JP2002524403A

JP2002524403A - カロチノイド製剤

Info

Publication number: JP2002524403A
Application number: JP2000568463A
Authority: JP
Inventors: スーダン、エティエンヌ; ベザレル、リー; シックラー、ヘドヴァ; パルティエル、ジュディス; ベンーアモッツ、アミ; シャイシュ、アヴィヴ; ペリー、イノン
Original assignee: アイ・ビー・アールイスラエリバイオテクノロジーリサーチリミテッド
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-05
Publication date: 2002-08-06
Anticipated expiration: 2019-09-05
Also published as: AU5529199A; IL126076A; JP4050869B2; BR9913397B1; EP1107723A2; ATE254903T1; EP1107723B1; US6383474B1; BR9913397A; HK1040051A1; US20020131940A1; JP2008001721A; DE69913158T2; IL126076A0; WO2000013654A2; DE69913158D1; WO2000013654A3; US7482032B2

Abstract

(57)【要約】酸化およびＵＶ線への曝露の結果として生じる様々な種類の損傷の予防において組み合わせると有効な量でカロチノイドであるフィトエンおよびフィトフルエンを含有する組成物が提供される。この製剤は実質的に無色であり、局所性の化粧品または医薬品並びに食品における添加物として使用することができる。さらに、カロチノイド産生有機体から相当に大量のフィトエンおよびフィトフルエンを生産するための方法も同様に記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明はカロチノイド含有製剤に関する。本発明の製剤は、食品、化粧品や、
様々な医療用途等に使用することができる。本発明は更に、カロチノイドを製造
する方法に関する。

【０００２】背景技術カロチノイドは、微生物類、真菌類および植物によって産生される色素であり
、それらによって酸化防止剤および過度の放射線に対する保護剤として使用され
ている。食品、医薬品または化粧品において最も広く使用されているカロチノイ
ドは、β−カロチンおよびリコペンである。β−カロチンおよびリコペンは光線
および酸化に高感受性であるが、この特性はそれらの使用を相当大きく制限し、
それらを含有する製品の保管寿命を短縮する（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ，Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ（カロチノイド、化学および生物学），
Ｋｒｉｎｓｋｉ，Ｎ．Ｉ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ−Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ｍ．，Ｔａｙｌ
ｏｒ，Ｒ．Ｆ．，（Ｅｄｓ），ＰｌａｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，
Ｌｏｎｄｏｎ，１９８９を参照）。さらに、β−カロチンおよびリコペンは独特
のオレンジ色を有しており、この色は様々な化粧品または食品における用途を重
大に制限する。

【０００３】フィトエン（７、８、１１、１２、７’、８’、１１’ 、１２’−オクタヒ
ドロ−γ、γ−カロチン）およびフィトフルエン（１５Ｚ、７、８、１１、１２
、７’、８’−ヘキサヒドロ−γ、γ−カロチン）は、β−カロチン、リコペン
およびその他のカロチノイド類の産生を導く生合成経路における前駆物質である
カロチノイド（Ｃ−４０イソプレノイド鎖）である（フィトエンは第１カロチノ
イド特異的前駆物質であり、フィトフルエンはそれからその後の不飽和化ステッ
プで産生される）。フィトエンは完全に無色であるが、他方フィトフルエンはか
すかに黄色がかった色を呈する。一定のトランスフェクト癌細胞内へフィトエン
の発現をもたらすＤＮＡ配列を導入することを開示した日本国特許出願第９０−
４０５２０号は、癌細胞の増殖の阻害およびエプスタイン・バー・ウイルス（Ｅ
ＢＶ）の活性化の阻害を生じさせた。

【０００４】発明の開示本発明に従うと、フィトエンおよびフィトフルエンが抗酸化特性を有しており
、さらにその上にＵＶ（紫外）線を吸収する能力があることが証明された。さら
に、これらの特性を有しているにもかかわらず、フィトエンおよびフィトフルエ
ンは、例えばβ−カロチンに比較して、酸化に対してはるかに安定性であること
が発見された。これらの発見は、フィトエンおよびフィトフルエンを組み合わせ
ると環境的に誘発される様々な種類の損傷の予防に有益であろうという認識を導
いた。

【０００５】そこで、本発明に従うと、酸化およびＵＶ線への曝露の結果として生じる損傷
の予防において組み合わせると有効な、ある量のフィトエンおよびある量のフィ
トフルエンを含有する組成物が提供される。

【０００６】本発明に従うと、用語「損傷」は、例えば酸素自体、ヒドロキシル基、過酸化
水素、その他の遊離基、オゾン等のような様々な酸化剤、または例えばＵＶＡお
よびＵＶＢ照射のようないずれかの種類の有害なＵＶ照射の結果として生じる何
らかの損傷であると理解しなければならない。損傷は製剤が使用される標的に左
右されるであろう。従って、製剤が皮膚上で使用される場合は、損傷は熱傷、水
疱、例えば皮膚の早期老化のような日光への慢性的曝露後に出現する損傷等のよ
うな何らかの皮膚損傷の可能性がある。製剤が食品防腐剤として使用される場合
は、損傷は製品安定性の低下、例えば酸敗化、促進老化等を生じさせる化学的変
化の形である可能性がある。

【０００７】発明を実施するための最良の形態本発明のある好ましい実施形態に従うと、フィトエンおよびフィトフルエンを
、組み合わせるとこれらのカロチノイドが皮膚に酸化保護作用およびＵＶ保護作
用を発揮するような有効量で含有する、環境危険から皮膚を保護するための局所
性皮膚用組成物が提供される。

【０００８】用語「環境危険」は、例えばＵＶ照射または酸化剤のような損傷を与える可能
性のある何らかの環境要因に関連する。

【０００９】用語「有効量」は、組み合わせて投与されたときに望ましい保護作用を達成す
る、ある量のフィトエンおよびある量のフィトフルエンを意味すると理解されな
ければならない。

【００１０】本発明の組成物中のフィトエンおよびフィトフルエンは、各々がそれらのｔｒ
ａｎｓ形またはそれらのｃｉｓ形のいずれであってもよい。

【００１１】本発明の組成物中のフィトエンおよびフィトフルエンの重量比は、各々約２０
０：１〜約１：２００の範囲内、典型的には約５０：１〜約１：５０であってよ
いが、約１０：１（フィトエン：フィトフルエン）が特定実施例である。フィト
エン対フィトフルエンの上記の比率は、望ましい比率で両方のカロチノイドを含
有する抽出物を使用すること、望ましい比率が入手されるように両方のカロチノ
イドを含有する抽出物に追加量の一方のカロチノイドを添加すること、またはそ
れらの間で望ましい比率を達成するために両方の個別カロチノイド（各々は上記
で言及されたまたは上記および下記で説明される方法のいずれかによって入手さ
れる）を混合することのいずれによって達成されてもよい。

【００１２】本発明の組成物の１つの新規の特徴は、上記の特性を有していながら、フィト
エンおよびフィトフルエンの組み合わせには本質的に全く色がない（フィトフル
エンがほとんど目には見えないほんの僅かに黄色がかっていることを除いて）点
である。この組成物が本質的に無色であるという事実は、これらのカロチノイド
がそれらを含有する製剤の審美的特性に何の影響も及ぼさないことを保障する。
さらに、可視範囲内における光線の吸光度が存在しない（これはそれらが本質的
に無色であるという事実の現れである）ことは、それらを可視光線下での劣化に
対して安定性にさせる。

【００１３】上記の好ましい実施形態に従うと、本製剤は例えばＵＶ（ＵＶＡおよび／また
はＵＶＢ）照射または様々な酸化剤によって影響を受ける可能性がある損傷を含
む上記のような環境危険から皮膚を保護するための局所性化粧品または医薬品と
して使用することができる。本発明の局所性組成物はゲル、Ｏ／Ｗ（水中油）型
またはＷ／Ｏ（油中水）型エマルジョン、軟膏剤等の形状であってよい。

【００１４】別の実施形態に従うと、本組成物は、例えば油もしくは脂肪のような様々な食
品成分の酸化を保護するための防腐剤として役立たせるための食品添加物として
使用することができる。

【００１５】ときには、本発明の組成物は組成物の基本的特徴を実質的に変更させない追加
の成分を含むことができる。そうした成分の１つの例はゼータカロチン（７、８
、７’、８’−テトラヒドロ−γ、γ−カロチン）である。

【００１６】本発明の組成物は明らかにその用途に依存して、さらにその他の成分、化粧品
学的または製薬学的に容認可能な基材、防腐剤、その他の抗酸化剤、例えば局所
性に作用する薬物のような様々な製薬学的または化粧品学的有効成分等を含むこ
とができる。

【００１７】ある好ましい実施形態に従うと、本組成物はさらに例えば植物油、鉱油もしく
は合成油のような化粧品、医薬品または食品産業において典型的に使用される油
類から選択することのできる疎水性基材を含有する。

【００１８】フィトエンおよびフィトフルエンは様々な起源から入手することができる。典
型的には、それらは例えば様々な植物、様々な藻類、および特に特異的例である
微小藻類のＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．のようなカロチノイドを産生する有機
体から入手することができる。極めて少量のフィトエンおよびフィトフルエンは
β−カロチノイド産生有機体によって産生されてきた。たとえそうした少量であ
ってもカロチノイドを入手するためには、有機体は薄暗い条件下で成長させられ
た。本発明に従うと、そうしたカロチノイド産生有機体から相当に大量のフィト
エンまたはフィトフルエンの少なくとも一方を生産することを可能にする方法が
提供される。用語「相当に大量」は、カロチノイド産生有機体に関連する。用語
「相当に大量」は、約０．１ｍｇ／ｌ（培地）〜約３０ｍｇ／ｌ（培地）、典型
的には約１ｍｇ／ｌ〜約２０ｍｇ／ｌの範囲内のフィトエンの量またはフィトフ
ルエンの量に関する。カロチノイド産生有機体が藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓ
ｐ．である場合は、産生させることのできるフィトエンおよびフィトフルエンの
典型的な量は約１ｍｇ／ｌ〜約１５ｍｇ／ｌである。本発明の方法に従うと、典
型的には藻類であるカロチノイド産生有機体を種々様々な条件下で成長させるこ
とができる。

【００１９】本発明のこの態様の１つの実施形態に従うと、カロチノイド産生有機体は、例
えばＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．の場合には、屋外において約１０℃〜約４０
℃の温度の海水および再生海水を含有する成長培地を含む屋外プール中で成長さ
せられる。有機体は８０％遮光から完全直射日光までの程度の直射日光下で成長
させることができる。ある好ましい実施形態によると、カロチノイド産生有機体
は約４０％遮光から完全直射日光までの範囲内の明るい光線下で成長させられる
。

【００２０】また別の実施形態によると、カロチノイド産生有機体は成長培地中で、典型的
には発酵槽内および典型的には室温で成長させられるが、この場合には成長培地
は典型的には種々の組み合わせで様々な塩およびミネラルを含有するであろう（
例えば下記の実施例１．１を参照）。この実施形態に従うと、有機体は約１０Ｗ
／ｍ²より上方および約１０Ｗ／ｍ²〜約２００Ｗ／ｍ²の範囲内の広帯域光線（
可視光線の実質的な部分全体に及ぶ光線）下で成長させられる。

【００２１】本発明の方法に従うと、相当に大量のフィトエンおよび／またはフィトフルエ
ンは典型的には数日間（例、約４〜６日間）に渡る有機体の成長後に産生される
。

【００２２】フィトエンおよびフィトフルエンは、典型的にはカロチノイド産生の生化学経
路におけるその後の反応ステップで作用できる阻害剤であるカロチノイド生合成
阻害剤の存在下でβ−カロチン産生有機体を成長させることによって、有機体の
細胞内におけるフィトエンおよびフィトフルエンの蓄積に好都合な条件下で入手
される。１つの例として「４−クロロインヒビター」がある。フィトエンおよび
フィトフルエンの起源が微小藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａである場合、４−クロロ
インヒビターは典型的には約０．１μＭの濃度で成長培地内に含まれる（Ｂｅｎ
−Ａｍｏｔｚｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８６：１２８６，
１９８８）。使用できるその他の阻害剤は、例えばＪ３３４（Ｂｅｎ−Ａｍｏｔ
ｚｅｔａｌ．上記参照）、ＳａｎｄｏｚＨ６７０６（Ｋuｅｍｍｅｌ，
Ｈ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ３０ｃ，３３３，１９７
５）、ジ−フェニル−アミン（ＤＰＡ）（ＦｏｐｐｅｎＦ．Ｈ．，Ａｎｎ．Ｉ
ｓｔ．Ｓｕｐｅｒ．Ｓａｎｉｔａ，４３９，１９６９）およびニコチン（Ｓｈａ
ｉｓｈｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏ３１：６８
９，（１９９０））である。

【００２３】従って本発明のこの態様の１つの実施形態に従うと、フィトエンまたはフィト
フルエンの少なくとも一方を含む組成物を調製するための下記のステップを含む
方法が提供される：（ｉ）１種以上のカロチノイド合成阻害剤の存在下で、約１０Ｗ／ｍ²より
上方の強度を有する広帯域光線下の成長培地中においてカロチノイド産生有機体
をインキュベートするステップ；（ｉｉ）フィトエンまたはフィトフルエンの少なくとも一方の濃度が約１ｍ
ｇ／ｌ（培地）〜約５０ｍｇ／ｌ（培地）になるまで前記カロチノイド産生有機
体を成長させるステップ；および（ｉｉｉ）前記有機体を培地から分離させるステップ。

【００２４】本発明のこの態様のまた別の実施形態に従うと、フィトエンまたはフィトフル
エンの少なくとも一方を含む組成物を調製するための下記のステップを含む方法
が提供される：（ｉ）１種以上のカロチノイド合成阻害剤の存在下で、約８０％遮光から全
直射日光の程度の直射日光下の成長培地中においてカロチノイド産生有機体をイ
ンキュベートするステップ；（ｉｉ）フィトエンまたはフィトフルエンの少なくとも一方の濃度が約１ｍ
ｇ／ｌ（培地）〜約５０ｍｇ／ｌ（培地）になるまで前記カロチノイド産生有機
体を成長させるステップ；および（ｉｉｉ）前記有機体を培地から分離させるステップ。

【００２５】本発明のこの態様に従うと、成長した有機体中で入手されるフィトエンおよび
フィトフルエンは産生有機体の乾物から分離せずに使用することができる。しか
し、ある好ましい実施形態に従うと、カロチノイド産生有機体の培地からの分離
に引続いて、本製剤はさらにフィトエン、フィトフルエンまたは両方から調製さ
れる。典型的には、本製剤は例えばエタノール：ヘキサン抽出法のような技術に
おいて知られているいずれかの抽出方法によってカロチノイド産生有機体から調
製できる抽出物である。

【００２６】本発明の方法に従うと、典型的にはフィトエンおよびフィトフルエンの両方が
カロチノイド産生有機体から入手され、フィトエン対フィトフルエンの比率はそ
の有機体がその下で成長させられる条件、および製剤が調製されるときには製剤
を入手するために使用される方法のタイプに従って変動する可能性がある。しか
し時には、一定の条件下で、本発明の方法に従ってカロチノイド産生有機体を成
長させるステップがこれら２種のカロチノイドのほとんど１種または１種のみを
入手することとを生じさせる場合がある。

【００２７】本発明に従うと、さらにカロチノイドの比率がカロチノイド抽出中に活性炭を
添加することによってフィトエンおよびフィトフルエンに好都合に増強される可
能性があることが発見された。活性炭は阻害剤が使用されるとき並びにカロチノ
イド産生有機体が阻害剤なしで成長させられるときに添加することができる。活
性炭は後になっていずれかの知られている遠心分離法または濾過法を使用して培
地または製剤から濾して除去される。

【００２８】上記に加えて、本発明に従うと本発明の組成物中のカロチノイドはさらにまた
いずれかの知られている化学的もしくは生化学的方法または組換え法によって合
成することもできる。化学的には、例えばフィトエンはフィトエンシンターゼに
よって媒介される反応において２種のゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ−２０）
から合成することができる。ゲラニルゲラニルピロリン酸は、メバロン酸の変換
またはピルビン酸塩とグリセルアルデヒド−３−リン酸の縮合によって直接に入
手することができる。フィトフルエンはフィトエンデサチュラーゼによって媒介
される反応であるフィトエンの不飽和化によって合成することができる。組換え
法には、例えばフィトフルエンに向かって活性である酵素の突然変異が含まれる
。そうした合成フィトエンおよびフィトフルエンは、上記で説明されたようなカ
ロチノイドを産生する有機体から入手されたフィトエンおよびフィトフルエンの
活性と実質的に類似である活性を有するであろう。

【００２９】本発明の組成物中のカロチノイドの安定性は、カロチノイド組成物に光線を照
射することおよび／または組成物を酸化剤に曝露させることによって試験するこ
とができる。そうした処置が本発明の組成物中のカロチノイドに及ぼす作用は、
例えばβ−カロチンのような他のカロチノイドへそうした処置が及ぼす作用より
小さい。有効量のカロチノイドを含有する先行技術組成物においては、そうした
処置は典型的には例えば吸光度の変化、すなわち色によって発現するカロチノイ
ドの劣化を生じさせる。本発明の組成物の抗酸化作用は、例えばＤＮＡへの抗酸
化保護作用を測定することによって測定することができる（Ｓａｌｌｅｓｅｔ
ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：３７，１９９５）。

【００３０】今度は比限定的な特定実施例についての下記の説明で本発明をさらに具体的に
説明する。

【００３１】実施例Ｉ．材料および方法１．成長培地下記の成長培地が使用された：１．１下記を含有する成長培地：ＭｇＳＯ₄、５ｍＭ；ＣａＣｌ₂、０．２ｍＭ；ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２ｍＭ；Ｆｅ
Ｃｌ₃＋Ｎａ₂ＥＤＴＡ、２μＭ＋５μＭ；ＭｎＣｌ₂、７μＭ；ＣｕＣｌ₂、１μ
Ｍ；ＺｎＣｌ₂、１μＭ；ＣｏＣｌ₂、１μＭ；（ＮＨ₄）₆ＭＯ₇Ｏ₂₄、１μＭ；
ＮａＣｌ、１Ｍ；ＮａＨＣＯ₃、５０ｍＭ；ＫＣｌ、５ｍＭ．この成長培地は、典型的には人工条件下の屋内でカロチノイド産生有機体を成
長させるために使用される。１．２２Ｍの塩分濃度を生じさせる量で海水および再生海水を含有する成長
培地。そうした培地は、典型的には屋外の直射日光下でカロチノイド産生有機体
を成長させるときに使用される。成長培地の最終ｐＨは７．０〜８．０である。

【００３２】２．化学薬品 β−カロチン生合成阻害剤４−クロロ−５（メチルアミノ）−２−（３−トリ
フルオロメチル）フェニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン。４−クロロインヒビ
ターは、フィトエンおよびフィトフルエン産生のために使用された。４−クロロ
インヒビターの濃度範囲は約０．０７μＭ〜約０．５μＭであった。未処理活性炭は他のカロチノイドに対するフィトエンおよびフィトフルエンの
比率を増加させるために使用された。活性炭は抽出物調製の最終ステップで抽出
物から濾して除去された。様々な市販で使用される油がフィトエンおよびフィトフルエンを溶解させるた
めに使用された。

【００３３】３．Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．の成長藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．は下記のうちの１つの条件下で成長させら
れた：３．１薄暗い光線（約１Ｗ／ｍ²）から明るい光線（約１０Ｗ／ｍ²より上）の
範囲内で変化させられた人工照明下で、典型的には１０Ｗ／ｍ²〜２００Ｗ／ｍ² の範囲内の１０Ｗ／ｍ²より上方の光線下で、室温の発酵槽内に入れられた上記
の１．１に記載された成長培地中において。３．２８０％遮光から完全直射日光まで、典型的には約４０％遮光から完全直
射日光までの範囲内の光線条件下で、約１０℃〜約４０℃の温度の屋外プールに
おいて。

【００３４】４．カロチノイド抽出法フィトエンおよびフィトフルエンは、０．０７μＭ〜１．０μＭの濃度の４−
クロロインヒビターによって藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．におけるβ−カ
ロチン合成の阻害によって産生させられた。藻類は上記の通りに屋外または屋内のいずれかでの藻類の４〜６日間の成長後
に収集され、細胞小球がエタノール：ヘキサン（１：２）ｖ／ｖを用いて抽出さ
れた。エタノールは少なくとも１：１０の藻類：エタノール比で細胞小球に最初
に添加された。この段階では、エステル結合の基礎加水分解は少なくとも３０分
間攪拌しながら０．５ＭＮａＯＨを添加することによって実施される。エタノ
ール：ヘキサン相分離は適切な量のＮａＣｌの添加によって達成される。ヘキサ
ンフラクションは分光光度法によって分析された。ヘキサンは真空下で乾燥させられ、カロチノイドはヘキサンまたは油中に再溶
解させられた。

【００３５】５．分光光度法による分析フィトエンおよびフィトフルエン抽出物の吸収スペクトルはＨｅｗｌｅｔｔＰ
ａｃｋａｒｄ社製８４５２Ａダイオード・アレー分光光度計を使用して測定され
た。

【００３６】６．ＵＶ線および種々のインキュベーション温度での好気性条件下におけるフィ
トエンおよびフィトフルエンの安定性様々な温度におけるカロチノイドの安全性は、４℃、２３℃、３０℃および６
０℃での種々のタイプの油および溶媒中におけるフィトエンおよびフィトフルエ
ンの長時間インキュベーションによって測定された。残ったフィトエンおよびフ
ィトフルエンの量は分光光度法によって測定された。フィトエンおよびフィトフ
ルエンの残留率は次のように計算された：｛処置後のフィトエンおよびフィトフルエン（ｍｇ／ｍｌ）／処置前のフィト
エンおよびフィトフルエン（ｍｇ／ｍｌ）｝^*１００＝ＰＨおよびＰＦの残留率
（％）３００／３１０μｗ／ｃｍ²でＵＶ線（２５４ｎｍ、３６５ｎｍ、２５４＋３
６５ｎｍ）に３０分間曝露させられた場合の安定性が測定された。

【００３７】７．可視光線における好気性条件下でのフィトエンおよびフィトフルエンの安定
性可視光線下のフィトエンおよびフィトフルエンの安定性は、「ホット・ミラー
（ｈｏｔｍｉｒｒｏｒ）」（ＡｎｄｏｖｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、
サーレム、ニューハンプシャー州、透過度４００〜６５０ｎｍ）フィルターを通
して濾過された直射日光（イスラエルのレホボトにおける盛夏の正午に）下で測
定された。サンプルはエタノール中に溶解させられ、日光に３０〜１５０分間曝
露させられ、その後基礎加水分解後にヘキサン中で抽出された（上記の抽出法の
通りに）。フィトエン、フィトフルエンおよびβ−カロチンの量は分光光度法に
よって測定され、残留百分率が上記の５．に記載された通りに計算された。

【００３８】８．抗遊離基活性８．ａヒドロキシル基のクエンチング化合物がヒドロキシル基（⁰ＯＨ）の活性をクエンチする能力は、電子常磁性
共鳴（ＥＰＲ）法によって化合物を用いた場合と用いない場合の信号強度を比較
することによって測定された。ヒドロキシル基は、鉄による過酸化水素の分解［
（ＦｅＳＯ₄）フェントン反応］によって生成された。⁰ＯＨは、ＤＭＰＯによっ
て捕獲されて、ＥＰＲにおいて特徴的な信号を発するＤＭＰＯ−ＯＨ付加物を生
成する。各々６．６６：１の比でフィトエンおよびフィトフルエンから構成され
る化合物は、３種の１／２０、１／５０および１／２００の最終希釈率でこの系
に添加された。 ⁰ＯＨの捕獲によってだけではなくＤＭＰＯ−ＯＨ付加物への添加によっても
様々な物質が信号を減少させる可能性があるので、フェントン反応後に生成物が
添加された（後添加）ときにも信号を評価する必要がある。ヒドロキシル基の捕
獲能力は理論的には生成物の前添加に対応するＥＰＲ信号の数値と後添加の結果
として生じる信号の数値の相違によって評価される。８．ｂ抗酸化作用によるＤＮＡ保護化合物の抗酸化作用によるＤＮＡ保護はＳａｌｌｅｓら（上記参照）の方法に
基づいて試験された。この試験では、反応性酸素種（ＲＯＳ）を生成する酸化Ｄ
ＮＡ損傷に対する化合物の保護作用が、プラスミドＤＮＡ標的を使用してＤＮＡ
の損傷形成の阻害を定量化することによって測定された。

【００３９】ＩＩ．結果実施例１フィトエンおよびフィトフルエンの産生フィトエンおよびフィトフルエンは、上記の通りに０．１〜０．５μｇのβ−
カロチン生合成４−クロロインヒビターの存在下で藻類Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．を成長させることによってこの藻類から生産された。その後、培地が抽出
され、抽出物は蒸発によって乾燥させられ、ヘキサンまたは油中に再溶解させら
れた。抽出されたカロチノイド中において４−クロロインヒビターの残留物は検
出されなかった。図１から明らかなように、フィトエンの主要吸光度ピーク値は２８６ｎｍ（Ｕ
ＶＢ）であることが発見され、さらに図２から明らかなように、フィトフルエン
の主要吸光度ピーク値は３４８ｎｍ（ＵＶＡ）であることが発見された。予想さ
れた通りに、β−カロチンの主要吸光度ピーク値は４５０ｎｍであった。β−カ
ロチンは合成阻害のために減少したが、他方フィトエンおよびフィトフルエンは
増加した。

【００４０】実施例２抽出されたフィトエンおよびフィトフルエンのＵＶ線下での安定性に
ついての実施例上記の実施例１で説明された通りに入手されたフィトエンおよびフィトフルエ
ンの安定性が分光測光分析法によって測定された。フィトエンおよびフィトフル
エンは、ヘキサンまたは油中に溶解させられた。製剤の吸光度は２２０〜６００
ｎｍで測定され、抽出物の照射後に測定されたカロチノイドの量を放射線曝露前
に抽出物中で測定された同一カロチノイドの量で割った百分率を決定するために
各サンプル中の上記のカロチノイド各々の量が計算される（上記の材料および方
法の５．を参照）。フィトエンおよびフィトフルエンの安定性は、ＵＶＡ線（３
６５ｎｍ）およびＵＶＢ線（２５４ｎｍ）の両方並びにＵＶＡおよびＵＶＢ照射
の組み合わせに抽出物を曝露させることによって測定された。下記の表１から明らかなように、油またはヘキサン中に溶解させたフィトエン
およびフィトフルエンはＵＶＡ、ＵＶＢまたはＵＶＡ＋Ｂ照射に曝露させた後に
極めて安定性であった。

【００４１】

【表１】

【００４２】ヘキサン中または他の種々の市販の油中における種々の温度条件（４℃、２３
℃、３０℃および６０℃）下でのフィトエンおよびフィトフルエンの安定性もま
た測定された。測定は４ヶ月間に渡って実行された。フィトエンおよびフィトフルエンは、カロチノイドが溶解させられた油の種類
から実質的な影響を受けることなく、測定された全温度範囲において安定性であ
ることが発見された。

【００４３】実施例３抽出されたフィトエンおよびフィトフルエンの可視光線下での安定性フィトエンおよびフィトフルエンの安定性が（材料および方法の項で説明され
た通りに）可視光線下でβ−カロチンの安定性と比較された。製剤の吸光度は２
２０〜６００ｎｍの波長で測定され、各サンプル中の上記のカロチノイド各々の
量が計算され、照射前の測定値に比較した抽出物の照射後に測定されたカロチノ
イドの百分率が測定される（上記の実施例２参照）。表２に示されているように、高強度の可視光線への曝露はフィトエンおよびフ
ィトフルエンと比較してβ−カロチンの統計的有意に高い劣化を惹起する。

【００４４】

【表２】

【００４５】実施例４抗遊離基活性４．ａヒドロキシル基のクエンチング：ヒドロキシル基のクエンチングは、材料および方法の項で説明された通りにＥ
ＰＲによって測定された。入手された結果（表３）は、生成物によるヒドロキシ
ル基の用量依存性の捕獲活性を示している。

【００４６】

【表３】

【００４７】生成物は、フィトエン０．０２ｍｇ／ｍｌおよびフィトフルエン０．００３ｍ
ｇ／ｍｌの初期濃度で、各々６．６６：１の比率のフィトエンおよびフィトフル
エンから構成された。各結果の平均値は３回の測定値から引き出されたものである。４．ｂ抗酸化作用：フィトエンおよびフィトフルエン抽出物の抗酸化作用によるＤＮＡ保護は、上
記の材料および方法の７．ｂで説明された通りにＳａｌｌｅｓ法（上記参照）に
基づいて測定された。下記の表４から明らかなように、上記の通りに入手されたフィトエンおよびフ
ィトフルエンはヒドロキシル基から保護することができた。

【００４８】

【表４】

【００４９】実施例５フィトエンおよびフィトフルエンによるＤＮＡへの保護作用遺伝毒性作用遺伝毒性はＤＮＡ修復合成活性の誘発として測定され、比率（Ｒ）によって表
される：このときＲ≦２は毒性作用がないことを意味する。Ｒ＝サンプルの相対光度単位／溶媒単独の相対光度単位下記の表５から明らかなように、フィトエンおよびフィトフルエンは遺伝毒性
ではない。パラメーターＲは統計的有意に２より小さく（保護作用）、さらに既知の遺伝
毒性化合物である陽性対照と比較してはるかに小さい。

【００５０】

【表５】

【００５１】実施例６下記は本発明に従って使用できる組成物の例である：Ａ−Ｏ／Ｗ型の乳化ゲル（局所性経路）： −Ｃａｒｂｏｐｏｌ９８１（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ社によって市販）０．６ｇ −エチルアルコール１５ｇ −揮発性シリコーン油３ｇ −パーセリン油７ｇ −防腐剤０．３ｇ −香料０．４ｇ −トリエタノールアミン０．２ｇ −フィトエン０．０１ｇ −フィトフルエン０．００１ｇ −脱塩水、十分量１００ｇ

【００５２】Ｂ−無水ゲル（局所性経路）： −プロピレングリコール２５ｇ −ヒドロキシエチルセルロース０．８ｇ −ポリエチレングリコール１２ｇ −フィトエン１ｇ −フィトフルエン１ｇ −無水エタノール、十分量１００ｇ

【００５３】Ｃ−Ｏ／Ｗ型エマルジョン（局所性経路）： −流動パラフィン６ｇ −流動ラノリン３ｇ −Ａｒｌａｃｅｌ１６５（Ａｔｌａｓ社によって市販）６ｇ −Ｔｗｅｅｎ６０（Ａｔｌａｓ社によって市販）２ｇ −セチルアルコール１．２ｇ −ステアリン酸２．５ｇ −揮発性シリコーン油１０ｇ −トリエタノールアミン０．１ｇ −防腐剤０．３ｇ −酸化防止剤０．３ｇ −フィトエン０．３ｇ −フィトフルエン０．２ｇ −脱塩水、十分量１００ｇ

【００５４】Ｄ−リポソーム含有クリーム剤（局所性経路）： −ひまわり油３５ｇ −セチルアルコール４ｇ −Ｂ−シトステロール４ｇ −リン酸ジセチル０．５ｇ −防腐剤０．３ｇ −香料０．６ｇ −Ｃａｒｂｏｐｏｌ９８１（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ社によって市販）０．２ｇ −トリエタノールアミン０．２ｇ −スフィンゴシン００５ｇ −フィトエン０．００００１ｇ −フィトフルエン０．０００００１ｇ −脱塩水、十分量１００ｇ

【００５５】Ｅ−経口用組成物： −タルク５ｇ −Ａｅｒｏｓｉｌ２００５ｇ −亜鉛のステアリン酸塩５ｇ −フィトエン０．０００００１５ｇ −フィトフルエン０．０００００１ｇ −ラクトース、十分量４００ｇ

【００５６】Ｆ−Ｗ／０型エマルジョン（局所性経路）： −Ｐｒｏｔｅｇｉｎ（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ社によって市販）１９ｇ −グリセリン３ｇ −ワセリン油８ｇ −フィトフルエン０．５ｇ −フィトエン０．５ｇ −マグネシウムの硫酸塩０．５ｇ −香料０．８ｇ −防腐剤０．２ｇ −水、十分量１００ｇ

【図面の簡単な説明】

【図１】４−クロロインヒビターを用いて成長させたＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．か
ら抽出されたフィトエンを含有する組成物のＵＶ吸光度スペクトルである。

【図２】４−クロロインヒビターを用いて成長させたＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．か
ら抽出されたフィトフルエンのＵＶ吸光度スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/16 Ａ６１Ｐ 17/16 ４Ｃ２０６ 39/06 39/06 Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｎ 1/12 ＡＣ１２Ｐ 5/00 Ｃ１２Ｐ 5/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｎ 1/12 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｒ 1:89）Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｐ 5/00 (Ｃ１２Ｐ 5/00 Ｃ１２Ｒ 1:89）Ｃ１２Ｒ 1:89）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シックラー、ヘドヴァイスラエル国、76804 マズケレトバティヤ、ハマゲンストリート 19 (72)発明者パルティエル、ジュディスイスラエル国、76000 レホボート、パーシャニストリート 12／26 (72)発明者ベンーアモッツ、アミイスラエル国、56542 サヴィオン、ハトマーストリート 21 (72)発明者シャイシュ、アヴィヴイスラエル国、79800 シクミン、アクヴァストリート 37 (72)発明者ペリー、イノンイスラエル国、62301 テルアヴィヴ、アプト 23，デレクナミール 85 Ｆターム(参考） 4B018 MA01 MD89 ME06 ME14 4B024 AA05 BA80 CA02 DA20 4B064 AB01 CA08 DA10 4B065 AA83X AB01 AC14 CA03 CA41 4C083 AA122 AC011 AC012 AC022 AC072 AC102 AC122 AC242 AC542 AC902 AD042 AD092 AD152 AD282 AD492 AD512 AD572 BB47 CC01 CC02 CC05 DD28 DD33 DD41 DD45 EE10 EE12 EE13 EE17 4C206 AA01 AA02 BA02 MA02 MA03 MA04 MA72 MA83 NA05 NA14 ZA89 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化またはＵＶ線への曝露の結果として生じる損傷の予防に
おいて組み合わせると有効な、ある量のフィトエンおよびある量のフィトフルエ
ンを含有する組成物。
【請求項２】環境危険から皮膚を保護するための局所性皮膚用製剤であり
、フィトエンおよびフィトフルエンを、組み合わせるとこれらのカロチノイドが
皮膚上に酸化保護作用およびＵＶ保護作用を発揮するような有効量で含有する請
求項１に記載の組成物。
【請求項３】化粧品または医薬品である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】食品添加物である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】本質的に無色である請求項１〜４のうちいずれか１項に記載
の組成物。
【請求項６】組成物中のフィトエンとフィトフルエンの重量比が、約２０
０：１〜約１：２００の範囲内にある、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載
の組成物。
【請求項７】組成物中のフィトエンとフィトフルエンの重量比が、約５０
：１〜約１：５０の範囲内にある請求項６に記載の組成物。
【請求項８】組成物中のフィトエンとフィトフルエンの重量比が、約１０
：１〜約１：１０の範囲内にある請求項７に記載の組成物。
【請求項９】疎水性基材を含有する請求項１〜８のうちいずれか１項に記
載の組成物。
【請求項１０】ゼータカロチンをさらに含有する請求項１〜９のうちいず
れか１項に記載の組成物。
【請求項１１】フィトエンとフィトフルエンのうち少なくとも一方を含む
組成物の製造方法であって、（ｉ）１種以上のカロチノイド合成阻害剤の存在下で、約１０Ｗ／ｍ²より高
い強度を有する広帯域光線下の成長培地中においてカロチノイド産生有機体をイ
ンキュベートするステップと、（ｉｉ）フィトエンまたはフィトフルエンの少なくとも一方の濃度が約１ｍｇ
／ｌ（培地）〜約５０ｍｇ／ｌ（培地）になるまで前記カロチノイド産生有機体
を成長させるステップと、（ｉｉｉ）前記有機体を培地から分離させるステップとを含む製造方法。
【請求項１２】前記光線が約２０Ｗ／ｍ²〜約２００Ｗ／ｍ²の範囲内の強
度を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】フィトエンとフィトフルエンのうち少なくとも一方を含む
組成物の製造方法であって、（ｉ）１種以上のカロチノイド合成阻害剤の存在下で、約８０％遮光から全
直射日光の程度の直射日光下の成長培地中においてカロチノイド産生有機体をイ
ンキュベートするステップと、（ｉｉ）フィトエンまたはフィトフルエンの少なくとも一方の濃度が約１ｍ
ｇ／ｌ（培地）〜約５０ｍｇ／ｌ（培地）になるまで前記カロチノイド産生有機
体を成長させるステップと、（ｉｉｉ）前記有機体を培地から分離させるステップとを含む製造方法。
【請求項１４】直射日光の程度が約８０％遮光から全直射日光である請求
項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記有機体が全直射日光下で成長させられる請求項１３に
記載の方法。
【請求項１６】（ｉｖ）前記分離された有機体からフィトエン、フィト
フルエンまたはその両方を含有する製剤を製造するステップを更に含む、請求項
１１〜１５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】前記製剤が抽出物である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記抽出物がエタノール：ヘキサン抽出物である請求項１
７に記載の方法。
【請求項１９】前記カロチノイド産生有機体が微小藻類である請求項１１
〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】前記微小藻類がＤｕｎａｌｉｅｌｌｅｓｐ．である請求
項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記カロチノイド合成阻害剤が４−クロロ−５（メチルア
ミノ）−２−（３‐（トリフルオロメチル）フェニル）−３（２Ｈ）−ピリダジ
ノンである請求項１１〜２０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】前記抽出物が極微量の前記阻害剤を含有していない請求項
１６〜２１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】前記カロチノイド製剤に活性炭を添加するステップを更に
含む、請求項１６〜２２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】前記フィトエンおよびフィトフルエンが、化学合成によっ
て調製される請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】前記フィトエンおよびフィトフルエンが組換え法によって
調製される請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の組成物。