JP2016521711A - Ｃｍｖ中和抗原結合性タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的に結合し、そして好ましくはそれを中和するモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメント（これらに限定されるものではない）を含む抗原結合性タンパク質に関する。また、ヒト化された抗原結合性タンパク質も本発明に含まれる。本発明の抗原結合性タンパク質は、ＣＭＶ感染の治療および／または予防を要する患者においてＣＭＶ感染を治療および／または予防するための治療用物質として有用である。【選択図】図２C

Description

発明の分野
本発明は、モノクローナル抗体（これに限定されるものではない）を含む抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質に関する。本発明はまた、ＣＭＶ感染の診断、治療および／または予防における本発明の抗原結合性タンパク質の使用に関する。本発明の抗原結合性タンパク質を含む組成物も本発明に含まれる。
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１３年６月１０日付け出願の米国仮特許出願第６１／８３３，１８４号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、２０１４年６月６日付け作成の「２３５３０−ＳＥＱＬＩＳＴ−０６ＪＵＮＥ２０１４．ＴＸＴ」なるファイル名および１５４ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂから提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）はヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）としても公知であり、ヘルペスウイルス科のベータ亜科のメンバーとして分類されているヘルペスウイルスである。米国疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によると、ＣＭＶ感染はヒト集団においてかなり遍在的に見出され、米国成人集団の推定４０〜８０％が感染している。このウイルスは主として体液を介して広がり、しばしば、妊娠母体から胎児または新生児へと伝染する。ウイルス活性化は高熱、悪寒、倦怠感、頭痛、悪心および脾腫を引き起こしうるが、ほとんどの個体においてはＣＭＶ感染は潜伏性である。
ほとんどのヒトＣＭＶ感染は無症候性であるが、免疫無防備状態の個体（例えば、ＨＩＶ陽性患者、同種移植患者および癌患者）または免疫系が未だに完全には発達していない者（例えば、新生児）におけるＣＭＶ感染は特に問題となりうる（Ｍｏｃａｒｓｋｉら，Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，Ｆｉｅｌｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７０１−２７７２，ＫｎｉｐｅｓおよびＨｏｗｌｅｙ編，２００７）。そのような個体におけるＣＭＶ感染は、有害な病態のなかで特に肺炎、肝炎、脳炎、大腸炎、ブドウ膜炎、網膜炎、失明および神経障害を含む重篤な罹患を引き起こしうる。また、妊娠中のＣＭＶ感染は先天異常の主要原因である（Ａｄｌｅｒ，２００８ Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，４１：２３１；Ａｒｖｉｎら，２００４ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，３９：２３３；Ｒｅｖｅｌｌｏら，２００８ Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ，８０：１４１５）。
発明の概括
本発明は、ＣＭＶへの特異的結合および好ましくはＣＭＶの中和を含む１以上の所望の特性を有する抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質に関する。本発明はまた、ＣＭＶ感染の治療および／または予防における本発明の抗原結合性タンパク質の使用に関する。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質はＣＭＶに特異的に結合し、そして好ましくはＣＭＶを中和する。より詳細な実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、ＣＭＶビリオンが細胞に結合し、細胞膜と融合し、および／またはウイルス遺伝物質を細胞内に放出することを遮断／低減する。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は組換え抗原結合性タンパク質である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はヒト化抗原結合性タンパク質である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は完全ヒト（すなわち、完全にヒト性である）抗原結合性タンパク質である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はキメラ抗原結合性タンパク質である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は２価抗原結合性タンパク質である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質の重鎖と軽鎖とは連結されていて一本鎖抗原結合性タンパク質を形成している。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＦｖドメインフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントである。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はジアボディである。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はドメイン抗体である。
特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質はラクダ化単一ドメイン抗体である。
更に追加的な実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかをコードする組換え核酸を提供する。
更に追加的な実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の使用を、対象におけるＣＭＶ感染を治療および／または予防するための医薬の製造のために提供する。
更にもう１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質を、対象におけるＣＭＶ感染の治療および／または予防方法における使用のために提供する。
更に追加的な実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかの使用を診断用途のために提供する。
本発明はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性および／または抗体半減期（インビボにおけるもの）を増加させるＦｃ領域内の突然変異（これらに限定されるものではない）を含む１以上の突然変異を含む抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質を提供する。
更に追加的な実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質のいずれかをコードする単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。１つの実施形態においては、単離された核酸は、本明細書に記載されているＶＨまたはＶＬ鎖のいずれかをコードしている。本発明はまた、本明細書に記載されている発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。
特定の実施形態においては、本発明のこれらの核酸、発現ベクターまたはポリペプチドは抗体の製造方法において有用である。
図１Ａ〜Ｂ：復帰突然変異体ビリオンにおいて五量体ｇＨ複合体が検出可能である。ＡＤ１６９ウイルスおよび上皮向性が回復した復帰突然変異体ウイルスをプレート上にコートし、五量体ｇＨ複合体の検出のために（Ａ）ｇＢ特異的ｍＡｂ Ｂ８．６および３５．１または（Ｂ）ＵＬ１３０タンパク質特異的ｍＡｂ ３Ｅ３および３Ｃ５と反応させた。どちらのｇＢ特異的ｍＡｂもＡＤ１６９および該復帰突然変異体ビリオンと同等に反応したが、ＵＬ１３０タンパク質特異的ｍＡｂは該復帰突然変異体ウイルスとしか反応しなかった。 図２Ａ〜２Ｃ：ＣＭＶに対する４５個のウサギｍＡｂのパネルの中和および結合特性の相関分析。各抗体の中和および結合特性をそれぞれウイルス中和アッセイおよび結合アッセイにおいて分析した。ヒトＣＭＶ過免疫ＩｇＧ（ＨＩＧ，ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標））を、（Ａ）ＡＲＰＥ−１９細胞内へのウイルス侵入を抑制する能力および（Ｂ）ＣＭＶに結合する能力（ＩｇＧ濃度に対応したもの）に関する陽性対照として使用した。（Ｃ）４５個の特定されたウサギモノクローナル抗ＣＭＶ抗体をそれらのＥＣ５０中和およびＥＣ５０結合に関して分析した。各ｍＡｂが復帰突然変異体ウイルスに対するそのＥＣ５０中和（ｙ軸）およびＥＣ５０結合（ｘ軸）に従いプロットされている。中央のベタの四角形の記号はＨＩＧ（ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標））を表し、水平破線はＨＩＧのＥＣ５０中和を表す。該線の上のモノクローナル抗体（三角形）は中和ｍＡｂであり、該線の下のモノクローナル抗体は非中和ｍＡｂ（円形）である。優良中和ｍＡｂが黒塗りの三角形として示されている。 ＡＲＰＥ−１９細胞における該抗体の中和特性はＭＲＣ−５細胞におけるそれらの活性と常に相関するわけではない。ＭＲＣ−５細胞の場合と比較されたＡＲＰＥ−１９細胞における各抗体の中和特性を分析し、ＥＣ５０中和値を計算した。垂直線はＨＩＧ（ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標））に関するＡＲＰＥ−１９細胞におけるＥＣ５０値を表す。群ＡにおけるｍＡｂはＡＲＰＥ−１９細胞においてウイルスを中和するに過ぎず、群ＢにおけるｍＡｂは両方の細胞型においてウイルスを中和し、群ＣにおけるｍＡｂはいずれの細胞型においても非中和性である。 図４Ａ〜４Ｄ：復帰突然変異体ウイルスへの抗体の優先的結合は抗体の中和活性に関連づけられる。ｍＡｂを、種々の濃度のＡＤ１６９ウイルスおよび復帰突然変異体ウイルス（ｘ軸）へのそれらの結合に関して試験し、それらのＥＣ５０中和値（ｙ軸）に対してプロットした。モノクローナル抗体は（Ａ）復帰突然変異体ウイルスとのみ反応した、あるいは（Ｂ）復帰突然変異体ウイルスおよびＡＤ１６９ウイルスの両方と反応したが、復帰突然変異体ウイルスと優先的に反応した、あるいは（Ｃ）復帰突然変異体ウイルスおよびＡＤ１６９ウイルスの両方と反応したが、優先性を示さなかった。（Ｄ）優良中和性ｍＡｂ（円形）および優良結合性ｍＡｂ（三角形）に関する結合特性が示されている。 １１個の優良中和抗体のうちの８個はＥＩＡにおいて組換え五量体ｇＨ複合体を認識する。優良中和ｍＡｂおよび優良結合性ｍＡｂを２μｇ／ｍＬ 組換えｇＢ抗原または五量体ｇＨ複合体との反応性に関してアッセイした。組換え五量体ｇＨ複合体（黒塗りの棒）または組換えｇＢ（中空の棒線）のいずれかへの結合に関して観察された蛍光シグナルが〜１μｇ／ｍＬの各抗体に関してプロットされている。１１個中８個の優良中和抗体が五量体ｇＨ複合体と反応し、２個の優良結合性抗体のみが五量体ｇＨ抗原に対する特異性を示した。 ４５個の単離されたｍＡｂのアミノ酸配列の、それらの抗原結合および中和特性に関する系統発生解析。全重鎖可変領域アミノ酸配列に基づいて系統樹を構築した。重鎖ＣＤＲ３における抗体間の類似性に基づいて系統群を分類した。２以上の抗体を含有する系統群が枠内にグループ化されている。黒塗りの点は中和抗体を示し、中空の点は非中和抗体を示す。３個の点は優良中和抗体または優良結合性抗体を示す。 優良中和抗体の重鎖ＣＤＲ３の平均サイズは優良結合性抗体のものより有意に大きい。単離されたモノクローナル抗体に関する重鎖（黒塗りの記号）および軽鎖（中空の記号）のＣＤＲ３の長さをプロットした。ＣＤＲ３の平均長を水平線により示した。示されている群の統計比較のために独立両側ｔ検定を行った。円形は優良中和抗体を示し、逆三角形は優良結合性抗体を示し、三角形は中和抗体を示し、菱形は非中和抗体を示す。 図８Ａ〜８Ｃ：幾つかの抗ＣＭＶモノクローナル抗体による補体依存性ウイルス中和。モノクローナル抗体（Ａ）２９５．５、（Ｂ）２７２．７および（Ｃ）３５０．１をウサギ補体の存在下または非存在下でウイルスと混合し、ＡＲＰＥ−１９細胞のＣＭＶ感染を中和するそれらの能力を試験した。ＡＲＰＥ−１９細胞におけるウイルスＩＥ抗原の発現によりＣＭＶ感染を評価した。 図９Ａ〜Ｂ：抗ＣＭＶモノクローナル抗体のウエスタンブロット分析。精製ＣＭＶウイルスを変性させ、ウイルスタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ウイルスタンパク質をニトロセルロース膜に移し、（Ａ）本発明の４５個の単離された抗ＣＭＶモノクローナル抗体または（Ｂ）クローン５８．５でブロッティングした。ワクチン接種前ウサギ血清から対照ＩｇＧ（陰性対照）を単離し、ワクチン接種後免疫ウサギ血清からポリＩｇＧ（陽性対照）を単離した。
詳細な説明
本発明は、単離された抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質ならびにＣＭＶ感染の治療および／または予防における該抗原結合性タンパク質の使用方法を提供する。１つの実施形態においては、本発明はヒト化または完全ヒト抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質ならびにＣＭＶ感染の治療および／または予防における使用方法を提供する。
本明細書中で用いる抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、ＣＭＶに特異的に結合する抗原結合性タンパク質を意味する。「ＣＭＶに特異的に結合する」抗原結合性タンパク質は、他のウイルスと比較してＣＭＶへの優先的結合を示す抗原結合性タンパク質であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要しない。該抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、いずれかの他の抗原に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きな、ＣＭＶに対するアフィニティを有する。
抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質
ＣＭＶに結合する組換え抗原結合性タンパク質は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５または６個を含みうる。そのような１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、独立して、本明細書（例えば、表１および２）に開示されている抗原結合性タンパク質のＣＤＲ配列から選択されうる。あるいは、そのような１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは本発明の単一の記載されている抗原結合性タンパク質のＣＤＲ配列から選択されうる。
ＣＭＶに結合する組換え抗原結合性タンパク質は、本発明のいずれかの抗原結合性タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１以上を含む少なくとも１つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含みうる（表１を参照されたい）。特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、本発明の抗原結合性タンパク質のＣＤＲの３個を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２および配列番号９のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２および配列番号１２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１６のＣＤＲ１、配列番号１７のＣＤＲ２および配列番号１８のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１９のＣＤＲ１、配列番号２０のＣＤＲ２および配列番号２１のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２２のＣＤＲ１、配列番号２３のＣＤＲ２および配列番号２４のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２５のＣＤＲ１、配列番号２６のＣＤＲ２および配列番号２７のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２８のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２および配列番号３０のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号３１のＣＤＲ１、配列番号３２のＣＤＲ２および配列番号３３のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号３４のＣＤＲ１、配列番号３５のＣＤＲ２および配列番号３６のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号３７のＣＤＲ１、配列番号３８のＣＤＲ２および配列番号３９のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号４０のＣＤＲ１、配列番号４１のＣＤＲ２および配列番号４２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号４３のＣＤＲ１、配列番号４４のＣＤＲ２および配列番号４５のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号４６のＣＤＲ１、配列番号４７のＣＤＲ２および配列番号４８のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号４９のＣＤＲ１、配列番号５０のＣＤＲ２および配列番号５１のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号５２のＣＤＲ１、配列番号５３のＣＤＲ２および配列番号５４のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号５５のＣＤＲ１、配列番号５６のＣＤＲ２および配列番号５７のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号５８のＣＤＲ１、配列番号５９のＣＤＲ２および配列番号６０のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号６１のＣＤＲ１、配列番号６２のＣＤＲ２および配列番号６３のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号６４のＣＤＲ１、配列番号６５のＣＤＲ２および配列番号６６のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号６７のＣＤＲ１、配列番号６８のＣＤＲ２および配列番号６９のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７０のＣＤＲ１、配列番号７１のＣＤＲ２および配列番号７２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７３のＣＤＲ１、配列番号７４のＣＤＲ２および配列番号７５のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７６のＣＤＲ１、配列番号７７のＣＤＲ２および配列番号７８のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号７９のＣＤＲ１、配列番号８０のＣＤＲ２および配列番号８１のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号８２のＣＤＲ１、配列番号８３のＣＤＲ２および配列番号８４のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号８５のＣＤＲ１、配列番号８６のＣＤＲ２および配列番号８７のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号８８のＣＤＲ１、配列番号８９のＣＤＲ２および配列番号９０のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号９１のＣＤＲ１、配列番号９２のＣＤＲ２および配列番号９３のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号９４のＣＤＲ１、配列番号９５のＣＤＲ２および配列番号９６のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号９７のＣＤＲ１、配列番号９８のＣＤＲ２および配列番号９９のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１００のＣＤＲ１、配列番号１０１のＣＤＲ２および配列番号１０２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１０３のＣＤＲ１、配列番号１０４のＣＤＲ２および配列番号１０５のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１０６のＣＤＲ１、配列番号１０７のＣＤＲ２および配列番号１０８のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１０９のＣＤＲ１、配列番号１１０のＣＤＲ２および配列番号１１１のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１１２のＣＤＲ１、配列番号１１３のＣＤＲ２および配列番号１１４のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１１５のＣＤＲ１、配列番号１１６のＣＤＲ２および配列番号１１７のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１１８のＣＤＲ１、配列番号１１９のＣＤＲ２および配列番号１２０のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１２１のＣＤＲ１、配列番号１２２のＣＤＲ２および配列番号１２３のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１２４のＣＤＲ１、配列番号１２５のＣＤＲ２および配列番号１２６のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１２７のＣＤＲ１、配列番号１２８のＣＤＲ２および配列番号１２９のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１３０のＣＤＲ１、配列番号１３１のＣＤＲ２および配列番号１３２のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１３３のＣＤＲ１、配列番号１３４のＣＤＲ２および配列番号１３５のＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含む。
他の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、前記のＶＬドメインに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む。
ＣＭＶに結合する単離された抗原結合性タンパク質は、本発明のいずれかの抗原結合性タンパク質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１以上を含む少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含みうる（表２を参照されたい）。特定の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、本発明の抗原結合性タンパク質のＣＤＲの３個を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１３６のＣＤＲ１、配列番号１３７のＣＤＲ２および配列番号１３８のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１３９のＣＤＲ１、配列番号１４０のＣＤＲ２および配列番号１４１のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１４２のＣＤＲ１、配列番号１４３のＣＤＲ２および配列番号１４４のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１４５のＣＤＲ１、配列番号１４６のＣＤＲ２および配列番号１４７のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１４８のＣＤＲ１、配列番号１４９のＣＤＲ２および配列番号１５０のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１５１のＣＤＲ１、配列番号１５２のＣＤＲ２および配列番号１５３のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１５４のＣＤＲ１、配列番号１５５のＣＤＲ２および配列番号１５６のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１５７のＣＤＲ１、配列番号１５８のＣＤＲ２および配列番号１５９のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１６０のＣＤＲ１、配列番号１６１のＣＤＲ２および配列番号１６２のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１６３のＣＤＲ１、配列番号１６４のＣＤＲ２および配列番号１６５のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１６６のＣＤＲ１、配列番号１６７のＣＤＲ２および配列番号１６８のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１６９のＣＤＲ１、配列番号１７０のＣＤＲ２および配列番号１７１のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７２のＣＤＲ１、配列番号１７３のＣＤＲ２および配列番号１７４のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７５のＣＤＲ１、配列番号１７６のＣＤＲ２および配列番号１７７のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１７８のＣＤＲ１、配列番号１７９のＣＤＲ２および配列番号１８０のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１８１のＣＤＲ１、配列番号１８２のＣＤＲ２および配列番号１８３のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１８４のＣＤＲ１、配列番号１８５のＣＤＲ２および配列番号１８６のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１８７のＣＤＲ１、配列番号１８８のＣＤＲ２および配列番号１８９のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１９０のＣＤＲ１、配列番号１９１のＣＤＲ２および配列番号１９２のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１９３のＣＤＲ１、配列番号１９４のＣＤＲ２および配列番号１９５のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１９６のＣＤＲ１、配列番号１９７のＣＤＲ２および配列番号１９８のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号１９９のＣＤＲ１、配列番号２００のＣＤＲ２および配列番号２０１のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２０２のＣＤＲ１、配列番号２０３のＣＤＲ２および配列番号２０４のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２０５のＣＤＲ１、配列番号２０６のＣＤＲ２および配列番号２０７のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２０８のＣＤＲ１、配列番号２０９のＣＤＲ２および配列番号２１０のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２１１のＣＤＲ１、配列番号２１２のＣＤＲ２および配列番号２１３のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２１４のＣＤＲ１、配列番号２１５のＣＤＲ２および配列番号２１６のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２１７のＣＤＲ１、配列番号２１８のＣＤＲ２および配列番号２１９のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２２０のＣＤＲ１、配列番号２２１のＣＤＲ２および配列番号２２２のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２２３のＣＤＲ１、配列番号２２４のＣＤＲ２および配列番号２２５のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２２６のＣＤＲ１、配列番号２２７のＣＤＲ２および配列番号２２８のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２２９のＣＤＲ１、配列番号２３０のＣＤＲ２および配列番号２３１のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２３２のＣＤＲ１、配列番号２３３のＣＤＲ２および配列番号２３４のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２３５のＣＤＲ１、配列番号２３６のＣＤＲ２および配列番号２３７のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２３８のＣＤＲ１、配列番号２３９のＣＤＲ２および配列番号２４０のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２４１のＣＤＲ１、配列番号２４２のＣＤＲ２および配列番号２４３のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２４４のＣＤＲ１、配列番号２４５のＣＤＲ２および配列番号２４６のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２４７のＣＤＲ１、配列番号２４８のＣＤＲ２および配列番号２４９のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２５０のＣＤＲ１、配列番号２５１のＣＤＲ２および配列番号２５２のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２５３のＣＤＲ１、配列番号２５４のＣＤＲ２および配列番号２５５のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２５６のＣＤＲ１、配列番号２５７のＣＤＲ２および配列番号２５８のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２５９のＣＤＲ１、配列番号２６０のＣＤＲ２および配列番号２６１のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２６２のＣＤＲ１、配列番号２６３のＣＤＲ２および配列番号２６４のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２６５のＣＤＲ１、配列番号２６６のＣＤＲ２および配列番号２６７のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、配列番号２６８のＣＤＲ１、配列番号２６９のＣＤＲ２および配列番号２７０のＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。
他の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、前記のＶＨドメインに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む。
もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、ヒト化モノクローナル抗体（これに限定されるものではない）を含むヒト化抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質である。そのようなヒト化抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の例には、実施例９に開示されている軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む抗原結合性タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
１つの実施形態においては、該ヒト化抗原結合性タンパク質は配列番号６３１または６３２のＶＬドメインおよび配列番号６３３または６３４のＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該ヒト化抗原結合性タンパク質は配列番号６３５または６３６のＶＬドメインおよび配列番号６３７または６３８のＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は配列番号６３９または６４０のＶＬドメインおよび配列番号６４１のＶＨドメインを含む。
１つの実施形態においては、抗原結合性タンパク質は配列番号６４２または６４３のＶＬドメインおよび配列番号６４４または６４５のＶＨドメインを含む。
他の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、前記のＶＬおよびＶＨドメインに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む。
本明細書中で用いる「抗原結合性タンパク質」なる語は、抗原に結合する部分と、所望により、抗原への抗原結合性部分の結合を促進するコンホメーションを抗原結合性部分が取ることを可能にするスカフォールドまたはフレームワーク部分とを含むタンパク質を意味する。抗原結合性タンパク質の例には、抗体およびその抗原結合性フラグメントが含まれ、限定的なものではないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびラクダ化単一ドメイン抗体が含まれる。該抗原結合性タンパク質は、例えば、抗体由来タンパク質スカフォールドまたは代替的タンパク質スカフォールドまたは人工的スカフォールド（グラフト化ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含むもの）を含みうる。そのようなスカフォールドには、例えば、抗原結合性タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された突然変異を含む抗体由来スカフォールド、および例えば生体適合性重合体を含む完全合成スカフォールドが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１−１２９（２００３）；Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４（２００４）を参照されたい。また、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）が使用可能であり、同様に、フィブロネクチン成分をスカフォールドとして利用した抗体模倣体に基づくスカフォールドも使用されうる。
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、少なくとも１つまたは２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてはＶＨと略される）と、少なくとも１つまたは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてはＶＬと略される）とを含むタンパク質を意味する。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域に更に細分されうる。フレームワーク領域およびＣＤＲの度合は厳密に定められている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。好ましくは、各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で位置している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部を更に含みうる。１つの実施形態においては、抗体は２個の免疫グロブリン重鎖と２個の免疫グロブリン軽鎖との四量体であり、ここで、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は例えばジスルフィド結合により相互連結されている。重鎖定常領域は３個のドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は１個のドメイン、すなわち、ＣＬから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合をもたらす。「抗体」なる語はＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（およびそのサブタイプ）の無傷免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダ型のものでありうる。
軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は軽鎖可変領域ＣＤＲおよび重鎖可変領域ＣＤＲからのアミノ酸残基を含む。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多い可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要するとは解釈されない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
本明細書中で用いる「キメラ抗体」は、第１抗体からの可変ドメインと第２抗体からの定常ドメインとを有する抗体であり、ここで、第１抗体および第２抗体は異なる種からのものである（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。典型的には、可変ドメインはげっ歯類のような実験動物からの抗体（「親抗体」）から得られ、定常ドメイン配列はヒト抗体から得られ、その結果、生じるキメラ抗体は、ヒト対象において免疫応答を惹起する可能性が、親（例えば、げっ歯類）抗体より低いであろう。
本明細書中で用いる「ヒト化抗体」なる語は、ヒト抗体および非ヒト（例えば、マウス、ラット）抗体の両方からの配列を含有する抗体の形態を意味する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、超可変ループの全部または実質的に全部は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、所望により、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含みうる。
「完全ヒト抗体」なる語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。完全ヒト抗体は、マウスまたはラットにおいて、マウスまたはラット細胞において、あるいはマウスまたはラット細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生された場合には、マウスまたはラット炭水化物鎖を含有しうる。
本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」なる語は抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合される抗原に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗体結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「Ｆａｂフラグメント」は１個の軽鎖およびＣＨ１および１個の重鎖の可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とはジスルフィド結合を形成し得ない。「Ｆａｂフラグメント」は抗体のパパイン切断の産物でありうる。
「Ｆａｂ’フラグメント」は１個の軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１個の重鎖の部分または断片、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域を含有し、その結果、２個のＦａｂ’フラグメントの、２個の重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成しうる。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２個の軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域の部分を含有する２個の重鎖を含有し、その結果、それらの２個の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、それらの２個の重鎖の間のジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ’フラグメントから構成される。「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は抗体のペプシン切断の産物でありうる。
「Ｆｖ領域」は重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
本明細書中で用いる「ラクダ化抗体」なる語は、ラクダ化重鎖Ｉｇに由来する単一ドメイン抗体を意味する（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｎｕｔｔａｌｌら，２０００，Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：２５３；ＲｅｉｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５；国際公開番号ＷＯ ９４／０４６７８およびＷＯ ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい）。
本明細書中で用いる「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体なる語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントであって、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖内に存在するものを意味する。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの総説としては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際特許出願公開番号ＷＯ ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号を参照されたい。
本明細書中で用いる「ドメイン抗体」なる語は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合には、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーにより共有結合されて２価ドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の、２個のＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的化しうる。
本明細書中で用いる「２価抗体」なる語は２個の抗原結合部位を含む。幾つかの場合には、それらの２個の結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、２価抗体は、異なる抗原特異性を各抗原結合部位が有するように、「二重特異性」でありうる。異なる抗原特異性は同一分子上の異なる抗原であることが可能であり、あるいはそれらは、異なる分子上の抗原に対するものでありうる。
本明細書中で用いる「ジアボディ」なる語は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、同一ポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む。同一鎖上で２個のドメイン間のペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、それらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとペア形成することを強要され、２個の抗原結合部位を生成する。ジアボディは、例えばＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８に、より詳細に記載されている。操作された抗体変異体の総説としては、全般的には、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を参照されたい。
本明細書中で用いる「組換え体」なる語は、天然に存在しないポリペプチドまたは核酸を意味する。「組換え」抗体なる語は、組換え手段により製造、発現、作製または単離された抗体、例えば、宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアル（組合せ）抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、あるいは他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むいずれかの他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を意味する。そのような組換え抗体は、ヒト化、ＣＤＲグラフト化、キメラ、インビトロ作製（例えば、ファージ提示により）抗体を含み、所望により、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含みうる。組換えポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド配列内に一緒に存在する２以上のヌクレオチド配列を含み、ここで、それらの２つの配列は天然で一緒に（例えば、結合または融合状態で）は見出されない。例えば、それらの配列は、天然で通常は一緒には見出されない、或るポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列およびプロモーター、あるいはベクターおよび異種ヌクレオチド配列である。
本明細書中で用いる「単離（された）」または「精製（された）」なる語は、天然状態で通常付随している他の分子から少なくとも部分的に分離された分子（例えば、抗体、核酸など）に関するものである。「単離または精製されたポリペプチド」は、他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、細胞残渣および増殖培地を実質的に含有しない。「単離または精製された核酸」は、天然状態で当該ポリヌクレオチドに通常は隣接している核酸から少なくとも部分的に分離されている。したがって、通常は付随していない調節またはコード配列に例えば組換え技術の結果として融合しているポリヌクレオチドは、本明細書においては、単離されているとみなされる。そのような分子は、例えば宿主細胞の染色体内または核酸溶液中に存在する場合でさえも、単離されているとみなされる。一般に、「単離（された）」および「精製（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在を意味するものではなく、また、水、バッファーもしくは塩が該分子の実験的または治療的用途を実質的に妨げる量で存在するのでない限り、水、バッファーもしくは塩の非存在を意味するものではない。本発明の抗原結合性タンパク質、および本発明の抗原結合性タンパク質をコードする核酸は単離／精製されている。
本明細書中で用いる「相同性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の間の配列類似性を意味する。それらの２つの比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占拠されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の割合（％）は、２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算したものである。例えば、２つの配列における位置の１０個中６個が、それらの配列が最適にアライメントされた場合に、一致（マッチ）している又は相同である場合、それらの２つの配列は６０％相同である。一般に、該比較は、最大相同性（％）を与えるように２つの配列がアライメントされた場合に行われる。
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、全てのそのような表示は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、トランスファー（転移）の数には無関係に、初代対象細胞およびそれに由来する培養を含む。また、意図的または非意図的な突然変異ゆえに、全ての後代が厳密に同一のＤＮＡ含量を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞において選別されたものと同じ機能または生物学的特性を有する突然変異後代が含まれる。異なる表示が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再編成免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を意味する。未再編成免疫グロブリン配列の任意の適当な起源が用いられうる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから入手可能である。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１に記載されているとおりに入手可能である。
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抗原結合性タンパク質誘導体
他の実施形態においては、本発明は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の誘導体である抗原結合性タンパク質を提供する。本発明の抗原結合性タンパク質誘導体はＣＭＶに特異的に結合し、本明細書に開示されている抗体（例えば、表１および２ならびに実施例９におけるもの）のＶＬドメインおよびＶＨドメインに対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する一方で、所望の結合および機能特性（例えば、ＣＭＶ中和）を尚も示す。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメインを含む一方で、所望の結合および機能特性を尚も示す。
本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、ＣＭＶに特異的に結合する誘導体であって、本発明の抗原結合性タンパク質のＶＬドメインおよびＶＨドメインに関して本明細書に開示されているＣＤＲ（例えば、表１および２ならびに実施例９におけるもの）に対して少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ＶＬドメインのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびＶＨドメインのＣＤＲを有する一方で、所望の結合および機能特性（例えば、ＣＭＶ中和）を尚も示す誘導体をも含む。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、所望の結合および機能特性を尚も示す一方で、０、１、２、３個まで又はそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する開示されているＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲを含む。
配列同一性は、２つの配列が最適にアライメントされた場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が同等位置において同一である度合を意味する。配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大一致が得られるように選択される。以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
典型的には、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は、（親抗原結合性タンパク質と比較された場合）そのＣＭＶ結合および／または中和活性の少なくとも１０％（その活性がモル濃度に基づいて表された場合）を保有する。好ましくは、本発明の抗原結合性タンパク質誘導体は親抗原結合性タンパク質としてのＣＭＶ結合アフィニテイおよび／または中和活性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保有する。
本明細書中で用いる「保存的置換」なる語は、タンパク質中のアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸により置換されることを意味し、その結果、該変化は、しばしば、該タンパク質の生物活性を変化させることなく又は実質的に変化させることなく施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄ．）を参照されたい）。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。本発明の抗原結合性タンパク質の種々の実施形態は、本明細書（例えば、表１および２ならびに実施例９）に開示されている配列のポリペプチド鎖、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０個まで又はそれ以上の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド鎖を含む。典型的な保存的置換を表３に記載する。
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本発明の抗原結合性タンパク質の機能保存的誘導体も本発明により想定される。本明細書中で用いる「機能保存的誘導体」なる語は、抗原アフィニティおよび／または特異性および／または中和活性のような所望の特性を変化させることなく１以上のアミノ酸残基が変化している抗原結合性タンパク質を意味する。そのような変異体には、アミノ酸が、類似特異性を有するアミノ酸で置換されたもの、例えば、表３の保存的アミノ酸置換体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
また、高いアフィニティおよび特異性でＣＭＶに結合する能力を尚も示し、および／またはＣＭＶを中和しうる一方で、１、２、３、４または５個まで又はそれ以上のアミノ酸置換を有する本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質のＶＨドメインを含む組換えポリペプチド、および本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質のＶＬドメインを含む組換えポリペプチドを提供する。
もう１つの実施形態においては、本明細書に記載されているＶＬドメインまたはＶＨドメインの１以上に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または５０％の配列相同性を有するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを有し、ＣＭＶへの特異的結合を示す、および／またはＣＭＶを中和しうる抗原結合性タンパク質を提供する。もう１つの実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質は、１、２、３、４または５個まで又はそれ以上のアミノ酸置換を有するＶＬドメインおよびＶＨドメイン（シグナル配列を伴う又は伴わない）を含み、ＣＭＶへの特異的結合を示し、および／またはＣＭＶを中和しうる。
核酸
本発明は更に、本明細書に開示されている抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸を含む。
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（配列番号１〜１３５）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む抗原結合性タンパク質をコードする。
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（配列番号１３６〜２７０）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗原結合性タンパク質をコードする。
１つの実施形態においては、該組換え核酸は、少なくとも１つの軽鎖（ＶＬ）ドメインと少なくとも１つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む抗原結合性タンパク質をコードし、ここで、ＶＬドメインは、配列番号１〜１３５から選択される配列を有する少なくとも３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号１３６〜２７０から選択される配列を有する少なくとも３つのＣＤＲを含む。１つの実施形態においては、単離された核酸は、本明細書に開示されている軽鎖可変領域（表１を参照されたい）および重鎖可変領域（表２を参照されたい）をコードする。幾つかの実施形態においては、単離された核酸は単一核酸分子上で軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の実施形態においては、軽鎖および重鎖は別個の核酸分子上でコードされる。もう１つの実施形態においては、該核酸は更にシグナル配列をコードする。
本発明は更に、本明細書に開示されている抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸を含む。一般に、該核酸は、中程度または高度なストリンジェンシーの条件下、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質をコードする、そしてまた、ＣＭＶに特異的に結合する能力を維持する抗原結合性タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする。第１核酸分子が第２核酸分子に「ハイブリダイズ可能」と言えるのは、温度および溶液イオン強度の適当な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）、第１核酸分子の一本鎖形態が第２核酸分子にアニーリングしうる場合である。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な中程度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は４０％ ホルムアミド、ならびに５×または６×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ、４２℃である。高度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は５０％ ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ）、４２℃、または所望により、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）である。ハイブリダイゼーションは、それらの２つの核酸が相補的配列を含有することを要する。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸のハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェンシーは核酸の長さ、および相補性の度合、当技術分野でよく知られた変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合が大きければ大きいほど、それらの核酸がハイブリダイズしうるストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチドを超える長さのハイブリッドの場合、融解温度を計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸、例えばオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲，１１．７−１１．８を参照されたい）。
また、抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質誘導体をコードする核酸も本発明に含まれる。
本発明は、本発明の組換え核酸を含む発現ベクターをも提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞、および抗原結合性タンパク質をコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培地内で培養し、該宿主細胞または培養培地から該抗原結合性タンパク質を単離することを含む、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の製造方法も提供する。
抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の生物学的特性
本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、ＣＭＶに結合すること、および好ましくはＣＭＶを中和することが可能である。
ＣＭＶへの結合は、当技術分野で公知の方法により測定されうる。例えば、結合は抗原滴定ＥＬＩＳＡ（ＥＩＡ）において測定される。抗原は、組換えウイルスタンパク質もしくはその一部であっても精製組換え復帰突然変異体ビリオンであっても、９６ウェルマイクロタイタープレート上に固定化される。固定化抗原に対する抗原結合性タンパク質の反応性はＥＩＡにおいて測定される。対照抗原結合性タンパク質と比較された場合の試験抗原結合性タンパク質の強力な反応性シグナルはウイルス抗原に対する試験抗原結合性タンパク質の高いアフィニティを反映する。
ＣＭＶを中和する抗原結合性タンパク質の能力は当技術分野で公知の方法により測定されうる。例えば、中和はウイルス中和アッセイにおいて測定される。抗原結合性タンパク質を一定数の感染性ＣＭＶビリオンと混合し、該混合物を、ＣＭＶ感染に感受性の細胞（すなわち、ＡＲＰＥ−１９またはＭＲＣ−５細胞のような上皮細胞）に適用する。ＣＭＶに感染した細胞は、ウイルス抗原、例えばウイルス最初期（ＩＥ）抗原の発現に関してアッセイすることにより検出されうる。抗原結合性タンパク質の非存在下で感染した細胞と比較された場合のウイルス抗原発現を伴う細胞の数の減少は中和能を反映する（すなわち、該抗原結合性タンパク質は細胞に対するウイルス感染性を低減しうる）。ウイルス感染性の低減は、細胞へのＣＭＶの結合を該抗原結合性タンパク質が低減しうること、細胞膜とのウイルス融合を該抗原結合性タンパク質が低減しうること、および／または該抗原結合性タンパク質が低減しうること（これらに限定されるものではない）を含むいずれかのメカニズムによるものでありうる。
競合抗原結合性タンパク質
本発明はまた、ＣＭＶ上の本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかと同じエピトープまたは重複したエピトープに結合する抗原結合性タンパク質を含む。そのような競合性抗原結合性タンパク質は、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質のいずれかの結合を交差遮断しうる。１つの実施形態においては、該競合性抗原結合性タンパク質は、表１に開示されているＣＤＲを含む軽鎖可変領域および／または表２に開示されているＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む抗原結合性タンパク質を交差遮断しうる。もう１つの実施形態においては、該競合性抗原結合性タンパク質は、表１に開示されている軽鎖可変領域および／または表２に開示されている重鎖可変領域を含む抗原結合性タンパク質を交差遮断しうる。
第１抗原結合性タンパク質が第２抗原結合性タンパク質の結合を交差遮断するとみなされるのは、飽和までの第１抗原結合性タンパク質への標的の前結合が、該標的の半最大結合を達成するために必要な第２抗原結合性タンパク質の濃度を２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００倍またはそれ以上増加させる場合である。
あるいは、第１抗原結合性タンパク質が第２抗原結合性タンパク質の結合を交差遮断するとみなされるのは、それぞれが結合するエピトープが同じである又は有意に重複している場合である。１つの実施形態においては、結晶構造解析によりエピトープ結合の決定を行う。
標的
ＣＭＶは、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ニューロン、平滑筋細胞、肝細胞および間質細胞を含む種々の細胞にインビボで感染する（Ｐｌａｃｈｔｅｒら，１９９６，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４６：１９５）。臨床ＣＭＶ分離体は種々の細胞型において複製し、実験株ＡＤ１６９（Ｅｌｅｋ ＆ Ｓｔｅｒｎ，１９７４，Ｌａｎｃｅｔ １：１）およびタウン（Ｔｏｗｎｅ）（Ｐｌｏｔｋｉｎら，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１２：５２１）はほぼ専ら線維芽細胞において複製する（Ｈａｈｎら，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３）。線維芽細胞における該ウイルスの最終的順応および連続継代から生じる、向性における制限は、弱毒化のマーカーに要求される（Ｇｅｒｎａら，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２７５；Ｇｅｒｎａら，２００２，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａら，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８４：１４３１；Ｄａｒｇａｎら，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１：１５３５）。ヒトＣＭＶ実験株において上皮細胞、内皮細胞、白血球および樹状細胞の向性の喪失を引き起こす突然変異は以下の３つのオープンリーディングフレームに位置づけられている：ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１（Ｈａｈｎら，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ，２００５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０；ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ，２００５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：１８１５３）。生化学的および再構成研究は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１がｇＨ／ｇＬスカフォールド上に集合して五量体ｇＨ複合体を形成することを示している（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ，２００５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎら，２００８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ビリオンにけるこの複合体の回復は実験株におけるウイルス上皮向性を回復させる（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ，２００５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０）。
内皮および上皮向性の喪失が、タウン（Ｔｏｗｎｅ）のようなワクチンとして既に評価されているものにおける欠損として疑われている（Ｇｅｒｎａら，２００２，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３；Ｇｅｒｎａら，２００３，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８４：１４３１）。自然ＣＭＶ感染のヒト被験者からの血清中の中和抗体は、線維芽細胞侵入に対する場合より１５倍以上高い、ウイルス上皮侵入に対する活性を有する（Ｃｕｉら，２００８ Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：５７６０）。一次感染を有するヒトはウイルスの内皮および上皮侵入に対しては中和抗体を迅速に産生するが、ウイルスの線維芽細胞侵入に対しては中和抗体を遅く産生するに過ぎない（Ｇｅｒｎａ，２００８ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８９：８５３）。更に、タウン（Ｔｏｗｎｅ）ワクチンが投与されたヒト被験者からの免疫血清中にはウイルスの上皮および内皮侵入に対する中和活性は存在しない（Ｃｕｉら，２００８ Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：５７６０）。より最近になって、ＣＭＶ感染を有する４名のドナーからのヒトモノクローナル抗体のパネルが記載され、五量体ｇＨ複合体の抗原を認識するパネルからの、より強力な中和クローンが記載された（Ｍａｃａｇｎｏら，２０１０ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１００５）。
本明細書中で用いる「五量体ｇＨ複合体」または「ｇＨ複合体」なる語はＣＭＶビリオンの表面上の５つのウイルスタンパク質の複合体を意味する。該複合体は、ｇＨ／ｇＬスカフォールド上に集合したＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１によりコードされるタンパク質から構成される（ＷａｎｇおよびＳｈｅｎｋ，２００５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎら，２００８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。ＣＭＶ株ＡＤ１６９からの複合体タンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ ７８３７９７．１（ＵＬ１２８）、ＮＰ ０４００６７（ＵＬ１３０）、ＣＡＡ３５２９４．１（ＵＬ１３１）、ＮＰ ０４０００９（ｇＨ；ＵＬ７５としても公知）およびＮＰ ７８３７９３（ｇＬ；ＵＬ１１５としても公知）に示されている。幾つかの弱毒化ＣＭＶ株はＵＬ１３１において１以上の突然変異を有していて、該タンパク質は発現されず、したがってｇＨ複合体は形成されない。
本明細書中で用いる「復帰突然変異体ウイルス」または「復帰突然変異体ビリオン」なる語は、回復したｇＨ複合体を有し、したがってそのエンベロープ上でｇＨ複合体を発現するＣＭＶを意味する。
抗原結合性タンパク質の製造方法
モノクローナル抗体である抗原結合性タンパク質は、親（例えば、げっ歯類）モノクローナル抗ＣＭＶ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を使用する当技術分野で一般に公知の方法により製造されうる。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）により最初に開発されたハイブリドーマ技術およびトリオーマ技術（Ｈｅｒｉｎｇら（１９８８）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．４７：２１１−２１６およびＨａｇｉｗａｒａら（１９９３）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ４：１５）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２およびＣｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ８０：２０２６−２０３０）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）およびサイトパルス大チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ ｌａｒｇｅ ｃｈａｍｂｅｒ ｃｕｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を使用する電場に基づく電気融合が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、マウス脾細胞を単離し、標準的なプロトコールに従い、ＰＥＧで又は電気融合によりマウス骨髄腫細胞系と融合させる。ついで、生じたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることが可能である。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単細胞浮遊液を、５０％ ＰＥＧを使用して、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）の数の６分の１と融合させることが可能である。細胞を平底マイクロタイタープレート内で約２×１０５細胞／ｍＬでプレーティングし、２０％ 胎児クローン血清、１８％ 「６５３」馴らし培地、５％ オリジン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＬ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；該融合の２４時間後にＨＡＴを加える）を含有する選択培地内で２週間のインキュベーションを行うことが可能である。２週間後、該ＨＡＴがＨＴで置換された培地内で細胞を培養することが可能である。ついで個々のウェルを抗ＸモノクローナルＩｇＧ抗体に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることが可能である。十分なハイブリドーマ増殖が生じたら、培地を通常１０〜１４日後に観察することが可能である。該抗体分泌ハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧに関して尚も陽性である場合には、抗ＣＭＶモノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングすることが可能である。ついで、特徴づけのために組織培養培地内で少量の抗体を産生させるために安定サブクローンをインビトロで培養することが可能である。
本明細書に開示されている抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は組換え法によって（例えば、前記の大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)Ｔ７発現系において）も製造されうる。この実施形態においては、本発明の抗原結合性タンパク質（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴ系プラスミド内に挿入し、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)／Ｔ７系内で発現させることが可能である。当技術分野で公知である組換え抗原結合性タンパク質を製造するための幾つかの方法が存在する。抗原結合性タンパク質の組換え製造のための方法の一例は米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するためのいずれかの公知方法により行われうる。哺乳類細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、遺伝子銃注入および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを包含する。また、ウイルスベクターにより哺乳類細胞内に核酸分子を導入することが可能である。細胞を形質転換する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。
抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、米国特許第６，３３１，４１５号に記載されている方法のいずれかによっても合成されうる。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質の発現のための宿主として入手可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系を包含する。哺乳類宿主細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を包含する。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するのかを決定することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合、該宿主細胞における該抗原結合性タンパク質の発現、またはより好ましくは、該宿主細胞が培養される培地内への該抗原結合性タンパク質の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって該宿主細胞を培養することにより、該抗原結合性タンパク質を製造する。
抗原結合性タンパク質は、標準的なタンパク質精製方法（例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー）を用いて培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗原結合性タンパク質の発現は幾つかの公知技術により増強されうる。例えば、グルタミンシンターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、一定条件下で発現を増強するための一般的アプローチである。ＧＳ系は欧州特許第０ ２１６ ８４６号、第０ ２５６ ０５５号および第０ ３２３ ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号において全体的または部分的に考察されている。
一般に、個々の細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、該細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有するであろう。したがって、抗原結合性タンパク質の個々のグリコシル化パターンは、該抗原結合性タンパク質を製造するために使用される個々の細胞系またはトランスジェニック動物に左右されるであろう。特定の実施形態においては、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗原結合性タンパク質が有利でありうる。なぜなら、これらの抗原結合性タンパク質は、インビトロおよびインビボの両方において、それらのフコシル化対応物より高い効力を典型的に示すことが示されているからである（Ｓｈｉｎｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および第７，２１４，７７５号を参照されたい）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらの抗原結合性タンパク質はそれ自体は免疫原性でない可能性がある。なぜなら、それらの炭水化物構造は、ヒト血清ＩｇＧにおいて存在する集団の正常集団であるからである。
二重特異性または二官能性抗原結合性タンパク質は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペアおよび２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗原結合性タンパク質である。二重特異性抗原結合性タンパク質は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法により製造されうる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照されたい。また、二重特異性抗原結合性タンパク質は「ジアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８）または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５−３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２）として形成されうる。
本発明の抗原結合性タンパク質には、本明細書に開示されている抗ＣＭＶ抗体の抗体フラグメントが含まれる。該抗体フラグメントにはＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれ、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によりＶＨ−ＣＨ１鎖に連結されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、今度は２つのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、ジスルフィド架橋が間に位置しているＦｃ領域の部分を含む。ＦｖフラグメントはＶＬまたはＶＨ領域である。
幾つかの実施形態においては、種々の定常ドメインが、本発明で提供されるＣＤＲに由来するヒト化ＶＬおよびＶＨ領域に連結されうる。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質の個々の意図される使用がエフェクター機能の改変を求めるものである場合には、ヒトＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用可能であり、あるいはハイブリッドＩｇＧ１／ＩｇＧ４が使用可能である。
ヒトＩｇＧ１抗体は長い半減期およびエフェクター機能、例えば補体活性化および抗体依存性細胞傷害性をもたらすが、そのような活性は該抗体の全ての用途に望ましいとは限らない可能性がある。そのような場合、例えばヒトＩｇＧ４定常ドメインが使用されうる。１つの実施形態においては、該ＩｇＧ４定常ドメインはＥＵ系における２２８位およびＫＡＢＡＴ系における２４１位に対応する位置において天然ヒトＩｇＧ４定常ドメイン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８６１．１）とは異なることが可能であり、この場合、適切な鎖内ジスルフィド結合形成を妨げうるＣｙｓ１０６およびＣｙｓ１０９（ＥＵ系におけるＣｙｓ２２６およびＣｙｓ２２９位ならびにＫＡＢＡＴ系におけるＣｙｓ２３９およびＣｙｓ２４２位に対応する）間の潜在的鎖間ジスルフィド結合を妨げるために天然Ｓｅｒ１０８はＰｒｏで置換される。Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｕｎｏｌ．３０：１０５を参照されたい。他の場合においては、半減期を増加させるために又はエフェクター機能を低減するために修飾された修飾ＩｇＧ１定常ドメインが使用されうる。
抗原結合性タンパク質の改変
親抗原結合性タンパク質の可変ドメイン内のフレームワーク残基に対する修飾を含むように、例えば、抗原結合性タンパク質の特性を改善するために、抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質が改変される実施形態が更に含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、該抗原結合性タンパク質の免疫原性を低下させるために行われる。これは通常、親抗原結合性タンパク質における可変ドメイン内の非ＣＤＲ残基（すなわち、フレームワーク残基）を、該抗原結合性タンパク質が使用されることになる種の免疫レパトワからの類似残基（例えば、ヒト用治療剤の場合にはヒト残基）で置換することにより達成される。そのような抗体は「ヒト化」抗原結合性タンパク質と称される。幾つかの場合には、改変（例えば、ヒト化）抗原結合性タンパク質の特性を変化させ、またはアフィニティを増強することが望ましい。１つのアプローチは１以上のフレームワーク残基を対応生殖系列配列へと「復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳しくは、体細胞突然変異を受けた抗原結合性タンパク質は、該抗原結合性タンパク質が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有しうる。そのような残基は、該抗原結合性タンパク質が由来する生殖系列配列とフレームワーク配列を比較することにより特定されうる。もう１つのアプローチは、該改変（例えば、ヒト化）抗原結合性タンパク質の位置の１以上において元の親残基へと復帰突然変異させること、例えば、フレームワーク残基の置換の過程において喪失した可能がある結合アフィニティを回復させることである（例えば、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，５３０，１０１号を参照されたい）。
もう１つのタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内または更には１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより該抗原結合性タンパク質の潜在的免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、米国特許第７，１２５，６８９号に更に詳細に記載されている。
特定の実施形態においては、以下のとおりに、最終的な抗原結合性タンパク質の、より高い化学的安定性を得るために、露出側鎖を含有する或るアミノ酸を別のアミノ酸残基へと変化させることが望ましいであろう。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じ、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらすことが可能であり、該残基はポリペプチド鎖内にねじれ（キンク）を導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）。ある実施形態においては、本開示の抗原結合性タンパク質はアスパラギン異性部位を含有しない。
例えば、特にＣＤＲ内の、いずれかのＡｓｎ−Ｇｌｙ配列におけるイソアスパルタートの形成の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）残基はＧｌｎまたはＡｌａへと改変されうる。同様の問題はＡｓｐ−Ｇｌｙ配列において生じうる。ＲｅｉｓｓｎｅｒおよびＡｓｗａｄ（２００３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６０：１２８１。イソアスパルタート形成は抗体のその標的抗原への結合を減弱し、または完全に阻止しうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４を参照されたい。１つの実施形態においては、該アスパラギンはグルタミン（Ｇｌｎ）へと改変される。小さなアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミンに隣接して存在する場合にはより高い率で生じる脱アミド化の可能性を低減するために、アスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接したアミノ酸を改変することも望ましいかもしれない。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ＆ Ｋｏｌｂｅ（１９９４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．６６２：２６１を参照されたい。また、抗原結合アフィニティを低減し、そしてまた、最終抗体調製物における分子不均一性に寄与するメチオニン硫黄の酸化の可能性を低減するために、ＣＤＲ内のいずれかのメチオニン残基（典型的には溶媒露出Ｍｅｔ）がＬｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅへと改変されうる（同誌）。１つの実施形態においては、メチオニンはアラニン（Ａｌａ）へと改変される。また、Ａｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の潜在的な切断を妨げ又は最小にするために、ＣＤＲにおいて見出されるいずれかのＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せをＧｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｓｎ−Ａｌａへと改変することが望ましいかもしれない。ついで、そのような置換を有する抗原結合性タンパク質をスクリーニングして、該置換がＣＭＶに対する抗体のアフィニティもしくは特異性または他の所望の生物活性を、許容し得ないレベルに低減しないことを確認する。
Figure 2016521711
ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲの変異は、独立して、任意の組合せで選択されうる。また、所望の活性または結合能が維持される限り、本明細書に記載されている任意の変異は、独立して、任意の組合せで選択されうる。
Ｆｃ領域の改変
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質はまた、Ｆｃ領域内の修飾を含むように、典型的には、抗原結合性タンパク質の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能（例えば、抗原依存性細胞傷害性）の１以上を変化させるために改変されうる。更に、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は化学的に修飾可能であり（例えば、１以上の化学的部分が該抗原結合性タンパク質に結合可能である）、あるいは、再び抗原結合性タンパク質の機能特性の１以上を改変するために、そのグリコシル化を改変するように修飾されうる。これらの実施形態のそれぞれは後記に更に詳細に記載されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、改変されたエフェクター機能をもたらすための、修飾（または遮断）されたＦｃ領域を有する抗原結合性タンパク質をも含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２を参照されたい。そのような修飾は、診断および療法における可能な有益な効果を伴って、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために用いられうる。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加が含まれる。Ｆｃに対する変化はまた、治療用抗原結合性タンパク質における抗体の半減期を改変することが可能であり、それほど頻繁でない投与ならびにそれによる便利さの向上および物質の使用の減少を可能にする。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４−３５を参照されたい。
１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、重鎖定常領域のヒンジ領域内の２２８位に対応する位置におけるセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ；ＥＵインデックス）を含むＩｇＧ４抗体の抗体またはそのフラグメントである。この突然変異はヒンジ領域内の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を排除することが報告されている（Ａｎｇａｌら，前掲；２４１位はＫａｂａｔ番号付け系に基づく）。
１つの実施形態においては、ＣＨ１のヒンジ領域は、該ヒンジ領域内のシステイン残基の数が増加または減少するように修飾される。このアプローチは米国特許第５，６７７，４２５号に更に詳細に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進させるために、または抗体の安定性を増強もしくは低減するために改変される。
もう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許６，２７７，３７５号に記載されているとおり、以下の突然変異の１以上が導入されうる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されているとおり、生物学的半減期を増加させるために、該抗原結合性タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合性エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
更に他の実施形態においては、該抗原結合性タンパク質のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗原結合性タンパク質がエフェクターリガンドに対する改変されたアフィニティを有するが、親抗原結合性タンパク質の抗原結合能を保有するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基で置換されうる。アフィニティが改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に更に詳細に記載されている。
もう１つの例においては、アミノ酸２３１位および２３９位における１以上のアミノ酸残基を改変して、それにより、補体を固定する該抗原結合性タンパク質の能力を改変する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１に更に詳細に記載されている。
更にもう１つの例においては、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらす該抗原結合性タンパク質の能力を増強もしくは低減するために、および／またはＦｃγ受容体に対する該抗原結合性タンパク質のアフィニティを増強もしくは低減するために、以下の位置：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９位における１以上のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。このアプローチはＰＣＴ公開ＷＯ ００／４２０７２に更に詳細に記載されている。更に、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位が位置決定されており、改善された結合を示す変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９位における特定の突然変異はＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。また、以下の組合せ突然変異体はＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
１つの実施形態においては、エフェクター機能をもたらす該抗原結合性タンパク質の能力を低減するために、および／または抗炎症特性を増強するために、残基２４３および２６４を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。１つの実施形態においては、２４３位および２６４位における残基をアラニンへと変化させることにより、該抗原結合性タンパク質のＦｃ領域を修飾する。１つの実施形態においては、エフェクター機能をもたらす抗体の能力を低減するために、および／または抗炎症特性を増強するために、残基２４３、２６４、２６７および３２８を修飾することにより、Ｆｃ領域を修飾する。
更にもう１つの実施形態においては、該抗原結合性タンパク質は特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、非グリコシル化抗原結合性タンパク質（すなわち、該抗原結合性タンパク質はグリコシル化を欠く）が製造されうる。抗原結合性タンパク質のグリコシル化パターンは、例えば、抗原に対する該抗原結合性タンパク質のアフィニティまたはアビディティを増強する改変されうる。そのような修飾は、例えば、該抗原結合性タンパク質配列内のグリコシル化部位の１以上を改変することにより達成されうる。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位の１以上の除去をもたらし、それによりその部位におけるグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換が施されうる。そのような非グリコシル化は抗原に対する該抗体のアフィニティまたはアビディティを増強しうる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。
グリコシル化パターンが低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）または非フコシル化グリカンを含む抗原結合性タンパク質も製造されうる。例えば、低フコシル化抗原結合性タンパク質または非フコシル化抗原結合性タンパク質は、低減した量のフコシル化残基をグリカン上に有する。抗原結合性タンパク質は、増加した量の二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有するグリカンをも含みうる。そのような改変されたグリコシル化パターンは抗原結合性タンパク質のＡＤＣＣ能を増強することが実証されている。そのような修飾は、例えば、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するようにグリコシル化経路が遺伝的に操作された宿主細胞において該抗原結合性タンパク質を発現させることにより達成されうる。これらの細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗原結合性タンパク質を発現させて、改変されたグリコシル化を有する抗原結合性タンパク質を産生させるための宿主細胞として使用されうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９はフコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、その結果、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系において発現される抗原結合性タンパク質はそれらの炭水化物上にフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを使用するＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊により作製された（米国特許公開第２００４０１１０７０４号およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２）。もう１つの例としては、ＥＰ １ １７６ １９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載しており、そのような細胞系において発現される抗原結合性タンパク質は、α−１，６結合関連酵素を低減または除去することにより、低フコシル化を示す。ＥＰ １ １７６ １９５はまた、該抗原結合性タンパク質のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するための低い酵素活性を有する、または該酵素活性有さない細胞系、例えば、ラット黒色腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）を記載している。ＰＣＴ公開ＷＯ ０３／０３５８３５は変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載しており、これは、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力を低減し、また、その宿主細胞において発現される抗原結合性タンパク質の低フコシル化をもたらした（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照されたい）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合性タンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ ０６／０８９２３１に記載されているとおり、鶏卵内でも製造されうる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合性タンパク質は、植物細胞、例えばアオウキクサ（Ｌｅｍｎａ）において製造されうる（米国特許第７，６３２，９８３号）。植物系における抗原結合性タンパク質の製造方法は米国特許第６，９９８，２６７号および第７，３８８，０８１号に開示されている。ＰＣＴ公開ＷＯ ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載しており、該操作細胞系において発現される抗原結合性タンパク質は、該抗体のＡＤＣＣ活性の増強をもたらす増加した二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を示す（Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照されたい）。
あるいは、該抗原結合性タンパク質のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断除去されうる。例えば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は更に、下等真核宿主細胞、特に真菌宿主細胞、例えば酵母および糸状菌において産生されるものを含み、該細胞は、哺乳類またはヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている（例えば、Ｃｈｏｉら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５０２２−５０２７；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４−１２４６；Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１−１４４３を参照されたい）。現在使用されている哺乳類細胞系と比較した場合の、これらの遺伝的に修飾された宿主細胞の格別の利点は、該細胞内で製造される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルの制御が可能なことであり、その結果、特定のＮ−グリカン構造が優勢な糖タンパク質の組成物が製造されうる（例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号を参照されたい）。これらの遺伝的に修飾された宿主細胞は、特定のＮ−グリカン構造を主に有する抗原結合性タンパク質を製造するために使用されている（例えば、Ｌｉら（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５を参照されたい）。
また、酵母または糸状菌のような真菌は、フコシル化糖タンパク質を産生する能力を欠いているため、そのような細胞において産生される抗原結合性タンパク質は、該細胞がフコシル化糖タンパク質の産生のための酵素経路を含むように更に修飾されていない限り、フコースを欠くであろう（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００８１１２０９２を参照されたい）。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は更に、二分岐および多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含むフコシル化および非フコシル化ハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のようなＮ−グリカンを含むが、これらに限定されるものではない）を含む、下等真核宿主細胞において産生されるものを含む。
特定の実施形態においては、本発明において提供する抗原結合性タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有する抗原結合性タンパク質を含む。特定の態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは、該組成物中のハイブリッドＮ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
特定の実施形態においては、本発明において提供する抗原結合性タンパク質組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つの複合Ｎ−グリカンを有する抗原結合性タンパク質を含む。特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中の複合Ｎ−グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンはフコシル化されている。一般に、該フコースは、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，６−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌとのα１，２−結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，３−結合、または該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃとのα１，４−結合で存在する。
したがって、前記の糖タンパク質組成物の特定の態様においては、該グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，６−結合フコース；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，３−結合またはα１，４−結合フコース；あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを与えるα１，２−結合フコースで存在する。
更に詳細な態様においては、該抗原結合性タンパク質は、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン構造からなるＮ−グリカン（これらに限定されるものではない）を含む高マンノースＮ−グリカンを含む。
前記の更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは更に、フコシル化および非フコシル化二分岐および多アンテナ種を含む。
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているＮ−結合オリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。糖基のプロセシングは翻訳と同時にＥＲの内腔において生じ、翻訳後はＮ−結合糖タンパク質のためにゴルジ装置において継続する。
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。通常、Ｎ−グリカン構造は、非還元末端を左側に、そして還元末端を右側にして表される。Ｎ−グリカンの還元末端は、該タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基が結合している末端である。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「少（ｐａｕｃｉ）マンノースコア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数において異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐（分枝）構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」が挙げられ、ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をも有しうる。複合Ｎ−グリカンは、コアフコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換をも有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端における少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上の０個以上のマンノースとを有する。前記の種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム（糖形態）」とも称される。
複合Ｎ−グリカンに関しては、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は以下を意味する。「Ｇ−２」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ−１」なる語は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ０」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ１」なる語は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ２」なる語は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ１」なる語は、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ２」なる語は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味する。特に示されていない限り、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコースを欠くＮ−グリカン種を意味する。該用語が「Ｆ」を含む場合、「Ｆ」は、該Ｎ−グリカン種が該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１ＦおよびＡ２Ｆは全て、Ｎ−グリカンが、該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコース残基を更に含むことを示す。酵母および糸状菌のような下等真核生物は、通常、フコースを示すＮ−グリカンを産生しない。
多アンテナＮ−グリカンに関しては、「多アンテナＮ−グリカン」なる語は、該Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基上のＧｌｃＮＡｃ残基、または該Ｎ−グリカンの１，６アームおよび１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基のそれぞれにおいてＧｌｃＮＡｃ残基を更に含むＮ−グリカンを意味する。したがって、多アンテナＮ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられうる。「１−４」なる語は１、２、３または４個の残基を意味する。
二分岐Ｎ−グリカンに関しては、「二分岐Ｎ−グリカン」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ残基が該Ｎ−グリカンの還元末端においてマンノース残基に結合している、Ｎ−グリカンを意味する。二分岐Ｎ−グリカンは式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられることが可能であり、ここで、各マンノース残基はその非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。これに対して、多アンテナＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられる場合、該式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの、２つのアームの一方の非還元末端において、マンノース残基に結合しており、１つのＧｌｃＮＡｃ残基が、該Ｎ−グリカンの他方のアームの非還元末端において、マンノース残基に結合していることを示す。
抗原結合性タンパク質コンジュゲート
本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は化学的部分にコンジュゲート化（結合）されることも可能である。該化学的部分は、とりわけ、重合体、放射性核種、細胞毒性因子でありうる。特定の実施形態においては、該化学的部分は、対象の体内の該抗原結合性タンパク質の半減期を増加させる重合体である。適当な重合体には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）（これらに限定されるものではない）を包含する親水性重合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｌｅｅら（１９９９）（Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１）は、放射性金属キレーター（ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））に結合したＰＥＧに対して抗体をコンジュゲート化することを開示している。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質はまた、例えば９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈおよび４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅのような標識に対してコンジュゲート化されうる。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、例えば、その生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されることも可能である。抗原結合性タンパク質をペグ化するためには、典型的には、１以上のＰＥＧ基が抗原結合性タンパク質に結合する条件下、抗原結合性タンパク質を、反応性形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。特定の実施形態においては、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水溶性高分子）でのアルキル化反応またはアシル化反応により行われる。本明細書中で用いる「ポリエチレングリコール」なる語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれか、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを含むと意図される。ある実施形態においては、ペグ化されるべき抗体は非グリコシル化抗原結合性タンパク質である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗原結合性タンパク質に適用されうる。例えば、ＥＰ ０ １５４ ３１６およびＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照されたい。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、蛍光または化学発光標識、例えば発蛍光団、例えば希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジミウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識および安定フリーラジカルに対してコンジュゲート化されることも可能である。
該抗原結合性タンパク質を種々の部分にコンジュゲート化するための当技術分野で公知のいずれかの方法が利用可能であり、該方法は、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．（１９８２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７に記載されている方法を包含する。抗体のコンジュゲート化方法は常套手段であり、当技術分野において非常によく知られている。
抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の治療用途
更に、本明細書に開示されている単離された抗原結合性タンパク質での治療を要するヒト対象を含む対象の治療方法を提供する。治療方法は、受動免疫を得るために、本発明の１以上の抗原結合性タンパク質を対象に投与することを含む。
「対象（被験者）」は、ＣＭＶに感染している哺乳動物を意味する。好ましい実施形態においては、対象はヒトである。対象は予防的または治療的に治療されうる。予防的治療は、一次感染、再発性感染（すなわち、潜伏性ＣＭＶの再活性化から生じるもの）および重感染（すなわち、患者が既に罹患しているＣＭＶ株とは異なるＣＭＶ株での感染から生じるもの）を含むＣＭＶ感染の可能性または重症度を低減するための十分な防御免疫をもたらす。治療的治療は、ＣＭＶ感染の重症度を低減するために、または再発性もしくは重感染の可能性／重症度を低減するために行われうる。
本明細書中で用いる「受動免疫」なる語は抗原結合性タンパク質の形態での能動的体液性免疫の転移を意味する。受動免疫は、投与された抗原結合性タンパク質により認識される病原体に対する即時型防御効果を患者にもたらし、および／または病原体の感染に関連した少なくとも１つの病状を改善する。しかし、患者は該病原体に対する免疫記憶を生成せず、したがって、該病原体に対する防御が持続するためには、該投与抗原結合性タンパク質の投与を受け続けなければならない。好ましい実施形態においては、受動免疫を付与するために、モノクローナル抗体、より好ましくは、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を患者に投与する。
治療は、本発明の１以上の抗原結合性タンパク質またはそのフラグメントを含む医薬組成物を使用して行われうる。医薬組成物は一般集団、特に、ＣＭＶ感染（一次、再発性または重感染のいずれか）の増大したリスクを有する者、またはＣＭＶ感染が特に問題となる者（例えば、免疫無防備状態の個体、移植患者または妊娠女性）に投与されうる。１つの実施形態においては、妊娠中のＣＭＶ感染（一次、再発性または重感染のいずれか）の可能性を低減するために、出産可能年齢の女性、特に妊娠女性に本発明の１以上の抗原結合性タンパク質を投与する。
治療を要する者には、既に感染を有する者、および感染を有する傾向にある者、または感染の可能性の低減が望まれる者が含まれる。治療は、ＣＭＶ感染に関連した疾患の症状を改善し、ならびに／またはＣＭＶ感染（潜在性ＣＭＶの再活性化による感染を含む）の長さ及び／もしくは重症度を低減しうる。
ＣＭＶ感染（一次、再発性または重感染のいずれか）の増大したリスクを有する者には、低下した免疫を有する患者、または免疫低下につながる療法を受けている患者（例えば、癌に対する化学療法もしくは放射線療法を受けている又は免疫抑制薬を服用している者）が含まれる。本明細書中で用いる「低下した免疫」は、免疫応答が適切に機能しない又は健常成体のレベルで機能しないため、感染に抵抗する能力が低下した免疫系を意味する。低下した免疫を有する患者の例としては、乳児、幼児、高齢者、妊娠女性である患者、または免疫系の機能に影響を及ぼす疾患、例えばＨＩＶ感染もしくはエイズを有する患者が挙げられる。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、単独で、または互いに組合せて、またはＣＭＶ感染を治療もしくは予防するための他の物質と組合せて使用されうる。特定の実施形態においては、１５．１、５７．４、５８．５、７０．７、１２４．４、２２３．４、２７０．７、２７６．１０、３１６．２、３２４．４、３４７．３および２７２．７からなる群から選択される１以上のモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントを、ＣＭＶ感染を治療または予防するために、対象に投与する。より詳細な実施形態においては、５７．４、５８．５、２７６．１０および２７２．７からなる群から選択される１以上のモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントを、ＣＭＶ感染を治療または予防するために、対象に投与する。
本発明の１以上の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（ＧＣＶ）、バルガンシクロビル（ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）（ＶＧＣＶ）、フォスカルネット（ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）（ＦＯＳ）、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）（ＣＤＶ）およびＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）（ＣＳＬ，Ｉｎｃ．Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（これらに限定されるものではない）を含む１以上の他の治療用物質とに共投与されうる。該抗原結合性タンパク質は（免疫複合体として）該物質に連結されることが可能であり、あるいは該物質とは別に投与されうる。後者（別々の投与）の場合、該抗原結合性タンパク質は該物質の前、後または同時に投与されることが可能であり、あるいは他の公知療法と共投与されうる。
「治療する」または「治療」は、治療用物質、例えば本発明の抗原結合性タンパク質を含有する組成物を、ＣＭＶ感染を有する対象またはＣＭＶ感染を有する疑いのある対象に、内的または外的に投与することを意味する。典型的には、該物質は、いずれかの臨床的に測定可能な度合によるそのような症状の退縮の誘導または進行の抑制により、治療対象または集団におけるＣＭＶ感染の症状の１以上を軽減するのに有効な量で投与される。いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用物質の量（「治療的有効量」とも称される）は患者の感染段階、年齢および体重ならびに対象において所望の応答を惹起する治療用物質の能力のような要因によって変動しうる。感染症状が軽減したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために医師または他の熟練医療提供者により典型的に用いられるいずれかの臨床的測定により評価されうる。本発明の或る実施形態（例えば、治療方法または製造品）は全ての対象における標的感染症状の軽減において有効であるとは限らないかもしれないが、それは、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ２検定、マン（Ｍａｎｎ）およびホイットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クルスカル−ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンケーレ−テルプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定およびウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定により決定される統計的に有意な対象数において、標的感染症状を軽減するべきである。
実験および診断用途
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質はアフィニティ精製剤として使用されうる。この方法においては、該抗原結合性タンパク質を、当技術分野でよく知られた方法を用いて、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）樹脂または濾紙のような固相上に固定化する。固定化された抗原結合性タンパク質を、精製されるべきＣＭＶを含有するサンプルと接触させ、ついで、該固定化抗原結合性タンパク質に結合したＣＭＶを除くサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、結合ＣＭＶをカラムから溶出する溶媒で支持体を洗浄する。そのような固定化抗体は本発明の一部を構成する。
本明細書に開示されている抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、ＣＭＶに関する診断アッセイ、例えば、組織または血清におけるその存在の検出においても有用でありうる。診断アッセイは、本発明の抗原結合性タンパク質を使用するＣＭＶの検出のための種々の方法、限定的なものではないが例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、ウエスタンブロットを用いることが可能である。該抗原結合性タンパク質自体が標識されることが可能であり、したがって直接的に検出されうる。あるいは、該抗原結合性タンパク質は、標識された二次抗体により結合されることが可能であり、ついで該二次抗体が検出される。
精製、診断および検出は、好ましくは、５７．４、２１０．４、２１６．５、２６９．６、２７１．１、２７２．７、２７５．２、２８３．７、２９２．１、２９５．５、３４０．６および３５０．１からなる群から選択されるモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントを使用する。
医薬組成物および投与
本発明はまた、医薬上許容される担体または希釈剤と共に製剤化された、本明細書に記載されている抗原結合性タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物に関する。
抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の医薬組成物または無菌組成物を製造するためには、該タンパク質を医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。医薬上許容される担体には、生理的に適合性である、すなわち、ヒトへの投与に適した、あらゆる溶媒、分散媒、等張および吸収遅延剤などが含まれる。該担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入によるもの）に適したものでありうる。
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体」は、ヒトへの投与に適した、本発明の抗原結合性タンパク質と混合される前記物質を意味する。本発明の幾つかの実施形態においては、医薬上許容される担体は天然に同形態では存在しない。例えば、それが天然に存在しないため、あるいは該物質の純度および／または無菌性が対応天然物と同じでないため、該物質は人工物である。例えば、注射用蒸留水の無菌、細菌非含有、溶質非含有製剤である注射用無菌水は天然に同形態では存在せず、医薬上許容される担体とみなされる。幾つかの実施形態においては、本発明の医薬組成物は、本明細書に開示されている１以上の抗原結合性タンパク質と注射用無菌水とを含む。更に詳細な実施形態においては、医薬上許容される担体は、医薬製剤または生物学的製剤に適した、天然に存在する水と同じではない、水のもう１つの形態、例えば、精製水、注射用水、無菌精製水および注射用静菌水でありうる。
追加的な実施形態においては、本発明の組成物は医薬上許容される担体としてバッファーを含む。バッファーを使用する場合、該バッファーのｐＨは、好ましくは、約５．５〜約８．０の範囲である。追加的な実施形態においては、該ｐＨは約５．５〜約７．５、約５．５〜約７．０、約５．５〜約６．５、約６．０〜約８．０、約６．０〜約７．５、約６．０〜約７．０、約６．５〜約７．０、約６．０〜６．５、約６．０〜約６．９、約６．２〜約６．７５、または約６．０〜約６．７５である。
医薬組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で安定で無菌であるべきである。治療用および診断用物質の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、懸濁液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高い抗体濃度に適した他の秩序だった構造の形態で、許容される担体、賦形剤または安定剤との混合により製造されうる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
無菌注射溶液は、適当な溶媒中の要求される治療的有効量の活性化合物（すなわち、抗体または抗原結合性タンパク質）を、必要に応じて１つの成分または複数成分の組合せと一緒にし、ついで濾過滅菌に付すことにより製造されうる。一般に、分散液は、基礎分散媒および要求される他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を加えることにより製造される。無菌注射溶液の製造のための無菌粉末の場合、有用な製造方法は、有効成分およびいずれかの追加的な所望の成分の粉末を、既に滅菌濾過されたその溶液から与える真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持されうる。注射可能製剤の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを該組成物中に含有させることによりもたらされうる。
１つの実施形態においては、本発明の抗ＣＭＶ抗体またはそのフラグメントは酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５〜６）中で適当な濃度まで希釈され、ＮａＣｌまたはスクロースが等張化のために加えられる。安定性を増強するために、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のような追加的物質が加えられうる。
単独で又は別の物質と組合せて投与される抗原結合性タンパク質組成物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手法により決定されうる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様においては、高い治療指数を示す抗原結合性タンパク質が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲の設定において用いられうる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与量および投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。
もう１つの実施形態においては、本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質を含む組成物は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；５７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １，２００２））に従い対象に投与される。
投与方式は様々でありうる。適当な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸内、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、ガス注入、局所、皮膚、経皮または動脈内経路が含まれる。
特定の実施形態においては、該抗ＣＭＶ抗原結合タンパク質は、例えば注射により、侵襲的経路により投与されうる。本発明の更に詳細な実施形態においては、抗ＣＭＶ抗原結合タンパク質またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（例えば、関節炎の関節内）、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲的経路による投与（例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤における経口投与）も本発明の範囲内である。
組成物は当技術分野で公知の医学的装置で投与されうる。例えば、本発明の医薬組成物は、例えば予め充填されたシリンジまたは自動注射器を含む皮下注射針での注射により投与されうる。
本明細書に開示されている医薬組成物は、無針皮下注射装置、例えば、米国特許第６，６２０，１３５号、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている装置によっても投与されうる。
本明細書に開示されている医薬組成物は注入によっても投与されうる。医薬組成物を投与する良く知られたインプラントおよびモジュール形態の例には、米国特許第４，４８７，６０３号（これは、制御された速度で医薬を分配するための移植可能な微量注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２３３号（これは、正確な注入速度で医薬を運搬するための医薬注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２２４号（これは連続的薬物運搬のための可変流動移植可能注入装置を開示している）、米国特許第４，４３９，１９６号（これは、多室コンパートメントを有する浸透圧薬物運搬系を開示している）のものが含まれる。多数の他のそのようなインプラント、運搬系およびモジュールが当業者によく知られている。
投与レジメンは、該治療用抗原結合性タンパク質の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該治療用抗原結合性タンパク質の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の利用可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小にすると同時に標的病態における改善をもたらすのに十分な治療用抗原結合性タンパク質を運搬する。したがって、運搬される生物学的物質の量は、１つには、個々の治療用抗原結合性タンパク質、および治療される状態の重症度に左右される。治療用抗原結合性タンパク質の適当な用量を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照されたい）。
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において知られている又は疑われているパラメータまたは因子を用いて、臨床家により行われる。一般に、投与は、最適用量より幾分少ない量から開始し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が得られるまで、小さな増加量でそれを増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。一般に、使用される生物学的物質は、治療の標的となる動物と同じ種から誘導され、それにより、該物質に対する免疫応答を最小に抑える。ヒト対象の場合、例えば、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗原結合性タンパク質が望ましいかもしれない。
本明細書に開示されている抗原結合性タンパク質は、連続的注入により、または例えば毎日、週１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、毎年などで投与される複数の用量により供与されうる。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸内、筋肉内、大脳内、髄腔内に、または吸入により投与されうる。毎週の合計用量は、一般には少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（例えば、Ｙａｎｇら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照されたい）。用量はまた、対象の血清中の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の予め決められた標的濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌ以上を達成するように投与されうる。他の実施形態においては、本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質は、毎週、隔週、「４週ごとに」、毎月、隔月または年４回、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で、皮下または静脈内投与される。
本明細書中で用いる「抑制（する）」または「治療する」または「治療」は、ＣＭＶ感染に関連した症状の発生の遅延、および／またはＣＭＶ感染の症状の重症度の低減を含む。該用語は更に、既存の無制御の又は望ましくない症状を改善すること、追加的症状を予防すること、およびそのような症状の根本原因を改善または予防することを含む。したがって、該用語は、ＣＭＶ感染を有する又はそのような感染を発生する可能性を有する脊椎動物対象に対して有益な結果がもたらされることを示す。
本明細書中で用いる「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」なる語は、単独で又は追加的な治療用物質と共に細胞、組織または対象に投与された場合に、ＣＭＶ感染もしくは状態の症状の１以上またはそのような感染の進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明の抗ＣＭＶ抗原結合性タンパク質の量を意味する。治療的有効量は更に、症状の少なくとも部分的な改善、例えば、関連医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の治療、治癒、予防もしくは改善の率における増加をもたらすのに十分な該抗原結合性タンパク質の量を意味する。治療的有効量は、単独で投与される個々の有効成分に適用される場合には、その成分のみに関するものである。治療的有効量は、組合せ体に適用される場合には、連続投与または同時投与のいずれで組合せ投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、有効成分の組合された量を意味する。治療用物質の有効量は、少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の、診断尺度またはパラメータの改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するために主観的尺度が用いられる場合には、主観的尺度における改善をもたらしうる。本発明の幾つかの実施形態においては、有効量は、ＣＭＶ複製を抑制するのに十分な量である。
キット
本発明の抗原結合性タンパク質、抗体または医薬組成物を含む容器を含むキットも本発明に含まれる。本明細書中で用いる「容器」なる語は、本発明の抗原結合性タンパク質、抗体または医薬組成物を収容、貯蔵または輸送するための人造容器を意味し、バイアル、シリンジ、カートリッジ、アンプルおよびボトルを包含する。容器は、医薬製剤または生物学的製剤を貯蔵するのに適したいずれかの材料、すなわち、該製剤に対して無反応性であり無菌である材料、例えばガラスから形成される。ガラス容器は公定要件、例えば、医薬品包装に使用されるガラスに関する米国および欧州薬局方（ＵＳＰおよびＥＰ）により定められた基準を満たすべきである。
該キットは１以上の他の要素を含むことが可能であり、これらには、使用説明；他の試薬、例えば標識、治療用物質またはキレート化もしくはカップリングに有用な物質、標識または治療用物質に対する抗体、あるいは投与のために抗体を調製するための他の物質；医薬上許容される担体；および対象への投与のための装置または他の物質が含まれる。
使用説明は、例えばＣＭＶ感染の症状を有する患者における、推奨投与量および／または投与方式を含む、治療的適用のための説明を含みうる。他の説明は、キレーター、標識または治療用物質への抗体のカップリングに関する、あるいは例えば未反応コンジュゲート化成分からのコンジュゲート化抗体の精製のための説明を含みうる。
実施例
本発明の種々の特徴を更に詳細に例示するために、以下に実施例を記載する。該実施例は、本発明を実施するための有用な方法論をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
実施例１：ウサギモノクローナル抗体のパネルの作製
ＡＤ１６９における五量体ｇＨ複合体の発現を回復させ、復帰突然変異体ウイルスはＭＲＣ−５およびＡＲＰＥ−１９細胞の両方に感染することが可能であった。ＡＴＣＣからのＡＤ１６９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１７４０３）をＭＲＣ−５細胞（Ｆｕら，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：７４６９−７４７４；Ｔａｎｇら，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：８３５０−８３５６）において増殖させた。該復帰突然変異体ウイルスは、Ｆｕら（２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：７４６９−７４７４）およびＴａｎｇら（２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：８３５０−８３５６）に記載されているとおりに、培養におけるＡＤ１６９の連続継代馴化により作製した。ＡＤ１６９ウイルスおよびその復帰突然変異体分離体をそれぞれＭＲＣ−５（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１７１）またはＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−２３０２）において増殖させた。
該復帰突然変異体ウイルスおよびその親ＡＤ１６９ウイルスは共に、抗原滴定酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて決定された場合、同レベルのｇＢを含有する。図１Ａは、ｇＢモノクローナル抗体Ｂ８．６（ＩｇＧ２ａκ）および３５．１（ＩｇＧ２ａκ）（共に内部開発）が両方のウイルスに同等に反応したことを示している。これとは対照的に、ＵＬ１３０タンパク質特異的モノクローナル抗体（３Ｅ３（ＩｇＧ１κ）および３Ｃ５（ＩｇＧ１κ）（共に、プリンストン大学のＴｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋにより快く提供していただいたもの；Ｗａｎｇら，２００５，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：２１１５−２１２３を参照されたい）は該復帰突然変異体ウイルスのみに対する反応性を示し、親ＡＤ１６９ウイルスに対する反応性を示さなかった（図１Ｂ）。
３〜４月齢のニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）雌ウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡにおける特異的病原体非含有コロニーから購入）においてモノクローナル抗体を作製した。実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従い、動物をメルク（Ｍｅｒｃｋ）動物施設内に個別に収容した。第０週、３週および８週における１００μｇの復帰突然変異体ウイルスの３回の筋肉内注射の後、第１１週に１頭のウサギの中和力価が１：３４００に上昇した（Ｆｕら，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ ３０：７４６９−７４７４；Ｔａｎｇら，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：８３５０−８３５６）。第１４週に、このウサギの筋肉内に５００μｇの該復帰突然変異体ウイルスを追加抗原（ブースター）接種し、４日後にハイブリドーマ培養のために脾臓を回収した。ウサギハイブリドーマは、既に報告されているプロトコール（Ｙｕら，２０１０，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ９０７２）に基づき、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）において作製された。まず、約５００個のハイブリドーマ培養をウサギＩｇＧの産生に関してスクリーニングし、ついでＡＲＰＥ−１９細胞における該復帰突然変異体の中和に関する機能アッセイにおいて、または該復帰突然変異体ウイルスへの結合に関するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。７５個の培養を選択し、２ラウンドの限界希釈によりクローニングした。それらの活性を確認した後、４５個のユニークな系を樹立し、抗体産生のために増殖させた。
ウサギハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体コード化遺伝子のクローニングは、若干の改変を伴う、既に報告されている方法に基づくものであった（Ｙｕ ｅｔら，２０１０，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ９０７２）。簡潔に説明すると、ｍＲＮＡを、トリザール（Ｔｒｉｚａｌ）抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてウサギハイブリドーマ細胞から単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡへと逆転写した。Ｌ鎖およびＨ鎖プライマーを使用して可変（ＶＨおよびＶＬ）領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ヌクレオスピン（ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）ゲル抽出キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ）を使用してゲル精製し、ｐＣＲ２．１ ＴＡ−クローンベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結し、白色コロニーの選択のためにＳ−Ｇａｌ ＡｍｐＲプレート上にプレーティングした。ミニプレップキット（ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して該プラスミドを複数のコロニーから抽出し、Ｍ１３ＲおよびＭ１３Ｆ配列決定プライマーを使用して各クローンを両方向から配列決定した。少なくとも３つの同じ配列決定結果から最終的な配列が確認された。各モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列を表１０〜１５に示す。
実施例２：抗ＣＭＶモノクローナル抗体の結合および中和プロファイル
該モノクローナル抗体をそれらの中和およびウイルス結合および中和能に関してアッセイした。該中和アッセイは、ウイルス上皮細胞侵入を妨げる該モノクローナル抗体の能力を評価した。該ウイルス結合アッセイは、ＥＬＩＳＡを用いて、ビリオンに結合する該モノクローナル抗体の能力を評価した。
簡潔に説明すると、用いた中和アッセイは、感染の２４時間後の、ウイルス最初期（ＩＥ）抗原を発現する細胞の計数に基づくものであり、既に記載されている（Ｔａｎｇら，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：８３５０−６）。５０％のウイルス侵入を阻止するのに要する抗体濃度として定義されるＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）５（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する４パラメータ曲線フィッティングから計算した。
簡潔に説明すると、用いたウイルス結合アッセイは、抗原としての復帰突然変異体ビリオンに対する各モノクローナル抗体の相対結合アフィニティを決定するための抗体滴定酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）であった。該抗原を９６ウェルＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上、最大濃度で、典型的にはＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬで、４℃で一晩コートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中の３％ 脱脂乳でブロッキングし、０．２〜３０μｇ／ｍＬの滴定におけるモノクローナル抗体と共にインキュベートした。プレートを抗体インキュベーション後に洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＨＲＰ結合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）と反応させた。インキュベーションおよび洗浄の後、ＨＲＰ濃度に比例した濃度でレゾルフィンを生成させるために発蛍光性ＨＲＰ基質１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ；Ｖｉｒｏｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を１００μＬ／ウェルで加えた（Ｈｉｇｈら，２００５，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４７：１５９−６１およびＭｅｎｇら，２００５，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４５：２２７−３６）。５３１ｎｍの励起シグナルおよび５９５ｎｍの発光シグナルを蛍光リーダー（Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩＩ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で測定した。Ｐｒｉｓｍ（登録商標）５を使用する４パラメータ曲線フィッティングからＥＣ５０結合値を計算した。
ヒトポリクローナルＣＭＶ過免疫ＩｇＧ（ＨＩＧ，ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）；ＣＳＬ，Ｉｎｃ．（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により商業的に製造され流通している）を中和および結合アッセイにおける陽性対照として、そして実施例１に記載されている４５個のモノクローナル抗体を比較するための参照体として使用した（図２を参照されたい）。ウイルスを中和する（ウイルス感染を予防する）ＨＩＧ抗体の能力を、抗体濃度と逆相関するウイルス最初期（ＩＥ）抗原発現を示す細胞の百分率（ｙ軸）として測定した（図２Ａ）。蛍光単位で示された結合シグナル（ｙ軸）は抗体濃度に比例した（図２Ｂ）。図２Ａにおけるｙ軸は、ウイルス侵入事象の指標となるウイルス最初期抗原発現を示す細胞の百分率を示す。図２Ｂにおけるｙ軸は抗体特異的蛍光シグナルを示す。ウイルス侵入の５０％を阻止するのに要するＩｇＧ濃度（図２Ａ）または５０％最大結合に達するのに要するＩｇＧ濃度（図２Ｂ）として定義されるそれぞれＥＣ５０中和およびＥＣ５０結合を４パラメータ曲線フィッティングにより計算した。ＨＩＧ、すなわち、ＣｙｔｏＧａｍ（登録商標）は１μｇ／ｍＬのＥＣ５０中和および２μｇ／ｍＬのＥＣ５０結合を示した。
ＡＲＰＥ−１９細胞におけるウイルスを中和する又はＥＬＩＳＡにおいてビリオンと反応する抗体の能力を定量するために、実施例１に記載されている抗体のそれぞれに関する抗ウイルス活性（ＥＣ５０中和）および結合アフィニティ（ＥＣ５０結合）を４パラメータ曲線フィッティングにより計算した。より低いＥＣ５０は、それぞれ、より良好な中和活性またはより高い結合アフィニティを示す。モノクローナル抗体が、乏しい結合アフィニティまたは抗ウイルス活性を有する場合、あるいは典型的なＳ状分布に収束しない全データ点に関する信頼しうる曲線フィッティングが存在しなかった場合、ＥＣ５０には、ウイルスの中和またはウイルスへの結合の機能の不良を示す１００μｇ／ｍＬの値が任意に割り当てられた。復帰突然変異体ウイルスに対する全４５個のモノクローナル抗体の結合および中和特性を表５に一覧する。
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各抗体に関して結合アフィニティが中和活性にどのように関連づけられるのかを理解するために、全４５個の抗体に関する中和（ｙ軸）対結合（ｘ軸）に関するＥＣ５０値をプロットした（図２Ｃ）。ＨＩＧに関するＥＣ５０中和活性（〜１μｇ／ｍＬ、図２Ａ）は図２Ｃに水平破線として示されており、該モノクローナル抗体をそれらの抗ウイルス効力に基づいて分離するために用いられた。図２Ｃに示されている４５個のモノクローナル抗体のうち、＜１μｇ／ｍＬのＥＣ５０中和を示す２５個のモノクローナル抗体は中和抗体（線の上の三角形）とみなされ、＞１μｇ／ｍＬのＥＣ５０中和を示す２０個のモノクローナル抗体は非中和抗体（線の下の円形）とみなされた。
全ての中和モノクローナル抗体に関するＥＣ５０結合は０．２〜５μｇ／ｍＬであり、ＨＩＧ（２μｇ／ｍＬ）に比較されうるものであった。これとは対照的に、非中和モノクローナル抗体の大多数は、ＨＩＧより高い、ビリオンに対する結合アフィニティを有していたが（図２Ｃ、左下の四半部）、このことは、より大きな結合アフィニティが抗ウイルス機能の改善に関連していなかったことを示している。
＜１μｇ／ｍＬのＥＣ５０中和を示す示すモノクローナル抗体を優良中和抗体として分類した（表６を参照されたい）。同様に、＜０．２μｇ／ｍＬのＥＣ５０結合を示すモノクローナル抗体を優良結合性抗体と称することにした（表６を参照されたい）。これらのモノクローナル抗体がそのように称されるのは、それらが、ＨＩＧと比較して＞１０倍の中和または結合アフィニティを有するからである（表５）。モノクローナル抗体５７．４は、優良中和体および優良結合体の両方である唯一の抗体である。
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実施例３：上皮細胞における抗体の中和能は線維芽細胞におけるその活性とは相関しない
ＨＩＧはＭＲＣ−５細胞のような線維芽細胞へのウイルス侵入を、上皮細胞、すなわちＡＲＰＥ−１９細胞へのウイルス侵入の阻止より約１０〜１５倍低い有効性で阻止しうることが公知である（Ｃｕｉら，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：５７６０−５７６６）。ウイルスは上皮細胞への感染と線維芽細胞への感染とで異なる侵入メカニズムを用いることが示唆されている（Ｗａｎｇら，２００７，ＰＮＡＳ １０４：２００３７−４２）。したがって、各モノクローナル抗体に関してＭＲＣ−５細胞におけるＥＣ５０中和を測定することにより、抗体のパネルを評価した（表５）。ＡＲＰＥ−１９細胞（ｘ軸）と比較した場合のＭＲＣ−５細胞（ｙ軸）へのウイルス侵入を阻止する抗体のＥＣ５０値間の相関性を図３に示す。全４５個の抗体は以下の３つの群に分類されうる：ＡＲＰＥ−１９細胞においてのみウイルスを中和する群Ａの抗体、両方の細胞型においてウイルスを中和する群Ｂの抗体、およびいずれの細胞系においても非中和性である群Ｃの抗体（表７を参照されたい）。
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ＡＲＰＥ−１９細胞におけるウイルス侵入に対する強力な活性を示すモノクローナル抗体、例えば５７．４および２７６．１０は、線維芽細胞へのウイルス侵入を阻止しなかった。１１個の優良中和モノクローナル抗体中の僅か５個が線維芽細胞へのウイルス侵入に対する活性を示したに過ぎなかった。残りの１４個の中和モノクローナル抗体のうち、１１個の抗体が線維芽細胞へのウイルス侵入に対する活性を示した。したがって、該モノクローナル抗体の約６０％は上皮細胞および線維芽細胞の両方においてウイルスを中和しうる。ＡＲＰＥ−１９細胞とＭＲＣ−５細胞とにおける中和能に関する矛盾はヒト抗体の結果（Ｍａｃａｇｎｏら，２０１０，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：１００５−１０１３）と合致しており、強力な優良中和モノクローナル抗体が上皮細胞へのウイルス侵入に特有の抗原を認識したが、線維芽細胞に関してはそうではなかったという見解と合致している（Ｗａｎｇら，２００７，ＰＮＡＳ １０４：２００３７−４２）。
実施例４：精製ウイルスへの差次的結合プロファイル
抗原滴定ＥＩＡを用いて、ＡＤ１６９ビリオンおよび復帰突然変異体ビリオンに対する優良中和および優良結合性の両方の抗体に関する結合プロファイルを得た。意図的に、該復帰突然変異体ウイルスおよびＡＤ１６９ウイルスは五量体ｇＨ複合体以外は同じ抗原組成を有していた。したがって、ＡＤ１６９と復帰突然変異体ウイルスとに対するモノクローナル抗体の結合アフィニティにおけるいずれかの相違は復帰突然変異体ウイルス上の五量体ｇＨ複合体の存在によるものであった可能性がある。上皮侵入には必須であるが線維芽細胞侵入には必須でない五量体ｇＨ複合体を優良中和抗体が標的化したのかどうかを評価するために、結合プロファイルを比較した。
３つの結合パターンを図４に示す。該モノクローナル抗体は（ａ）復帰突然変異体ウイルスのみと反応した（クローン５７．４に関して図４Ａに示されている）、（ｂ）復帰突然変異体ウイルスおよびＡＤ１６９ウイルスの両方と反応したが、復帰突然変異体ウイルスを好んだ（クローン５８．５に関して図４Ｂに示されている）、または（ｃ）復帰突然変異体ウイルスおよびＡＤ１６９ウイルスの両方と反応したが、優先性を示さなかった（クローン２９５．５に関して図４Ｃに示されている）。該抗体を、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるそれらのＥＣ５０中和値と相関するそれらの結合パターンに基づいてプロットしたところ、全ての優良中和体は復帰突然変異体ウイルスのみと反応した（パターンＡ）、または復帰突然変異体ウイルスに対する優先性を示した（パターンＢ）。しかし、１１個中９個の優良結合体は復帰突然変異体ウイルスまたはＡＤ１６９間で優先性を示さなかった（パターンＣ）（クローン２１０．４，２６９．６，２７１．１，２７２．７，２７５．２，２８３．７，２９２．１，２９５．５および３５０．１）。したがって、強力な中和抗体に対する抗原は復帰突然変異体ウイルス上に、ＡＤ１６９ウイルス上より豊富に提示され、これは五量体ｇＨ複合体が中和抗体の主要標的であることと合致する。
実施例５：組換え五量体ｇＨ複合体に対する反応性を示す中和抗体の大多数
優良中和および優良結合性抗体の抗原特異性を更に特徴づけるために、組換えｇＢおよび五量体ｇＨ複合体を抗体滴定ＥＩＡにおいて使用した。１μｇ／ｍｌの単一濃度における組換え五量体ｇＨおよびｇＢ抗原に対する抗体反応性の比較を図５に示す。優良中和体がＡＤ１６９に対して中和活性をほとんど示さず、低減した結合を示したことに合致して、優良中和抗体はいずれもｇＢと反応しなかった。３つの優良結合体（クローン２７２．７、３５０．１および２１０．４）はｇＢに対して強力に反応し、これらのモノクローナル抗体はいずれも、ＡＤ１６９も復帰突然変異体ウイルスも中和しなかった。この結果は、上皮細胞における中和抗体の惹起においてｇＢが有効でないという従来の観察と合致している（Ｃｕｉら，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：５７６０−６；Ｗａｎｇら，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：９０７５−８０；Ｔａｎｇら，２０１１，Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：８３５０−６）。これとは対照的に、１１個の優良中和体のうちの８個が五量体ｇＨ複合体と反応した（クローン５７．４、７０．７、１２４．４、２７０．７、２７６．１０、３１６．２および３２４．４）。７個の優良結合体のうちの僅か２個（クローン２９２．１および２６９．６）が五量体ｇＨ複合体と反応し、それらは、優良中和体と比較して、五量体ｇＨへの比較的弱い結合を示した。したがって、五量体ｇＨ複合体は、中和抗体の大多数により認識される抗原複合体であり、五量体ｇＨ複合体に対する抗体の反応性は上皮細胞におけるその中和に関連している。
実施例６：抗ＣＭＶモノクローナル抗体の系統分析
全ＶＨ領域のアミノ酸配列に基づいて系統樹を構築した（図６）。重鎖可変ドメインＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）は接合部多様性およびクローン特異性を最も良く表すため、４５個のモノクローナル抗体をそれらのＨＣＤＲ３配列相同性に基づいて２６個の系統群に分類した。クラスター化抗体間のＨＣＤＲ３配列の類似性に基づけば、２６個の群のそれぞれは別個のエピトープへの単一のユニークＢ細胞系統に由来している可能性がある。もしそうであれば、同一系統群内のモノクローナル抗体は類似した中和または結合特性を有するはずである。実際、該中和および結合モノクローナル抗体は大部分が別個の系統群へと分離されていた。１１個の優良中和モノクローナル抗体のうちの８個は３個の系統群（群１３、１６および２０）においてクラスター化ｓれた。系統群１８の唯一のメンバーである優良中和モノクローナル抗体３４７．３は優良中和系統群１６と密接に関連していた。優良中和モノクローナル抗体２７６．１０は弱い中和モノクローナル抗体３０．２と共にグループ化された。優良中和体と同様に、弱い中和モノクローナル抗体も共通の系統群においてクラスター化する傾向にあった（群１内の５個のｍＡｂ、群６内の３個のｍＡｂ、群１７内の２個のｍＡｂおよび群２１内の２個のｍＡｂは全て弱い中和体であった）。全体で、７個の系統群が２５個中２０個の中和モノクローナル抗体を含んでいた。中和モノクローナル抗体とは対照的に、非中和モノクローナル抗体は、系統群９および２２を除いて、系統群の全体にわたって、より分散していた。系統群９内の全５個のモノクローナル抗体が優良体または中間的結合体であり、系統群２２内の２個のモノクローナル抗体が優良結合体であった。１０個の非中和モノクローナル抗体が単一抗体の系統群に帰属された。非中和モノクローナル抗体に関する多数の独立系統は、これらのモノクローナル抗体が多様なウイルス抗原および／またはエピトープに特異的であったことを示唆している。また、中和モノクローナル抗体と比較した場合のこれらの非中和モノクローナル抗体における関連性の欠如は、これらのモノクローナル抗体により認識される抗原標的が、中和モノクローナル抗体により認識されるものより多様であることを示唆している。
しかし、これには幾つかの例外が存在する。ｍＡｂ ２５０．５およびｍＡｂ ５７．４は共に、結合および中和の両方の能力を示した。尤も、前者は両方の特性に関して弱いｍＡｂであり、後者は両方の特性に関する優良ｍＡｂであった。興味深いことに、ｍＡｂ ５７．４は中和系統群６および結合系統群９と密接に関連していた。最後に、優良結合体であるｍＡｂ ３５０．１および弱い中和体であるｍＡｂ １１７．８は同一ＨＣＤＲ３配列を共有しており、共に系統群７に属していた。
ある与えられたモノクローナル抗体に関して、ＨＣＤＲ３のサイズは時には抗ウイルス機能（例えば、中和）または物理的相互作用（例えば、結合）と相関していた。したがって、抗体の機能特性を有する抗体に関するＨＣＤＲ３と軽鎖可変ドメインＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）との間の関連性を分析した（図７）。１１個の優良中和ｍＡｂが１１個の優良結合体の場合より長い平均ＨＣＤＲ３を有していたが（１５．６アミノ酸対１２．２；ｐ＝０．０２４）、それらのＬＣＤＲ３の平均長はほぼ同じであり、優良中和体は１１．６アミノ酸であり、優良結合体は１０．８アミノ酸であった（ｐ＝０．２６６）。また、中和活性を有さないｍＡｂ（ｎ＝２０）と比較して全ての中和ｍＡｂ（ｎ＝２５）に関して該比較を行った。この比較において、中和機能を有する抗体に関するＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３の平均サイズであるそれぞれ１５．９および１２．３アミノ酸は、中和活性を有さない抗体に関するＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３の平均サイズであるそれぞれ１３．０および１０．９アミノ酸より有意に長かった（両方の比較においてｐ＝０．００９）。この結果は、ウイルス中和に重要な標的が、長いＨＣＤＲ３またはＬＣＤＲ３を有する前駆体Ｂ細胞受容体によって優先的に認識されることを示した。
興味深いことに、中和抗体において見出される体細胞突然変異の平均数は、ＶＨまたはＶＬに関して、非中和抗体におけるものと有意には異ならなかった（表８〜９）。体細胞突然変異の率を計算するために、ウサギ抗体のヌクレオチド配列をＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏ ＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃら，２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５−７７）に提出した。各抗体に関する決定されたＶ領域を最も近い生殖系列Ｖ領域配列とアライメントさせて、アミノ酸突然変異（挿入、欠失または置換）の数を計算した。該率はＶ領域全体における突然変異の数に基づいて計算された。
これらの観察が示したところによると、ウイルス中和に重要な標的は複雑であり、中和のためのこれらの標的との相互作用は、より長いＨＣＤＲ３および／またはＬＣＤ３を有する抗体を優先した。体細胞突然変異による抗体アフィニティ成熟はそのような中和抗体の発生のために二次的な役割を果たした。
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実施例７：幾つかの抗ＣＭＶモノクローナル抗体による補体依存性ウイルス中和
抗体はそれらのＦｃ領域によるＮＫ細胞の活性化または補体の固定によりエフェクター機能を発揮しうる（Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：６８５）。ウイルス粒子上またはウイルス感染細胞上に提示されたウイルス抗原への結合により、これらの抗体はウイルス感染細胞の細胞傷害性または抗原特異的ウイルス溶解をインビボでもたらしうる。全２０個の非中和ウサギモノクローナル抗体を、標準的なウサギ補体の存在下、それらのウイルス中和能に関して試験した。
簡潔に説明すると、滴定におけるモノクローナル抗体をウサギ補体（１：３２の容量希釈；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，＃ＣＬ３１１１）の存在下または非存在下でウイルスと混合した。室温で１時間のインキュベーションの後、該混合物を、９６ウェルプレート内でプレーティングされたＡＲＰＥ−１９細胞に加えた。翌日、該細胞を固定し、ウイルスＩＥ抗原の発現に関して染色した（既に記載されているとおりに行った）。
該モノクローナル抗体の大多数はウサギ補体の存在下または非存在下で中和活性を示さなかったが、５個の非中和モノクローナル抗体（クローン２０２．３、２１６．５、２７２．７、２７５．２および３４５．１）は、補体が存在する場合に抗ウイルス機能を示した。該補体依存性ウイルス中和はビリオンに対する抗体アフィニティに関連しておらず、エピトープ特異的でなかった。図８に示されているとおり、最高アフィニティを有するクローンであるクローン２９５．５は補体の存在下または非存在下で抗ウイルス活性を有する（図８Ａ）。クローン２７２．７および３５０．１は共にｇＢタンパク質を認識するが、クローン２７２．７のみが、ウイルス中和アッセイにおいて補体が加えられた場合にウイルスを中和しうる（図８Ｂおよび８Ｃ）。補体の存在下のクローン２７２．７による抗ウイルス活性を４パラメータ曲線フィッティングに基づいて計算し、補体存在下のＥＣ５０中和は０．２２μｇ／ｍＬと推定されれた。
実施例８：ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡによる抗ＣＭＶ ｍＡｂ標的の特定
精製されたＣＭＶビリオンをサンプルバッファー（ｉｔｅｍ ＃ＮＰ０００７，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で変性させ、ウイルスタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。４５個の抗体の大多数は特異的ウイルスタンパク質バンドを認識しなかったが（図９Ａ）、このことは、これらの抗体により認識される標的が本質的に高次構造的（コンホメーション的）であり、ウイルス抗原が変性した場合にそれらのエピトープが十分に提示されなかったことを示唆している。しかし、ｇＨ（ＵＬ７５）に関して報告されている分子量１００ＫＤａに近い１つの特異的ウイルスタンパク質がクローン１５．１、５８．５、２２３．４、３４７．３、２１２．６、２４０．８および２０３．１により顕著にブロットされた。この結果は図９Ｂにおいてクローン５８．５で更に証明された。
ＥＬＩＳＡ（図４および図５）およびウエスタンブロット分析（図９Ａ）からの結果に基づいて、クローン５７．４、５８．５、２７２．７および２７６．１０により認識されるウイルス抗原を帰属した。クローン５７．４および２７６．１０は復帰突然変異体ウイルスのみに結合し、ＡＤ１６９ウイルスには結合せず（図４Ａ）、それらは組換え五量体ｇＨ複合体と強力に反応し、したがって、それらのエピトープはＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／またはＵＬ１３１タンパク質から一意的（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）に構成されるものであった。クローン５８．５は組換え五量体ｇＨ複合体を認識し、ウエスタンブロットにおいてｇＨの同じ分子量を有するタンパク質を検出し、したがって、その標的化ウイルス抗原はｇＨであった。クローン２７２．７により認識されるウイルスタンパク質は、ＥＬＩＳＡにおける組換え形態のｇＢに対するその反応性に基づけば、ｇＢであった（図５）。
実施例９：ウサギ抗ＣＭＶ抗体のヒト化
当技術分野における方法（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，２２５，５３９号、第６，６９３，７６２号）に従い、ＣＤＲグラフティングの概念に基づいて、４個のウサギ抗ＣＭＶ抗体（クローン５７．４、５８．５、２７２．７および２７６．１０）をヒト化した。Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｋａｂａｔら，１９８０，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５２：７２−８４；Ｙｕら，２０１０，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５：ｅ９０７２；Ｈａｉｄａｒら，２０１２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８０：８９６−９１２）を参照し、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃら，２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５−７７）の規則に基づいて、ウサギ重鎖および軽鎖のＣＤＲドメインを特定した。簡潔に説明すると、与えられたウサギモノクローナル抗体重鎖または軽鎖の、ヒト生殖系列に対する最良マッチを、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））により特定する。推定ＣＤＲの配列を表１０（配列番号１〜１３５）および１３（配列番号１３６〜２７０）に示す。ヒト化は、Ｙｕら，２０１０，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５：ｅ９０７２およびＨａｉｄａｒら，２０１２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８０：８９６−９１２参照し、米国特許第５，５３０，１０１号および第６，６９３，７６２号のＣＤＲグラフティングプロトコールの規則に従い達成された。該ヒト化抗体の発現のために、重鎖可変領域をＩｇＧ１定常領域にインフレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をカッパ定常領域にインフレームで融合させた。ほとんどの場合、１個または２個のアミノ酸残基が互いに異なる、各抗体のために設計される重鎖および軽鎖可変領域の２つの形態が存在する。該ヒト化重鎖および軽鎖領域は以下のとおりである。
ヒト化５７．４
Figure 2016521711
ヒト化５８．５
Figure 2016521711
ヒト化２７２．７
Figure 2016521711
ヒト化２７６．１０
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他の実施形態も以下の特許請求の範囲の範囲内である。幾つかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
Figure 2016521711
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Claims (26)

  1. （ｌ−ａ）配列番号１を含むＣＤＲ１、配列番号２を含むＣＤＲ２および配列番号３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｂ）配列番号４を含むＣＤＲ１、配列番号５を含むＣＤＲ２および配列番号６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２および配列番号９を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｄ）配列番号１０を含むＣＤＲ１、配列番号１１を含むＣＤＲ２および配列番号１２を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｅ）配列番号１３を含むＣＤＲ１、配列番号１４を含むＣＤＲ２および配列番号１５を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｆ）配列番号１６を含むＣＤＲ１、配列番号１７を含むＣＤＲ２および配列番号１８を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｇ）配列番号１９を含むＣＤＲ１、配列番号２０を含むＣＤＲ２および配列番号２１を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｈ）配列番号２２を含むＣＤＲ１、配列番号２３を含むＣＤＲ２および配列番号２４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｉ）配列番号２５を含むＣＤＲ１、配列番号２６を含むＣＤＲ２および配列番号２７を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｊ）配列番号２８を含むＣＤＲ１、配列番号２９を含むＣＤＲ２および配列番号３０を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｋ）配列番号３１を含むＣＤＲ１、配列番号３２を含むＣＤＲ２および配列番号３３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｌ）配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２および配列番号３６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｍ）配列番号３７を含むＣＤＲ１、配列番号３８を含むＣＤＲ２および配列番号３９を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｎ）配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１を含むＣＤＲ２および配列番号４２を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｏ）配列番号４３を含むＣＤＲ１、配列番号４４を含むＣＤＲ２および配列番号４５を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｐ）配列番号４６を含むＣＤＲ１、配列番号４７を含むＣＤＲ２および配列番号４８を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｑ）配列番号４９を含むＣＤＲ１、配列番号５０を含むＣＤＲ２および配列番号５１を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｒ）配列番号５２を含むＣＤＲ１、配列番号５３を含むＣＤＲ２および配列番号５４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｓ）配列番号５５を含むＣＤＲ１、配列番号５６を含むＣＤＲ２および配列番号５７を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｔ）配列番号５８を含むＣＤＲ１、配列番号５９を含むＣＤＲ２および配列番号６０を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｕ）配列番号６１を含むＣＤＲ１、配列番号６２を含むＣＤＲ２および配列番号６３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｖ）配列番号６４を含むＣＤＲ１、配列番号６５を含むＣＤＲ２および配列番号６６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｗ）配列番号６７を含むＣＤＲ１、配列番号６８を含むＣＤＲ２および配列番号６９を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｘ）配列番号７０を含むＣＤＲ１、配列番号７１を含むＣＤＲ２および配列番号７２を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｙ）配列番号７３を含むＣＤＲ１、配列番号７４を含むＣＤＲ２および配列番号７５を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｚ）配列番号７６を含むＣＤＲ１、配列番号７７を含むＣＤＲ２および配列番号７８を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ａ’）配列番号７９を含むＣＤＲ１、配列番号８０を含むＣＤＲ２および配列番号８１を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｂ’）配列番号８２を含むＣＤＲ１、配列番号８３を含むＣＤＲ２および配列番号８４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｃ’）配列番号８５を含むＣＤＲ１、配列番号８６を含むＣＤＲ２および配列番号８７を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｄ’）配列番号８８を含むＣＤＲ１、配列番号８９を含むＣＤＲ２および配列番号９０を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｅ’）配列番号９１を含むＣＤＲ１、配列番号９２を含むＣＤＲ２および配列番号９３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｆ’）配列番号９４を含むＣＤＲ１、配列番号９５を含むＣＤＲ２および配列番号９６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｇ’）配列番号９７を含むＣＤＲ１、配列番号９８を含むＣＤＲ２および配列番号９９を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｈ’）配列番号１００を含むＣＤＲ１、配列番号１０１を含むＣＤＲ２および配列番号１０２を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｉ’）配列番号１０３を含むＣＤＲ１、配列番号１０４を含むＣＤＲ２および配列番号１０５を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｊ’）配列番号１０６を含むＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｋ’）配列番号１０９を含むＣＤＲ１、配列番号１１０を含むＣＤＲ２および配列番号１１１を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｌ’）配列番号１１２を含むＣＤＲ１、配列番号１１３を含むＣＤＲ２および配列番号１１４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｍ’）配列番号１１５を含むＣＤＲ１、配列番号１１６を含むＣＤＲ２および配列番号１１７を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｎ’）配列番号１１８を含むＣＤＲ１、配列番号１１９を含むＣＤＲ２および配列番号１２０を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｏ’）配列番号１２１を含むＣＤＲ１、配列番号１２２を含むＣＤＲ２および配列番号１２３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｐ’）配列番号１２４を含むＣＤＲ１、配列番号１２５を含むＣＤＲ２および配列番号１２６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｑ’）配列番号１２７を含むＣＤＲ１、配列番号１２８を含むＣＤＲ２および配列番号１２９を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｒ’）配列番号１３０を含むＣＤＲ１、配列番号１３１を含むＣＤＲ２および配列番号１３２を含むＣＤＲ３；ならびに
    （ｌ−ｓ’）配列番号１３３を含むＣＤＲ１、配列番号１３４を含むＣＤＲ２および配列番号１３５を含むＣＤＲ３
    からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的に結合する組換え抗原結合性タンパク質。
  2. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、
    （ｌ−ｂ）配列番号４を含むＣＤＲ１、配列番号５を含むＣＤＲ２および配列番号６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｇ）配列番号１９を含むＣＤＲ１、配列番号２０を含むＣＤＲ２および配列番号２１を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｋ）配列番号３１を含むＣＤＲ１、配列番号３２を含むＣＤＲ２および配列番号３３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｏ）配列番号４３を含むＣＤＲ１、配列番号４４を含むＣＤＲ２および配列番号４５を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｕ）配列番号６１を含むＣＤＲ１、配列番号６２を含むＣＤＲ２および配列番号６３を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｂ’）配列番号８２を含むＣＤＲ１、配列番号８３を含むＣＤＲ２および配列番号８４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｄ’）配列番号８８を含むＣＤＲ１、配列番号８９を含むＣＤＲ２および配列番号９０を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｆ’）配列番号９４を含むＣＤＲ１、配列番号９５を含むＣＤＲ２および配列番号９６を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｌ’）配列番号１１２を含むＣＤＲ１、配列番号１１３を含むＣＤＲ２および配列番号１１４を含むＣＤＲ３；
    （ｌ−ｍ’）配列番号１１５を含むＣＤＲ１、配列番号１１６を含むＣＤＲ２および配列番号１１７を含むＣＤＲ３；ならびに
    （ｌ−ｒ’）配列番号１３０を含むＣＤＲ１、配列番号１３１を含むＣＤＲ２および配列番号１３２を含むＣＤＲ３
    からなる群から選択され、該抗原結合性タンパク質がＣＭＶを中和する、請求項１記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  3. 該抗原結合性タンパク質がヒト化抗体である、請求項１または請求項２記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  4. 該軽鎖可変領域ドメインが、配列番号６３１、６３２、６３５、６３６、６３９、６４０、６４２および６４３からなる群から選択される、請求項１記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  5. 該軽鎖可変領域が更に、
    （ａ）（ｌ−ａ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２７１を含むＦＲ１、配列番号２７２を含むＦＲ２、配列番号３６１を含むＦＲ３および配列番号３６２を含むＦＲ４；
    （ｂ）（ｌ−ｂ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２７３を含むＦＲ１、配列番号２７４を含むＦＲ２、配列番号３６３を含むＦＲ３および配列番号３６４を含むＦＲ４；
    （ｃ）（ｌ−ｃ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２７５を含むＦＲ１、配列番号２７６を含むＦＲ２、配列番号３６５を含むＦＲ３および配列番号３６６を含むＦＲ４；
    （ｄ）（ｌ−ｄ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２７７を含むＦＲ１、配列番号２７８を含むＦＲ２、配列番号３６７を含むＦＲ３および配列番号３６８を含むＦＲ４；
    （ｅ）（ｌ−ｅ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２７９を含むＦＲ１、配列番号２８０を含むＦＲ２、配列番号３６９を含むＦＲ３および配列番号３７０を含むＦＲ４；
    （ｆ）（ｌ−ｆ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２８１を含むＦＲ１、配列番号２８２を含むＦＲ２、配列番号３７１を含むＦＲ３および配列番号３７２を含むＦＲ４；
    （ｇ）（ｌ−ｇ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２８３を含むＦＲ１、配列番号２８４を含むＦＲ２、配列番号３７３を含むＦＲ３および配列番号３７４を含むＦＲ４；
    （ｈ）（ｌ−ｈ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２８５を含むＦＲ１、配列番号２８６を含むＦＲ２、配列番号３７５を含むＦＲ３および配列番号３７６を含むＦＲ４；
    （ｉ）（ｌ−ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２８７を含むＦＲ１、配列番号２８８を含むＦＲ２、配列番号３７７を含むＦＲ３および配列番号３７８を含むＦＲ４；
    （ｊ）（ｌ−ｊ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２８９を含むＦＲ１、配列番号２９０を含むＦＲ２、配列番号３７９を含むＦＲ３および配列番号３８０を含むＦＲ４；
    （ｋ）（ｌ−ｋ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２９１を含むＦＲ１、配列番号２９２を含むＦＲ２、配列番号３８１を含むＦＲ３および配列番号３８２を含むＦＲ４；
    （ｌ）（ｌ−ｌ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２９３を含むＦＲ１、配列番号２９４を含むＦＲ２、配列番号３８３を含むＦＲ３および配列番号３８４を含むＦＲ４；
    （ｍ）（ｌ−ｍ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２９５を含むＦＲ１、配列番号２９６を含むＦＲ２、配列番号３８５を含むＦＲ３および配列番号３８６を含むＦＲ４；
    （ｎ）（ｌ−ｎ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２９７を含むＦＲ１、配列番号２９８を含むＦＲ２、配列番号３８７を含むＦＲ３および配列番号３８８を含むＦＲ４；
    （ｏ）（ｌ−ｏ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２９９を含むＦＲ１、配列番号３００を含むＦＲ２、配列番号３８９を含むＦＲ３および配列番号３９０を含むＦＲ４；
    （ｐ）（ｌ−ｐ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３０１を含むＦＲ１、配列番号３０２を含むＦＲ２、配列番号３９１を含むＦＲ３および配列番号３９２を含むＦＲ４；
    （ｑ）（ｌ−ｑ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３０３を含むＦＲ１、配列番号３０４を含むＦＲ２、配列番号３９３を含むＦＲ３および配列番号３９４を含むＦＲ４；
    （ｒ）（ｌ−ｒ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３０５を含むＦＲ１、配列番号３０６を含むＦＲ２、配列番号３９５を含むＦＲ３および配列番号３９６を含むＦＲ４；
    （ｓ）（ｌ−ｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３０７を含むＦＲ１、配列番号３０８を含むＦＲ２、配列番号３９７を含むＦＲ３および配列番号３９８を含むＦＲ４；
    （ｔ）（ｌ−ｔ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３０９を含むＦＲ１、配列番号３１０を含むＦＲ２、配列番号３９９を含むＦＲ３および配列番号４００を含むＦＲ４；
    （ｕ）（ｌ−ｕ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３１１を含むＦＲ１、配列番号３１２を含むＦＲ２、配列番号４０１を含むＦＲ３および配列番号４０２を含むＦＲ４；
    （ｖ）（ｌ−ｖ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３１３を含むＦＲ１、配列番号３１４を含むＦＲ２、配列番号４０３を含むＦＲ３および配列番号４０４を含むＦＲ４；
    （ｗ）（ｌ−ｗ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３１５を含むＦＲ１、配列番号３１６を含むＦＲ２、配列番号４０５を含むＦＲ３および配列番号４０６を含むＦＲ４；
    （ｘ）（ｌ−ｘ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３１７を含むＦＲ１、配列番号３１８を含むＦＲ２、配列番号４０７を含むＦＲ３および配列番号４０８を含むＦＲ４；
    （ｙ）（ｌ−ｙ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３１９を含むＦＲ１、配列番号３２０を含むＦＲ２、配列番号４０９を含むＦＲ３および配列番号４１０を含むＦＲ４；
    （ｚ）（ｌ−ｚ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３２１を含むＦＲ１、配列番号３２２を含むＦＲ２、配列番号４１１を含むＦＲ３および配列番号４１２を含むＦＲ４；
    （ａ’）（ｌ−ａ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３２３を含むＦＲ１、配列番号３２４を含むＦＲ２、配列番号４１３を含むＦＲ３および配列番号４１４を含むＦＲ４；
    （ｂ’）（ｌ−ｂ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３２５を含むＦＲ１、配列番号３２６を含むＦＲ２、配列番号４１５を含むＦＲ３および配列番号４１６を含むＦＲ４；
    （ｃ’）（ｌ−ｃ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３２７を含むＦＲ１、配列番号３２８を含むＦＲ２、配列番号４１７を含むＦＲ３および配列番号４１８を含むＦＲ４；
    （ｄ’）（ｌ−ｄ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３２９を含むＦＲ１、配列番号３３０を含むＦＲ２、配列番号４１９を含むＦＲ３および配列番号４２０を含むＦＲ４；
    （ｅ’）（ｌ−ｅ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３３１を含むＦＲ１、配列番号３３２を含むＦＲ２、配列番号４２１を含むＦＲ３および配列番号４２２を含むＦＲ４；
    （ｆ’）（ｌ−ｆ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３３３を含むＦＲ１、配列番号３３４を含むＦＲ２、配列番号４２３を含むＦＲ３および配列番号４２４を含むＦＲ４；
    （ｇ’）（ｌ−ｇ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３３５を含むＦＲ１、配列番号３３６を含むＦＲ２、配列番号４２５を含むＦＲ３および配列番号４２６を含むＦＲ４；
    （ｈ’）（ｌ−ｈ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３３７を含むＦＲ１、配列番号３３８を含むＦＲ２、配列番号４２７を含むＦＲ３および配列番号４２８を含むＦＲ４；
    （ｉ’）（ｌ−ｉ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３３９を含むＦＲ１、配列番号３４０を含むＦＲ２、配列番号４２９を含むＦＲ３および配列番号４３０を含むＦＲ４；
    （ｊ’）（ｌ−ｊ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３４１を含むＦＲ１、配列番号３４２を含むＦＲ２、配列番号４３１を含むＦＲ３および配列番号４３２を含むＦＲ４；
    （ｋ’）（ｌ−ｋ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３４３を含むＦＲ１、配列番号３４４を含むＦＲ２、配列番号４３３を含むＦＲ３および配列番号４３４を含むＦＲ４；
    （ｌ’）（ｌ−ｌ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３４５を含むＦＲ１、配列番号３４６を含むＦＲ２、配列番号４３５を含むＦＲ３および配列番号４３６を含むＦＲ４；
    （ｍ’）（ｌ−ｍ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３４７を含むＦＲ１、配列番号３４８を含むＦＲ２、配列番号４３７を含むＦＲ３および配列番号４３８を含むＦＲ４；
    （ｎ’）（ｌ−ｎ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３４９を含むＦＲ１、配列番号３５０を含むＦＲ２、配列番号４３９を含むＦＲ３および配列番号４４０を含むＦＲ４；
    （ｏ’）（ｌ−ｏ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３５１を含むＦＲ１、配列番号３５２を含むＦＲ２、配列番号４４１を含むＦＲ３および配列番号４４２を含むＦＲ４；
    （ｐ’）（ｌ−ｐ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３５３を含むＦＲ１、配列番号３５４を含むＦＲ２、配列番号４４３を含むＦＲ３および配列番号４４４を含むＦＲ４；
    （ｑ’）（ｌ−ｑ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３５５を含むＦＲ１、配列番号３５６を含むＦＲ２、配列番号４４５を含むＦＲ３および配列番号４４６を含むＦＲ４；
    （ｒ’）（ｌ−ｒ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３５７を含むＦＲ１、配列番号３５８を含むＦＲ２、配列番号４４７を含むＦＲ３および配列番号４４８を含むＦＲ４；ならびに
    （ｓ’）（ｌ−ｓ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号３５９を含むＦＲ１、配列番号３６０を含むＦＲ２、配列番号４４９を含むＦＲ３および配列番号４５０を含むＦＲ４
    からなる群から選択されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む、請求項１記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  6. （ｈ−ａ）配列番号１３６を含むＣＤＲ１、配列番号１３７を含むＣＤＲ２および配列番号１３８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｂ）配列番号１３９を含むＣＤＲ１、配列番号１４０を含むＣＤＲ２および配列番号１４１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｃ）配列番号１４２を含むＣＤＲ１、配列番号１４３を含むＣＤＲ２および配列番号１４４を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｄ）配列番号１４５を含むＣＤＲ１、配列番号１４６を含むＣＤＲ２および配列番号１４７を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｅ）配列番号１４８を含むＣＤＲ１、配列番号１４９を含むＣＤＲ２および配列番号１５０を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｆ）配列番号１５１を含むＣＤＲ１、配列番号１５２を含むＣＤＲ２および配列番号１５３を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｇ）配列番号１５４を含むＣＤＲ１、配列番号１５５を含むＣＤＲ２および配列番号１５６を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｈ）配列番号１５７を含むＣＤＲ１、配列番号１５８を含むＣＤＲ２および配列番号１５９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｉ）配列番号１６０を含むＣＤＲ１、配列番号１６１を含むＣＤＲ２および配列番号１６２を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｊ）配列番号１６３を含むＣＤＲ１、配列番号１６４を含むＣＤＲ２および配列番号１６５を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｋ）配列番号１６６を含むＣＤＲ１、配列番号１６７を含むＣＤＲ２および配列番号１６８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｌ）配列番号１６９を含むＣＤＲ１、配列番号１７０を含むＣＤＲ２および配列番号１７１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｍ）配列番号１７２を含むＣＤＲ１、配列番号１７３を含むＣＤＲ２および配列番号１７４を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｎ）配列番号１７５を含むＣＤＲ１、配列番号１７６を含むＣＤＲ２および配列番号１７７を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｏ）配列番号１７８を含むＣＤＲ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ２および配列番号１８０を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｐ）配列番号１８１を含むＣＤＲ１、配列番号１８２を含むＣＤＲ２および配列番号１８３を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｑ）配列番号１８４を含むＣＤＲ１、配列番号１８５を含むＣＤＲ２および配列番号１８６を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｒ）配列番号１８７を含むＣＤＲ１、配列番号１８８を含むＣＤＲ２および配列番号１８９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｓ）配列番号１９０を含むＣＤＲ１、配列番号１９１を含むＣＤＲ２および配列番号１９２を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｔ）配列番号１９３を含むＣＤＲ１、配列番号１９４を含むＣＤＲ２および配列番号１９５を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｕ）配列番号１９６を含むＣＤＲ１、配列番号１９７を含むＣＤＲ２および配列番号１９８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｖ）配列番号１９９を含むＣＤＲ１、配列番号２００を含むＣＤＲ２および配列番号２０１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｗ）配列番号２０２を含むＣＤＲ１、配列番号２０３を含むＣＤＲ２および配列番号２０４を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｘ）配列番号２０５を含むＣＤＲ１、配列番号２０６を含むＣＤＲ２および配列番号２０７を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｙ）配列番号２０８を含むＣＤＲ１、配列番号２０９を含むＣＤＲ２および配列番号２１０を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｚ）配列番号２１１を含むＣＤＲ１、配列番号２１２を含むＣＤＲ２および配列番号２１３を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ａ’）配列番号２１４を含むＣＤＲ１、配列番号２１５を含むＣＤＲ２および配列番号２１６を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｂ’）配列番号２１７を含むＣＤＲ１、配列番号２１８を含むＣＤＲ２および配列番号２１９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｃ’）配列番号２２０を含むＣＤＲ１、配列番号２２１を含むＣＤＲ２および配列番号２２２を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｄ’）配列番号２２３を含むＣＤＲ１、配列番号２２４を含むＣＤＲ２および配列番号２２５を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｅ’）配列番号２２６を含むＣＤＲ１、配列番号２２７を含むＣＤＲ２および配列番号２２８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｆ’）配列番号２２９を含むＣＤＲ１、配列番号２３０を含むＣＤＲ２および配列番号２３１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｇ’）配列番号２３２を含むＣＤＲ１、配列番号２３３を含むＣＤＲ２および配列番号２３４を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｈ’）配列番号２３５を含むＣＤＲ１、配列番号２３６を含むＣＤＲ２および配列番号２３７を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｉ’）配列番号２３８を含むＣＤＲ１、配列番号２３９を含むＣＤＲ２および配列番号２４０を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｊ’）配列番号２４１を含むＣＤＲ１、配列番号２４２を含むＣＤＲ２および配列番号２４３を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｋ’）配列番号２４４を含むＣＤＲ１、配列番号２４５を含むＣＤＲ２および配列番号２４６を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｌ’）配列番号２４７を含むＣＤＲ１、配列番号２４８を含むＣＤＲ２および配列番号２４９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｍ’）配列番号２５０を含むＣＤＲ１、配列番号２５１を含むＣＤＲ２および配列番号２５２を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｎ’）配列番号２５３を含むＣＤＲ１、配列番号２５４を含むＣＤＲ２および配列番号２５５を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｏ’）配列番号２５６を含むＣＤＲ１、配列番号２５７を含むＣＤＲ２および配列番号２５８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｐ’）配列番号２５９を含むＣＤＲ１、配列番号２６０を含むＣＤＲ２および配列番号２６１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｑ’）配列番号２６２を含むＣＤＲ１、配列番号２６３を含むＣＤＲ２および配列番号２６４を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｒ’）配列番号２６５を含むＣＤＲ１、配列番号２６６を含むＣＤＲ２および配列番号２６７を含むＣＤＲ３；ならびに
    （ｈ−ｓ’）配列番号２６８を含むＣＤＲ１、配列番号２６９を含むＣＤＲ２および配列番号２７０を含むＣＤＲ３
    からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＭＶに特異的に結合する組換え抗原結合性タンパク質。
  7. ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、
    （ｈ−ｂ）配列番号１３９を含むＣＤＲ１、配列番号１４０を含むＣＤＲ２および配列番号１４１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｇ）配列番号１５４を含むＣＤＲ１、配列番号１５５を含むＣＤＲ２および配列番号１５６を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｋ）配列番号１６６を含むＣＤＲ１、配列番号１６７を含むＣＤＲ２および配列番号１６８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｏ）配列番号１７８を含むＣＤＲ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ２および配列番号１８０を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｕ）配列番号１９６を含むＣＤＲ１、配列番号１９７を含むＣＤＲ２および配列番号１９８を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｂ’）配列番号２１７を含むＣＤＲ１、配列番号２１８を含むＣＤＲ２および配列番号２１９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｄ’）配列番号２２３を含むＣＤＲ１、配列番号２２４を含むＣＤＲ２および配列番号２２５を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｆ’）配列番号２２９を含むＣＤＲ１、配列番号２３０を含むＣＤＲ２および配列番号２３１を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｌ’）配列番号２４７を含むＣＤＲ１、配列番号２４８を含むＣＤＲ２および配列番号２４９を含むＣＤＲ３；
    （ｈ−ｍ’）配列番号２５０を含むＣＤＲ１、配列番号２５１を含むＣＤＲ２および配列番号２５２を含むＣＤＲ３；ならびに
    （ｈ−ｒ’）配列番号２６５を含むＣＤＲ１、配列番号２６６を含むＣＤＲ２および配列番号２６７を含むＣＤＲ３
    からなる群から選択され、該抗原結合性タンパク質がＣＭＶを中和する、請求項６記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  8. 該抗原結合性タンパク質がヒト化抗体である、請求項６または請求項７記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  9. 該重鎖可変領域ドメインが、配列番号６３３、６３４、６３７、６３８、６４１、６４４および６４５からなる群から選択される、請求項６記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  10. 該重鎖可変領域が更に、
    （ａ）（ｈ−ａ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４５１を含むＦＲ１、配列番号４５２を含むＦＲ２、配列番号５４１を含むＦＲ３および配列番号５４２を含むＦＲ４；
    （ｂ）（ｈ−ｂ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４５３を含むＦＲ１、配列番号４５４を含むＦＲ２、配列番号５４３を含むＦＲ３および配列番号５４４を含むＦＲ４；
    （ｃ）（ｈ−ｃ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４５５を含むＦＲ１、配列番号４５６を含むＦＲ２、配列番号５４５を含むＦＲ３および配列番号５４６を含むＦＲ４；
    （ｄ）（ｈ−ｄ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４５７を含むＦＲ１、配列番号４５８を含むＦＲ２、配列番号５４７を含むＦＲ３および配列番号５４８を含むＦＲ４；
    （ｅ）（ｈ−ｅ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４５９を含むＦＲ１、配列番号４６０を含むＦＲ２、配列番号５４９を含むＦＲ３および配列番号５５０を含むＦＲ４；
    （ｆ）（ｈ−ｆ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４６１を含むＦＲ１、配列番号４６２を含むＦＲ２、配列番号５５１を含むＦＲ３および配列番号５５２を含むＦＲ４；
    （ｇ）（ｈ−ｇ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４６３を含むＦＲ１、配列番号４６４を含むＦＲ２、配列番号５５３を含むＦＲ３および配列番号５５４を含むＦＲ４；
    （ｈ）（ｈ−ｈ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４６５を含むＦＲ１、配列番号４６６を含むＦＲ２、配列番号５５５を含むＦＲ３および配列番号５５６を含むＦＲ４；
    （ｉ）（ｈ−ｉ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４６７を含むＦＲ１、配列番号４６８を含むＦＲ２、配列番号５５７を含むＦＲ３および配列番号５５８を含むＦＲ４；
    （ｊ）（ｈ−ｊ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４６９を含むＦＲ１、配列番号４７０を含むＦＲ２、配列番号５５９を含むＦＲ３および配列番号５６０を含むＦＲ４；
    （ｋ）（ｈ−ｋ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４７１を含むＦＲ１、配列番号４７２を含むＦＲ２、配列番号５６１を含むＦＲ３および配列番号５６２を含むＦＲ４；
    （ｌ）（ｈ−ｌ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４７３を含むＦＲ１、配列番号４７４を含むＦＲ２、配列番号５６３を含むＦＲ３および配列番号５６４を含むＦＲ４；
    （ｍ）（ｈ−ｍ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４７５を含むＦＲ１、配列番号４７６を含むＦＲ２、配列番号５６５を含むＦＲ３および配列番号５６６を含むＦＲ４；
    （ｎ）（ｈ−ｎ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４７７を含むＦＲ１、配列番号４７８を含むＦＲ２、配列番号５６７を含むＦＲ３および配列番号５６８を含むＦＲ４；
    （ｏ）（ｈ−ｏ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４７９を含むＦＲ１、配列番号４８０を含むＦＲ２、配列番号５６９を含むＦＲ３および配列番号５７０を含むＦＲ４；
    （ｐ）（ｈ−ｐ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４８１を含むＦＲ１、配列番号４８２を含むＦＲ２、配列番号５７１を含むＦＲ３および配列番号５７２を含むＦＲ４；
    （ｑ）（ｈ−ｑ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４８３を含むＦＲ１、配列番号４８４を含むＦＲ２、配列番号５７３を含むＦＲ３および配列番号５７４を含むＦＲ４；
    （ｒ）（ｈ−ｒ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４８５を含むＦＲ１、配列番号４８６を含むＦＲ２、配列番号５７５を含むＦＲ３および配列番号５７６を含むＦＲ４；
    （ｓ）（ｈ−ｓ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４８７を含むＦＲ１、配列番号４８８を含むＦＲ２、配列番号５７７を含むＦＲ３および配列番号５７８を含むＦＲ４；
    （ｔ）（ｈ−ｔ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４８９を含むＦＲ１、配列番号４９０を含むＦＲ２、配列番号５７９を含むＦＲ３および配列番号５８０を含むＦＲ４；
    （ｕ）（ｈ−ｕ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４９１を含むＦＲ１、配列番号４９２を含むＦＲ２、配列番号５８１を含むＦＲ３および配列番号５８２を含むＦＲ４；
    （ｖ）（ｈ−ｖ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４９３を含むＦＲ１、配列番号４９４を含むＦＲ２、配列番号５８３を含むＦＲ３および配列番号５８４を含むＦＲ４；
    （ｗ）（ｈ−ｗ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４９５を含むＦＲ１、配列番号４９６を含むＦＲ２、配列番号５８５を含むＦＲ３および配列番号５８６を含むＦＲ４；
    （ｘ）（ｈ−ｘ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４９７を含むＦＲ１、配列番号４９８を含むＦＲ２、配列番号５８７を含むＦＲ３および配列番号５８８を含むＦＲ４；
    （ｙ）（ｈ−ｙ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号４９９を含むＦＲ１、配列番号５００を含むＦＲ２、配列番号５８９を含むＦＲ３および配列番号５９０を含むＦＲ４；
    （ｚ）（ｈ−ｚ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５０１を含むＦＲ１、配列番号５０２を含むＦＲ２、配列番号５９１を含むＦＲ３および配列番号５９２を含むＦＲ４；
    （ａ’）（ｈ−ａ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５０３を含むＦＲ１、配列番号５０４を含むＦＲ２、配列番号５９３を含むＦＲ３および配列番号５９４を含むＦＲ４；
    （ｂ’）（ｈ−ｂ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５０５を含むＦＲ１、配列番号５０６を含むＦＲ２、配列番号５９５を含むＦＲ３および配列番号５９６を含むＦＲ４；
    （ｃ’）（ｈ−ｃ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５０７を含むＦＲ１、配列番号５０８を含むＦＲ２、配列番号５９７を含むＦＲ３および配列番号５９８を含むＦＲ４；
    （ｄ’）（ｈ−ｄ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５０９を含むＦＲ１、配列番号５１０を含むＦＲ２、配列番号５９９を含むＦＲ３および配列番号６００を含むＦＲ４；
    （ｅ’）（ｈ−ｅ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５１１を含むＦＲ１、配列番号５１２を含むＦＲ２、配列番号６０１を含むＦＲ３および配列番号６０２を含むＦＲ４；
    （ｆ’）（ｈ−ｆ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５１３を含むＦＲ１、配列番号５１４を含むＦＲ２、配列番号６０３を含むＦＲ３および配列番号６０４を含むＦＲ４；
    （ｇ’）（ｈ−ｇ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５１５を含むＦＲ１、配列番号５１６を含むＦＲ２、配列番号６０５を含むＦＲ３および配列番号６０６を含むＦＲ４；
    （ｈ’）（ｈ−ｈ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５１７を含むＦＲ１、配列番号５１８を含むＦＲ２、配列番号６０７を含むＦＲ３および配列番号６０８を含むＦＲ４；
    （ｉ’）（ｈ−ｉ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５１９を含むＦＲ１、配列番号５２０を含むＦＲ２、配列番号６０９を含むＦＲ３および配列番号６１０を含むＦＲ４；
    （ｊ’）（ｈ−ｊ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５２１を含むＦＲ１、配列番号５２２を含むＦＲ２、配列番号６１１を含むＦＲ３および配列番号６１２を含むＦＲ４；
    （ｋ’）（ｈ−ｋ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５２３を含むＦＲ１、配列番号５２４を含むＦＲ２、配列番号６１３を含むＦＲ３および配列番号６１４を含むＦＲ４；
    （ｌ’）（ｈ−ｌ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５２５を含むＦＲ１、配列番号５２６を含むＦＲ２、配列番号６１５を含むＦＲ３および配列番号６１６を含むＦＲ４；
    （ｍ’）（ｈ−ｍ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５２７を含むＦＲ１、配列番号５２８を含むＦＲ２、配列番号６１７を含むＦＲ３および配列番号６１８を含むＦＲ４；
    （ｎ’）（ｈ−ｎ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５２９を含むＦＲ１、配列番号５３０を含むＦＲ２、配列番号６１９を含むＦＲ３および配列番号６２０を含むＦＲ４；
    （ｏ’）（ｈ−ｏ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５３１を含むＦＲ１、配列番号５３２を含むＦＲ２、配列番号６２１を含むＦＲ３および配列番号６２２を含むＦＲ４；
    （ｐ’）（ｈ−ｐ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５３３を含むＦＲ１、配列番号５３４を含むＦＲ２、配列番号６２３を含むＦＲ３および配列番号６２４を含むＦＲ４；
    （ｑ’）（ｈ−ｑ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５３５を含むＦＲ１、配列番号５３６を含むＦＲ２、配列番号６２５を含むＦＲ３および配列番号６２６を含むＦＲ４；
    （ｒ’）（ｈ−ｒ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５３７を含むＦＲ１、配列番号５３８を含むＦＲ２、配列番号６２７を含むＦＲ３および配列番号６２８を含むＦＲ４；ならびに
    （ｓ’）（ｈ−ｓ’）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５３９を含むＦＲ１、配列番号５４０を含むＦＲ２、配列番号６２９を含むＦＲ３および配列番号６３０を含むＦＲ４；
    からなる群から選択されるフレームワーク領域（ＦＲ）１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む、請求項６記載の組換え抗原結合性タンパク質。
  11. （ａ）請求項４記載の（ａ）の軽鎖および請求項８記載の（ａ）の重鎖；
    （ｂ）請求項４記載の（ｂ）の軽鎖および請求項８記載の（ｂ）の重鎖；
    （ｃ）請求項４記載の（ｃ）の軽鎖および請求項８記載の（ｃ）の重鎖；
    （ｄ）請求項４記載の（ｄ）の軽鎖および請求項８記載の（ｄ）の重鎖；
    （ｅ）請求項４記載の（ｅ）の軽鎖および請求項８記載の（ｅ）の重鎖；
    （ｆ）請求項４記載の（ｆ）の軽鎖および請求項８記載の（ｆ）の重鎖；
    （ｇ）請求項４記載の（ｇ）の軽鎖および請求項８記載の（ｇ）の重鎖；
    （ｈ）請求項４記載の（ｈ）の軽鎖および請求項８記載の（ｈ）の重鎖；
    （ｉ）請求項４記載の（ｉ）の軽鎖および請求項８記載の（ｉ）の重鎖；
    （ｊ）請求項４記載の（ｊ）の軽鎖および請求項８記載の（ｊ）の重鎖；
    （ｋ）請求項４記載の（ｋ）の軽鎖および請求項８記載の（ｋ）の重鎖；
    （ｌ）請求項４記載の（ｌ）の軽鎖および請求項８記載の（ｌ）の重鎖；
    （ｍ）請求項４記載の（ｍ）の軽鎖および請求項８記載の（ｍ）の重鎖；
    （ｎ）請求項４記載の（ｎ）の軽鎖および請求項８記載の（ｎ）の重鎖；
    （ｏ）請求項４記載の（ｏ）の軽鎖および請求項８記載の（ｏ）の重鎖；
    （ｐ）請求項４記載の（ｐ）の軽鎖および請求項８記載の（ｐ）の重鎖；
    （ｑ）請求項４記載の（ｑ）の軽鎖および請求項８記載の（ｑ）の重鎖；
    （ｒ）請求項４記載の（ｒ）の軽鎖および請求項８記載の（ｒ）の重鎖；
    （ｓ）請求項４記載の（ｓ）の軽鎖および請求項８記載の（ｓ）の重鎖；
    （ｔ）請求項４記載の（ｔ）の軽鎖および請求項８記載の（ｔ）の重鎖；
    （ｕ）請求項４記載の（ｕ）の軽鎖および請求項８記載の（ｕ）の重鎖；
    （ｖ）請求項４記載の（ｖ）の軽鎖および請求項８記載の（ｖ）の重鎖；
    （ｗ）請求項４記載の（ｗ）の軽鎖および請求項８記載の（ｗ）の重鎖；
    （ｘ）請求項４記載の（ｘ）の軽鎖および請求項８記載の（ｘ）の重鎖；
    （ｙ）請求項４記載の（ｙ）の軽鎖および請求項８記載の（ｙ）の重鎖；
    （ｚ）請求項４記載の（ｚ）の軽鎖および請求項８記載の（ｚ）の重鎖；
    （ａ’）請求項４記載の（ａ’）の軽鎖および請求項８記載の（ａ’）の重鎖；
    （ｂ’）請求項４記載の（ｂ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｂ’）の重鎖；
    （ｃ’）請求項４記載の（ｃ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｃ’）の重鎖；
    （ｄ’）請求項４記載の（ｄ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｄ’）の重鎖；
    （ｅ’）請求項４記載の（ｅ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｅ’）の重鎖；
    （ｆ’）請求項４記載の（ｆ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｆ’）の重鎖；
    （ｇ’）請求項４記載の（ｇ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｇ’）の重鎖；
    （ｈ’）請求項４記載の（ｈ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｈ’）の重鎖；
    （ｉ’）請求項４記載の（ｉ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｉ’）の重鎖；
    （ｊ’）請求項４記載の（ｊ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｊ’）の重鎖；
    （ｋ’）請求項４記載の（ｋ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｋ’）の重鎖；
    （ｌ’）請求項４記載の（ｌ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｌ’）の重鎖；
    （ｍ’）請求項４記載の（ｍ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｍ’）の重鎖；
    （ｎ’）請求項４記載の（ｎ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｎ’）の重鎖；
    （ｏ’）請求項４記載の（ｏ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｏ’）の重鎖；
    （ｐ’）請求項４記載の（ｐ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｐ’）の重鎖；
    （ｑ’）請求項４記載の（ｑ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｑ’）の重鎖；
    （ｒ’）請求項４記載の（ｒ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｒ’）の重鎖；ならびに
    （ｓ’）請求項４記載の（ｓ’）の軽鎖および請求項８記載の（ｓ’）の重鎖
    からなる群から選択される軽鎖および重鎖を含む組換え抗原結合性タンパク質。
  12. （ａ）配列番号１を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２を含むＣＤＲ２および配列番号３を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１３６を含むＣＤＲ１、配列番号１３７を含むＣＤＲ２および配列番号１３８を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｂ）配列番号４を含むＣＤＲ１、配列番号５を含むＣＤＲ２および配列番号６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１３９を含むＣＤＲ１、配列番号１４０を含むＣＤＲ２および配列番号１４１を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｃ）配列番号７を含むＣＤＲ１、配列番号８を含むＣＤＲ２および配列番号９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１４２を含むＣＤＲ１、配列番号１４３を含むＣＤＲ２および配列番号１４４を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｄ）配列番号１０を含むＣＤＲ１、配列番号１１を含むＣＤＲ２および配列番号１２を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１４５を含むＣＤＲ１、配列番号１４６を含むＣＤＲ２および配列番号１４７を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｅ）配列番号１３を含むＣＤＲ１、配列番号１４を含むＣＤＲ２および配列番号１５を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１４８を含むＣＤＲ１、配列番号１４９を含むＣＤＲ２および配列番号１５０を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｆ）配列番号１６を含むＣＤＲ１、配列番号１７を含むＣＤＲ２および配列番号１８を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１５１を含むＣＤＲ１、配列番号１５２を含むＣＤＲ２および配列番号１５３を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｇ）配列番号１９を含むＣＤＲ１、配列番号２０を含むＣＤＲ２および配列番号２１を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１５４を含むＣＤＲ１、配列番号１５５を含むＣＤＲ２および配列番号１５６を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｈ）配列番号２２を含むＣＤＲ１、配列番号２３を含むＣＤＲ２および配列番号２４を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１５７を含むＣＤＲ１、配列番号１５８を含むＣＤＲ２および配列番号１５９を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｉ）配列番号２５を含むＣＤＲ１、配列番号２６を含むＣＤＲ２および配列番号２７を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１６０を含むＣＤＲ１、配列番号１６１を含むＣＤＲ２および配列番号１６２を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｊ）配列番号２８を含むＣＤＲ１、配列番号２９を含むＣＤＲ２および配列番号３０を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１６３を含むＣＤＲ１、配列番号１６４を含むＣＤＲ２および配列番号１６５を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｋ）配列番号３１を含むＣＤＲ１、配列番号３２を含むＣＤＲ２および配列番号３３を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１６６を含むＣＤＲ１、配列番号１６７を含むＣＤＲ２および配列番号１６８を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｌ）配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２および配列番号３６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１６９を含むＣＤＲ１、配列番号１７０を含むＣＤＲ２および配列番号１７１を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｍ）配列番号３７を含むＣＤＲ１、配列番号３８を含むＣＤＲ２および配列番号３９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１７２を含むＣＤＲ１、配列番号１７３を含むＣＤＲ２および配列番号１７４を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｎ）配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１を含むＣＤＲ２および配列番号４２を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１７５を含むＣＤＲ１、配列番号１７６を含むＣＤＲ２および配列番号１７７を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｏ）配列番号４３を含むＣＤＲ１、配列番号４４を含むＣＤＲ２および配列番号４５を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１７８を含むＣＤＲ１、配列番号１７９を含むＣＤＲ２および配列番号１８０を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｐ）配列番号４６を含むＣＤＲ１、配列番号４７を含むＣＤＲ２および配列番号４８を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１８１を含むＣＤＲ１、配列番号１８２を含むＣＤＲ２および配列番号１８３を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｑ）配列番号４９を含むＣＤＲ１、配列番号５０を含むＣＤＲ２および配列番号５１を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１８４を含むＣＤＲ１、配列番号１８５を含むＣＤＲ２および配列番号１８６を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｒ）配列番号５２を含むＣＤＲ１、配列番号５３を含むＣＤＲ２および配列番号５４を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１８７を含むＣＤＲ１、配列番号１８８を含むＣＤＲ２および配列番号１８９を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｓ）配列番号５５を含むＣＤＲ１、配列番号５６を含むＣＤＲ２および配列番号５７を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１９０を含むＣＤＲ１、配列番号１９１を含むＣＤＲ２および配列番号１９２を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｔ）配列番号５８を含むＣＤＲ１、配列番号５９を含むＣＤＲ２および配列番号６０を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１９３を含むＣＤＲ１、配列番号１９４を含むＣＤＲ２および配列番号１９５を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｕ）配列番号６１を含むＣＤＲ１、配列番号６２を含むＣＤＲ２および配列番号６３を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１９６を含むＣＤＲ１、配列番号１９７を含むＣＤＲ２および配列番号１９８を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｖ）配列番号６４を含むＣＤＲ１、配列番号６５を含むＣＤＲ２および配列番号６６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１９９を含むＣＤＲ１、配列番号２００を含むＣＤＲ２および配列番号２０１を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｗ）配列番号６７を含むＣＤＲ１、配列番号６８を含むＣＤＲ２および配列番号６９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２０２を含むＣＤＲ１、配列番号２０３を含むＣＤＲ２および配列番号２０４を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｘ）配列番号７０を含むＣＤＲ１、配列番号７１を含むＣＤＲ２および配列番号７２を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２０５を含むＣＤＲ１、配列番号２０６を含むＣＤＲ２および配列番号２０７を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｙ）配列番号７３を含むＣＤＲ１、配列番号７４を含むＣＤＲ２および配列番号７５を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２０８を含むＣＤＲ１、配列番号２０９を含むＣＤＲ２および配列番号２１０を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｚ）配列番号７６を含むＣＤＲ１、配列番号７７を含むＣＤＲ２および配列番号７８を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２１１を含むＣＤＲ１、配列番号２１２を含むＣＤＲ２および配列番号２１３を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ａ’）配列番号７９を含むＣＤＲ１、配列番号８０を含むＣＤＲ２および配列番号８１を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２１４を含むＣＤＲ１、配列番号２１５を含むＣＤＲ２および配列番号２１６を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｂ’）配列番号８２を含むＣＤＲ１、配列番号８３を含むＣＤＲ２および配列番号８４を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２１７を含むＣＤＲ１、配列番号２１８を含むＣＤＲ２および配列番号２１９を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｃ’）配列番号８５を含むＣＤＲ１、配列番号８６を含むＣＤＲ２および配列番号８７を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２２０を含むＣＤＲ１、配列番号２２１を含むＣＤＲ２および配列番号２２２を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｄ’）配列番号８８を含むＣＤＲ１、配列番号８９を含むＣＤＲ２および配列番号９０を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２２３を含むＣＤＲ１、配列番号２２４を含むＣＤＲ２および配列番号２２５を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｅ’）配列番号９１を含むＣＤＲ１、配列番号９２を含むＣＤＲ２および配列番号９３を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２２６を含むＣＤＲ１、配列番号２２７を含むＣＤＲ２および配列番号２２８を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｆ’）配列番号９４を含むＣＤＲ１、配列番号９５を含むＣＤＲ２および配列番号９６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２２９を含むＣＤＲ１、配列番号２３０を含むＣＤＲ２および配列番号２３１を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｇ’）配列番号９７を含むＣＤＲ１、配列番号９８を含むＣＤＲ２および配列番号９９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２３２を含むＣＤＲ１、配列番号２３３を含むＣＤＲ２および配列番号２３４を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｈ’）配列番号１００を含むＣＤＲ１、配列番号１０１を含むＣＤＲ２および配列番号１０２を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２３５を含むＣＤＲ１、配列番号２３６を含むＣＤＲ２および配列番号２３７を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｉ’）配列番号１０３を含むＣＤＲ１、配列番号１０４を含むＣＤＲ２および配列番号１０５を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２３８を含むＣＤＲ１、配列番号２３９を含むＣＤＲ２および配列番号２４０を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｊ’）配列番号１０６を含むＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２４１を含むＣＤＲ１、配列番号２４２を含むＣＤＲ２および配列番号２４３を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｋ’）配列番号１０９を含むＣＤＲ１、配列番号１１０を含むＣＤＲ２および配列番号１１１を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２４４を含むＣＤＲ１、配列番号２４５を含むＣＤＲ２および配列番号２４６を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｌ’）配列番号１１２を含むＣＤＲ１、配列番号１１３を含むＣＤＲ２および配列番号１１４を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２４７を含むＣＤＲ１、配列番号２４８を含むＣＤＲ２および配列番号２４９を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｍ’）配列番号１１５を含むＣＤＲ１、配列番号１１６を含むＣＤＲ２および配列番号１１７を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２５０を含むＣＤＲ１、配列番号２５１を含むＣＤＲ２および配列番号２５２を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｎ’）配列番号１１８を含むＣＤＲ１、配列番号１１９を含むＣＤＲ２および配列番号１２０を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２５３を含むＣＤＲ１、配列番号２５４を含むＣＤＲ２および配列番号２５５を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｏ’）配列番号１２１を含むＣＤＲ１、配列番号１２２を含むＣＤＲ２および配列番号１２３を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２５６を含むＣＤＲ１、配列番号２５７を含むＣＤＲ２および配列番号２５８を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｐ’）配列番号１２４を含むＣＤＲ１、配列番号１２５を含むＣＤＲ２および配列番号１２６を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２５９を含むＣＤＲ１、配列番号２６０を含むＣＤＲ２および配列番号２６１を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｑ’）配列番号１２７を含むＣＤＲ１、配列番号１２８を含むＣＤＲ２および配列番号１２９を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２６２を含むＣＤＲ１、配列番号２６３を含むＣＤＲ２および配列番号２６４を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    （ｒ’）配列番号１３０を含むＣＤＲ１、配列番号１３１を含むＣＤＲ２および配列番号１３２を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２６５を含むＣＤＲ１、配列番号２６６を含むＣＤＲ２および配列番号２６７を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｓ’）配列番号１３３を含むＣＤＲ１、配列番号１３４を含むＣＤＲ２および配列番号１３５を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号２６８を含むＣＤＲ１、配列番号２６９を含むＣＤＲ２および配列番号２７０を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的に結合する組換え抗原結合性タンパク質。
  13. 該抗原結合性タンパク質がヒト化抗体である、請求項１２記載の抗原結合性タンパク質。
  14. 該抗原結合性タンパク質が、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、ジアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１〜２、４〜７および９〜１２のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質。
  15. モノクローナル抗体である、請求項１４記載の抗原結合性タンパク質。
  16. ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗原結合性タンパク質。
  17. 交差遮断アッセイにおいてＣＭＶへの請求項１１または１２記載の抗原結合性タンパク質の結合を交差遮断するモノクローナル抗体。
  18. サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に結合するモノクローナル抗体であって、請求項１１または１２記載の抗原結合性タンパク質により結合されるＣＭＶエピトープと同じ又は重複したＣＭＶエピトープに結合するモノクローナル抗体。
  19. 請求項１〜２、４〜７または９〜１２のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸。
  20. 請求項１９記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
  21. 請求項２０記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  22. 請求項１〜２、４〜７もしくは９〜１２のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質または請求項３、８もしくは１３のいずれか１項記載のヒト化抗体と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
  23. 請求項１〜２、４〜７もしくは９〜１２のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質または請求項３、８もしくは１３のいずれか１項記載のヒト化抗体の有効量を、ＣＭＶ感染の治療を要する対象に投与することを含む、対象におけるＣＭＶ感染の治療方法。
  24. （ａ）請求項１〜２、４〜７もしくは９〜１２のいずれか１項記載の１以上の抗原結合性タンパク質、
    （ｂ）請求項３、８もしくは１３のいずれか１項記載の１以上のヒト化抗体、または
    （ｃ）（ａ）と（ｂ）との組合せ
    を患者に投与することを含む、患者においてＣＭＶ感染に対する受動免疫を付与する方法。
  25. １以上の抗原結合性タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項２４記載の方法。
  26. 請求項１〜２、４〜７または９〜１２のいずれか１項記載の抗原結合性タンパク質の製造方法であって、
    ａ．核酸配列が発現される条件下、請求項２１記載の宿主細胞を培地内で培養し、それにより、軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生させ、
    ｂ．該ポリペプチドを該宿主細胞または培地から回収することを含む製造方法。
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