KR20150132754A - 항산화 및 항균 효과를 가지는 초임계 함초 추출물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소와 보조용매를 사용하여 다단계 초임계 추출함으로써 함초로부터 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 고효율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

항산화 및 항균 효과를 가지는 초임계 함초 추출물의 제조 방법{A preparation method of an extract of Saliconia Herbacea L having antioxidant and antimicrobial activity}

본 발명은 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소와 보조용매를 사용하여 다단계 초임계 추출함으로써 함초로부터 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 고효율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

함초(Saliconia Herbacea L)는 우리나라의 울릉도와 중부지방, 남부서해안의 강하구언이나 갯벌 및 염전부근에서 자생하는 내염성 식물로서 해연자라고 불리기도 하는 명아주과의 1년생 초본으로 잎이 없는 식물이며 통통한 마디가 있기 때문에 퉁퉁마디라 부르며 민물과 바닷물이 교차하는 들녘에 자란다. 높이는 10-30cm 로 둥근 나무형이며 마주 달린 가시가 많이 있고 원줄기는 짙은 녹색에 두드러진 마디가 많이 있고 짠맛이 나며, 7-9월에 녹황색 꽃이 피고 10월에 납작하고 까만 열매가 맺히며 가을이 되면 함초 전체가 붉은 홍자색으로 변한다.

국립수산진흥원의 퉁퉁마디에 대한 부위별 성분분석에 따르면, 수분함량은 잎이 90.9%로 가장 높았고, 회분은 잎이 4.6%,줄기가 6.1%, 뿌리가 6.2%이다. 염분함량은 줄기에서 가장 높고 다음으로 잎, 뿌리의 순이다. 회분 중 염분의 함량은 잎에서 약 70%를 차지한다. 총당 및 환원당은 뿌리에서 각각 22.8% 및 13.4%로 가장 높고, 우론산 (uronic acid)의 함량은 시료 100g 당 잎이 0.31g, 줄기가 1.40g, 뿌리가 1.88g이다. 아미노산은 잎의 경우 글루타민산 (glutamic acid), 아스파르트산 (aspartic acid) 등이 많고, 줄기 및 뿌리에서 라이신(lysine), 글루타민산 등이 많다. 잎에는 티로신 (tyrosine)이 10.8mg/100g 함유되어 있고 줄기 및 뿌리에서는 검출되지 않으며, 타우린은 잎보다 줄기와 뿌리에서 3~5배 가량 많다. 프로린 (proline)은 잎 및 뿌리에서 총 아미노산 중 약 7%로 검출된다. 무기질은 나트륨이 1333.8mg/100g으로 가장 많이 함유되어 있다. 특히 퉁퉁마디에 칼륨이 많이 함유되어 있어 이뇨작용을 촉진시키며, 또 체내에서 저항력과 골격의 건강을 유지하는 칼슘도 많이 함유되어 있다. 부위별 무기질은 나트륨은 뿌리에서 가장 높고, 칼슘은 잎 (650.1mg/100g)에서 뿌리 (22.1mg/100g)의 약 20배 가량 많이 함유되어 있다. 마그네슘 (46.5mg/100g ~ 54.0mg/100g) 및 칼륨 (650.1 ~ 741.1mg/100g)은 부위에 따른 큰 차이가 없으며, 아연은 줄기에서 29.6mg/100g으로 가장 높다. 철은 잎에서 31.5mg/100g, 줄기에서 66.2mg/100g, 뿌리에서 84.8mg/100g으로 나타나며, 이외에도 구리, 니켈, 망간 등이 미량 함유되어 있다.

화학적으로 자유라디칼 (free radical)이란 1개 또는 그 이상의 짝짓지 않은 전자를 가진 독립적으로 존재하는 화학종을 말한다. 보통의 분자에서는 스핀의 방향이 반대인 2개의 전자들이 하나의 전자쌍을 만들어 안정한 상태로 존재하나, 자유라디칼은 짝을 짓지 않은 활성 전자를 가지고 있기 때문에 일반적으로 불안정하고 이로 인해, 매우 큰 반응성을 가지며 수명이 짧다.

생체내에서 활성산소의 생성은 다양한 경로를 거쳐서 생성된다. 정상적인 대사과정에 있어서도 호흡한 산소의 2%가 슈퍼옥사이드 라디칼로 전환되는 것으로 알려져 있다. 자외선에 노출 후, 피부 세포 및 조직 손상에 대한 자유라디칼의 원인설은 자외선의 피부 작용에 대한 일관된 손상 기전을 제시하고 있으며, 주요한 생리적 설명은 다음과 같다. (1) 자유라디칼은 피부에 대한 자외선 작용으로 생성된다. 피부에는 자유라디칼을 파기하는 항산화 방어계가 있다. 그러나 이러한 방어계는 자외선량이 많으면 한계에 도달되고 세포 및 조직의 산화가 유발된다. 결과적으로 단백질, 지질, DNA와 같은 주요 세포 성분들은 자유라디칼에 의한 손상을 받게되어, 세포 기능이 변질되고 궁극적으로는 피부노화가 촉진되어 피부 손상 및 질환이 유발되게 된다.

피부에서 자유라디칼에 의해서 유발되는 주름의 생성 원인은 대표적인 세 가지를 들 수 있다. 첫째, 자외선에 의한 피부 항산화제의 파괴를 들 수 있으며, 둘째, 지질 산화, 단백질 산화, 그리고 DNA 산화와 같은 세포 구성 성분의 산화 마지막으로 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (matrix metalloproteinase) 과발현, 콜라겐 사슬의 절단과 비정상적인 교차결합, 히아루론산 (hyaluronic acid) 사슬의 절단 등으로 나타나는 결합조직의 손상이다. 과도한 자외선 노출에 의해 생성된 자유라디칼은 주름 형성을 촉진할 수 있는 다양한 생리적 손상을 유발시킬 뿐아니라, 피부에 존재하는 색소세포를 자극하여 멜라닌 (melanin) 색소의 생성을 가속화시켜 피부를 어둡게 만든다고 알려져 있다. 또한 그 정도와 위치에 따라 심각한 염증 및 피부 면역의 손상을 유발할 수도 있다.

유해산소(toxic oxygen species)라고도 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 호흡 등과 같은 생리작용에 의해 세포에서 생성되는 독성물질로 끊임없이 생산되고 소멸하며, 정상적인 상태에서는 3~5%정도로 존재한다. 이런 활성산소종은 수퍼옥시드 라디칼(Superoxide radical, O^{2 -}), 하이드록시라디칼(hydroxyl radical, HO⁺)과 같은 자유라디칼(free radical : 화학적으로 최외각 전자궤도에 쌍을 이루고 있지 않은 원자나 분자로 매우 불안정하여 높은 반응성을 가짐)의 형태로 존재하거나 혹은 과산화수소(hydorgen peroxide, H₂O₂)나 일중항산소(Singlet radical, ¹O₂)와 같이 쌍을 이룬 전자를 가진 화합물의 형태로 존재한다. 활성산소는 생리계 내에서 세균을 살균하는 생체 방어 작용을 하는 장점도 있지만, 일반적으로 생체 내에서 산화를 일으켜 질병의 원인이 되는 유해한 작용을 한다. 이 활성산소는 생물분자를 공격하여 세포나 조직에 피해를 주며, 노화나 각종 성인병질환에 관여하는 여러 종류의 질병을 야기한다는 보고도 있다. 이러한 활성산소에 의한 산화작용을 억제 할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 미용업계에서도 활발하게 진행되고 있으며, 항산화력이 강력한 천연물이나 물질들의 연구개발은 노화예방 물질로서 각광받고 있다.

자연환경에서 자라는 천연의 식물 소재들은 다양한 생리활성 성분과 우수한 항산화능을 보유하고 있으며, 이러한 생리활성을 바탕으로 식품, 화장품, 그리고 의약품에 널리 사용되고 있다. 그러나, 천연식물들의 생리활성과 항산화능은 유용성분을 추출하는 방법에 따라 크게 그 정도가 좌우되며 이에 따라 생체에 친화적이고 우수한 생리활성성분을 추출하는 데 있어 최적의 방법을 설정하는 것이 중요하게 여겨지고 있다.

추출은 대부분 열수추출법이나 용매추출법을 통해 수행되어 왔다. 이와 같이 이루어진 종래 추출 후, 열에 민감한 성분의 손실이 야기되고, 복잡한 정제과정을 거치며 이로 인한 유기용매의 잔존, 용매의 제거 및 오일성분의 낮은 분리효과 등의 문제점들이 있다. 그 외 유효성분 추출에 초임계 유체 추출(supercritical fluid extraction) 공정이 사용되고 있다. 이는 물질의 임계점 이상 압력과 온도를 설정하여 액체상의 용해력과 기체상의 확산계수와 점도 특성을 지니게 하여, 신속하면서 선택적 추출이 가능한 방법이다. 특히 초임계유체 추출에 사용되는 용매인 이산화탄소는 비용이 저렴하며, 무독성이고 불연성 등의 특성이 있어 친환경적 추출용매로 적용가능성이 제시되고 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 함초 추출물이 다양한 생리활성 및 효과 등을 고려하였을 때 그 이용가치가 충분한 것으로 여겨 함초 건조 분쇄물을 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 다단계 초임계 추출한 후 상기 함초 추출물을 in vitro 피부생물학적 평가시스템을 기반으로 인간피부세포 in vitro 안전성, DPPH 항산화능, 그리고 아토피 피부염 악화 미생물에 대한 항균능을 평가한 결과 함초로부터 특히 항산화 활성 및 항균 활성이 뛰어난 추출물을 고효율로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 초임계 유체와 보조용매를 사용하여 다단계 초임계 추출을 이용하여 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법을 제공한다.

1) 함초 건조 분쇄물을 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 탈지시키는 단계(단계 1);

2) 상기 1차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 잔류 유지성분 및 불순물을 제거하는 단계(단계 2); 및

3) 상기 2차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 2차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 회수하는 단계(단계 3).

바람직하기로, 본 발명의 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법은 상기 단계 1 이전에 하기 단계 a 내지 단계 b를 추가로 포함할 수 있다:

a) 함초를 건조하는 단계(단계 a); 및

b) 상기 함초 건조물을 분쇄하는 단계(단계 b);

바람직하기로, 본 발명의 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법은 상기 단계 3 이후에 상기 단계 3에서 얻은 함초 추출물을 농축하는 단계(단계 4)를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하기로, 본 발명의 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법은 상기 단계 4 이후에 상기 단계 4에서 얻은 함초 추출물 농축액을 여과하여 상층액을 회수하는 단계(단계 5)를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 상기 초임계 추출은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction, SFE)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다.

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체의 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 원료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질인 유지성분과 그 외 다양한 물질들이 초임계 이산화탄소에 의해 추출되어 나온다. 특히 원료로부터 유지성분이 추출되어 제거되는 것을 탈지라 한다.

유지성분을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 원료(탈지된 원료)에 다시 소량의 보조용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 특히 본 발명은 상기와 같은 방법을 통해, 활성이 다소 떨어지는 유지성분과 기타 불순물을 먼저 분리하고, 탈지된 원료로부터 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않는 활성물질을 고순도로 얻을 수 있다는 특징이 있다.

상기 단계 a는, 함초를 건조하는 단계로서, 함초의 추출 효율을 증가시키기 위한 전처리 단계이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "함초(Saliconia Herbacea L)"는 명아주과의 1년생 초본으로 퉁퉁마디라고도 하는 식물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 함초는 이의 다양한 기관 또는 부분(예를 들어 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)을 의미하고, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리를 의미하고, 가장 바람직하게는 줄기를 의미한다.

본 발명에서, 상기 단계 a는 열풍 건조로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 열풍 건조는 열풍을 이용하여 건조하는 방식을 의미하며, 바람직하기로 40℃ 내지 70℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 열풍 건조는 수일 동안, 바람직하기로 1 내지 3일 동안 수행될 수 있으며, 이는 함초의 수분 함량에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 단계 b는, 상기 함초 건조물을 분쇄하는 단계로서, 함초 건조물을 일정 크기로 분쇄시켜 함초의 추출 효율을 증가시키기 위한 전처리 단계이다.

본 발명에서, 상기 함초 건조물은 0.5 mm 내지 2 mm의 입자크기로 분쇄하는 것이 바람직하다. 만일 상기 분쇄 시 입자 크기가 상기 범위 밖일 경우, 함초의 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다. 특히, 0.5 mm 미만의 입자 크기에서는 초임계 추출 시 압력 부하로 인하여 추출 효율이 떨어지게 되고 2 mm 보다 큰 입자 크기에서는 입자 속에 포함되어 있는 유효물질이 초임계 유체에 의해 외부로 추출되기 어려워 결과적으로 유효물질의 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명에서, 상기 분쇄는 핀형 분쇄기를 사용하여 수행할 수 있다.

상기 단계 1은, 함초 건조 분쇄물을 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 탈지시키는 단계로서, 비교적 저압의 압력조건 하에서 함초 건조 분쇄물에 함유된 항산화 및 항균 성분을 제외한 유지성분을 주로 추출하여 회수하는 단계이다.

상기 유지성분은 대표적으로 함초에 포함된 지질 및 지방과 같은 지용성 물질을 의미한다. 이들은 본 발명이 목적하는 항산화 및 항균 활성을 갖는 유효성분의 함량이 낮고, 항산화 및 항균 활성을 저해하는 요인으로 작용할 수 있다. 본 발명에서는 이들을 탈지하여 제거하는 단계로서 1차 초임계 추출을 수행함으로써, 유지성분을 효율적으로 추출하여 제거할 수 있다.

상기 단계 1의 조건 하에서 상기 유지성분들은 항산화 및 항균 성분에 비해 상대적으로 많은 양으로 추출될 수 있다. 이를 통하여 향후 단계 3에서 항산화 및 항균 활성 효과가 높은 성분을 효율적으로 얻을 수 있다. 단계 1에서 추출된 유지성분을 포함하는 추출물은 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 1은 바람직하기로 10분 내지 1시간, 더욱 바람직하기로 20분 내지 40분, 가장 바람직하기로 약 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 1은 50℃의 온도에서 압력을 150bar로 설정하여 초임계 이산화탄소만을 사용하여 30분간 실시하였다.

상기 단계 2는, 상기 1차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 잔류 유지성분 및 불순물을 제거하는 단계로서, 상기 단계 1과 마찬가지로 함초에 잔류하는 항산화 및 항균 성분을 제외한 불순물을 추출하여 회수하는 단계이다. 나아가 상기 단계 2는, 유효 활성성분 추출을 위한 최종적 단계(단계 3)의 목적 압력과 온도에 다다르도록 설정하는 중간 단계의 의미를 갖는다.

상기 불순물은 본 발명에서 목적하는 항산화 및 항균 성분을 제외한 항산화 및 항균 활성을 저해하는 각종 물질로서, 대표적으로 전술한 유지성분이 포함될 수 있다. 상기 단계 1에서 유지 성분을 주로 제거한 다음 단계 2에서 잔류 유지 성분을 포함하는 항산화 및 항균 활성을 저해할 수 있는 성분들, 즉 불순물을 제거시킬 수 있다.

구체적으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1에 이어지면서 단계 1과 단계 3의 중간 단계로서의 역할을 하며, 단계 1의 추출 압력에서부터 비교적 고압의 압력조건인 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 서서히 증가시키면서 진행될 수 있다. 또한 단계 2의 진행 동안 공급되는 초임계 이산화탄소에 보조용매를 추가로 투입하여 공급시킬 수 있다. 이를 통하여 원료에 잔류하는 유지성분 및 불순물을 상당히 제거할 수 있으며, 나아가 이어지는 단계 3에서 고순도의 항산화 및 항균 성분을 고효율로 추출할 수 있게 할 수 있다.

상기 단계 2의 온도는 상기 단계 1에서의 온도와 동일할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 35℃ 내지 60℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있다.

본 발명에서, 단계 2에서의 가압 속도는 바람직하기로 2 bar/min 내지 25 bar/min일 수 있다.

상기 단계 1과 마찬가지로, 단계 2에서 추출된 불순물을 포함하는 추출물을 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 2는 바람직하기로 10분 내지 1시간, 더욱 바람직하기로 20분 내지 40분, 가장 바람직하기로 약 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 2는 보조용매로서 에탄올(Ethanol)을 첨가하면서 수행될 수 있다. 이때 초임계 추출 장치에 있어서, 온도는 50℃로 유지하고 압력은 150bar로부터 400bar까지 서서히 증가시키면서 보조용매인 에탄올을 초임계 이산화탄소와 함께 추출조로 흘려 보내 30분 동안 수행하였다. 이때 보조용매로 사용한 에탄올은 초임계 추출 장치의 관벽에 남아있는 잔류 오일(유지성분)까지 제거할 수 있는 효과가 있다.

상기 단계 3은, 상기 2차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 2차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 회수하는 단계로서, 상기 단계 1 및 단계 2를 통하여 항산화 및 항균 활성을 저해하는 불순물이 상당량 제거된 함초 건조 분쇄물에서 항산화 및 항균 활성 성분을 고순도 및 고효율로 추출하는 단계이다.

바람직하기로, 상기 단계 3은 바람직하기로 30분 내지 5시간, 더욱 바람직하기로 60분 내지 3시간, 가장 바람직하기로 약 120분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 3은 보조용매로서 에탄올(Ethanol)을 첨가하면서 수행될 수 있다. 이때 초임계 추출 장치에 있어서, 온도는 50℃로 유지하고 압력은 400bar로 유지하면서 보조용매인 에탄올을 초임계 이산화탄소와 함께 추출조로 흘려 보내 120분 동안 수행하였다.

바람직하기로, 상기 단계 1 내지 단계 3의 초임계 이산화탄소는 5 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급될 수 있고, 추출시간 대비 보다 많은 양의 추출물을 얻기 위하여 30 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급됨이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 체적유량은 이산화탄소 봄베이에서 나온 액화 이산화탄소가 초임계 고압펌프 전단계까지의 압력과 온도 상태에서 이산화탄소가 갖는 체적을 기준으로, 단위시간당 추출조 내로 들어가는 체적을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "보조용매"는 초임계 이산화탄소와 함께 사용되는 유기용매를 의미하며, 이들의 복합으로 유효성분인 항산화 및 항균 성분을 보다 효율적으로 추출할 수 있다.

사용가능한 보조용매로는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하기로 에탄올을 사용할 수 있다.

상기 단계 2 및 단계 3의 보조용매는 전체 초임계 이산화탄소와의 혼합물 중 1 내지 30 부피%의 부피로 사용 가능하며, 바람직하기로는 5 부피%의 양으로 사용하는 것이 추출 효율면에서 바람직하다.

상기 단계 4는, 상기 단계 3에서 얻은 함초 추출물을 농축하는 단계로서, 추출된 함초 추출물 내 보조용매를 제거하기 위하여 추출물을 농축시키는 단계이다.

상기 농축은 당업계에 알려져 있는 통상의 농축기를 이용하여 수행 가능하다.

상기 단계 5는 상기 단계 4에서 얻은 함초 추출물 농축액을 여과하여 상층액을 회수하는 단계로서, 함초 추출물 농축액 중 바닥의 침전물을 제외한 순도 높은 상층액을 유효성분으로 회수하는 단계이다. 이는 최종 추출물 내에서도 상층액 부분이 항산화 및 항노화 활성이 보다 우수하기 때문이다.

구체적으로, 초임계 추출된 추출물의 여과는 각종 공지된 필터를 이용해 수행될 수 있으며, 종이 필터를 사용하는 것이 여과 효율과 경제적 측면에서 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법은 유지성분 등의 불순물을 제거하기 위한 단계 1 및 단계 2를 거침으로써, 단계 3에서 추출된 추출물이 단계 1 및 단계 2에서 추출된 추출물보다 항산화 활성 및 항균 활성이 더 높음을 확인할 수 있었다.

특히 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 초임계 추출의 경우 항산화 활성과 항균 활성이 종래의 열수추출에 비해 현저하게 높음을 확인할 수 있었다.

구체적으로, 본 발명의 실험예를 통해, 본 발명의 제조방법에 따른 함초 추출물이 우수한 항산화 활성(실험예 1), 항균 활성(실험예 2)을 가지며, 나아가 적정 농도에서 세포독성(실험예 3)을 갖지 않음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

전술한 제조 방법을 통하여 추출 및 수득된 함초 추출물은 종래의 열수 추출물에 비해 높은 항산화 활성을 가지므로 피부 미백 및 주름개선에 효과적이며, 이에 따라 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

전술한 제조 방법을 통하여 추출 및 수득된 함초 추출물은 종래의 열수 추출물에 비해 높은 항균 활성을 가지므로 아토피에 효과적이며, 이에 따라 아토피의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 피부 노화 또는 아토피의 발생을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유 동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서, 화장료 조성물은 예를 들면, 화장수, 스킨, 로션, 크림, 겔, 연고, 페이스트, 분말 파운데이션, 세럼, 유탁액 파운데이션, 에센스, 페이스트, 분말, 스프레이, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형과 같은 제형으로 제형화 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장용 조성물은 상기 화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제형에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장용 조성물 전체 중량에 대하여 약 1 중량 ％ 내지 약 99.99 중량 ％, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량％ 내지 약 99.99중량 ％로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장용 조성물이 제조되는, 전술한 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 본 발명에 따른 화장용 조성물은 상기 함초 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 에센셜 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

전술한 추출 방법을 통하여 추출된 추출물의 화장용 조성물로의 응용은 예시적이며, 당업자라면, 본 발명의 범위 내에서, 함초 추출물의 항산화 효과, 피부 미백 및 주름개선 효과에 기초하여, 피부, 두피 및 음용될 수 있는 제약이나 샴푸 및 비누와 같은 세제, 식품 및 음료 등으로 제품화될 수 있으며, 이 또한 본 발명에 포함됨을 이해하여야 한다.

본 발명은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용하여 다단계로 함초로부터 항산화 및 항균 활성 추출물을 초임계 추출함으로써, 함초 유래 항산화 및 항균 활성 추출물을 고효율로 추출하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 추출물을 포함하는 피부 미백 및 주름개선 효과가 있는 화장용 조성물 또는 아토피 개선 효과가 있는 화장용 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예의 다단계 초임계 추출을 통해 얻은 추출물의 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거능에 대한 모니터링 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예의 다단계 초임계 추출을 통해 얻은 추출물의 E. coli, S. aureus, 및 P. acnes 균에 대한 항균활성 효능 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예의 다단계 초임계 추출을 통해 얻은 추출물에 대한 농도별 인간각질형성세포의 안전성 세포독성 평가 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 추출물에 대한 지표성분인 베타인(Betain)의 HPLC 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 추출물 중의 지표성분인 베타인(Betain)의 함량을 HPLC로 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 함초 건조 분쇄물의 다단계 초임계 추출

함초 건조 분쇄물로부터 항산화 및 항염 활성이 높은 성분을 효율적으로 얻기 위하여 다단계를 통한 초임계유체 추출 방법을 이용하였으며, 상기 단계에는 활성이 낮은 오일(유지) 성분을 제거하는 탈지 단계가 포함되었다. 이때 각각의 추출 단계에서 얻어지는 추출물을 모두 샘플로서 수득하였다.

전처리로, 함초를 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 핀형분쇄기를 이용하여 0.5㎜m의 입자 크기로 분쇄함으로써 추출 원료를 준비하였다.

첫 번째 단계로, 상기 전처리된 원료 각각을 150 g의 양으로 주입하고 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 50℃에서, 압력을 150bar로 조절하여 1차 초임계 추출을 실시하였다. 초임계 이산화탄소의 유량은 60 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며(SFE 추출법), 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다(비교예 1).

두 번째 단계로, 첫 번째 단계에 이어서 초임계 추출 장치의 압력을 조절하여 150bar에서부터 400bar까지 천천히 압력을 상승시킴과 동시에, 초임계 이산화탄소뿐만 아니라 보조용매로 에탄올(주정)을 추가로 공급하여 상기 1차 추출을 거친 원료의 2차 추출을 실시하였다. 이때 초임계 이산화탄소의 유량은 첫 번째 단계와 동일하게 유지시킨 상태로, 보조용매인 에탄올의 유량은 3 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다(비교예 2).

세 번째 단계로, 50℃에서 압력은 400bar인 상태로 초임계 이산화탄소 및 보조용매인 에탄올을 공급하여 상기 2차 추출을 거친 원료의 3차 추출을 실시하였다(SFE with co-solvent). 세 번째 단계의 각각의 유체에 대한 유량은 전술한 두 번째 단계와 동일하며, 120분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하여 샘플로서 수득하였다( 실시예 1).

상기 각각의 단계에 대하여, 초임계 추출이 완료되면 초임계 추출 장치의 추출조 압력을 낮춰 초임계유체 상태를 해제하여 추출물을 샘플로서 회수하였다. 상기 회수된 각각의 단계에 대한 샘플들을 농축기를 이용하여 농축하였다.

상기 3차 추출의 결과물인 실시예 1의 농축 샘플을 종이 필터(Whatman filter papers No. 1)를 이용하여 여과하였다. 그 후, 샘플을 각각 회수하였다.

이들 각각에 대하여 하기 표 1에 나타내었다.

번호	추출 온도 (℃)	추출 압력 (bar)	추출 시간 (min)		보조용매 (에탄올)
비교예 1 (1차 추출)	50	150	30	1차+2차+3차: 총 180분	-
비교예 2 (2차 추출)	50	150 부터 400 까지 가압	30		3 ㎖/min
실시예 1	50	400	120		3 ㎖/min

실험예 1: 초임계 유체 추출 조건에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 실험 분석

상기 실시예 1에서 얻어진 추출물 샘플에 대하여 DPPH 라디칼 소거 실험을 실시하였다. 상기 본 시험 방법은 에탄올상에서 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH, Sigma D9132-1G)가 발생시키는 자유 라디칼에 대한 소거능을 시험함으로써 항산화 효과의 직접적인 작용 정도를 파악할 수 있는 시험법이다. 화합물 1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH, Sigma D9132-1G)은 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 이에 일정 농도의 추출물과 혼합하여 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지 확인하였다. 구체적으로는 에탄올 0.4ml에 0.1mM의 DPPH용액 0.5ml, 그리고 일정농도로 희석된 초임계추출물들 0.1ml를 첨가하였다. 10초간 강하게 vortexing 후 냉암소에서 30분간 반응시킨 후, ELISA를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하며, 항산화능의 정도는 에탄올을 사용한 대조군의 흡광강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

결과적인 자유 라디칼 소거능을 하기의 수학식 1에 의하여 계산하였다.

[수학식 1]

자유 라디칼 소거활성(%)= {1-(B/A)}×100

A: 추출물 샘플을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 추출물 샘플을 처리한 실험군 웰의 흡광도

그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

실시예 농도별	Control	62.5 ㎍/ml	125 ㎍/ml	250 ㎍/ml	500 ㎍/ml	1 mg/ml
자유 라디칼 소거활성 (%)	0	6.7	10.7	17.3	27.9	41.8

상기 결과를 통하여 실시예 농도가 높아질수록 DPPH 라디칼 소거능이 높게 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 실시예 추출물 및 열수추출물의 항균 활성 측정 분석

함초의 초임계추출물의 항균력의 여부를 확인하기 위하여 고상배지를 활용하는 항균시험을 수행하였다. 이를 위하여 그람음성세균의 대표적인 세균으로 이. 콜라이(E. coli)를 선택하였으며, 아토피 피부염이 있는 피부 병변에 과증식하여 아토피 피부염을 악화시키는 대표적인 그람양성세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 그리고 여드름 원인균으로 잘 알려진 세균으로 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 사용하여 항균테스트를 시험하였다. 이 항균방법은 시험물질이 적셔진 paper disc 주위에 저해에 의해 clear zone이 생기는 것으로 항균활성을 평가할 수 있으며, 초임계추출물에 특이적인 항균활성을 확인하기 위하여 각각의 열수추출물을 대조군으로 항균활성을 평가하였다.

고상배지를 활용하는 항균시험, 즉 agar plate paper difusion assay를 수행하기 위해서는 아래와 같이 수행하였다. E. coli에 대한 항균효과의 시험은 LB agar plate로 수행하였는데, top agar 10ml에 O.D가 0.5 정도인 E. coli 배양액을 100㎕를 넣고 굳어진 LB agar plate 상부에 분주하여 2시간 동안 추가로 굳힌 후 적정농도의 시험물질을 paper에 100㎕를 적신 후 굳힌 plate 위에 얹어 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 동일한 방법으로 Staphylococcus aureus는 micrococcus medium (MM)에서 배양한 후 O.D가 0.5정도 되었을 때 top agar에 100㎕ 넣고 MM agar plate에 분주하여 2시간 굳힌 후 적정농도의 시험물질을 paper에 100㎕ 적신 후 굳힌 plate위에 얹어 37℃에서 24시간 배양하였다. Propionibacterium acnes는 GAM (Nissui Pharmaceutical, Japan)배지로 혐기성 상태에서 배양하여 O.D가 0.5정도 까지 배양하였다. 그 후 top agar에 Propionibacterium acnes 배양배지 100㎕ 넣고 GAM agar plate에 분주하여 굳힌 후 적정농도로 희석된 시험물질을 paper에 100㎕ 씩 적신 후 굳힌 plate 위에 얹어서 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. Propionibacterium acnes 균의 경우는 혐기성 세균으로써 배양시 혐기성 상태를 유지하기 위하여, jar에 활성탄소 가스팩을 넣어 혐기성 상태를 유지시켜 배양하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 통해, 함초 열수추출물은 E. coli, S. aureus, P. acnes 균에 대한 항균효과는 없었으나, 초임계 추출물에서 S. aureus 균에 대하여 10 mg/ml 농도에서 4 mm, 5 mg/ml에서 4 mm의 clear zone의 항균력을 보였다.

실험예 3: 실시예 추출물의 농도별 인간각질형성세포 안정성 세포독성평가 측정 실험

상기 실시예 얻어진 추출물 샘플에 대하여 샘플의 농도별 세포독성 평가 측정 실험을 수행하였다.

실시예 1의 초임계 추출물에 대하여 인간피부구성세포들 즉, 각질형성세포(keratinocyte) HaCaT cell line에 대하여 안전성 혹은 증식촉진 효과를 MTT 시험법을 사용하여 검사하였다. 이를 위해 인간각질형성세포주 HaCaT 세포를 24 well plate에 5 × 10³ cells/well씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 ~ 50%만큼 배양되면, 함초의 초임계 추출물을 적절한 농도대로 처리하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50 ㎕ 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ㎕의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200㎕ 처리하여 교반한 후, 100 ㎕ 씩을 96 well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 대한 안전성 혹은 증식촉진 효과는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

실시예 농도별	Control	0.0001 중량%	0.0005 중량%	0.001 중량%	0.005 중량%	0.01 중량%
상대적 세포 생육도 (%)	100	89.8	123.6	108.3	121.6	135.2

그 결과, 실시예 추출물은 가장 낮은 처리 농도인 0.0001 중량%에서는 미약하게 세포가 억제되는 현상이 관찰되었으나 그 이상의 처리농도에서는 세포 증식을 증가시키는 효과가 관찰되었다. 이로써 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.

실험예 4: 실시예의 지표성분 HPLC 분석결과

본 발명의 상기 실시예 1의 초임계 유체 추출물 지표성분으로 베타인(Betain)을 선정하였으며, 추출물을 HPLC로 베타인(Betain)의 함량에 대해 분석하였다. 상기 실시예 1을 5,000ppm으로 제조 한 후, 0.45 μm membrane filter로 여과한 다음 HPLC(waters, USA)로 분석하였다. 분석조건으로서 columm은 SHODEX sugar KS-802 (8.0mm × 300mm, 5 μm, USA)을 사용하였고, 이동상은 물을 사용하였으며 50분 동안 분석하였다. 유속은 1 mL/min, 주입량은 10 ㎕, 컬럼의 온도는 84℃, 검출기는 RI Detector로 굴절률 차이로 함량을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 4와 도 4에 나타내었다.

실시예 1의 추출물의 농도	실시예 1의 추출물 중 베타인의 농도
5,000 ppm	62.316 ppm

상기 표 4와 도 4를 통해, 본 발명의 다단계 초임계 추출을 통해 얻은 함초 추출물이 상당량의 베타인을 함유하고 있음을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 하기 단계를 포함하는 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물의 제조 방법:
   1) 함초 건조 분쇄물을 35℃ 내지 60℃의 온도 및 100bar 내지 250bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 탈지시키는 단계(단계 1);
   2) 상기 1차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 450bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 잔류 유지성분 및 불순물을 제거하는 단계(단계 2); 및
   3) 상기 2차 초임계 추출된 함초 건조 분쇄물을 상기 2차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 상기 단계 2의 최종 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 항산화 및 항균 효과를 가지는 함초 추출물을 회수하는 단계(단계 3).
   
2. 제1항에 있어서, 상기 보조용매는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 보조용매는 초임계 이산화탄소 및 보조용매 혼합물의 1 내지 30 부피%로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 함초 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.

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