JP2016530532A - 腎疾患の検出方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、腎疾患、および腎疾患に関連する死亡率の決定、診断、進行、および予後の方法および機器に関する。本開示は、動物において、腎機能を決定する、特に、糸球体濾過量（ＧＦＲ）を推定する方法を含む。ＧＦＲは、腎疾患または腎機能障害の診断および治療に有用である可能性がある。種々の態様において、本開示は、糸球体濾過量および腎疾患を決定するための、動物、特に、ネコおよびイヌからの血液サンプル中の遊離型対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）およびクレアチニンの使用に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１３年９月５日に出願した米国仮特許出願第６１／８７４，０１１号の利益を主張するものである。

本開示は、一般に、腎機能の決定に関する。より詳細には、本開示は、糸球体濾過量を推定する、ならびに、腎疾患の進行を診断、予測および決定する方法に関する。

腎機能を迅速かつ正確に測定できることは重要である。例えば、薬の投薬は、腎不全患者に適したものでなければならない。したがって、腎機能を正確に評価することは、臨床医学において必要なことである。しかし、腎不全の診断は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の確実なマーカー、および／または利用可能な診断試験の欠如によって妨げられる。広く使用されているＧＦＲ測定法は、イヌリンクリアランスであるが、この試験は、煩雑で費用がかかり、そのことは、臨床診療におけるその有用性を本質的に低下させる。これは、ラジオアイソトープクリアランス試験にもあてはまる。したがって、臨床診療においては、腎機能を評価するために、通常、血清クレアチニンが使用される。しかし、血清クレアチニンの使用は、データが比較的大きく変動しうるので、不正確さを欠点として持つ。

したがって、本発明者らは、当分野における、正確さが増した腎機能評価方法の必要性を認識している。

一態様において、本開示は、動物対象における糸球体濾過量（ＧＦＲ）を推定する方法に関する。該方法は、対象からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度を測定すること、およびクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積を含む方程式から得られる値を、動物対象における糸球体濾過量と相関がある１つまたは複数の標準値と比較することを含む。

本明細書に記述する方法の種々の例示的実施形態において、方程式は、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を含む。また、クレアチニンの濃度および／または遊離型ＳＤＭＡの濃度は、計算で重み付けをすることができる。比較するステップは、マイクロプロセッサーを使用して行うことができる。該方法はまた、対象におけるＧＦＲを、１または複数の健康な対象におけるＧＦＲと比較することによって、腎機能、腎疾患または腎機能障害を決定することも含む。

さらに別の実施形態において、本開示は、動物対象における腎疾患または腎機能障害を診断する方法に関する。該方法は、対象からの血清中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、対象からの血清中のクレアチニンの濃度を測定すること、ならびにクレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積を、腎疾患または腎機能障害と相関がある１つまたは複数の標準値と比較することを含む。

特定の例示的実施形態において、クレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積は、式ＰＲＯＤ＝（ＣＲＥ）^P×（ＳＤＭＡ）^Qによって表され、式中、ＰＲＯＤは、積であり、ＣＲＥは、クレアチニンの濃度であり、ＳＤＭＡは、ＳＤＭＡの濃度であり、Ｐは、式中のＣＲＥに与える重みを示し、Ｑは、式中のＳＤＭＡに与える重みを示す。１つまたは複数の標準値は、積の逆数と相関があってもよい。

本開示のさらなる態様は、動物対象における腎疾患または腎機能障害の診断に関連する値を算出する方法に関する。該方法は、対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、対象からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積を算出するための機械読み取り可能な命令を実行することを含む。

さらなる態様において、本開示は、個体が腎疾患を有するかどうかを決定する方法に関する。該方法は、個体からの血清サンプル中のＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］およびクレアチニンの濃度［ＣＲＥ］を測定すること、［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT比を算出すること、［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUT比を算出すること、組合せ値：Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUTを算出すること、およびＣがＣ_CUTよりも大きい場合、個体が腎疾患を有すると決定することを含み、式中、ＳＤＭＡ_CUTは、ＳＤＭＡのカットオフ値であり、ＣＲＥ_CUTは、クレアチニンのカットオフ値であり、Ｃ_CUTは、組合せ値のカットオフ値である。

本開示による１つの方法は、個体が腎疾患を有するかどうかを決定することを含む。該方法は、個体からの血清サンプル中のＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］およびクレアチニンの濃度［ＣＲＥ］を測定すること、［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT比を算出すること、［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUT比を算出すること、組合せ値：Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUTを算出すること、およびＣがＣ_CUTよりも大きい場合、個体が腎疾患を有すると決定することを含み、式中、ＳＤＭＡ_CUTは、ＳＤＭＡのカットオフ値であり、ＣＲＥ_CUTは、ＣＲＥのカットオフ値であり、Ｃ_CUTは、組合せ値のカットオフ値である。

さらに、本開示は、動物対象における早期死亡を予測する方法に関するものであり、該方法は、対象からの血清中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、対象からの血清中のクレアチニンの濃度を測定すること、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比を算出すること、および、その比がカットオフ値を超える場合、個体が早期死亡すると決定することを含む。

一実施形態において、本開示は、腎疾患に関連する死亡率を決定する方法に関する。該方法は、患者、例えば、イヌ類またはネコ類からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡを測定すること、および、患者が閾値よりも高い血中ＳＤＭＡ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定することを含む。該方法は、血液サンプル中のクレアチニンを測定し、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比を算出するステップをさらに含んでいてもよく、ここで、患者が閾比率よりも高い血中［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有する。

別の態様において、本開示はまた、動物対象における腎機能を決定するための装置に関する。該装置は、ＳＤＭＡ類似体、または非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ−アルギニンおよびＮ−メチルアルギニンから選択される１つもしくは複数の化合物と交差反応性を有しないもしくは実質的に有しないＳＤＭＡに特異的な抗体を結合させた第１の固相；ならびにクレアチニン検出試薬またはクレアチニンに特異的な抗体を結合させた第２の固相を含む。

さらなる態様において、本開示は、動物対象における腎機能を決定するためのキットに関する。該キットは、１種または複数のクレアチニン検出試薬、および１種または複数のＳＤＭＡ検出試薬を含み、動物からの１つまたは複数の血液サンプル中のクレアチニンの濃度とＳＤＭＡの濃度との積に基づく、腎機能に関連する１つまたは複数の標準値のセットを含んでいてもよい。

さらに、本開示は、実行時にクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を計算する、ソフトウェア命令を含む記憶装置を有するコンピューティング装置に関する。記憶装置はまた、計算の結果を、動物対象における糸球体濾過量を表す１つまたは複数の標準値と比較するためのソフトウェア命令を含むこともできる。

添付図面は、本開示をさらに理解するために含まれるものであり、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本開示の実施形態を図示し、詳細な説明と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。本発明の構造的詳細を、本発明および本発明を実施しうる様々な方法の基本的理解に必要とされうる以上に詳細に示すそうとするものではない。

ＳＤＭＡを検出するＥＬＩＳＡ法の結果を、質量分析法と比較したグラフである。 健康なイヌおよび癌、心疾患または心腎臓疾患を有するイヌにおけるＳＤＭＡ濃度のプロットである。横棒は、カットオフ値（健康なイヌの集団の平均ＳＤＭＡ濃度＋２標準偏差として決定した）を表す。 健康なネコおよび腎疾患または癌を有するネコにおけるＳＤＭＡ濃度のプロットである。横棒は、カットオフ値（健康なネコの集団の平均ＳＤＭＡ濃度＋２標準偏差として決定した）を表す。 実施例に記述したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍゲル濾過カラムからのＳＤＭＡシスタミドタンパク質コンジュゲート（タンパク質は、ＫＬＨ（◆）またはＢＳＡ（■）である）の溶出についての画分番号に対する２８０ｎｍでの吸光度のプロットである。 実施例６に記述したイヌ血清サンプルのセットについてのクレアチニン濃度対ＧＦＲのプロットである。 実施例６に記述したイヌ血清サンプルのセットについてのＳＤＭＡ濃度対ＧＦＲのプロットである。 実施例６に記述したイヌ血清サンプルのセットについての［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］対ＧＦＲのプロットである。 実施例６に記述したイヌ血清サンプルのセットについてのクレアチニン対ＧＦＲ、１／ＳＤＭＡ対ＣＧＦ、および１／［クレアチニン^0.37］^*１／［ＳＤＭＡ^0.43］対クレアチニンの、直線のあてはめを使用したプロットを示す。 実施例７に記述したネコ血清サンプルのセットについてのＳＤＭＡ濃度対ＧＦＲのプロットである。 実施例７に記述したネコ血清サンプルのセットについてのクレアチニン濃度対ＧＦＲのプロットである。 実施例７に記述したネコ血清サンプルのセットについての［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］対ＧＦＲのプロットである。 実施例７に記述したネコ血清サンプルのセットについての［クレアチニン］対ＧＦＲ、１／ＳＤＭＡ対ＣＧＦ、および１／［クレアチニン^1.2］^*１／［ＳＤＭＡ^0.39］対クレアチニンの、直線のあてはめを使用したプロットを示す。 腎疾患を決定する方法における感度および特異度の向上を示すグラフである。 イヌにおけるＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）とクレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）との間の相関関係を示す。 ネコの集団における血清中のクレアチニンおよびＳＤＭＡ濃度を示す。 数年にわたるネコにおける血清中のクレアチニンおよびＳＤＭＡ濃度を示す。 数年にわたるネコにおける血清中のクレアチニンおよびＳＤＭＡ濃度を示す。 数年にわたるネコにおける血清中のクレアチニンおよびＳＤＭＡ濃度を示す。 血清中のＳＤＭＡ濃度が１４μｇ／ｄＬ未満であるネコは、濃度が１４μｇ／ｄＬより高いネコよりも約１．６倍長く生存することを示すカプラン−マイヤー生存曲線である。 血清中のＳＤＭＡ濃度が１４μｇ／ｄＬ未満であるイヌは、濃度が１４μｇ／ｄＬより高いイヌよりも約２．６倍長く生存することを示すカプラン−マイヤー生存曲線である。

それの種々の態様において、本開示は、腎疾患および腎疾患に関連する死亡率の決定、診断、進行、および予後に関する。本開示は、動物において、腎機能を決定する、特に、糸球体濾過量（ＧＦＲ）を推定する方法を含む。ＧＦＲは、腎疾患または腎機能障害の診断および治療に有用である可能性がある。

種々の態様において、本開示は、糸球体濾過量および腎疾患を決定するための、動物、特に、ネコおよびイヌからの血液サンプル中の遊離型対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）およびクレアチニンの使用に関する。一態様において、動物からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積は、ＧＦＲおよび腎疾患と相関がある可能性がある。例えば、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数（例えば、１／［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）が使用され、意外なことに、どちらかの測定のみの使用よりも、糸球体濾過量の測定についてはるかに高い正確さをもたらす。したがって、本開示は、動物対象からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの濃度の測定；動物対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度の測定；およびクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を、動物対象における糸球体濾過量の１つまたは複数の標準値と比較することによる、動物対象の糸球体濾過量の決定方法を含む。本開示の他の態様は、本明細書に記述する腎疾患の決定のための、ＳＤＭＡ濃度単独の、またはＳＤＭＡ濃度とクレアチニン濃度との比におけるＳＤＭＡ濃度の使用を含む。

ＳＤＭＡは、内因性一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害物質である非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）の構造異性体である。ＡＤＭＡもＳＤＭＡも、Ｌ−アルギニン残基の核内メチル化から生じ、タンパク質分解後、細胞質中に放出される。ＳＤＭＡは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）およびＰＲＭＴ７によって産生される。メチルアルギニン、例えば、ＳＤＭＡ、モノメチルアルギニン、およびＡＤＭＡを有するタンパク質は、ＲＮＡプロセッシング、タンパク質シャトリング、およびシグナル伝達に関与する（ＢｅｄｆｏｒｄおよびＲｉｃｈａｒｄ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００５年、４月２９日、１８（３）：２６３〜７２）。そのようなメチル化タンパク質の分解から生じた遊離型ＳＤＭＡは、主に、腎排泄によって排出されるのに対して、ＡＤＭＡは、大部分は代謝される。ＡＤＭＡは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）のリスク因子、例えば、高血圧、高コレステロール血症、高ホモシステイン血症、インスリン抵抗性、年齢、および平均動脈圧と強く相関する。ＳＤＭＡは、腎機能のパラメーター、例えば、糸球体濾過量（ＧＦＲ）、イヌリンクリアランス、およびクレアチニンクリアランスと相関する。

したがって、本開示の一態様は、血清中の遊離型ＳＤＭＡの濃度とクレアチニン濃度の両方の値を使用することによって、動物対象の糸球体濾過量を推定する方法に関する。その値の積の逆数（例えば、１／［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）は、クレアチニンまたはＳＤＭＡの濃度のみよりも正確にＧＦＲと直線的に相関する。

多くの用語を以下に定義する。

Ａｂは、抗体である。

ＡＤＭＡは、非対称性ジメチルアルギニンである。ＡＤＭＡの構造は、

である。

ＢＵＮは、血中尿素窒素である。

ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンである。

ＣＭＩＡは、化学発光磁気免疫アッセイである。

ＤＣＭは、ジクロロメタンである。

ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。

ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。

ＥＩＡは、酵素免疫アッセイである。

ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着アッセイである。

ＥＭＩ−ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。

ＦＰＩＡは、蛍光偏光免疫アッセイである。

ＧＦＲは、糸球体濾過量である。

ＨＡＴＵは、（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウランヘキサフルオロホスフェートメタナミニウムである。

ＫＬＨは、キーホールリンペットヘモシアニンである。

ＭＥＩＡは、微粒子酵素免疫アッセイである。

ＮＯＳは、一酸化窒素合成酵素である。

ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水である。

ＲＩＡは、放射免疫アッセイである。

ＳＤＭＡは、対称性ジメチルアルギニンである。ＳＤＭＡの構造は、

である。

遊離型ＳＤＭＡは、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡを指す。ＳＤＭＡの１つまたは複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドに存在しうる。

ＳＬＥは、全身性エリテマトーデスである。

ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸である。

アルギニンの構造は、

である。

Ｎ−ＭＭＡは、Ｎ−モノメチルアルギニン、または単純にＮ−メチルアルギニンである。Ｎ−モノメチルアルギニンの構造は、

である。

用語「類似体」は、本明細書で使用する場合、概して、１つまたは複数の個々の原子が異なる原子（複数可）または異なる官能基（複数可）で置きかえられた化合物を指す。例えば、類似体は、受容体に対する分析物と競合できる、分析物の変更形態であってもよく、変更は、分析物が別の部分、例えば、標識または固体担体に結合する手段を与える。分析物類似体は、分析物と同じように抗体に結合することができる。

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原への曝露に反応して、Ｂリンパ球細胞により産生される糖タンパク質を指し、その抗原に特異的に結合する。用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、詳細には、それは、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、複数特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。

本明細書で使用する場合、「抗ＳＤＭＡ」、「抗ＳＤＭＡ抗体部分」、もしくは「抗ＳＤＭＡ抗体フラグメント」および／または「抗ＳＤＭＡ抗体変異体」などは、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、例えば、限定されないが、重鎖または軽鎖定常領域の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域、またはその任意の一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。

用語「抗体フラグメント」は、本明細書で使用する場合、完全長の抗体の一部分、概して、その抗原結合または可変領域を指す。詳細には、例えば、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントからの複数特異性抗体を挙げることができる。

用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原に特異的な抗体と適切な条件下で反応することができる物質を指す。

用語「分析物」は、本明細書で使用する場合、概して、検出および／または測定されるサンプル中の物質または物質のセットを指す。

用語「動物」は、本明細書で使用する場合、概して、任意の動物、例えば、ヒト、またはヒト以外の動物、例えば、ネコ、イヌ、またはウマを指す。

用語「血液サンプル」は、本明細書で使用する場合、概して、それらに限定されないが全血、血漿、および血清を含めた任意の血液由来の流体サンプルを指す。本開示の方法で使用する血清を用意するために、１つまたは複数の血清サンプルは、動物対象から得られる。血清サンプルを、例えば、血液サンプルとして動物対象から得ることができ、次いで、分離して血清を用意することができる。ある種の実施形態において、血清は、血液から分離することなく測定することができる。当業者が理解する通り、単一で得られたサンプルを、両方の濃度を測定するために分ける、または使用することができる。あるいは、複数のサンプルを動物対象から得ることができ、（少なくとも）１つのサンプルは、クレアチニン濃度について測定され、（少なくとも）１つのサンプルは、遊離型ＳＤＭＡ濃度について測定される。ある種のそのような場合において、サンプルは、ほぼ同時（例えば、互いに６０分以内、３０分以内、または１０分以内）に動物から得られる。

用語「交差反応性」は、本明細書で使用する場合、概して、抗体の個々の抗原結合部位の、２つ以上の抗原決定基と反応する能力、または抗体分子の集団の、２つ以上の抗原と反応する能力を指す。一般に、交差反応は、（ｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原と共通のエピトープを共有すること、または（ｉｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原上のエピトープと構造的に類似するエピトープを有すること（複数特異性）を理由にして起こる。

用語「免疫アッセイ」は、本明細書で使用する場合、概して、測定可能な反応を生じさせる抗体抗原複合体を用いる検定を指す。「抗体抗原複合体」を、用語「免疫複合体」と互換的に使用することができる。一般に、免疫アッセイとしては、非競合型免疫アッセイ、競合型免疫アッセイ、均一系免疫アッセイ、および不均一系免疫アッセイが挙げられる。「競合型免疫アッセイ」において、試験サンプル中の標識されていない分析物（または抗原）は、免疫アッセイにおいて、標識されている抗原と競合する能力によって測定される。標識されていない抗原は、標識されている抗原の結合能力を妨げる。なぜなら、抗体の結合部位がすでにふさがれているからである。「競合型免疫アッセイ」において、試験サンプルに存在する抗原の量は、標識から生じるシグナルの量と逆の関係にある。反対に、「サンドイッチ型」免疫アッセイとしても知られる「非競合型免疫アッセイ」において、分析物は、特異性の高い２つの抗体試薬の間に結合して、複合体を形成し、抗原の量は、その複合体に関連するシグナルの量に正比例する。結合した抗体抗原複合体の分離を必要とする免疫アッセイは、一般に、「不均一系免疫アッセイ」と呼ばれ、抗体抗原複合体の分離を必要としない免疫アッセイは、一般に、「均一系免疫アッセイ」と呼ばれる。当業者は、様々な免疫アッセイの形態を容易に理解するであろう。

用語「免疫複合体」は、本明細書で使用する場合、概して、補体結合を伴ってまたは伴わずに抗原と抗体分子との結合により形成される複合体を指す。抗体または抗原のどちらか一方が標識された場合、抗原と抗体との結合の結果として、標識は、免疫複合体と関連する。したがって、抗体が標識された場合、結合の結果として、標識は、抗原と関連するようになる。同様に、抗原が標識された場合（例えば、標識を有する分析物類似体）、抗原と抗体との結合の結果として、標識は、抗体と関連するようになる。

用語「標識」は、本明細書で使用する場合、（例えば、共有結合もしくは非共有結合で、単独で、または被包化されて）本開示の抗体、ＳＤＭＡ類似体または抗原と直接または間接的にコンジュゲートさせることができる、検出可能な化合物、組成物、または固体担体を指す。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）であってもよいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。本開示で用いる標識は、それらに限定されないが、アルカリホスファターゼ；グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、例えば、イソルミノール、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）例えば、フルオロセインおよびローダミン化合物；リボザイム；ならびに色素でありうる。標識はまた、それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｅｎａｔｅ）、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）であってもよい。標識は、別の分子または固体担体に結合してもよく、標識された分子の検出を可能にする特性で選択される。標識の利用は、電磁放射または直接可視化の検出などの手段によって検出することができ、場合により、測定することができるシグナルをもたらす。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一である）から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。それに対して、異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を指すだけであり、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。詳細には、例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法によって作製されてもよいし、公知の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、概して、ペプチド結合でつながったアミノ酸配列を有する分子を指す。この用語は、タンパク質、融合タンパク質、オリゴペプチド、環状ペプチド、およびポリペプチド誘導体を含む。抗体および抗体の誘導体を、別の段落ですでに述べたが、抗体および抗体の誘導体を、本開示の目的のために、ポリペプチドおよびポリペプチド誘導体のサブクラスとして取り扱う。

用語「固体担体」は、本明細書で使用する場合、本開示の抗体またはＳＤＭＡ類似体が付着できる非水性マトリクスを指す。固体担体の例としては、ガラス（例えば、多孔質ガラス）、合成および天然ポリマー、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン、磁気粒子、ラテックス粒子、クロマトストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、または結合した抗原および／または抗体を結合されていない材料から洗浄もしくは分離させることができる任意の他の物質で部分的または全体的に形成される担体が挙げられる。ある種の実施形態において、適用に応じて、固体担体は、アッセイプレートのウェルである場合もあるし、精製カラム（例えば、親和クロマトグラフィーカラム）である場合もある。

「受容体」は、分子の特定の空間的および極性組織、例えば、エピトープまたは決定部位を認識できる任意の化合物または組成物を指す。受容体の例としては、抗体、Ｆａｂフラグメントなどが挙げられる。

「結合特異性」または「特異的結合」は、第１の分子の第２の分子への実質的な認識、例えば、ポリペプチドと、ポリペプチドに特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント）を指す。例えば、「特異性」は、本明細書で使用する場合、概して、個々の抗体結合部位の、たった１つの抗原決定基と反応する能力、または抗体分子の集団の、たった１つの抗原と反応する能力を指す。一般に、抗原−抗体反応においては、高度な特異性が存在する。抗体は、（ｉ）抗原の一次構造、（ｉｉ）抗体の異性形態、ならびに（ｉｉｉ）抗原の二次および三次構造における違いを区別することができる。高い特異性を示す抗体−抗原反応は、低い交差反応性を示す。

「実質的な結合」または「実質的に結合する」は、特定のアッセイ条件下でのアッセイ混合物における分子間の特異的結合または認識の程度を指す。最も広い態様において、実質的な結合は、分子の相対濃度、ならびにインキュベーションの時間および温度を含む特定のセットのアッセイ条件下で、第１の分子が第２の分子と結合するまたは第２の分子を認識する能力の欠如と、第１の分子が第３の分子と結合するまたは第３の分子を認識する能力との差に関係しており、この差は、特異的な結合を区別する意味あるアッセイの実施を可能にするのに十分である。別の態様においては、交差反応という意味において、１つの分子は、別の分子と結合するまたは別の分子を認識する能力が実質的に欠如し、ここでは、特定のセットのアッセイ条件下で、第１の分子が第２の分子について、第３の分子に対して示す反応性の２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の反応性を示す。特異的な結合は、広く知られている多くの方法、例えば、免疫組織化学アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタン・ブロットアッセイを使用して試験することができる。

用語「塩」は、本明細書で使用する場合、酸と化合物の塩基性官能基との間に形成される塩を意味する。塩の例としては、それらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））が挙げられる。用語「塩」はまた、酸性官能基、例えば、カルボン酸官能基を有する化合物と、無機または有機塩基との間に形成される塩も指す。適切な塩基としては、それらに限定されないが、アルカリ金属、例えば、ナトリウム、カリウムおよびリチウムの水酸化物；アルカリ土類金属、例えば、カルシウムおよびマグネシウムの水酸化物；他の金属、例えば、アルミニウムおよび亜鉛の水酸化物；アンモニア、および有機アミン、例えば、非置換またはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリアルキルアミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン）、例えば、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；ならびにアミノ酸、例えば、アルギニン、リシンなどが挙げられる。

本明細書に記述するある種の方法において、動物対象の糸球体濾過量は、動物対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡとの積を考慮する方程式の結果を比較することによって決定される。例えば、ＧＦＲを決定するために、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を、動物対象における糸球体濾過量と相関がある１つまたは複数の標準値と比較することができる。下記の実施例６でより詳細に記述した通り、ＧＦＲと、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数との間に直線関係が存在する。したがって、当業者は、（例えば、同じ種またはタイプの他の動物を使用して）動物対象について、ＧＦＲと１／（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）間の線形方程式を立てることができ、その方程式を使用して、測定した濃度の積の逆数との比較のための標準値を与えることができる。当業者が理解する通り、標準値との比較は、方程式を使用して１／（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）の値からＧＦＲを算出することのみを含む。あるいは、公知のＧＦＲ値のセットに対してクレアチニンおよび遊離型ＳＤＭＡの濃度の積の逆数の標準値のセットを決定することができ、動物対象のＧＦＲを、クレアチニンおよび遊離型ＳＤＭＡの測定された濃度の積の逆数を、標準値と比較することによって決定することができる。ある種の実施形態において、決定ステップは、クレアチニンおよび遊離型ＳＤＭＡの濃度の積の逆数を、方程式、または１つもしくは複数の標準値と比較するようプログラムされたマイクロプロセッサーを使用して行うことができる。マイクロプロセッサーは、通常、実行時にオペレーターまたは検出装置からの入力に基づいて、方程式を計算して比較を行う機能を実施するソフトウェア命令を含む記憶装置を含んだコンピューティング装置の構成部分である。

当業者が理解する通り、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数と、糸球体濾過量と相関がある、積の逆数についての１つまたは複数の標準値との比較は、そのような比較と数学的に等価な数値比較も含む。例えば、｛定数×（１／（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］））｝および／または［定数×ＧＦＲ］を代表する値を使用する比較も企図する。例えば、比較は、積のみ（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）に基づいて達成することができる。加えて、当業者は、商（１／（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］））の分母および／または分子に係数を入れることが、ＧＦＲとのその関係の強さを変えないことを理解するであろう（例えば、２／（［ＳＤＭＡ］［クレアチニン］）、１／（２［ＳＤＭＡ］［クレアチニン］）または５／（３［ＳＤＭＡ］［クレアチニン］））。同様に、（［クレアチニン］［ＳＤＭＡ］）と１／ＧＦＲとの関係も企図する。

別の態様において、本開示は、以下の式
ＧＦＲ≒１／（ＣＲＥ×ＳＤＭＡ）
を使用してＧＦＲを推定することに関する。

実験結果に基づき、この式は、約０．８３４７の相関係数（Ｒ２乗）を有する。方程式を、以下
ＧＦＲ≒（ＣＲＥ）^P×（ＳＤＭＡ）^Q
の通り、導き出した場合、相関係数を最大にする累乗指数（ＰおよびＱ）は、Ｐ≒−１．５５１１０２、およびＱ≒−０．２２０４４０９である。この累乗指数のセットについてのＲ２乗は、０．９１１６である。当業者に理解される通り、ＰおよびＱは、相関係数を最大にするように調整できる重み付け係数である。

累乗指数をわずかに変えることは、Ｒ２乗に大きく影響を与えるようではない。例えば、Ｐ＝−１．５であり、Ｑ＝−０．２５である場合、Ｒ２乗は、０．９１１４である。簡単にすると、ＧＦＲ値と関係するクレアチニンおよびＳＤＭＡの値の理想の累乗変換は、
ＧＦＲ≒（ＣＲＥ）^-1.5×（ＳＤＭＡ）^-0.25
という形式をとる。

種々の実施形態において、重み付け係数ＰおよびＱは、さらに調整することができる。例えば、Ｐは、約−５から約０未満（例えば−０．０１）まで変動することができる。換言すると、Ｐは、約−５から、−５と０の間の任意の値まで変動することができるが、０を含まない。特定の非限定例において、Ｐは、約−４．０から−０．１、約−３．０から−０．５、約−２．０から−１．０、および約−１．０から０まで変動することができるが、０を含まない。独立に、Ｑは、−２．５から約０（例えば、−０．０１）まで変動することができる。換言すると、Ｑは、約−２．５から、−２．５と０の間の任意の値まで変動しうるが、０を含まない。特定の非限定例において、Ｑは、約−２．０から０．１、約−１．５から−０．１５、約−１．０から−０．２、約−１．５から−０．５、約−１．２から−０．８、および約−１．０から０まで変動することができるが、０を含まない。

ある種の実施形態において、糸球体濾過量は、動物対象の腎機能を決定するために使用される。例えば、糸球体濾過量は、動物対象における腎疾患または腎機能障害を診断するために使用することができる。腎疾患および腎障害（例えば、腎機能低下、腎不全、慢性腎疾患、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、および高血圧性腎疾患）は、ＧＦＲを含めた腎機能全体を低下させる傾向があり、本明細書に記述する方法を使用して診断することができる。例えば、疾患を有するまたは有すると疑われる動物における糸球体濾過量は、１つまたは複数の、例えば、健康な対象の集団における、糸球体濾過量と比較することができる。腎疾患および腎障害は、対象の糸球体濾過量が、健康な対象（複数可）の糸球体濾過量未満である場合に予測することができる。ある種の実施形態において、糸球体濾過量が、健康な同種の動物の集団の平均値よりも統計的に有意に低い場合（すなわち、［クレアチニン］^P［ＳＤＭＡ］^Qとの相関関係を使用して推定される）、腎疾患または腎機能障害を診断することができる。非限定例において、対象動物のＧＦＲは、健康な集団の平均ＧＦＲとの差が２標準偏差よりも大きい場合、健康な集団の平均ＧＦＲよりも統計的に有意に低い。

一態様において、本開示は、ＧＦＲまたは腎疾患もしくは腎機能不全と相関がある、方程式についての標準値の集積に関する。その集積は、図７に示す通り、方程式の値をＧＦＲと相関させる標準曲線に関連しうる。他の実施形態において、値または標準曲線は、腎疾患または腎機能障害に関連する。標準値は、医療提供者によって参照される表または図の形態、または本明細書に記述するコンピューティング装置に関連する機械読み取り可能な命令で表すことができる。

別の態様において、腎疾患または腎障害は、ＧＦＲを決定する中間ステップなしで、上記のクレアチニンの濃度とＳＤＭＡの濃度との積を含む方程式から診断することができる。したがって、値を出す方程式を使用して、その値を、疾患または機能障害に関連すると知られている標準値または標準値のセットと比較することができる。一態様において、計算は、参照試験所（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で行われ、方程式からの値は、医師、獣医師、または他の動物医療提供者に報告することができる。医療提供者は、その値を、腎疾患または腎機能障害と相関がある１つまたは複数の公知の値のセットと比較することができる。別の態様において、参照試験所は、例えば、コンピューティング装置で比較を行うことができ、最終結果を医師に報告することができる。

別の態様において、本開示は、動物から採取したサンプル、例えば、血清サンプル中のＳＤＭＡおよびクレアチニンの濃度と関連する値を組み合わせることによる、慢性腎疾患（ＣＫＤ）などの腎疾患または腎障害の診断に関する。式は、腎疾患を示す、サンプルの閾値濃度から得られるＳＤＭＡおよびクレアチニンのカットオフ値を使用する。カットオフまたは閾値濃度は、当分野で公知の通り、動物の集団のサンプルを抽出し、集団のＳＤＭＡおよびクレアチニンの濃度を疾患状態と関連付けることによって決定することができる。種々の実施形態において、ＳＤＭＡのカットオフ値（ＳＤＭＡ_CUT）は、約１０〜約２０μｇ／ｄＬであってもよく、より詳細には、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０μｇ／ｄＬであってもよく、さらに詳細には、約１４μｇ／ｄＬであってもよい。クレアチニンのカットオフ値は、約１．３〜約２．５ｍｇ／ｄＬ、または約１．７〜約２．８ｍｇ／ｄＬであってもよく、より詳細には、約１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７および２．８ｍｇ／ｄＬであってもよい。一度カットオフ値が決定されたら、ＳＤＭＡおよびクレアチニンのカットオフ値を比較した、患者のサンプル中のＳＤＭＡとクレアチニンの濃度の組合せを表す値（Ｃ）を、以下の式、Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUTで得ることができる。ＣがＣ_CUTよりも大きい場合、患者は、腎疾患と診断される。

Ｃ_CUTは、アッセイについての感度および特異度の最適な組合せを有する値を選択することによって決定される。図１３は、異なるＣ_CUT値が、特異度および／または感度にどのくらい影響を与えるかを示している。Ｃ_CUTは、腎疾患の検出についての所望の特異度および／または感度レベルを与えるように選択することができる。例えば、図１３に示すデータセットについて、検出の感度も特異度も、Ｃ_CUT＝１．６の場合、９０％を超える。通常、Ｃ_CUTより大きい値は、より高い特異度をもたらすが、より低い感度をもたらす。逆に、Ｃ_CUTより小さい値は、通常、より低い特異度をもたらすが、より高い感度をもたらすことになる。

本開示または、ＧＦＲを決定するための、または腎疾患または腎機能障害を診断するための上記の計算を行うコンピューティング装置に関する。該コンピューティング装置は、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度の積を含む方程式から値を実行時に算出するソフトウェア命令のための記憶装置を含む。

別の実施形態において、本開示は、患者または動物対象の時期尚早のまたは早期の死亡を予測するための予測方法に関する。該方法によれば、それぞれの正常なカットオフ値に対して、ＳＤＭＡ値が、ＣＲＥ値よりもはるかに高い程度に上昇するような、［ＳＤＭＡ］と［ＣＲＥ］との間の異常な不調和が存在する場合、ネコは、早期死亡のリスクが高い。一実施形態において、該方法は、血清中の［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比が、ある閾値Ｔよりも大きい場合、早期死亡の予測を与える。

例えば、［ＳＤＭＡ］が、μｇ／ｄＬ（マイクログラム／デシリットル）で表され、［ＣＲＥ］が、ｍｇ／ｄＬ（ミリグラム／デシリットル）で表される場合、Ｔは、約４から約１０の値（すなわち、約４μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ：１ｍｇ／ｄＬのクレアチニンから約１０μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ：１ｍｇ／ｄＬのクレアチニン）を仮定してもよい。種々の実施形態において、閾値Ｔは、約７から２０であってもよく、より詳細には、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であってもよい。当業者は、ＣＲＥおよび／またはＳＤＭＡの濃度が、上に示した単位と異なる測定単位で表された場合、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］の閾値が、該方法の趣旨および予測の有用性に影響を与えることなく、その都度かつ比例的に変化することができることを理解するであろう。

さらに、時期尚早の死亡のリスクは、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］の比の値の増加と共に増大しうる。例えば、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］＝４０を有する個体は、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］＝１２を有する個体よりも時期尚早の死亡のリスクが高い可能性がある。

加えて、［ＳＤＭＡ］の異常に突然の増加は、早期死亡のリスクの増大の兆候である。同様に、［ＳＤＭＡ］の異常に高い値は、早期死亡のリスクの増大の兆候である。例えば、ネコにおける［ＳＤＭＡ］の異常に高い値は、約２５μｇ／ｄＬ超、約３０μｇ／ｄＬ超、または約３０μｇ／ｄＬ超の値でありうる。

一態様において、本開示は、死亡率を予示する血清中ＳＤＭＡ濃度に関する。例えば、図１９および図２０に示す通り、１４μｇ／ｄＬより高い血清中ＳＤＭＡ濃度は、ネコおよびイヌの死亡率に関連していることを示している。したがって、本開示は、死亡率を最も予示する、適切なＳＤＭＡ濃度のカットオフ値を特定することに関する。一態様において、該カットオフ値は、約１０〜２０μｇ／ｄＬの範囲、より詳細には、約１２〜１８μｇ／ｄＬの範囲、または約１４〜１６μｇ／ｄＬの範囲にある。適切なカットオフ濃度の特定は、例えば、イヌまたはネコの群の各メンバーにおける血清中ＳＤＭＡの濃度を測定し、その群の各メンバーの死亡まで数か月または数年にわたって測定を繰り返すことによって決定することができる。場合により、その群におけるすべてのイヌまたはネコは、ＣＫＤと診断されている。ＳＤＭＡ濃度のカットオフ値、閾値の異なる候補が、生存期間の短縮を予示する能力について検定される。そのような検定は、例えば、カプラン−マイヤー生存曲線の使用によって行うことができる。

カプラン−マイヤー生存曲線は、死亡率の予測を表すのに使用することができる。カプラン−マイヤー曲線は、特に、すべての対象が、研究で継続しているわけではない場合に、異なる生存期間（事象までの期間）に対処する一般的方法である。各対象は、３つの変数、すなわち、彼らの連続時間、連続時間の最後（事象発生または打ち切り）での彼らの状態、彼らがいる研究群（例えば、ＳＤＭＡ＜１４または≧１４）によって特徴付けられる。事象は、通常、死亡、腫瘍の消滅などの臨床転帰である。研究の期間は、目的の事象が、開始時点から発生する可能性のある期間である。研究は、残りの参加者の結果が分からないとしても、すべての参加者がこの事象を示す前に終わる。図１９および図２０は、１４μｇ／ｄＬ未満の血清中ＳＤＭＡ濃度を有するネコおよびイヌが、１４μｇ／ｄＬ以上の濃度を有するネコおよびイヌよりも、（それぞれ、）約１．６倍および２．６倍長く生存することを示す、カプラン−マイヤー生存曲線である。別の態様において、本開示は、健康な動物および病気の動物におけるクレアチニンとＳＤＭＡとの比の決定の方法、ならびに腎疾患および腎疾患に関連する死亡率の決定のための、その比の使用に関する。例えば、健康な動物において、ＳＤＭＡの濃度（μｇ／ｄＬ）およびクレアチニンの濃度（ｍｇ／ｄＬ）は、一般に、約４：１から１０：１（μｇ／ｄＬ：ｍｇ／ｄＬ）の範囲の比である。しかし、一部の慢性腎疾患患者において、ＳＤＭＡ値は、対応するクレアチニン値よりもかなり大きく、そのことは、疾患の進行を示している可能性がある。したがって、ＳＤＭＡ：クレアチニン比の不調和は、動物の死亡率を予示する可能性がある。図１４に示す通り、ＳＤＭＡとクレアチニンとの間に強い相関関係が存在し、正常比は、１０未満（μｇ／ｄＬ：ｍｇ／ｄＬ）である。しかし、１０より大きい、ＳＤＭＡ濃度（μｇ／ｄＬ）とクレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）との比は、腎疾患の進行を示し、しばしば死につながる。

したがって、血清中のＳＤＭＡ濃度とクレアチニンの濃度との比の使用によって、疾患および／または死亡率が予測される。したがって、本開示は、腎疾患または腎疾患に関連する死亡を決定または予測することを含む。該方法は、動物、特に、ネコおよびイヌからの血液、例えば、血清サンプル中のＳＤＭＡおよびクレアチニンの濃度を決定することを含む。一度濃度が決定されたら、ＳＤＭＡとクレアチニンとの比をカットオフ比と比較して、腎疾患の存在、程度または進行、および腎疾患の結果としての死の可能性を決定することができる。カットオフ比は、約５〜１５（μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ：ｍｇ／ｄＬのクレアチニン）、より詳細には、約７〜１３または約９〜１１、さらに詳細には約１０でありうる。１０より大きいＳＤＭＡ：クレアチニン比を有する動物は、時期尚早の死亡の可能性が高いとみなされる。一般に、その比が大きくなるほど、差し迫った死の可能性が高くなる。例えば、図１５は、ネコの集団についてのＳＤＭＡ：クレアチニン比を示す。２匹のネコは、約１９および３４の比を有し、それぞれが、研究期間内に死亡した。図１６、図１７および図１８は、それらの比が、約１０より大きいと特定されてから約２年以内に死亡した３匹のネコの長期的な研究の結果を示す。これらのネコの１匹は、比が２０より大きいと特定されて約１か月以内に死亡した（図１８）。

一度腎疾患または腎機能障害と診断されたら、該方法は、腎疾患または腎機能障害の治療をその動物対象にすることを含むことができる。治療としては、例えば、透析、腎移植、抗生物質療法（例えば、腎機能障害が、潜在する感染によるものである場合）、療法食；潜在的な全身性炎症疾患、感染症、または腫瘍性疾患の治療（例えば、腎機能障害が、タンパク質漏出性腎症によるものである場合）；ホメピゾール（ｆｏｍｅｐａｚｏｌｅ）またはエタノールの投与（例えば、エチレングリコール中毒の場合）；ＡＣＥ阻害剤の投与、適度なタンパク制限食、および／またはω−３脂肪酸補給（例えば、タンパク尿症の場合）；リン吸着剤の投与および／またはリン制限食（例えば、高リン血症の場合）；ＩＶ輸液による治療、皮下輸液療法、低タンパク食、および／またはＨ₂受容体アンタゴニスト（例えば、高窒素血症の場合）；アムロジピン、アテノロール、および／またはＡＣＥ阻害剤（例えば、全身性高血圧の場合）；重炭酸塩および／またはクエン酸塩（例えば、アシドーシスについて）；ビタミンＤ類似体、例えば、カルシトリオールまたは１，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ）、リン吸着剤（好ましくは、Ｃａベースでない）の投与、および／またはリン制限食（例えば、腎性二次性上皮小体機能亢進症の場合）；および／またはＨ₂受容体アンタゴニストおよび／または遺伝子組換えヒトエリスロポエチンの投与（鉄分補給と共に可能）（例えば、貧血症の場合）を挙げることができる。

ある種の実施形態において、遊離型ＳＤＭＡの濃度は、参照によりそれら全体がそれぞれ本明細書に組み込まれる、２００８年８月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０８６，８７０、２００９年７月３０日に出願された米国特許出願第１２／５１２，４７９、および２０１０年２月１１日に公開された米国特許出願公開第２０１０／００３５２７４に記載されている、免疫学的な方法、装置およびキットを使用して決定される。該方法は、１種または複数のＳＤＭＡ類似体を含む対照、校正物質、または標準物質を含むことができる。特に、該方法は、それに限定されないが、マイクロプレートおよびラテラルフロー装置を使用することを含めて、当業者に周知の免疫アッセイ技術を使用することで達成することができる。ＳＤＭＡを検出するためにサンプルが得られる動物対象としては、ヒトおよびヒト以外の動物（例えば、伴侶動物、家畜など）対象が挙げられる。ＳＤＭＡの存在または量に関連する疾患状態の決定は、ヒト対象およびヒト以外の動物対象の両方について行うことができる。

固相アッセイ形式は、よく使用される結合アッセイ技術である。分析物の存在が、コンジュゲートおよび／または固定化された相補性結合メンバーへの分析物の結合によって示される、いくつものアッセイ装置および手順が存在する。１つの特定の態様において、固定化された結合メンバー（例えば、抗ＳＤＭＡ抗体）は、アッセイの間に、固相、例えば反応ウェル、ディップスティック、試験紙、フロースルーパッド、紙、ファイバーマトリクス、または他の適切な固体材料に結合する、または結合するようになる。サンプル中の遊離型ＳＤＭＡと固定化抗体との結合反応は、ある量のＳＤＭＡ類似体をサンプルに添加することによって決定され、ＳＤＭＡ類似体としては標識にコンジュゲートしたＳＤＭＡが挙げられる。サンプルとＳＤＭＡ類似体との混合物を固相に接触させた後、混合物および固相をインキュベートして、固定化抗体とＳＤＭＡとＳＤＭＡ類似体の間で結合させる。インキュベーション後、結合していない反応物は、固相から除去される。類似体への抗体の結合によって抗体と結び付いた標識の量が測定される。抗体に結び付いた標識の量は、サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの量に反比例する。

ＳＤＭＡに対する１つまたは複数の抗体の、装置または固体担体への固定化は、抗体が、サンプル、希釈剤および／または洗浄手順によって流されないように行われる。１つまたは複数の抗体は、物理的吸着によって（すなわち、化学リンカーの使用なしで）、または化学的結合によって（すなわち、化学リンカーを使用して）、表面に付着させることができる。化学的結合は、表面での抗体のより強い付着をもたらすことができ、表面結合分子の明確な配向および形態を与えることができる。

別の実施形態において、特定種において生じたＳＤＭＡ抗体は、固体担体に結合する抗種抗体との相互作用によって、固体担体に結合する。１つの特定の態様において、抗ＳＤＭＡ抗体は、ウサギにおいて生じさせ、担体は、ウサギにおいて生じた抗ＳＤＭＡ抗体を認識する、抗ウサギ抗体に結合している。この態様において、抗体は、その種から得られた抗血清の形態であってもよい。抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する前に、抗種抗体を有する固相に付けることもできるし、抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する前に、サンプルと混合させることもできる。どちらの場合でも、抗ＳＤＭＡ抗体は、固相上の抗種抗体への結合によって、固相に結合するようになる。

別の実施形態において、１つまたは複数の標識された抗体は、混合物を固体担体に付ける前に、試験サンプルと混合させることができる。この場合において、ＳＤＭＡ類似体は、サンプル、希釈剤および／または洗浄手順によって流されないように固体担体に付着させることができる。サンプル中の標識された抗体は、サンプル中のＳＤＭＡに結合し、したがって、固体担体でのＳＤＭＡ類似体と結合させるために利用することができない。混合物を固体担体に付けて、適切にインキュベートした後、混合物は、固体担体から洗浄される。サンプルのＳＤＭＡに結合していなかった抗体は、固体担体上のＳＤＭＡ類似体に結合することになる。サンプル中のＳＤＭＡの存在または量は、ＳＤＭＡ類似体に結合した抗体の量に反比例する。抗体上の標識に関連するシグナルは、適切な方法によって測定することができる。

図１は、ＳＤＭＡが混入されたプールされたイヌ血清中のＳＤＭＡを検出するＥＬＩＳＡ法と、質量分析を使用するＳＤＭＡ検出との比較を示す。示した通り、本明細書に記述するＥＬＩＳＡを使用して得られたＳＤＭＡ濃度値は、ＭＳを使用して得られたＳＤＭＡ濃度値と強く相関する。

抗体抗原複合体の検出は、当業者に周知の様々な手法、例えば、比濁法、酵素標識化、放射性標識、発光、または蛍光によって実現することができる。免疫アッセイ法は、当業者に公知であり、それらに限定されないが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、微粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩＡ）、酵素増幅免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）アッセイ、免疫濁度または凝集アッセイ、ラテラルフロー装置を含むコロイド金ベースの免疫アッセイ、および化学発光磁気免疫アッセイ（ＣＭＩＡ）を含むと理解されている。ＲＩＡにおいて、抗体または抗原は、放射能で標識され、競合または非競合形式で使用される。ＥＩＡにおいて、抗体または抗原は、基質を、測定される得られたシグナル、例えば、色の変化を有する産物に変える酵素で標識される。ＦＰＩＡにおいて、抗原は、蛍光標識で標識され、試料からの標識されていない抗原と競合する。測定される分析物の量は、測定されるシグナルの量に反比例する。ＭＥＩＡにおいて、固相の微粒子は、目的の抗原に対する抗体で被覆され、分析物を捕捉するために使用される。検出のための抗体は、ＥＩＡ法においてのように、酵素で標識される。測定される分析物の濃度は、測定されるシグナルの量に比例する。ＣＭＩＡにおいて、化学発光標識が、抗体または抗原へコンジュゲートされ、その基質と合わさった時に光を発生する。ＣＭＩＡは、競合または非競合形式に設定することができ、それぞれ、存在する分析物の量に反比例または正比例する結果をもたらす。

特異的結合アッセイにおける、試薬に浸漬した試験紙の使用も周知である。そのような手法において、試験サンプルは、試験紙の一部分に付けられ、試験紙材料を移動する、またはそれに吸いとられる。したがって、検出または測定される分析物は、試験サンプル自体でありうるまたは別個に添加される溶出液を恐らく利用して、前記材料中をまたは前記材料に沿って通過する。分析物は、分析物の相補性結合メンバーが固定化されている、試験紙上の捕捉部分または検出部分へと移動する。分析物が検出部分で結合する程度は、試験紙に組み込むこともできるまたは別個に付けることができるコンジュゲートを利用して決定することができる。一実施形態において、ＳＤＭＡに特異的な抗体は、離れた所で固体担体に固定化される。サンプルの添加後、固体担体でのＳＤＭＡ−抗体複合体の検出は、当分野で公知の任意の手段によるものでありうる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２６，０１０号は、ラテラルフロー装置の一例、ＳＮＡＰ（登録商標）免疫アッセイ装置（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を記載している。

他の検出技術は、磁気粒子またはマイクロビーズ、例えば、超常磁性酸化鉄に浸漬したポリマービーズを用いる。これらのビーズは、例えば、分析物の特異的な結合相手に結び付く。ビーズは、試験されるサンプル中の標的の分析物と結合し、次いで、通常、磁気によって溶液から単離または分離される。一度単離が行われたら、直接的に、光学的に、またはカメラによって、特定の画像かまたは標識を観察することを含む、他の試験を行うことができる。

さらなる実施形態において、ＳＤＭＡ類似体、特に、チオール含有、ヒドロキシル含有、アミノ含有、およびカルボキシレート含有ＳＤＭＡ類似体は、ＳＤＭＡを他の分子（コンジュゲートする標的）、例えば、活性化タンパク質と連結させることができ、ＳＤＭＡコンジュゲートを形成する。本明細書に記述するＳＤＭＡ類似体は、ＳＤＭＡを、コンジュゲートする標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、固体担体などに連結させることができ、ＳＤＭＡコンジュゲートをもたらす。本明細書に記述するＳＤＭＡコンジュゲートを使用して、ＳＤＭＡに特異的な免疫アッセイで使用する抗体を作ることができる。その抗体は、アルギニン、ＡＤＭＡおよび／またはモノメチルアルギニンとの交差反応性をほとんど有しない、または全く有しない。ＳＤＭＡ類似体は、ＳＤＭＡに特異的な免疫アッセイで使用する標識とコンジュゲートさせることもできる。

ＳＤＭＡ類似体は、例えば、以下の構造

（式中、ｘおよびｙは、１から５の範囲の整数である）
を有していてもよい。

一実施形態によれば、ＳＤＭＡ類似体は、以下の一般式

［式中、Ｒ₁は、チオール（もしくは保護チオール）、ヒドロキシル（もしくは保護ヒドロキシル）、アミノ（もしくは保護アミノ）基、またはカルボキシレート（カルボン酸を含む）もしくは保護カルボキシレート基であってもよい］
を有する。

適したチオール、ヒドロキシル、アミノおよびカルボキシレート保護基、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版（１９９９）に記述されているものは、当業者に公知である。

１つの特定の実施形態において、ＳＤＭＡ類似体は、式（３）の化合物

またはその塩である。式（３）の化合物は、適切な「チオール反応部位」、すなわち、チオール基と反応する部位を含む、コンジュゲートする標的と反応できる利用可能なチオールを与える。例えば、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アリール、ならびにα−ハロアシルは、チオールと反応してチオエーテルを形成することができる、例示的なチオール反応部位である。同様に、ピリジルジスルフィドは、チオールと反応して、混合ジスルフィドを形成することができる。

別の実施形態において、Ｒ₁は、Ｘ−Ｒ₂であり、式中、Ｘは、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ−、または−ＣＯＯ−であり、Ｒ₂は、チオール、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボキシレート反応性基を有する標識である。

一実施形態において、Ｒ₁は、Ｘ−Ｒ₂であり、式中、Ｘは、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｎ−、または−ＣＯＯ−であり、Ｒ₂は、チオール、ヒドロキシル、アミノ、またはカルボキシレート反応性基を含むように官能基を有させたタンパク質である。

一実施形態において、ＳＤＭＡは、キャリアタンパク質とコンジュゲートされ、「ハプテン−キャリア」免疫原を形成し、それを、ＳＤＭＡを含むエピトープへの免疫反応を刺激するために使用することができる。免疫原タンパク質の例としては、それらに限定されないが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、およびオボアルブミンが挙げられる。ハプテンを免疫原タンパク質とコンジュゲートするためのプロトコルは、当分野で公知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）７８〜８７頁を参照されたい）。

一実施形態において、ＳＤＭＡ類似体は、マレイミド活性化タンパク質、例えば、マレイミド活性化キーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートされる。

一実施形態において、式（３）の化合物は、マレイミド活性化タンパク質、例えば、マレイミド活性化キーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）またはマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートされる。

したがって、特定の実施形態において、式（３）の化合物とマレイミド活性化タンパク質とのコンジュゲートは、以下の式：

（式中、ｍは、整数である）
を有する。

典型的には、ｍは、５より大きい。しかし、ｍの値は、変えることができる。例えば、ｍは、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているマレイミド活性化ＢＳＡにおいて、タンパク質あたり約１５のマレイミド基であり；ｍは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨにおいて、タンパク質あたり約８０のマレイミド基であり；ｍは、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されているマレイミド活性化ＢＳＡにおいて、タンパク質あたり約１５から約２５の範囲のマレイミド基であり；ｍは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨにおいて、タンパク質あたり約４００より多いマレイミド基であり；ｍは、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＡ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているマレイミド活性化ＫＬＨにおいて、タンパク質あたり約１５０から約３００の範囲のマレイミド基である。一般に、ｍは、免疫原タンパク質に存在する利用可能なアミン基の数によって制限される。利用可能なアミンの数は、免疫原タンパク質をポリアミンとコンジュゲートすることによって増加しうる。

一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約１０より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約２５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約５０より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約７５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約５から約８０の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約７５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約１０から約８０の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約７５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約２０から約８０の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約７５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＢＳＡであり、ｍは、約３０から約８０の範囲にある。

一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５０より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約１００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約２００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約３００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約４００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約６００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約７００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約８００より大きい。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５から約８００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５から約６００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５から約４００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５から約２００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約５から約１００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約１００から約２００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約１００から約３００の範囲にある。一実施形態において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約１００から約４００の範囲にある。種々の態様において、タンパク質は、ＫＬＨであり、ｍは、約１００から約５００、約１００から約６００、約１００から約７００、約１００から約８００、または約１００から約１，０００の範囲にある。

式（３）の化合物とマレイミド活性化タンパク質とのコンジュゲートは、当業者に周知の方法を使用して、特徴付けすることができる（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｆｏｒ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ，ＫＬＨ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号ＭＢＫ１）を参照されたい）。

代替的実施形態において、ＳＤＭＡ類似体は、チオール、ヒドロキシル、アミノまたはカルボキシレート基を介して、検出可能な標識に連結される。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）であってもよいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）。標識は、それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）であってもよい。ＳＤＭＡは、当業者に周知の方法を使用して、検出可能な標識に連結させることができる。例として、ＳＤＭＡ類似体は、タンパク質１ｍｇあたり約２００ユニットより多い西洋ワサビの凍結乾燥粉末からのマレイミド活性化ペルオキシダーゼ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているもの（カタログ番号Ｐ１７０９）、製品マニュアルの指示に従って）に連結させることができる。

式（３）の類似体は、以下の図示的な合成スキーム（１）によりＳＤＭＡ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．から市販されている）から調製されてもよい。

ＳＤＭＡの一級および二級アミノ基は、ＳＤＭＡをジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（Ｂｏｃ₂Ｏ）と反応させることによって保護される。得られたｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）保護ＳＤＭＡ（（Ｂｏｃ₃）−ＳＤＭＡ、１）は、次いで、樹脂に連結させる。例えば、（Ｂｏｃ₃）−ＳＤＭＡ（１）は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウランヘキサフルオロホスフェートメタナミニウム（ＨＡＴＵ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下で、（Ｂｏｃ₃）−ＳＤＭＡ（１）をシステイン−４−メトキシ−トリチル樹脂（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．から市販されている）と接触させることによって、その樹脂と連結することができ、樹脂に結合した（Ｂｏｃ₃）−ＳＤＭＡシスタミド（ｃｙｓｔａｍｉｄｅ）（２）をもたらす。樹脂に結合した（Ｂｏｃ₃）−ＳＤＭＡシスタミド（２）上のＢＯＣ保護基を除去し、得られた、樹脂に結合したＳＤＭＡシスタミドは、例えば、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸を使用して、樹脂から切断され、ＳＤＭＡシスタミド（３）をもたらし、それは、塩酸との反応によって、塩酸塩（４）に変換された。

上記の式ＡからＤの類似体は、スキーム１に記述したのと同様な方法を使用して作製することができる。

次いでマレイミド活性化タンパク質を、ＳＤＭＡシスタミド（３）と反応させて、以下のスキームＩＩに記述するＳＤＭＡシスタミドタンパク質コンジュゲートがもたらされる：

（式中、ｎは、１から３の範囲の整数であり、ｍは、上記で定義した整数である）。

得られたコンジュゲートは、それらに限定されないが、カラムクロマトグラフィー、例えば、固体担体としてのＳｅｐｈａｄｅｘ（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む当業者に公知の方法を使用して、精製することができる。

ＡからＤの類似体のコンジュゲートは、スキーム２に記述したのと同様な方法を使用して作製することができる。

式ＡからＤの類似体とマレイミド活性化ＫＬＨまたはマレイミド活性化ＢＳＡとのコンジュゲートを免疫原として使用して、ＳＤＭＡと実質的に結合する抗体（すなわち、抗ＳＤＭＡ抗体）であって、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニンとの交差反応性を全くまたは実質的に示さない抗体をもたらすことができる。式（３）の類似体とマレイミド活性化ＫＬＨまたはマレイミド活性化ＢＳＡとのコンジュゲートを免疫原として使用して、ＳＤＭＡ（すなわち、抗ＳＤＭＡ抗体）と実質的に結合する抗体をもたらすことができる。そのような抗体は、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニンとの交差反応性を全くまたは実質的に示さない。

本開示の方法、装置、およびキットに有用な抗ＳＤＭＡ抗体は、ＡＤＭＡ、アルギニン、および／またはモノメチルアルギニンに対する交差反応性をほとんどまたは全く有することなく、ＳＤＭＡに高い親和性で結合することを特徴とする。したがって、本明細書に記述するのは、単離された、遺伝子組換えの、合成の、および／またはインビボで生成された抗ＳＤＭＡ抗体、ならびに、そのような抗体を作製および使用する方法であり、診断用および治療用の組成物、方法および装置を含む。本明細書に記述する抗ＳＤＭＡ抗体は、例えば、腎機能、例えば、腎機能低下、腎不全、糸球体濾過量（ＧＦＲ）、イヌリンクリアランス、およびクレアチニンクリアランスのマーカーとして、ならびに、腎障害／疾患、例えば、慢性腎疾患、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、および高血圧性腎疾患の診断用マーカーとして有用である。

一実施形態において、もたらされた抗体は、遊離型ＳＤＭＡ（すなわち、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡ）を検出することができ、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニンとの交差反応性を全くまたは実質的に示さない。実施例に示す通り、本明細書に記述する抗体は、等しい濃度の抗原に基づいて、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニンと１％未満の交差反応性を示す。当分野で一般に理解されている通り、交差反応性の影響は、試験サンプル中の免疫抗原（ＳＤＭＡ）と比較した、交差反応性抗原（例えば、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニン）の相対存在量に依存する。例えば、５０％ほどの高い交差反応性は、免疫抗原の濃度が、交差反応性抗原の濃度よりも１００倍高ければ、許容可能でありうる。逆に、１％ほどの低い交差反応性は、交差反応性抗原の濃度が、免疫抗原の濃度の１００倍であるならば、問題となりうる。したがって、交差反応性の影響は、分析されるサンプルにおける任意の交差反応性抗原および免疫抗原の相対存在量の文脈で考えなければならない。本開示の種々の態様において、交差反応性は、ＳＤＭＡまたはＳＤＭＡ類似体と抗ＳＤＭＡ抗体との実質的な結合に影響を与えない。

抗体を作製するための方法は、１つまたは複数のＳＤＭＡコンジュゲートを免疫原として使用して、免疫反応を刺激することを含むことができる。該方法は、適切な免疫化プロトコルを使用して、１つまたは複数のＳＤＭＡコンジュゲートを動物に投与すること、および、例えば、以下の実施例３に記述した通り、動物の体液（複数可）から適切な抗体を分離することを含む。あるいは、ＳＤＭＡコンジュゲートをファージディスプレイ法で使用して、それらの表面に適切な抗体を示すファージを選択することができ、その後、少なくとも適切な抗体の様々なドメイン領域をコードする核酸配列の分離が続く。ファージディスプレイ法は、当業者に周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ，１７８、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｐｈｉｌｉｐｐａ Ｍ．；Ａｉｔｋｅｎ，Ｒｏｂｅｒｔ（Ｅｄｓ．）２００２を参照されたい）。ＳＤＭＡに対するモノクローナル抗体は、当分野で一般に知られた方法によって、調製することができる。

本明細書に記述するＳＤＭＡ類似体は、受容体結合アッセイ、例えば、ＳＤＭＡの免疫アッセイで使用する検出可能なコンジュゲートを与えるために、標識に連結させることができる。同様に、抗ＳＤＭＡ抗体も、受容体結合アッセイ、例えば、ＳＤＭＡの免疫アッセイで使用する検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体を与えるために、標識に連結させることができる。ＳＤＭＡ類似体および抗ＳＤＭＡ抗体は、当業者に周知の方法を使用して、標識に連結させることができる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２９５、Ｒ．Ｂｕｒｎｓ編（２００５））。検出可能なＳＤＭＡコンジュゲートまたは検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体は、試験サンプル中のＳＤＭＡの存在または量に関係するシグナルを出すために、様々な均一系、サンドイッチ型、競合型、または非競合型アッセイ形式で使用することができる。

特定の実施形態において、免疫アッセイ法は、抗ＳＤＭＡ抗体の検出のための競合型免疫アッセイである。競合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行うことができる。動物の体液からの、潜在的に抗ＳＤＭＡ抗体を含有するサンプルは、固体担体とコンジュゲートしたＳＤＭＡ類似体、および検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体と接触させる。サンプルに存在する、目的の抗ＳＤＭＡ抗体は、固体担体とコンジュゲートしたＳＤＭＡ類似体との結合のために、検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体と競合する。固体担体と結び付いた標識の量は、結合していない抗体および固体担体を分離した後に決定することができる。代替的実施形態において、競合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行われる。動物の体液からの、潜在的に抗ＳＤＭＡ抗体を含有するサンプルは、検出可能な標識に連結したＳＤＭＡ類似体、次いで、固体担体とコンジュゲートした抗体と接触させる。サンプル中の抗ＳＤＭＡ抗体は、検出可能な標識に連結したＳＤＭＡコンジュゲートと結合するために、固体担体上の抗ＳＤＭＡ抗体と競合する。どちらの場合でも、得られたシグナルは、サンプルに存在する目的にＳＤＭＡ抗体の量と逆関係である。

もちろん、遊離型ＳＤＭＡを測定する他の方法を、本明細書に記述する方法に使用することができる。ＳＤＭＡ自体、疾患を予示することができる（図２および図３を参照されたい）。

血清中のクレアチニンの濃度は、当業者によって知られているように、様々な方法で測定することができる。例えば、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＡｎａｌｙｚｅｒまたはＶｅｔＴｅｓｔ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒは、クレアチニンの試験に適応するドライスライド、例えば、ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されているものと共に使用することができる。他の分析装置およびスライド、例えば、Ｏｒｔｈｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なＶＩＴＲＯＳ（商標）９５０分析装置およびＶＩＴＲＯＳ（商標）ＣＲＥＡスライドも使用することができる。酵素湿式アッセイ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｗｅｔ ａｓｓａｙ）も使用することができる。例えば、当業者は、Ｉｎｔｅｇｒａ ８００分析装置で酵素湿式化学法を使用することができる。１つの特定のアッセイは、５５２ｎｍでの検出、および６５９ｎｍでの吸光度ブランキングを伴う、クレアチニナーゼ／クレアチナーゼ／サルコシンオキシダーゼ系に基づく。当業者は、比色法、例えば、ピクリン酸に基づくもの、例えば、Ｊａｆｆｅアッセイも使用することができる。当業者に公知の他の方法、例えば、参照によりそれぞれが本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５／０２６６５７４号および米国特許第４，８１８、７０３号に記載されているものも、クレアチニン濃度を測定するために使用することができる。ある種の実施形態において、クレアチニン濃度の測定は、アイソトープ希釈質量分析を使用して行われる。

ＧＦＲを決定するいくつかの方法が知られている。例えば、ＧＦＲは、参照によりその全体がそれぞれ本明細書に組み込まれるＰｅｒｒｏｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ．１６、２２４〜３５頁（１９９０）およびＬｅｖｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、ｖｏｌ．４、１１５９〜７１頁（１９９３）に記述されている通り、¹²⁵Ｉ−イオタラム酸の腎クリアランスとして決定することができる。他の尿採集ベースの方法も、他の外因性物質、例えば、⁵¹Ｃｒ−ＥＤＴＡ、⁹⁹Ｔｃ−ＤＴＰＡ、イオヘキソールまたはイヌリンの腎クリアランスを測定することを含めて使用することができる。これらの方法のいずれかにより得られるＧＦＲ値は、本明細書に記述する方法で使用する検量線または標準値を与えるために、ほぼ同時に集めたサンプルについてのクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数と相関させることができる。

以下のものは、例示の目的で示すにすぎず、上記の広義の用語で説明している本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本開示で引用したすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＳＤＭＡシスタミド（３）とＳＤＭＡシスタミド塩酸塩（４）との合成
ＳＤＭＡシスタミド（３）を、スキーム１に記述した合成の経路に従って調製した。

（ＢＯＣ）₃−ＳＤＭＡ（１）：４．３６ｇ（２０ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ₂Ｏ）のジオキサン（２０ｍＬ）溶液に、１０ｍＬの５．０ＮのＮａＯＨに溶解した５５０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルアルギニンジヒドロクロリド（ＳＤＭＡ）（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．から市販されている）を室温で撹拌しながら３０分にわたって滴下した。得られた反応混合物を一晩かけて撹拌した。次いで、反応混合物に、３０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）および３０ｍＬの水を添加し、酢酸（ＡｃＯＨ）でｐＨを６．５に調整した。ＤＣＭ層を分け、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。次いで、ＤＣＮを、減圧下で除去し、固体を得た。得られた固体を１０ｍＬのヘキサンで２回洗浄した。次いで、個体を真空中で乾燥し、８００ｍｇの淡黄色固体を得た。次の反応は、さらなる精製を必要としなかった。その固体を質量分析によって特徴付けた。ＥＳＩ−ＭＳ：５２５．７（Ｍ＋Ｎａ）⁺、５０３．６（Ｍ＋１）⁺、４０３．５（Ｍ−Ｂｏｃ＋１）⁺、３０３．５（Ｍ−２Ｂｏｃ＋１）⁺。

（Ｂｏｃ）₃−ＳＤＭＡ−シスタミン−樹脂（２）：１５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の６００ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の（Ｂｏｃ）₃−ＳＤＭＡ（１）と６２７ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）の２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウランヘキサフルオロホスフェートメタナミニウム（ＨＡＴＵ）の混合物に、４２０μＬ（２．４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した。次いで、得られた混合物を、乾燥Ｎ２雰囲気下で２０分間撹拌した。別個に、シスタミン４−メトキシトリチル樹脂（１．０ｇ）（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．から市販されている）を膨張させて、ＤＭＦを使用して洗浄した。次いで、膨張させた樹脂を反応混合物に添加し、反応混合物を、Ｎ２雰囲気下で３時間優しく振盪した。次いで、樹脂を濾過によって集め、５ｍＬのＤＭＦ、５ｍＬのメタノール、および５ｍＬのＤＣＭで連続的に洗浄した。

ＳＤＭＡ−シスタミド（３）：変性樹脂に、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１５ｍＬを添加し、得られた混合物を２時間優しく振盪し、濾過した。樹脂を、３ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１（ｖ／ｖ））で２回洗浄した。濾液および洗い落とされたものを合わせて、２００ｍＬの冷たいエーテルに添加し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、遠心分離によって集め、減圧下で乾燥させて、３００ｍｇのＳＤＭＡ−シスタミド（３）を得た。ＳＤＭＡ−シスタミド（３）を、質量分析によって特徴付けた。ＥＩＳ−ＭＳ：２６２．４（Ｍ＋１）＋、１３２．０（Ｍ＋２）＋。

ＳＤＭＡ−シスタミド塩酸塩（４）：ＳＤＭＡ−シスタミド３（３００ｍｇ）を、１．０ＮのＨＣｌ５ｍＬで戻し、得られた混合物を凍結乾燥し、淡黄色固体を泡状物質として得た。

上記の同じ一般的手順を使用して、他のＳＤＭＡ類似体を調製した。

実施例２：ＳＤＭＡシスタミド（３）とマレイミド活性化タンパク質とのコンジュゲーション
Ａ．ＳＤＭＡシスタミド（３）をマレイミド活性化ＫＬＨとコンジュゲートするための一般的手順
１．マレイミド活性化ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｋ０３８３））のバイアルをゆっくり開けて、真空を解除した。
２．１ｍＬの水でバイアルの中身を戻し、５ｍｇ／ｍＬのマレイミド活性化ＫＬＨの、２３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび８０ｍＭのスクロースを有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中溶液を得た。
３．コンジュゲーション緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｃ３９５７））を１０ｍＬの水で戻すことによって、１００ｍＭのＥＤＴＡおよび８０ｍＭのスクロースを有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）のコンジュゲーション緩衝溶液を調製した。
４．約０．８ｍｇのハプテン（すなわち、ＳＤＭＡシスタミド（３））を０．５ｍＬのコンジュゲーション緩衝液に溶解した。結合効率（ハプテン−総計）の決定のために、５０μｌの得られたペプチド溶液を維持した。維持されたハプテン溶液を２〜８℃で保存した。
５．ステップ４のハプテン溶液を、撹拌子を備えた反応バイアル中ですぐにステップ２のマレイミド活性化ＫＬＨ溶液と混合した。得られた混合物を、穏やかな窒素流下で約１〜２分撹拌しながら脱気した。
６．反応バイアルにふたを閉め、室温で２時間または２〜８℃で一晩中撹拌を続けた。
７．ステップ６（ハプテン−遊離）１００μｌのコンジュゲーション反応物を、結合効率の決定のために維持した。

Ｂ：ＳＤＭＡシスタミド（３）をマレイミド活性化ＢＳＡとコンジュゲートするための一般的手順
１．マレイミド活性化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｂ７５４２））のバイアルをゆっくり開けて、真空を解除した。
２．１ｍＬの水でバイアルの中身を戻し、５ｍｇ／ｍＬのマレイミド活性化ＢＳＡの、２３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡおよび８０ｍＭのスクロースを有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中溶液を得た。
３．５ｍｇのハプテン（すなわち、ＳＤＭＡシスタミド（３））を０．５ｍＬのコンジュゲーション緩衝液（ステップＡ３で説明した通りに調製した）に溶解した。結合効率（ハプテン−全体）の決定のために、５０μｌの得られたペプチド溶液を維持した。維持されたハプテン溶液を２〜８℃で保存した。
４．ステップ３のハプテン溶液を、撹拌子を備えた反応バイアル中ですぐにステップ２のマレイミド活性化ＢＳＡ溶液と混合した。得られた混合物を、穏やかな窒素流下で約１〜２分撹拌しながら脱気した。
５．反応バイアルにふたを閉め、室温で２時間または２〜８℃で一晩中撹拌を続けた。
６．ステップ５（ハプテン−遊離）１００μｌのコンジュゲーション反応物を、結合効率の決定のために維持した。

Ｃ：ＫＬＨまたはＢＳＡコンジュゲートの単離
１．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の容器（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｐ３８１３））の中身を、１リットルの水に溶解した。
２．Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍゲル濾過カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｂ４７８３））をビーカーで支えた。
３．カラムの上部のふたを外し、カラムの下の先端を切開して、過剰な液体を流動させた。カラムを枯渇させないようにした。
４．３０ｍＬのＰＢＳでカラムを平衡化した。
５．実施例２Ａまたは２Ｂからの反応混合物をカラムに付けた
６．総体積約１０ｍＬを使用して、ＰＢＳでカラムを溶出し、約０．５〜１．０ｍＬの画分を集めた。画分におけるタンパク質の存在を、２８０ｎｍでの各画分の吸光度を測定することによってモニタリングした。
７．タンパク質を含有する画分を合わせた。図４は、吸光度対画分番号の、タンパク質ＫＬＨ（◆）とＢＳＡ（■）についての例示的な溶出プロファイルをグラフで示したものである。
８．タンパク質含有画分を、小分量に分け、−２０℃で凍らせて保存した。

Ｄ．結合効率を決定するためのアッセイ
１．システイン標準アッセイ−類似体とシステインペプチドとの結合効率を推定するために、システインの公知の濃度を使用して、標準曲線を作成した。アッセイは、ｐＨ８．０でスルフヒドリル基と反応し、４１２ｎｍで最大吸光度を有する発色団を生成する、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢまたはエルマン試薬）の反応に基づいた。その後の手順は、以下の通りである。
ａ．ＤＴＮＢ緩衝液を、ＤＴＮＢ緩衝剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｄ４１７９））のバイアルの中身を１０ｍＬの水に溶解することによって調製した。
ｂ．次いで、ＤＴＮＢ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｄ８１３０））を、ステップａからのＤＴＮＢ緩衝液５ｍＬに溶解した。
ｃ．使用する直前に、システイン溶液を、３２ｍｇのＬ−システイン塩酸塩一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｃ７８８０））を１ｍＬの水に溶解することによって調製した。得られたＬ−システイン塩酸塩溶液を、逐次的に水で希釈し、０．４〜０．０４ｍｇ／ｍＬの範囲の希釈ストック溶液を得た。希釈ストック溶液をすぐに使用した。
ｄ．ラベルを貼った試験管に、５０μＬの希釈ストック溶液を添加した。水５０μＬを含有する試験管を、ブランクとして使用した。
ｅ．次いで、各試験管に、０．１ｍＬの水、０．７５ｍＬのＤＴＮＢ緩衝液（ｐＨ８．０）、および直ちに０．１ｍＬのＤＴＮＢ試薬溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加して、体積１ｍＬの最終のシステイン標準アッセイ溶液を得た。
ｆ．各試験管の中身を混合した。
ｇ．各システイン標準アッセイ溶液の吸光度を、４１２ｎｍで決定した。吸光度が１．４を超える場合、サンプルを希釈し、アッセイを繰り返した。
ｈ．４１２ｎｍでの吸光度を、システイン濃度（ｍｇ／ｍＬ）に対してプロットし、標準曲線を得た。システインの濃度が２〜２０μｇ／ｍｌの範囲である、標準曲線の直線部分を、ハプテン−総計、およびハプテン−遊離を決定するために使用した。

２．ハプテンアッセイ−注記：サンプルが、システイン標準アッセイにおいて最も高いシステイン標準よりも高い数値を出した場合、サンプルを希釈し、アッセイを繰り返した。
ａ．適切にラベルを貼った試験管に、５０μｌの以下の溶液を添加した：
（ｉ）ＤＴＮＢ緩衝液（ブランク）
（ｉｉ）希釈ペプチドサンプル（ハプテン−総計、ＫＬＨコンジュゲーションから、実施例２のステップＡ４から）
（ｉｉｉ）ハプテン−ＫＬＨ（ハプテン−遊離、ＫＬＨコンジュゲーション、実施例２のステップＡ７から）
（ｉｖ）希釈ペプチドサンプル（ハプテン−総計、ＢＳＡコンジュゲーション、実施例２のステップＢ３から）
（ｖ）ハプテン−ＢＳＡ（ハプテン−遊離、ＢＳＡコンジュゲーション、実施例２のステップＢ６から）
ｂ．ステップ（ａ）からの各ラベル化試験管に、０．１ｍＬの水、０．７５ｍＬのＤＴＮＢ緩衝液（ｐＨ８．０）、および直ちに０．１ｍｌのＤＴＮＢ試薬溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を添加して、体積１ｍＬの最終的なハプテンアッセイ溶液を得た。
ｃ．各試験管の中身を混合した。
ｄ．各ラベル化試験管中の溶液の吸光度を、４１２ｎｍで決定した。吸光度が１．４を超えた場合、サンプルを希釈し、アッセイを繰り返した。
ｅ．次いで、ハプテン−総計の濃度を、１ｈの項で上記した得られた標準曲線を使用して、測定された吸光度から決定した。試験管（ｉｉ）および試験管（ｉｖ）で測定された吸光度を使用して、それぞれ、ＫＬＨおよびＢＳＡについてのハプテン−総計を決定した。試験管（ｉｉｉ）および試験管（ｖ）について測定された吸光度を使用して、それぞれ、ＫＬＨおよびＢＳＡについてのハプテン−遊離を決定した。次いで、希釈されていない溶液のペプチド濃度および結合効率を、以下の計算に記述した通りに計算した。

３．計算
ペプチド濃度および結合効率を推定するために、上記した（システイン標準アッセイ）公知のシステイン濃度を使用して、標準曲線を作成した。この計算において、システイン１モルは、スルフヒドリル含有ハプテン１モルに等しい。

以下の式を使用した。
％結合効率＝｛（ハプテン（コンジュゲート化）／ハプテン（総計）｝×１００＝［｛ハプテン（総計）−ハプテン（遊離）｝／ハプテン（総計）］×１００
ハプテン（総計）＝ペプチド（総計）μｍｏｌｅ／ｍｌ
ハプテン（遊離）＝ペプチド（遊離）μｍｏｌｅ／ｍｌ
ハプテン（コンジュゲート化）＝ハプテン（総計）−ハプテン（遊離）
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｆｏｒ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ，ＫＬＨ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号ＭＢＫ１）も参照されたい）。実施例２Ａから２Ｄに記述したものと同じ一般的手順を使用して、他のＳＤＭＡ類似体とＫＬＨおよびＢＳＡとのコンジュゲーションの効率を測定することができる。

実施例３：抗ＳＤＭＡ抗体を作製する方法
抗ＳＤＭＡ抗体を作製する免疫プロトコルを、以下のプロトコルに従って実施した。６羽のカリフォルニア種のウサギを、ＳＤＭＡコンジュゲートで免疫した。６匹のウサギのうち３匹を、ＢＳＡとコンジュゲートしたＳＤＭＡで免疫し（ウサギ１５５番、１５６番、および１５７番）、残りの３匹のウサギを、ＫＬＨとコンジュゲートしたＳＤＭＡで免疫した（ウサギ１５２番、１５３番および１５４番）（実施例２に記述した通りに調製した）。一次免疫について、各ウサギに、１ｍｌの完全フロイントアジュバントと混合された、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５ｍｇのＳＤＭＡコンジュゲートを注射した。各ウサギの剃毛された背部に、２０〜３０回の皮内注射を行った。各ウサギの後ろ足に、等量の不完全フロイントアジュバントと混合された１ｍｌのＰＢＳ中の０．２５ｍｇの免疫原で追加免疫した。追加免疫注射を、最初の注射後に各月に与えた。各追加免疫の７〜１０日後に、各ウサギから試験採血の血液５ｍｌを採取した。産物採血（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｌｅｅｄｓ）４０ｍｌを、３回目の追加免疫注射後、抗血清力価が約１：２０００より大きかった時、各ウサギから採取した。抗血清力価は、アッセイについての校正曲線の傾きが最も大きい、抗血清の希釈度である。

実施例４：抗ＳＤＭＡ抗体の特徴付け
実施例３で上記した手順によって得られた抗体の特異性を評価するために、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、Ｌ−アルギニン、および／またはＮ−メチルアルギニンに対する反応性を、競合型ＥＬＩＳＡアッセイで測定した（表１）。

ＡＤＭＡ−２ＨＣｌ、ＳＤＭＡ−２ＨＣｌ、Ｎ−メチルアルギニン酢酸塩（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ７０３３）、またはＬ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５００６）を、それぞれＰＢＳに溶解させ、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作った。これらのストック溶液から、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの標準溶液を、ＰＢＳにおいて調製した。

５０μｌのＳＤＭＡ−ＨＲＰコンジュゲート（下記の実施例５に記述した）、５０μｌのＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、Ｎ−メチルアルギニンまたはＬ−アルギニン（上記した通り、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度）、および血清中のウサギ抗ＳＤＭＡ抗体５０μｌ（力価１：３０００）を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥのＢｅａｃｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から市販されている）で前もって被覆した、９６ウェルのポリスチレン製マイクロウェルプレートの個々のウェルに連続的に添加した。室温での３０分のインキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。

それに続いて、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）を添加した。室温での３０分のインキュベーション後、１００μｌの反応停止溶液（１ＮのＨＣｌ）を添加し、吸光度を、ＢｉｏＴｅｋのＥＬＸ８０８（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）プレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで測定した。データを、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量化した。

０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および１００μｇ／ｍＬのＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、Ｎ−メチルアルギニン、またはＬ−アルギニンで得られた吸光度の値を決定してプロットした。吸光度の値が５０％減少したＳＤＭＡの濃度（０μｇ／ｍＬのＳＤＭＡで得られた最大吸光度に対して；すなわちＩＣ５０）を、吸光度の値が５０％減少したＡＤＭＡ、Ｎ−メチルアルギニンまたはＬ−アルギニンの各濃度（ＩＣ５０）でそれぞれ割った。得られた値に１００をかけて、「％交差反応性」の値を得た。＜５０％の吸光度減少を、１００μｇ／ｍＬ以下の濃度で観察した場合、＜１％の交差反応性であることが分かった（表１を参照されたい）。

表１に示す通り、６匹のウサギの抗ＳＤＭＡ血清はすべて、ＡＤＭＡ、Ｎ−メチルアルギニン、またはＬアルギニンに対して＜１％の交差反応性を有した。

ＳＤＭＡではなくＡＤＭＡを使用した、実施例１から４に記述した実験と同様の実験でも、抗体を作製した。しかし、抗体を作製するためにＡＤＭＡ−タンパク質コンジュゲートを使用すると、遊離型ＡＤＭＡに特異的でなく、ＡＤＭＡを測定するアッセイに有用でない抗体が生成された。

１５４番のウサギからのポリクローナル抗体のみを使用した別の実験において、抗体の特異性を、上記の方法によって、より厳密に決定した。このデータ（表２を参照されたい）は、１５４番のウサギからの抗体の特異性が、上の表１に示したものよりもはるかに高いことを示す。

実施例５：インビボでのＳＤＭＡレベルを検出するための競合型免疫アッセイ
血清サンプルは、ルーチンの身体検査およびルーチンの化学反応検査を受けた動物から、動物病院／獣医学研究所によって提供された。

ＳＤＭＡ−ＨＲＰコンジュゲートを、以下の手順に従って調製した。
１．タンパク質１ｍｇあたり＞２００ユニットのマレイミド活性化西洋ワサビペルオキシダーゼ凍結乾燥粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（製品番号Ｐ１７０９））を、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で戻して、２〜５ｍｇ／ｍＬにした。緩衝液を、使用前に窒素またはアルゴンで脱気およびパージして、緩衝液を調製するために使用した水は、わずかな重金属および他の酸化剤も含まなかった。カップリングを、光から反応を保護するために琥珀色のバイアルにおいて実施した。
２．ＳＤＭＡ類似体（３）を、ステップ１で使用したものと同じ緩衝液に溶解し、２〜５ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液を用意した。概して、スルフヒドリル化合物１モルあたり１〜２モルのペルオキシダーゼ化合物を使用した。ペルオキシダーゼの分子量は、約４０，０００であった。
３．ステップ１からの溶液を、ステップ２からの溶液と合わせて、得られた溶液を室温で３時間穏やかに撹拌した。次いで、１Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｍ６２５０））を、２−メルカプトエタノールの最終濃度が０．００１５Ｍになるように添加することによって、未反応のマレイミド基をブロックし、得られた溶液を、約１５分間撹拌した。
４．次いで、０．３ＭのＮ−エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されている（カタログ番号Ｄ８６５４））を、Ｎ−エチルマレイミドの最終濃度が０．００３Ｍになるようにステップ３からの溶液に添加することによって、未反応のスルフヒドリル基をブロックした。
５．次いで、得られたＳＤＭＡ−ＨＲＰコンジュゲート溶液を、クロマトグラフィー（ＳＤＭＡ類似体（３）をマレイミド活性化ＫＬＨおよびＢＳＡとコンジュゲートする実施例において上記した同じ手順を使用して）によって、または製造業者の使用説明書に従ったＰＢＳへの透析（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３、ＭＷＣＯ ３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）によって、ＰＢＳに交換した。次いで、得られた溶液を凍結乾燥した。

Ｌｉｎ，Ｆ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８（４）、６９０（１９７９）；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｔら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２９（４）、１１３１（１９８１）；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．Ｊ．Ｓ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２、６８（１９８３）；およびＰａｌｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３８（７）、２３９３（１９６３）も参照されたい。

５０μｌのＳＤＭＡ−ＨＲＰコンジュゲート、５０μｌの血清サンプル（または校正物質、ＳＤＭＡ２ＨＣｌ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販されている）、および血清中のウサギ抗ＳＤＭＡ抗体５０μｌ（力価１：３０００）を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥのＢｅａｃｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から市販されている）で前もって被覆した、９６ウェルのポリスチレン製マイクロウェルプレートの個々のウェルに連続的に添加した。室温での３０分のインキュベーション後、ウェルを、ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。

それに続いて、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）を添加した。室温での３０分のインキュベーション後、１００μｌの反応停止溶液（１ＮのＨＣｌ）を添加し、吸光度を、ＢｉｏＴｅｋのＥＬＸ８０８（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）プレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで測定した。データを、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量化した。校正曲線を、一連のＳＤＭＡ標準（例えば、０、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１５μｇ／ｍＬ、０．４５μｇ／ｍＬ、および１．３５μｇ／ｍＬ）を処理することによって作成した。未知のサンプルを、校正曲線を使用して定量化した。結果を表３にまとめる。

表３において、状態「腎疾患」は、動物から採取されたサンプルが、正常の参照範囲を超えるクレアチニン値および血中尿素窒素（ＢＵＮ）値を示したことを示し、状態「健康」は、動物から採取されたサンプルが、正常の（参照範囲の）クレアチニン値および血中尿素窒素（ＢＵＮ）値を示したことを示す。イヌの場合、正常の参照範囲の上限は、ＢＵＮについて２７ｍｇ／ｄＬであり、クレアチニンについて１．８ｍｇ／ｄＬであった。ネコの場合、正常の参照範囲の上限は、ＢＵＮについて３４ｍｇ／ｄＬであり、クレアチニンについて２．３ｍｇ／ｄＬであった。

表３中の結果は、ＳＤＭＡレベルが、腎機能障害を有するイヌおよびネコにおいて上昇したことを示す。したがって、ＳＤＭＡは、動物における腎疾患を診断するためのマーカーとして使用することができる。

実施例６：クレアチニン濃度および遊離型ＳＤＭＡ濃度によるイヌの糸球体濾過量の分析
血清サンプルを、Ｘ連鎖遺伝性ニューロパチー（ＸＬＨＮ）を有するヘテロ接合（キャリア）の雌のイヌ（ｎ＝２０）から採取した。ＸＬＨＮは、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子の突然変異によって起こり、それは、雌のイヌにおいて、ＩＶ型コラーゲンペプチドのモザイク発現、および３〜６か月齢での糸球体性タンパク尿の発症を引き起こす（Ｎａｂｉｔｙら、Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００７；２１：４２５〜４３０）。クレアチニンおよびＳＤＭＡの濃度を、各サンプルで測定した。

サンプルのクレアチニン濃度を、上記した通り、ＩＤＥＸＸのドライスライド技術を使用して測定した。

サンプルの遊離型ＳＤＭＡ濃度を、以下の通り決定した。ＬＣＭＳの移動相は、（Ａ）１Ｌの水中の１０ｍＬのプロピオン酸および２５０μＬのトリフルオロ酢酸；ならびに（Ｂ）１Ｌのアセトニトリル中の１０ｍＬのプロピオン酸および２５０μＬのトリフルオロ酢酸であった。水中の２．５ｎｇ／ｍＬの重水素化非対称性ジメチルアルギニン（ｄ−ＡＤＭＡ）という内部標準を調製した。ＳＴＤ（標準）曲線を、２０μｇ／ｍＬのＳＤＭＡ溶液を混入し、その後、希釈して、１．５６μｇ／ｄＬから１００μｇ／ｄＬの濃度で異なる９点のＳＴＤ曲線を得ることによって、処理済みイヌ血清で作成した。測定を行うために、測定する１００μＬのサンプル（すなわち、血清サンプルまたは標準溶液）を、マイクロチューブに移した。１０μＬの内部標準溶液および２００μＬの移動相Ｂを、各チューブに添加した。チューブをボルテックスにかけて混合し、３０分放置し、次いで、２５℃で２０分間、１３０００ｇで遠心分離した。上澄みを、２ｍＬの琥珀色のＨＰＣＬバイアルに移し、サンプルをＬＣＭＳによって分析した。ＬＣＭＳを、ＨＰＬＣおよびＡＢＳｃｉｅｘ製のＡＰＩ−４０００（スキャンタイプ ＭＲＭ、正極性、ターボスプレースキャンモード、Ｑ１解像度＝ユニットおよびＱ３解像度＝ユニットで操作される）で実施した。カラムは、１５０×４．６のＰＶＡ ＳＩＬカラムであり、流速は、１ｍＬ／分であり、勾配は、無勾配の９０：１０（Ｂ：Ａ）であった。クロマトグラムを、周囲温度で９分間行った。

動物の実際のＧＦＲを、イオヘキソールクリアランス法によって測定した。対象に、イオヘキソールを注射した。

血液サンプルを、様々な時間間隔で採取し、血清中のイオヘキソールをＨＰＬＣによって測定した。

各イヌについて、３つのデータ点を集めた。クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）対ＧＦＲ（ｍｌ／分／ｋｇ）の４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）プロットを図５に示す。これらのデータのＲ²の値は、０．９４であり、０．５〜３．０ｍｇ／ｄｌ濃度範囲についての標準誤差が０．１２であり、それは、全範囲の約５％である。

図６は、ＳＤＭＡ濃度（μｇ／ｄｌ）対ＧＦＲ（ｍｌ／分／ｋｇ）の結果を示す。ＳＤＭＡ−ＧＦＲ関係への４ＡＰＬのあてはめは、０．９５というＲ²値を与え、ＳＤＭＡの５〜４０μｇ／ｄＬの範囲についての標準誤差が１．７である。この誤差は、全範囲の約５％である。

図７は、クレアチニン値とＳＤＭＡ値を、それらの値の単純な掛け算を使用して組み合わせた結果を示し、それは、クレアチニンのみまたはＳＤＭＡのみからの、ＧＦＲとの関係の改善を示す。［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］とＧＦＲとの関係の４ＰＬのあてはめは、０．９８というＲ²値を与え、［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］の０〜９０μｇ／ｄＬ範囲についての標準誤差が２．８である。この誤差は、これらのイヌについてのＧＦＲとの関係に対する全範囲の約３％である。

図８は、直線のあてはめを使用した、１／［クレアチニン］^P*１／［ＳＤＭＡ］^Qの分析を示す。線形回帰を使用すると、Ｐは、０．３７であり、Ｑは、０．４３であった。この組合せのＲ²は、１／［クレアチニン］のみの０．８３、および１／［ＳＤＭＡ］のみの０．８５に対して、０．８７という値であった。

実施例７：クレアチニン濃度および遊離型ＳＤＭＡ濃度によるネコの糸球体濾過量の分析
それぞれ１〜４つのデータ点を有する１０匹のネコを使用して、ＳＤＭＡ値とクレアチニン値の掛け合わせが、個々のマーカー値のみよりもＧＦＲとよりよく相関するかどうかを評価した。ＳＤＭＡ、クレアチニンおよびＧＦＲを、上記の通りに測定した。

図９は、ＳＤＭＡ濃度（μｇ／ｄｌ）対ＧＦＲ（ｍｌ／分／ｋｇ）の結果を示す。ＳＤＭＡ−ＧＦＲ関係への４ＰＬのあてはめは、０．７３というＲ²値を与え、標準誤差は、ＳＤＭＡの１５μｇ／ｄＬ範囲について２．３である。この誤差は、全範囲の約１５％である。

図１０は、クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄｌ）対ＧＦＲ（ｍｌ／分／ｋｇ）の結果を示す。クレアチニンとＧＦＲとの関係への４ＰＬのあてはめは、０．８２というＲ²値を与え、標準誤差は、ＳＤＭＡの１．５ｍｇ／ｄＬ範囲について０．１５である。この誤差は、全範囲の約１０％である。

図１１は、クレアチニン値とＳＤＭＡ値を、それらの値の単純な掛け算を使用して組み合わせた結果を示し、それは、クレアチニンのみまたはＳＤＭＡのみからの、ＧＦＲとの関係の改善を示す。［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］とＧＦＲとの関係の４ＰＬのあてはめは、０．８９というＲ²値を与え、［クレアチニン］^*［ＳＤＭＡ］の４０μｇ／ｄＬ範囲についての標準誤差が３．９である。この誤差は、全範囲の約１０％である。

図１２は、直線のあてはめを使用した、１／［クレアチニン］^P*１／［ＳＤＭＡ］^Qの分析を示す。線形回帰を使用すると、Ｐは、１．２であり、Ｑは、０．９５であった。この組合せのＲ²は、１／［クレアチニン］のみの０．４４、および１／［ＳＤＭＡ］のみの０．６５に対して、０．９５という値であった。

実施例８：ＣＲＥおよびＳＤＭＡのカットオフ値の組合せによる、腎疾患の診断における感度および／または特異度の改善
１１３匹のネコの腎疾患状態を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ＩＲＩＳ）によって提供されている、イヌおよびネコにおけるＡｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｓｔａｇｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＫＤ）に従って、決定し、段階付けた。各ネコについて、様々な時点で採取した１〜６つの血清サンプルを、クレアチニン［ＣＲＥ］および／またはＳＤＭＡについて分析した。１９４個のサンプルが、正常な（すなわちＣＫＤでない）６１匹のネコからのものであった。１８２個のサンプルが、ＣＫＤを患う５５匹のネコからのものであった。

この実施例において、ＳＤＭＡおよびＣＲＥのカットオフ値を決定し、それらを使用して、ＣＫＤを決定した。カットオフ値は、個体が、この特定の検査で腎疾患を有すると診断された、血清の閾値濃度を示す。ＳＤＭＡ_CUTは、ＳＤＭＡのカットオフ値である。［ＳＤＭＡ］およびＳＤＭＡ_CUTは、μｇ／ｄＬ（マイクログラム／デシリットル）で測定される。例えば、ＳＤＭＡ_CUTは、約１４μｇ／ｄＬであってもよいし、約１０〜２０μｇ／ｄＬであってもよい。

ＣＲＥ_CUTは、ＣＲＥのカットオフ値である。ＣＲＥおよびＣＲＥ_CUTは、ｍｇ／ｄＬで測定される。例えば、ＣＲＥ_CUTは、約２．０ｍｇ／ｄＬから２．４ｍｇ／ｄＬであってもよいし、約１．７〜２．８ｍｇ／ｄＬであってもよい。

ＳＤＭＡのみについて、カットオフ値（ＳＤＭＡ_CUT）を、１４μｇ／ｄＬに設定した。この値を使用すると、正常のネコについて、１０．３％の偽陽性が存在し、ＣＫＤのネコについて２６．９％の偽陰性が存在した（表４を参照されたい）。

クレアチニンのみについて、カットオフ値（ＣＲＥ_CUT）を、２．４ｍｇ／ｄＬに設定した。この値を使用すると、正常のネコについて、０．０％の偽陽性が存在し、ＣＫＤのネコについて４３．４％の偽陰性が存在した（表５を参照されたい）。

Ｃ_CUTは、組合せ値Ｃのカットオフ値である。クレアチニン値およびＳＤＭＡ値を、下式に従って組み合わせた。
組合せ値Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUT

Ｃ_CUTは、測定単位を有しない。例えば、Ｃ_CUTは、１．５、１．７または２．０であってもよいし、１．３〜２．５であってもよい。

Ｃ_CUTを、１．５に設定した場合、正常なネコについて、１２．４％の偽陽性が存在し、ＣＫＤのネコについて、１．６％の偽陰性が存在した（表６を参照されたい）。Ｃ_CUTを、１．７に設定した場合、正常なネコについて、３．５％の偽陽性が存在し、ＣＫＤのネコについて、１４．３％の偽陰性が存在した（表７を参照されたい）。Ｃ_CUTを、２．０に設定した場合、正常なネコについて、３．５％の偽陽性が存在し、ＣＫＤのネコについて、３３．５％の偽陰性が存在した（表８を参照されたい）。

Ｃ_CUTの適切な値を決定するために、組合せ値の推定される感度および特異度を、Ｃ_CUTに対してプロットした（図１３を参照されたい）。Ｃが、Ｃ_CUTよりも大きい（＞）場合、個体を、腎疾患を有すると診断する。したがって、各診断カットオフ値に基づいて、ＳＤＭＡの値とＣＲＥの値とを組み合わせることは、動物における腎疾患の検出の改善された感度および／または特異度をもたらす。

実施例９：健康なまたは疾患を有する動物におけるクレアチニン対ＳＤＭＡ比の決定
健康な動物において、ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）とクレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）との濃度の比は、一般に、約４：１から１０：１（μｇ／ｄＬ：ｍｇ／ｄＬ）の範囲である。一部の慢性腎疾患患者は、この比が１０：１を超え、そのことは、病気の進行を示している可能性がある。

この研究において、ＣＫＤのイヌにおけるＳＤＭＡおよびクレアチニンの長期的な傾向を観察した。ＣＫＤを有する２４匹のイヌを、以下の基準、すなわち、年齢（９．４〜１８．３歳）；持続的な高窒素血症（＞３か月）；ＧＦＲ；身体検査；血清クレアチニン、および検尿に基づいて、研究に含めた。

すべてのイヌを、最適な栄養、獣医学的健康管理、および毎日の運動を含む良質なケアで維持した。ＣＫＤと診断した後、イヌに、ドックフードのＰＲＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＤＩＥＴ（登録商標）ｋ／ｄ（登録商標）（Ｈｉｌｌ’ｓ Ｐｅｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｐｅｋａ、Ｋａｎｓａｓ）を食べさせた。

これらのイヌからサンプルを定期的に（年に２〜３回）集めた。サンプルを凍結し、貯蔵した。クレアチニンを、ＣＯＢＡＳ（登録商標）分析装置を使用して、酵素比色法によって測定した。ＳＤＭＡを、血清サンプルをアセトニトリルで沈殿させたこと、およびＷａｔｅｒｓのＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８（５μｍ ４．６^*３０）カラムを使用したことを除いて、上記の通りＬＣＭＳによって測定した。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸における０．５ｍＭペルフルオロヘプタン酸からなり、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ギ酸であり、勾配が、１００％Ｂから１００％Ａであり、実施時間が４分であった。ＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）とクレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）との相関関係を図１４に示す。

実施例１０：ＣＫＤを有する一部のネコにおけるＳＤＭＡ値とクレアチニン値との間の不調和
ＳＤＭＡ：クレアチニン比における不調和は、動物における死亡率を予示する可能性がある。例えば、ＣＫＤのネコにおいて、観察されたＳＤＭＡ値は、対応するクレアチニン値に基づく予想濃度よりも高かった。図１４に示す通り、ＳＤＭＡとクレアチニンとの間に強い相関関係が存在し、正常比は、１０（μｇ／ｄＬ：ｍｇ／ｄＬ）未満である。この研究において、その比を、２６匹のＣＫＤのネコで決定した。これらの２６匹のネコを、身体検査、血清クレアチニンおよび検尿に基づいてＣＫＤと診断していた。図１５に示す通り、２６匹のネコの内２匹は、安楽死したか病気で死亡したかは文書に記録されていないが、１０より大きいＳＤＭＡ：クレアチニン比を有し、追跡期間時に死亡した。

実施例１１：ＣＫＤを有するネコの死亡率の予測におけるＳＤＭＡ：クレアチニン比
この研究において、ＣＫＤのネコにおけるＳＤＭＡおよびクレアチニンの長期的な傾向を観察した。ＣＫＤを有する１８匹のネコを、以下の基準、すなわち、少なくとも３か月間の持続的な高窒素血症；または、正常なネコのＧＦＲの中央値からＧＦＲが＞３０％低下した非高窒素血症；またはシュウ酸カルシウム腎結石に基づいて、研究に含めた。

すべてのネコを、最適な栄養、獣医学的健康管理、および毎日の運動、ならびに環境的および行動的な豊かさのための定期的な機会を含む良質なケアで維持した。ＣＫＤと診断した後、ネコに、ＰＲＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＤＩＥＴ（登録商標）ｃ／ｄ（登録商標）フード（Ｈｉｌｌ’ｓ Ｐｅｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｐｅｋａ、Ｋａｎｓａｓ）を食べさせた。

これらのネコから血液と尿サンプルを様々な時点で集め、凍結し、貯蔵した。クレアチニンを、ＣＯＢＡＳ（登録商標）分析装置を使用して、酵素比色法によって測定した。ＳＤＭＡを、上記の通りＬＣＭＳによって測定した。

１８匹のネコのそれぞれにおいて、ＳＤＭＡの濃度が１４μｇ／ｄＬに初めて達したまたはそれを超えた時、１２匹のネコは、１０：１より大きいＳＤＭＡ：クレアチニン比を有し、６匹のネコは、１０：１以下のＳＤＭＡ：クレアチニン比を有していた。各ネコについて、ＳＤＭＡの濃度が１４μｇ／ｄＬに初めて達したまたはそれを超えた日から、死亡する日までの期間を２匹のネコを除いて観察した。これらの２匹のネコは、研究の終了時にも生存しており、したがって、研究の最終日が、これらの２匹のネコの死亡日の代わりとなった。

１０：１より大きいＳＤＭＡ：クレアチニン比を有した１２匹のネコは、生存期間中央値が１３．９か月（平均値１８．７；範囲＝１．８〜４７．４）であった。１０：１以下のＳＤＭＡ：クレアチニン比を有した６匹のネコは、生存期間中央値が１８．７か月（平均値１８．９；範囲＝８．７〜２８．７）であった。したがって、１０：１より大きいＳＤＭＡ：クレアチニン比を有したネコは、１０：１のＳＤＭＡ：クレアチニン比を有したネコよりも死亡率が高い。図１６、図１７および図１８は、ＳＤＭＡ：クレアチニン比が１０を超える、この研究からの３匹のネコ（ネコ＃１３、ネコ＃８、およびネコ１４）についての数年間にわたるＳＤＭＡ：クレアチニン比の経時変化を示す。血清中ＳＤＭＡ濃度が少なくとも１４μｇ／ｄＬに初めて達した日から、ネコ＃１３は、２７．２か月で死亡し、ネコ＃８は、２９．４か月で死亡し、ネコ１４は、１２．３か月で死亡した。検死の際の最後の測定時に、３匹のネコの上記比は、約１７から３４の範囲であった。

実施例１２：ＳＤＭＡおよびクレアチニンを使用した死亡率の予測
図１９および図２０は、１４μｇ／ｄＬというＳＤＭＡカットオフ値を使用した、ネコ（実施例１１に記述した研究からの）およびイヌ（実施例９に記述した研究からの）のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。図１９は、少なくとも１４μｇ／ｄＬの血清中ＳＤＭＡ濃度を有するネコは、生存期間が短縮し、死の高い可能性を有することを示す。１４μｇ／ｄＬ未満の血清中ＳＤＭＡを有したネコは、１４μｇ／ｄＬ以上の血清中ＳＤＭＡを有したネコよりも約１．６倍長く生きた。この研究において、クレアチニンは、ネコの死亡率を予測することができなかった（参照カットオフ値２．１ｍｇ／ｄＬ）。

図２０は、１４μｇ／ｄＬより高いまたは低い血清中ＳＤＭＡ濃度を有するイヌのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。この研究において、ＳＤＭＡ＜１４μｇ／ｄＬを有したイヌは、ＳＤＭＡ≧１４μｇ／ｄＬを有したイヌよりも２．６倍長く生きた。クレアチニンは、死亡率を予測することができなかった（参照カットオフ値１．５ｍｇ／ｄＬ）。

先に示した実施例は、例示的なものにすぎず、本発明のすべての可能な実施形態、応用、または変更形態の網羅的な列挙であることを意味するものではない。したがって、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、上記の本発明の方法および系の種々の変更形態または変形物が、当業者に明らかである。本発明を、特定の実施形態と絡めて説明してきたが、特許請求している本発明を、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際、本発明を実施するための上記の形態の種々の変更形態が、当業者に明らかである。

本発明を、本明細書に記述した特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定しないと理解されたい。なぜなら、それらは、当業者が認識するように変わりうるからである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記述するために使用するものにすぎず、本発明の範囲を限定していることを意図するものではないとも理解されたい。また、本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の言及を含むことにも留意されたい。したがって、例えば、「１つのリンカー（ａ ｌｉｎｋｅｒ」への言及は、１つまたは複数のリンカー、および当業者に公知の等価物への言及である。

別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者に共通に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施形態および種々の特徴、ならびにそれらの有利な詳細を、非限定的な実施形態の参照によってより十分に説明され、および／または添付図面で図示し、その後の説明で詳述する。図面に示した特徴は、必ずしも正寸ではなく、本明細書で明記されていなくても、当業者が認識するように、一実施形態の特徴を他の実施形態によって用いることができることに留意すべきである。

本明細書に記述する任意の数値は、その低い値と高い値とが少なくとも２単位離れていれば、その低い値からその高い値まで１単位ずつ増えるすべての値を含む。一例として、ある成分の濃度、またはプロセスの変数の値、例えば、大きさ、角度、圧力、時間などが、例えば、１〜９０、詳細には２０〜８０、より詳細には３０〜７０と記載されていれば、１５〜８５、２２〜６８、４３〜５１、３０〜３２などの値を本明細書に明白に列挙していることを意図するものである。１未満の値の場合、１単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると考える。これらは、特に意図しているものの単なる一例にすぎず、列挙している最小の値から最高の値までの間の数値のすべての可能な組合せを、同じように本出願に明記しているものと考えるべきである。

特定の方法、装置、材料を記述するが、本明細書に記述するものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。先に引用したすべての参考文献および刊行物の開示は、あたかも、それらそれぞれが、参照によって個々に組み込まれるように、参照によってそれら全体が本明細書に明らかに組み込まれる。

Claims (48)

1. 動物対象における糸球体濾過量（ＧＦＲ）を推定する方法であって、
   対象からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、
   対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度を測定すること、および
   クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積を含む方程式から得られる値を、動物対象における糸球体濾過量と相関がある１つまたは複数の標準値と比較すること
   を含む方法。
2. 前記方程式が、クレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を含む、請求項１に記載の方法。
3. クレアチニンの濃度および遊離型ＳＤＭＡの濃度のうちの少なくとも１つが、計算で重み付けされる、請求項１に記載の方法。
4. クレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積が、式ＰＲＯＤ＝［ＣＲＥ］^P×［ＳＤＭＡ］^Qによって表され、式中、ＰＲＯＤが積であり、［ＣＲＥ］がクレアチニンの濃度であり、［ＳＤＭＡ］がＳＤＭＡの濃度であり、Ｐが式中の［ＣＲＥ］に与える重みを示し、Ｑが式中の［ＳＤＭＡ］に与える重みを示す、請求項１に記載の方法。
5. １つまたは複数の標準値が、積の逆数と相関がある、請求項４に記載の方法。
6. Ｐ＝−１であり、Ｑ＝−１である、請求項４に記載の方法。
7. Ｐ＝−１．５であり、Ｑ＝−０．０２５である、請求項４に記載の方法。
8. Ｐが約−５から０の間であるが、０を含まない、請求項４に記載の方法。
9. Ｑが約−２．５から０の間であるが、０を含まない、請求項４に記載の方法。
10. 比較するステップが、実行時に計算および比較を行う機械読み取り可能な命令を含むマイクロプロセッサーを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
11. 対象におけるＧＦＲを、１または複数の健康な対象におけるＧＦＲと比較することによって、腎機能、腎疾患または腎機能障害を決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
12. ＧＦＲが動物種の健康な集団の平均ＧＦＲよりも統計的に有意に低い場合に、腎疾患または腎機能障害の治療を動物にすることをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 動物のＧＦＲと健康な集団のＧＦＲとの差が、２標準偏差よりも大きい場合、動物対象のＧＦＲが、健康な集団の平均ＧＦＲよりも統計的に有意に低い、請求項１３に記載の方法。
14. 遊離型ＳＤＭＡの濃度の測定が、
    サンプルを、標識にコンジュゲートされた抗ＳＤＭＡ抗体、およびＳＤＭＡ類似体と接触させること、ならびに
    ＳＤＭＡ類似体に関連する標識の存在または量を検出し、それによってサンプル中のＳＤＭＡの存在または量を決定すること
    を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 動物対象における腎疾患または腎機能障害を診断する方法であって、
    対象からの血清中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、
    対象からの血清中のクレアチニンの濃度を測定すること、および
    クレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積を、腎疾患または腎機能障害と相関がある１つまたは複数の標準値と比較すること
    を含む方法。
16. クレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積が、式ＰＲＯＤ＝［ＣＲＥ］^P×［ＳＤＭＡ］^Qによって表され、式中、ＰＲＯＤが積であり、［ＣＲＥ］がクレアチニンの濃度であり、［ＳＤＭＡ］がＳＤＭＡの濃度であり、Ｐが式中の［ＣＲＥ］に与える重みを示し、Ｑが式中の［ＳＤＭＡ］に与える重みを示す、請求項１５に記載の方法。
17. １つまたは複数の標準値が、積の逆数と相関がある、請求項１６に記載の方法。
18. Ｐ＝−１であり、Ｑ＝−１である、請求項１６に記載の方法。
19. Ｐ＝−１．５であり、Ｑ＝−０．０２５である、請求項１６に記載の方法。
20. Ｐが約−５から０の間であるが、０を含まない、請求項１６に記載の方法。
21. Ｑが約−２．５から０の間であるが、０を含まない、請求項１６に記載の方法。
22. 動物対象における腎疾患または腎機能障害の診断に関連する値を算出する方法であって、対象からの血液サンプル中のクレアチニンの濃度に基づく第１の重み付けされた値と、対象からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡの濃度に基づく第２の重み付けされた値との積を算出するための機械読み取り可能な命令を実行することを含む方法。
23. 請求項２２に記載の方法により算出された値を、腎疾患または腎機能障害に関連する標準値と比較することを含む、腎疾患または腎機能障害を診断する方法。
24. 個体が腎疾患を有するかどうかを決定する方法であって、
    （ａ）個体からの血清サンプル中のＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］およびクレアチニンの濃度［ＣＲＥ］を測定すること、
    （ｂ）［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT比を算出すること、
    （ｃ）［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUT比を算出すること、
    （ｄ）組合せ値：Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUTを算出すること、
    （ｅ）ＣがＣ_CUTよりも大きい場合、個体が腎疾患を有することを決定すること
    を含み、式中、ＳＤＭＡ_CUTがＳＤＭＡのカットオフ値であり、ＣＲＥ_CUTがクレアチニンのカットオフ値であり、Ｃ_CUTが組合せ値のカットオフ値である、方法。
25. 個体が腎疾患を有するかどうかを決定する方法であって、
    （ａ）個体からの血清サンプル中のＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］およびクレアチニンの濃度［ＣＲＥ］を測定すること、
    （ｂ）組合せ値：Ｃ＝［ＳＤＭＡ］／ＳＤＭＡ_CUT＋［ＣＲＥ］／ＣＲＥ_CUTを算出すること、
    （ｃ）ＣがＣ_CUTよりも大きい場合、個体が腎疾患を有することを決定すること
    を含み、式中、ＳＤＭＡ_CUTが［ＳＤＭＡ］のカットオフ値であり、ＣＲＥ_CUTが［ＣＲＥ］のカットオフ値であり、Ｃ_CUTが組合せ値のカットオフ値である、方法。
26. ＳＤＭＡ_CUTが、約１０〜約２０μｇ／ｄＬである、請求項２４または２５に記載の方法。
27. ＳＤＭＡ_CUTが、約１４μｇ／ｄＬである、請求項２４または２５に記載の方法。
28. ＣＲＥ_CUTが、約１．３〜約２．５ｍｇ／ｄＬである、請求項２４または２５に記載の方法。
29. ＣＲＥ_CUTが、約１．７〜約２．８ｍｇ／ｄＬである、請求項２４または２５に記載の方法。
30. ＣＲＥ_CUTが、約１．７μｇ／ｄＬである、請求項２４または２５に記載の方法。
31. 動物対象における早期死亡を予測する方法であって、
    （ａ）対象からの血清中の遊離型ＳＤＭＡの濃度を測定すること、
    （ｂ）対象からの血清中のクレアチニンの濃度を測定すること、
    （ｃ）［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比を算出すること、および
    （ｄ）その比がカットオフ値を超える場合、個体が早期死亡すると決定すること
    を含む方法。
32. カットオフ値が、１０である、請求項３１に記載の方法。
33. カットオフ値が、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である、請求項３１に記載の方法。
34. 遊離型ＳＤＭＡの濃度が、少なくとも１４μｇ／ｄＬである、請求項３１に記載の方法。
35. 動物対象が、ＣＫＤと診断されている、請求項３１に記載の方法。
36. 動物対象が、イヌ類またはネコ類である、請求項３１に記載の方法。
37. 腎疾患に関連する死亡率を決定する方法であって、
    （ａ）患者からの血液サンプル中の遊離型ＳＤＭＡを測定すること、
    （ｂ）患者が閾値よりも高い血中ＳＤＭＡ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定すること
    を含む方法。
38. 閾値が、１４μｇ／ｄＬである、請求項３７に記載の方法。
39. 血液サンプル中のクレアチニンを測定し、［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比を算出するステップをさらに含み、ここで、その比がカットオフ比を超える場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有する、請求項３７に記載の方法。
40. ［ＳＤＭＡ］／［ＣＲＥ］比が、１０を超える、請求項３９に記載の方法。
41. 動物対象が、イヌ類またはネコ類である、請求項３７に記載の方法。
42. 動物対象が、ＣＫＤと診断されている、請求項３７に記載の方法。
43. 動物対象における腎機能を決定する装置であって、ＳＤＭＡ類似体、または非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｌ−アルギニンおよびＮ−メチルアルギニンからなる群から選択される１つもしくは複数の化合物と交差反応性を有しないもしくは実質的に有しないＳＤＭＡに特異的な抗体を結合させた第１の固相；ならびにクレアチニン検出試薬またはクレアチニンに特異的な抗体を結合させた第２の固相を含む装置。
44. クレアチニン検出試薬が、ピクリン酸もしくはその塩、またはクレアチニンに特異的な抗体である、請求項４３に記載の装置。
45. 動物対象における腎機能を決定するためのキットであって、１種または複数のクレアチニン検出試薬、および１種または複数のＳＤＭＡ検出試薬を含む、キット。
46. 動物からの１つまたは複数の血液サンプル中のクレアチニンの濃度とＳＤＭＡの濃度との積に基づく、腎機能に関連する１つまたは複数の標準値のセットをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
47. 実行時にクレアチニンの濃度と遊離型ＳＤＭＡの濃度との積の逆数を計算する、ソフトウェア命令を含む記憶装置を備えたコンピューティング装置。
48. 記憶装置が、計算の結果を、動物対象における糸球体濾過量を表す１つまたは複数の標準値と比較するためのソフトウェア命令をさらに含む、請求項４７に記載のコンピューティング装置。