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７３）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求め
られる。簡単にいえば、１５００〜５００００の細胞を、３８４または９６ウェルプレー
トのいずれかの２５μｌ（３８４ウェル）または１００μｌ（９６ウェル）の増殖培地に
蒔き、細胞を一晩付着させた後、各種濃度の薬物または薬物の組み合わせとともに７２時
間インキュベーションし、薬物処理の終わりに、同量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ摂政
をそれぞれのウェルに添加して、細胞を溶解させ、発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレ
ートリーダーにより記録する。
組み合わせの効果を算出するための方法：エベロリムス（ＲＡＤ００１）および（Ｓ）
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，
２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾー
ル−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）の組み合わせの効果を評価するためおよび起
こりうるすべての濃度における相乗作用の可能性を確認するために、組み合わせ試験を「
用量マトリックス」を用いて行う。組み合わせについて、連続的に希釈したエベロリムス
（ＲＡＤ００１）および化合物Ｉの起こりうるすべての単独薬剤用量を組み替えて試験す
るあらゆる組み合わせアッセイでは、各化合物を同時に適用する。単独薬剤用量の反応曲
線、ＩＣ５０、ＩＣ９０および相乗作用のすべてをＣｈａｌｉｃｅソフトウェア（Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ ＭＡ）を使用して分析する。単独薬物用量相加性参照
モデルに対して、組み合わせの反応を、その各単独薬剤の反応と比較することによって相
乗効果を算出する。用量相加性の偏差は、アイソボログラムにより視覚的にまたは併用係
数により数量的に評価することができる。相乗作用が生じている場所を捕らえられるよう
、相加性と比較した過剰阻害も全用量マトリックスチャートとしてグラフ化できる。組み
合わせ効果の全般的な強度を定量化するために、単独薬剤希釈要素ｆＸ、ｆＹについて正
規化したデータおよび最高単独薬剤面間の量スコアＶＨＳＡ＝ΣＸ，ＹｌｎｆＸｌｎｆＹ
（Ｉｄａｔａ−ＩＨＳＡ）も算出する。
結果：
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１６）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の細胞増殖
に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを使用して
評価する。単独薬剤およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理の
細胞増殖に対する効果を、上記のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ（ＣＴＧ）アッセイを
使用して評価する。実験セットアップは、ＳＫＢＲ−３モデルについて上で記載した実験
手順と同一である（図１６）。さらに、同じ「用量マトリックス」（エベロリムス（ＲＡ
Ｄ００１）：４用量、３倍、１ｎＭから２７ｎＭ、化合物Ｉ：７用量、３倍、４ｎＭから
３μＭ）が適用される。
この試験の結果を図１６に示す。化合物Ｉ単独では、細胞増殖に対して有意な阻害はも
たらされず、Ａｍａｘがおよそ０．１６（ＤＭＳＯ対照と比較して１６％の増殖阻害）で
あり、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えると細胞増殖に対する
より良好な増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０がおよそ１５ｎＭおよびＡｍａｘ＝０．
５５である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単
独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６７である（エ
ベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．５５、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．１６）。
しかしながら、用量マトリックス全体にわたって、化合物１の最高用量で有意な弱い相乗
作用の増加が観察される（３μＭ）。化合物Ｉがより低用量の範囲では（４ｎＭ〜１μＭ
）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ
００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
たらされず、Ａｍａｘがおよそ０．１６（ＤＭＳＯ対照と比較して１６％の増殖阻害）で
あり、単独薬剤の場合のエベロリムス（ＲＡＤ００１）に置き換えると細胞増殖に対する
より良好な増殖阻害効果がもたらされ、ＩＣ５０がおよそ１５ｎＭおよびＡｍａｘ＝０．
５５である。エベロリムス（ＲＡＤ００１）／化合物Ｉの両方による処理は、いずれの単
独薬剤と比較しても阻害の最大レベルを著しく増大させ、Ａｍａｘ＝０．６７である（エ
ベロリムス（ＲＡＤ００１）のＡｍａｘ＝０．５５、化合物ＩのＡｍａｘ＝０．１６）。
しかしながら、用量マトリックス全体にわたって、化合物１の最高用量で有意な弱い相乗
作用の増加が観察される（３μＭ）。化合物Ｉがより低用量の範囲では（４ｎＭ〜１μＭ
）、本組み合わせは、この実験の単独薬剤としての化合物Ｉおよびエベロリムス（ＲＡＤ
００１）の処理と比較して付加的な利益を呈していないようである。
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌ヌードマウス異種移植モデルにおけるエベロリムス（ＲＡＤ０
０１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
方法および材料：
試験の１日目に体重（ＢＷ）が２１．０〜３１．３ｇの範囲の８週齢の雄ヌードマウス
（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ）を使用する。動物に適宜、水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）
ならびに１８．０％粗タンパク質、５．０％粗脂肪および５．０％粗繊維からなるＮＩＨ
３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商
標）を与える。１２時間の光サイクル、２１〜２２℃、湿度４０〜６０％の静的マイクロ
アイソレーター内の光照射したＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇにマウスを収容する。
０１）の化合物Ｉとの組み合わせの効果
方法および材料：
試験の１日目に体重（ＢＷ）が２１．０〜３１．３ｇの範囲の８週齢の雄ヌードマウス
（ｎｕ／ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ）を使用する。動物に適宜、水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）
ならびに１８．０％粗タンパク質、５．０％粗脂肪および５．０％粗繊維からなるＮＩＨ
３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商
標）を与える。１２時間の光サイクル、２１〜２２℃、湿度４０〜６０％の静的マイクロ
アイソレーター内の光照射したＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇにマウスを収容する。
ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手する。ＤＵ１４５細胞株を、１０％ウシ胎仔血
清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍ
Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、２μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ
および０．０７５％炭酸水素ナトリウムを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に指数関数的増
殖培養になるように維持する。その腫瘍細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気雰
囲気の加湿されたインキュベーター内の組織培養フラスコで培養する。
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手する。ＤＵ１４５細胞株を、１０％ウシ胎仔血
清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍ
Ｌのストレプトマイシン硫酸塩、２μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ
および０．０７５％炭酸水素ナトリウムを加えたＲＰＭＩ−１６４０培地に指数関数的増
殖培養になるように維持する。その腫瘍細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気雰
囲気の加湿されたインキュベーター内の組織培養フラスコで培養する。
ＤＵ１４５前立腺癌細胞を、指数関数的な増殖の間に回収し、細胞５×１０７個／ｍＬ
の濃度で５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む冷え
たＰＢＳに再懸濁させる。各ヌードマウスの右脇腹の皮下に０．２ｍＬの懸濁液（１×１
０７細胞）を接種する。その平均体積が所望の１００〜１５０ｍｍ３の範囲に近づくよう
、増殖を観察するために腫瘍を二次元にキャリパスで測る。腫瘍体積＝（幅２×長さ）／
２により腫瘍の大きさをｍｍ３で算出する。腫瘍の重量は、１ｍｇが腫瘍体積の１ｍｍ３
に相当するという想定により推定できる。腫瘍移植の７日後、試験の１日目に、個々の腫
瘍の大きさが１４４〜１９６ｍｍ３のマウスを、群の平均腫瘍体積が１８１〜１８４ｍｍ
３のマウス１０匹の１１群に仕分ける。
の濃度で５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む冷え
たＰＢＳに再懸濁させる。各ヌードマウスの右脇腹の皮下に０．２ｍＬの懸濁液（１×１
０７細胞）を接種する。その平均体積が所望の１００〜１５０ｍｍ３の範囲に近づくよう
、増殖を観察するために腫瘍を二次元にキャリパスで測る。腫瘍体積＝（幅２×長さ）／
２により腫瘍の大きさをｍｍ３で算出する。腫瘍の重量は、１ｍｇが腫瘍体積の１ｍｍ３
に相当するという想定により推定できる。腫瘍移植の７日後、試験の１日目に、個々の腫
瘍の大きさが１４４〜１９６ｍｍ３のマウスを、群の平均腫瘍体積が１８１〜１８４ｍｍ
３のマウス１０匹の１１群に仕分ける。
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２
−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−
チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）を室温で溶解するまでＮ−メチルピ
ロリドン（ＮＭＰ；最終体積の１０％）中で撹拌する。ポリエチレングリコール３００（
ＰＥＧ３００）を添加し（最終体積の３０％）、続いて、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）Ｈ
ＳＳ１５（最終体積の２０％）を添加し、その混合物を均質になるまで撹拌する。脱イオ
ン化水（最終体積の４０％）の添加によって最終体積にする。化合物Ｉビヒクル、ＮＭＰ
：ＰＥＧ３００：Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５：脱イオン化水（１０：３０：２
０：６０）、を「ビヒクル１」と呼ぶ。ビヒクル１を含む高用量溶液の希釈によって、よ
り低用量の溶液を調製する。新しい投薬溶液を、週に１回調製し、光から保護して４℃で
保存する。
−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−
チアゾール−２−イル｝−アミド）（「化合物Ｉ」）を室温で溶解するまでＮ−メチルピ
ロリドン（ＮＭＰ；最終体積の１０％）中で撹拌する。ポリエチレングリコール３００（
ＰＥＧ３００）を添加し（最終体積の３０％）、続いて、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）Ｈ
ＳＳ１５（最終体積の２０％）を添加し、その混合物を均質になるまで撹拌する。脱イオ
ン化水（最終体積の４０％）の添加によって最終体積にする。化合物Ｉビヒクル、ＮＭＰ
：ＰＥＧ３００：Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５：脱イオン化水（１０：３０：２
０：６０）、を「ビヒクル１」と呼ぶ。ビヒクル１を含む高用量溶液の希釈によって、よ
り低用量の溶液を調製する。新しい投薬溶液を、週に１回調製し、光から保護して４℃で
保存する。
エベロリムス（ＲＡＤ００１）を、活性成分を２％（ｗ／ｗ）含む、すなわち、２０ｍ
ｇＲＡＤ００１／ｇのマイクロエマルションとして製剤化し、このマイクロエマルション
の密度は、０．９９５ｇ／ｃｍ３とする。ＲＡＤ００１マイクロエマルションを得て、ま
ず−２０℃で保存する。ストックのアリコートを解凍し、計量して１日の１回分に分け、
４℃で保存する。各処置日に、ＲＡＤ００１のアリコートを室温にし、デキストロース水
溶液（Ｄ５Ｗ）で希釈して、最高用量の１ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。このストックをＤ５Ｗ
で希釈して、より低用量の溶液を調製する。Ｄ５Ｗで希釈したプラセボのマイクロエマル
ションを「ビヒクル２」と呼ぶ。
ｇＲＡＤ００１／ｇのマイクロエマルションとして製剤化し、このマイクロエマルション
の密度は、０．９９５ｇ／ｃｍ３とする。ＲＡＤ００１マイクロエマルションを得て、ま
ず−２０℃で保存する。ストックのアリコートを解凍し、計量して１日の１回分に分け、
４℃で保存する。各処置日に、ＲＡＤ００１のアリコートを室温にし、デキストロース水
溶液（Ｄ５Ｗ）で希釈して、最高用量の１ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。このストックをＤ５Ｗ
で希釈して、より低用量の溶液を調製する。Ｄ５Ｗで希釈したプラセボのマイクロエマル
ションを「ビヒクル２」と呼ぶ。
処置計画：
化合物Ｉ、ＲＡＤ００１およびそれらのビヒクルをそれぞれ、経口胃管栄養法（ｐ．ｏ
．）によって１日に１回、連続して２１日間（ｑｄ×２１）投与する。１〜２０日目の併
用療法については、化合物Ｉの後３０分以内にＲＡＤ００１を投薬する。群１０には、２
１日目および７日目に、ケージごとにＲＡＤ００１のすぐ後に化合物Ｉを続けた。パクリ
タキセルを、急速尾部ベール注射（ｉ．ｖ．）により１日おきに１日に１回５用量（ｑｏ
ｄ×５）投与する。金曜のＢＷが繰り越される週末を除き、投薬の日に測定する場合は、
各動物についての体重に対して、投薬量、１０ｍＬ／ｋｇ（）．２ｍＬ／２０ｇマウス）
を計る。
化合物Ｉ、ＲＡＤ００１およびそれらのビヒクルをそれぞれ、経口胃管栄養法（ｐ．ｏ
．）によって１日に１回、連続して２１日間（ｑｄ×２１）投与する。１〜２０日目の併
用療法については、化合物Ｉの後３０分以内にＲＡＤ００１を投薬する。群１０には、２
１日目および７日目に、ケージごとにＲＡＤ００１のすぐ後に化合物Ｉを続けた。パクリ
タキセルを、急速尾部ベール注射（ｉ．ｖ．）により１日おきに１日に１回５用量（ｑｏ
ｄ×５）投与する。金曜のＢＷが繰り越される週末を除き、投薬の日に測定する場合は、
各動物についての体重に対して、投薬量、１０ｍＬ／ｋｇ（）．２ｍＬ／２０ｇマウス）
を計る。
１１群のヌードマウス（群あたりｎ＝１０）を以下のように処置する：群１のマウスに
は、ビヒクル１およびビヒクル２を与え、すべての分析についての対照とする。群２〜４
には、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉによる単剤療法を受けさ
せる。群５〜７には、それぞれ２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１による単
剤療法を受けさせる。群８には、１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて１２．５
ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群９には、５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて
２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群１０には、２．５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組
み合わせて５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。毒性の理由から、この処置は、７用量の
各薬剤（ｑｄ×７）の後止める。群１１には、２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを与える
。
は、ビヒクル１およびビヒクル２を与え、すべての分析についての対照とする。群２〜４
には、それぞれ１２．５、２５および５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉによる単剤療法を受けさ
せる。群５〜７には、それぞれ２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１による単
剤療法を受けさせる。群８には、１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて１２．５
ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群９には、５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組み合わせて
２５ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。群１０には、２．５ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ００１と組
み合わせて５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを与える。毒性の理由から、この処置は、７用量の
各薬剤（ｑｄ×７）の後止める。群１１には、２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを与える
。
腫瘍増殖阻害：
２１日目に処置の有効性を確認する。統計的分析およびグラフによる分析のために、２
１日目まで生き延びた各動物について、ΔＴＶ、１日目（投薬開始）および最終日間の腫
瘍体積の差を測定する。各処置群について、以下の関係によって最終日の反応を算出する
。
Ｔ／Ｃ（％）＝１００×ΔＴ／ΔＣ、ΔＴ＞０
ここで、ΔＴ＝（最終日の処置群の平均腫瘍体積）−（１日目の処置群の平均腫瘍体積）
であり、ΔＣ＝（最終日の対照群の平均腫瘍体積）−（１日目の対照群の平均腫瘍体積）
である。Ｔ／Ｃ値が４０％以下を達成した処置は、場合によって治療的に有効であると分
類してもよい。
２１日目に処置の有効性を確認する。統計的分析およびグラフによる分析のために、２
１日目まで生き延びた各動物について、ΔＴＶ、１日目（投薬開始）および最終日間の腫
瘍体積の差を測定する。各処置群について、以下の関係によって最終日の反応を算出する
。
Ｔ／Ｃ（％）＝１００×ΔＴ／ΔＣ、ΔＴ＞０
ここで、ΔＴ＝（最終日の処置群の平均腫瘍体積）−（１日目の処置群の平均腫瘍体積）
であり、ΔＣ＝（最終日の対照群の平均腫瘍体積）−（１日目の対照群の平均腫瘍体積）
である。Ｔ／Ｃ値が４０％以下を達成した処置は、場合によって治療的に有効であると分
類してもよい。
退縮反応（regression response）についての基準：
処置の有効性は、退縮反応の数から確認してもよい。処置により、動物の腫瘍の部分的
退縮（ＰＲ）または完全な退縮（ＣＲ）が起こることもある。ＰＲは、試験の過程の連続
した３測定値について、腫瘍体積が１日目の体積の５０％以下であり、これらの３測定値
のうちの１つまたは複数が１３．５ｍｍ３以上であることを指す。ＣＲは、試験の過程の
連続した３測定値について、腫瘍体積が１３．５ｍｍ３未満であることを指す。
処置の有効性は、退縮反応の数から確認してもよい。処置により、動物の腫瘍の部分的
退縮（ＰＲ）または完全な退縮（ＣＲ）が起こることもある。ＰＲは、試験の過程の連続
した３測定値について、腫瘍体積が１日目の体積の５０％以下であり、これらの３測定値
のうちの１つまたは複数が１３．５ｍｍ３以上であることを指す。ＣＲは、試験の過程の
連続した３測定値について、腫瘍体積が１３．５ｍｍ３未満であることを指す。
毒性：
試験の終了まで、動物を１〜５日目および各処置日（週末を除く）に計量する。最大耐
用量の許容される毒性は、試験中の群の平均ＢＷ減少が１５％未満であり、１０匹の動物
のうち処置関連（ＴＲ）死が最大で１匹までと定義する。１測定値について、ＢＷ減少が
２０％を上回る動物がいれば、それが、その群の最初の死亡でない限り、安楽死させ、Ｔ
Ｒ死亡と分類する。処置非関連（ＮＴＲ）死を、ＮＴＲａ（事故または過失による）、Ｎ
ＴＲｕ（原因不明）またはＮＴＲｍ（死体解剖により確認された浸潤および／または転移
による腫瘍内転移）と分類する。最大限の情報を得ながらも動物を保護するために、群の
最初の死亡は、ＮＴＲｕと分類するが、以降の群の結果により処置が有毒であると示され
た場合は、その死亡をＴＲと再分類する。
試験の終了まで、動物を１〜５日目および各処置日（週末を除く）に計量する。最大耐
用量の許容される毒性は、試験中の群の平均ＢＷ減少が１５％未満であり、１０匹の動物
のうち処置関連（ＴＲ）死が最大で１匹までと定義する。１測定値について、ＢＷ減少が
２０％を上回る動物がいれば、それが、その群の最初の死亡でない限り、安楽死させ、Ｔ
Ｒ死亡と分類する。処置非関連（ＮＴＲ）死を、ＮＴＲａ（事故または過失による）、Ｎ
ＴＲｕ（原因不明）またはＮＴＲｍ（死体解剖により確認された浸潤および／または転移
による腫瘍内転移）と分類する。最大限の情報を得ながらも動物を保護するために、群の
最初の死亡は、ＮＴＲｕと分類するが、以降の群の結果により処置が有毒であると示され
た場合は、その死亡をＴＲと再分類する。
サンプリング：
７日目に、ＣＯ２麻酔下において致死的心臓穿刺によって、群１０の動物＃１〜４を投
薬の２時間後に安楽死させる。８日目に、投薬の２４時間後に動物＃５から同様にサンプ
ルを取る。各動物から全量の血液を採取し、抗凝固剤としてのＫ−ＥＤＴＡにより血漿を
個々に処理する。その血漿サンプルを−８０℃で冷凍する。腫瘍を切除し、液体Ｎ２中で
瞬間冷凍（snap frozen）する。２１日目の最終投薬の２時間および２４時間後に、各時
点につき群１、４、６および９の動物４匹ずつから、前に記載したように血液および腫瘍
のサンプルを取る。
７日目に、ＣＯ２麻酔下において致死的心臓穿刺によって、群１０の動物＃１〜４を投
薬の２時間後に安楽死させる。８日目に、投薬の２４時間後に動物＃５から同様にサンプ
ルを取る。各動物から全量の血液を採取し、抗凝固剤としてのＫ−ＥＤＴＡにより血漿を
個々に処理する。その血漿サンプルを−８０℃で冷凍する。腫瘍を切除し、液体Ｎ２中で
瞬間冷凍（snap frozen）する。２１日目の最終投薬の２時間および２４時間後に、各時
点につき群１、４、６および９の動物４匹ずつから、前に記載したように血液および腫瘍
のサンプルを取る。
未処理データにおいて、群４の動物＃２、６および７をＴＲ死亡として試験から除き、
群９の動物＃４および１０をそれぞれＴＲおよびＮＴＲとして除く。これらの動物は、実
際には２１日目まで生き延び、サンプルを取られている。
群９の動物＃４および１０をそれぞれＴＲおよびＮＴＲとして除く。これらの動物は、実
際には２１日目まで生き延び、サンプルを取られている。
統計的分析およびグラフによる分析：
統計的分析およびグラフによる分析をＷｉｎｄｏｗｓ用Ｐｒｉｓｍ３．０３（Ｇｒａｐ
ｈ Ｐａｄ）により行う。マウスの処置群対対照群間の平均ΔＴＶ値の差の有意性を、バ
ートレット検定およびダネットの事後多重比較検定（post-hoc Dunnett's multiple comp
arison test）による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって確認する。バートレット検定によ
り、分散（Ｐ＜０．０００１）に有意差が示された場合、その結果を、体積変化の中央値
の有意差（Ｐ＜０．０００１）を示すノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス検定（
nonparametric Kruskal-Wallis test）により分析する。各群間の差をダンの事後多重比
較検定（post-hoc with Dunn's multiple comparison test）により分析する。マン・ホ
イットニーのＵ検定を２群間の体積変化の中央値を比較するために利用する。Ｐ＝０．０
５で両側統計分析を行う。Ｐｒｉｓｍは、検定結果を、Ｐ＞０．０５では有意でない（ｎ
ｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５では有意（「＊」で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１で
は非常に有意（「＊＊」で表す）、Ｐ≦０．００１では極めて有意（「＊＊＊」で表す）
とまとめる。検定の統計的有意性は、各群間の差の大きさの推定値を提供するものではな
いため、あらゆるレベルの有意性も有意かまたは有意でないかのいずれかで記載する。
統計的分析およびグラフによる分析をＷｉｎｄｏｗｓ用Ｐｒｉｓｍ３．０３（Ｇｒａｐ
ｈ Ｐａｄ）により行う。マウスの処置群対対照群間の平均ΔＴＶ値の差の有意性を、バ
ートレット検定およびダネットの事後多重比較検定（post-hoc Dunnett's multiple comp
arison test）による分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって確認する。バートレット検定によ
り、分散（Ｐ＜０．０００１）に有意差が示された場合、その結果を、体積変化の中央値
の有意差（Ｐ＜０．０００１）を示すノンパラメトリック・クラスカル・ウォリス検定（
nonparametric Kruskal-Wallis test）により分析する。各群間の差をダンの事後多重比
較検定（post-hoc with Dunn's multiple comparison test）により分析する。マン・ホ
イットニーのＵ検定を２群間の体積変化の中央値を比較するために利用する。Ｐ＝０．０
５で両側統計分析を行う。Ｐｒｉｓｍは、検定結果を、Ｐ＞０．０５では有意でない（ｎ
ｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５では有意（「＊」で表す）、０．００１＜Ｐ≦０．０１で
は非常に有意（「＊＊」で表す）、Ｐ≦０．００１では極めて有意（「＊＊＊」で表す）
とまとめる。検定の統計的有意性は、各群間の差の大きさの推定値を提供するものではな
いため、あらゆるレベルの有意性も有意かまたは有意でないかのいずれかで記載する。
群別の個々の動物についてのΔＴＶ値を示すために散布図を作る。群平均±平均値の標
準誤差（ＳＥＭ）または腫瘍体積の中央値を時間の一次関数としてグラフ化する。試験期
間にわたる群平均ＢＷ変化を、１日目からの変化率、±ＳＥＭとしてグラフ化する。ＴＲ
死亡が１０％を上回った場合は、腫瘍増殖曲線を切り捨てる。
準誤差（ＳＥＭ）または腫瘍体積の中央値を時間の一次関数としてグラフ化する。試験期
間にわたる群平均ＢＷ変化を、１日目からの変化率、±ＳＥＭとしてグラフ化する。ＴＲ
死亡が１０％を上回った場合は、腫瘍増殖曲線を切り捨てる。
結果：
本試験から以下のデータを得ている：
本試験から以下のデータを得ている：
この試験において、ビヒクル処置群１のマウスのΔＴＶ値は、広範囲にわたり、個々の
動物間で最大９．９倍の差になっている。それでもなお、治療活性の可能性を示す４０％
限界点未満のＴ／Ｃ値をもたらす処置のすべてに有意な活性が観察されている。
動物間で最大９．９倍の差になっている。それでもなお、治療活性の可能性を示す４０％
限界点未満のＴ／Ｃ値をもたらす処置のすべてに有意な活性が観察されている。
１２．５：１０および２５：５ｍｇ／ｋｇの用量比の化合物Ｉ／ＲＡＤ００１の組み合
わせ（群８および９）により、それぞれ２９％および１５％のＴ／Ｃならびに統計学的に
有意な活性（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１）がもたらされている。１２．５：１０
ｍｇ／ｋｇの比の併用療法（群８）は、それぞれ群２および群７の化合物ＩおよびＲＡＤ
００１の単剤療法よりも改善されているが、群８のΔＴＶ値は、群２および群７の値の範
囲内にあり、単剤療法を上回る統計学的に有意な改善は観察されていない。
わせ（群８および９）により、それぞれ２９％および１５％のＴ／Ｃならびに統計学的に
有意な活性（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１）がもたらされている。１２．５：１０
ｍｇ／ｋｇの比の併用療法（群８）は、それぞれ群２および群７の化合物ＩおよびＲＡＤ
００１の単剤療法よりも改善されているが、群８のΔＴＶ値は、群２および群７の値の範
囲内にあり、単剤療法を上回る統計学的に有意な改善は観察されていない。
２５：５ｍｇ／ｋｇの比の併用療法（群９）は、１５％のＴ／Ｃという結果になり、し
たがって、群３の化合物Ｉの単剤療法（１６％のＴ／Ｃ）よりもやや改善している。５０
：２．５ｍｇ／ｋｇの用量比の化合物Ｉ／ＲＡＤ００１の組み合わせは、５日目に群の平
均ＢＷ減少が１９．４％であり、処置を止めた７日目までの死亡率が５０％という結果に
なっている。
たがって、群３の化合物Ｉの単剤療法（１６％のＴ／Ｃ）よりもやや改善している。５０
：２．５ｍｇ／ｋｇの用量比の化合物Ｉ／ＲＡＤ００１の組み合わせは、５日目に群の平
均ＢＷ減少が１９．４％であり、処置を止めた７日目までの死亡率が５０％という結果に
なっている。
Claims (15)
- ａ）式（Ａ）の化合物
Ａは、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記
置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロま
たは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（
２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数
、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、
メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合に
より置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以
下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ
、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される
）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒド
ロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、
フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、
１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）
アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される
）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは
、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換
基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重
水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つの
オキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の
置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表
し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フ
ルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（
ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−
アミド）を除く化合物、またはその塩
および
ｂ）少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤
を含む薬学的組み合わせ。 - 式（Ａ）の化合物が、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛
４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピ
リジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である、請求項１に記載の薬学
的組み合わせ。 - ｍＴＯＲ阻害剤が、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ
００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ
５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５
７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、Ｅ
Ｘ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ
−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／
ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択される、請求項１または２に記載の
薬学的組み合わせ。 - 哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防
に使用するための、請求項１または２に記載の薬学的組み合わせ。 - 請求項１に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および少なくとも
１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。 - 哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防
のための薬剤を製造するための、式（Ａ）の化合物
Ａは、
Ｒ１は、以下：（１）非置換または置換、好ましくは、置換Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（前記
置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から９つの以下の部分：重水素、フルオロま
たは１から２つの以下の部分、Ｃ３〜Ｃ５−シクロアルキルから独立に選択される）；（
２）場合により置換されたＣ３〜Ｃ５−シクロアルキル（前記置換基は、１つまたは複数
、好ましくは、１から４つの以下の部分：重水素、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル（好ましくは、
メチル）、フルオロ、シアノ、アミノカルボニルから独立に選択される）；（３）場合に
より置換されたフェニル（前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から２つの以
下の部分：重水素、ハロ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノ
、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）アミノ、Ｃ１〜Ｃ７−アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシから独立に選択される
）；（４）場合によりモノまたはジ置換アミン（前記置換基は、以下の部分：重水素、Ｃ
１〜Ｃ７−アルキル（これは、非置換であるか、または重水素、フルオロ、クロロ、ヒド
ロキシの群から選択される１つもしくは複数の置換基によって置換されたものである）、
フェニルスルホニル（これは、非置換であるか、または１つもしくは複数、好ましくは、
１つの、Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシ、ジ（Ｃ１〜Ｃ７−アルキル）
アミノ−Ｃ１〜Ｃ７−アルコキシによって置換されたものである）から独立に選択される
）；（５）置換スルホニル（前記置換基は、以下の部分：Ｃ１〜Ｃ７−アルキル（これは
、非置換であるか、または重水素、フルオロの群から選択される１つもしくは複数の置換
基によって置換されたものである）、ピロリジノ、（これは、非置換であるか、または重
水素、ヒドロキシ、オキソの群から選択される１つもしくは複数の置換基、特に、１つの
オキソによって置換されたものである）から選択される）；（６）フルオロ、クロロ；の
置換基の１つを表し、
Ｒ２は、水素を表し；
Ｒ３は、（１）水素、（２）フルオロ、クロロ、（３）場合により置換されたメチルを表
し、前記置換基は、１つまたは複数、好ましくは、１から３つの以下の部分：重水素、フ
ルオロ、クロロ、ジメチルアミノから独立に選択される］
であって、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛５−［２−（
ｔｅｒｔ−ブチル）−ピリミジン−４−イル］−４−メチル−チアゾール−２−イル｝−
アミド）を除く化合物、または薬学的に許容されるその塩、および
少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤の使用。 - 式（Ａ）の化合物が、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛
４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピ
リジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）である、請求項６に記載の使用
。 - ｍＴＯＲ阻害剤が、ＲＡＤラパマイシン（シロリムス）ならびにエベロリムス（ＲＡＤ
００１）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）、ＳＡＲ
５４３、アスコマイシン（ＦＫ５０６のエチルアナログ）、デフェロリムス（ＡＰ２３５
７３／ＭＫ−８６６９）、ＡＰ２３８４１、ＫＵ−００６３７９４、ＩＮＫ−１２８、Ｅ
Ｘ２０４４、ＥＸ３８５５、ＥＸ７５１８、ＡＺＤ０８０５５、ＯＳＩ−０２７、ＷＹＥ
−１２５１３２、ＸＬ７６５、ＮＶ−１２８、ＷＹＥ−１２５１３２およびＥＭ１０１／
ＬＹ３０３５１１などのその誘導体／類似体から選択される、請求項６または７に記載の
使用。 - 治療対象の疾患が、良性または悪性腫瘍；脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、腎細胞
癌、神経内分泌腫瘍、前立腺、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣も
しくは甲状腺の癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結
腸直腸腺腫または頭頸部腫瘍、上皮過剰増殖、乾癬、前立腺肥大症、新形成、上皮性新形
成、リンパ腫、乳癌または白血病；臓器または組織移植拒絶反応；再狭窄；結節性硬化症
；カウデン病；リンパ脈管筋腫症；網膜色素変性；自己免疫疾患；ステロイド抵抗性急性
リンパ芽球性白血病；線維性疾患；肺高血圧症；免疫修飾；多発性硬化症；ＶＨＬ症候群
；カーニー複合；家族性アデノナムトスポリポーシス；若年性ポリポーシス症候群；バー
ト・ホッグ・デューク症候群；家族性肥大型心筋症；ウォルフ・パーキンソン・ホワイト
症候群；神経変性（Neurodegenarative）障害；滲出型および乾燥型黄斑変性；筋消耗（
萎縮、悪液質）またはミオパチー；細菌性またはウイルス性感染症；神経線維腫症あるい
はポイツ・ジェガース症候群である、請求項６または７に記載の使用。 - 哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患の治療または予防
に使用するための、請求項１または２に記載の薬学的組み合わせ。 - 請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容されるその塩および
少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤または薬学的に許容されるその塩を投与することによっ
て、ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）キナーゼ依存性疾患を治療または予防する
方法。 - 治療有効量の請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物または薬学的に許容される
その塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴＯ
Ｒ阻害剤による治療においてもたらされるＡＫＴのリン酸化および活性化に依存する増殖
性疾患を治療する方法。 - 治療対象の疾患が、良性または悪性腫瘍；脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、乳房、腎細胞
癌、神経内分泌腫瘍、前立腺、胃、胃腫瘍、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肺、膣も
しくは甲状腺の癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌もしくは結
腸直腸腺腫または頭頸部腫瘍、上皮過剰増殖、乾癬、前立腺肥大症、新形成、上皮性新形
成、リンパ腫、乳癌または白血病；臓器または組織移植拒絶反応；再狭窄；結節性硬化症
；カウデン病；リンパ脈管筋腫症；網膜色素変性；自己免疫疾患；ステロイド抵抗性急性
リンパ芽球性白血病；線維性疾患；肺高血圧症；免疫修飾；多発性硬化症；ＶＨＬ症候群
；カーニー複合；家族性アデノナムトスポリポーシス；若年性ポリポーシス症候群；バー
ト・ホッグ・デューク症候群；家族性肥大型心筋症；ウォルフ・パーキンソン・ホワイト
症候群；神経変性（Neurodegenarative）障害；滲出型および乾燥型黄斑変性；筋消耗（
萎縮、悪液質）またはミオパチー；細菌性またはウイルス性感染症；神経線維腫症あるい
はポイツ・ジェガース症候群である、請求項１１に記載の方法。 - 治療有効量の請求項１もしくは２に記載の式（Ａ）の化合物、または薬学的に許容され
るその塩をそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つのｍＴ
ＯＲ阻害剤による治療に耐性を持つようになったか、またはそれに対する感受性が低下し
た増殖性疾患を治療する方法。 - 請求項１または２に記載の式（Ａ）の化合物および少なくとも１つのｍＴＯＲ阻害剤を
含む組み合わせをそれを必要とする温血動物に投与するステップを含む、少なくとも１つ
のｍＴＯＲ阻害剤による増殖性疾患の標的の治療の有効性を改善する方法。
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