JP2016523814A - 特に化粧品に使用するためのアルスロバクター・アジリスの抽出物 - Google Patents
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Abstract
Description
GATCCTGGCT CAGGATGAAC GCTGGCGGCG TGCTTAACAC ATGCAAGTCG AACGATGAAC
CTCACTTGTG GGGGGATTAG TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGAGTAAC CTGCCCTTGA
CTCTGGGATA AGCCTGGGAA ACCGGGTCTA ATACTGGATA CGACCTTCTG GCGCATGCCA
TGTTGGTGGA AAGCTTTTGT GGTTTTGGAT GGACTCGCGG CCTATCAGCT TGTTGGTGGG
GTAATGGCCT ACCAAGGCGA CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGTGACCG GCCACACTGG
GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC
GCAAGCCTGA TGCAGCGACG CCGCGTGAGG GATGAAGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT
CAGTAGGGAA GAAGCCTGTC TTTTGGGTGG GTGACGGTAC CTGCAGAAGA AGCGCCGGCT
AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGGCGCAAG CGTTATCCGG AATTATTGGG
CGTAAAGAGC TCGTAGGCGG TTTGTCGCGT CTGCCGTGAA AGTCCGGGGC TTAACTCCGG
ATCTGCGGTG GGTACGGGCA GACTAGAGTG CAGTAGGGGA GACTGGAATT CCTGGTGTAG
CGGTGAAATG CGCAGATATC AGGAGGAACA CCGATGGCGA AGGCAGGTCT CTGGGCTGTA
ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCATGGGGAG CGAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAT
GCCGTAAACG TTGGGCACTA GGTGTGGGGG ACATTCCACG TTTTCCGCGC CGTAGCTAAC
GCATTAAGTG CCCCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGCTA AAACTCAAAG GAATTGACGG
GGGCCCGCAC AAGCGGCGGA GCATGCGGAT TAATTCGATG CAACGCGAAG AACCTTACCA
AGGCTTGACA TGAACCGGAA TGATGCAGAG ATGTGTCAGC CACTTGTGGC CGGTTTACAG
GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC
GCAACCCTCG TTCCATGTTG CCAGCGGGTT ATGCCGGGGA CTCATGGGAG ACTGCCGGGG
TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GACGACGTCA AATCATCATG CCCCTTATGT CTTGGGCTTC
ACGCATGCTA CAATGGCCGG TACAAAGGGT TGCGATACTG TGAGGTGGAG CTAATCCCAA
AAAGCCGGTC TCAGTTCGGA TTGAGGTCTG CAACTCGACC TCATGAAGTT GGAGTCGCTA
GTAATCGCAG ATCAGCAACG CTGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC ACACCGCCCG
TCAAGTCACG AAAGTTGGTA ACACCCGAAG CCGGTGGCCT AACCCCTTGT GGGAGGGAGC
CGTCGAAGGT GGGACCGGCG ATTGGGACTA AGTCGTAACA AG
- ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体;
- N-アセチル-システイン(NAC);
- ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
- ビタミンC;
- グルタチオン;
- コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
- クルクミン又はジフェルロイルメタン;
- ケルセチン又はケルセトール;
- リコピン;
- コエンザイムQ10(Q10);
- 尿酸。
- UVによって生成された一重項酸素(1O2)を中和する効果;
- 直接的なUV吸収による「スクリーン」、「フィルター」又は「遮蔽」効果;
- 古典的な抗酸化効果、すなわち一重項酸素(1O2)によって生成されたフリーラジカルの中和。
- ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体;
- N-アセチル-システイン(NAC);
- ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
- ビタミンC;
- グルタチオン;
- コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
- クルクミン又はジフェルロイルメタン;
- ケルセチン又はケルセトール;
- リコピン;
- コエンザイムQ10(Q10);
- 尿酸。
細菌(SB5)を、落雪中で単離し、そのUVCに対する耐性及びその急速に増殖する能力に関して選択した。それは、その多くの種が好極限性細菌又は極限耐性細菌(extremotolerant)であるグラム陽性細菌である、アルスロバクターに属するとして特徴付けられている。
ACATGCAAGT CGAACGATGA ACCTCACTTG TGGGGGGATT AGTGGCGAAC GGGTGAGTAA
CACGTGAGTA ACCTGCCCTT GACTCTGGGA TAAGCCTGGG AAACCGGGTC TAATACTGGA
TACGACCTTC TGGCGCATGC CATGTTGGTG GAAAGCTTTT GTGGTTTTGG ATGGACTCGC
GGCCTATCAG CTTGTTGGTG GGGTAATGGC CTACCAAGGC GACGACGGGT AGCCGGCCTG
AGAGGGTGAC CGGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG
TGGGGAATAT TGCACAATGG GCGCAAGCCT GATGCAGCGA CGCCGCGTGA GGGATGAAGG
CCTTCGGGTT GTAAACCTCT TTCAGTAGGG AAGAAGCCGG CCTTTTGGGT TGGTGACGGT
ACCTGCAGAA GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCA
AGCGTTATCC GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGTTTGTCGC GTCTGCCGTG
AAAGTCCGGG GCTTAACTCC GGATCTGCGG NGGGTACGGG CAGACTAGAG TGCAGTAGGG
GAGACTGGAA TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGATGGC
GAAGGCAGGT NTCTGGGCTG TAACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCATGGGG AGCGAACAGG
ATTAGATACC CTGGTAGTCC ATGCCGTAAA CGTTGGGCAC TAGGTGTGGG GGACATTCCA
CGTTTTCCGC GCCGTAGCTA ACGCATTAAG TGCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC
TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGCG GAGCATGCGG ATTAATTCGA
TGCAACGCGA AGAACCTTAC CAAGGCTTGA CATGAACCGG AATGATGCAG AGATGTGTCA
GCCACTTGTG GCCGGTTTAC AGGTGGTGCA TGGTTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT
TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT CGTTCCATGT TGCCAGCGGG TTATGCCGGG
GACTCATGGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAATCATCA
TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT TCACGCATGC TACAATGGCC GGTACAAAGG GTTGCGATAC
TGTGAGGTGG AGCTAATCCC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGAGGTC TGCAACTCGA
CCTCATGAAG TTGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAA CGCTGCGGTG AATACGTTCC
CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCAAGTCA CGAAAGTNGT AACACCCGAA GCCGGNGCCT
AACCCCTTGN GGAGGGAGCC
2-1.SB5株の培養:
株を、約3日後に定常期に達するまで、好気的に、活発に撹拌しながら、25℃の温度で塩を有さないLB培地中で培養する。
ペレットを、任意選択でメタノールの存在下(例えば、メタノール/アセトン混合物(5/1))で、ペレットのグラム当たり6mlのアセトンで採取する。この抽出ステップは、暗所で4℃で、数時間、典型的に18時間の間行う。
3-1.ABTSアッセイ:
上記のように、このアッセイは、化粧品及び農業食品産業において従来から使用されており、純化学的に、抽出物の「総抗酸化能力」を確立するのに役立つ。このアッセイは、特定種類のラジカルを扱う場合のみ抽出物の抗酸化活性が測定されるので、不完全であるが、それは、トロロクスによる標準化を介して、このように試験された数千の他の分子と比較できる結果を生成するという利点を有する。
この試験は、前記化合物又は抽出物のタンパク質に対する保護能力を評価するために、フリーラジカル、特にヒドロキシル(OH・)、及び化合物又は抽出物の存在下でアルカリホスファターゼ(AP)の活性を405nmで測定することからなる。
試薬:
緩衝液:「トリス緩衝生理食塩水」粉末(Sigma社;製品参照番号:T6664-10PAK);
酵素:緩衝グリセロール溶液中の125U/μLでのアルカリホスファターゼ10KU(Sigma社;製品参照番号:P0114);
酸化剤:
1/30%又は9Mでの過酸化水素(Sigma社;製品参照番号:H1009-5ML):溶液B1;
2/硫酸鉄II七水和物(FeSO4,7H2O)0.1M(Fluka社;製品参照番号:44970):溶液B2;
基質:4-ニトロフェニルリン酸の溶液(「アルカリホスファターゼ黄色基質」;Sigma社;製品参照番号:P7998-100ML)。
キット:
- 96-ウェルプレート;
- 緩衝液:20mlのTBS溶液-0.05M、pH8;
- 溶液A(酵素):緩衝液に1/1000(又は1.25Uすなわち0.125U/μL)で希釈された10μlの原液;
- 100μlの溶液B1及び100μlの溶液B2又は緩衝液中での適した希釈度での溶液B1及びB2の混合物に相当する溶液B(例えば30μlの溶液B1+30μLの溶液B2、すなわち1/100希釈から得られる、90mMでの3mlの溶液B);
- 溶液C(基質):5mlの市販の溶液。
プロトコール:
- 適した希釈度で緩衝液において溶液Aを希釈する;
- 0.005から0.05Uの間の酵素量を有するように、各ウェルに10μlの希釈された溶液Aを挿入する;
- 緩衝液において任意選択で希釈された、10μlの試験される生成物又は抽出物を各ウェルに加える。個々のウェルを使用して、一連の希釈度を試験することができる;
- 30μlの溶液Bを各ウェルに加える。溶液Bの濃度を調節して、存在する酵素の量の90%の不活性化を得る。溶液Bの濃度の30%に等しい酸化剤の最終濃度;
- 撹拌せずに37℃で15分間インキュベートする;
- 50μlの溶液Cを加える。したがって、反応体積は、100μlに等しい;
- プレートを撹拌しながら37℃で設置する;
- 吸光度を、405nmで反応の20分間(動態学的)、又は反応の5分後に(選択的)読む。
図4Aは、本発明による抽出物(SBE)が、トロロクスの保護能力より約100倍高く、試験した全ての抗酸化剤の6倍を超える高さの、フリーラジカルからのタンパク質の保護能力を有することを示している。この結果とABTSによって測定された抗酸化潜在力間の差は、タンパク質の保護がSBEの抗酸化潜在力のみに連結しているわけではないことを実証している。
この試験は、前の節で記載したものと同様である。それは、前記化合物又は抽出物のタンパク質からの保護能力を評価するために、化合物又は抽出物の存在下で、UV-C(254nm)を使用して照射されたアルカリホスファターゼ(AP)の活性を405nmで測定することからなる。
アルカリホスファターゼを、UV-Cに相当する254nmでのUV照射に供する。一定の撹拌下で、酵素の90%の不活性化を生じるUV線量を、上記のものと同様の条件下で反応媒体に適用した。酸化剤によって占められる体積は、緩衝液と交換されることに留意すべきである。実際に、1又は2時間の曝露時間で0.0365J/cm2/分ランプに等しい力を有するランプ。
図5は、本発明による抽出物(SBE)が、トロロクスの保護能力の300倍を超える高さであり、試験した全ての抗酸化剤よりもほぼ40倍大きい、UVからのタンパク質保護能力を有することを示している。
- UVによって生成された一重項酸素(1O2)を中和する効果;
- 直接的なUV吸収による「スクリーン」、「フィルター」又は「遮蔽」効果;
- 古典的な抗酸化効果、すなわち一重項酸素(1O2)によって生成されたフリーラジカルの中和。
アルカリホスファターゼの活性を、酸化ストレスの非存在下であるが、本発明による抽出物(SBE)の増加する濃度の存在下で測定した。
本発明による抽出物(SBE)によるタンパク質保護の有効性を増加させることができる抗酸化剤を同定するために、3-2節で記載した試験を、本発明による抽出物(SBE)と1ダースの既知の抗酸化剤を個々に混合することによって行った。本発明による抽出物(SBE)が抗酸化効果を複合する分子を同定すること、又は相加効果を超える相乗作用を強調することが必要である。かかる混合物の別の利点は、本発明による抽出物(SBE)の可能な安定化である。
A/コメットアッセイ:
本発明による抽出物(SBE)によるヒト細胞の保護を確認するために、UV/可視光によって誘発された酸化ストレスに直面しているケラチノサイトの初代培養物及びそれらのDNAを保護する措置を、Ostling、O.及びK.J. Johanson. (Biochemical and biophysical research communications 123.1 (1984): 291〜298)並びにSingh、Narendra P.等(Experimental cell research 175.1 (1988): 184〜191)によって報告されたように、コメットアッセイを通して行った。細胞モデルにおける本発明による抽出物(SBE)の保護活性を示し、それを参照抗酸化剤、酢酸トコフェロールと比較することは必須である。
UVB/UVA/可視放射線(照射:290nm〜800nm)に対するSBE及び酢酸トコフェロール(Ac-Toc)の抗酸化特性を、正常なヒトケラチノサイトの初代培養物上でコメットアッセイ(アルカリ変法)によって評価した。
図8は、本発明による抽出物(SBE)が、酸化ストレスからの高い細胞保護能力を有し、100倍少なく濃縮されているのに、酢酸トコフェロールよりも細胞DNAを保護するのに役立つことを示している。したがって、そのin vitroの保護能力は、酢酸トコフェロールの保護能力の100倍を超える大きさである。
コメットアッセイに関して上記で使用したものと同じUV/可視照射プロトコールに従って、SBE及び酢酸トコフェロールの存在下でのケラチノサイトのカルボニル化の速度を測定した。
1-ケラチノサイトの培養及び照射
- 正常なヒトケラチノサイト(NHK)(T6)-106細胞/条件
- 条件:
- 1%THF溶媒対照
- SBE 200nM
- 酢酸トコフェロール20μM
- 各条件を、三連で行う。
- 2時間の種々の実験条件におけるKHNとの接触。
- 4℃でのSuntest CPS+ソーラーシミュレーター(Atlas Material Testing Technology社)によるPBSに置かれた細胞の120kJ/m2でのUVB/UVA/可視照射。陰性対照を、照射と同じ期間、4℃で維持する。
- 照射後の細胞のトリプシン処理。氷で冷やしたPBSの水洗。PBSの除去及び-80℃での細胞ペレットの即時の凍結。
2-カルボニル化の測定
- タンパク質を、細胞の溶解後に抽出し、それらの濃度を、Bradford試験を使用して測定する。
- タンパク質を、カルボニル基に結合する、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)によって引き出す。
- 次いで、カルボニル化速度を、450nmでELISAプレート上で測定する(OxyELISA(商標) Oxidized Protein Quantitation Kit, Millipore)。
図9は、ケラチノサイトのタンパク質のカルボニル化の速度が、UV/可視照射後に著しく増加することを示している。この増加は、酸化からタンパク質を保護する、SBE抽出物又は酢酸トコフェロールの追加によって有意に減少する(P値<0.01)。SBE抽出物は100倍少なく濃縮されているが、この保護は、SBE及び酢酸トコフェロールに関して同様である(P値>0.01)。
化粧用組成物は、0.0001から0.01wt%の本発明による抽出物(乾いた)を典型的に含む。
- 細菌の比較的容易な培養及び抽出物の調製(好塩菌を含めた多くの好極限性微生物とは異なる);
- 抽出物の異なる画分間の相乗作用;
- 抽出物の全体的な活性における異なるアイソフォームの寄与(例えばディノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)のデイノキサンチンのみとは異なる);
- 既知の抗酸化剤と比較して非常に強い抗ラジカル及び抗UV活性;
- 既知の抗酸化剤との相乗作用;
- 抗酸化能力をしのぐ、プロテオームに対するこれまでにない保護効果:生化学的試験並びに細胞培養の両方に関して、SBE抽出物の抗酸化能力は、トロロクスの抗酸化能力よりも4倍高い一方、タンパク質を保護するその能力は、トロロクスの能力よりも100倍強い。
Claims (15)
- アルスロバクター・アジリス細菌のカロテノイドに富んだ抽出物を含む、化粧用、医薬用又は食事用組成物。
- 前記抽出物が、1wt%のトリプトン及び0.5wt%の酵母抽出物からなる培地中で前記細菌を培養することによって得られることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記抽出物が、定常期にある細胞から得られることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記抽出物が、細菌ペレットから得られる無極性相に相当することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細菌ペレットが、好ましくはアセトン及び/又はメタノールを使用して抽出され、前記無極性相が、無極性溶媒、好ましくはヘキサン、及び飽和塩溶液、好ましくはNaCl溶液を加えることによって得られることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- 好ましくは以下の群:
- ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体の1つ;
- N-アセチル-システイン(NAC);
- ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
- ビタミンC;
- グルタチオン;
- コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
- クルクミン又はジフェルロイルメタン;
- ケルセチン又はケルセトール;
- リコピン;
- コエンザイムQ10(Q10);
- 尿酸
から選択される抗酸化剤も含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記抽出物が、組成物の乾燥質量の0.0001から0.01%に相当することを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- ローション、クリーム、ジェル、スプレー、溶液、カプセル又は錠剤の形態であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に適用することからなる、好ましくは酸化ストレス、特に皮膚の細胞老化に抵抗するための、美容トリートメントの方法。
- UV安定剤として使用するための、請求項1から5のいずれか一項に規定の抽出物。
- 可視光、特に青紫色光からの保護剤としての、請求項1から5のいずれか一項に規定の抽出物の使用。
- フリーラジカル捕捉剤又は抗酸化剤としての、請求項1から5のいずれか一項に規定の抽出物の使用。
- タンパク質の保護剤としての、請求項1から5のいずれか一項に規定の抽出物の使用。
- 前記抽出物が、好ましくは以下のリスト:
- ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体の1つ;
- N-アセチル-システイン(NAC);
- ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
- ビタミンC;
- グルタチオン;
- コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
- クルクミン又はジフェルロイルメタン;
- ケルセチン又はケルセトール;
- リコピン;
- コエンザイムQ10(Q10);
- 尿酸
から選択される、別の抗酸化剤と組み合わされていることを特徴とする、請求項10に記載の使用のための抽出物又は請求項11から13に記載の使用。 - プロテオームを保護するための、好ましくはアルスロバクター・アジリス細菌に由来する、カロテノイドの使用。
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