KR101550271B1

KR101550271B1 - 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101550271B1
Application number: KR1020150095501A
Authority: KR
Inventors: 최성규; 김윤정; 이대우; 김동욱
Original assignee: 주식회사 더마랩
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2015-09-07

Abstract

본 발명은 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 송악추출물에 당결합 분해 효소를 처리함으로써 알파-헤데린 배당체를 헤데라게닌으로 전환시켜 염증 매개 발현 인자 억제 및 항산화 활성이 우수한 추출물을 제조하며, 이를 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물의 제조에 이용하는 기술에 관한 것이다.
본 발병에 따른 화장료 조성물은 천연물 유래의 물질로, 독성 및 부작용이 없으며, 탁월한 염증 매개 발현 인자 억제 및 항산화 효과를 나타내므로, 피부 염증에 영향을 주는 외부인자로부터 피부를 보호함으로써, 피부염 완화 및 피부 트러블을 개선하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물{Method for preparing Hedera Rhombea extract and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 송악추출물에 당결합 분해 효소를 처리함으로써 알파-헤데린 배당체를 헤데라게닌으로 전환시켜 염증 매개발현인자 억제 및 항산화에 대한 활성이 우수한 추출물을 제조하며, 이를 아토피 피부염 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물의 제조에 이용하는 기술에 관한 것이다.

피부는 신체 중 가장 큰 기관으로서 항상 외부와 접하고 있으면서, 여러 가지 자극이나 건조한 환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 역할을 하고 있으며, 다른 기관에 비하여 새로운 세포의 생성과 소멸이 활발히 일어나는 기관이다. 또한, 물리적인 찰과상으로부터 보호하고, 몸 안에 가지고 있는 물의 손실을 막아주며, 태양으로부터 나오는 해로운 자외선으로부터 보호해주고, 몸의 체온을 조절해주는데 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 아기 피부는 하얗고 부드러우며 여드름 같은 염증이 없는 것이 일반적이다. 그러나 아기 피부는 결코 여성들이 이상적이라 생각하는 것처럼 좋은 것은 아니다. 오히려 극히 미성숙한 상태로 인해 외부와의 경계를 이루는 각질층이 성인에 비해 얇고 각질층의 수분 함유량 및 각질층이 보유한 가장 중요한 기능 중 하나인 표피의 보호 장벽 기능이 약한 것이다. 이러한 이유로 아기피부는 외부영향에 민감하며, 바이러스에 쉽게 노출될 수 있다. 이렇듯 아기 피부는 건조한 피부가 되기 쉽고 이 건조한 피부는 면역기능이 약화되어 아토피 피부염뿐만 아니라 여러 피부 질환으로 발전할 수도 있으며, 마찬가지로 약하고 민감한 피부일수록 항염 및 피부 자극완화 기능의 강화가 절실하다고 하겠다.

이처럼 민감한 피부에 트러블을 일으키는 요인으로는 오존층 파괴에 따른 자외선 조사량 증가, 생활공간의 건조화, 스트레스, 유해 화학 물질의 증가 등의 외부 환경에 의해 나타나고 있으며, 이러한 외부 환경요인으로 인해 피부의 과성숙 및 노화가 촉진됨에 따라, 최근 소비자의 지향은 자연 친화적, 저자극성의 화장품을 선호하는 추세이다. 따라서 외부 환경으로부터 민감성 피부를 보호하고 노화를 예방하고 최소화시킬 수 있는 피부 진정 및 항산화용 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.

한편, 최근에는 천연물에서 추출하고 분리한 사포닌계 물질들이 피부에 자극이 적고, 수렴작용, 항균 작용과 같은 기타의 약리작용을 가지고 있다는 사실이 널리 알려짐에 따라, 천연물을 이용하여 화장품 조성물을 제조하고자 하는 다양한 시도가 이루어지고 있다.

종래 대한민국 공개특허 제2006-0113112호 '피부진정용 화장료 조성물'에는 '조성물 총 중량에 대하여 30~90중량%의 자일리톨을 함유함으로써 피부에 시원함 및 청량감을 주고 피부탄력증진, 피부자극진정과 같은 미용효과를 나타내는 화장료 조성물'이 개시되어 있다. 또한 대한민국 공개특허 제2012-0015881호 '피부 진정 효과를 가지는 서양배꽃 추출물을 함유하는 화장료 조성물'에는 '항자극, 항염증 및 항알러지 효과를 가지는 서양배꽃(Pyrus Communis Flower) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 진정 및 피부 자극 완화용 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 피부진정 및 항산화 활성을 가지는 천연물에 대한 연구를 하던 중, 특정한 추출방법에 의하는 경우 송악으로부터 이러한 활성을 가지는 생리활성물질인 헤데라게닌을 높은 수율로 추출할 수 있으며, 이를 피부진정 및 항산화용 화장료로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 효소반응에 의하여 특정 활성성분이 강화되어, 피부 진정 및 항산화활성이 우수한 송악추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 송악추출물의 제조에 있어서 염증매개 발현인자 억제 및 항산화에 대한 활성이 우수한 헤데라게닌을 강화하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 송악추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 진정 및 항산화용 화장료조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 건조된 송악을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 송악추출물 제조단계; 상기 송악추출물을 용매에 용해시키고 당결합 분해효소를 첨가하는 효소첨가단계; 상기 효소가 첨가된 송악추출물을 교반하면서 반응pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건하에서 효소반응을 진행하는 효소반응단계; 및 여과 후 효소를 실활시키고 감압농축하는 단계를 포함하는 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 당결합 분해 효소로는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 아밀라아제(amylase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 펙티나제(pectinase)가 사용될 수 있다. 상기 효소반응에 의하여 송악추출물에 함유된 알파-헤데린 배당체의 당이 선택적으로 제거됨으로써 헤데라게닌 성분이 강화된 송악추출물이 제조된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 건조된 송악을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 송악추출물 제조단계; 상기 송악추출물을 물에 용해시키고 펙티나제(pectinase)를 첨가하는 효소첨가단계; 및 상기 효소가 첨가된 송악추출물을 교반하면서 반응pH 4.5, 반응온도 45℃ 및 반응시간 48시간의 조건 하에서 반응시키는 단계를 포함하는 송악추출물에 함유되는 헤데라게닌의 함량 증대 방법이 제공된다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 상기 효소반응에 의하여 제조된 송악추출물을 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량%, 바람직하게는 0.01~20중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물은 우수한 염증매개인자 발현억제 효과 및 항산화 효과를 나타내므로 피부 진정 및 항산화용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

효소반응에 의한 송악추출물을 유효성분으로 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조되는 효소반응에 의한 송악추출물은 헤데라게닌 성분이 강화되며, 피부 진정 및 항산화활성이 우수하여 적은 사용량으로도 우수한 피부 진정 및 항산화효과를 나타내므로 화장료 조성물로 유용하다.

본 발명은 송악추출물의 제조에 있어서, 당결합 분해작용을 하는 효소, 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 아밀라아제(amylase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase) 및 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 사용하여 효소반응에 의하여 특정 활성성분인 헤데라게닌이 강화된 추출물을 제조하며 이를 화장료에 적용하는 기술에 관한 것이다.

한약재로서의 송악은 줄기와 잎을 상춘등 이라고 하며, 해독의 효능이 있어 류마티즘 관절염, 간염, 구안와사를 치료하는데 사용되었다. 또한 소염 작용이 있어 새로운 피부조직의 재생을 촉진하는데 효과가 있으며 민간에서는 피부병에 있어서 송악 열매의 삶은 물을 이용하여 피부병을 치료하였다고 한다[배기환 한국의 약용식물; 안덕균 한국본초도감]. 그리고 북한의 조선약용식물지(1999)에 의하면 민간에서는 줄기와 잎을 물로 짓찧어 얻은 즙을 약으로 사용하였다. 송악 성분 중 루틴(Rutin)을 포함한 4종의 플라보노이드(Flavonoid) 분리에 대한 연구가 보고 되고 있으며, 또한 사포닌(Sapoinin)에 대한 분리 및 생리활성 작용이 보고되었다(Krajewska 1981; Timoad et al., 1980; Hostetunann 1980; Takagi 1976). 이외에 조선식물지에 의하면 잎에는 알파-헤데린(α-Hederin), 헤데라게닌(Hederagenin) 및 클로로겐산(Chlorogenic acid) 등이 함유되어 있다. 본 발명에서는 송악의 잎, 줄기부위를 사용할 수 있다.

하기의 화학식으로 표시되는 알파-헤데린(α-Hederin)은 하얀색의 사포닌 화합물인 트리터르페노이드의 일종으로 헤데라게닌(Hederagenin)에 아라비노스(Arabinose)와 람노스(Rhamnose)가 결합된 물질이다.

하기의 화학식으로 표시되는 헤데라게닌(Hederagenin)은 트리터르페노이드의 일종으로서 여러 생리활성을 갖는 성분 중의 하나이다.

헤데라게닌은 강력한 항산화제로서 세포의 산화적 손상 및 지방의 산패를 막아 주며 이를 통해 고혈압의 예방효과도 인정되고 있다. 헤데라게닌이 이와 같은 효과를 나타내는 이유는 생체 내에서 반응성이 강해 세포의 여러 성분을 손상시키는 프리 라디칼(free radical)을 제거하고, 동맥경화와 심장병의 원인인 저밀도 지단백질 산화(low-density lipoprotein oxidation)를 줄이며, 체내 항산화제인 비타민 E를 보호함과 동시에 재생시키며, 금속이온의 유해작용을 불활성화시키는 역할을 하기 때문인 것으로 알려져 있다.

본 발명은 송악에 포함되어 있는 특정 생리활성물질인 헤데라게닌을 고효율로 추출하기 위하여 효소처리 송악추출물을 제조함에 있어서, 특정 효소를 사용하여 특정 반응조건에서 반응시킴으로써 특정 생리활성물질이 강화되고, 피부흡수능이 촉진되는 추출물을 제조하고, 이를 피부 진정 및 항산화용 화장료 조성물에 적용하는 것에 특징이 있다.

본 발명에 따르면, 건조된 송악을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하여 송악추출물을 제조하는 단계; 상기 송악추출물을 용매, 바람직하게는 물에 용해시키고 당결합 분해 효소를 첨가하는 효소첨가단계; 상기 효소가 첨가된 추출물을 교반하면서 반응pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건 하에서 효소반응을 진행하는 효소반응단계; 및 여과 후 효소를 실활시키고 감압농축하는 단계를 포함하는 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법이 제공된다. 이와 같은 당결합 분해 효소에 의한 효소반응에 의해 추출물 내의 헤데라게닌의 함량이 증대되며, 피부에 적용시 피부흡수가 촉진된다.

그 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 효소반응에 제공되는 송악추출물은 건조된 송악을 물 또는 유기용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들과 물의 혼합물, 더욱 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하여 통상의 추출 방법으로 추출함으로써 제조될 수 있다.

헤데로게닌 강화를 위해 수행되는 효소반응에는 당결합 분해작용을 하는 효소, 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 아밀라아제(amylase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase) 및 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소, 더욱 바람직하게는 펙티나제(pectinase)가 사용된다.

상기 당결합 분해효소에 의하여 송악추출물에 함유된 헤데린 배당체의 당은 선택적으로 분해되어 추출물내의 헤데라게닌 성분의 함량이 증대된다. 상기 효소들은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(basillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobactertium)속, 모르티엘렐라(mortierella)속의 미생물로부터 얻을 수 있다.

송악추출물 내의 헤데로게닌 성분 강화를 위해서는 상기 효소반응시의 조건이 중요하다. 반응pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건 하에서 효소반응을 진행하는 것이 바람직하다. 특히 당결합분해 효소로서 펙티나제를 사용하는 경우에는 반응pH 4.5, 반응온도 45℃ 및 반응시간 48시간의 조건에서 수행하는 경우에 헤데로게닌의 함량 증가율이 가장 우수하였다.

상기 효소반응에 의하여 제조된 송악추출물은 단순한 일반 송악추출물과 비교하여 볼 때, 헤데라게닌 성분이 강화되어 적은 사용량으로도 더욱 우수한 피부 진정 및 항산화작용을 하는 것이 확인되었다.

이와 같이 본 발명에 따르면 상기 효소반응에 의하여 제조되어 우수한 염증매개인자 발현억제 및 항산화 활성을 가지는 송악추출물이 제공된다. 또한 본 발명에 따르면, 상기 효소반응에 의한 송악추출물을 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량%, 바람직하게는 0.01~20중량% 함유하는 피부 진정 및 항산화용 화장료 조성물이 제공된다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 송악추출물의 제조

건조된 송악 100g을 70% 에탄올 600g에서 50℃로 3시간 추출하여 송악추출액을 얻은 후, 이를 감압 농축하고 동결 건조하여 송악추출물 5.54g을 제조하였다.

실시예 1~7 : 효소반응에 의한 송악추출물의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 송악추출물 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g에 정제수 400ml와 하기 표 1의 효소액 50ml를 혼합하여 pH 4.5, 45℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시켰다. 효소반응 후에 여과하고 온도를 올려 효소를 실활시켰다. 이어서, 송악추출물을 감압 농축하여 효소반응에 의한 송악추출물 1.2g을 제조하였다.

	효소(Enzyme)	출처(Origin)
실시예 1	아밀라아제	Aspergillus oryzae
실시예 2	베타-글루코시다제	Aspergillus oryzae
실시예 3	셀룰라제-A	Aspergillus niger
실시예 4	베타-갈락토시다제	Aspergillus oryzae
실시예 5	베타-자일로시다제	Aspergillus niger
실시예 6	펙티나제	Rhizopus sp
실시예 7	나린지나아제	Penicillium decumbens

시험예 1 : 헤데라게닌 생성율 측정

HPLC를 이용하여 상기 실시예 1 ~ 7에서 제조된 효소반응 송악추출물의 헤데라게닌 생성율을 측정하였다. 헤데라게닌의 생성율은 상기 제조예 1의 추출물을 대조군으로 하였을 때의 헤데라게닌 함량의 증가율을 나타내며, 하기의 식과 같이 계산하였다.

생성율(%)= 헤데라게닌 Standard 시료량(mg) × 실시예의 peak 면적값 ÷ 헤데라게닌 Standard peak 면적값 ÷ 실시예의 시료량(mg)

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	생성율(%)
제조예 1	0.18
실시예 1	3.2
실시예 2	4.5
실시예 3	5.9
실시예 4	5.6
실시예 5	2.8
실시예 6	7.9
실시예 7	1.2

실시예 8~13 : 효소반응에 의한 송악추출물의 제조

헤데라게닌 생성율이 가장 좋았던 상기 실시예 6의 펙티나제를 이용하여 반응온도를 달리하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다. 상기 제조예 1에서 제조된 송악추출물의 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g을 정제수 400ml와 펙티나제(AFP-L4, 노보자임사) 효소액 50ml와 혼합하여 하기의 표 3과 같은 조건에서 효소반응을 진행시킨 후, 감압 농축하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다.

	반응 온도(℃)	반응시간(hr)	반응 pH
실시예 8	25	48	4.5
실시예 9	30	48	4.5
실시예 10	35	48	4.5
실시예 11	40	48	4.5
실시예 12	45	48	4.5
실시예 13	50	48	4.5

실시예 14~19 : 효소반응에 의한 송악추출물의 제조

헤데라게닌 생성율이 가장 좋았던 상기 실시예 6의 펙티나제를 이용하여 반응시간을 달리하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다.

상기 제조예 1에서 제조된 송악추출물의 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g을 정제수 400ml 및 펙티나제(AFP-L4, 노보자임사) 효소액 50ml와 혼합하여 하기의 표 4와 같은 조건에서 효소반응을 진행시킨 후, 감압 농축하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다.

	반응 온도(℃)	반응시간(hr)	반응 pH
실시예 14	45	12	4.5
실시예 15	45	18	4.5
실시예 16	45	24	4.5
실시예 17	45	36	4.5
실시예 18	45	48	4.5
실시예 19	45	60	4.5

실시예 20~23 : 효소반응에 의한 송악추출물의 제조

헤데라게닌 생성율이 가장 좋았던 상기 실시예 6의 펙티나제를 이용하여 반응pH를 달리하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다.

상기 제조예 1에서 제조된 송악추출물의 농축액(100g당 고형분 함량 2g) 50g을 정제수 400ml 및 펙티나제(AFP-L4, 노보자임사) 효소액 50ml와 혼합하여 하기의 표 5와 같은 조건에서 효소반응을 진행시킨 후, 감압 농축하여 효소반응에 의한 송악추출물을 제조하였다.

	반응 온도(℃)	반응시간(hr)	반응 pH
실시예 20	45	48	3.5
실시예 21	45	48	4.0
실시예 22	45	48	4.5
실시예 23	45	48	5.0

시험예 2 : 헤데라게닌 생성율 측정

상기 실시예 8~23에서 제조된 효소반응에 의한 송악추출물의 생성율을 측정하였으며 그 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

	실시예						실시예						실시예
	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23
생성율 (%)	5.8	6.1	6.3	6.6	7.2	6.5	4.1	4.6	5.2	6.6	7.3	6.7	6.9	7.1	9.5	7.3

상기 표 6에 나타낸 바와 같이 당결합 분해효소로서 펙티나제(AFP-L4, 노보자임사)를 사용하는 경우에, 반응 온도는 45℃, 반응 시간은 48시간, 반응 pH는 4.5인 조건에서 가장 우수한 헤데라게닌 생성율(%)을 나타내었다.

하기 효소 반응에 의한 송악추출물에 대한 유효성 활성 검증에 사용한 시료는 다음과 같다. 비교군으로 제조예 1에서 70% 에탄올로 추출하여 파우더화한 일반 송악추출물을 시험에 이용하였다.

상기 실시예 22에서 제조한 효소 반응에 의한 송악추출물을 농도별로 디메틸설폭사이드에 희석하여 제조한 희석용액을 실험에 사용하였다.

시험예 3 : 세포독성시험

제조된 효소반응에 의한 송악추출물을 가지고 유효성 시험에 들어가기 전 농도별 세포성장율을 확인함으로써 적절한 시험 시료농도를 산출하고 사용하는 농도가 안전에 영향을 미치는지에 대한 확인시험으로 세포독성시험을 실시하였다.

실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실시예 22에서 제조한 효소 반응에 의한 송악추출물을 최종 농도가 100, 500, 1000, 5000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후 (3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의 흡광도 × 100

시료물질	시료 농도(㎍/㎖)	세포 생존율(%)
실시예 22	100	100
	500	100
	1000	100
	5000	99.28
Control		100

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 효소 반응에 의한 송악추출물 (실시예 22)을 적용한 시료 모두 99% 이상의 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 효소 반응에 의한 송악추출물이 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 4 : 염증매개인자 발현억제 효과 확인 시험

상기 실시예 22에서 제조한 효소 반응에 의한 송악추출물의 염증매개인자 발현억제 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다.

TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 형성 과정으로 이어지게 된다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다.

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A260nm/A280nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다. cDNA합성은 3㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500ng/㎕l) primer, dNTP (10mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA)를 첨가하여 25℃에서 10분간 primer annealing, 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase denaturation 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3㎕, 10X taq polymerase buffer 5㎕, 10mM dNTP 2㎕, 10pmol primer 각각 2㎕, taq polymerase 0.5㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50㎕로 조정한 후 증폭시켰다. 프라이머 서열은 표 8에 나타내었다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% 아가로우스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 image analyzer(UGEN, U:Genius)로 확인하였으며 각 밴드의 밀도는 밀도계측프로그램(Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다.

Gene		Primer sequence
GAPDH	Forward	5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3’
GAPDH	Reverse	5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3’
TNF-α	Forward	5' - CAG AGG GAA GAG TTC CCC AG - 3'
TNF-α	Reverse	5' - CCT TGG TCT GGT AGG AGA CG - 3'

그 결과를 하기의 표 9에 나타내었다. 대조군으로는 알파-비사보롤 (α-Bisabolol)을 사용하였다.

TNF-α expression(%)	미조사	UV 조사
TNF-α expression(%)	0.00%	0.00%	0.01%	0.05%	0.10%	0.50%
Blank	6.18	100.00	-	-	-	-
실시예 22	-	-	52.89	32.40	12.06	5.76
제조예 1	-	-	85.54	67.60	60.78	48.45
α-Bisabolol	-	-	62.24	42.68	30.52	24.55

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 의한 효소 반응에 의한 송악추출물(실시예 22)은 UV에 의해 유발된 염증 반응 유발인자인 종양괴사인자(TNF-α)의 발현을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제한 것을 알 수 있었다. 그러므로 효소 반응에 의한 송악추출물은 피부 염증 반응을 효과적으로 억제하며, 이로써 피부 자극을 진정시키는 효능 또한 뛰어나다. 또한, 본 발명의 효소 반응에 의한 송악추출물은 일반적인 송악추출물에 비하여 그 효능이 매우 우수하였다.

시험예 5 : 세포내 MMP-1 생성 억제 시험

인간 정상 피부세포인 섬유아세포 CCD-986SK(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1 x 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1과 실시예 22에서 제조한 일반 송악추출물과 효소 반응에 의한 송악추출물을 최종 농도가 100, 500, 1000, 5000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 10에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다.

시료 농도 (㎍/㎖)	MMP-1 생성 억제율(%)
시료 농도 (㎍/㎖)	실시예 22	제조예 1	TGF-β
100	37.5	14.6	42.3
500	54.3	26.9	65.5
1000	68.1	39.1	69.7
5000	87.6	48.2	88.9

상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 일반 송악추출물(제조예 1)을 적용한 시료에 비하여 효소 반응에 의한 송악추출물을 적용한 시료가 MMP-1 생성 억제 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 상승효과로 대조군 TGF-β와 유사한 경향의 효과를 보여주었다.

시험예 6 : DPPH 라디칼 소거능을 이용한 항산화활성 시험

본 발명에 따른 추출물의 항산화능을 DPPH에 대한 전자공여능(electron donating ability)으로 측정하였다. DPPH는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 517nm에서 강한 흡수 띠를 보이나 전자공여체와 반응을 하게 되면 전자나 수소 라디칼을 받아 안정한 분자가 되어 흡수 띠도 사라지게 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하며 그 수에 비례하여 진보라색의 DPPH의 색깔은 점점 옅어지게 되고 흡광도도 감소하게 된다.

상기 실시예 22에서 제조된 효소 반응에 의한 송악추출물을 시료로 사용하였으며, DPPH는 시그마사(Sigma CO,. Ltd, 미국)에서 구입하여 사용하였다. 먼저, 400㎛ 농도의 표준 DPPH 용액을 만들었다. 그리고 상기 실시예 22의 시료를 각각 50, 100, 250, 500ppm의 농도가 되도록 DMSO에 용해시켜 준비하였다. 대조군으로서 아스코르빈산(500ppm) 및 효소 처리되지 않은 일반 송악추출물(500ppm, 제조예 1)을 준비하였다. 아스코르빈산 및 시료를 100 ㎕에 0.4 mM DPPH 100 ㎕를 96 well plate에 넣어 혼합한다. 아스코르빈산과 시료의 blank는 0.4 mM DPPH대신 EtOH 100㎕를 넣어 혼합한다. 37℃에서 30분 동안 발색한 후, 517nm에서 blank로 영점보정하고 흡광도를 측정하였다.

DPPH radical 소거능(%)=(1-시험군의 흡광도/대조군의 흡광도)×100

그 결과를 하기의 표 11에 나타내었다.

시료 농도	자유라디칼소거효과(%)
대조군(Ascorbic acid) 500ppm	94.8
실시예 22 50ppm	28.4
실시예 22 100ppm	53.1
실시예 22 250ppm	72.6
실시예 22 500ppm	92.8
제조예 1 500ppm	46.3

상기 표 11에서 확인되는 바와 같이 본 발명에 따른 효소반응에 의한 송악추출물(실시예 22)은 기존의 항산화제인 아스코르빈산과 유사하고, 효소처리하지 않은 일반 송악추출물(제조예 1)에 비하여 우수한 항산화능을 나타내었다.

실시예 24~25 : 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 로션 제조

효소 반응에 의한 송악추출물(실시예 22)을 함유한 로션을 하기의 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

비교예 1 : 일반 송악추출물을 함유하는 로션 제조

상기 일반 송악추출물(제조예 1)을 함유한 로션을 하기의 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

(중량%)	대조예	비교예 1	실시예 24	실시예 25
제조예 1	-	0.5	-	-
실시예 22	-	-	0.5	1.0
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
유동 파라핀	10.0	10.0	10.0	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5
글리세릴스테아레이트/ 피이지-400 스테아레이트	1.0	1.0	1.0	1.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0	3.0	3.0
카르복시폴리머	0.1	0.1	0.1	0.1
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2
방부제	미량	미량	미량	미량
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100

시험예 7 : 피부 진정 효과 확인

현재 피부 알레르기 증상이 없는 20 내지 30대 남녀 20명을 대상으로 하완의 안쪽 부위에 테입 스트리핑 법(Tape Stripping Method)을 통한 피부자극을 유발한 후, 본 발명에 따른 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유한 로션(실시예 24 ~ 25)과 일반 송악추출물을 함유한 로션(비교예 1)을 도포하여 유발된 자극이 진정되는 정도를 상대평가 하였다. 먼저 하완의 안쪽 부위 두 곳에 일반 스카치 테잎으로 30회 테이핑을 하여 피부 홍반을 유발하였다. 홍반 유발된 후, 본 발명에 따른 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유한 로션(실시예 24 ~ 25)을 도포하였으며, 본 발명에 따른 일반 송악추출물을 함유한 로션(비교예 1)을 도포하였다. 도포 후 3시간 후 피부진정 정도를 평가하였다.

<피부자극정도(홍반) 평가>

0 (무반응) 1 (매우 경미한 홍반흔적) 2 (희미한 또는 가벼운 홍반)

3 (경계가 뚜렷하나 약한 홍반) 4 (뚜렷한 홍반) 5 (심한 홍반)

시료명	피부 자극 정도
시료명	좌	우
실시예 24	1	0
실시예 25	0	0
비교예 1	2	1
대조예	2	2

상기 표 13에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유한 실시예 24 내지 25의 로션 조성물은 상기 추출물을 함유하지 않은 대조예와 일반 송악추출물을 함유한 비교예 1에 비해 피부자극완화 효과가 우수하였다. 그 중에서도 실시예 25의 로션 제형에서 가장 우수한 피부 자극 완화 효과를 나타내었다.

시험예 8 : 제형의 안정성 실험

상기 본 발명의 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다. 화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 24 내지 25, 비교예 1 및 대조예 1을 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리정도를 비교 측정하여 그 결과를 하기 표 14에 기재하였다. 이 때 제품 변색 및 변취, 분리정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

0:변화없음 1:극히 조금 분리(변색, 변취)

2:조금 분리(변색, 변취) 3:조금 심하게 분리(변색, 변취)

4:심하게 분리(변색, 변취) 5:극히 심하게 분리(변색, 변취)

구 분	제형의 안정성
	실시예 24		실시예 25		비교예 1		대조예 1
	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	0	0	2	0	0	0
변취	0	0	0	0	1	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0	0	0

상기 표 14로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 24 내지 25와 대조예 1에는 45℃와 4℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고, 효소 반응에 의한 송악추출물이 제형 내에서 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

실시예 26 : 유연 화장수

하기 표 15에 기재된 조성으로 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 유연 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
송악추출물(실시예 22)	0.5
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 27 : 영양 화장수(밀크로션)

하기 표 16에 기재된 조성으로 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 영양 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
송악추출물(실시예 22)	0.5
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 28 : 영양 크림

하기 표 17에 기재된 조성으로 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 영양 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
송악추출물(실시예 22)	0.5
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
스테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
정화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제,향,색소	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 29 : 맛사지 크림

하기 표 18에 기재된 조성으로 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
송악추출물(실시예 22)	0.5
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	0.5
유동파라핀	24.0
스쿠알란	3.0
밀납	2.1
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	2.4
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.3
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 30 :팩

하기 표 19에 기재된 조성으로 효소 반응에 의한 송악추출물을 함유하는 팩을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
송악추출물(실시예 22)	0.5
에틸알코올	3.0
EDTA-2Na	0.02
프로필렌 글리콜	5.1
글리세린	4.5
카보폴	1.0
폴리옥사이드	0.1
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100

Claims

건조된 송악을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 송악추출물 제조단계;
상기 송악추출물을 용매에 용해시키고 당 결합 분해효소를 첨가하는 효소첨가단계;
상기 효소가 첨가된 송악추출물을 교반하면서 반응pH 3.5 ~ 5.0, 반응온도 25 ~ 50℃ 및 반응시간 12 ~ 60시간의 조건하에서 효소반응을 진행하는 효소반응단계; 및
여과 후 효소를 실활시키고 감압농축하는 단계를 포함하는 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 당 결합 분해 효소로는 글루코시다제(glucosidase), 자일로시아다제(xylosidase), 아밀라아제(amylase), 셀룰라제(cellulose), 갈락토시다제(galactosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나아제(naringinase)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 것이 사용되는 것임을 특징으로 하는 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 당결합 분해 효소는 펙티나제(pectinase)인 것임을 특징으로 하는 효소반응에 의한 송악추출물의 제조방법.
건조된 송악을 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 송악추출물 제조단계;
상기 송악추출물을 물에 용해시키고 펙티나제(pectinase)를 첨가하는 효소첨가단계; 및
상기 효소가 첨가된 송악추출물을 교반하면서 반응pH 4.5, 반응온도 45℃ 및 반응시간 48시간의 조건 하에서 반응시키는 단계를 포함하는 송악추출물에 함유되는 헤데라게닌의 함량 증대 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 효소반응에 의한 송악추출물을 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량% 함유하는 염증 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 염증 완화 및 피부 진정용 화장료 조성물.