JP2016537989A5

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Publication number: JP2016537989A5
Application number: JP2016535001A
Authority: JP
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2018-01-11
Anticipated expiration: 2034-11-26

Claims

試料における第２の染色体または染色体遺伝子座と比べた第１の染色体または染色体遺伝子座の定量方法であって、
第１の一揃いのプローブ及び第２の一揃いのプローブに試料を接触させることであって、このとき第１の一揃いのプローブがそれぞれ第１の染色体または染色体遺伝子座内の別々の標的配列を特異的に認識し、第２の一揃いのプローブがそれぞれ第２の染色体または染色体遺伝子座内の別々の標的配列を特異的に認識することと、
第１及び第２の染色体または染色体遺伝子座における前記標的配列が少なくとも部分的に一本鎖である条件を提供することと、
前記プローブがその標的配列とハイブリッド形成し、ライゲーション産物を生成し、各ライゲーション産物がライゲーション接合部を含む核酸の環状物である、アニーリング及びライゲーションの条件を提供することと、
核酸の前記環状物のローリングサークル複製の条件を提供することと、
第１の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物から増幅される、第１のローリングサークル複製の産物の数を数えて、第１のカウントを提供することと、
第２の一揃いのプローブによって生成されるライゲーション産物から増幅される、第２のローリングサークル複製の産物の数を数えて、第２のカウントを提供することと、
第１及び第２のカウントを比較し、それによって前記試料における第１及び第２の核酸種属の相対量を決定することとを含む、方法。
第１の染色体が第２１染色体であり、第２の染色体が第１３染色体及び第１８染色体から選択される、請求項１に記載の方法。
一揃いのプローブが、それぞれ別々の標的配列を特異的に認識する少なくとも１，０００のプローブを含む、請求項１又は２に記載の方法。
一揃いのプローブが、それぞれ別々の標的配列を特異的に認識する少なくとも１０，０００のプローブを含む、請求項３に記載の方法。
前記の数を数える工程が、個々のローリングサークル増幅産物分子を互いから分離し、一定の面積または容積における個々のローリングサークル増幅産物分子の数を数えることによって行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記の数を数える工程が、
（ｉ）標識されたオリゴヌクレオチドをＲＣＡ産物分子とハイブリッド形成させることであって、このとき標識されたオリゴヌクレオチドがＲＣＡ産物において反復する配列とハイブリッド形成し、それによって、それぞれが、単一のＲＣＡ産物と、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドとを含む複数の複合体が生成されることと、
（ｉｉ）標識された複合体の数を数えること
によって行われる、請求項５に記載の方法。
前記の数を数える工程が、
（ａ）基材の表面上にばらまかれた標識された複合体を含む基材を得ることと、
（ｂ）基材の第１の領域に存在するＲＣＡ産物の数を数えること
によって実行される、請求項６に記載の方法。
前記ローリングサークル複製産物が、
（ａ）基材の表面上にばらまかれた複数の複合体を含む基材を得ることであって、このとき複合体のそれぞれが単一のＲＣＡ産物と、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する複数の標識されたオリゴヌクレオチドとを含み、第１ローリングサークル複製産物に相当する複合体と第２ローリングサークル複製産物に相当する複合体とが区別可能に標識されていることと、
（ｂ）基材の領域に存在する、第１のＲＣＡ産物の数を数えることと、別々に第２のＲＣＡ産物の数を数えること
によって、別々に数が数えられる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
ライゲーション産物が標的配列を含む核酸の環状物である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
試料が核酸の制限酵素消化物であり、標的配列が制限断片である、請求項９に記載の方法。
プローブがそれぞれ、
標的断片より長く、内部標的相補性配列を含有し、その結果、標的化オリゴヌクレオチドと前記標的断片との間でのハイブリッド形成が前記標的化オリゴヌクレオチドの上流及び下流の隣接配列の間に位置する二本鎖配列を形成する、標的化オリゴヌクレオチドと、
それぞれ遊離の５’及び３’末端を有し、それぞれ前記上流及び下流の隣接配列に対して相補性である、頭部及び尾部の配列
とを含み、
アニーリング及びライゲーションの条件下では、前記頭部及び尾部の配列は前記隣接配列とハイブリッド形成し、前記標的配列は、存在するならば、前記標的相補性配列とハイブリッド形成し、それによって前記頭部配列の５’末端と前記尾部配列の３’末端に並置して前記標的配列の末端を位置付け、前記標的断片の３’末端は前記頭部配列の５’末端にライゲーションされて第１のライゲーション接合部を形成し、前記標的断片の５’末端は前記尾部配列の３’末端にライゲーションされて第２のライゲーション接合部を形成し、前記頭部及び尾部の配列と前記標的断片を含む核酸の連続する鎖を含む二重ライゲーションの産物を生じ、前記連続する鎖は環状物である、請求項１に記載の方法。
試料が妊娠女性の血液に由来する胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡの混合物を含有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。