KR20210082567A - 신장 질환을 검출하기 위한 방법 - Google Patents

신장 질환을 검출하기 위한 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210082567A
KR20210082567A KR1020217020124A KR20217020124A KR20210082567A KR 20210082567 A KR20210082567 A KR 20210082567A KR 1020217020124 A KR1020217020124 A KR 1020217020124A KR 20217020124 A KR20217020124 A KR 20217020124A KR 20210082567 A KR20210082567 A KR 20210082567A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sdma
concentration
creatinine
cre
value
Prior art date
Application number
KR1020217020124A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102412431B1 (ko
Inventor
마하락슈미 예라밀리
머시 브이.에스.엔. 예라밀리
Original Assignee
아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52628954&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20210082567(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 filed Critical 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드
Publication of KR20210082567A publication Critical patent/KR20210082567A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102412431B1 publication Critical patent/KR102412431B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 개시 내용은 신장 질환 및 신장 질환과 관련된 사망률의 측정, 진단, 진행 및 예후를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 개시 내용은 동물의 신장 기능을 측정하기 위한, 특히 사구체 여과율(GFR)을 추정하기 위한 방법을 포함한다. GFR은 신장 질환 또는 기능 장애의 진단 및 치료에 유용할 수 있다. 다양한 양태에서, 본 개시 내용은 사구체 여과율 및 신장 질환을 측정하기 위한 동물, 특히 고양이 및 개로부터의 혈액 샘플 중의 유리 대칭 디메틸아르기닌 (SDMA) 및 크레아티닌의 용도에 관한 것이다.

Description

신장 질환을 검출하기 위한 방법{METHODS FOR DETECTING RENAL DISEASE}
관련 출원
본 출원은 2013년 9월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/874,011호의 우선권을 주장한다.
분야
본 개시 내용은 일반적으로 신장 기능의 측정에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 개시 내용은 사구체 여과율(glomerular filtration rate)을 추정하고, 신장 질환의 진행을 진단하고, 예후하고, 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
신장 기능을 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 것은 중요하다. 예를 들어, 약물의 투여량은 신기능부전을 앓고 있는 환자에 맞게 조정되어야 한다. 따라서, 신장 기능을 정확하게 평가하는 것이 임상 의약에서 필수적이다. 그러나, 사구체 여과율(GFR) 및/또는 이용가능한 진단 시험의 신뢰가능한 표지가 부족하기 때문에 신기능부전의 진단이 어렵다. GFR에 대하여 광범위하게 이용되는 수단은 이눌린 청소율(inulin clearance)이지만, 이러한 시험은 복잡하고 비용이 많이 드는데, 이로 인해 특히 임상 실험에서 이의 사용이 본질적으로 감소된다. 이는 또한 방사성동위원소 청소율 시험에서 실제로 그러하다. 따라서, 임상 실험에서, 신장 기능을 평가하기 위해 혈청 크레아티닌이 전형적으로 사용된다. 그러나, 혈청 크레아티닌은 데이터가 비교적 높은 정도의 가변성에 주어질 수 있으므로 부정확할 수 있다.
이에 따라서, 본 발명자들은 당해 분야에서 정밀도가 증가된 신장 기능을 평가하는 방법이 필요하다는 것을 확인하였다.
한 가지 양태에서, 본 개시 내용은 동물 대상체의 사구체 여과율(GFR)을 추정하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고; 대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도를 측정하고; 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱을 포함하는 식으로부터 생성된 값을 동물 대상체의 사구체 여과율과 연관된 하나 이상의 표준 값과 비교함을 포함한다.
본원에 기재된 방법의 다양한 예시적인 구체예에서, 방정식은 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 포함한다. 또한, 크레아티닌의 농도 및/또는 유리 SDMA의 농도는 계산에서 칭량될 수 있다. 비교하는 단계는 마이크로프로세서(microprocessor)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 또한 대상체의 GFR과 하나 이상의 건강한 대상체의 GFR을 비교함으로써 신장 기능, 신장 질환 또는 신장 기능 장애를 결정함을 포함한다.
추가의 또 다른 구체예에서, 본 개시 내용은 동물 대상체의 신장 질환 또는 신장 기능 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체로부터의 혈청 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고; 대상체로부터의 혈청 중 크레아티닌의 농도를 측정하고; 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량된 값과 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량된 값의 곱을 신장 질환 또는 신장 기능 장애와 연관된 하나 이상의 표준 값과 비교함을 포함한다.
특정의 예시적인 구체예에서, 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량된 값과 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량된 값의 곱은 식 PROD = (CRE)P × (SDMA)Q로 표현되며, 상기 식에서, PROD는 생성된 값이고, CRE는 크레아티닌의 농도이고, SDMA는 SDMA의 농도이고, P는 식에서 CRE에 대해 주어지는 중량을 제공하고, Q는 식에서 SDMA에 대해 주어지는 중량을 제공한다. 하나 이상의 표준 값은 생성된 값의 역수와 상관관계에 있을 수 있다.
본 개시 내용의 추가의 양태는 동물 대상체의 신장 질환 또는 신장 기능 장애의 진단과 관련된 값을 계산하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량된 값과 대상체로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량된 값의 곱을 계산하기 위한 기계 판독가능한 명령을 실행함을 포함한다.
또 다른 추가의 양태에서, 본 개시 내용은 개체가 신장 질환인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 개체로부터의 혈청 샘플 중의 SDMA [SDMA] 및 크레아티닌 [CRE]의 농도를 측정하고, 비율 [SDMA] / SDMACUT를 계산하고, 비율 [CRE] / CRECUT를 계산하고, 합한 값 C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT를 계산하고, C가 CCUT보다 큰 경우에 개체가 신장 질환임을 결정함을 포함하며, 여기서 SDMACUT는 SDMA에 대한 컷오프(cutoff) 값이고, CRECUT는 크레아티닌에 대한 컷오프 값이고, CCUT는 합한 값에 대한 컷오프 값이다.
본 개시 내용에 따른 한 가지 방법은 개체가 신장 질환인지의 여부를 결정함을 포함한다. 이러한 방법은 개체로부터의 혈청 샘플 중의 SDMA [SDMA]와 크레아티닌 [CRE]의 농도를 측정하고, 비율 [SDMA] / SDMACUT를 계산하고, 비율 [CRE] / CRECUT를 계산하고, 합한 값 C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT를 계산하고, C가 CCUT보다 큰 경우에 개체는 신장 질환인 것으로 결정함을 포함하며, 여기서 SDMACUT는 SDMA에 대한 컷오프 값이고, CRECUT는 CRE에 대한 컷오프 값이고, CCUT는 합한 값에 대한 컷오프 값이다.
또 다른 추가로, 본 개시 내용은 동물 대상체에서 조기 사망을 예측하기 위한 방법으로서, 대상체로부터의 혈청 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고, 대상체로부터의 혈청 중 크레아티닌의 농도를 측정하고, 비율 [SDMA]/[CRE]를 계산하고, 비율이 컷오프 값 초과인 경우에 개체는 조기 사망할 것으로 결정함을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 구체예에서, 본 개시 내용은 신장 질환과 관련된 사망률의 측정을 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 환자, 예를 들어, 개 또는 고양이로부터의 혈액 샘플 중의 유리 SDMA를 측정하고, 환자가 역치 수준보다 큰 SDMA의 혈액 농도를 지니는 경우에 환자의 신장 질환과 관련된 사망 가능성은 증가하는 것으로 결정함을 포함한다. 이러한 방법은 혈액 중의 크레아티닌을 측정하고 비율 [SDMA]/[CRE]를 계산하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 환자가 역치 비율보다 큰 혈액 비율 [SDMA]/[CRE]를 지니는 경우에 환자의 신장 질환 관련된 사망 가능성은 증가한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 또한 동물 대상체에서 신장 기능 장애를 결정하기 위한 장치에 관한 것이다. 이러한 장치는 SDMA 유사체, 또는 비대칭 디메틸아르기닌 (ADMA), L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 교차 반응성을 지니지 않거나 실질적으로 지니지 않는 SDMA에 대해 특이적인 항체가 결합된 제 1 고체상; 및 크레아티닌 감지 시약 또는 크레아티닌에 대해 특이적인 항체가 결합된 제 2 고체상을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 개시 내용은 동물 대상체에서 신장 기능을 측정하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 하나 이상의 크레아티닌 검출 시약 및 하나 이상의 SDMA 검출 시약을 포함하고, 임의로 동물로부터의 하나 이상의 혈액 샘플 중의 크레아티닌의 농도와 SDMA의 농도의 곱을 기초로 하는 신장 기능과 관련된 일련의 하나 이상의 표준 값을 포함한다.
또 다른 추가로, 본 개시 내용은 실행 시에 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 계산하는 소프트웨어 명령을 포함한 메모리 저장을 지니는 컴퓨팅 장치에 관한 것이다. 메모리 저장은 또한 계산 결과를 동물 대상체의 사구체 여과율을 나타내는 하나 이상의 표준 값과 비교하기 위한 소프트웨어 명령을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 추가 이해를 제공하기 위해 포함된 첨부된 도면은 본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하며, 본 개시 내용의 구체예를 도시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 이는 보다 상세하게 본 발명의 구조적 세부 사항을 나타내고자 의도된 것이 아니며, 실시될 수 있는 다양한 방식과 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요할 수 있는 것을 나타낸 것이다.
도 1은 질량 분광기로 SDMA를 검출하는 ELISA 방법의 결과를 비교하는 그래프이다.
도 2는 건강한 개와 암, 심장 질환, 또는 심장-신장 질환을 앓고 있는 개의 SDMA 농도의 플롯이다. 수평 마디는 컷오프 값을 나타낸다(건강한 개의 집단으로부터 두 표준 편차와 평균 SDMA 농도의 합으로 결정).
도 3은 건강한 고양이와 신장 질환 또는 암을 앓고 있는 고양이의 SDMA 농도의 플롯이다. 수평 마디는 컷오프 값을 나타낸다(건강한 고양이의 집단으로부터 두 표준 편차와 평균 SDMA 농도의 합으로 결정).
도 4는 실시예에 기재되는 바와 같은 Sephadex G-25M 겔-여과 컬럼으로부터의 SDMA 시스타미드 단백질 컨쥬게이트의 280 nm에서의 흡광도 대 용리에 대한 분획 수의 플롯이고, 여기서 단백질은 KLH (◆) 또는 BSA (■)이다.
도 5는 실시예 6에 기재된 바와 같은 일련의 개 혈청 샘플에 대한 크레아티닌 농도 대 GFR의 플롯이다.
도 6은 실시예 6에 기재된 바와 같은 일련의 개과 혈청 샘플에 대한 SDMA 농도 대 GFR의 플롯이다.
도 7은 실시예 6에 기재된 바와 같은 일련의 개 혈청 샘플에 대한 [크레아티닌]*[SDMA] 대 GFR의 플롯이다.
도 8은 실시예 6에 기재된 바와 같은 일련의 개 혈청 샘플에 대한 크레아티닌 대 GFR, 1/SDMA 대 CGF 및 1/[크레아티닌0.37]*1/[SDMA0.43] 대 크레아티닌의 선형 피트를 이용한 플롯을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 7에 기재된 바와 같은 일련의 고양이 혈청 샘플에 대한 SDMA 농도 대 GFR의 플롯이다.
도 10은 실시예 7에 기재된 바와 같은 일련의 고양이 혈청 샘플에 대한 크레아티닌 농도 대 GFR의 플롯이다.
도 11은 실시예 7에 기재된 바와 같은 일련의 고양이 혈청 샘플에 대한 [크레아티닌]*[SDMA] 대 GFR의 플롯이다.
도 12는 실시예 7에 기재된 바와 같은 일련의 개 혈청 샘플에 대한 [크레아티닌] 대 GFR, 1/SDMA 대 CGF, 및 1/[크레아티닌1.2]*1/[SDMA0.39] 대 크레아티닌의 선형 피트를 이용한 플롯을 나타낸 것이다.
도 13은 신장 질환을 결정하기 위한 방법에서 특이성 및 민감도의 개선을 나타내는 그래프이다.
도 14는 개에서 SDMA (μg/dL)와 크레아티닌 (mg/dL) 사이의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 15는 고양이 집단에서 크레아티닌과 SDMA의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 16은 수년 동안에 걸친 고양이에서 크레아티닌과 SDMA의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 17은 수년의 동안에 걸친 고양이에서 크레아티닌와 SDMA의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 18은 수년의 동안에 걸친 고양이에서 크레아티닌과 SDMA의 혈청 농도를 나타낸 것이다.
도 19는 14 μg/dL 미만의 혈청 SDMA 농도를 지니는 고양이가 14 μg/dL 초과의 농도를 지니는 고양이보다 약 1.6배 더 오래 생존한다는 것을 나타내는 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.
도 20은 14 μg/dL 미만의 혈청 SDMA 농도를 지니는 개가 14 μg/dL 초과의 농도를 지니는 고양이보다 약 2.6배 더 오래 생존한다는 것을 나타내는 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.
본 발명의 다양한 양태에서, 본 개시 내용은 신장 질환 및 신장 질환과 관련된 사망률의 결정, 진단, 진행 및 예후에 관한 것이다. 본 개시 내용은 동물의 신장 기능을 결정하기 위한, 특히 사구체 여과율(GFR)을 추정하기 위한 방법을 포함한다. GFR은 신장 질환 또는 기능 장애의 진단 및 치료에 유용할 수 있다.
다양한 양태에서, 본 개시 내용은 사구체 여과율 및 신장 질환을 결정하기 위한 동물, 특히, 고양이 및 개로부터의 혈액 샘플 중의 유리 대칭 디메틸아르기닌 (SDMA) 및 크레아티닌의 용도에 관한 것이다. 한 가지 양태에서, 동물로부터의 혈액 샘플 중의 크레아티닌과 유리 SDMA의 농도의 곱은 GFR 및 신장 질환과 상관관계에 있을 수 있다. 예를 들어, 크레아티닌과 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수(예, 1/[크레아티닌][SDMA])이 이용되는데, 예상외로 이는 사구체 여과율의 측정에 대한 정밀도를 어느 하나의 측정을 단독으로 이용하는 것보다 훨씬 더 높게 만들었다. 따라서, 본 개시 내용은 동물 대상체로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고; 동물 대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도를 측정하고; 동물 대상체에서 사구체 여과율에 대한 하나 이상의 표준 값과 크레아티닌의 농도와 SDMA의 농도의 곱의 역수를 비교함으로써 동물 대상체의 사구체 여과율을 결정하기 위한 방법을 포함한다. 본 개시 내용의 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 신장 질환의 결정을 위한 단독의 SDMA 농도, 또는 크레아티닌 농도에 대한 SDMA 농도의 비율의 용도를 포함한다.
SDMA는 내생성 산화질소 합성효소(nitric oxide synthetase: NOS) 억제제 비대칭 디메틸아르기닌 (ADMA)의 구조 이성질체이다. ADMA와 SDMA 둘 모두는 L-아르기닌 잔기의 핵내 메틸화로부터 유래되고, 단백질 분해 후 세포질 내로 방출된다. SDMA는 단백질-아르기닌 메틸전이효소 5 (PRMT 5) 및 PRMT 7에 의해 생성된다. 메틸아르기닌, 예컨대, SDMA, 모노메틸아르기닌 및 ADMA를 전달하는 단백질은 RNA 가공, 단백질 왕복 및 신호 전달의 역할을 한다[Bedford and Richard, Mol. Cell, 2005, Apr 29, 18(3):263-72]. 그러한 메틸화 단백질의 분해로부터 생성되는 유리 SDMA는 주로 신장 추출에 의해 제거되는 반면, ADMA는 대부분 대사작용된다. ADMA는 관상 동맥 질환(coronary artery disease: CAD), 예컨대, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 고호모시스테인혈증, 인슐린 저항성, 노화, 및 평균 동맥압에 대한 위험 요소와 큰 연관성이 있다. SDMA는 신장 기능의 파라미터, 예컨대, 사구체 여과율(GFR), 이눌린 청소율, 및 크레아티닌 청소율과 연관성이 있다.
이에 따라서, 한 가지 양태에서 본 개시 내용은 혈청 중 유리 SDMA의 농도와 크레아티닌의 농도 둘 모두에 대한 값을 이용함으로써 동물 대상체의 사구체 여과율을 추정하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 값들의 곱의 역수(예, 1/([크레아티닌][SDMA])는 단독의 크레아티닌 또는 SDMA의 농도보다 정밀하게 GFR에 직접적으로 연관된다.
하기에 다수의 용어들이 정의되어 있다:
Ab는 항체이다.
ADMA는 비대칭 디메틸아르기닌이다. ADMA의 구조는 하기와 같다:
Figure pat00001
BUN은 혈중 요소 질소이다.
BSA는 소의 혈청 알부민이다.
CMIA는 화학발광 자성 면역검정이다.
DCM은 디클로로메탄이다.
DIPEA는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
DMF는 디메틸 포름아미드이다.
EIA는 효소 면역검정이다.
ELISA는 효소-연결 면역흡수 검정이다.
ESI-MS는 전자분무 이온화 질량 분광법이다.
FPIA는 형광 편광 면역검정이다.
GFR은 사구체 여과율이다.
HATU는 (1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우라늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미니늄이다.
KLH는 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin)이다.
MEIA는 마이크로입자 효소 면역검정이다.
NOS는 산화 질소 합성효소이다.
PBS는 인산 완충 식염수이다.
RIA는 방사면역검정이다.
SDMA 대칭 디메틸아르기닌이다. SDMA의 구조는 하기와 같다:
Figure pat00002
유리 SDMA는 폴리펩티드 사슬의 일부가 아닌 SDMA를 지칭한다. SDMA의 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드에 존재할 수 았다.
SLE는 전신 홍반성 루프스이다.
TFA는 트리플루오르아세트산이다.
아르기닌의 구조는 하기와 같다:
Figure pat00003
N-MMA는 N-모노메틸아르기닌, 또는 간단히 N-메틸아르기닌이다. N-모노메틸아르기닌의 구조는 하기와 같다:
Figure pat00004
본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 일반적으로 하나 이상의 개개 원소들이 상이한 원소(들) 또는 상이한 작용기(들)로 치환된 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 유사체는 수용체에 대한 분석물과 경쟁할 수 있는 변형 형태의 분석물일 수 있고, 상기 변형은 표지 또는 고형 지지체와 같이 또 다른 모이어티(moiety)에 분석물을 접합시키기 위한 수단을 제공한다. 분석물 유사체는 분석물에 유사한 방식으로 항체에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 일반적으로 항원에 대한 노출에 반응하여 B 림프구 세포에 의해 생성되는 당단백질을 지칭하며, 항원에 특이적으로 결합한다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 특히 단클론성 항체(전장 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다가특이성 항체(예, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용되는 "항-SDMA," "항-SDMA 항체 부분," 또는 "항-SDMA 항체 단편" 및/또는 "항-SDMA 항체 변형체" 등은 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 어떠한 단백질 또는 펩티드 함유 분자, 예컨대, 이로 제한되지는 않지만, 중쇄 또는 경쇄 고정 부위의 하나의 상보성 결정 부위(complementarity determining region: CDR), 골격 부위, 또는 이들의 어느 일부를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 변형 도메인을 지칭한다. 특히, 예를 들어, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터의 다가특이성 항체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 일반적으로 항원에 특이적인 항체와 적절한 조건하에 반응할 수 있는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "분석물"은 검출되고/거나 측정된 샘플에서의 물질, 또는 물질들의 집합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "동물"은 일반적으로 어떠한 동물, 예를 들어, 인간, 또는 비-인간 동물, 예컨대, 고양이, 개, 또는 말을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈액 샘플"은 일반적으로 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 어떠한 혈액-유래된 유체 샘플을 지칭한다. 본 개시 내용의 방법에 사용하기 위한 혈청을 제공하기 위해, 하나 이상의 혈청 샘플은 동물 대상체로부터 얻어진다. 혈청 샘플은, 예를 들어, 혈액 샘플로서 동물 대상체로부터 얻은 후에 분리하여 혈청을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 혈청은 혈액으로부터 분리 없이 측정될 수 있다. 당업자에게 인지될 바와 같이, 단일의 얻어진 샘플은 분리되거나 달리 둘 모두의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 복수의 샘플들이 동물 대상체로부터 크레아티닌 농도에 대해 측정된 (적어도) 하나의 샘플, 및 유리 SDMA 농도에 대해 측정된 (적어도) 하나의 샘플로 얻어질 수 있다. 특정의 그러한 경우에, 샘플은 동물로부터 대략적으로 동일한 시간에(예, 60분 이내에, 30분 이내에, 또는 또한 각각 10분 이내에) 얻어진다.
본원에서 사용되는 용어 "교차-반응성"은 일반적으로 하나 이상의 항원 결정체와 반응하는 항체의 각각의 항원 결합 부위의 능력 또는 하나 이상의 항원과 반응하는 항체 분자 집단의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 교차 반응은 (i) 교차 반응하는 항원이 면역 항원과 공동으로 에피토프(epitope)를 공유하거나 (ii) 면역 항원에 대한 에피토프와 구조적으로 유사한(다가특이성) 에피토프를 지니기 때문에 발생한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역검정"은 일반적으로 측정가능한 반응을 발생시키기 위해 항체와 항원 복합체를 사용하는 시험을 지칭한다. "항체:항원 복합체"는 용어 "면역-복합체"와 교체가능하게 사용될 수 있다. 면역검정은 일반적으로 비경쟁적 면역검정, 경쟁적 면역검정, 균일 면역검정, 및 불균일 면역검정을 포하만다. "경쟁적 면역검정"에서 시험 샘플 중의 미표지된 분석물(또는 항원)은 면역검정에서 표지된 항원와 경정하는 이의 능력에 의해 측정된다. 미표지된 항원은 항체에 대한 결합 부위가 이미 점유되기 때문에 표지된 항원이 결합하는 능력을 차단한다. "경쟁적 면역검정"에서 시험 샘플에 존재하는 항원의 양은 표지로부터 발생한 신호의 양과 반비례 관계에 있다. 반대로, "샌드위치(sandwich)" 면역검정으로도 알려진 "비경쟁적 면역검정"에서 분석물은 두 개의 매우 특이한 항체 시약 사이에 결합되어 복합체를 형성시키고, 항원의 양은 복합체와 관련된 신호의 양과 비례한다. 결합된 항체:항원 복합체의 분리가 필요한 면역검정은 일반적으로 "불균일 면역검정"으로 지칭되고, 항체:항원 복합체의 분리가 필요하지 않은 면역검정은 일반적으로 "균일 면역검정"으로 지칭된다. 당업자는 다양한 면역검정 형식을 용이하게 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 복합체"는 일반적으로 보체 고정(complement fixation)으로 또는 보체 고정 없이 항원 및 항체 분자의 결합에 의해 형성된 복합체를 지칭한다. 항체 또는 항원 중 어느 하나가 표지된 경우, 표지는 항원과 항체 사이의 결합의 결과로 면역 복합체와 관련된다. 따라서, 항체가 표지된 경우, 표지는 결합의 결과로 항원과 관련된다. 유사하게, 항원이 표지된 경우(예, 표지를 지니는 분석물 유사체), 표지는 항원과 항체 사이의 결합의 결과로 항체와 관련된다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 본 개시 내용의 항체, SDMA 유사체, 또는 항원에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션(conjugation)될 수 있는(예, 공유 또는 비공유 수단을 통해, 단독으로 또는 캡슐화되어) 검출가능한 화합물, 조성물, 또는 고체 지지체를 지칭한다. 표지는 자체로에 의해 검출가능할 수 있거나(예, 방사성 동위원소 표지, 화학발광 염료, 전기화학적 표지, 금속 킬레이트, 라텍스 입자, 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매작용할 수 있다(예, 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소 등과 같은 효소). 본 개시 내용에 사용되는 표지는 이로 제한되지는 않지만 알칼리성 인산가수분해효소; 글루코오스-6-인산탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase: "G6PDH"), 양고추냉이 과산화효소(HRP); 화학발광체, 예컨대, 이소루미놀, 형광체, 예컨대, 플루오레세인 및 로다민 화합물; 리보자임; 및 염료일 수 있다. 표지는 또한 자체가 검출가능한 특이적 결합 분자일 수 있다(예, 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 디곡시제닌, 말토오스, 올리고히스티딘, 2,4,-디니트로벤젠, 페닐아르세네이트, ssDNA, 및 dsDNA 등). 표지는 또 다른 분자 또는 고체 지지체에 결합될 수 있고, 표지된 분자의 검출을 가능하게 하는 특이적인 특성 때문에 선택된다. 표지의 이용에 의해, 전자기 복사의 검출과 같은 수단 또는 직접 가시화에 의해 검출될 수 있고 임의로 측정될 수 있는 신호가 생성된다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"는 일반적으로 실질적으로 균일한 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체, 즉, 집단을 포함하는 각각의 항체들이 동일한 항체를 지칭한다. 단클론성 항체는 단일 항원 부위로 유도되는 높은 특이성이 있다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조물과 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상에서 단일의 에피토프에 대해 유도된다. 변형체 "단클론성"은 단지 항체의 특성을 지칭하는 것이며, 어떠한 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특히, 예를 들어, 단클론성 항체는 혼성세포 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있거나, 공지된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리(phage antibody library)로부터 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 링킹된 아미노산 서열을 지니는 분자를 지칭한다. 이 용어는 단백질, 융합 단백질, 올리고펩티드, 사이클릭 펩티드, 및 폴리펩티드 유도체를 포함한다. 항체 및 항체 유도체는 개별 섹션으로 상기에서 논의되지만, 항체 및 항체 유도체는 본 개시 내용의 목적 상 폴리펩티드 및 폴리펩티드 유도체의 하위부류로 취급된다.
본원에서 사용되는 용어 "고체 지지체"는 본 개시 내용의 항체 또는 SDMA 유사체가 접착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 지칭한다. 고체 지지체의 예로는 유리(예, 조절 공극 유리(controlled pore glass)), 합성 및 천연 폴리머, 폴리사카라이드(예, 아가로오스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘, 자성 입자, 라텍스 입자, 크로마토그래픽 스트립, 마이크로타이터 폴리스티렌 플레이트, 또는 결합된 항원 및/또는 항체가 비결합된 물질로부터 세척되거나 분리될 수 있게 하는 어떠한 다른 물질로부터 일부 또는 전부 형성된 지지체들을 포함한다. 특정 구체예에서, 적용에 좌우하여, 고체 지지체는 검정 플레이트의 웰일 수 있거나 정제 컬럼(예, 친화성 크로마토그래피 컬럼)일 수 있다.
"수용체"는 분자의 특정 공간 및 극성 조직, 예를 들어, 에피토프 또는 결정체 부위를 인식할 수 있는 어떠한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 예시적인 수용체로는 항체, 및 Fab 단편 등이 포함된다.
"결합 특이성" 또는 "특이적 결합"은, 예를 들어, 제 1 분자의 제 2 분자, 예를 들어, 폴리펩티드, 및 폴리펩티드에 대해 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체, 또는 항체 단편(예, Fv, 단쇄 Fv, Fab', 또는 F(ab')2 단편)의 실질적인 인식을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용되는 "특이성"은 일반적으로 단지 하나의 항원과 반응하는 항체 분자 집단의 능력 또는 단지 하나의 항원 결정체와 반응하는 개별 항체 조합 부위의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 (i) 항원의 일차 구조, (ii) 항원의 이성질체 형태, 및 (iii) 항원의 이차 및 삼차 구조의 차이를 구별할 수 있다. 높은 특이성을 나타내는 항체-항원 반응은 낮은 교차 반응성을 나타낸다.
"실질적 결합" 또는 "실질적으로 결합하는"은 특정 검정 조건하에 검정 혼합물에서 분자들 사이의 특정 결합 또는 인식의 양을 지칭한다. 이의 가장 넓은 양태에서, 실질적 결합은, 상대적인 분자 농도, 및 인큐베이션 시간 및 온도를 포함하는 특정 구성의 검정 조건하에서 유의한 검정이 실시되어 특이적 결합을 구별할 수 있도록 차이가 충분한, 제 1 분자의 제 2 분자에 대한 결합 또는 인식 불능, 및 제 1 분자의 제 3 분자에 대한 결합 또는 인식 불능의 차이를 지칭한다. 또 다른 양태에서, 제 1 분자가 특정 구성의 검정 조건하에서 제 2 분자에 대한 반응성을 제 3 분자에 대해 나타나는 반응성의 25% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만으로 나타내는 교차-반응성 의미로 하나의 분자가 또 다른 분자를 실질적으로 결합하거나 인식할 수 없다. 특이적 결합은 다수의 광범위하게 공지된 방법, 예를 들어, 면역조직화학적 검정, 효소-연결 면역흡수 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 또는 웨스턴 블롯 검정(western blot assay)을 이용하여 시험될 수 있다.
본원에서 사용되는 "염"은 화합물의 산성 작용기와 염기성 작용기 사이에서 형성된 염을 의미한다. 예시적인 염으로는, 이로 제한되지 않지만, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설페이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염이 포함된다. 용어 "염"은 또한 산성 작용기, 예컨대, 카복실산 작용기를 지니는 화합물과 무기 또는 유기 염기 사이에서 형성된 염을 지칭한다. 적합한 염기로는, 이로 제한되지 않지만, 알칼리 금속, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 및 리튬의 수산화물; 알칼리 토금속, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘의 수산화물; 그 밖의 금속, 예컨대, 알루미늄 및 아연의 수산화물; 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대, 비치환된 또는 하이드록시-치환된 모노-, 디-, 또는 트리알킬아민; 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시-저급 알킬 아민), 예컨대, 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-3차-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디-저급 알킬-N-하이드록시 저급 알킬)-아민, 예컨대, N,N,-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민, 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 및 라이신 등이 포함된다.
본원에 기재된 특정 방법에서, 동물 대상체의 사구체 여과율은 동물 대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱을 고려한 방정식의 결과를 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, GFR을 측정하기 위해, 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수가 동물 대상체에서 사구체 여과율과 관련된 하나 이상의 표준 값과 비교될 수 있다. 하기에서 실시예 6에 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, GFR과 크레아티닌 농도와 유리 SDMA 농도의 곱의 역수 사이에는 선형 관계가 존재한다. 이에 따라서, 당업자는 동물 대상체에 대한 GFR과 1/([크레아티닌][SDMA])의 선형 방정식을 확립할 수 있고(예를 들어, 동일한 종 또는 유형의 다른 동물을 이용하여), 측정된 농도의 곱의 역수와의 비교로 표준 값을 제공하는 방정식을 이용할 수 있다. 당업자는, 표준 값과의 비교가 단지 1/([크레아티닌][SDMA])의 값으로부터 GFR을 계산하는 방정식을 사용함을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 대안적으로, 일련의 공지된 GFR 값에 대한 크레아티닌 및 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수의 일련의 표준 값이 결정될 수 있고; 동물 대상체의 GFR은 표준 값과 측정된 크레아티닌 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 비교함으로써 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 결정하는 단계는 하나 이상의 표준 값과 방정식에 대한 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 비교하도록 프로그래밍된 마이크로프로세서를 이용하여 수행된다. 마이크로프로세서는 일반적으로 실행 시에 방정식을 계산하고, 연산자 또는 검출 장치로부터의 입력을 기초로 하여 비교를 수행하는 기능을 실시하는 소프트웨어 명령을 함유한 메모리 저장을 함유하는 컴퓨팅 장치의 부품이다.
당업자는 사구체 여과율과 관련된 곱의 역수에 대한 하나 이상의 표준 값과 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수의 비교가 그러한 비교와 수학적으로 동일한 수적 비교를 또한 포함한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, {상수 × (1/([크레아티닌][SDMA])} 및/또는 [상수 × GFR]로 표현되는 값을 이용한 비교가 또한 고려된다. 예를 들어, 비교는 ([크레아티닌][SDMA])만의 곱을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 또한, 당업자는 몫 (1/([크레아티닌][SDMA])의 분모 및/또는 분자에 인자를 삽입하는 것은 GFR (예, 2/([SDMA][크레아티닌]), 1/(2[SDMA][크레아티닌]) 또는 5/(3[SDMA][크레아티닌])과 이의 관계의 강도를 변화시키지 않을 것임을 인지할 것이다. 유사하게, 1/GFR과 ([크레아티닌][SDMA])의 관계가 마찬가지로 고려된다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 하기 식을 이용하여 GFR을 추정하는 것에 관한 것이다:
Figure pat00005
실험 결과를 기초로 하여, 이 식은 약 0.8347의 상관 계수(R-제곱값)를 지닌다. 방정식이 하기와 같이 일반화되는 경우, 상관 계수를 최대화시키는 지수(P 및Q)는
Figure pat00006
및
Figure pat00007
이다:
Figure pat00008
이러한 지수들 세트에 대한 R-제곱 값은 0.9116이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, P 및 Q는 상관 계수를 최대화시키도록 조절될 수 있는 칭량 인자이다.
지수를 약간 변화시키는 것은 유의한 방식으로 R-제곱 값에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 예를 들어, P = -1.5이고, Q = -0.25인 경우, R-제곱 값은 0.9114이다. 간단하게 하기 위해, GFR와 관련된 크레아티닌 및 SDMA 수준에 대한 이상적인 큰 변형은 하기 형태를 지닌다:
Figure pat00009
다양한 구체예에서, 칭량 인자 P 및 Q는 추가로 조절될 수 있다. 예를 들어, P는 약 -5에서 거의 0 미만(예, -0.01)으로 달라질 수 있다. 다시 말해서, P는 약 -5에서 -5 내지 0(0(제로)을 포함하지 않음)의 임의의 값으로 달라질 수 있다. 특정의 비-제한적 예에서, P는 약 -4.0 내지 -0.1, 약 -3.0 내지 -0.5, 약 -2.0 내지 -1.0, 및 약 -1.0 내지 0(0을 포함하지 않음)으로 달라질 수 있다. 독립적으로, Q는 -2.5 내지 거의 0 (예, -0.01)으로 달라질 수 있다. 다시 말해서, Q는 약 -2.5에서 -2.5 내지 0(0을 포함하지 않음)의 임의의 값으로 달라질 수 있다. 특정의 비-제한적 예에서, Q는 약 -2.0 내지 0.1, 약 -1.5 내지 -0.15, 약 -1.0 내지 -0.2, 약 -1.5 내지 -0.5, 약 -1.2 내지 -0.8, 및 약 -1.0 내지 0(0을 포함하지 않음)으로 달라질 수 있다.
특정 구체예에서, 사구체 여과율은 동물 대상체의 신장 기능을 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 사구체 여과율은 동물 대상체의 신장 질환 또는 기능 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 신장 질환 및 장애(예, 신장 감손, 신기능부전, 만상 신장 질환, 사구체신염, 당뇨병성 신경증, 간질성 신염, 다낭성 신장 질환, 및 고혈압성 신장 질환)은 GFR을 포함하여 전반적인 신장 기능을 감소시키는 경향이 있고, 본원에 기재된 방법을 이용하여 진단될 수 있다. 예를 들어, 질환을 앓거나 질환이 의심되는 것으로 알려진 동물의 사구체 여과율은 하나 이상의 예를 들어 건강한 대상체의 집단의 사구체 여과율과 비교될 수 있다. 대상체의 비율이 건강한 대상체(들)의 비율보다 낮은 경우에 신장 질환 및 장애로 예측될 수 있다. 특정의 구체예에서, 사구체 여과율이 동일한 종의 건강한 동물 집단에 대한 평균 값보다 통계적으로 유의하게 낮은 경우(즉, [크레아티닌]P[SDMA]Q과의 상관관계를 이용하여 추정하는 경우), 신장 질환 또는 기능 장애로 진단될 수 있다. 비-제한적 예에서, 대상 동물의 GFR은 두 표준 편차보다 차이가 큰 경우에 건강한 집단의 평균 GFR보다 통계적으로 유의하게 낮다.
한 가지 양태에서, 본 개시 내용은 GFR 또는 신장 질환 또는 기능 장애와 관련된 방정식의 표준 값의 수집에 관한 것이다. 수집은 도 7에 도시왼 바와 같이 GFR이 있는 방정식의 값과 연관성이 있는 표준 곡선과 관련될 수 있다. 다른 구체예에서, 값 또는 표준 곡선은 신장 질환 또는 기능 장애와 관련된다. 표준 값은 본원에 기재된 바와 같은 컴퓨팅 장치와 관련된 기계 판독가능한 명령으로 또는 헬쓰 케어 공급업자에 의해 참조되는 표 또는 차트의 형태로 표시될 수 있다.
또 다른 양태에서, 신장 질환 또는 장애는 GFR을 결정하는 중간 단계 없이 상기 기재된 바와 같은 크레아티닌과 SDMA의 농도의 곱을 포함한 방정식으로부터 진단될 수 있다. 이에 따라서, 값을 생성시키는 방정식을 이용하여 값은 질환 또는 기능 장애와 관련되는 것으로 알려진 표준 값 또는 일련의 표준 값들과 비교될 수 있다. 한 가지 양태에서, 계산하는 것은 참조 실험실에서 실시되며, 방정식으로부터의 값은 의사, 수의사, 또는 그 밖의 동물 헬쓰 케어 공급업자에게 보고될 수 있다. 공급업자는 신장 질환 또는 기능 장애와 연관성이 있는 것으로 알려진 하나 이상의 공지된 일련의 값들과 값을 비교할 수 있다. 또 다른 양태에서, 참조 실험실은, 예를 들어, 컴퓨팅 장치에서 비교를 실시하고, 의사에게 최종 결과를 보고할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 동물로부터 채취된 샘플, 예를 들어, 혈청 샘플 중의 SDMA 및 크레아티닌 농도와 관련된 값의 합에 의한 신장 질환 또는 장애, 예컨대, 만성 신장 질환(CKD)의 진단에 관한 것이다. 식에는 신장 질환을 나타내는 역치 샘플 농도로부터 얻어진 SDMA 및 크레아티닌에 대한 컷오프 값이 이용된다. 컷오프 또는 역치 농도는 동물 집단을 샘플링하고, 당해 분야에 알려진 바와 같은 질환 상태와 상기 집단의 SDMA 및 크레아티닌의 농도의 관계를 알아봄으로써 결정될 수 있다. 다양한 구체예에서, SDMA 컷오프(SDMACUT)는 약 10 내지 약 20 μg/dL, 더욱 특히 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 μg/dL, 더욱 더 특히 약 14 μg/dL일 수 있다. 크레아티닌 컷오프는 약 1.3 내지 약 2.5 또는 약 1.7 내지 약 2.8 mg/dL, 더욱 특히 약 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 및 2.8 mg/dL일 수 있다. 컷오프 값이 결정되면, SDMA 및 크레아티닌에 대한 컷오프 값과 비교된 환자 샘플 중의 SDMA와 크레아티닌의 농도의 합을 나타내는 값 (C)는 다음 식으로 얻어질 수 있다: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT. C가 CCUT보다 큰 경우, 환자는 신장 질환으로 진단된다.
CCUT는 검정에 대한 민감도와 특이성이 최적으로 조합된 값을 선택함으로써 결정된다. 도 13은 상이한 CCUT 값이 특이성 및/또는 민감도에 어떻게 영향을 미치는 지를 도시한 것이다. CCUT는 신장 질환의 검출을 위한 요망되는 수준의 특이성 및/또는 민감도를 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 도 13에 도시되어 있는 데이터 세트의 경우, CCUT = 1.6일 때 검출의 민감도와 특이성 둘 모두는 90%를 초과한다. 전형적으로, 더 높은 CCUT 값은 더 높은 특이성과 더 낮은 민감도를 생성시킨다. 반대로, 더 낮은 CCUT 값은 전형적으로 더 낮은 특이성과 더 높은 민감도를 생성시킬 것이다.
본 개시 내용은 또한 상기 기재된 계산을 수행하기 위한, GFR을 결정하기 위한, 또는 신장 질환 또는 기능 장애를 진단하기 위한 컴퓨팅 장치에 관한 것이다. 컴퓨팅 장치에는, 실행 시에 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱을 포함하여 방정식으로부터 값을 계산하는 소프트웨어 명령을 위한 메모리 저장을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시 내용은 환자 또는 동물 대상체의 조기 또는 이른 사망을 예측하기 위한 예후 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에 따르면, 고양이는, SDMA 값이 CRE 값보다 이들의 각각의 정상적인 컷오프 값에 비해 훨씬 더 큰 정도로 상승되는 [SDMA]와 [CRE] 사이에 흔치 않은 부조화가 존재하는 경우에 조기 사망의 위험성이 증가된다. 한 가지 구체예에서, 이러한 방법은 혈청 중 비율 [SDMA]/[CRE]이 특정 역치 값 T보다 큰 경우에 조기 사망의 진단을 제공한다.
예를 들어, [SDMA]가 μg/dL(마이크로그램/데시리터)로 표시되고 [CRE]가 mg/dL(밀리그램/데시리터)로 표시되는 경우, T는 약 4 내지 약 10(즉, 약 4 μg/dL의 SDMA : 1mg/dL의 크레아티닌 내지 약 10 μg/dL의 SDMA : 1mg/dL의 크레아티닌)의 값으로 추정될 수 있다. 다양한 구체예에서, 역치 값 T는 약 7 내지 20, 더욱 특히 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. 당업자는 CRE 및/또는 SDMA의 농도가 상기 주어진 단위와 상이한 측정 단위로 표시되는 경우에 [SDMA]/[CRE]의 역치 값은 방법의 목적 및 예후 용도에 영향을 미치지 않으면서 이에 따라서 그리고 비례하여 변화될 수 있음을 이해할 것이다.
게다가, 조기 사망의 위험성은 비율 [SDMA]/[CRE]의 값이 증가함에 따라서 증가될 수 있다. 예를 들어, [SDMA]/[CRE] = 40인 개체는 [SDMA]/[CRE] = 12인 개체보다 조기 사망의 위험성이 더 높을 수 있다.
또한, [SDMA]의 특이한 갑작스런 증가는 조기 사망 위험성 증가에 대한 예후이다. 유사하게, 특이하게 높은 [SDMA] 값은 이른 사망 위험성 증가에 대한 예후이다. 예를 들어, 고양이의 특이하게 높은 [SDMA] 값은 약 25 μg/dL 초과, 약 30 μg/dL 초과, 또는 약 30 μg/dL 초과의 값일 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 개시 내용은 사망률이 예측되는 혈청 SDMA 농도에 관한 것이다. 예를 들어, 도 19 및 20에 도시된 바와 같이, 14 μg/dL보다 큰 SDMA 혈청 농도는 고양이 및 개의 사망률과 관련된 것으로 보여진다. 이에 따라서, 본 개시 내용은 사망률이 가장 잘 예측되는 적절한 SDMA 농도의 컷오프 값을 알아보는 것에 관한 것이다. 한 가지 양태에서, 컷오프 값은 약 10-20 μg/dL, 더욱 특히 약 12-18 μg/dL, 또는 약 14-16 μg/dL의 범위이다. 적절한 컷오프 농도를 알아보는 것은, 예를 들어, 개 또는 고양이 그룹의 각각의 구성원에서 혈청 SDMA의 농도를 측정하고, 상기 그룹의 각각의 구성원이 사망할 때까지 몇 달 또는 몇 년의 기간에 걸쳐서 측정을 반복함으로써 결정될 수 있다. 임의로, 그룹의 모든 개 또는 고양이는 CKD로 진단되었다. 상이한 후보 SDMA 농도 컷오프 값 및 역치 값으로 감소된 생존 시간을 예측하는 능력에 대하여 시험하였다. 그러한 시험은, 예를 들어, Kaplan-Meier 생존 곡선의 이용을 통해 수행될 수 있다.
Kaplan-Meier 생존 곡선은 생존률의 예측을 나타내는데 사용될 수 있다. Kaplan-Meier 곡선은 특히 모든 대상체가 계속 연구되지 않는 경우에 상이한 생존 시간으로 처리하는 일반적인 방식이다(시간-대-사건). 각각의 대상체는 다음과 같은 3개의 변수에 의해 특성화된다: 이들의 연속 시간, 이들의 생존 시간의 말미에서 이들의 상태(사건 발생 또는 검열); 이들이 존재하는 연구 그룹(예, SDMA < 또는 ≥ 14). 사건은 일반적으로 사망, 종양의 사라짐 등과 같은 임상적 결과이다. 연구 시간은 관심의 대상이 되는 사건이 출발 시점으로부터 발생할 가능성이 있는 기간이다. 모든 참가자에게 이러한 사건이 나타나기 전에, 심지어 남은 참가자의 결과를 모르는 경우에도 연구가 종결되는 시점에 이르게 된다. 도 19 및 20은 14 μg/dL 미만의 혈청 SDMA 농도를 지니는 고양이 및 개가 14 μg/dL 또는 그 초과의 농도를 지니는 고양이 및 개보다 약 1.6 및 2.6배(각각) 더 길게 생존한다는 것을 나타내는 Kaplan-Meier 생존 곡선이다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 건강한 동물 및 질환이 있는 동물의 SDMA에 대한 크레아티닌의 비율을 결정하는 방법, 및 신장 질환 및 신장 질환과 관련된 사망률의 결정을 위한 그러한 비율의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 건강한 동물의 SDMA (μg/dL) 및 크레아티닌 (mg/dL)의 농도는 일반적으로 약 4:1 내지 10:1 (ug/dL:mg/dL) 범위의 비율이다. 그러나, 몇몇 만성 신장 질환 환자의 SDMA 값은 상응하는 크레아티닌 값보다 유의하게 더 높은데, 이는 질환의 진행을 나타낼 수 있다. 이에 따라서, SDMA:크레아티닌 비율의 부조화로 동물의 사망률을 예측할 수 있다. 도 14에 도시된 바와 같이, SDMA과 크레아티닌 사이에는 강한 상관 관계가 있으며, 보통 비율은 10 (μg/dL:mg/dL) 미만이다. 그러나, 10 초과의 크레아티닌 (mg/dL)에 대한 SDMA 농도 (μg/mL)의 비율은 흔히 사망을 초래하는 신장 질환의 악화를 나타낸다.
이에 따라서, 혈청 중 크레아티닌 농도에 대한 SDMA 농도의 비율을 이용하여 질환 및/또는 사망률이 예측된다. 따라서, 본 개시 내용은 신장 질환 또는 신장 질환과 관련된 사망을 결정하거나 예후함을 포함한다. 이러한 방법은 동물, 특히 고양이 및 개로부터의 혈액, 예를 들어, 혈청 샘플 중의 SDMA 및 크레아티닌의 농도를 측정함을 포함한다. 농도가 측정되면, SDMA와 크레아티닌의 비율이 신장 질환 및 신장 질환으로 인한 사망 가능성의 존재, 정도 또는 진행을 결정하기 위해 컷오프 비율과 비교될 수 잇다. 컷오프 비율은 약 5-15 (SDMA(μg/dL) : 크레아티닌(mg/dL)), 더욱 특히 약 7-13 또는 약 9-11, 더욱 더 특히 약 10일 수 있다. 10초과의 SDMA:크레아티닌 비율을 지니는 동물은 조기 사망 가능성이 증가되는 것으로 특성화될 수 있다. 일반적으로, 비율이 높을수록 임박한 사망의 가능성이 높아진다. 예를 들어, 도 15는 고양이 집단에 대한 SDMA:크레아티닌 비율을 나타낸 것이다. 2마리의 고양이는 약 19 및 34의 비율을 지니고, 각각 연구 기간 내에 사망하였다. 도 16, 17 및 18은 비율이 약 10 초과로 확인된 후에 약 2년 이내에 사망한 3마리의 고양이에 대한 종단적 연구의 결과를 나타낸 것이다. 이러한 고양이들 중 한 마리는 비율이 20 초과로 확인된 후에 약 한 달 이내에 사망하였다(도 18).
신장 질환 또는 기능 장애가 진단되면, 이러한 방법은 신장 질환 또는 기능 장애에 대하여 동물 대상체를 치료함을 포함한다. 이러한 치료는, 예를 들어, 투석, 신장 이식, 항생물질 요법(예, 신장 기능 장애가 기본적인 간염으로 인한 경우), 음식 처방; 기본적인 전신 염증, 감염, 또는 종양 질환(예, 신장 기능 장애가 단백질 손실 신장병으로 인한 경우)의 치료; 포메파졸(fomepazole) 또는 에탄올의 투여(예, 에틸렌 글리콜 독성의 경우); ACE 억제제의 투여, 적당한 단백질-제한 음식 및/또는 오메가-3 지방산 보충(예, 단백뇨의 경우); 인산염 결합제의 투여 및/또는 인-제한 음식(예, 고인산혈증의 경우); IV 수액, 피하 수액 요법, 저 단백질 식사 및/또는 H2 수용체 길항제로의 치료(예, 고질소혈증의 경우); 암로디핀(amlodipine), 아테놀로(atenolo) 및/또는 ACE 억제제(예, 전신성 고혈압의 경우); 바이카보네이트 및/또는 시트레이트(예, 산성증(acidosis)의 경우); 비타민 D 유사물, 예컨대, 칼시트리올 또는 1,25-디하이드록시비타민 D, 인산염 결합제(바람직하게는 Ca-기반 아님)의 투여 및/또는 인-제한 식사(예, 신장의 속발성 부갑상선기능항진증의 경우); 및/또는 H2 수용체 길항제 및/또는 인간 재조합 에리스로포이에틴(erythropoietin)(가능하게는 철 보충된)의 투여(예, 빈혈의 경우)를 포함할 수 있다.
특정의 구체예에서, 유리 SDMA의 농도는, 전체는 본원에 참조로 포함되는, 2008년 8월 7일자 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/086,870호, 2009년 7월 30일자 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제12/512,479호, 및 2010년 2월 11일자 공개된 미국 특허 출원 공보 제2010/0035274호에 개시된 면역학적 방법, 장치 및 키트를 이용하여 측정되며, 상기 출원들의 된다. 방법은 제어기, 보정기 또는 하나 이상의 SDMA 유사체를 포함하는 표준물을 포함할 수 있다. 특히, 방법은, 마이크로플레이트 및 측면 유동 장치를 사용함을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 당해 분야에 잘 알려진 면역검정 기술을 이용하여 수행될 수 있다. SDMA를 검출하기 위해 샘플이 얻어지는 동물 대상체로는 인간 및 비-인간 동물(예, 반려 동물, 가축 등) 대상체가 포함된다. SDMA의 존재 또는 양과 관련된 질환 상태의 결정은 인간과 비-인간 대상체 둘 모두에 대하여 실시될 수 있다.
고체상 검정 형식이 결합 검정 기술에 흔하게 사용된다. 분석물의 존재가 컨쥬게이트 및/또는 고정된 상보적 결합원에 대한 분석물의 결합에 의해 지시되는 다수의 검정 장치 및 절차가 있다. 한 가지 특정 양태에서, 고정된 결합원(예, 항-SDMA 항체)은 고체상, 예컨대, 반응 웰, 딥스틱(dipstick), 시험 스트립, 유동 패드, 페이퍼, 섬유 매트릭스 또는 그 밖의 적합한 고체상 물질에 결합되거나, 검정 동안 결합되어 있다. 샘플 중의 유리 SDMA와 고정된 항체 사이의 결합 반응은, 표지에 컨쥬게이션된 SDMA를 포함하는 소정량의 SDMA 유사체를 샘플에 첨가함으로써 결정된다. 고체상에 샘플과 SDMA 유사체의 혼합물을 접촉시킨 후에, 혼합물과 고체상은 고정된 항체, SDMA 및 SDMA 유사체 사이에 결합이 가능하도록 인큐베이션된다. 인큐베이션 후, 비결합된 반응물이 고체상으로부터 제거된다. 유사체에 대한 항체의 결합을 통해 항체와 관련된 표지의 양이 측정된다. 항체와 관련된 표지의 양은 샘플 중의 유리 SDMA의 양과 반비례한다.
장치 또는 고체 지지체 위에서 SDMA에 대한 하나 이상의 항체의 고정은 항체가 샘플, 희석제 및/또는 세척 과정에 의해 세척되지 않도록 수행된다. 하나 이상의 항체는 물리적 흡착에 의해(즉, 화학적 연결제의 사용 없이) 또는 화학적 결합에 의해(즉, 화학적 연결제의 사용으로) 표면에 부착될 수 있다. 화학적 결합은 표면 상의 항체의 부착을 더 강하게 만들고, 표면-결합된 분자의 형태 및 배향의 지정을 제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 특정 종에서 상승된 SDMA 항체는 지지체에 결합된 항-종 항체와의 상호 작용에 의해 고체 지지체에 결합된다. 한 가지 특정 양태에서, 항-SDMA 항체가 토끼에서 증가되며, 지지체에는 토끼에서 증가된 항-SDMA 항체를 인식하는 항-토끼 항체가 결합된다. 이러한 양태에서, 항체는 종으로부터 얻어진 항-혈청의 형태일 수 있다. 항-SDMA 항체는 고체상에 샘플을 첨가하기 전에 항-종 항체를 지니는 고체상에 적용될 수 있거나, 항-SDMA 항체가 샘플을 고체상에 첨가하기 전에 샘플과 혼합될 수 있다. 어느 하나의 경우에, 항-SDMA 항체는 고체 상에서 항-종 항체에 결합함으로써 고체상에 결합된다.
또 다른 구체예에서, 하나 이상의 표지된 항체는 고체 지지체에 혼합물을 적용하기 전에 시험 샘플과 혼합될 수 있다. 이러한 경우에, SDMA 유사체는 샘플, 희석제 및/또는 세척 과정에 의해 세척되지 않도록 고체 지지체에 부착될 수 있다. 샘플 중의 표지된 항체는 샘플 중의 SDMA에 결합하고, 이에 따라서, 고체 지지체 상에서 SDMA 유사체와 결합하는데 이용가능하지 않다. 고체 지지체에 대한 혼합물의 적용, 및 적절한 인큐베이션 후, 혼합물은 고체 지지체로부터 세척된다. 샘플 SDMA에 결합되지 않은 항체는 고체 지지체 상에서 SDMA 유사체에 결합될 것이다. 샘플 중의 SDMA의 존재 또는 양은 SDMA 유사체에 결합된 항체의 양에 반비례한다. 항체 상의 표지와 관련된 신호는 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다.
도 1은 SDMA가 첨가된 개의 혼주 혈청에서 SDMA를 검출하는 ELISA 방법과 질량 분광기를 사용한 SDMA의 검출의 비교를 도시한 것이다. 도시된 바와 같이, 본원에 기재된 ELISA를 사용하여 얻어진 SDMA 농도 값은 MS를 사용하여 얻어진 값과 크게 상관관계가 있다.
항체:항원 복합체의 검출은, 예를 들어, 비탁법, 효소 표지, 방사표지, 발광, 또는 형광과 같은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 기술을 통해 달성될 수 있다. 면역검정법은 방사면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA), 형광 편광 면역검정(FPIA), 마이크로입자 효소 면역검정(MEIA), 효소 증대 면역검정 기술(enzyme multiplied immunoassay technology: EMIT) 검정, 면역 비탁 또는 응집 검정, 콜로이드성 금 기반 면역 검정, 예컨대, 측면 유동 장치 및 화학발광 자성 면역검정(chemiluminescent magnetic immunoassay: CMIA)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 것으로 인지된다. RIA에서, 항체 또는 항원은 방사능으로 표지되고, 경쟁적 또는 비경쟁적 형식으로 사용된다. EIA에서, 항체 또는 항원은, 측정되는 생성된 신호, 예컨대, 색 변화로 기질을 생성물로 전환시키는 효소로 표지된다. FPIA에서, 항원은 형광 표지로 표지되고, 시료로부터의 비표지된 항원과 경쟁한다. 측정된 분석물의 양은 측정된 신호의 양과 반비례한다. MEIA에서, 고체상 마이크로입자는 관심의 대상이 되는 항원에 대한 항체로 코팅되고, 분석물을 포집하는데 사용된다. 검출을 위한 항체는 EIA 방법에서와 같이 효소로 표지된다. 측정된 분석물의 농도는 측정된 신호의 양에 비례한다. CMIA에서, 화학발광 표지는 항체 또는 항원에 컨쥬게이션되고, 이의 기질과 조합되는 때에 광을 발생시킨다. CMIA는 경쟁적 또는 비경쟁적 형식으로 구성될 수 있고, 존재하는 분석물의 양에 각각 반비례하거나 비례하는 결과를 생성시킨다.
특이적 결합 검정에서 시약-함침 시험 스트립의 사용이 또한 잘 알려져 있다. 그러한 과정에서, 시험 샘플은 시험 스트립의 일부에 적용되고, 스트립 물질을 통해 이동되거나 위킹(wicking)되는 것을 가능하게 한다. 따라서, 검출하거나 측정하고자 하는 분석물은 가능하게는 시험 샘플 자체 또는 개별적으로 첨가된 용액일 수 있는 용리 용매의 도움으로 물질을 통해 또는 물질을 따라 통과된다. 분석물은 시험 스트립 상에서 포집 또는 검출 구역으로 이동하며, 여기서 분석물에 대한 상보적 결합원이 분리된다. 분석물이 검출 구역에서 결합되는 정도는 시험 스트립에 또한 도입될 수 있거나 별도로 적용될 수 있는 컨쥬게이트의 도움으로 측정될 수 있다. 한 가지 구체예에서, SDMA에 대해 특이적인 항체는 별개의 위치로 고체 지지체 상에서 분리된다. 샘플의 첨가 후, 고체 지지체 상의 SDMA-항체 복합체의 검출이 당해 분야에 공지된 어떠한 수단에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,726,010호에는 측면 유동 장치인 SNAP® 면역검정 장치(IDEXX Laboratories)의 예가 기재되어 있다.
그 밖의 검출 기술에는 자성 입자 또는 마이크로비드, 예를 들어, 초상자성 산화철 함침 폴리머 비드가 사용된다. 이러한 비드는, 예를 들어, 분석물에 대한 특이적 결합 파트너와 관련된다. 비드는 시험되는 샘플에서 타겟 분석물과 결합된 후, 전형적으로 자기로 용액으로부터 격리되거나 분리된다. 격리가 발생하면, 임의로 직접적으로 또는 카메라에 의해 특정 이미지 또는 표지를 관찰하는 것을 포함하여 다른 시험이 실시될 수 있다.
추가의 구체예에서, SDMA 유사체, 특히, 티올-함유, 하이드록실-함유, 아미노 함유, 및 카복실레이트 함유 SDMA 유사체는 SDMA가 또 다른 분자(컨쥬게이션 표적), 예컨대, 활성화 단백질에 링킹되어 SDMA 컨쥬게이트를 형성시킬 수 있게 한다. 본원에 기재된 SDMA 유사체는 SDMA가 컨쥬게이션 표적, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 검출가능한 표지, 및 고체 지지체 등에 링킹되어 SDMA 컨쥬게이트를 제공할 수 있게 한다. 본원에 기재된 SDMA 컨쥬게이트는 SDMA에 대해 특이적인 면역 검정에서 사용하기 위한 항체를 제공하는데 사용될 수 있다. 항체는 아르기닌, ADMA, 및/또는 모노메틸아르기닌과 교차-반응성을 지니지 않거나, 거의 지니지 않는다. SDMA 유사체는 또한 SDMA에 특이적인 면역검정에서의 사용을 위해 표지에 컨쥬게이션될 수 있다.
SDMA 유사체는, 예를 들어, 하기 구조를 지닐 수 있다:
Figure pat00010
상기 식에서, x 및 y는 1 내지 5 범위의 정수이다.
한 가지 구체예에 따르면, SDMA 유사체는 하기 일반식을 지닌다:
Figure pat00011
상기 식에서, R1은 티올(또는 보호된 티올), 하이드록실(또는 보호된 하이드록실), 아미노(또는 보호된 아미노) 기, 또는 카복실레이트(카복실산 포함) 또는 보호된 카복실레이트 기일 수 있다.
적합한 티올, 하이드록실, 아미노, 및 카복실레이트 보호 기는, 예를 들어, 문헌[T.W. Greene, et al. Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. (1999)]에 기재된 것들과 같이 당업자에게 알려져 있다.
한 가지 특정 구체예에서, SDMA 유사체는 하기 화학식(3)의 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pat00012
화학식 (3)의 화합물은 적절한 "티올-반응성 부위", 즉, 티올 기와 반응할 부위를 포함하는 컨쥬게이션 표적과 반응할 수 있는 이용가능한 티올을 제공한다. 예를 들어, 말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, 및 알파-할로아실은, 티올과 반응하여 티오-에테르를 형성시킬 수 있는 예시적인 티올-반응성 부위이다. 유사하게, 피리딜 디설파이드는 티올과 반응하여 혼합된 디설파이드를 형성시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, R1은 X-R2이고, 여기서 X는 -S-, -O-, -N-, 또는, -COO-이고, R2는 티올, 하이드록실, 아미노, 또는 카복실레이트 반응성 기를 지니는 표지이다.
한 가지 구체예에서, R1은 X-R2이고, 여기서 X는 -S-, -O-, -N-, 또는, -COO-이고, R2은 티올, 하이드록실, 아미노, 또는 카복실레이트 반응성 기를 포함하도록 작용화된 단백질이다.
한 가지 구체예에서, SDMA는 DMA를 포함하는 에피토프에 대한 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있는 "합텐-담체" 면역원을 형성시키기 위해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 예시적인 면역원 단백질로는 BSA, KLH, 및 오브알부민을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 면역원 단백질에 대해 합텐을 컨쥬게이션하기 위한 프로토콜은 당해 분야에 알려져 있다[참조예: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988) pp. 78-87].
한 가지 구체예에서, SDMA 유사체는, 예를 들어, 말레인이미드 활성화 열쇠구멍 삿갓조개 단백질(keyhole limpet protein: KLH) 또는 말레인이미드 활성화 소 혈청 알부민(bovin serum albumin: BSA)과 같은 말레인이미드 활성화 단백질에 컨쥬게이션된다.
한 가지 구체예에서, 화학식 (3)의 화합물은, 예를 들어, 말레인이미드 활성화 열쇠구멍 삿갓조개 단백질(KLH) 또는 말레인이미드 활성화 소 혈청 알부민(BSA)와 같은 말레인이미드 활성화 단백질에 컨쥬게이션된다.
따라서, 특정의 구체예에서, 화학식 (3)의 화합물과 말레인이미드 활성화 단백질의 컨쥬게이트는 하기 화학식을 지닌다:
Figure pat00013
상기 식에서, m은 정수이다.
전형적으로, m은 5 초과이다. 그러나, m에 대한 값은 가변적이다. 예를 들어, m은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능한 말레인이미드 활성화 BSA에서 단백질 당 약 15개의 말레인이미드 기이고; m은 Sigma-Aldrich로부터 시중에서 구입가능한 말레인이미드 활성화 KLH에서 단백질 당 약 80개의 말레인이미드 기이고; m은 Thermo Scientific(Pierce)의 단백질 연구 제품(Rockford)으로부터 시중에서 입수가능한 말레인이미드 활성화 BSA에서 단백질 당 약 15 내지 약 25개 범위의 말레인이미드 기이고; m은 Thermo Scientific(Pierce)의 단백질 연구 제품으로부터 시중에서 구입가능한 말레인이미드 활성화 KLH에서 단백질 당 약 400개 초과의 말레인이미드 기이고; m은 A. G. Scientific(San Diego, CA)로부터 시중에서 구입가능한 말레인이미드 활성화 KLH에서 단백질 당 약 150개 내지 약 300개 범위의 말레인이미드 기이다. 일반적으로, m은 면역원성 단백질에 존재하는 이용가능한 아민 기의 갯수에 의해 제한된다. 이용가능한 아민의 갯수는 폴리아민에 면역원성 단백질을 컨쥬게이션함으로써 증가될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 5 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 10 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 25 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 50 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 75 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 5 내지 약 80의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 75 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 10 내지 약 80의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 75 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 20 내지 약 80의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 75 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 BSA이고, m은 약 30 내지 약 80의 범위이다.
한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 50 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 100 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 200 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 300 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 400 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 500 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 600 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 700 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 800 초과이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 내지 약 800의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 내지 약 600의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 내지 약 400의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 내지 약 200의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 5 내지 약 100의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 100 내지 약 200의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 100 내지 약 300의 범위이다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 100 내지 약 400의 범위이다. 다양한 양태에서, 단백질은 KLH이고, m은 약 100 내지 약 500, 약 100 내지 약 600, 약 100 내지 약 700, 약 100 내지 약 800, 또는 약 100 내지 약 1,000의 범위이다.
화학식 (3)의 화합물과 말레인이미드 활성화 단백질의 컨쥬게이트는 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 특성화될 수 있다[참조예: 말레인이미드 활성화 BSA, KLH 컨쥬게이션 키트 (카탈로그 no. MBK1)에 대한 Sigma-Aldrich 기술 회보].
대안적인 구체예에서, SDMA 유사체는 티올, 하이드록실, 아미노, 또는 카복실레이트 기를 통해 검출가능한 표지에 링킹된다. 표지는 자체로 검출가능할 수 있거나(예, 방사성동위원소 표지, 화학발광 염료, 전기화학적 표지, 금속 킬레이트, 라텍스 입자, 또는 형광 표지), 효소적 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매작용할 수 있다(예, 양고추냉이 과산화효소, 및 알칼리성 인산가수분해효소 등과 같은 효소). 표지는 자체로 검출가능할 수 있는 특이적 결합 분자일 수 있다(예, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 디곡시게닌, 말토오스, 올리고히스티딘, 2,4-디니트로벤젠, 페닐아르세네이트, ssDNA, dsDNA 등). SDMA는 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 검출가능한 표지에 링킹될 수 있다. 예시적인 예로서, SDMA 유사체는 양고추냉이 동결건조 분말로부터 약 200개 초과의 단위/mg 단백질의 말레인이미드 활성화 과산화효소(제품 메뉴얼에서의 지시에 따라 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(카탈로그 no. P1709))에 링킹될 수 있다.
화학식 (3)의 유사체는 하기 예시적인 합성식(1)에 의해 SDMA(EMD Chemicals Inc.(Gibbstown, NJ)로부터 시중에서 구입가능)로부터 제조될 수 있다:
식 1:
Figure pat00014
SDMA의 1차 및 2차 아미노 기는 SDMA를 디-3차-부틸디카보네이트 (Boc2O)와 반응시킴으로써 보호된다. 그 후에, 생성된 3차-부톡시카보닐 (BOC) 보호된 SDMA ((Boc3)-SDMA, 1)는 수지에 링킹된다. 예를 들어, (Boc3)-SDMA (1)은 디메틸 포름아미드 (DMF) 중의 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우라늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미니늄 (HATU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)의 존재 하에 (Boc3)-SDMA (1)을 수지와 접촉시킴으로써 시스테아민-4-메톡시 트리틸 수지 (EMD Chemicals, Inc.(Gibbstown, NJ)로부터 시중에서 구입가능)에 링킹되어 수지 결합된 (Boc3)-SDMA 시스타미드 (2)를 제공할 수 있다. 수지 결합된 (Boc3)-SDMA 시스타미드 (2) 상의 BOC 보호기는 제거되고, 생성된 수지 결합된 SDMA 시스타미드는, 예를 들어, 디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산을 사용하여 수지로부터 절단되어 SDMA 시스타미드 (3)을 제공하고, SDMA 시스타미드 (3)는 염산과의 반응에 의해 하이드로클로라이드 염 (4)으로 전환된다.
상기 기재된 화학식 A-D의 유사체는 식 1에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
그 후에, 말레인이미드 활성화 단백질은 SDMA 시스타미드 (3)과 반응하여 하기 식 II에 기재된 바와 같은 SDMA 시스타미드 단백질 컨쥬게이트를 제공할 수 있다:
식 II:
Figure pat00015
상기 식에서, n은 1 내지 3 범위의 정수이고, m은 상기 정의된 바와 같은 정수이다.
생성된 컨쥬게이트는, 이로 제한되지는 않지만, 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어, 고체 지지체로서 Sephadex (예, Sephadex G-25M)를 지니는 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 (Sigma-Aldrich로부터 시중에서 구입가능)를 포함하는 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 정제될 수 있다.
유사체 A-D의 컨쥬게이트는 식 2에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
화학식 A-D의 유사체와 말레인이미드 활성화 KLH 또는 말레인이미드 활성화 BSA의 컨쥬게이트는, SDMA(즉, 항-SDMA 항체)를 실질적으로 결합하고 ADMA, L-아르기닌, 및/또는 N-메틸아르기닌과 교차 반응을 나타내지 않거나 실질적으로 나타내지 않는 항체를 발생시키기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 화학식 (3)의 유사체와 말레인 이미드 활성화 KLH 또는 말레인이미드 활성화 BSA의 컨쥬게이트는 SDMA를 실질적으로 결합하는 항체(즉, 항-SDMA 항체)를 발생시키기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러한 항체는 ADMA, L-아르기닌, 및/또는 N-메틸아르기닌과 교차 반응을 나타내지 않거나 실질적으로 나타내지 않는다.
본 개시 내용의 방법, 장치 및 키트에 유용한 항-SDMA 항체는 ADMA, 아르기닌, 및/또는 모노메틸아르기닌과 교차 반응을 지니지 않거나 거의 지니지 않으면서 SDMA에 결합하는 높은 친화성에 의해 특성화된다. 이에 따라서, 분리, 재조합, 합성, 및/또는 생체내-생산된 항-SDMA 항체뿐만 아니라, 진단 및 치료 조성물, 방법, 및 장치를 포함하여 그러한 항체를 제조하고 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 항-SDMA 항체는, 예를 들어, 신장 기능, 예컨대, 신장 감손, 신기능부전, 사구체 여과율 (GFR), 이눌린 청소율, 및 크레아티닌 청소율을 위한, 및 신장 장애/질환, 예컨대, 만성 신장 질환, 사구체신염, 당뇨병성 신장 질환, 간질성 신염, 다낭포성 신장 질환, 및 고혈압성 신장 질환을 위한 진단용 표지로서 유용하다.
한 가지 구체예에서, 생성된 항체는 유리 SDMA(즉, 폴리펩티드 사슬의 일부가 아닌 SDMA)를 검출하고, ADMA, L-아르기닌, 및/또는 N-메틸아르기닌과 교차 반응을 나타내지 않거나 실질적으로 나타내지 않을 수 있다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본원에 기재된 항체는 동일한 농도의 항원을 기준으로 하여 ADMA, L-아르기닌 및/또는 N-메틸아르기닌과 1% 미만의 교차 반응성을 나타낸다. 당업계에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 교차-반응성의 영향은 시험 샘플에서 면역화시키는 항원 (SDMA)와 비교되는 교차-반응 항원(예, ADMA, L-아르기닌 및/또는 N-메틸아르기닌)의 상대 존재비에 좌우될 것이다. 예를 들어, 50% 만큼 높은 교차-반응성은 면역화시키는 항원의 농도가 교차-반응하는 항원보다 100배 더 큰 경우에 허용가능할 수 있다. 반대로, 1% 만큼 낮은 교차-반응성은 교차-반응하는 항원의 농도가 면역화시키는 항원의 100배인 경우에 문제가 될 수 있다. 이에 따라서, 교차-반응성의 영향은 분석하고자 하는 샘플 중의 어떠한 교차-반응하는 항원 및 면역화시키는 항원의 상대 존재비의 맥락으로 고려되어야 한다. 본 개시 내용의 다양한 양태에서, 교차 반응성은 항-SDMA 항체에 대한 SDMA 또는 SDMA 유사체의 실질적인 결합에 영향을 미치지 않는다.
항체를 제조하기 위한 방법은 면역 반응을 자극하기 위해 면역원으로서 하나 이상의 SDMA 컨쥬게이트를 사용함을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 적합한 면역화 프로토콜을 사용하여 동물에게 하나 이상의 SDMA 컨쥬게이트를 투여하고, 예를 들어, 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이 동물의 체액(들)으로부터 적절한 항체를 분리함을 포함한다. 대안적으로, SDMA 컨쥬게이트는 적절한 항체를 이의 표면 상에 전시하는 파지를 선택하는 파지 전시법에 사용될 수 있고, 이어서 적절한 항체의 적어도 가변성 도메인 영역을 엔코딩하는 핵산 서열의 분리가 수행될 수 있다. 파지 전시법은 당업자에게 잘 알려져 있다[참조예: Antibody Phage Display; Methods in Molecular Biology, Vol. 178, O'Brien, Philippa M.; Aitken, Robert (Eds.) 2002]. SDMA에 대한 단클론성 항체는 일반적으로 당해 분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 SDMA 유사체는 SDMA에 대한 면역검정과 같은 수용체 결합 검정에서 사용하기 위한 검출가능한 컨쥬게이트를 제공하기 위해 표지에 링킹될 수 있다. 유사하게, 항-SDMA 항체는 SDMA에 대한 면역검정과 같은 수용체 결합 검정에 사용하기 위한 검출가능한 항-SDMA 항체를 제공하기 위해 표지에 링킹될 수 있다. SDMA 유사체 및 항-SDMA-항체는 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 표지에 링킹될 수 있다[참조예: Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology , Vol. 295, edited by R. Burns (2005)]. 검출가능한 SDMA 컨쥬게이트 또는 검출가능한 항-SDMA 항체는 시험 샘플 중의 SDMA의 존재 또는 양과 관련된 신호를 발생시키기 위해 다양한 균일, 샌드위치, 경쟁적, 또는 비-경쟁적 검정 형식으로 사용될 수 있다.
특정의 구체예에서, 면역검정 방법은 항-SDMA 항체의 검출을 위한 경쟁적 면역검정이다. 경쟁적 면역검정은 하기 예시적인 방식으로 수행될 수 있다. 잠재적으로 항-SDMA 항체를 함유하는 동물 체액으로부터의 샘플은 고체 지지체에 컨쥬게이션된 SDMA 유사체와 그리고 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된 항-SDMA 항체와 접촉된다. 샘플에 존재하는 관심의 대상이 되는 항-SDMA 항체는 고체 지지체에 컨쥬게이션된 SDMA 유사체와의 결합을 위해 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된 항-SDMA 항체와 경쟁한다. 고체 지지체와 관련된 표지의 양은 비결합된 항체와 고체 지지체를 분리한 후에 측정될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 경쟁적 면역검정은 하기 예시적인 방식으로 수행된다. 잠재적으로 항-SDMA 항체를 함유하는 동물의 체액으로부터의 샘플은 검출가능한 표지에 링킹된 SDMA 유사체와 이후 고체 지지체에 컨쥬게이션된 항체와 접촉된다. 샘플 중의 항-SDMA 항체는 검출가능한 표지에 링킹된 SDMA 컨쥬게이션과 결합을 위해 고체 지지체 상에서 항-SDMA 항체와 경쟁한다. 어느 하나의 경우에, 얻어진 신호는 샘플에 존재하는 관심의 대상이 되는 SDMA 항체의 양과 반비례 관계에 있다.
물론, 유리 SDMA를 측정하는 다른 방법이 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있다. SDMA 자체로 질환이 예측될 수 있다(도 2 및 3 참조).
혈청 중 크레아티닌의 농도는 당업자에 의해 알려진 바와 같은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, Catalyst DxTM Chemistry 분석기 또는 VetTest® Chemistry 분석기가 크레아티닌에 대하여 시험하도록 구성된 건조-슬라이드, 예를 들어, IDEXX Laboratories부터 시중에서 구입가능한 것과 함께 사용될 수 있다. 그 밖의 분석기 및 슬라이드, 예컨대, Ortho Clinical Diagnostics로부터 구입가능한 VITROS® 950 분석기 및 VITROS® CREA 슬라이드가 또한 사용될 수 있다. 효소적 습식 검정이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 Integra 800 분석에 대하여 효소적 습식 화학 방법을 이용할 수 있다. 한 가지 특정 검정은 552 nm에서의 검출 및 659 nm에서의 흡광도 블랭킹을 지니는 크레아티니나아제/크레아티나아제/사르코신 산화효소계를 기초로 한다. 당업자는 또한 비색법, 예를 들어, Jaffe 검정과 같은 피크레이트를 기초로 한 방법을 이용할 수 있다. 당업자에게 알려진 다른 방법, 예컨대, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공보 제2005/0266574호 및 미국 특허 제4,818,703호에 기재된 방법들이 또한 크레아티닌 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 특정의 구체예에서, 크레아티닌 농도의 측정은 동위원소 희석 질량 분광기를 사용하여 수행된다.
GFR을 측정하는 여러 방법이 알려져 있다. 예를 들어, GFR은 각각 본원에 전체가 참조로 포함되는 Perrone 등의 문헌[Am. J. Kidney Disease, vol. 16, pp 224-35 (1990)] 및 Levey 등의 문헌[J. Am. Soc. Nephrol., vol. 4, pp. 1159-71 (1993)]에 기재된 바와 같이 125I-아이오탈라메이트의 신장 청소율로 측정될 수 있다. 다른 외인성 물질, 예를 들어, 51Cr-EDTA, 99Tc-DTPA, 아이오헥솔, 또는 이눌린의 신장 청소율을 측정함을 포함하여 다른 소변 채취-기반 방법이 또한 이용될 수 있다. 어떠한 이러한 방법에 의해 얻어진 GFR 값은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 보정 곡선 또는 표준 값을 제공하기 위해 동시에 채취된 샘플에 대한 크레아티닌과 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수와 연관성이 있을 수 있다.
하기는 단지 예시의 목적으로 제공된 것이며, 상기 넓은 용어로 기재된 본 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것이 아니다. 본 개시 내용에서 언급되는 모든 참조 문헌들은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: SDMA 시스타미드 (3)와 SDMA 시스타미드 하이드로클로라이드 염 (4)의 합성
식 1에 기재된 합성 방법에 따라 SDMA 시스타미드 (3)를 제조하였다.
(BOC)3-SDMA (1): 20 mL의 디옥산 중의 4.36 g (20 mmol)의 디-3차-부틸디카보네이트 (Boc2O)의 용액에 10 mL의 5.0 N NaOH 중에 용해된 550 mg (2.0 mmol)의 N, N-디메틸아르기닌 디하이드로클로라이드 (SDMA) (EMD Chemicals Inc.(Gibbstown, NJ)로부터 시중에서 구입가능)를 교반하면서 실온에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 그 후에, 30 mL의 디클로로메탄 (DCM) 및 30 mL의 물을 반응 혼합물에 첨가하고, pH를 아세트산 (AcOH)에 의해 6.5로 조절하였다. DCM 층을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 이후, DCM을 감압하에 제거하여 고형물을 제공하였다. 생성된 고형물을 10 mL의 헥산으로 2회 세척하였다. 그 후에, 고형물을 진공하에 건조시켜 800 mg의 옅은 황색 고형물을 제공하였다. 후속 반응에는 추가 정제가 필요하지 않았다. 고형물을 질량 분광기에 의해 특성화시켰다. ESI-MS: 525.7 (M + Na)+, 503.6 (M + 1)+, 403.5 (M - Boc + 1)+, 303.5 (M - 2Boc + 1)+.
(Boc)3-SDMA-시스타민-수지 (2): 15 mL의 디메틸포름아미드 (DMF) 중의 600 mg의 (1.2 mmol) (Boc)3-SDMA (1)과 627 mg (1.6 mmol)의 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미니늄 (HATU)의 혼합물에 420 μL (2.4 mmol)의 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 이후 건조 N2 분위기하에 20분 동안 교반하였다. 개별적으로, 시스타민 4-메톡시 트리틸 수지 (1.0 g) (EMD Chemicals, Inc.(Gibbstown, NJ)로부터 시중에서 구입가능)를 팽윤시키고, DMF를 사용하여 세척하였다. 그 후에, 팽윤된 수지를 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물을 N2 분위기하에 3시간 동안 약하게 진탕시켰다. 수지를 이후 여과에 의해 수거하고, 5 mL의 DMF, 5 mL의 메탄올, 및 5 mL의 DCM으로 연속하여 세척하였다.
SDMA-시스타미드 (3): 개질된 수지에 15 mL의 90% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 약하게 진탕시키고, 여과하였다. 수지를 3 mL의 TFA/DCM (1:1 (v/v))로 2회 세척하였다. 여과액과 세척액을 합하고, 200 mL의 차가운 에테르에 첨가하여 침전물을 제공하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수거하고, 감압하에 건조시켜 300 mg의 SDMA-시스타미드 (3)을 제공하였다. SDMA-시스타미드 (3)을 질량 분광기에 의해 특성화시켰다. EIS-MS: 262.4 (M + 1)+, 132.0 (M + 2)+.
SDMA-시스타미드 하이드로클로라이드 염 (4): SDMA-시스타미드 3 (300 mg)을 5 mL의 1.0 N HCl에서 재구성하고, 생성된 혼합물을 동결건조하여 포움으로서 옅은 황색 고형물을 제공하였다.
상기 기재된 절차와 동일한 일반적인 절차는 다른 SDMA 유사체를 제조하는데 이용될 수 있다.
실시예 2: 말레인이미드 활성화 단백질과 SDMA 시스타미드 (3)의 컨쥬게이션
A. 말레인이미드 활성화 KLH와 SDMA 시스타미드 (3)를 컨쥬게이션시키기 위한 일반적인 절차:
1. 말레인이미드 활성화 KLH(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입가능 (카탈로그 no. K0383))의 바이알을 서서히 열어 진공을 해제시켰다.
2. 30 mM의 NaCl, 2 mM의 EDTA, 및 80 mM의 수크로오스와 pH 6.6인 20 mM의 인산나트륨 완충액 중의 5 mg/mL의 말레인이미드 활성화 KLH 용액을 제공하도록 바이알의 함유물을 1 mL의 물로 재구성하였다.
3. 100 mM의 EDTA 및 80 mM의 수크로오스와 pH 6.6인 20 mM의 인산나트륨 완충액의 컨쥬게이션 완충액을 제조하도록 컨쥬게이션 완충액(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(카탈로그 no. C3957))을 10 mL의 물로 재구성하였다.
4. 0.5 mL의 컨쥬게이션 완충액에 약 0.8 mg의 합텐 (즉, SDMA 시스타미드 (3))을 용해시켰다. 커플링 효율(hap-전체)의 측정을 위해 50 μl의 생성된 펩티드 용액을 보유하였다. 보유된 합텐 용액을 2-8℃에서 저장하였다.
5. 교반 막대가 장착된 반응 바이알에서 단계 4의 합텐 용액을 단계 2의 말레인이미드 활성화 KLH 용액과 즉시 혼합하였다. 생성된 혼합물을 약 1-2 분 동안 약한 질소 스트림하에 교반하면서 탈기시켰다.
6. 반응 바이알을 캡핑하고, 실온에서 2시간 동안 또는 2-8℃에서 밤새 계속 교반하였다.
7. 단계 6으로부터의 100 μl의 컨쥬게이션 반응(hap-비함유)을 커플링 효율의 측정을 위해 보유하였다.
B: 말레인이미드 활성화 BSA와 SDMA 시스타미드 (3)의 컨쥬게이션을 위한 일반적인 절차:
1. 말레인이미드 활성화 BSA (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(카탈로그 no. B7542))의 바이알을 서서히 열어 진공을 해제시켰다.
2. 230 mM의 NaCl, 2 mM의 EDTA, 및 80 mM의 수크로오스와 pH 6.6인 20 mM의 인산나트륨 완충액 중의 5 mg/mL의 말레인이미드 활성화 BSA 용액을 제공하도록 바이알의 함유물을 1 mL의 물로 재구성하였다.
3. 0.5 mL의 컨쥬게이션 완충액 (단계 A3에서 상기 기재된 바와 같이 제조됨)에 5 mg의 합텐 (즉, SDMA 시스타미드 (3))을 용해시켰다. 커플링 효율의 측정을 위해 50 μl 의 생성된 펩티드 용액(hap-전체)을 보유하였다. 보유된 합텐 용액을 2-8℃에서 저장하였다.
4. 단계 3의 합텐 용액을 교반 막대가 장착된 반응 바이알에서 단계 2의 말레인이미드 활성화 BSA 용액과 즉시 혼합하였다. 생성된 혼합물을 약 1-2 분 동안 약한 질소 스트림하에 교반하면서 탈기시켰다.
5. 반응 바이알을 캡핑하고, 실온에서 2시간 동안 또는 2-8℃에서 밤새 계속 교반하였다.
6. 단계 5로부터 100 μl의 컨쥬게이션 반응(hap-비함유)을 커플링 효율의 측정을 위해 보유하였다.
C: KLH 또는 BSA 컨쥬게이트의 분리:
1. 1리터의 물에 인산 완충 식염수 (PBS) 패키지 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능 (카탈로그 no. P3813))의 함유물을 용해시켰다.
2. 비커 위에 Sephadex G-25M 겔 여과 컬럼 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능 (카탈로그 no. B4783))을 지지시켰다.
3. 컬럼의 상부로부터 마개를 제거하고, 개방된 컬럼의 하부 팁을 절단하고, 과량의 액체를 유동시켰다. 컬럼이 건조되지 않아야 한다.
4. 30 mL의 PBS와 컬럼을 평형시켰다.
5. 실시예 2A 또는 2B로부터의 반응 혼합물을 컬럼에 적용하였다.
6. 컬럼을 약 10 mL의 총 부피를 이용하여 PBS를 용리시키고, 약 0.5-1.0 mL의 분획을 수거하였다. 280 nm에서 각각의 분획의 흡광도를 측정함으로써 분획 중의 단백질의 존재를 모니터링하였다.
7. 단백질을 함유하는 분획을 합하였다. 도 4는 단백질 KLH (◆) 및 BSA (■)에 대한 예시적인 용리 프로파일에 대한 흡광도 대 분획 수를 그래프로 도시한 것이다.
8. 단백질을 함유하는 분획을 적은 분취량으로 나누고, -20℃에서 냉동 저장하였다.
D. 커플링 효율을 측정하기 위한 검정:
1. 시스테인 표준 검정 - 시스테인 펩티드에 대한 유사체의 커플링 효율을 추정하기 위해, 공지된 농도의 시스테인을 사용하여 표준 곡선을 만들었다. 검정은, pH 8.0에서 설프하이드릴 기와 반응하여 412nm에서 최대 흡광도를 지니는 발색단을 생성시키는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB 또는 Ellman 시약)의 반응을 기초로 하였다. 하기 절차를 따랐다:
a. 10 mL의 물에 DTNB 완충액 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(카탈로그 no. D4179))의 바이알의 함유물을 용해시킴으로써 DTNB 완충액을 제조하였다.
b. 이후, 단계 a로부터의 5 mL의 DTNB 완충액에 DTNB 시약 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능 (카탈로그 no. D8130))을 용해시켰다.
c. 사용 직전에, 시스테인 용액을 1 mL의 물에 32 mg의 L-시스테인 하이드로클로라이드 단수화물 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO))로부터 시중에서 구입가능 (카탈로그 no. C7880))을 용해시킴으로써 시스테인 용액을 제조하였다. 생성된 L-시스테인 하이드로클로라이드의 용액을 물로 연속하여 희석하여 0.4-0.04 mg/mL 범위의 희석된 저장 용액을 제공하였다. 희석된 저장 용액을 즉시 사용하였다.
d. 표지된 시험 튜브에 50 μL의 희석된 저장 용액을 첨가하였다. 50 μL의 물을 함유하는 시험 튜브를 블랭크로서 사용하였다.
e. 그 후에, 각각의 시험 튜브에 0.1 mL의 물, pH 8.0의 0.75 mL의 DTNB 완충액, 및, 즉시, 0.1 mL의 DTNB 시약 용액 (1 mg/mL)을 첨가하여 1 mL의 부피를 지니는 최종 시스테인 표준 검정 용액을 제공하였다.
f. 각각의 시험 튜브의 함유물을 혼합하였다.
g. 각각의 시스테인 표준 검정 용액의 흡광도를 412 nm에서 측정하였다. 흡광도가 1.4를 초과하는 경우, 샘플을 희석하고, 검정을 반복하였다.
h. 412 nm에서의 흡광도를 시스테인 농도 (mg/mL)에 대해 플롯팅하여 표준 곡선을 제공하였다. 시스테인 농도가 2-20 μg/ml의 범위인 표준 곡선의 선형 부분을 이용하여 hap-전체 및 hap-비함유를 측정하였다.
2. 합텐 검정 - 주의: 시스테인 표준 검정에서 샘플이 가장 높은 시스테인 표준보다 높은 값을 생성시킨 경우, 샘플을 희석하고, 검정을 반복하였다.
a. 적절하게 표지된 시험 튜브에 50 μl의 하기 용액을 첨가하였다:
(i) DTNB 완충액 (블랭크)
(ii) 희석된 펩티드 샘플 (hap-전체, 실시예 2의 단계 A4로부터의 KLH 컨쥬게이션으로부터)
(iii) 합텐-KLH (hap-비함유, 실시예 2의 단계 A7로부터의 KLH 컨쥬게이션으로부터)
(iv) 희석된 펩티드 샘플 (hap-전체, 실시예 2의 단계 B3로부터의 BSA 컨쥬게이션으로부터)
(v) hap-BSA (hap-비함유, 실시예 2의 단계 B6으로부터의 BSA 컨쥬게이션으로부터)
b. 단계 (a)로부터의 각각의 표지된 튜브에 0.1 mL의 물, pH 8.0인 0.75 mL의 DTNB 완충액, 및, 즉시 0.1 ml의 DTNB 시약 용액(1 mg/mL)을 첨가하고 1mL의 부피를 지니는 최종 합텐 검정 용액을 제공하였다.
c. 각각의 튜브의 함유물을 혼합하였다.
d. 각각의 표지된 튜브에서의 용액의 흡광도를 412nm에서 측정하였다. 흡수가 1.4를 초과하는 경우, 샘플을 희석하고, 검정을 반복하였다.
e. 그 후에, 섹션 1h에서 상기 기재된 바와 같이 얻어진 표준 곡선을 이용하여 측정된 흡수로부터 hap-전체의 농도를 측정하였다. 튜브 (ii) 및 튜브 (iv)에 대하여 측정된 흡광도를 이용하여 KLH 및 BSA에 대한 hap-전체를 각각 측정하였다. 튜브 (iii) 및 튜브 (v)에 대하여 측정된 흡광도를 이용하여 KLH 및 BSA에 대한 hap-비함유를 각각 측정하였다. 비희석된 용액 중의 펩티드 농도 및 커플링 효율을 이후 하기 기재된 계산에 따라 계산하였다.
3. 계산
펩티드 농도 및 커플링 효율을 추정하기 위해, 상기 기재된 바와 같은 공지된 농도의 시스테인을 사용하여 표준 곡선을 만들었다(시스테인 표준 검정). 이러한 계산에서, 1몰의 시스테인은 1몰의 설프하이드릴 함유 합텐과 같다.
하기 식을 이용하였다:
% 커플링 효율 = {(Hap(컨쥬게이션됨)/Hap(전체)} × 100 = [{Hap(전체) - Hap(비함유)} / Hap(전체)] × 100
Hap(전체) = 펩티드(전체)μmole/ml
Hap(비함유) = 펩티드(비함유)μmole/ml
Hap(컨쥬게이션됨) = Hap(전체) - Hap(비함유)
[또한, 말레인이미드 활성 BSA, KLH 컨쥬게이션 키트 (카탈로그 no. MBK1)에 대한 Sigma-Aldrich 기술 회보 참조]. 실시예 2A-D에 기재된 절차와 동일한 이러한 일반적인 절차를 이용하여 KLH 및 BSA에 대한 다른 SDMA 유사체의 컨쥬게이션의 효율을 측정할 수 있다.
실시예 3: 항-SDMA 항체를 생성시키기 위한 방법
항-SDMA 항체를 생성시키기 위한 면역화 프로토콜을 다음 프로토콜에 따라 수행하였다. 6마리의 캘리포니아 사육 토끼를 SDMA-컨쥬게이트로 면역화시켰다. 6마리의 토끼 중 3마리를 BSA와 컨쥬게이션된 SDMA로 면역화시키고(토끼 # 155, 156 및 157), 다른 3마리의 토끼를 KLH와 컨쥬게이션된 SDMA로 면역화시켰다(래빗 # 152, 153 및 154)(실시예 2에 기재된 바와 같이 제조됨). 일차 면역화의 경우, 각각의 토끼에게 1 ml의 프로인트 완전 보강제(Freund's complete adjuvant)와 혼합된 1 ml의 인산 완충 식염수(PBS) 중의 0.5 mg의 SDMA 컨쥬게이트를 주입하였다. 각각의 토끼의 깎은 등 위에 피내로 20-30회 주입하였다. 각각의 토끼의 뒷다리에 동일 부피의 프로인트 완전 보강제와 혼합된 1 ml PBS 중의 0.25 mg의 면역원을 부스팅시켰다. 일차 주입 후에 1달 마다 부스팅 샷을 제공하였다. 7-10일의 각각의 부스트 후에 각각의 토끼로부터 5 ml 혈액의 시험 혈액을 채취하였다. 항혈청 역가가 약 1:2000 초과인 경우, 3번 째 부스터 샷 후에 각각의 토끼로부터 40 ml의 생성된 혈액을 채취하였다. 항혈청 역가는 검정에 대하여 가장 가파른 보정 곡선을 생성시키는 항혈청의 희석도이다.
실시예 4: 항-SDMA 항체의 특성화
상기 실시예 3에 기재된 절차에 의해 얻어진 항체의 특이성을 평가하기 위해여, SDMA, ADMA, L-아르기닌, 및/또는 N-메틸아르기닌에 대한 이들의 반응성을 경쟁적 ELISA 검정으로 측정하였다(표 1).
ADMA-2HCl, SDMA-2HCl, N-메틸아르기닌 아세테이트 (Sigma, Cat. No. M7033) 또는 L-아르기닌 (Sigma, Cat. No. A5006)을 각각 PSB에 용해시켜 1 mg/ml의 저장 용액을 제조하였다. 이러한 저장 용액으로부터, 100 μg/ml, 10 μg/ml 및 1 μg/ml의 작업 용액을 PBS에서 제조하였다.
혈청 (1:3000 역가) 중의 50 μl의 SDMA-HRP 컨쥬게이트(하기 실시예 5에 기재된 바와 같은), 50 μl의 ADMA, SDMA, N-메틸아르기닌 또는 L-아르기닌 (상기 기재된 바와 같은 1-100 μg/ml의 농도), 및 50 μl의 토끼 항-SDMA 항체를, 양의 항-토끼 IgG(Beacon Analytical Systems Inc.(Portland, ME)으로부터 시중에서 구입가능)로 사전코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로웰 플레이트에서 각각의 웰에 연속적으로 첨가하였다. 실온에서 30분의 인큐베이션 기간 후, 웰을 PBST(인산 완충 식염수, 0.05% 트윈)로 4회 세척하였다.
이어서, 100 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Promega Corporation(Madison, WI)로부터 시중에서 구입가능)을 첨가하였다. 실온에서 30분의 인큐베이션 기간 후, 100 μl의 저장 용액(1 N HCl)을 첨가하고, BioTek ELX 808 (Winooski, VT) 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 Softmax 소프트웨어(Molecular Devices(Sunnyvale, CA))를 사용하여 정량화에 주어지게 하였다.
0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 및 100 μg/mL의 ADMA, SDMA, N-메틸아르기닌 또는 L-아르기닌으로 얻어진 흡광도 값을 각각 측정하고 플롯팅하였다. 흡광도 값이 50%까지 감소된 SDMA의 농도(0 μg/mL의 SDMA에서 얻어진 최대 흡광도에 대해; 즉, IC50)를 각각 흡광도 값이 50%까지 감소된 각각의 ADMA, N-메틸아르기닌 또는 L-아르기닌 농도(IC50)로 나누었다. 생성된 값에 100을 곱해 "% 교차-반응성" 값을 얻었다. 100 μg/mL 이하의 농도에서 < 50%의 흡광도 감소율이 관찰되는 경우, 교차-반응성은 <1%로 주지되었다(표 1 참조).
표 1에 나타난 바와 같이, 6마리 모두의 항-SDMA 혈청은 ADMA, N-메틸아르기닌 또는 L-아르기닌에 대해 각각 <1%의 교차-반응성을 지녔다.
표 1
Figure pat00016
실시예 1-4에 기재된 실험과 유사하지만 SDMA가 아니라 ADMA를 사용하여 또한 항체를 생성시켰다. 그러나, 항체를 생성시키기 위해 ADMA-단백질 컨쥬게이트를 사용하는 것은, 유리 ADMA에 대해 특이성이 아니고 ADMA를 측정하는 검정에 유용하지 않은 항체를 생성시켰다.
또 다른 실험에서, 154번 토끼로부터의 다클론성 항체만을 사용하여 항체의 특이성을 상기 기재된 방법에 의해 보다 엄격하게 측정하였다. 이 데이터(표 2 참조)는 154번 토끼로부터의 항체에 대한 특이성이 상기 표 1에 나타나 있는 것보다 훨씬 더 크다는 것을 보여준다.
표 2
Figure pat00017
실시예 5: 생체내 SDMA 수준을 검출하기 위한 경쟁적 면역검정
일상적인 물리 검사 및 일상적인 화학 패널에 주어진 동물로부터 동물 병원/실험실에서 혈청 샘플을 제공받았다.
SDMA-HRP 컨쥬게이트를 하기 절차에 따라 제조하였다:
1. >200개 유닛/단백질(mg)인 말레인이미드 활성화 양고추냉이 과산화효소 동결건조 분말(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(제품 no. P1709))를 0.15 M NaCl, 0.1 M 인산나트륨 중에 pH 7.0에서 2-5 mg/mL로 재구성하였다. 완충액을 기포제거하고, 사용 전에 질소 또는 아르곤으로 퍼징하고, 완충액을 제조하는데 사용된 물에서 미량의 중금속 및 기타 산화제를 제거하였다. 광으로부터의 반응을 보호하기 위해 호박색 바이알에서 커플링을 수행하였다.
2. SDMA 유사체 (3)를 단계 1에서 사용된 완충액과 동일한 완충액에 용해시켜 2-5 mg/mL의 농도를 지니는 용액을 제공하였다. 일반적으로, 1몰의 설프하이드릴 화합물 당 1-2 몰의 과산화효소를 사용하였다. 과산화효소의 분자량은 약 40,000였다.
3. 단계 1로부터의 용액을 단계 2로부터의 용액과 합하고, 생성된 용액을 실온에서 3시간 동안 약하게 교반하였다. 미반응된 말레인이미드 기를 이후 1M 2-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능 (카탈로그 no. M 6250))을 첨가함으로써 블로킹하여 0.0015 M의 최종 농도의 2-머캅토에탄올을 제공하고, 생성된 용액을 약 15분 동안 교반하였다.
4. 그 후에, 0.3 M N-에틸말레인이미드 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 시중에서 구입가능(카탈로그 no. D 8654))를 단계 3으로부터의 용액에 첨가함으로써 미반응된 설프하이드릴 기를 블로킹하여 0.003 M의 최종 농도의 N-에틸말레인이미드를 제공하였다.
5. 이후, 생성된 SDMA-HRP 컨쥬게이트 용액을 제조업체로부터의 지시에 따라 크로마토그래피에 의해 PBS로 교환하였다(SDMA 유사체 (3)를 말레인이미드 활성화 KLH 및 BSA에 컨쥬게이팅하거나 PBS(Spectra/Por3, MWCO 3500 Spectrum Labs(Rancho Dominguez, CA)로의 투석을 위해 실시예에서 상기 기재된 절차와 동일한 절차 이용). 생성된 용액을 이후 동결건조시켰다.
또한, 문헌[Lin, F. T., et al., Biochemistry, 18(4), 690 (1979); Kitagawa, T., et al., Chem. Pharm. Bull., 29(4), 1131 (1981); Duncan, R. J. S., et al., Anal. Biochem., 132, 68 (1983); and Palmer, J. L., et al., J. Biol. Chem., 238(7), 2393 (1963)]을 참조하라.
50 μl의 SDMA-HRP 컨쥬게이트, 50 μl의 혈청 샘플 (또는 캘리브레이터(calibrator), SDMA 2 HCl, Calbiochem(San Diego, CA)로부터 시중에서 구입가능), 및 혈청 중 50 μl의 토끼 항-SDMA 항체(1:3000 역가)를, 양의 항-토끼 IgG(Beacon Analytical Systems Inc.(Portland, ME)으로부터 시중에서 구입가능)로 사전코팅된 96-웰 폴리스티렌 마이크로웰 플레이트에서 각각의 웰에 연속적으로 첨가하였다. 실온에서 30분의 인큐베이션 기간 후, 웰을 PBST(인산 완충 식염수, 0.05% 트윈)로 4회 세척하였다.
이어서, 100 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (Promega Corporation(Madison, WI)로부터 시중에서 구입가능)을 첨가하였다. 실온에서 30분의 인큐베이션 기간 후, 100 μl의 저장 용액(1 N HCl)을 첨가하고, BioTek ELX 808 (Winooski, VT) 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 Softmax 소프트웨어(Molecular Devices(Sunnyvale, CA))를 사용하여 정량화에 주어지게 하였다. 일련의 SDMA 표준물(예, 0, 0.05 μg/mL, 0.15 μg/mL, 0.45 μg/mL, 및 1.35 μg/mL)로 작업하여 보정 곡선을 생성시켰다. 알 수 없는 샘플은 보정 곡선을 이용하여 정량화하였다. 결과는 표 3에 요약되어 있다.
표 3
Figure pat00018
표 3에서, 상태 "신장 질환"은 동물로부터 채취된 샘플이 정상 참조 범위 초과의 크레아티닌 및 혈중 요소 질소(BUN) 값을 나타냈음을 지시하고, 상태 "건강한"은 동물로부터 채취된 샘플이 정상(참조 범위) 크레아티닌 및 혈중 요소 질소(BUN) 값을 나타냈음을 지시한다. 개의 경우, 정상 참조 범위의 상한치가 BUN의 경우 27 mg/dL이고, 크레아티닌의 경우 1.8 mg/dL이었다. 고양이의 경우, 정상 참조 범위의 상한치는 BUN의 경우 34 mg/dL이고, 크레아티닌의 경우 2.3 mg/dL였다.
표 3에서의 결과는 SDMA 수준이 신장 기능이 좋지 않은 개 및 고양이의 SDMA 수준이 상승했음을 보여준다. 따라서, SDMA는 동물의 신장 질환을 진단하기 위한 마커(marker)로서 사용될 수 있다.
실시예 6: 크레아티닌 농도 및 유리 SDMA 농도에 의한 개 사구체 여과율의 분석
X-연관된 유전성 신경병증(X-linked hereditary neuropathy: XLHN)이 있는 이형접합(캐리어) 암컷 개(n=20)로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 유전자 COL4A5에서의 돌연변이에 의해 XLHN이 초래되었는데, 이는 암컷 개에서 3 내지 6개월 연령에 IV형 콜라겐 펩티드의 모자이크 발현 및 사구 단백뇨의 발병을 초래한다[Nabity et al., J Vet Intern Med 2007; 21:425-430]. 크레아티닌 및 SDMA의 농도를 각각의 샘플에서 측정하였다.
샘플의 크레아티닌 농도를 상기 기재된 바와 같은 IDEXX 건조-슬라이드 기술을 이용하여 측정하였다.
샘플의 유리 SDMA 농도를 다음과 같이 측정하였다: LCMS 이동상은 (A) 1 L의 물 중의 10 mL 프로피온산 및 250 μL의 트리플루오로아세트산; 및 (B) 1 L 아세토니트릴 중의 10 mL 프로피온산 및 250 μL의 트리플루오로아세트산이었다. 물 중의 2.5 ng/mL의 중수소치환된 비대칭 디메틸 아르기닌 (d-ADMA)의 내부 표준물을 제조하였다. 이어서, 20 g/mL의 SDMA 용액을 스파이킹함으로써 스트립핑된 개 혈청에서 STD (표준) 곡선을 얻고, 이어서 희석하여 1.56 ㎍/dL 내지 100 ㎍/dL의 농도로 달라지는 9-점 STD 곡선을 얻었다. 측정을 수행하기 위하여, 측정하고자 하는 100 μL의 샘플(즉, 혈청 샘플 또는 표준 용액)을 마이크로퓨지 튜브로 옮겼다. 10 μL의 내부 표준 용액 및 200 μL의 이동상 B를 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 볼텍싱하여 혼합하고, 30 min 동안 정치시킨 후, 13000g으로 25℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 2 mL 호박색 HPLC 바이알로 옮기고, LCMS에 의해 샘플을 분석하였다. LCMS를, 스캔 유형 MRM, 양성 극성, 터보 스프레이 스캔 방식, Q1 분해능 = 유닛 및 Q3 분해능 = 유닛으로 작동되는 ABSciex로부터의 API-4000 및 HPLC 상에서 수행하였다. 컬럼은 150x4.6 PVA SIL 컬럼이고, 유량은 1 mL/min이고, 구배는 등용매 90:10 B:A였다. 크로마토그램을 주위 온도에서 9 min 동안 작동시켰다.
동물의 실제 GFR을 아이오헥솔 청소율 방법에 의해 측정하였다. 대상체에 아이오헥솔을 주입하였다.
혈액 샘플을 다양한 시간 간격으로 채취하고, 혈청 아이오헥솔을 HPLC에 의해 측정하였다.
각각의 개에 대하여 3개의 데이터 값을 수집하였다. 크레아티닌 농도 (mg/dL) 대 GFR (ml/min/kg)의 4 파라미터 로지스틱(four parameter logistic: 4PL) 플롯은 도 5에 제공되어 있다. 이러한 데이터에 대한 R2의 값은, 전 범위에서 대략 5%를 나타내는 0.5-3.0 mg/dl 농도 범위에 걸친 0.12의 표준 오차로 0.94였다.
도 6은 SDMA 농도 (μg/dl) 대 GFR (ml/min/kg)의 결과를 나타낸 것이다. SDMA-GFR 관계에 대한 4A PL 피트는 SDMA의 경우 5-40 μg/dL에 걸쳐 1.7의 표준 오차로 0.95의 R2 값을 제공한다. 이러한 오차는 전 범위에서 대략 5%를 나타낸다.
도 7은 크레아티닌 값과 SDMA 값을 값들의 간단한 곱을 이용하여 조합한 결과를 나타낸 것인데, 이는 단독의 크레아티닌 또는 단독의 SDMA에 대한 GFR의 관계의 개선을 보여주는 것이다. [크레아티닌]*[SDMA]--GFR 관계의 4PL 피트는 [크레아티닌]*[SDMA]에 대하여 0-90 μg/dL 범위에 걸친 2.8의 표준 오차 값으로 0.98의 R2 값을 제공한다. 이러한 오차는 전 범위에서 대략 3%를 나타낸다.
도 8은 선형 피트를 이용한 1/[크레아티닌]P*1/[SDMA]Q의 분석을 나타낸 것이다. 선형 회귀를 이용하면, P는 0.37이고, Q는 0.43이었다. 합하여 R2는 단독의 1/[크레아티닌]의 경우 0.83 및 단독의 1/[SDMA]의 경우 0.85와 비교하여 0.87의 값으로 얻어졌다.
실시예 7: 크레아티닌 농도 및 유리 SDMA 농도에 의한 고양이 사구체 여과율의 분석
SDMA와 크레아티닌 값의 곱의 합이 단독의 개별 표지 값보다 우수하게 GFR과 관련되었는지의 여부를 평가하기 위해 각각 1 내지 4개의 데이터 값으로 10마리의 암컷 고양이를 이용하였다. SDMA, 크레아티닌 및 GFR을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.
도 9는 SDMA 농도 (μg/dl) 대 GFR (ml/min/kg)의 결과를 나타낸 것이다. SDMA-GFR 관계에 대한 4 PL 피트는 SDMA의 경우 15 μg/dL 범위에 걸쳐 2.3의 표준 오차로 0.73의 R2 값을 제공한다. 이러한 오차는 전 범위에서 대략 15%를 나타낸다.
도 10은 크레아티닌 농도 (mg/dl) 대 GFR (ml/min/kg)의 결과를 나타낸 것이다. 크레아티닌-GFR 관계에 대한 4 PL 피트는 1.5 mg/dL 범위에 걸쳐 0.15의 표준 오차로 0.82의 R2 값을 제공한다. 이러한 오차는 전 범위에서 대략 10%를 나타낸다.
도 11은 크레아티닌 값과 SDMA 값을 값들의 단순한 곱을 이용하여 조합한 결과를 나타낸 것인데, 이는 단독의 크레아티닌 또는 단독의 SDMA에 비해서 GFR의 관계에 대한 개선을 보여준다. [크레아티닌]*[SDMA]-GFR 관계에 대한 4 PL 피트는 [크레아티닌]*[SDMA]에 대하여 40 μg/dL 범위에 걸쳐 3.9의 표준 오차로 0.89의 R2 값을 제공한다. 이러한 오차는 전 범위에서 대략 10%를 나타낸다.
도 12는 선형 피트를 이용한 1/[크레아티닌]P*1/[SDMA]Q의 분석을 나타낸 것이다. 선형 회귀를 이용하면, P는 1.2이고, Q는 0.95였다. 합하여 R2는 단독의 1/[크레아티닌]의 경우 0.44 및 단독의 1/[SDMA]의 경우 0.65와 비교하여 0.95의 값으로 얻어졌다.
실시예 8: CRE과 SDMA 컷오프 값의 합을 통한 신장 질환의 진단에서의 민감도 및/또는 특이성 개선
113마리의 고양이들의 신장 질환 상태를 측정하고, 국제 신장 관심 단체(International Renal Interest Society: IRIS)에 의해 제공되는 개 및 고양이의 만성 신장 질환(CKD)의 단계화에 대한 알고리즘에 따라 단계화시켰다. 각각의 고양이의 경우에, 다양한 시점에서 채취된 1 내지 6개의 혈청 샘플을 크레아티닌 [CRE] 및/또는 SDMA에 대하여 분석하였다. 6마리의 정상 고양이(즉, CKD가 아님)로부터 194개의 샘플을 얻었다. CKD를 앓고 있는 55마리의 고양이로부터 182개의 샘플을 얻었다.
이 실시예에서, SDMA 및 CRE에 대한 컷오프 값을 측정하고, 이를 CKD를 결정하는데 사용하였다. 컷오프 값은 역치 혈청 농도 초과에서는 개체가 이러한 특정 시험에서 신장 질환이 있는 것으로 진단된다는 것을 나타낸다. SDMACUT는 SDMA에 대한 컷오프 값이다. [SDMA] 및 SSDMACUT는 μg/dL (마이크로그램/데시리터)로 측정하였다. 예를 들어, SDMACUT는 약 14 μg/dL, 또는 약 10 내지 20 μg/dL일 수 있다.
CRECUT는 CRE에 대한 컷오프 값이다. CRE 및 CRECUT는 mg/dL로 측정하였다. 예를 들어, CRECUT는 약 2.0 mg/dL 내지 2.4 mg/dL, 또는 약 1.7 내지 2.8 mg/dL일 수 있다.
단독의 SDMA 경우, 컷오프 값(SDMACUT)은 14 μg/dL로 설정하였다. 이러한 값을 이용하면, 정상 고양이의 경우 허위양성률은 10.3%이고, CKD 고양이의 경우 허위음성률은 26.9%였다(표 4 참조).
표 4
Figure pat00019
단독의 크레아티닌의 경우, 컷오프 값(CRECUT)은 2.4 mg/dL로 설정하였다. 이 값을 이용하면, 정상 고양이의 경우 허위양성률은 0.0%이고, CKD 고양이의 경우 허위음성률은 43.4%였다(표 5 참조).
표 5
Figure pat00020
CCUT는 합한 값 C에 대한 컷오프 값이다. 크레아티닌 및 SDMA 값을 하기 식에 따라 합하였다.
합한 값 C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] /CRECUT.
CCUT는 측정 단위를 지니지 않는다. 예를 들어, CCUT는 1.5, 1.7 또는 2.0, 또는 1.3 내지 2.5일 수 있다.
CCUT가 1.5로 설정하면, 정상 고양이의 경우에 허위양성률은 12.4%이고, CKD 고양이의 경우에 허위음성률은 1.6%였다(표 6 참조). CCUT를 1.7로 설정하면, 정상 고양이의 경우에 허위양성률은 3.5%이고, CKD 고양이의 경우에 허위음성률은 14.3%였다(표 7 참조). CCUT를 2.0로 설정하면, 정상 고양이의 경우에 허위양성률은 3.5%이고, CKD 고양이의 경우에 허위음성률은 33.5%였다(표 8 참조).
표 6
Figure pat00021
표 7
Figure pat00022
표 8
Figure pat00023
CCUT에 대한 적합한 값을 알아보기 위해 합한 값의 추정되는 민감도 및 특이성을 CCUT에 대해 플롯팅하였다(도 13 참조). C가 (>) CCUT를 초과하는 경우, 개체는 신장 질환이 있는 것으로 진단된다. 이에 따라서, 각각의 진단 컷오프 값을 기초로 SDMA와 CRE 값을 합하면 동물의 신장 질환의 검출에 대한 민감도 및/또는 특이성이 개선된다.
실시예 9: 건강한 동물과 질환이 있는 동물의 크레아티닌 대 SDMA의 비의 측정
건강한 동물의 SDMA (μg/dL) 및 크레아티닌 (mg/dL) 농도의 비는 일반적으로 약 4:1 내지 10:1 (μg/dL:mg/dL)의 범위이다. 몇몇 만성 신장 질환 환자에서, 이 비는 10초과:1인데, 이는 질환의 진행을 나타낼 수 있다.
이러한 연구에서, CKD 개에서 SDMA 및 크레아티닌의 종단 경향이 관찰되었다. CKD인 24마리의 개를 다음 기준을 기초로 하여 연구에 포함하였다: 연령 (9.4-18.3 y); 지속적 고질소혈증 (> 3달); GFR; 물리적 검사; 혈청 크레아티닌, 및 요검사.
모든 개를 최적의 영양, 가축 헬쓰케어, 및 매일 운동을 포함하여 양질로 돌보며 관리하였다. CKD로 진단된 후, 개에게 PRESCRIPTION DIET® k/d® 견 식품 (Hill's Pet Nutrition, Inc.(Topeka, Kansas))으로 먹이를 주었다.
이러한 개들로부터 정기적으로(1년에 2-3회) 샘플을 수집하였다. 샘플을 동결시키고, 보관하였다. COBAS® 분석기를 사용하여 효소 비색법으로 크레아티닌을 측정하였다. 혈청 샘플을 아세토니트릴로 침전시키고, Waters XBridge C18 5㎛ 4.6* 30 컬럼을 사용한 점을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 LCMS에 의해 SDMA를 측정하였다. 이동상 A는 물에서 0.1% 포름산 중의 0.5mM 퍼플루오로헵탄산으로 이루어졌고, 이동상 B는 4분의 이동 시간으로 100% B 대 100%A의 구배로 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이었다. SDMA (μg/dL)와 크레아티닌 (mg/dL)의 연관성은 도 14에 나타나 있다.
실시예 10: CKD인 몇몇 고양이의 SDMA와 크레아티닌 값 사이의 부조화
SDMA:크레아티닌 비의 부조화로 동물의 사망률을 예측할 수 있다. 예를 들어, CKD 고양이에서, 상응하는 크레아티닌 값을 기초로 하여 예측된 농도에 비해 관찰된 DMA 값은 높았다. 도 104에 나타난 바와 같이, SDMA와 크레아티닌 사이에는 큰 연관성이 있었고, 정상 비율은 10 (μg/dL:mg/dL) 미만이었다. 이러한 연구에서, 26마리의 CKD 고양이에서 비율을 측정하였다. 이러한 26마리의 고양이는 물리적 검사, 혈청 크레아티닌, 및 요검사를 기초로 하여 CKD로 진단되었다. 도 15에 나타난 바와 같이, 26마리의 고양이들 중 2마리가 10 초과의 SDMA:크레아티닌 비를 지니고, 이러한 고양이가 안락사되거나 질병으로 사망했는지의 여부가 기록되어 있지는 않지만 후처리 시간에 사망하였다.
실시예 11: SDMA:크레아티닌 비에 의한 CKD인 고양이의 사망률 예측
이러한 연구에서, CKD 고양이에게서 SDMA 및 크레아티닌의 종단 경향이 관찰되었다. CKD인 18마리의 고양이를 다음 기준을 기초로 하여 연구에 포함하였다: 3개월 이상 동안 지속적으로 고질소혈증; 또는 정상 고양이의 중간 GFR로부터 GFR이 >30% 감소된 비질소혈증; 또는 칼슘 옥살레이트 신장 결석.
모든 고양이를 최적의 영양, 가축 헬쓰케어, 및 매일 운동을 포함하여 양질로 돌보고 환경적 및 거동적 풍부로 규칙적으로 기회를 주며 관리하였다. CKD로 진단된 후, 고양이에게 RESCRIPTION DIET® c/d® 식품 (Hill's Pet Nutrition, Inc.(Topeka, Kansas))으로 먹이를 주었다.
이러한 고양이로부터의 혈액 및 소변 샘플을 다양한 시간에 채취하고, 동결시키고, 보관하였다. COBAS® 분석기를 사용하여 효소 비색법으로 크레아티닌을 측정하였다. SDMA를 상기 기재된 바와 같이 LCMS에 의해 측정하였다.
각각의 18마리의 고양이에서 SDMA의 농도가 맨 먼저 14 μg/dL에 도달하거나 이를 초과하는 시점에, 12마리의 고양이는 10 초과:1의 SDMA:크레아티닌 비를 지니고, 6마리의 고양이는 10 또는 그 미만:1인 SDMA:크레아티닌 비를 지녔다. 각각의 고양이의 경우, 데이터로부터의 시간은 2마리의 고양를 제외하고 사망 데이터가 관찰될 때까지 SDMA의 농도가 맨 먼저 14 μg/dL에 도달하거나 이를 초과하였다. 이러한 2마리의 고양이는 연구의 마지막에 여전히 생존하였고; 그에 따라서, 이러한 2마리의 고양이의 경우에 사망 데이터로 연구의 최종 데이터를 대체하였다.
10 초과:1의 SDMA:크레아티닌 비를 지니는 12마리의 고양이는 13.9개월의 중간 생존 시간(평균 = 18.7; 범위 = 1.8-47.4)을 지녔다. 10 또는 그 미만:1의 SDMA:크레아티닌 비를 지니는 6마리의 고양이는 18.7개월의 중간 생존 시간(평균 = 18.9; 범위 = 8.7-28.7)을 지녔다. 따라서, 10 또는 그 초과:1의 SDMA:크레아티닌 비를 지니는 고양이는 10:1의 SDMA:크레아티닌 비를 지니는 고양이보다 높은 사망률을 지녔다. 도 16, 17 및 18은 연구로부터 3마리의 고양이에 대한 시간에 걸친 SDMA:크레아티닌 비를 나타내는데, 몇 년 동안에 걸쳐서 SDMA:크레아티닌 비는 10 초과였다(고양이 #13, 고양이 #8 및 고양이 #14). 데이터에서 혈청 SDMA 농도가 맨 먼저 적어도 14 μg/dL에 도달한 후에, 고양이 #13은 27.2개월에 사망하고, 고양이 #8는 29.4개월에 사망하고, 고양이 #14는 12.3개월에 사망하였다. 부검에 대한 마지막 측정에서, 3마리의 고양이에 대한 비율은 약 17 내지 34의 범위였다.
실시예 12: SDMA 및 크레아티닌을 이용한 사망률의 예측
도 19 및 20은 14 μg/dL의 SDMA 컷오프 값을 이용한 고양이(실시예 11에 기재된 연구로부터) 및 개(실시예 9에 기재된 연구로부터)에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 도 19는 적어도 14 μg/dL의 SDMA 혈청 농도를 지니는 고양이는 생존 시간이 감소하고 사망 발생률이 증가하였음을 나타낸다. 14 μg/dL 미만의 혈청 SDMA를 지니는 고양이는 14 μg/dL 또는 그 초과의 혈청 SDMA를 지니는 고양이보다 약 1.6배 더 오래 생존하였다. 이러한 연구에서, 크레아티닌은 고양이의 사망률을 예측하는데 실패했다(2.1 mg/dL의 참조 컷오프).
도 20은 14 μg/dL 초과 또는 미만의 혈청 SDMA 농도를 지니는 개에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 이러한 연구에서, <14 μg/dL의 SDMA를 지니는 개는 ≥14 μg/dL의 SDMA를 지니는 개에 비해 2.6배 더 오래 생존하였다. 크레아티닌은 사망률을 예측하는데 실패했다(1.5 mg/dL의 참조 컷오프).
상기 주어진 실시예는 단지 예시적인 것이고, 본 발명의 모든 가능한 구체예, 적용예 또는 변형예의 완전한 열거인 것으로 의미되지 않는다. 따라서, 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형예 및 변형체는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남 없이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명은 특정의 구체예와 연관하여 기술되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정의 구체예로 지나치게 제한되지 않아야 함을 이해해야 한다. 확실히, 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 당양한 변형예는 당업자에게 명백하다.
본 발명은 이들이 당업자가 인식하는 것에 따라 달라질 수 있기 때문에 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 기재하려는 목적으로 사용된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형은 문맥에서 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들어, "링커"에 대한 지칭은 당업자에게 알려진 하나 이상의 링커 및 이의 등가물로 지칭된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 당업자에 의해 일반적으로 의해되는 의미와 동일한 의미를 지닌다. 본 발명의 구체예 및 이의 다양한 특징부 및 유리한 세부 사항은 비-제한적 구체예를 참조로 하여 보다 충분히 설명되고/거나 첨부된 도면에서 예시되고 하기 설명에서 구체화된다. 도면에 도시되어 있는 특징부는 반드시 비례하여 도시된 것이 아니며, 한 가지 구체예의 특징부는 본원에 명확하게 명시되어 있지 않더라도 당업자가 인식하는 것에 따라 다른 구체예로 사용될 수 있음을 주지해야 한다.
본원에서 언급되는 어떠한 수치는, 어느 하한치와 어느 상한치 사이에 둘 이상의 단위에 차이가 있다면, 하나의 단위의 인상에 대한 하한치와 상한치 사이의 모든 값을 포함한다. 예로서, 성분의 농도 또는 공정 변수 값, 예컨대, 크기, 각도 크기, 압력, 및 시간 등이, 예를 들어, 1 내지 90, 특히 20 내지 80, 더욱 특히 30 내지 70인 것으로 명시되는 경우, 15 내지 85, 22 내지 68, 43 내지 51, 30 내지 32 등과 같은 값은 본 명세서에서 분명하게 열거되는 것으로 의도된다. 1 미만인 값의 경우, 어떠한 단위는 적절하게 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1인 것으로 간주된다. 예들은 단지 특별하게 의도된 것들이며, 열거된 하한치와 상한치 사이의 수치의 모든 가능한 조합이 유사한 방식으로 본 출원에서 분명하게 명시되는 것으로 간주되어야 한다.
특정 방법, 장치, 및 물질이 지개되지만, 본원에서 기재된 것들과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상기 언급된 모든 참조문헌 및 공보의 개시 내용의 전체는 각각 개별적으로 참조로 포함되는 경우와 동일한 정도로 명백하게 포함된다.

Claims (48)

  1. 동물 대상체의 사구체 여과율(glomerular filtration rate: GFR)을 추정하기 위한 방법으로,
    대상체로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고;
    대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도를 측정하고;
    크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱을 포함한 방정식으로부터 생성된 값을 동물 대상체의 사구체 여과율과 연관된 하나 이상의 표준 값과 비교함을 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 방정식이 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도 중 하나 이상이 계산에서 칭량되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량되는 값과 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량되는 값의 곱이 식 PROD = [CRE]P × [SDMA]Q으로 표현되고, 여기서 PROD는 생성된 값이고, [CRE]는 크레아티닌의 농도이고, [SDMA]는 SDMA의 농도이고, P는 식에서 [CRE]에 주어지는 중량을 제공하고, Q는 식에서 [SDMA]에 주어지는 중량을 제공하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 하나 이상의 표준 값이 곱의 역수와 상관관계에 있는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, P= -1이고, Q= -1인 방법.
  7. 제 4항에 있어서, P= -1.5이고, Q = -0.025인 방법.
  8. 제 4항에 있어서, P가 약 -5 내지 0(0 불포함)인 방법.
  9. 제 4항에 있어서, Q가 약 -2.5 내지 0(0 불포함)인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 비교하는 단계가, 실행 시에 계산 및 비교를 수행하는 기계 판독가능한 명령을 포함하는 마이크로프로세서(microprocessor)를 사용하여 수행되는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 대상체의 GFR을 하나 이상의 건강한 대상체의 GFR과 비교함으로써 신장 기능, 신장 질환 또는 신장 기능 장애를 결정함을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, GFR이 건강한 동물 종의 집단에 대한 평균 GFR보다 통계적으로 유의하게 더 낮은 경우에 신장 질환 또는 기능 장애에 대하여 동물을 치료함을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 13항에 있어서, 동물의 GFR과 건강한 집단의 GFR 사이의 차이가 두 표준 편차 보다 큰 경우에 동물 대상체의 GFR이 건강한 집단에 대한 평균 GFR보다 통계적으로 유의하게 더 낮은 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 SDMA의 농도의 측정이
    샘플을 표지(label)에 컨쥬게이션된 항-SDMA 항체와, 그리고 SDMA 유사체와 접촉시키고;
    SDMA 유사체와 관련된 표지의 존재 또는 양을 검출함으로써 샘플 중의 SDMA의 존재 또는 양을 결정함을 포함하는 방법.
  15. 동물 대상체의 신장 질환 또는 신장 기능 장애를 진단하는 방법으로서,
    대상체로부터의 혈청 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고;
    대상체로부터의 혈청 중 크레아티닌의 농도를 측정하고;
    크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량되는 값과 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량되는 값의 곱을 신장 질환 또는 신장 기능 장애와 연관된 하나 이상의 표준 값과 비교함을 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량된 값과 유리 SDMA의 농도를 기초로 하여 두 번째로 칭량된 값의 곱이 식 PROD = [CRE]P × [SDMA]Q로 표현되고, 여기서 PROD는 생성된 값이고, [CRE]는 크레아티닌의 농도이고, [SDMA]는 SDMA의 농도이고, P는 식에서 [CRE]에 주어지는 중량을 제공하고, Q는 식에서 [SDMA]에 주어지는 중량을 제공하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 하나 이상의 표준 값이 곱의 역수와 상관관계에 있는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, P= -1이고, Q= -1인 방법.
  19. 제 16항에 있어서, P= -1.5이고, Q = -0.025인 방법.
  20. 제 16항에 있어서, P가 약 -5 내지 0(0 불포함)인 방법.
  21. 제 16항에 있어서, Q가 약 -2.5 내지 0(0 불포함)인 방법.
  22. 동물 대상체의 신장 질환 또는 신장 기능 장애의 진단과 관련된 값을 계산하기 위한 방법으로서, 대상체로부터의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도를 기초로 하여 첫 번째로 칭량된 값과 대상체로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA의 농도를 기초로 한 두 번째로 칭량된 값의 곱을 계산하기 위한 기계 판독가능한 명령을 실행함을 포함하는 방법.
  23. 제 22항의 방법에 의해 계산되는 값을 신장 질환 또는 기능 장애와 관련된 표준 값과 비교함을 포함하는, 신장 질환 또는 기능 장애를 진단하기 위한 방법.
  24. 개체가 신장 질환인지의 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터의 혈청 샘플 중 SDMA [SDMA] 및 크레아티닌 [CRE]의 농도를 측정하고;
    (b) 비율 [SDMA] / SDMACUT를 계산하고;
    (c) 비율 [CRE] / CRECUT를 계산하고;
    (d) 합한 값 C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT를 계산하고;
    (e) C가 CCUT보다 큰 경우에 개체가 신장 질환인 것으로 결정함을 포함하며,
    SDMACUT가 SDMA에 대한 컷오프(cutoff) 값이고, CRECUT가 CRE에 대한 컷오프 값이고, CCUT가 합한 값에 대한 컷오프 값인 방법.
  25. 개체가 신장 질환인지의 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 개체로부터의 혈청 샘플 중 SDMA [SDMA] 및 크레아티닌 [CRE]의 농도를 측정하고;
    (b) 합한 값 C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT를 계산하고;
    (c) C가 CCUT다 큰 경우에 개체가 신장 질환이라는 것을 결정함을 포함하는 방법으로서,
    SDMACUT가 SDMA에 대한 컷오프 값이고, CRECUT가 CRE에 대한 컷오프 값이고, CCUT가 합한 값에 대한 컷오프 값인 방법.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, SDMACUT가 약 10 내지 약 20 μg/dL인 방법.
  27. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, SDMACUT가 약 14 μg/dL인 방법.
  28. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, CRECUT가 약 1.3 내지 약 2.5 mg/dL인 방법.
  29. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, CRECUT가 약 1.7 내지 약 2.8 mg/dL인 방법.
  30. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, CRECUT가 약 1.7 μg/dL인 방법.
  31. 동물 대상체의 조기 사망을 예측하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터의 혈청 중 유리 SDMA의 농도를 측정하고;
    (b) 대상체로부터의 혈청 중 크레아티닌의 농도를 측정하고;
    (c) 비율 [SDMA]/[CRE]를 계산하고;
    (d) 비율이 컷오프 값을 초과하는 경우에 개체가 조기 사망할 것으로 결정함을 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 컷오프 값이 10인 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 컷오프 값이 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15인 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 유리 SDMA의 농도가 14 μg/dL 이상인 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 동물 대상체가 CKD로 진단되는 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 동물 대상체가 고양이과 또는 개과인 방법.
  37. 신장 질환과 관련된 사망률의 결정을 위한 방법으로서,
    (a) 환자로부터의 혈액 샘플 중 유리 SDMA를 측정하고;
    (b) 환자가 역치 수준보다 높은 혈중 SDMA 농도를 지니는 경우에 환자의 신장 질환과 관련된 사망 가능성이 증가되는 것으로 결정함을 포함하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 역치 수준이 14 μg/dL인 방법.
  39. 제 37항에 있어서, 혈액 샘플 중의 크레아티닌을 측정하는 단계 및 비율 [SDMA]/[CRE]을 계산하는 단계를 추가로 포함하고, 비율이 컷오프 비율을 초과하는 경우에 환자의 신장 질환과 관련된 사망 가능성이 증가되는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 비율 [SDMA]/[CRE]이 10을 초과하는 방법.
  41. 제 37항에 있어서, 동물 대상체가 개과 또는 고양이과인 방법.
  42. 제 37항에 있어서, 동물 대상체가 CKD로 진단되는 방법.
  43. 동물 대상체의 신장 기능을 결정하기 위한 장치로서, SDMA 유사체, 또는 비대칭 디메틸아르기닌 (ADMA), L- 아르기닌, 및 N-메틸아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 교차-반응성을 지니지 않거나 실질적으로 지니지 않는 SDMA에 특이적인 항체가 결합된 제 1 고체상; 및 크레아티닌 감지 시약 또는 크레아티닌에 대해 특이적인 항체가 결합된 제 2 고체상을 포함하는 장치.
  44. 제 43항에 있어서, 크레아티닌 감지 시약이 피크르산 또는 이의 염, 또는 크레아티닌에 특이적인 항체인 장치.
  45. 동물 대상체의 신장 기능을 결정하기 위한 키트로서, 하나 이상의 크레아티닌 검출 시약 및 하나 이상의 SDMA 검출 시약을 포함하는 키트.
  46. 제 45항에 있어서, 동물로부터의 하나 이상의 혈액 샘플 중 크레아티닌의 농도와 SDMA의 농도의 곱을 기초로 하여 신장 기능과 관련된 일련의 하나 이상의 표준 값들을 추가로 포함하는 키트.
  47. 실행 시에 크레아티닌의 농도와 유리 SDMA의 농도의 곱의 역수를 계산하는 소프트웨어 명령을 포함하는 메모리 저장을 포함하는, 컴퓨팅 장치.
  48. 제 47항에 있어서, 메모리 저장이 계산 결과를 동물 대상체의 사구체 여과율을 나타내는 하나 이상의 표준 값과 비교하기 위한 소프트웨어 명령을 추가로 포함하는, 컴퓨팅 장치.
KR1020217020124A 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법 KR102412431B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361874011P 2013-09-05 2013-09-05
US61/874,011 2013-09-05
PCT/US2014/054278 WO2015035155A1 (en) 2013-09-05 2014-09-05 Methods for detecting renal disease
KR1020167009015A KR102273028B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167009015A Division KR102273028B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210082567A true KR20210082567A (ko) 2021-07-05
KR102412431B1 KR102412431B1 (ko) 2022-06-22

Family

ID=52628954

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217020124A KR102412431B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법
KR1020167009015A KR102273028B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167009015A KR102273028B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-05 신장 질환을 검출하기 위한 방법

Country Status (20)

Country Link
US (2) US11035861B2 (ko)
EP (3) EP4295907A3 (ko)
JP (4) JP6657096B2 (ko)
KR (2) KR102412431B1 (ko)
CN (1) CN105705202B (ko)
AU (2) AU2014315063B2 (ko)
CA (2) CA2923140C (ko)
CY (1) CY1123179T1 (ko)
DK (1) DK3041576T3 (ko)
ES (2) ES2746008T3 (ko)
HR (1) HRP20191569T1 (ko)
HU (1) HUE045723T2 (ko)
LT (1) LT3041576T (ko)
MX (2) MX2016002922A (ko)
NZ (1) NZ717554A (ko)
PL (1) PL3041576T3 (ko)
PT (1) PT3041576T (ko)
RS (1) RS59287B1 (ko)
SI (1) SI3041576T1 (ko)
WO (1) WO2015035155A1 (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3041576T (pt) 2013-09-05 2019-09-27 Idexx Lab Inc Métodos para detecção de uma doença renal
JP6896637B2 (ja) 2015-02-20 2021-06-30 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． バックグラウンドシグナルを補正するホモジニアスなイムノアッセイ
JP6923449B2 (ja) * 2015-04-30 2021-08-18 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． 腎疾患の検出方法
PL3631472T3 (pl) 2017-05-31 2022-10-17 Mars, Incorporated Sposoby diagnozowania i leczenia przewlekłej choroby nerek
EP3665705A1 (en) 2017-08-08 2020-06-17 Fresenius Medical Care Holdings, Inc. Systems and methods for treating and estimating progression of chronic kidney disease
AU2018351349A1 (en) * 2017-10-19 2020-04-23 Idexx Laboratories, Inc. Detection of symmetrical dimethylarginine
JP6868878B2 (ja) * 2018-10-17 2021-05-12 Kagami株式会社 糸球体濾過能力の決定方法
CN109545377B (zh) * 2018-10-22 2021-11-23 中南大学湘雅三医院 获取肾小球滤过率的模型的建立方法
US10745492B1 (en) * 2019-04-03 2020-08-18 Ark Diagnostics, Inc. Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof
WO2021046339A1 (en) * 2019-09-05 2021-03-11 The Regents Of The University Of California Noninvasive method to quantify kidney function and functional decline
WO2021132658A1 (ja) * 2019-12-27 2021-07-01 Kagami株式会社 腎機能を推定する方法及びシステム
JP2021168837A (ja) * 2020-04-17 2021-10-28 株式会社藤商事 遊技機
CN112768073B (zh) * 2021-01-15 2023-04-18 中山大学附属第三医院 一种肾小球滤过率估计模型的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100035274A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Idexx Laboratories, Inc. Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3134787A1 (de) * 1981-09-02 1983-03-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Creatinin-antikoerper
US4818703A (en) 1985-10-23 1989-04-04 Pizzolante John M Stabilized alkaline picrate reagent for jaffe creatinine determination
EP0356160A3 (en) 1988-08-24 1991-09-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capillary device
US5726010A (en) 1991-07-31 1998-03-10 Idexx Laboratories, Inc. Reversible flow chromatographic binding assay
US6455288B1 (en) 1993-04-08 2002-09-24 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases
US5804452A (en) * 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
WO1998049199A1 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Panorama Research, Inc. Cardiovascular disease risk assessment
US6736957B1 (en) 1997-10-16 2004-05-18 Abbott Laboratories Biosensor electrode mediators for regeneration of cofactors and process for using
US6358699B1 (en) 1999-02-05 2002-03-19 Cooke Pharma Assay for asymmetrical NG, NG dimethyl-l-arginine
US6699673B2 (en) 1999-12-22 2004-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Protein methylarginine-specific antibodies
EP1299398A1 (en) 2000-07-06 2003-04-09 Fal Diagnostics Methods and kits for the detection of arginine compounds
US20040038296A1 (en) * 2000-07-12 2004-02-26 Werner Naser Direct assessment of analyte to reference molecule ratios
DE10040904A1 (de) 2000-08-18 2002-02-28 Boeger Rainer H Verfahren und Mittel zum Nachweis einer Wahrscheinlichkeit zukünftigen Fortschreitens von Gefässerkrankungen
US7241856B2 (en) 2003-06-02 2007-07-10 Pentron Clinical Technologies Llc Dental resins, dental composite materials, and method of manufacture thereof
JP4214271B2 (ja) 2002-10-15 2009-01-28 アークレイ株式会社 クレアチニン測定用試験片
US7501053B2 (en) 2002-10-23 2009-03-10 Abbott Laboratories Biosensor having improved hematocrit and oxygen biases
WO2004046314A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for detecting asymmetric dimethylarginine in a biological sample
US20050148029A1 (en) * 2003-09-29 2005-07-07 Biosite, Inc. Methods and compositions for determining treatment regimens in systemic inflammatory response syndromes
DE602004020360D1 (de) 2004-11-04 2009-05-14 Germediq Forsch & Entw Ges Mbh Methode zur Bestimmung von Arginin, methylierten Argininen und deren Derivate
US8725990B1 (en) 2004-11-15 2014-05-13 Nvidia Corporation Configurable SIMD engine with high, low and mixed precision modes
US7879979B2 (en) 2005-01-21 2011-02-01 Alere International Arginine analogs, and methods for their synthesis and use
JP2007176872A (ja) 2005-12-28 2007-07-12 Sentan Seimei Kagaku Kenkyusho:Kk アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法
FR2919063B1 (fr) * 2007-07-19 2009-10-02 Biomerieux Sa Procede de dosage du leucocyte elastase inhibitor pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal.
CN101932722A (zh) * 2007-12-05 2010-12-29 伦敦王室学院 方法和组合物
EP2438441B1 (en) 2009-06-02 2014-05-21 BIOCRATES Life Sciences AG New biomarkers for assessing kidney diseases
CN101587118B (zh) * 2009-07-03 2012-09-12 长春迪瑞医疗科技股份有限公司 肌酐尿液分析试纸及制备方法
CN101598727B (zh) * 2009-07-09 2012-10-10 上海科华生物工程股份有限公司 定量测定人体血液尿素含量的干化学试纸
CN101865911A (zh) * 2010-03-16 2010-10-20 苏州市玮琪生物科技有限公司 一种尿肌酐定量检测卡
DE102011055265A1 (de) 2010-11-17 2012-05-24 Karl-Heinz Kellner Automatenfähiger Immunoassay für biogene Amine
JP2012112785A (ja) 2010-11-24 2012-06-14 Tohoku Univ 透析膜の評価方法
JP5925026B2 (ja) * 2011-04-28 2016-05-25 アークレイ株式会社 クレアチニン測定用乾式試験片及びクレアチニン測定法
US20140038203A1 (en) * 2012-07-09 2014-02-06 Musc Foundation For Research Development Methods for detecting or predicting kidney disease
PT3041576T (pt) 2013-09-05 2019-09-27 Idexx Lab Inc Métodos para detecção de uma doença renal

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100035274A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Idexx Laboratories, Inc. Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Koch et al., 'Regulation and Prognostic Relevance of Symmetric Dimethylarginine Serum Concentrations in Critical Illness and Sepsis', Mediators of Inflammation, (2013.06), Vol. 2013, pp 1-8. 1부.* *
이창화, '임상에서 사용하는 사구체여과율의 평가 공식', 대한내과학회지, 2012, Vol. 83, pp 455-457. 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4295907A2 (en) 2023-12-27
EP4295907A3 (en) 2024-03-13
HUE045723T2 (hu) 2020-01-28
CN105705202A (zh) 2016-06-22
KR20160051887A (ko) 2016-05-11
EP3480600A1 (en) 2019-05-08
EP3041576A4 (en) 2017-07-26
HRP20191569T1 (hr) 2019-11-29
ES2746008T3 (es) 2020-03-04
PL3041576T3 (pl) 2019-12-31
NZ717554A (en) 2022-04-29
LT3041576T (lt) 2019-10-25
BR112016004839A8 (pt) 2020-02-11
JP2020073927A (ja) 2020-05-14
JP2022070879A (ja) 2022-05-13
JP2024020376A (ja) 2024-02-14
US11035861B2 (en) 2021-06-15
CA2923140A1 (en) 2015-03-12
CA2923140C (en) 2023-09-26
PT3041576T (pt) 2019-09-27
MX2021006716A (es) 2021-07-15
JP2016530532A (ja) 2016-09-29
EP3480600B1 (en) 2023-11-08
US20160187348A1 (en) 2016-06-30
AU2014315063A1 (en) 2016-03-17
US20220137059A1 (en) 2022-05-05
CN105705202B (zh) 2019-02-26
CA3213810A1 (en) 2015-03-12
AU2020256440B2 (en) 2023-03-02
JP6657096B2 (ja) 2020-03-04
KR102412431B1 (ko) 2022-06-22
DK3041576T3 (da) 2019-09-09
MX2016002922A (es) 2016-11-07
AU2020256440A1 (en) 2020-11-12
EP3041576A1 (en) 2016-07-13
EP3041576B1 (en) 2019-06-19
CY1123179T1 (el) 2021-10-29
SI3041576T1 (sl) 2019-11-29
EP3480600C0 (en) 2023-11-08
WO2015035155A1 (en) 2015-03-12
KR102273028B1 (ko) 2021-07-02
RS59287B1 (sr) 2019-10-31
AU2014315063B2 (en) 2020-07-23
ES2969979T3 (es) 2024-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220137059A1 (en) Methods for Detecting Renal Disease
US20220221446A1 (en) Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine
US20210239704A1 (en) Analogs and conjugates of beta-aminoisobutyric acid (baib)
BR112016004839B1 (pt) Método para estimar a taxa de filtração glomerular (gfr) em uma amostra de um indivíduo animal, para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, para predizer a morte prematura ou determinar a mortalidade associada a uma doença renal em um indivíduo animal a partir de uma amostra do mesmo, dispositivo e kit

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant