KR101434219B1

KR101434219B1 - 가지로부터 초임계유체를 이용하여 항산화 활성을 갖는 물질의 고효율 추출방법

Info

Publication number: KR101434219B1
Application number: KR1020130033796A
Authority: KR
Inventors: 이재의; 김귀철; 소수정; 김희진; 송하윤; 김대현; 조영익; 이수진; 문상지; 고정윤; 이지석; 강세원; 김주희; 김종륜
Original assignee: 재단법인 전남생물산업진흥원
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-08-28

Abstract

본 발명은 가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용하여 다단계를 거쳐 가지로부터 항산화 활성 성분인 폴리페놀 화합물을 고효율로 추출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용하여 다단계로 가지로부터 추출물을 초임계 추출함으로써, 가지 유래 폴리페놀 화합물 등의 항산화 활성 성분을 고효율로 추출하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 추출물을 포함하는 피부 미백 및 주름개선 효과가 있는 화장용 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

가지로부터 초임계유체를 이용하여 항산화 활성을 갖는 물질의 고효율 추출방법{A method for high yield extraction of material having antioxidant activity from egg plant using supercritical fluid extraction}

본 발명은 가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용하여 다단계를 거쳐 가지로부터 항산화 활성 성분인 폴리페놀 화합물을 고효율로 추출하는 방법에 관한 것이다.

가지(Solarum melongena L.)는 가지과에 속하는 식물로 인도 동부에 자생하고 있는 Solarum insarum L. 이 그 원종으로 추정되고 있으며(Yook CS 1990), 우리나라에서는 신라시대에 이미 가지의 재배와 성상에 관한 기록이 있는 것으로 보아 매우 오래전부터 우리 식단의 주요한 채소로 취급되어 온 것으로 생각된다. 가지는 무기질과 비타민을 많이 함유하고 있으며, 프로비타민 A(provitamin A)와 비타민 E(vitamin E)의 함량은 낮지만, 항산화능을 가진 페놀 화합물과 아스코르브산(ascorbic acid)의 함량(Vinson et al 1998)이 매우 높을 뿐만 아니라 식이섬유소가 풍부하여 장 운동 촉진과 변비를 예방하는 작용이 있고, 치통, 각기, 혈변, 하리(下痢), 화농에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Yoo TJ 1976). 또, 가지는 항균, 항종양, 항돌연변이 및 항암 작용을 가지는 것으로 보고되고 있다(Blankemeyer et al 1998, Kuo et al 2000, Yoshikawaet al 1996, Samaru Y 1998, Shinihara K 1992, Ohgakiet al 1991).

현대 사회의 눈부신 발달과 더불어 생체조직의 노화를 비롯한 퇴행성 신경 질환이 사회적인 문제로까지 크게 대두되고 있다. 노화란 세포와 신체 조직 전 기관에 걸쳐 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 변화라 할 수 있다. 인간의 피부는 시간이 지남에 따라 호르몬 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 활성이 저하되어 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 생기는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외적으로 오염된 공기와 약물, 자외선에 의한 광 노화(photo aging)에 의해 피부가 얇아지며, 주름이 증가되고, 탄력이 감소될 뿐만 아니라, 기미, 주근깨 및 검버섯이 증가하게 된다. 특히 피부가 자외선을 받으면 색소침착이 증가되는데, 이는 자외선 흡수에 의한 피부 세포의 손상을 억제할 목적으로 멜라닌 생성이 증가된 결과이다. 자외선에 의한 피부의 노화가 진행되면 멜라닌 증식이 항시적으로 증가되고 그 결과 기미가 나타난다. 최근 화장품 법에 명시된 기능성화장품 범위 중 특히 미백기능은 한국에서 많은 관심을 불러 모으고 있으며, 주름방지와 더불어 가장 중요한 효능으로 인식되고 있다. 현재까지 이러한 피부 미백 및 주름개선 효능에 관련한 다양한 연구가 많이 진행되고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로 미백 기능성 화장품의 경우 닥나무 추출물, 알부틴(arbutin), 에칠아스코빌에텔(ethyl ascorbyl ether), 유용성 감초추출물, 아스코빌글루코사이드(ascorbyl glucoside)와 마그네슘아스코빌포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate)가 있다. 현재 화장품 소재 중 많은 부분이 천연물 소재에서 멜라닌 생성을 억제하기 위한 티로시나아제(tyrosinase) 저해제를 분리 정제하여 개발하는 것이 주를 이루고 있으며, 특히 한방생약에서 추출되는 것이 주를 이루고 있다. 한방 생약은 과거 수백 년 동 안 동양에서 오랫동안 사용되어졌던 것이 대부분으로 어느 정도 약효가 인정된 것들이 많다. 그러나 이러한 한방 생약의 경우 원료 수급이 불안정하고 가격이 높기 때문에 문제가 되고 있다. 따라서 우리가 일상적으로 흔히 접할 수 있는 천연의 식물성 식품 소재를 활용한 기능성 화장품 개발이 필요한 실정이다.

가지(Solanum melongena L.)는 전 세계에서 가장 많이 생산하는 재배 채소 작물 중 하나로 안토시아닌의 일종인 나수닌(nasunin)과 비타민 C, 클로로겐산(chlorogenic acid)를 포함한 다양한 페놀 화합물(phenolics)을 함유하고 있다. 폴리페놀성 화합물은 지질 과산화의 프리 라디칼(free radical) 소거활성이 있으며, 비파나무 잎에서 추출한 폴리페놀성 화합물인 플라보노이드(flavonoid)와 클로로겐산(chlorogenic acid)이 항산화에 매우 효과적인 것으로 알려지고 있다. 특히 식물조직에서 폴리페놀성 화합물 중 안토시아닌은 산화억제제로서 자외선과 가시광선을 차단하는 기능이 있다고 알려져 있다. 지금까지 가지를 소재로 한 연구로는 항암효과 및 심혈관계 질환억제, 콜레스테롤혈증의 일시적인 개선 효과 등을 가진다고 보고되었고, 그 외에도 가지의 주요 폴리페놀 성분인 클로로겐산은 저밀도 지단백 산화 억제에 도움을 준다고 보고되고 있다. 하지만 국내산 가지를 활용한 다양한 생리활성 효과를 갖는 기능성 물질의 고효율 추출 방법 및 이를 이용한 기능성화장품 소재 개발 연구는 아직 미비한 실정이다.

종래 천연물의 추출은 대부분 열수추출법이나 용매추출법을 통해 수행되어 왔다. 이와 같이 이루어진 종래 추출법은, 복잡한 정제과정을 거치며 이로 인한 유기용매의 잔존, 용매의 제거 및 오일성분의 낮은 분리효과 등의 문제점들이 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 가지 건조 분쇄물을 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 다단계 초임계 추출함으로써 가지로부터 특히 항산화 활성이 뛰어난 폴리페놀 화합물을 고효율로 추출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 초임계 추출을 이용한 가지 유래 폴리페놀 화합물의 추출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 추출된 가지 유래 폴리페놀 화합물을 포함하는 화장용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법을 제공한다.

가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 100bar 내지 200bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 유지성분을 제거하는 단계(단계 1);

상기 1차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 400 bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 불순물을 제거하는 단계(단계 2); 및

상기 2차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 300bar 내지 400 bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 폴리페놀 화합물을 회수하는 단계(단계 3).

바람직하기로, 본 발명의 가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법은 상기 단계 3 이후에 초임계 추출된 추출물을 농축하는 단계(단계 4)를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 1 내지 단계 3은 순차적으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "가지 건조 분쇄물"은 통화식물목 가지과(Solanaceae)에 속하는 쌍떡잎 식물인 가지(Solarum melongena L.)의 열매를 건조시키고 분쇄시킨 결과물을 의미한다.

본 발명에서 가지는 활성화 성분들이 주로 열매 부위에 다량 함유되어 있기 때문에 열매 부위를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로 본 발명의 일 구현예로서, 가지의 열매를 열풍 건조하고 핀형 분쇄기를 사용하여 분쇄할 수 있다. 상기 열풍 건조는 열풍건조기를 이용하여 건조하는 방식을 의미하며, 50 내지 60℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 열풍 건조는 수일 동안, 바람직하기로 1 내지 3일 동안 수행될 수 있으며, 이는 가지의 수분 함량에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 분쇄는 핀형 분쇄기를 사용하여 0.5 내지 2㎜ 크기의 입자로 분쇄할 수 있다. 만일 상기 분쇄 시 입자 크기가 상기 범위 밖일 경우, 가지의 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다. 특히, 0.5㎜ 미만의 입자 크기에서는 초임계유체 추출 시 압력 부하로 인하여 추출 효율이 떨어지게 되고 2㎜ 보다 큰 입자 크기에서는 입자 속에 포함되어 있는 유효물질이 초임계유체에 의해 외부로 추출되기 어려워 결과적으로 유효물질의 추출 효율이 떨어지는 단점이 있다.

바람직하기로, 상기 가지 건조 분쇄물은 0.5㎜ 내지 1㎜의 입자 크기를 가질 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "폴리페놀 화합물"은 하이드록시기(-OH)를 2개 이상 갖고 있는 페놀류 화합물로서, 대표적으로 녹차에 들어 있는 카테킨류(catechins), 클로로겐산, 딸기나 가지, 포도, 검은콩, 팥 따위 붉은색이나 자색의 안토시아닌계 색소 및 플라보노이드(flavonoid) 등을 포함하며, 바람직하기로 플라보노이드(flavonoid)를 포함할 수 있다. 상기 폴리페놀 화합물은 산화를 방지하는 작용, 즉 항산화 활성 기능을 갖고 있으며, 생체 내에서도 항산화제로 작용함으로써 건강유지, 질병예방, 피부미백 및 주름개선 등에 기여할 수 있다. 특히 폴리페놀 화합물 중 하나인 상기 플라보노이드는 항산화에 매우 효과적일 수 있다.

상기 단계 1은, 가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 100bar 내지 200bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 유지성분을 제거하는 단계로서, 비교적 저압의 압력조건 하에서 가지 건조 분쇄물에 함유된 항산화 성분을 제외한 유지성분을 주로 추출하여 제거하는 단계이다.

상기 유지성분은 대표적으로 가지에 포함된 지질 및 지방과 같은 성분을 의미하며, 항산화 활성을 저해할 수 있는 대표적인 성분이다. 본 발명에서는 이들을 탈지하여 제거하는 단계로서 1차 초임계 추출을 수행함으로써, 오일 성분을 효율적으로 추출하여 제거할 수 있다.

상기 단계 1의 조건 하에서 상기 유지성분들은 항산화 성분에 비해 상대적으로 많은 양으로 추출될 수 있다. 이를 통하여 향후 단계 3에서 항산화활성 효과가 높은 성분을 효율적으로 얻을 수 있다. 단계 1에서 추출된 유지성분을 포함하는 추출물은 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 1은 약 30분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 2는, 상기 1차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 400 bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 불순물을 제거하는 단계로서, 상기 단계 1과 마찬가지로 가지에 잔류하는 항산화 성분을 제외한 불순물을 추출하여 제거하는 단계이다.

상기 불순물은 본 발명에서 목적하는 폴리페놀 화합물을 제외한 항산화 활성을 저해하는 각종 물질로서, 대표적으로 전술한 유지성분이 포함될 수 있다. 상기 단계 1)에서 유지 성분을 주로 제거한 다음 단계 2)에서 잔류 유지 성분을 포함하는 항산화 활성을 저해할 수 있는 성분들, 즉 불순물을 제거시킬 수 있다.

구체적으로, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 압력에서 비교적 고압의 압력조건인 300bar 내지 400 bar의 압력까지 압력을 서서히 증가시키면서, 이와 동시에 공급되는 초임계 이산화탄소에 보조용매를 추가로 투입하여 공급시킬 수 있다. 이를 통하여 가지에 잔류하는 유지성분을 포함하는 불순물을 상당히 제거할 수 있으며, 나아가 단계 3에서 고순도의 활성화 성분을 고효율로 추출할 수 있게 할 수 있다.

상기 단계 2의 온도는 상기 단계 1에서의 온도와 동일할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 40℃ 내지 70℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있다.

상기 단계 1과 마찬가지로, 단계 2에서 추출된 불순물을 포함하는 추출물을 회수하여 제거하거나 필요에 따른 용도로 재활용할 수 있다.

바람직하기로, 상기 단계 2는 약 30분에 걸쳐서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 3은, 상기 2차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 300bar 내지 400 bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 폴리페놀 화합물을 회수하는 단계로서, 상기 단계 1 및 단계 2를 통하여 항산화 활성을 저해하는 불순물이 상당량 제거된 가지 건조 분쇄물에서 플라보노이드 등의 폴리페놀성 화합물을 고순도 및 고효율로 추출하는 단계이다.

바람직하기로, 상기 단계 3은 약 120분간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하기로, 상기 단계 1 내지 단계 3의 초임계 이산화탄소는 5 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급될 수 있고, 추출시간 대비 보다 많은 양의 추출물을 얻기 위하여 30 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량으로 공급됨이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용하는 용어 "보조용매"는 초임계 이산화탄소와 함께 사용되는 유기용매를 의미하며, 이들의 복합으로 유효성분인 항산화 성분을 보다 효율적으로 추출할 수 있다.

상기 단계 2 및 단계 3의 보조용매는 전체 초임계 이산화탄소와의 혼합물 중 1 내지 15 부피%의 부피로 사용 가능하며, 바람직하기로는 3 부피%의 양으로 사용하는 것이 추출 효율면에서 바람직하다.

사용 가능한 보조용매로는 에탄올을 예로 들 수 있다.

상기 단계 4는, 상기 단계 3에서 추출된 가지 유래 폴리페놀 화합물을 포함하는 추출물을 농축하는 단계로서, 추출된 가지 추출물 내 보조용매를 제거하기 위하여 추출물을 농축시키는 단계이다.

상기 농축은 당업계에 알려져 있는 통상의 농축기를 이용하여 수행 가능하다.

본 발명의 가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법은 유지성분 등의 불순물을 제거하기 위한 단계 1 및 단계 2를 거침으로써, 단계 3에서 추출된 추출물이 단계 1 및 단계 2에서 추출된 추출물보다 항산화 활성 및 유효성분인 플라보노이드 및 폴리페놀의 함량이 더 높음을 확인할 수 있었다.

특히 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 초임계 추출의 경우 항산화 활성과 플라보노이드 및 폴리페놀의 함량이 종래의 용매추출 및 열수추출에 비해 현저하게 높음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 추출 방법으로 추출된 가지 유래 폴리페놀 화합물을 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.

전술한 추출 방법을 통하여 추출 및 수득된 가지 유래 폴리페놀 화합물을 포함하는 화장용 조성물은 높은 항산화 활성을 가지므로 피부 미백 및 주름개선에 효과적이며, 예를 들면, 화장수, 스킨, 로션, 크림, 겔, 연고, 페이스트, 분말 파운데이션, 세럼, 유탁액 파운데이션, 에센스, 페이스트, 분말, 스프레이, 수증유(O/W)형 또는 유증수(W/O)형과 같은 제형으로 제형화 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화장용 조성물은 상기 화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제형에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제형에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장용 조성물 전체 중량에 대하여 약 1 중량 ％ 내지 약 99.99 중량 ％, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량％ 내지 약 99.99 중량 ％로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장용 조성물이 제조되는, 전술한 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 본 발명에 따른 화장용 조성물은 상기 가지 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

전술한 추출 방법을 통하여 추출된 추출물의 화장용 조성물로의 응용은 예시적이며, 당업자라면, 본 발명의 범위 내에서, 폴리페놀 화합물의 항산화 효과, 피부 미백 및 주름개선 효과에 기초하여, 피부, 두피 및 음용될 수 있는 제약이나 샴푸 및 비누와 같은 세제, 식품 및 음료 등으로 제품화될 수 있으며, 이 또한 본 발명에 포함됨을 이해하여야 한다.

본 발명은 초임계 이산화탄소 및 보조용매를 이용하여 다단계로 가지로부터 추출물을 초임계 추출함으로써, 가지 유래 폴리페놀 화합물 등의 항산화 활성 성분을 고효율로 추출하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 추출물을 포함하는 피부 미백 및 주름개선 효과가 있는 화장용 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실험예 1에 따른 0.5㎜ 입자 크기를 갖는 가지 건조 분쇄물에서 본 발명의 단계 1, 단계 2 및 단계 3을 각각 거친 초임계 추출 후 얻은 시료의 수율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에 따른 초임계 유체 추출물(실시예 1), 주정 추출물(비교예 1, 2) 및 열수 추출물(비교예 3, 4)에 대한 2,2'-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)를 이용한 라디컬 소거능 실험의 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실험예 3에 따른 초임계 유체 추출물(실시예 1), 주정 추출물(비교예 1, 2) 및 열수 추출물(비교예 3, 4)에 대한 ferric reducing /antioxidant power(FRAP)를 이용한 시료의 환원력 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예 4에 따른 초임계 유체 추출물(실시예 1), 주정 추출물(비교예 1, 2) 및 열수 추출물(비교예 3, 4)의 폴리페놀 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 5에 따른 초임계 유체 추출물(실시예 1), 주정 추출물(비교예 1, 2) 및 열수 추출물(비교예 3, 4)의 폴라보노이드 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 6에 따른 가지의 추출 방법별 지표성분 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 지표성분인 클로로겐산(chlorogenic acid)의 HPLC 분석 결과이다.
도 6b는 본 발명의 초임계 유체 추출물인 실시예 1-1의 HPLC 분석 결과이다.
도 6c는 본 발명의 초임계 유체 추출물인 실시예 1-2의 HPLC 분석 결과이다.
도 6d는 본 발명의 초임계 유체 추출물인 실시예 1-3의 HPLC 분석 결과이다.
도 6e는 주정 추출물인 비교예 1의 HPLC 분석 결과이다.
도 6f는 주정 추출물인 비교예 2의 HPLC 분석 결과이다.
도 6g는 열수 추출물인 비교예 3의 HPLC 분석 결과이다.
도 6h는 열수 추출물인 비교예 4의 HPLC 분석 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 가지 건조 분쇄물의 다단계 초임계 추출

전처리로, 가지를 60℃에서 1일 동안 열풍 건조한 후 핀형분쇄기를 이용하여 0.5㎜의 크기로 분쇄함으로써 가지 건조 분쇄물을 시료로 준비하였다.

첫 번째 단계로, 상기 전처리된 가지 건조 분쇄물 시료를 90 g의 양으로 주입하고 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 50℃에서, 압력을 150bar로 조절하여 초임계 추출을 실시하였다. 초임계 이산화탄소의 유량은 60 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며(SFE 추출법), 여기서 추출된 추출물을 회수하였다(실시예 1-1).

두 번째 단계로, 초임계 추출 장치의 압력을 조절하여 150bar에서 400bar까지 천천히 압력을 상승시킴과 동시에, 초임계 이산화탄소뿐만 아니라 보조용매로 에탄올(주정)을 추가로 공급하여 상기 첫 번째 단계를 거친 시료의 추출을 실시하였다. 이때 초임계 이산화탄소의 유량은 첫 번째 단계와 동일하게 유지시킨 상태로, 보조용매인 에탄올의 유량은 2 ㎖/min으로 30분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하였다(실시예 1-2).

세 번째 단계로, 50℃에서 압력은 400bar인 상태로 초임계 이산화탄소 및 보조용매인 에탄올을 공급하여 상기 두 번째 단계를 거친 시료의 초임계 추출을 실시하였다(SFE with co-solvent). 세 번째 단계의 각각의 유체에 대한 유량은 전술한 두 번째 단계와 동일하며, 120분 동안 추출하였으며, 여기서 추출된 추출물을 회수하였다(실시예 1-3).

상기 각각의 단계에 대하여, 초임계 추출이 완료되면 초임계 추출 장치의 추출조 압력을 낮춰 초임계유체 상태를 해제하여 추출물을 회수하였다. 상기 회수된 각각의 단계에 대한 추출물을 농축기를 이용하여 농축하였다.

이들 각각에 대하여 하기 표 1에 나타내었다.

구분	추출조건	추출온도 (℃)	추출압력 (bar)	추출시간 (min)	보조용매 (에탄올)	입자크기 (㎜)
실시예 1-1	SFE	50	150	30	-	0.5
실시예 1-2	SFE with co-solvent	50	150 부터 400	30	2 ㎖/min	0.5
실시예 1-3	SFE with co-solvent	50	400	120	2 ㎖/min	0.5

비교예 1 및 2: 가지의 주정 추출물(용매 추출)의 제조

분쇄된 가지를 사용하여 회전 진공 농축 추출기를 이용하여 주정 추출을 수행하였다. 가지 분쇄물 30g을 농축 추출조에 70% 에탄올 30㎖를 넣은 후 열을 가하여 50℃(비교예 1) 또는 75℃(비교예 2)로 유지하면서 항온수조에서 6시간 동안 추출하였다. 추출이 완료된 후에는 가지와 추출액을 분리, 진공 농축하였다. 농축물은 동결건조하여 분말형태로 제조하였다.

이들 각각에 대하여 하기 표 2에 나타내었다.

비교예 번호	추출조건	추출온도 (℃)	추출시간 (hr)
1	주정 추출	50	6
2	주정 추출	75	6

비교예 3 및 4: 가지의 열수 추출물의 제조

분쇄된 가지를 사용하여 회전 진공 농축 추출기를 이용하여 열수추출을 수행하였다. 가지 분쇄물 30g을 농축 추출조에 3차 증류수 300㎖ 를 넣은 후 열을 가하여 50℃(비교예 3) 및 75℃(비교예 4)로 유지하면서 항온수조에서 6시간 동안 추출하였다. 추출이 완료된 후에는 가지와 추출액을 분리, 진공 농축하였다. 농축물은 동결건조하여 분말형태로 제조하였다.

이들 각각에 대하여 하기 표 3에 나타내었다.

비교예 번호	추출조건	추출온도 (℃)	추출시간 (hr)
3	열수 추출	50	6
4	열수 추출	75	6

실험예 1: 실시예 1의 각 단계에 따른 추출수율 조사

상기 실시예 1-1 내지 1-3에서 얻어진 각 단계에서의 가지 추출물의 추출 수율을 조사하고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 1에 나타내었다.

구분	주입 시료량 (g)	농축량 (g)	추출 수율 (%)
실시예 1-1	90	0.125	0.14
실시예 1-2	90	0.793	0.80
실시예 1-3	90	1.280	1.42

그 결과, 앞의 두 단계를 거치고, 50 ℃, 400 bar 및 보조용매와 함께 추출하여 얻어진 실시예 1-3 가지 추출물의 수율이 가장 높음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 가지의 추출 방법별 ABTS 라디칼 소거능 실험 분석

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물에 대하여 2,2'-azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 실험을 실시하였다. ABTS 라디칼 소거 실험은 총 항산화 활성(total antioxidant activity, TAA)의 측정방법 중의 한 가지로 무색의 환원된 ABTS가 산화되며서 특징적인 청록색을 띄는 ABTS+ (ABTS radical cation)가 형성되는 것을 이용한 방법이다. 이 청록색 ABTS+는 산화될 수 있는 물질과 반응하면 본래의 무색 ABTS로 환원되고 그와 반응한 물질의 산화가 일어나게 되어 흡광도의 감소가 일어나게 되고 항산화 능력을 측정할 수 있다.

7 mM ABTS 용액과 2.4 mM K₂S₂O₈ 용액을 1:1 비율로 섞어 어두운 곳, 실온에서 16 내지 24시간 방치시킨 후, 이를 734㎚에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다. 시료용액 60㎕와 ABTS 용액 240㎕를 혼합하여 10분간 반응시키고 734㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 1에 의하여 ABTS 라디칼 소거능(Radical scavenging activity, RSA)을 계산하였다..

[수학식 1]

그 결과를 하기 표 5 및 도 2에 나타내었다.

농도(ppm)	실시예1-1	실시예1-2	실시예1-3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
10000	91.91	97.23	98.42	97.39	98.21	96.85	96.25
5000	53.01	89.46	97.34	96.41	97.07	94.35	73.22
1000	10.59	26.4	95.49	68.33	66	28.08	31.94
500	0	7.77	76.64	33.68	32.92	11.35	15.59

표 5 및 도 3을 통해 본 발명의 실시예 1-3의 가지 추출물이 ABTS 라디컬 소거능이 모든 농도에 대하여 월등히 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 항산화 활성이 가장 우수함을 알 수 있다.

특히, 종래 보편적으로 사용되던 용매추출 및 열수추출(비교예 1 내지 4)에 비하여 항산화 활성이 월등히 우수하며, 나아가 실시예 1-1 및 1-2에서 추출된 추출물들은 항산화 성분들은 거의 포함하고 있지 않으며, 유지성분과 같은 항산화 활성이 거의 없는 물질들을 추출해낸 것을 확인하였다.

실험예 3: 가지의 추출 방법별 FRAP 환원력 분석

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물에 대하여 ferric reducing /antioxidant power(FRAP) assay를 이용하여 시료의 환원력 분석 실험을 실시하였다. FRAP 방법은 colored ferrous tropyridyl triazine complex에 의해 ferric ion이 ferrous로 전환되어지는 과정을 분석함으로써 시료 내의 총 항산화력을 측정하는 방법으로, 낮은 pH에서 환원제에 의해 3가 철이 2가 철로 환원되는 원리를 기초로 하는 방법이다.

원액(stock solution)으로 300 mM 아세테이트 완충액(acetate buffer, pH3.6), 40 mM 염산(HCl)로 용해시킨 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액, 그리고 증류수에 용해시킨 20 mM FeCl·6H₂O를 제조하여, 사용 직전에 이들을 10 : 1 : 1의 비율로 혼합하여 37℃, 10 내지 15분 동안 가온(warming)해준 뒤 FRAP 시약(working solution)으로 사용하였다. 희석한 추출물 15㎕에 285㎕의 FRAP시약을 혼합하여 암소에서 10분간 반응시킨 다음 593㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2에 의하여 환원력을 계산하였다.

[수학식 2]

그 결과를 하기 표 6 및 도 3에 나타내었다.

농도(ppm)	실시예1-1	실시예1-2	실시예1-3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
10000	2035	4340	16490	8994	9585	3204	3927
5000	1219	2319	9172	4945	5530	1980	2380
1000	405	1600	2465	1869	1964	792	1034
500	335	799	1649	1259	1037	557	804

표 6 및 도 3를 통해 상기 실험예 2의 라디칼 소거활성 결과와 마찬가지로, 환원력에 의한 항산화 활성 실험결과, 비교예 1 내지 4의 추출물들에 비해 실시예1-3의 추출물에서 가장 높은 환원력을 나타내었으며, 농도가 증가할수록 환원력이 증가하였다.

실험예 4: 가지의 추출 방법별 총 폴리페놀 함량 분석

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물에 대하여 Folin-Ciocalteu 시약을 이용한 폴리페놀성 화합물의 환원력을 분석하였다. 이를 통하여 각각의 추출물에 포함된 항산화 성분인 폴리페놀의 함량을 확인할 수 있다. 해당 실험은 페놀시약(phenol reagent)이 시료(추출물)의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 하여 분석한다.

추출물 20㎕에 10% Na₂CO₃용액을 200㎕ 첨가하고 상온에서 5분간 반응을 시킨 후 Folin-Ciocalteu 시약 20㎕를 혼합하여 30분간 정치한 후 730㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2에 의하여 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.

[수학식 2]

그 결과를 하기 표 7 및 도 4에 나타내었다.

농도(ppm)	실시예1-1	실시예1-2	실시예1-3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
10000	109.27	77.76	374.73	135.94	139.27	69.27	50.48
5000	49.58	37.76	197.45	66.55	71.7	39.58	34.12
1000	15.94	-6.48	36.24	16.85	20.79	0.79	2.91
500	7.15	10.48	28.36	12	11.7	-9.52	2.61

표 7 및 도 4를 통해 라디칼 소거활성(실험예 2), FRAP 환원력(실험예 3) 측정 결과와 마찬가지로, 비교예 1 내지 4의 추출물들에 비해 실시예1-3의 추출물에서 가장 높은 폴리페놀 함량을 나타냄을 확인하였으며, 농도가 증가할수록 함량 또한 증가하였다.

실험예 5: 가지의 추출 방법별 총 플라보노이드 함량 분석

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물에 대하여 당업계에 알려진 통상의 Davis 변법을 응용하여 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 분석하였다.

각 추출물 20㎕에 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol) 200㎕를 가하여 잘 혼합한 후, 1N NaOH 20㎕ 을 첨가하여 37℃, 60분 동안 가온(warming)해준 뒤 750㎚에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2에 의하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

[수학식 2]

그 결과를 하기 표 8 및 도 5에 나타내었다.

농도(ppm)	실시예1-1	실시예1-2	실시예1-3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
10000	118.67	258.67	1205.33	899.78	952	478.67	492
5000	50.89	123.11	585.33	417.56	480.89	232	210.89
1000	6.44	30.89	109.78	54.22	63.11	26.44	26.44
500	3.11	8.67	62	26.44	26.44	22	7.56

표 8 및 도 5를 통해 라디칼 소거활성(실험예 2), FRAP 환원력(실험예 3) 및 총 폴리페놀 함량(실험예 4) 측정 결과와 마찬가지로, 비교예의 추출물들에 비해 실시예1-3의 추출물에서 가장 높은 플라보노이드 함량을 나타냄을 확인하였으며, 농도가 증가할수록 함량 또한 증가하였다.

실험예 6: 가지의 추출 방법별 지표성분 HPLC 분석

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물의 지표성분으로 선정한 클로로겐산(chlorogenic acid)의 함량을 분석하였다.

실시예 1-1, 1-2 및 1-3과 비교예 1 내지 4에서 얻어진 추출물 시료를 10,000ppm으로 제조 한 후, 0.45㎛ membrane filter로 여과한 다음 HPLC(waters, USA)로 분석하였다. 분석조건 컬럼(columm)은 Waters Sunfire C18(4.6㎜×250㎜, 5㎛, USA)을 사용하였고, 이동상은 0.01M 인산칼륨(potassium phosphate)(A)와 메탄올(methanol)(B)을 사용하였으며, 0 내지 80% B 용매를 선형 그라디언트(linear gradient)로 30분 동안 분석하였다. 유속은 1 ㎖/min, 주입량은 10㎕, 검출기는 photo diode array detector 및 파장은 280㎚에서 분석하였다. 그 결과를 하기 표 9 및 도 6에 나타내었다.

농도(ppm)	실시예1-1	실시예1-2	실시예1-3	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
10000	0	0	2.782	266.742	287.158	30.682	43.931

표 9 및 도 6을 통해 상기 비교예 2의 가지 주정추출물이 지표성분 클로로겐산의 함량이 가장 높게 측정되었으며, 실시예 1-1 내지 1-3의 경우, 지표성분이 없거나 낮게 측정됨을 확인할 수 있었다(도 6b 내지 6d). 이는 상기 실험예 2 내지 5의 항산화 활성 평가 등과는 다른 결과이다. 도 6d에 나타난 실시예 1-3의 HPLC 분석결과는 비교예 1 내지 4(도 6e 내지 6h)와 다른 패턴을 가지고 있었으며, 클로로겐산 피크(peak)와 다른 메인 피크(peak)가 존재함을 확인하였다. 이를 통하여 실시예 1-3의 추출물은, 본 실험예의 지표성분은 클로로겐산이었지만, 항산화 활성을 나타내는 성분은 다른 물질, 대표적으로 플라보노이드 등을 다량 포함하고 있음을 예측할 수 있다.

Claims

가지 유래 폴리페놀 화합물의 초임계 추출 방법에 있어서,
가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 100bar 내지 200bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하여 유지성분을 제거하는 단계(단계 1);
상기 1차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 상기 1차 추출 단계와 동일한 온도 범위로 유지하면서 300bar 내지 400 bar의 압력까지 압력을 증가시키면서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 2차 초임계 추출하여 불순물을 제거하는 단계(단계 2); 및
상기 2차 초임계 추출 진행된 가지 건조 분쇄물을 40℃ 내지 70℃의 온도 및 300bar 내지 400 bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소 및 보조용매로 3차 초임계 추출하여 폴리페놀 화합물을 회수하는 단계(단계 3)를 포함하는 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3 이후에 초임계 추출된 추출물을 농축하는 단계(단계 4)를 추가로 포함하는 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1 내지 단계 3은 순차적으로 수행되는 것인 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 가지 건조 분쇄물은 0.5㎜ 내지 1㎜의 입자 크기를 갖는 것인 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 보조용매는 에탄올을 포함하는 것인 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1 내지 단계 3의 초임계 이산화탄소는 5 ㎖/min 내지 60 ㎖/min의 체적유량인 것인 추출 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2 내지 단계 3은 보조용매가 초임계 이산화탄소 및 보조용매 혼합물의 1 내지 15 부피%로 포함되는 것을 특징으로 하는 추출 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 추출 방법으로 추출된 가지 유래 폴리페놀 화합물을 포함하는 화장용 조성물.