CN105579469A - Cmv中和抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合并优选中和人巨细胞病毒(CMV)的抗原结合蛋白，包括但不限于单克隆抗体及其抗原结合片段。本发明还包括的是已经被人源化的抗原结合蛋白。本发明的抗原结合蛋白用作治疗剂用于在有需要的患者中治疗和/或预防CMV感染。
Description
发明领域
本发明涉及抗CMV抗原结合蛋白，包括但不限于单克隆抗体。本发明还涉及本发明的抗原结合蛋白在CMV感染的诊断、治疗和/或预防中的用途。本发明也包括包含本发明的抗原结合蛋白的组合物。
相关申请的交叉参考
该申请要求2013年6月10日提交的美国临时申请号61/833,184的权益，其内容以其整体由此通过引用并入。
电子提交的序列表的参考
本申请的序列表作为ASCII格式化序列表通过EFS-Web电子提交，所述序列表文件名为“23530-SEQLIST-06JUNE2014.TXT”，创建日期为2014年6月6日，大小为154 KB。该序列表提交的EFS-Web是说明书的一部分并且以其整体通过参考并入本文。
发明背景
巨细胞病毒（CMV），也称为人疱疹病毒5(HHV-5)，是划分为疱疹病毒科β亚科成员的疱疹病毒。根据Centers for Disease Control and Prevention，CMV感染相当普遍地发现于人群中，其中估计40-80%的美国成年人群已经被感染。该病毒主要通过体液传播并经常从怀孕母亲传递到胎儿或新生儿。在大多数个体中，CMV感染是潜伏的，尽管病毒激活可以导致高烧、寒战、疲劳、头痛、恶心和脾大。
尽管大多数人CMV感染是无症状的，但是在免疫妥协的个体（如HIV阳性患者、同种异体移植患者和癌症患者）或其免疫系统仍未发育完全的人（如新生儿）中，CMV感染问题特别严重(Mocarski等, Cytomegalovirus, Field Virology, 2701-2772, 编辑:Knipes和Howley, 2007)。在该个体中，CMV感染可以引起严重的发病率，除其他有害状况外包括肺炎、肝炎、脑炎、结肠炎、眼色素层炎、视网膜炎、失明、和神经病。此外，怀孕过程中的CMV感染是出生缺陷的主要原因(Adler, 2008 J. Clin Virol, 41:231; Arvin等, 2004 ClinInfect Dis, 39:233; Revello等, 2008 J Med Virol, 80:1415)。
发明概述
本发明涉及抗CMV抗原结合蛋白，其具有一种或多种想要的性质，包括特异性结合并优选中和CMV。本发明还涉及本发明的抗原结合蛋白在CMV感染的治疗和/或预防中的用途。
在具体的实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白特异性结合并优选中和CMV。在更具体的实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白阻断/降低CMV病毒体结合细胞、与细胞膜融合和/或释放病毒遗传物质进入细胞中。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是重组抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是单克隆抗体。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是人源化抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是完全人抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是嵌合的抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是二价抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白重链和轻链相连以形成单链抗原结合蛋白。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是Fab片段、Fab'片段、(Fab')2片段、Fv结构域片段和scFv片段。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是双抗体。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是结构域抗体。
在具体的实施方案中，抗原结合蛋白是骆驼化单结构域抗体。
在又一额外的实施方案中，提供编码本文公开的任何抗原结合蛋白的重组核酸。
在又一额外的实施方案中，提供本文公开的抗原结合蛋白的用途，其用于制备药剂以在主体中治疗和/或预防CMV感染。
在又一其他实施方案中，提供本文公开的抗原结合蛋白，其用于在主体中治疗和/或预防CMV感染的方法中。
在又一额外的实施方案中，提供本文公开的任何抗原结合蛋白的用途，其用于诊断用途。
本发明还提供抗CMV抗原结合蛋白，其包含包括但不限于在Fc区中的一个或多个突变，所述突变增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和/或体内抗体半衰期。
在又一额外的实施方案中，提供表达载体，其包含编码本发明的抗原结合蛋白的分离的核酸。在一个实施方案中，分离的核酸编码本文所述的任何VH或VL链。本发明还涉及包含本文所述的任何表达载体的宿主细胞。
在具体的实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体或多肽用于制备抗体的方法中。
附图简述
图1A-1B:可以在回复体病毒体中检测到五聚gH复合体。AD169病毒和恢复上皮向性的回复体病毒涂铺在平板上并与(A) gB-特异性mAbs B8.6和35.1或(B) UL130 蛋白特异性mAb 3E3和3C5反应用于检测五聚gH复合体。gB-特异性mAbs与AD169和回复体病毒体同等反应，而UL130蛋白特异性mAbs仅与回复体病毒反应。
图2A-2C:一组45个兔mAbs与CMV的中和与结合性质的相关性分析。分别在病毒中和测定和结合测定中分析各抗体的中和和结合性质。人CMV超免疫IgG (HIG, CytoGam®)用作阳性对照，用于(A)抑制病毒进入ARPE-19细胞的能力和(B)结合对应于IgG浓度的CMV的能力。(C)分析45个鉴定的兔单克隆抗CMV抗体其EC50中和和EC50结合。根据其对回复体病毒的EC50中和（y-轴）和EC50结合（x-轴）绘制各mAb。中心的实心正方形符号代表HIG (CytoGam®)，水平虚线代表HIG的EC50中和。落在线之上的单克隆抗体（三角形）是中和mAb，而落在线之下的单克隆抗体是非中和mAb（环形）。原种(elite)中和mAb被鉴定为实心三角形。
图3:ARPE-19细胞中抗体的中和性质不总是与其在MRC-5细胞中活性相关。分析ARPE-19细胞相对于MRC-5细胞中各抗体的中和性质并计算EC50中和值。垂直线代表ARPE-19细胞中对HIG (CytoGam®)的EC50值。A组中的mAb仅中和ARPE-19细胞中的病毒，B组中的mAb中和两种细胞类型中的病毒，C组中的mAb在任何细胞类型中均不中和。
图4A-4D：与其中和活性相关的抗体的回复体病毒的优先结合。测试mAbs其与不同浓度的AD169病毒和回复体病毒的结合（x-轴）并相对于其EC50中和值进行绘制（y-轴）。单克隆抗体(A)仅与回复体病毒反应，（B）与回复体病毒和AD169病毒均反应，但优选回复体病毒或(C)与回复体病毒和AD169病毒均反应，但没有展示优先性。（D）显示原种中和（环形）和原种结合（三角形）mAb的结合特征。
图5：十一个原种中和抗体中的八个识别EIA中的重组五聚gH复合体。测定原种中和与原种结合mAbs与2μg/mL重组gB抗原或五聚gH复合体的反应性。为~1μg/mL浓度的各抗体绘制为重组五聚gH复合体（实心棒）或重组gB（空心棒）的结合所观察到的荧光信号。十一个原种中和抗体中的八个与五聚gH复合体反应，而仅两个原种结合抗体对五聚gH抗原显示特异性。
图6: 45个分离的mAbs与其抗原结合和中和性质相关的氨基酸序列的系统进化分析。基于完整的重链可变区氨基酸序列构建系统树。基于抗体之间重链CDR3中的相似性划分同系群。将含有两个或多个抗体的同系群聚集到盒中。实心点表示中和抗体，而空心点表示非中和抗体。三个点表示原种中和或原种结合抗体。
图7:原种中和抗体的平均重链CDR3大小显著大于原种结合抗体的平均重链CDR3大小。为分离的单克隆抗体绘制重链（闭合符号）和轻链（开放符号）CDR3长度。通过水平线指示平均CDR3长度。进行未配对的双尾t-检验用于所指示组的统计比较。环形表示原种中和抗体，倒三角表示原种结合抗体，三角形表示中和抗体，菱形表示非中和抗体。
图8A-8C:通过一些抗CMV单克隆抗体的补体依赖性病毒中和。单克隆抗体(A)295.5 (B) 272.7 和(C) 350.1与病毒在存在或不存在兔补体的情况下混合并测试其中和ARPE-19细胞的CMV感染的能力。通过ARPE-19细胞中病毒IE抗原的表达评价CMV感染。
图9A-B:抗CMV单克隆抗体的蛋白质印迹分析。将纯化的CMV病毒变性并在SDS-PAGE上分离病毒蛋白。将病毒蛋白转移到硝酸纤维素膜上并利用(A)本发明的45个分离的抗CMV单克隆抗体或(B)克隆58.5印迹。从接种前的兔血清中分离对照IgG（阴性对照）并从接种后的免疫兔血清中分离聚IgG（阳性对照）。
发明详述
本发明提供分离的抗CMV抗原结合蛋白和抗原结合蛋白在治疗和/或预防CMV感染中的使用方法。在一个实施方案中，本发明提供人源化或完全人抗CMV抗原结合蛋白和在治疗和/或预防CMV感染中的使用方法。
如本文所用，抗CMV抗原结合蛋白指特异性结合CMV的抗原结合蛋白。“特异性结合CMV”的抗原结合蛋白是这样的抗原结合蛋白，其展示相比于其他病毒与CMV的优先结合，但是该特异性不需要绝对的结合特异性。抗CMV抗原结合蛋白对CMV具有亲和力，其比与任何其他抗原的亲和力高至少2倍，优选至少10倍，更优选至少20倍，并最优选至少100倍。
抗CMV抗原结合蛋白
结合CMV的重组抗原结合蛋白可以包含本文公开的抗原结合蛋白的一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)。一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR可以独立地选自本文公开的抗原结合蛋白的CDR序列（例如，表1和2）。 或者，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR可以选自本发明的单个所述抗原结合蛋白的CDR序列。
结合CMV的重组抗原结合蛋白可以包含至少一个轻链可变(VL)结构域，其包含本发明的任何抗原结合蛋白的一个或多个CDR1、CDR2和CDR3（参见表1）。在具体的实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含本发明的抗原结合蛋白的三个CDR。
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在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:94的CDR1、SEQ IDNO:95的CDR2和SEQ ID NO:96的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:97的CDR1、SEQ IDNO:98的CDR2和SEQ ID NO:99的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:100的CDR1、SEQID NO:101的CDR2和SEQ ID NO:102的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:103的CDR1、SEQID NO:104的CDR2和SEQ ID NO:105的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:106的CDR1、SEQID NO:107的CDR2和SEQ ID NO:108的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:109的CDR1、SEQID NO:110的CDR2和SEQ ID NO:111的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:112的CDR1、SEQID NO:113的CDR2和SEQ ID NO:114的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:115的CDR1、SEQID NO:116的CDR2和SEQ ID NO:117的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:118的CDR1、SEQID NO:119的CDR2和SEQ ID NO:120的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:121的CDR1、SEQID NO:122的CDR2和SEQ ID NO:123的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:124的CDR1、SEQID NO:125的CDR2和SEQ ID NO:126的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:127的CDR1、SEQID NO:128的CDR2和SEQ ID NO:129的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:130的CDR1、SEQID NO:131的CDR2和SEQ ID NO:132的CDR3。
在实施方案中，抗原结合蛋白包含VL结构域，其包含SEQ ID NO:133的CDR1、SEQID NO:134的CDR2和SEQ ID NO:135的CDR3。
在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含与上述VL结构域具有至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性的VL结构域。
结合CMV的分离的抗原结合蛋白可以包含至少一个重链可变(VH)结构域，其包含本发明的任何抗原结合蛋白的一个或多个CDR1、CDR2和CDR3（参见表2）。在具体的实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含本发明的抗原结合蛋白的三个CDR。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:136的CDR1、SEQ ID NO:137的CDR2和SEQ ID NO:138的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:139的CDR1、SEQ ID NO:140的CDR2和SEQ ID NO:141的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:142的CDR1、SEQ ID NO:143的CDR2和SEQ ID NO:144的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:145的CDR1、SEQ ID NO:146的CDR2和SEQ ID NO:147的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:148的CDR1、SEQ ID NO:149的CDR2和SEQ ID NO:150的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:151的CDR1、SEQ ID NO:152的CDR2和SEQ ID NO:153的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:154的CDR1、SEQ ID NO:155的CDR2和SEQ ID NO:156的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:157的CDR1、SEQ ID NO:158的CDR2和SEQ ID NO:159的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:160的CDR1、SEQ ID NO:161的CDR2和SEQ ID NO:162的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:163的CDR1、SEQ ID NO:164的CDR2和SEQ ID NO:165的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:166的CDR1、SEQ ID NO:167的CDR2和SEQ ID NO:168的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:169的CDR1、SEQ ID NO:170的CDR2和SEQ ID NO:171的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:172的CDR1、SEQ ID NO:173的CDR2和SEQ ID NO:174的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:175的CDR1、SEQ ID NO:176的CDR2和SEQ ID NO:177的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:178的CDR1、SEQ ID NO:179的CDR2和SEQ ID NO:180的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:181的CDR1、SEQ ID NO:182的CDR2和SEQ ID NO:183的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:184的CDR1、SEQ ID NO:185的CDR2和SEQ ID NO:186的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:187的CDR1、SEQ ID NO:188的CDR2和SEQ ID NO:189的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:190的CDR1、SEQ ID NO:191的CDR2和SEQ ID NO:192的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:193的CDR1、SEQ ID NO:194的CDR2和SEQ ID NO:195的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:196的CDR1、SEQ ID NO:197的CDR2和SEQ ID NO:198的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:199的CDR1、SEQ ID NO:200的CDR2和SEQ ID NO:201的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:202的CDR1、SEQ ID NO:203的CDR2和SEQ ID NO:204的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:205的CDR1、SEQ ID NO:206的CDR2和SEQ ID NO:207的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:208的CDR1、SEQ ID NO:209的CDR2和SEQ ID NO:210的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:211的CDR1、SEQ ID NO:212的CDR2和SEQ ID NO:213的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:214的CDR1、SEQ ID NO:215的CDR2和SEQ ID NO:216的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:217的CDR1、SEQ ID NO:218的CDR2和SEQ ID NO:219的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:220的CDR1、SEQ ID NO:221的CDR2和SEQ ID NO:222的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:223的CDR1、SEQ ID NO:224的CDR2和SEQ ID NO:225的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:226的CDR1、SEQ ID NO:227的CDR2和SEQ ID NO:228的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:229的CDR1、SEQ ID NO:230的CDR2和SEQ ID NO:231的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:232的CDR1、SEQ ID NO:233的CDR2和SEQ ID NO:234的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:235的CDR1、SEQ ID NO:236的CDR2和SEQ ID NO:237的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:238的CDR1、SEQ ID NO:239的CDR2和SEQ ID NO:240的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:241的CDR1、SEQ ID NO:242的CDR2和SEQ ID NO:243的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:244的CDR1、SEQ ID NO:245的CDR2和SEQ ID NO:246的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:247的CDR1、SEQ ID NO:248的CDR2和SEQ ID NO:249的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:250的CDR1、SEQ ID NO:251的CDR2和SEQ ID NO:252的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:253的CDR1、SEQ ID NO:254的CDR2和SEQ ID NO:255的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:256的CDR1、SEQ ID NO:257的CDR2和SEQ ID NO:258的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:259的CDR1、SEQ ID NO:260的CDR2和SEQ ID NO:261的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:262的CDR1、SEQ ID NO:263的CDR2和SEQ ID NO:264的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:265的CDR1、SEQ ID NO:266的CDR2和SEQ ID NO:267的CDR3。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:268的CDR1、SEQ ID NO:269的CDR2和SEQ ID NO:270的CDR3。
在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含与上述VH结构域具有至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性的VH结构域。
在其他实施方案中，抗原结合蛋白是人源化抗CMV抗原结合蛋白，包括但不限于人源化单克隆抗体。此类人源化抗CMV抗原结合蛋白的实例包括，但不限于包含如实施例9中公开的轻链可变区和/或重链可变区的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，人源化抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:631或632的VL结构域和SEQ ID NO:633或634的VH结构域。
在一个实施方案中，人源化抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:635或636的VL结构域和SEQ ID NO:637或638的VH结构域。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:639或640的VL结构域和SEQ IDNO:641的VH结构域。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:642或643的VL结构域和SEQ IDNO:644或645的VH结构域。
在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含与上述VL和VH结构域具有至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性的VL和/或VH结构域。
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”指这样的蛋白，其包含结合抗原的部分，和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的支架或构架部分。抗原结合片段的实例包括抗体及其抗原结合片段，包括但不限于重组抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和骆驼化单结构域抗体。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白支架或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白支架或人工支架。此类支架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的支架以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的支架。参见例如Korndorfer等, 2003,Proteins:Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque等, Biotechnol.Prog.20:639-654 (2004)。此外，肽抗体模拟物("PAMs")以及利用纤连蛋白组分基于抗体模拟物的支架可以用作支架。
如本文所用，术语“抗体”指这样的蛋白，其包括至少一个或两个重(H)链可变区（本文缩写为VH）和至少一个或两个氢(L)链可变区（本文缩写为VL）。VH和VL区可以进一步细分为称为“互补性决定区”（“CDR”）的高变的区域，其散布于由称为“构架区”（FR）的更保守的区域。已经精确定义了构架区和CDR的界限(参见，Kabat, E. A.,等Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版, U.S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, 和Chothia, C.等, J.Mol.Biol.196:901-917, 1987, 其通过参考并入本文)。优选地，每一VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
抗体的VH或VL链可以进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分。在一个实施方案中，抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含一个结构域，CL。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一个组分(C1q)的结合。术语“抗体”包括类型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（以及其亚类）的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。
在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.,编辑, 第2版 Raven Press, N.Y.(1989)。
如本文所用，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自轻链可变区CDR和重链可变区CDR的氨基酸残基。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指基本上同质的抗体群体，即包含群体的抗体分子在氨基酸序列上相同，除了可能少量存在的可能的天然发生的突变外。相反，传统（多克隆）抗体制剂通常包括在其可变域，特别是其CDR（其对不同表位经常是特异的）中具有不同氨基酸序列的多个不同抗体。修饰语“单克隆”表示抗体自基本上同质的抗体群体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来产生抗体。例如，可以通过Kohler等 (1975)Nature 256: 495首次描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)待根据本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clackson等 (1991)Nature 352: 624-628和Marks等 (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”，例如还参见, Presta (2005) J. Allergy Clin.Immunol. 116:731。
如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一个抗体的可变域和来自第二个抗体的恒定域的抗体，其中所述第一个和第二个抗体来自不同物种。(美国专利号4,816,567；和Morrison等, (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。通常，从来自实验动物，如啮齿类的抗体（“亲本抗体”）获得可变域，从人抗体获得恒定域序列，从而所得的嵌合抗体在人主体中比亲本（例如啮齿类）抗体将更不可能诱导不利的免疫应答。
如本文所用，术语“人源化抗体”指含有来自人和非人（例如鼠类、大鼠）抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变域的基本上所有，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有构架（FR）区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可以任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
术语“完全人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。完全人抗体可以含有鼠类或大鼠糖链，如果在小鼠或大鼠中、在小鼠或大鼠细胞中、或在来源于小鼠或大鼠细胞的杂交瘤中产生的话。
如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合被全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fab片段”包含一条轻链和一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是木瓜蛋白酶切割抗体的产物。
“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的部分或片段，其含有VH结构域和CH1结构域，还有CH1与CH2结构域之间的区域，从而可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，其含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，从而在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab')2片段因此由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段组成。“F(ab')2片段”可以是胃蛋白酶切割抗体的产物。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
如本文所用，术语“骆驼化抗体”指来源于骆驼(Camelidae)重链Ig的单结构域抗体（参见例如，Muyldermans等, 2001, Trends Biochem.Sci.26:230; Nuttall等, 2000,Cur.Pharm.Biotech.1:253; Reichmann和Muyldermans, 1999, J. Immunol.Meth.231:25; 国际公开号WO 94/04678和WO 94/25591; 美国专利号6,005,079）。
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”抗体指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽还在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其使得scFv能够形成想要的结构用于抗原结合。对于scFv的综述，参见Pluckthun(1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷, Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag, New York, 第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946, 778和5,260,203。
如本文所用，术语“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况中，两个或多个VH区通过肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同的或不同的抗原。
如本文所用，术语“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况中，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是“双特异性的”，从而各抗原结合位点具有不同的抗原特异性。不同的抗原特异性可以是相同分子上的不同抗原或它们可以指向不同分子上的抗原。
如本文所用，术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一条多肽链(VH - VL或VL-VH)中连接轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097; WO 93/11161; 和Holliger等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448中更彻底地描述了双抗体。对于改造的抗体变体的综述，一般参见Holliger和Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136。
如本文所用，术语“重组体”指自然界中不存在的多肽或核酸。术语“重组”抗体指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合的抗体文库分离的抗体、从其为人免疫球蛋白基因转基因的动物（例如，小鼠）分离的抗体、或通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体包括人源化的、CDR移植的、嵌合的、体外产生的（例如通过噬菌体展示）抗体，并且可以任选地包括来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。重组多核苷酸包括在较长的多核苷酸序列中一起存在的两条或多条核苷酸序列，其中所述两条序列在自然界中发现没有在一起（例如附着或融合），例如在自然界中通常发现不在一起的启动子和编码多肽的异源核苷酸序列或载体和异源核苷酸序列。
如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子（例如抗体、核酸等）。“分离的或纯化的多肽”基本上没有其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞碎片和生长培养基。“分离的或纯化的核酸”至少部分从在其天然状态中通常位于多核苷酸侧翼的核酸分离。因此，在本文中认为例如由于重组技术，融合它们通常不结合的调节或编码序列的多核苷酸是分离的。即使当存在于例如宿主细胞的染色体中或核酸溶液中，也认为此类分子是分离的。一般地，术语“分离的”和“纯化的”不旨在指此类物质的完全缺失或水、缓冲液或盐的缺失，除非它们以大量干扰分子的实验或治疗用途的量存在。本发明的抗原结合蛋白和编码本发明的抗原结合蛋白的核酸是分离的/纯化的。
如本文所用，“同源性”指当它们被最佳比对时，两条多核苷酸序列之间或两条多肽序列之间的序列相似性。当两条相比较的序列的两者中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的各自中的位置被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置上是同源的。同源性的百分比是两条序列共有的同源位置的数量除以相比较的位置的总数×100。例如，如果当序列被最佳比对时，两条序列的10个位置中的6个相匹配或同源，那么所述两条序列是60%同源。一般地，当比对两条序列时进行比较以给出最大百分比同源性。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主体细胞和不考虑转化次数的情况下来自其中的培养物。也应理解，由于有意的或无意的突变，并不是所有后代在DNA含量上都完全相同。包括如在最初转化的细胞中所筛选具有相同功能或生物活性的突变体后代。其中期望不同的指定时，将从上下文中显而易见。
如本文所用，“种系序列”指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用任何合适来源的未重排免疫球蛋白序列。例如可以从National Institute of Arthritis andMusculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes ofHealth网站上的JOINSOLVER®种系数据库获得人种系序列。可以获得小鼠种系序列，例如如Giudicelli等 (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261中所述。
抗原结合蛋白衍生物
在其他实施方案中，本发明提供抗原结合蛋白，其是本文公开的抗原结合蛋白的衍生物。本发明的抗原结合蛋白衍生物特异性结合CMV并且具有VL结构域和VH结构域，其与本文公开的抗体的VL结构域和VH结构域具有至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性（例如表1和2和实施例9），同时仍然展示想要的结合和功能性质（例如CMV中和）。在另一实施方案中，本发明的抗原结合蛋白衍生物包含VL和VH结构域，其具有高达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守或不保守的氨基酸取代，同时仍然展示想要的结合和功能性质。
本发明的抗原结合蛋白衍生物还包括特异性结合CMV并且具有VL结构域的CDR（即，CDR1、CDR2和CDR3）和VH结构域的CDR的那些衍生物，所述VL结构域的CDR和VH结构域的CDR与本文为本发明的抗原结合蛋白的VL结构域和VH结构域公开的CDR具有至少50%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性（例如表1和2和实施例9中），同时仍然展示想要的结合和功能性质（例如CMV中和）。在另一实施方案中，本发明的抗原结合蛋白衍生物包含公开的VL和VH结构域的CDR，其具有高达0、1、2、3或更多个保守或不保守的氨基酸取代，同时仍然展示想要的结合和功能性质。
序列同一性指当两条序列被最佳比对时，两条多肽的氨基酸在等同位置上相同的程度。可以使用BLAST算法确定序列同一性，其中选择算法的参数以在完整长度的各参考序列上的各序列之间给出最大匹配。以下参考涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法：Altschul, S.F.,等, (1990) J. Mol.Biol.215:403-410; Gish, W.,等, (1993)Nature Genet.3:266-272; Madden, T.L.,等, (1996) Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul, S.F.,等, (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Zhang, J.,等,(1997) Genome Res.7:649-656; Wootton, J.C.,等, (1993) Comput.Chem.17:149-163;Hancock, J.M. 等, (1994) Comput.Appl.Biosci.10:67-70; 比对评分系统: Dayhoff,M.O.,等, "A model of evolutionary change in proteins." 于Atlas of ProteinSequence and Structure, (1978) 第5卷，第3附录M.O.Dayhoff (编辑), 第345-352页,Natl.Biomed.Res.Found., Washington, DC; Schwartz, R.M.,等, "Matrices fordetecting distant relationships." 于Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978) 第5卷，第3附录"M.O.Dayhoff (编辑), 第353-358页, Natl.Biomed.Res.Found.,Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol.Biol.219:555-565; States, D.J.,等, (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S.,等, (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919; Altschul, S.F.,等, (1993) J. Mol.Evol.36:290-300; 比对统计学:Karlin, S.,等, (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268; Karlin, S.,等,(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877; Dembo, A.,等, (1994) Ann.Prob.22:2022-2039; 和Altschul, S.F."Evaluating the statistical significance ofmultiple distinct local alignments." 于Theoretical and Computational Methodsin Genome Research (S. Suhai, 编辑), (1997) 第1-14, Plenum, New York。
通常，当该活性在摩尔基础上表述时，本发明的抗原结合蛋白衍生物保留至少10%的其CMV结合和/或中和活性（当与亲本抗原结合蛋白相比时）。优选地，本发明的抗原结合蛋白衍生物保留亲本抗原结合蛋白的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%的CMV结合亲和力和/或中和活性。
如本文所用，术语“保守替换”指蛋白质中具有相似特性（例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等）的其他氨基酸对氨基酸的取代，从而可以频繁进行改变，但不改变或实质上改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区域中单个氨基酸取代本质上不改变生物活性（参见例如，Watson等(1987) MolecularBiology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co., 第224页 (第4版))。此外，结构或功能相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。本方面的抗原结合蛋白的多个实施方案包含具有本文公开的序列的多肽链，例如表1和2和实施例9中，或包含高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个保守氨基酸取代的多肽链。在表3中阐明了示例性保守取代。
表3示例性保守氨基酸取代
本发明也涵盖本发明的抗原结合蛋白的功能保守衍生物。如本文所用，术语“功能保守衍生物”指这样的抗原结合蛋白，其中已经改变了一个或多个氨基酸残基，但不改变想要的特性，如抗原亲和力和/或特异性和/或中和活性。此类变体包括，但不限于具有相似性质的一种氨基酸对氨基酸的替换，如表3的保守氨基酸取代。
还提供的是包含本发明的抗CMV抗原结合蛋白的VL结构域的重组多肽和包含本发明的抗CMV抗原结合蛋白的VH结构域的重组多肽，其具有高达1、2、3、4或5或更多个氨基酸取代，同时仍然展示以高亲和力和特异性结合CMV和/或可以中和CMV的能力。
在另一实施方案中，提供的是与本文所述的一个或多个VL结构域或VH结构域具有至少95%、90%、85%、80%、75% 或50%序列同源性的VL结构域和/或VH结构域并展示与CMV的特异性结合和/或可以中和CMV的抗原结合蛋白。在另一实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含VL和VH结构域（具有和没有信号序列），其具有高达1、2、3、4或5或更多个氨基酸取代，并展示与CMV的特异性结合和/或可以中和CMV。
核酸
本发明还包含编码本文公开的抗CMV抗原结合蛋白的重组核酸。
在一个实施方案中，所述重组核酸编码包含轻链可变(VL)结构域的抗原结合蛋白，所述轻链可变(VL)结构域包含本文公开的任何抗原结合蛋白的CDR1、CDR2和CDR3(SEQID NOs:1-135)。
在一个实施方案中，所述重组核酸编码包含重链可变(VH)结构域的抗原结合蛋白，所述重链可变(VH)结构域包含本文公开的任何抗原结合蛋白的CDR1、CDR2和CDR3(SEQID NOs:136-270)。
在一个实施方案中，所述重组核酸编码包含至少一个轻链可变(VL)结构域和至少一个重链可变(VH)结构域的抗原结合蛋白，其中所述VL结构域包含具有选自SEQ ID NOs:1-135的序列的至少3个CDR，所述VH结构域包含具有选自SEQ ID NOs:136-270的序列的至少3个CDR。在一个实施方案中，分离的核酸编码本文公开的轻链可变区（参见表1）和重链可变区（参见表2）。在一些实施方案中，分离的核酸编码单个核酸分子上的轻链和重链，而在其他实施方案中在分别的核酸分子上编码轻链和重链。在另一实施方案中，核酸还编码信号序列。
本发明还包含与编码本文公开的抗CMV抗原结合蛋白的核酸杂交的核酸。一般而言，核酸在中等或高度严格条件下与编码本文公开的抗原结合蛋白的核酸杂交并还编码维持特异性结合CMV的能力的抗原结合蛋白。当第一个核酸分子的单链形式可以与第二个核酸分子在适当的温度和溶液离子强度条件下退火时，第一个核酸分子可与第二个核酸分子“杂交”（参见Sambrook,等,上文）。温度和离子强度的条件决定杂交的“严格性”。典型的中等严格杂交条件是40%甲酰胺，5X或6X SSC和0.1% SDS，42℃。高等严格杂交条件是50%甲酰胺，5X或6X SSC (0.15M NaC1和0.015M柠檬酸钠)，42℃，或任选地在更高温度下(例如，57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补的程度，本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，核酸可以杂交的严格性越高。对于长度多于100个核苷酸的杂合体，已经衍生了用于计算解链温度的等式（参见Sambrook,等,上文, 9.50-9.51）。对于较短的核酸的杂交，例如寡核苷酸，错配位置变得更重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性（参见Sambrook,等,上文, 11.7-11.8）。
本发明还包括的是编码抗CMV抗原结合蛋白衍生物的核酸。
本发明还提供包含本发明的重组核酸的表达载体，其中所述核酸可操作连接当载体转染宿主细胞时被宿主细胞识别的控制序列。还提供的是包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗原结合蛋白的方法，其包括在培养基中培养携带编码抗原结合蛋白的表达载体的宿主细胞，并从所述宿主细胞或培养基中分离所述抗原结合蛋白。
抗CMV抗原结合蛋白的生物性质
本发明的抗CMV抗原结合蛋白能够结合，并优选中和CMV。
可通过本领域已知的方法测定与CMV的结合。例如，在抗原滴定ELISA (EIA)中测定结合。在96孔微量滴定板上固定抗原（重组的病毒蛋白或其部分或纯化的重组回复体病毒体）。在EIA中测定抗原结合蛋白与固定的抗原的反应性。与对照抗原结合蛋白相比，测试抗原结合蛋白的强反应信号反映了所述测试抗原结合蛋白与病毒抗原的高亲和力。
可通过本领域已知的方法测定抗原结合蛋白中和CMV的能力。例如，在病毒中和测定中测定中和。将抗原结合蛋白与确定数量的感染性CMV病毒体混合并将所述混合物应用到易受CMV感染的细胞（即，上皮细胞，如ARPE-19或MRC-5细胞）。可以通过测定病毒抗原，如病毒即时早期（IE）抗原的表达检测被CMV感染的细胞。与缺少抗原结合蛋白的情况下感染的细胞相比，具有病毒抗原表达的细胞数量的减少反映了中和能力（即，抗原结合蛋白可以减少细胞的病毒感染性）。降低的病毒感染性可以是由于任何机制，包括但不限于抗原结合蛋白降低CMV与细胞的结合的能力、抗原结合蛋白降低与细胞膜的病毒融合的能力和/或抗原结合蛋白降低病毒遗传物质释放到细胞中的能力。
竞争性抗原结合蛋白
本发明还包括与本文公开的任何抗原结合蛋白一样结合CMV上的相同表位或重叠表位的抗原结合蛋白。此类竞争性抗原结合蛋白能够交叉阻断本文公开的任何公开的抗原结合蛋白的结合。在一个实施方案中，所述竞争性抗原结合蛋白可以交叉阻断包含轻链可变区（包含表1中公开的CDR）和/或包含重链可变区（包含表2中公开的CDR）的抗原结合蛋白。在其他实施方案中，所述竞争性抗原结合蛋白可以交叉阻断包含表1中公开的轻链可变区和/或包含表2中公开的重链可变区的抗原结合蛋白。
认为第一个抗原结合蛋白交叉阻断第二个抗原结合蛋白的结合，如果将靶标与第一个抗原结合蛋白预先结合至饱和增加第二个抗原结合蛋白的浓度（其为实现靶标的最大结合的一半所需的）2、3、4、5、10、20、50、100、200倍或更多倍。
或者，认为第一个抗原结合蛋白交叉阻断第二个抗原结合蛋白的结合，如果各自结合的表位相同或显著重叠。在一个实施方案中，通过晶体学进行表位结合的测定。
靶标
CMV在体内感染多种细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经元、平滑肌细胞、肝细胞和基质细胞(Plachter等1996,Adv.Virus Res.46:195)。尽管临床CMV分离物在多种细胞类型中进行复制，实验菌株AD169(Elek & Stern, 1974, Lancet 1:1)和Towne (Plotkin等, 1975, Infect.Immun.12:521)几乎只在成纤维细胞中进行复制(Hahn等, 2004, J. Virol.78:10023)。因成纤维细胞中病毒的连续传代和最终适应引起的向性的限制规定了减毒的标志物 (Gerna等,2005, J. Gen.Virol.86:275; Gerna等, 2002, J. Gen Virol.83:1993; Gerna等,2003, J. Gen Virol.84:1431; Dargan等, 2010, J. Gen Virol.91:1535)。在人CMV实验菌株中引起上皮细胞、内皮细胞、白细胞和树突细胞向性丧失的突变已经作图到三个可读框 (ORFs)：UL128、UL130和UL131 (Hahn等, 2004, J. Virol.78:10023; Wang和Shenk,2005 J. Virol.79:10330; Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:18153)。生物化学和重塑研究显示UL128、UL130和UL131装配到gH/gL支架上以形成五聚gH复合体(Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:1815; Ryckman等, 2008 J.Virol.82:60)。在病毒体中恢复该复合体恢复了实验菌株中的病毒上皮向性 (Wang和Shenk, 2005 J. Virol.79:10330)。
已经怀疑内皮和上皮向性的缺失是先前评估为疫苗如Towne中的不足(Gerna等,2002, J. Gen Virol.83:1993; Gerna等, 2003, J. Gen Virol.84:1431)。在来自天然CMV感染的人主体的血清中中和抗体对病毒上皮进入比对成纤维细胞进入具有高于15倍的更高的活性(Cui等, 2008 Vaccine 26:5760)。具有初级感染的人针对病毒内皮和上皮进入快速产生中和抗体，但是针对病毒成纤维进入仅缓慢产生中和抗体(Gerna等, 2008 J.Gen.Virol.89:853)。此外，针对病毒上皮和内皮进入的中和活性在来自接受Towne疫苗的人主体的免疫血清中是缺失的(Cui等, 2008 Vaccine 26:5760)。最近以来，描述了来自CMV感染的四个供体的一组人单克隆抗体，并且来自该组的更有效中和克隆识别五聚体 gH复合体的抗原(Macagno等, 2010 J. Virol.84:1005)。
如本文所用，术语“五聚gH复合体”或“gH复合体”指CMV病毒体表面上五种病毒蛋白的复合体。所述复合体由在gH/gL支架上装配的UL128、UL130和UL131编码的蛋白组成(Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:1815; Ryckman等, 2008 J.Virol.82:60)。在GenBank登录号NP_783797.1 (UL128)、NP_040067 (UL130)、CAA35294.1(UL131)、NP_040009 (gH，也称为UL75)和NP_783793 (gL，也称为UL115)下显示了来自CMV菌株AD169的复合体蛋白的序列。 一些减毒CMV菌株在UL131中具有一个或多个突变，从而不表达所述蛋白并因而不形成所述gH复合体。
如本文所用，术语“回复体病毒”或“回复体病毒体”指已经恢复了gH复合体并因此在其包膜上表达了该gH复合体的CMV。
制备抗原结合蛋白的方法
可以使用产生亲本（例如啮齿类）单克隆抗CMV抗体的杂交瘤细胞通过本领域通常已知的方法产生抗原结合蛋白，其为单克隆抗体。这些方法包括，但不限于最初由Kohler,等,(1975) (Nature 256:495-497)开发的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术(Hering,等,(1988) Biomed.Biochim.Acta.47:211-216和Hagiwara,等, (1993)Hum.Antibod.Hybridomas 4:15)、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor,等, (1983) ImmunologyToday 4:72和Cote,等, (1983) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 80:2026-2030)、EBV杂交瘤技术(Cole,等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96页, 1985)，和使用Cyto Pulse大室细胞融合电转化仪基于电场的电融合(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)。优选地，分离小鼠脾细胞并与PEG融合或基于标准方案电融合到小鼠骨髓瘤细胞系中。然后可以筛选所得杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。例如，利用50% PEG可以将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与六分之一数量的P3X63- Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC, CRL 1580)融合。 可以将大约2 x 105细胞/mL的细胞平铺在平底微量滴定板中，随后在含有20%胎儿克隆血清、18% "653"条件培养基、5%三甲氧唑辛(IGEN)、4 mM L-谷氨酰胺、1 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055 mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50 mg/ml链霉素、50 mg/ml庆大霉素和1XHAT (Sigma; HAT在融合后24小时加入)的选择性培养基中温育2周。两周后，细胞可以在其中HAT被HT替换的培养基中进行培养。然后通过ELISA筛选各孔的抗-X单克隆IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，一般在10-14天后观察培养基。可以再次重新平铺筛选分泌抗体的杂交瘤，并且如果对人IgG仍然阳性，那么可以通过有限稀释亚克隆抗CMV单克隆抗体至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。
也可以重组产生本文公开的抗CMV抗原结合蛋白（例如在如上讨论的大肠杆菌/T7表达系统中）。在该实施方案中，可以将编码本发明的抗原结合蛋白（例如VH或VL）的核酸插入到基于pET的质粒中并在大肠杆菌/T7系统中进行表达。存在通过其产生重组抗原结合蛋白的本领域已知的若干方法。在美国专利号4,816,567中公开了用于重组产生抗原结合蛋白的方法的一个实例。可以通过任何已知方法进行转化用于将多核苷酸引入宿主细胞中。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知并包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中多核苷酸的包装、基因枪注射和将DNA直接注射到核中。此外，可以通过病毒载体将核酸分子引入到哺乳动物细胞中。转化细胞的方法为本领域所熟知。参见例如，美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461和4,959,455。
还可以通过美国专利号6,331,415中阐明的任何方法合成抗CMV抗原结合蛋白。
可用于表达本文公开的抗原结合蛋白的作为宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知并包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化细胞系。这些包括，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、狗细胞、猴细胞、猪细胞、山羊细胞、牛细胞、马细胞和仓鼠细胞。通过测定哪个细胞系具有高表达水平而选择特别优选的细胞系。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系，如Sf9细胞、两栖类动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗原结合蛋白在宿主细胞中表达，或者更优选地，抗原结合蛋白分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间来产生抗原结合蛋白。
可以使用标准蛋白纯化方法（例如蛋白A亲和层析）从培养基中回收抗原结合蛋白。另外，可以使用许多已知技术增强本发明的抗原结合蛋白从产生细胞系中的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下用于增强表达的常见方法。结合欧洲专利号0 216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4完整地或部分地讨论GS系统。
一般而言，在特定的细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白的特征的糖基化形式。因而，抗原结合蛋白的特定糖基化形式将取决于用于产生抗原结合蛋白的特定细胞系或转基因动物。在具体实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化形式的抗原结合蛋白可以是有利的，因为已经显示这些抗原结合蛋白在体外和体内通常显示比其岩藻糖基化对应物（counterparts）展示更有效的功效（参见例如，Shinkawa等, J. Biol.Chem.278:3466-3473 (2003);美国专利号6,946,292和7,214,775）。具有非岩藻糖基化N-聚糖的这些抗原结合蛋白本身不可能是免疫原性的，因为它们的碳水化合物结构是存在于人血清IgG中的群体的正常组分。
双特异性或双功能性抗原结合蛋白是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗原结合蛋白。可以通过多种方法，包括融合杂交瘤或连接Fab'片段产生双特异性抗原结合蛋白。参见例如，Songsivilai,等, (1990) Clin.Exp.Immunol.79:315-321, Kostelny,等, (1992) J Immunol.148:1547- 1553。此外，双特异性抗原结合蛋白可以形成为“双抗体”(Holliger,等, (1993) PNAS USA 90:6444-6448)或"Janusins"(Traunecker,等, (1991) EMBO J. 10:3655-3659和Traunecker,等, (1992) Int. J.Cancer Suppl. 7:51-52)。
本发明的抗原结合蛋白包括本文公开的抗CMV抗体的抗体片段。抗体片段包括F(ab)2片段，其可以通过例如胃蛋白酶酶促切割IgG产生。Fab片段可以通过例如利用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2产生。Fab片段是通过二硫键附着到VH-CH1链上的VL-CL链。F(ab)2片段是依次通过两个二硫键附着的两个Fab片段。F(ab)2分子的Fab部分包括在其之间二硫键定位的Fc区的部分。FV片段是VL或VH区。
在一些实施方案中，不同恒定域可以附着到来源于本文提供的CDR的人源化VL和VH区。例如，如果本发明的抗原结合蛋白的特定预期用途是要求改变的效应子功能，那么可以使用重链恒定域而非人IgG1，或可以利用杂合IgG1/IgG4。
尽管人IgG1抗体提供长的半衰期和效应子功能，如补体激活和抗体依赖性细胞的细胞毒性，但是该活性对于抗体的所有用途可能不是想要的。在该情况中，可以使用例如人IgG4恒定域。在一个实施方案中，IgG4恒定域可以在对应于EU系统中的位置228和KABAT系统中的位置241的位置上不同于天然的人IgG4恒定域(Swiss-Prot登录号P01861.1)，其中天然Ser108被Pro替换，以防止Cys106与Cys109（对应于EU系统中的位置Cys 226和Cys 229和KABAT系统中的位置Cys 239和Cys 242）之间可能的链间二硫键，其可能干扰正确的链间二硫键形成。参见Angal等(1993) Mol.Imunol.30:105。在其他情况中，可以使用已经被修饰以增加半衰期或降低效应子功能的修饰的IgG1恒定域。
抗原结合蛋白改造
进一步包括的是这样的实施方案，其中改造所述抗CMV抗原结合蛋白以包括亲本抗原结合蛋白的可变域内的构架残基的修饰，例如以改善所述抗原结合蛋白的性质。通常，进行此类构架修饰以降低抗原结合蛋白的免疫原性。这一般通过利用来自其中待使用抗原结合蛋白的物种的免疫全部组分的类似残基，例如在人治疗的情况中的人残基替换亲本抗原结合蛋白中可变域（即构架残基）中的非CDR残基来实现。该抗体称为“人源化”抗原结合蛋白。在一些情况中，期望增加亲和力，或改变改造的（例如人源化的）抗原结合蛋白的特异性。一种方法是将一个或多个构架残基“回突变”成相应的种系序列。更具体地，已经进行了体细胞突变的抗原结合蛋白可以含有不同于抗原结合蛋白来源的种系序列的构架残基。可以通过比较构架序列与抗原结合蛋白来源的种系序列来鉴定此类残基。另一种方法是恢复成改造的（例如人源化的）抗原结合蛋白的一个或多个位置上的初始亲本残基，例如以恢复在替换构架残基的过程中已经丢失的结合亲和力。(参见例如，美国专利号5,693,762、美国专利号5,585,089和美国专利号5,530,101.)。
另一种类型的构架修饰涉及突变构架区内，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T-细胞表位，由此降低抗原结合蛋白的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”并进一步详细描述于美国专利号7,125,689中。
在具体的实施方案中，将期望将含有暴露的侧链的某些氨基酸改变成另一种氨基酸残基以提供如下最终抗原结合蛋白的更高的化学稳定性。天冬酰胺的脱酰胺可以发生在N-G或D-G序列上并导致产生异天冬氨酸残基，其将纽结引入到多肽链中并降低其稳定性（异天冬氨酸效果）。在某些实施方案中，本公开内容的抗原结合蛋白不含有天冬酰胺同分异构位点。
例如，可以将天冬酰胺(Asn)残基改变成Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列，特别是CDR内的异天冬氨酸形成的可能性。相似问题可能发生在Asp-Gly序列处。Reissner和Aswad (2003) Cell.Mol.Life Sci.60:1281。异天冬氨酸形成可能削弱或完全消除抗体与其靶抗原的结合。参见，Presta (2005) J. Allergy Clin.Immunol.116:731于734。在一个实施方案中，将天冬酰胺变成谷氨酰胺(Gln)。也期望改变天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基附近的氨基酸以降低脱酰胺作用的可能性，当小氨基酸出现在天冬酰胺或谷氨酰胺附近时其以较大几率出现。参见Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog.662:261。此外，可以将CDR中的任何甲硫氨酸残基（通常是溶剂暴露的Met）变成Lys、Leu、Ala或Phe，以降低甲硫氨酸硫会氧化的可能性，其能够降低抗原结合亲和力，还促进最终抗体制剂中的分子异质性。同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸变成丙氨酸(Ala)。此外，为了阻止可能断裂的Asn-Pro肽键或将其降至最低，可期望将在CDR中发现的任何Asn-Pro组合改变成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类取代的抗原结合蛋白以保证所述取代不降低抗体对CMV的亲和力或特异性，或其他想要的生物活性至不可接受的水平。
表4 示例性稳定CDR变体
可以以任何组合独立地选择VH和/或VL CDR的变异。此外，可以以任何组合独立地选择本文描述的任何变异，只要维持想要的活性或结合能力。
Fc区的改造
也可以改造本文公开的抗原结合蛋白以在Fc区包括修饰，通常来改变所述抗原结合蛋白的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或效应子功能（例如，抗原依赖性细胞的细胞毒性）。此外，可以化学修饰本文公开的抗原结合蛋白（例如一个或多个化学部分可以附着到所述抗原结合蛋白上）或修饰本文公开的抗原结合蛋白以改变其糖基化，再次改变该抗原结合蛋白的一种或多种功能性质。在下文中进一步详细地描述了这些实施方案中的每一个。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引中的编号。
本文公开的抗原结合蛋白也包括具有修饰的（或阻断的）Fc区的抗原结合蛋白以提供改变的效应子功能。参见例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。该修饰可以用于增强或抑制免疫系统的多种反应，其在诊断和治疗中具有可能的有益效果。Fc区的改变包括氨基酸改变（取代、缺失和插入）、糖基化或去糖基化，和添加多个Fc。Fc的改变也可以改变治疗性抗原结合蛋白中抗体的半衰期，使得能够更不频繁地给药并因此增加便利性和减少材料的使用。参见Presta (2005) J. AllergyClin.Immunol.116:731于734-35。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或IgG4同种型抗体其片段，其在对应于重链恒定区的铰链区中位置228(S228P; EU指数)的位置上包含丝氨酸至脯氨酸的突变。已经报道了该突变消除了铰链区中重链间二硫键的异质性(Angal等上文;位置241基于Kabat编号系统)。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而铰链区中的半胱氨酸残基的数量增加或减少。该方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。例如改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，以促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，修饰抗原结合蛋白以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如，可以引入以下突变中的一个或多个：T252L、T254S、T256F，如美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗原结合蛋白以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的挽救受体结合表位，如美国专利号5,869,046 和6,121,022中所述。
在又一实施方案中，通过不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗原结合蛋白的效应子功能。例如，可以利用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，从而所述抗原结合蛋白对效应配体具有改变的亲和力，但是保留亲本抗原结合蛋白的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步详细描述于美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一实施方案中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，由此改变抗原结合蛋白固定补体的能力。该方法进一步描述于PCT公开WO 94/29351中。
在又一实施方案中，修饰Fc区以增加或降低抗原结合蛋白介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰以下位置上的一个或多个氨基酸增加或降低抗原结合蛋白对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述于PCT公开WO 00/42072中。此外，已经对人IgG1上与FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点作图并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等,(2001) J. Biol.Chem.276:6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334和339上的具体突变以改善与FcγRIII的结合。此外，显示以下组合突变体改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施方案中，通过修饰残基243和264来修饰Fc区以降低抗原结合蛋白介导效应子功能的能力和/或增加抗炎性质的能力。在一个实施方案中，通过将位置243和264上的残基改变成丙氨酸来修饰抗原结合蛋白的Fc区。在一个实施方案中，通过修饰残基243、264、267和328来修饰Fc区以降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎性质。
在仍另一实施方案中，抗原结合蛋白包含特定的糖基化模式。例如，可以制备去糖基化的抗原结合蛋白（即，缺少糖基化的抗原结合蛋白）。例如可以改变抗原结合蛋白的糖基化模式，以增加所述抗原结合蛋白对抗原的亲和力（affinity）或亲合力（avidity）。例如可以通过改变抗原结合蛋白序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区构架糖基化位点被去除，由此消除该位点上的糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力（affinity）或亲合力（avidity）。参见例如，美国专利号5,714,350和6,350,861。
也可以制备抗原结合蛋白，其中糖基化模式包括低岩藻糖基化（hypofucosylated）或去岩藻糖基化葡聚糖，如低岩藻糖基化抗原结合蛋白或去岩藻糖基化抗原结合蛋白在葡聚糖上具有减少量的岩藻糖残基。所述抗原结合蛋白也可以包括具有增加量的二等分GlcNac结构的葡聚糖。已经证明此类改变的糖基化模式增加抗原结合蛋白的ADCC能力。例如可以通过在宿主细胞中表达抗原结合蛋白来实现此类修饰，在所述宿主细胞中已经遗传改造了糖基化途径以产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。本领域已经描述了这些细胞并且其可以用作这样的宿主细胞，其中表达本发明的重组抗原结合蛋白，由此产生具有改变的糖基化的抗原结合蛋白。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶FUT8 (α (1,6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗原结合蛋白在其碳水化合物上缺少岩藻糖。 通过使用两个置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因产生Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系（参见美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一个实例，EP 1 176 195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖转移酶，从而在该细胞系中表达的抗原结合蛋白通过减少或消除α-1,6键相关的酶展示低岩藻糖基化。EP 1 176 195也描述了对向N-乙酰葡萄糖胺添加岩藻糖具有低酶活性的细胞系，其结合抗原结合蛋白的Fc区或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0 (ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，Lec13细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)连接的碳水化合物上的能力降低，也导致宿主细胞中表达的抗原结合蛋白低岩藻糖基化 (也参见Shields等,(2002) J. Biol.Chem.277:26733-26740)。也可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化概况的抗原结合蛋白，如PCT公开WO 06/089231中所述。或者，可以在植物细胞，如Lemna中产生具有修饰的糖基化概况的抗原结合蛋白(美国专利7,632,983)。在美国专利6,998,267和7,388,081中公开了在植物系统中产生抗原结合蛋白的方法。PCT公开WO 99/54342描述了被改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶（例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III (GnTIII)）的细胞系，从而在改造的细胞系中表达的抗原结合蛋白展示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的增加ADCC活性(还参见Umana等(1999) Nat. Biotech.17:176-180)。
或者，可以使用岩藻糖苷酶切掉抗原结合蛋白的岩藻糖残基；例如岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上去除岩藻糖残基(Tarentino等(1975) Biochem.14:5516-23)。
本文公开的抗原结合蛋白还包括在低等真核宿主细胞中产生的那些，特别是真菌宿主细胞，如已经被遗传改造以产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白的酵母和丝状真菌（参见例如，Choi等, (2003) Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027; Hamilton等,(2003) Science 301:1244-1246; Hamilton等, (2006) Science 313:1441-1443)。这些遗传修饰的宿主细胞优于目前使用的哺乳动物细胞系的具体优势是控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化概况的能力，从而可以产生糖蛋白的组合物，其中特定的N-聚糖结构占优势（参见例如，美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308）。这些遗传修饰的宿主细胞已经用于产生主要具有特定的N-聚糖结构的抗原结合蛋白（参见例如，Li等, (2006) Nat.Biotechnol.24:210-215)。
此外，因为真菌如酵母或丝状真菌缺少产生岩藻糖化的糖蛋白的能力，所以在此类细胞中产生的抗原结合蛋白将缺少岩藻糖，除非进一步修饰该细胞以包括用于产生岩藻糖化糖蛋白的酶途径（参见例如，PCT公开WO2008112092）。
在具体的实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的那些，并且其包括岩藻糖化和非岩藻糖化的杂合体和复合体N-聚糖，包括二等分的和多天线（multiantennary）种类，包括但不限于N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2;Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在具体的实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白组合物可以包含具有选自GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2;和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2的至少一个杂合体N-聚糖的抗原结合蛋白。在具体方面，杂合体N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。在其他方面，杂合体N-聚糖是在组合物中包含约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%杂合体N-聚糖的特定N-聚糖种类。
在具体的实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白组合物包含具有选自GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2;GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的至少一个复合体N-聚糖的抗原结合蛋白。在具体方面，复合体N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。在其他方面，复合体N-聚糖是在组合物中包含约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%复合体N-聚糖的特定N-聚糖种类。
在具体的实施方案中，N-聚糖是岩藻糖化的。一般而言，岩藻糖位于N-聚糖的还原末端与GlcNAc的α1,3-连接、N-聚糖的还原末端与GlcNAc的α1,6-连接、N-聚糖的非还原末端与Gal的α1,2-连接、N-聚糖的非还原末端与GlcNAc的α1,3-连接、或N-聚糖的非还原末端与GlcNAc的α1,4-连接中。
因而，在上述糖蛋白组合物的具体方面，糖形位于α1,3-连接或α1,6-连接岩藻糖中以产生选自Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc),GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc),Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc),和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)的糖形；位于α1,3-连接或α1,4-连接岩藻糖中以产生选自GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2,GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2,和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2的糖形；或位于α1,2-连接岩藻糖中以产生选自Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2,NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2,和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2的糖形。
在其他方面，抗原结合蛋白包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于 Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。
在上述其他方面，复合体N-聚糖进一步包括岩藻糖化和非岩藻糖化的二等分和多天线种类。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖形”可互换使用并指N-连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺连接附着到多肽的天冬酰胺残基上的N-连接的寡糖。N-连接的糖蛋白含有连接蛋白中的天冬酰胺的酰胺氮的N-乙酰葡萄糖胺残基。在糖蛋白上发现的主要糖类是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc), N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如N-乙酰-神经氨酸(NANA))。糖基的加工在ER的腔内翻译的同时发生并且在Golgi装置中在翻译后继续用于N-连接的糖蛋白。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2的共同戊多糖核心（“Man”指甘露糖；“Glc”指葡萄糖；并且“NAc”指N-乙酰基；GlcNAc指N-乙酰葡萄糖胺）。一般地，N-聚糖结构以左边是非还原末端，右边是还原末端呈现。N-聚糖的还原末端是附着到Asn残基上的末端，其包含蛋白上的糖基化位点。N-聚糖在分支（天线）数量方面不同，所述分支包含添加到Man3GlcNAc2 ("Man3")核心结构上的外周糖类（例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸），所述核心结构也称为“三甘露糖（triammnose）核心”、“戊多糖核心”或“寡甘露糖（paucimannose）核心”。根据其分支成分（例如高甘露糖、复合体或杂合体）划分N-聚糖。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合体”型N-聚糖通常具有附着到1,3甘露糖臂上的至少一个 GlcNAc和附着到“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂上的至少一个GlcNAc。复合体N-聚糖也可以具有半乳糖（“Gal”）或N-乙酰半乳糖胺（“GalNAc”）残基，其被唾液酸或衍生物（例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指神经氨酸，“Ac”指乙酰基）任选地修饰。复合体N-聚糖也可以具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖（“Fuc”）的链内取代。复合体N-聚糖在“三甘露糖核心”上也可以具有多个天线，经常称为“多天线葡聚糖”。“杂合体”N-聚糖在三甘露糖核心上的1,3甘露糖臂的末端具有至少一个GlcNAc和三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上的0或更多个甘露糖。多种N-聚糖也称为“糖形”。
对于复合体N-聚糖，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”和“A2”表示以下。“G-2”指可以被表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G-1”指可以被表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G0”指可以被表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G1”指可以被表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“G2”指可以被表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语“A1”指可以被表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；并且，术语“A2”指可以被表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另有说明，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”和“A2”指在N-聚糖还原末端缺少附着到GlcNAc残基上的岩藻糖的N-聚糖种类。当术语包括“F”时，“F”表示N-聚糖种类在N-聚糖还原末端的GlcNAc残基上含有岩藻糖残基。例如，G0F、G1F、G2F、A1F和A2F均表示N-聚糖进一步包括在N-聚糖还原末端附着到GlcNAc残基上的岩藻糖残基。低等真核生物，如酵母和丝状真菌通常不产生N-聚糖，其产生岩藻糖。
对于多天线N-聚糖，术语“多天线N-聚糖”指这样的N-聚糖，其在包含N-聚糖的1,6臂或1,3臂的非还原末端的甘露糖残基上进一步包含GlcNAc残基或在包含N-聚糖的1,6臂和1,3臂的非还原末端的各甘露糖残基上进一步包含GlcNAc残基。因此，多天线N-聚糖可以被式GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2表征。术语“1-4”指1、2、3或4个残基。
对于二等分N-聚糖，术语“二等分N-聚糖”指这样的N-聚糖，其中GlcNAc残基连接N-聚糖还原末端上的甘露糖残基。二等分N-聚糖可以被式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征，其中各甘露糖残基在其还原末端连接GlcNAc残基。相反，当多天线N-聚糖被表征为GlcNAc3Man3GlcNAc2时，该式表示两个GlcNAc残基在N-聚糖的两臂之一的非还原末端上连接甘露糖残基并且一个GlcNAc残基在N-聚糖另一臂的非还原末端连接甘露糖残基。
抗原结合蛋白缀合物
本发明的抗CMV抗原结合蛋白也可以缀合化学部分上。所述化学部分尤其可以是聚合物、放射性核素或细胞毒素因子。在具体的实施方案中，化学部分是聚合物，其增加主体身体中抗原结合蛋白的半衰期。合适的聚合物包括，但不限于亲水聚合物，其包括但不限于聚乙二醇（PEG）（例如，具有分子量2kDa、5 kDa、10 kDa、12kDa、20 kDa、30kDa或40kDa的PEG）、葡聚糖和一甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee,等, (1999) (Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合物的单链抗体。Wen,等, (2001) (Bioconj.Chem.12:545-553)公开了PEG附着到放射性金属螯合剂(二乙烯三胺五乙酸(DTPA))上的抗体。
本文公开的抗原结合蛋白也可以与标记如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe缀合。
还可以将本文公开的抗原结合蛋白聚乙二醇化，例如来增加其生物（例如，血清）半衰期。为了聚乙二醇化抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白通常与聚乙二醇(PEG)的反应形式，如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团开始附着抗原结合蛋白的条件下反应。在具体的实施方案中，通过酰化反应或与反应性PEG分子（或类似的反应性水溶聚合物）的烷基化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包括PEG的任何形式，其已经用于衍生其他蛋白，如单（C1-C10）烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗原结合蛋白。用于聚乙二醇化蛋白的方法为本领域所知并且可以应用于本发明的抗原结合蛋白。参见例如，EP 0154 316和EP 0 401 384。
本文公开的抗原结合蛋白也可以与荧光或化学发光标记缀合，所述标记包括荧光基团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛（o-phthaladehyde）、荧光胺、152Eu、丹酰、伞形酮、萤光素、luminal标记、isoluminal标记、芳香吖啶酯标记、咪唑标记、acridimium盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定的自由基。
可以使用本领域已知用于将抗原结合蛋白缀合到多种部分上的任何方法，包括Hunter,等, (1962) Nature 144:945; David,等, (1974) Biochemistry 13:1014;Pain,等, (1981) J. Immunol. Meth. 40:219;和Nygren, J., (1982) Histochem. andCytochem. 30:407描述的那些方法。用于缀合抗体的方法是常规的并且为本领域所熟知。
抗-CMV抗原结合蛋白的治疗用途
进一步提供的是用于治疗需要利用本文公开的分离的抗原结合蛋白治疗的主体，包括人主体的方法。治疗方法包括向主体施用一种或多种本发明的抗原结合蛋白以提供被动免疫。
“主体”指能够被CMV感染的哺乳动物。在优选的实施方案中，主体是人。可以预防性地或治疗性地治疗主体。预防治疗提供充分的保护性免疫以降低CMV感染的可能性或严重性，包括原发感染、复发性感染（即，起因于潜伏CMV重激活的那些）和重复感染（即，起因于与患者先前经历的CMV菌株不同的CMV菌株感染的那些）。可以进行治疗性治疗以降低CMV感染的严重性或降低复发性或重复感染的可能性/严重性。
如本文所用，短语“被动免疫”指抗原结合蛋白形式的活性体液免疫的转移。被动免疫向患者提供立即保护效应免于所施用的抗原结合蛋白识别的病原体和/或改善与病原体感染相关的至少一种病理学。然而，患者并没有发生对病原体的免疫记忆，因而必须继续接受所施用的抗原结合蛋白用于保护免于病原体以继续。在优选的实施方案中，向患者施用单克隆抗体，更优选人或人源化单克隆抗体，以赋予被动免疫。
可以使用包含一种或多种本发明的抗原结合蛋白或其片段的药物组合物进行治疗。可以向一般群体，尤其是CMV感染危险增加的那些人（原发、复发或重复）或CMV感染会特别有问题的那些人（如免疫妥协的个体、移植患者或孕妇）施用药物组合物。在一个实施方案中，向育龄女性，尤其是孕妇施用一种或多种本发明的抗原结合蛋白以降低怀孕过程中CMV感染（原发、复发或重复）CMV的可能性。
需要治疗的那些人包括早已被感染的那些人，以及易于感染或期望减少感染可能性的那些人。治疗可以改善与CMV感染相关的疾病症状和/或缩短CMV感染，包括由于潜伏CMV重激活引起的感染的长度和/严重性。
CMV感染（原发、复发或重复）危险增加的人包括免疫减弱的患者或面临治疗产生减弱的免疫的患者（例如，经历化学治疗或放射治疗用于癌症或服用免疫抑制药）。如本文所用，“减弱的免疫”指这样的免疫系统，其不太能够对抗感染，因为不能正确地起功能或不能以正常健康成年人的水平起功能的免疫应答。免疫减弱的患者的实例是这样的患者，其为婴儿、幼儿、老年人、孕妇或患有影响免疫系统功能的疾病，如HIV感染或AIDS的患者。
在具体的实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白可以单独使用，彼此组合或与用于治疗或预防CMV感染的其他试剂组合使用。在具体的实施方案中，向主体施用选自15.1、57.4、58.5、70.7、124.4、223.4、270.7、276.10、316.2、324.4、347.3和272.7的一种或多种单克隆抗体或其抗原结合片段以治疗或预防CMV感染。在更具体的实施方案中，向主体施用选自57.4、58.5、276.10和272.7的一种或多种单克隆抗体或其抗原结合片段以治疗或预防CMV感染。
本发明的一种或多种抗CMV抗原结合蛋白可以与一种或多种其他治疗剂，包括但不限于更昔洛韦（GCV）、缬更昔洛韦（VGCV）、膦甲酸（FOS）、西多福韦（CDV）和CytoGam®(CSL, Inc. Melbourne, Australia)共同施用。抗原结合蛋白可以连接试剂（作为免疫复合体）或可以与试剂分开施用。在后者情况下（分开施用），抗原结合蛋白可以在试剂之前、之后或共同施用或可以与其他已知疗法共同施用。
“治疗（Treat）”或“治疗（treating）”表示内在或外在向患有CMV感染或怀疑患有CMV感染的主体施用治疗剂，如含有本发明的任何抗原结合蛋白的组合物。通常，在所治疗的主体或群体中以有效减轻CMV感染的一种或多种症状的量施用试剂，无论通过诱导此类症状的退化或抑制其进展至任何临床可测量程度。有效减轻任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称为“治疗有效量”）可根据这样的因素，如感染状态、年龄和患者体重和治疗剂的能力而变化以在主体中诱导想要的应答。可以通过医师或其他医疗保健技术人员通常使用的任何临床测量评估感染症状是否已经减轻以评估该症状的严重性或进展状态。尽管本发明的实施方案（例如，治疗方法或制成品）在减轻每个主体中的靶标感染症状中可能无效，但是如通过本领域中已知的任何统计学测验，如Student's t-检验、chi2-检验、Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验所测定，其应该在统计显著数量的主体中减轻靶标感染症状。
实验和诊断用途
本文公开的抗原结合蛋白可以用作亲和力纯化剂。在该过程中，使用本领域所熟知的方法将抗原结合蛋白固定在固相上，如Sephadex树脂或滤纸。固定的抗原结合蛋白与含有待纯化的CMV的样品接触，然后利用会去除样品中基本上所有物质（除CMV外）的合适的溶剂洗涤支持物，所述CMV结合到固定的抗原结合蛋白上。最后，利用从柱上洗脱结合的CMV的溶剂洗涤支持物。此类固定的抗体形成本发明的一部分。
本文公开的抗CMV抗原结合蛋白也可以用于诊断测定CMV，例如检测其在组织或血清中的存在。诊断测定可以使用用于检测CMV的多种方法（其使用本发明的抗原结合蛋白）包括，但不限于ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹。可以标记因而直接检测抗原结合蛋白本身。或者，可以通过然后检测的标记的二级抗体结合抗原结合蛋白。
纯化、诊断和检测用途优选使用选自57.4、210.4、216.5、269.6、271.1、272.7、275.2、283.7、292.1、295.5、340.6和350.1的单克隆抗体或其抗原结合片段。
药物组合物和施用
本发明也涉及药物组合物，其包含本文所述的治疗有效量的抗原结合蛋白，其与药物学上可接受的载体或稀释剂一起配制。
为了制备药物或无菌组合物，将抗CMV抗原结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences和U.S. Pharmacopeia:National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)。药学上可接受的载体包括任何以及所有溶剂、分散剂、等渗和吸收延迟剂等，其是生理学上相容的，即适合于向人施用。载体可以适用于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、直肠的、脊柱的或表皮的施用（例如通过注射或输注）。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指如上所述的物质，其与适合于向人施用的本发明的抗原结合蛋白混合。在本发明的实施方案中，所述药学上可接受的载体不以相同形式出现在自然界中，例如所述物质是人造的，可能是因为其非天然存在的或该物质的纯度和/或无菌度与相应的天然物质不相同。例如，注射用无菌水（其为注射用蒸馏水的无菌、无细菌、无溶质制剂）不以相同形式出现在自然界中并且被认为是药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含本文公开的一种或多种抗原结合蛋白和注射用无菌水。在其他实施方案中，药学上可接受的载体可以是水的另一种形式，其适合于药学或生物学制备并且与自然界中出现的水不同，包括纯化的水、注射用水、无菌纯化的水，和注射用抑菌水。
在额外的实施方案中，本发明的组合物包括缓冲液作为药学上可接受的载体。当使用缓冲液时，缓冲液的pH优选在约5.5-约8.0范围内。在额外的实施方案中，pH是约5.5-约7.5、约5.5-约7.0、约5.5-约6.5、约6.0-约8.0、约6.0-约7.5、约6.0-约7.0、约6.5-约7.0、约6.0-6.5、约6.0-约6.9、约6.2-约6.75、or 约6.0-约6.75。
药物组合物在制造和储存条件下通常应该是无菌的并且是稳定的。可以通过与例如冻干粉剂、浆液、水溶液、悬浮液、微乳剂、分散体、脂质体或适合于高抗体浓度的其他有序结构形式的可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗和诊断剂的制剂（参见例如，Hardman,等(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY;Avis,等(编辑)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker, NY; Lieberman,等(编辑)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman,等(编辑)(1990) Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner和Kotkoskie (2000) ExcipientToxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY)。
可以通过将适当溶剂中所需要的治疗有效量的活性化合物（即，抗体或抗原结合蛋白）与一种成分或成分的组合掺和，需要时随后通过过滤灭菌来制备无菌的可注射用溶液。一般而言，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和所需要的其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，有用的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外想要成分的粉剂。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，分散体的情况下通过维持所需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持适当的溶液流动性。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶引起可注射组合物的延迟吸收。
在一个实施方案中，将本发明的抗CMV抗体或其片段在醋酸钠溶液pH 5-6中稀释到适当浓度，并且加入NaCl或蔗糖用于张力。可以加入额外的试剂，如聚山梨酯20或聚山梨酯80以增强稳定性。
可以通过标准的药学方法在细胞培养物中或实验动物中确定单独施用或与另一试剂组合施用的抗原结合蛋白组合物的毒性和治疗效力，例如用于确定LD50（使50%群体致死的剂量）和ED50（在50%群体中治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数(LD50/ ED50)。在具体方面，想要展示高治疗指数的抗原结合蛋白。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人的一定范围的剂量。此类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括基本不具有毒性或无毒性的ED50。剂量可以根据使用的剂量形式和施用途径而在这一范围内变化。
在其他实施方案中，根据Physicians' Desk Reference 2003 (ThomsonHealthcare；第57版(2002年11月1日))向主体施用包含本文公开的抗原结合蛋白的组合物。
施用方式可以变化。合适的施用途径包括口腔、直肠、透粘膜（transmucosal）、肠内、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、表皮、经皮，或动脉内。
在具体的实施方案中，可以通过侵入途径，如通过注射施用抗CMV抗原结合蛋白。在本发明的其他实施方案中，经静脉内、皮下、肌内、动脉内、关节内（例如在关节炎关节中）、瘤内，或通过吸入、气溶胶递送施用抗CMV抗原结合蛋白或其药物组合物。通过非侵入途径（例如口腔；例如，以丸剂、胶囊或片剂）的施用也在本发明的范围内。
可以利用本领域已知的医学设备施用组合物。例如，可以利用皮下针，包括例如预装注射器或自动注射器注射施用本发明的药物组合物。
也可以利用无针皮下注射设备；如在美国专利号6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的设备施用本文公开的药物组合物。
也可以通过输注施用本文公开的药物组合物。众所周知的施用药物组合物的埋植剂和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了以可控速率调配药疗的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药疗的药疗输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了变速流可植入输注装置用于连续药物递送；美国专利号4,439,196，其公开了具有多腔室的渗透药物递送系统。许多其他此类埋植剂、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。
施用方案取决于若干因素，包括治疗性抗原结合蛋白的血清或组织更新速率、症状水平、治疗性抗原结合蛋白的免疫原性，和生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送有效的治疗性抗原结合蛋白以引起靶标疾病状态的改善，同时将不想要的副作用降至最低。因此，所递送的生物量部分取决于特定的治疗性抗原结合蛋白和所治疗的状况的严重性。可获得在选择治疗性抗原结合蛋白的适当剂量的指导（参见例如，Wawrzynczak(1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub.Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina(编辑) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker,New York, NY; Bach (编辑) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert,等(2003) New Engl. J.Med.348:601-608; Milgrom等(1999) New Engl. J. Med.341:1966-1973; Slamon等(2001) New Engl. J. Med.344:783-792; Beniaminovitz等(2000) New Engl. J.Med.342:613-619; Ghosh等(2003) New Engl. J. Med.348:24-32; Lipsky等(2000) NewEngl. J. Med.343:1594-1602)。
由临床医师，例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行适当剂量的确定。一般地，剂量以多少少于最佳剂量的量开始，然后其以小增量增加，直至相对于任何阴性副作用实现想要的或最佳的效果。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生的炎性细胞因子的水平的那些量度。一般而言，期望将使用的生物剂来源自与靶向治疗的动物相同的物种，由此将针对试剂的任何免疫应答降至最低。在人主体的情况下，例如，可以期望嵌合的、人源化的和完全人抗原结合蛋白。
可以通过连续输注，或通过例如每天、每周1-7次、每周1次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次、每半年一次、每年一次等施用的剂量提供本文公开的抗原结合蛋白。例如可以静脉内、皮下、局部、口腔、经鼻、直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。总的每周剂量一般是至少0.05 μg/kg体重，更一般是至少0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.25 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/ml、10 mg/kg、25mg/kg、50 mg/kg或更高(参见例如，Yang,等(2003) New Engl. J. Med.349:427-434;Herold,等(2002) New Engl. J. Med.346:1692-1698; Liu,等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456; Portielji,等(20003) CancerImmunol.Immunother.52:133-144)。也可以提供剂量以在主体血清中实现抗CMV抗原结合蛋白的预定目标浓度，如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 µg/ml或更高。在其他实施方案中，经皮下或静脉内，在每周一次、每两周一次、“每4周一次”、每月一次、每两月一次、或每季度一次基础上以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500 mg/主体施用本发明的抗CMV抗原结合蛋白。
如本文所用，“抑制”、“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”包括与CMV感染相关的症状发生的延迟和/或CMV感染的症状严重性的降低。术语还包括改善现有的不受控的或不想要的症状、预防额外的症状，和改善或预防此类症状的潜在原因。因此，术语表示有益结果已经赋予患有CMV感染或具有发生该感染的可能的脊椎动物主体上。
如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指本发明的抗CMV抗原结合蛋白的量，当向细胞、组织或主体单独施用或与额外的治疗剂组合施用时，其有效引起CMV感染或状况或该感染的进展的一个或多个症状的可测量改善。治疗有效剂量还指这样的抗原结合蛋白的量，其足以导致症状的至少部分改善，例如相关医疗状况的治疗、愈合、预防或改善，或此类状况的治疗、愈合、预防或改善的速率增加。当应用于单独施用的个体活性成分时，治疗有效剂量指该单独成分。当应用于组合时，治疗有效剂量指活性成分的组合量，其产生治疗效果，无论是组合、连续或同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数改善至少10%；一般是20%；优选至少约30%；更优选至少40%，最优选至少50%。有效量也可以导致在其中主观量度用于评估疾病严重性的情况下主观量度的改善。在本发明的一些实施方案中，有效量是足以抑制CMV复制的量。
试剂盒
本发明中还包括的是这样的试剂盒，其包括包含本发明的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物的容器。如本文所用，术语“容器”指用于保存、储存或运输本发明的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物的人造容器，包括小瓶、注射器、药筒、安瓿、和瓶子。容器可以由适合于储存药物或生物制剂的任何材料，即无菌且与制剂不反应的材料，如玻璃形成。玻璃容器应该满足药典要求，例如美国和欧洲药典(USP和EP)为药物包装使用的玻璃定义的标准。
试剂盒可以包括一种或多种其他要素，包括：使用说明；其他试剂，例如标签、治疗剂、或用于螯合或另外偶联抗体至标签或治疗剂的试剂、或用于制备抗体用于施用的其他材料；药物学上可接受的载体；和用于向主体施用的设备或其他材料。
使用说明包括用于治疗应用的说明，包括例如在具有CMV感染症状的患者中的建议剂量和/或施用方式。其他说明可以包括将抗体与螯合剂、标签或治疗剂偶联，或用于例如从未反应的缀合组分纯化缀合的抗体的说明。
实施例
下文提供实施例以进一步阐明本发明的不同特征。所述实施例还阐明了用于实践本发明的有用方法学。这些实施例不限制要求保护的本发明。
实施例1：产生一组兔单克隆抗体
恢复五聚gH复合体在AD169中的表达并且所述回复体病毒能够感染MRC-5 和ARPE-19细胞。来自ATCC的AD169(GenBank登录号X17403)在MRC-5细胞中繁殖(Fu等, 2012,Vaccine 30: 7469-7474; Tang等, 2011, Vaccine 29: 8350-8356)。如Fu等 (2012,Vaccine 30: 7469-7474)和Tang等 (2011, Vaccine 29: 8350-8356)中所述通过培养中的AD169的连续传代适应产生回复体病毒。分别在MRC-5 (ATCC登录号CRL-171)或ARPE-19(ATCC登录号CRL-2302)中扩繁AD169病毒及其回复体分离物。
如使用抗原滴定酶联免疫测定(EIA)所测定，回复体病毒及其亲本AD169病毒均含有相同水平的gB。图1A显示gB单克隆抗体B8.6 (IgG2aκ)和35.1 (IgG2aκ)（两者为内源开发的）与两种病毒反应相当。相反，UL130蛋白特异性单克隆抗体(3E3 (IgG1κ)和3C5 (IgG1κ)(两者由Thomas Shenk of Princeton University友情提供；参见Wang等, 2005, J Virol79: 2115-2123)仅显示与回复体病毒的反应性，而非与亲本AD169病毒的反应性（图1B）。
在3-4月龄的New Zealand White雌兔（购自Covance, Denver, PA的无特异性病原体的群体）中产生单克隆抗体。根据Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals在Merck动物设备中单独圈养动物。在第0周、第3周和第8周利用100 μg回复体病毒三次肌内注射后，一只兔子中的中和效价在第11周升高至1:3400(Fu等, 2012, Vaccine30: 7469-7474; Tang等, 2011, Vaccine 29: 8350-8356)。在第14周时利用500 μg的回复体病毒经静脉内加强该兔子，并在4天后收集脾用于杂交瘤培养。基于先前报道的方案(Yu等, 2010, PLoS One 5: e9072)，在Epitomics, Inc (Burlingame, CA)产生兔杂交瘤。首先筛选大约500份杂交瘤培养物的兔IgG产生，然后在功能测定中进行筛选用于中和ARPE-19细胞中的回复体病毒或在ELISA中进行筛选结合回复体病毒。通过两轮有限稀释选择了75份培养物并进行了克隆。证实其活性后，建立了45个独立的株系并进行扩繁用于抗体产生。
从兔杂交瘤细胞克隆单克隆抗体编码基因基于先前报道的具有较小修改的方法(Yu等, 2010, PLoS One 5:e9072)。简言之，使用Trizal提取(Invitrogen, Carlsbad,CA) 从兔杂交瘤细胞中分离mRNA并使用Superscript II试剂盒(Invitrogen)将其反转录成cDNA。使用L链和H链引物PCR扩增可变(VH和VL)区。使用nucleospin凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel, Bethlehem, PA)凝胶纯化PCR产物，连接到pCR2.1 TA-克隆载体(Invitrogen)中并平铺到S-Gal AmpR平板中用于选择白色菌落。使用miniprep试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从多个菌落中提取质粒并且使用M13R和M13F测序引物从两个方向对各克隆进行测序。通过至少三次相同的测序结果验证最终的序列。在表10-15中显示了各单克隆抗体的重链和轻链可变域的CDR和构架区的氨基酸序列。
实施例2：抗CMV单克隆抗体的结合和中和概况
测定单克隆抗体其中和和病毒结合以及中和能力。中和测定评估了单克隆抗体防止病毒上皮细胞进入的能力。病毒结合测定使用ELISA评估了单克隆抗体结合病毒体的能力。
简言之，所使用的中和测定基于计数感染后24小时表达病毒立即早期（IE）抗原的细胞并如先前所述(Tang等, 2011, Vaccine 29:8350-6)。使用Prism® 5 (GraphPad®Software, San Diego, CA)从四参数曲线拟合计算EC50值，其定义为阻断50%病毒进入所需要的抗体浓度。
简言之，所用的病毒结合测定是抗体滴度酶联免疫测定(EIA)以测定各单克隆抗体与回复体病毒体（作为抗原）的相对结合亲和力。在96-孔FluoroNunc MaxiSorp™微量滴定板(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)上，以最大浓度，通常是在PBS中2 μg/mL，在4oC过夜包被抗原。利用PBS/0.05% Tween 20中3%脱脂乳封闭平板并且将其与0.2-30μg/mL滴度的单克隆抗体孵育。抗体孵育后洗涤平板并将其与山羊抗兔IgG, HRP缀合的抗体(Southern Biotech, Birmingham, AL)反应。孵育和洗涤后，以100 μL/孔加入荧光HRP底物10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（dihroxyphenoxazine） (ADHP; Virolabs,Chantilly, VA)以产生与HRP浓度成比例的浓度的试卤灵(High等, 2005, Anal Biochem347:159-61和Meng等, 2005, Anal Biochem 345:227-36)。利用荧光读取器(Victor III,Perkin-Elmer, Waltham, MA)测量531 nm处的激发信号和595 nm处的发射信号。使用Prism® 5从四参数曲线拟合计算EC50结合值。
人多克隆CMV超免疫IgG (HIG , CytoGam®, 由CSL, Inc. (Melbourne,Australia)商业制造和分销)在中和和结合测定中用作阳性对照并用作参考以比较实施例1中描述的45个单克隆抗体（参见图2）。将HIG抗体中和病毒（防止病毒感染）的能力测量为具有病毒立即早期（IE）抗原表达的百分比细胞（y-轴），其与抗体浓度负相关（图2A）。荧光单位的结合信号（y-轴）与抗体浓度成比例（图2B）。图2A中的y-轴显示具有病毒立即早期抗原表达的细胞的百分比，指示病毒进入事件。图2B中的y-轴显示抗体特异性荧光信号。通过四参数曲线拟合分别计算EC50中和和EC50结合，其定义为阻断50%病毒进入（图2A）或达到50%最大结合（图2B）所需要的IgG浓度。HIG，即CytoGam®具有1 μg/mL的EC50中和和2 μg/mL的EC50结合。
为了在ELISA中定量ARPE-19细胞中抗体中和病毒或与病毒体反应的能力，通过四参数曲线拟合计算实施例1中描述的各抗体的抗病毒活性（EC50中和）和结合亲和力（EC50结合）。较低的EC50分别表示较好的中和活性或较高的结合亲和力。如果单克隆抗体具有差的结合亲和力或抗病毒活性，或如果没有可靠的曲线拟合（其具有不会聚成典型S型分布的所有基准点），那么为EC50任意指定值100 µg/mL，表明中和或结合病毒的功能弱。在表5中列出了所有45个单克隆抗体针对回复体病毒的结合和中和性质。
表5：抗CMV抗体的功能性质
绘制所有45个抗体中和（y-轴）相比于结合（x-轴）的EC50值以理解结合亲和力怎样与各抗体的中和能力相关（图2C）。HIG的EC50中和活性（~1 µg/mL，图2A）显示为图2C中的水平虚线并基于其抗病毒潜力用于分离单克隆抗体。在图2C中显示的45个单克隆抗体中，认为具有≤1 µg/mL的EC50中和的25个单克隆抗体是中和抗体（线上的三角形）并认为具有>1µg/mL的EC50中和的20个单克隆抗体是非中和抗体（线下的圆环）。
所有中和单克隆抗体的EC50结合在0.2-5µg/mL范围内，与HIG相当（2µg/mL）。相反，大多数非中和单克隆抗体比HIG对病毒体具有更高的结合亲和力（图2C，左下象限），表明较高的结合亲和力与改善的抗病毒功能不相关。
将具有EC50中和≤0.1 µg/mL的单克隆抗体划分为原种中和抗体（参见表6）。同样地，将EC50结合≤0.2 µg/mL的单克隆抗体指定为原种结合抗体（参见表6）。如此指定这些单克隆抗体是因为其与HIG相比≥10倍的中和能力或结合亲和力（表5）。单克隆抗体57.4是原种中和体和原种结合体的唯一抗体。
表6：原种抗CMV抗体
实施例3：上皮细胞中抗体的中和能力与其在成纤维细胞中的活性不相关
已知HIG可以阻断病毒进入成纤维细胞，诸如MRC-5细胞，效力比阻断病毒进入上皮细胞即ARPE-19细胞低约10至15倍(Cui等, 2008, Vaccine 26:5760-5766)。已暗示对于感染上皮细胞相比成纤维细胞病毒使用不同进入机制(Wang等, 2007, PNAS 104:20037-42)。因此，通过测量每一单克隆抗体MRC-5细胞中的EC50中和来评价抗体组（表5）。抗体阻断病毒进入MRC-5细胞（y轴）相比于ARPE-19细胞（x轴）的EC50值之间的关系显示于图3中。所有45种抗体可以归类入三组：组A中的抗体仅中和ARPE-19细胞中的病毒，组B中的抗体中和两种细胞类型中的病毒，而组C中的抗体在任一细胞系中均是不中和的（参见表7）。
表7：
具有针对病毒进入ARPE-19细胞的有效活性的单克隆抗体诸如克隆57.4和276.10无法阻断病毒进入成纤维细胞。11种原种中和单克隆抗体中仅5种具有针对病毒进入成纤维细胞中的活性。剩余的14种中和单克隆抗体中，11种抗体具有针对病毒进入成纤维细胞的活性。因此，约60%的单克隆抗体可以中和上皮细胞和成纤维细胞中的病毒。ARPE-19相对于MRC-5细胞中中和能力之间的差异与人抗体的结果一致(Macagno等, 2010, J Virol84:1005-1013)并且与有效的原种中和单克隆抗体识别对于病毒进入上皮细胞而非成纤维细胞的独特的抗原这一看法相一致(Wang等, 2007, PNAS 104:20037-42)。
实施例4：对经纯化的病毒的差异结合概况
使用抗原滴定EIA生成原种中和且原种结合抗体对AD169病毒体和回复体病毒体的结合概况。通过设计，回复体病毒和AD169病毒具有除了五聚gH复合体之外的相同的抗原组成。因此，单克隆抗体对AD169相比于回复体病毒的结合亲合力中的任何差异可能是由于五聚gH复合体在回复体病毒上的存在。将结合概况比较以评价原种中和抗体是否靶向五聚gH复合体，这对于上皮进入而非成纤维细胞进入是必需的。
三种结合模式图示于图4中。单克隆抗体（a）仅与回复体病毒反应（克隆57.4，显示于图4A中），（b）与回复体病毒和AD169病毒反应，但优选回复体病毒（克隆58.5，显示于图4B中），或者（c）与回复体病毒和AD169病毒反应，但未显示差别（克隆295.5， 显示于图4C中）。当基于抗体结合模式与其在ARPE-19细胞中的EC50中和值的相关性来将它们作图时，所有原种中和体仅与回复体病毒反应（模式A）或者显示对回复体病毒的偏好（模式B）。然而，11种原种结合体中的9种在回复体病毒或AD169之间没有显示出偏好（模式C）（克隆210.4、269.6、271.1、272.7、275.2、283.7、292.1、295.5和350.1）。因此，相比于AD169病毒，强中和抗体的抗原更大量地展示在回复体病毒上，且这与成为中和抗体的优势靶标的五聚gH复合体是一致的。
实施例5：大部分中和抗体具有与重组五聚gH复合体的反应性
为了进一步表征原种中和和原种结合抗体的抗原特异性，将重组gB和五聚gH复合体用于抗体滴定EIA中。以1 μg/ml的单一浓度时对重组五聚gH相比于gB抗原的抗体反应性显示于图5中。没有原种中和抗体与gB反应，这与原种中和抗体几乎不具有中和活性和对AD169降低的结合这一事实是一致的。三种原种结合体（克隆272.7、350.1和210.4）与gB强烈反应，且这些单克隆抗体均不中和AD169或回复体病毒。该结果与之前的观察结果一致，所述观察结果为gB在上皮细胞中诱导中和抗体中是无效的Cui等, 2008, Vaccine 26:5760-6;Wang等, 2011, Vaccine 29:9075-80; Tang等, 2011, Vaccine 29:8350-6)。相反，在11种原种中和体中，8种与五聚gH复合体反应(克隆57.4、70.7、124.4、270.7、276.10、316.2和324.4)。7种原种结合体中仅两种（克隆292.1和269.6）与五聚gH复合体反应，且相比于原种中和体它们具有对五聚gH相对弱的结合。因此，五聚gH复合体是由大多数中和抗体所识别的抗原复合体，且抗体与五聚gH复合体的反应性与其在上皮细胞中的中和作用相关。
实施例6：抗CMV单克隆抗体的进化分析
基于完整VH区的氨基酸序列构建进化树（图6）。由于重链可变结构域CDR3（HCDR3）最好地代表连接多样性和克隆特异性，因此将45种单克隆抗体基于其HCDR3序列同源性分入26个谱系组中。基于聚簇抗体之间的HCDR3序列的相似性，26个组中的每一组可起源于对不同表位的单一独特的B细胞谱系。如果是这样，则相同谱系组内的单克隆抗体应具有相似的中和或结合特性。的确，中和和结合单克隆抗体大部分分开到不同的谱系组中。11种原种中和单克隆抗体中的八种聚簇在三个谱系组中（组13、16和20）。原种中和单克隆抗体347.3（谱系组18中的唯一成员）与原种中和谱系组16密切相关。原种中和单克隆抗体276.10与弱中和单克隆抗体30.2归入一组。如同原种中和体，弱中和单克隆抗体也趋于在普通谱系组中聚簇（组1中5个mAbs；组6中3个mAbs；组17中2个mAbs和组21中2个mAbs均为弱中和体）。总体来说，7个谱系组占25种中和单克隆抗体中的20种。与中和单克隆抗体相反，非中和单克隆抗体在所有谱系组中更为分散，除了谱系组9和22之外。谱系组9中的所有5种单克隆抗体为原种或中间结合体，且谱系组22中的2种单克隆抗体为原种结合体。十种非中和单克隆抗体落入单一抗体的谱系组中。非中和单克隆抗体的独立谱系的最大数目表明这些单克隆抗体对于不同的病毒抗原和/或表位是特异性的。此外，与中和单克隆抗体相比这些非中和单克隆抗体之间缺乏相关性表明由这些单克隆抗体所识别的抗原靶标比由中和单克隆抗体识别的那些更为多样。
然而，对此存在一些例外。mAb 250.5和mAb 57.4两者均具有结合和中和能力，尽管前者是两种特性的弱mAb，而后者为两种特性的原种mAb。有趣的是，mAb 57.4与中和谱系组6和结合谱系组9密切相关。最后，mAb 350.1（原种结合体）和mAb 117.8（弱中和体）共享相同的HCDR3序列且均在谱系组7中。
对于给定的单克隆抗体，HCDR3的大小有时与增加的抗病毒功能（诸如中和）或物理相互作用（诸如结合）相关。因此，分析具有抗体的功能特性的抗体的HCDR3和轻链可变结构域（LCDR3）之间的关系（图7）。11种原种中和mAb具有比11种原种结合体更长的平均HCDR3（15.6个氨基酸相对于12.2个；p=0.024），而它们LCDR3的平均长度大约相同，对于原种中和体为11.6个氨基酸相比于对于原种结合体的10.8个(p=0.266)。对所有中和mAb（n=25）相比于不具有中和活性的那些（n=20）进行比较。在该比较中，具有中和功能的抗体的HCDR3和LCDR3的平均大小（分别为15.9和12.3个氨基酸）比不具有中和活性的抗体的HCDR3和LCDR3的那些（分别13.0和10.9个氨基酸）显著更长（两个比较中均为p=0.009）。该结果表明对于病毒中和重要的靶标优先被具有长HCDR3或LCDR3的B祖细胞受体所识别。
有趣的是，中和抗体中发现的体细胞突变的平均数目与非中和抗体中VH或VL的没有显著不同（表8-9）。为了计算体细胞突变的比率，将兔抗体的核苷酸序列提交到IMGT(ImMuno GeneTics Informations System®; Lefranc等, 2003, Dev Comp Immunol 27:55-77)。将各抗体的确定的V区与最接近的种系V区序列比对来计算氨基酸突变（插入、缺失或取代）的数目。比率基于完整V区内突变的数目来计算。
这些观察结果表明对于病毒中和重要的靶标是复杂的且用于中和的与这些靶标的相互作用倾向于具有更长HCDR3和/或LCDR3的那些抗体。由体细胞突变的抗体亲合力成熟对于发育诸如中和抗体起次要作用。
表8：中和mAb的体细胞突变
表9：非中和mAb的体细胞突变
实施例7：由一些抗CMV单克隆抗体的补体依赖性病毒中和
抗体可以通过经其Fc区固定补体或活化NK细胞来行使效应子功能(Strohl, 2009,Curr Opin Biotechnol 20:685)。通过结合病毒颗粒或病毒感染的细胞上展示的病毒抗原，这些抗体可以介导抗原特异性病毒裂解(virolysis)或体内病毒感染的细胞的细胞毒性。测试所有20种非中和兔单克隆抗体在标准兔补体存在的情况下的病毒中和能力。
简言之，将滴定中的单克隆抗体在具有或不具有兔补体（1:32体积稀释，来自Cedarlane, #CL3111）的情况下与病毒混合。室温下孵育1小时后，将混合物添加至铺在96孔板中的ARPE-19细胞。第二天将细胞固定并如之前所述对病毒IE抗原的表达进行染色。
尽管大部分单克隆抗体在兔补体存在或不存在的情况下未显示出中和活性，但五种非中和单克隆抗体（克隆202.3、216.5、272.7、275.2和345.1）当补体存在时显示出抗病毒功能。补体依赖性病毒中和与对病毒体的抗体亲合力不相关，且不是表位特异性的。如图8中所示，具有最高亲合力的克隆（克隆295.5）在具有或不具有补体的情况下不具有抗病毒活性（图8A）。克隆272.7和350.1识别gB蛋白，但当将在病毒中和测定中添加补体时，仅克隆272.7可以中和病毒（图8B和8C）。基于四参数曲线拟合计算补体存在的情况下克隆272.7的抗病毒活性，且具有补体的EC50中和估计为0.22 μg/mL。
实施例8：通过蛋白质印迹分析和ELISA鉴定抗CMV mAb靶标
在样品缓冲液(商品#NP0007, Invitrogen, Carlsbad, California)中将纯化的CMV病毒体变性并在SDS-PAGE上分离病毒蛋白。45种抗体中大部分无法识别特异性病毒蛋白条带（图9A），表明由这些抗体所识别的靶标是天然构象的且当病毒抗原变性时它们的表位呈递差。然而，一个接近100KDa（gH (UL75)的报道分子量）的特异性病毒蛋白显著地被克隆15.1、58.5、223.4、347.3、212.6、240.8和203.1所印迹。该结果进一步用图9B中的克隆58.5所验证。
基于ELISA（图4和图5）和蛋白质印迹分析（图9A）的结果，指定由克隆57.4、58.5、272.7和276.10所识别的病毒抗原。克隆57.4和276.10仅结合回复体病毒，而非AD169（图4A），且它们与重组五聚gH复合体强反应，因而其表位唯一由UL128、UL130和/或UL131蛋白构成。克隆58.5识别重组五聚gH复合体且在蛋白质印迹中检测具有gH的相同分子量的蛋白，因此，其靶向的病毒抗原为gH。基于ELISA中其与gB的重组形式的反应性（图5），由克隆272.7识别的病毒蛋白为gB。
实施例9：兔抗CMV抗体的人源化
基于根据本领域中的方法的CDR移植的概念(美国专利号5,530,101; 5,225,539; 6,693,762)，将四种兔抗CMV抗体（克隆57.4、58.5、272.7和276.10）人源化。基于IMGT规则(Lefranc等, 2003, Dev Comp Immunol 27: 55-77)并参考Kabat/Chothia (Kabat等,1980, J Exp Med 152: 72-84; Yu等, 2010, PLoS ONE 5: e9072; Haidar等, 2012,Proteins 80: 896-912)鉴定兔重链和轻链的CDR结构域。简言之，经 IMGT®, 国际ImMunoGeneTics信息系统®鉴定给定的兔单克隆抗体重链或轻链与人种系的最佳匹配。推定的CDR的序列显示于表10 (SEQ ID NOs.:1-135)和13 (SEQ ID NOs.:136-270)中。通过美国专利号5,530,101和6,693,762的CDR移植方案的规则并参考Yu等, 2010, PLoS ONE5: e9072和Haidar等, 2012, Proteins 80: 896-912来实现人源化。对于表达人源化抗体，将重链可变区框内与IgG1恒定区融合而轻链可变区框内与κ恒定区融合。在大多数情况下，存在设计用于每一抗体的重链和轻链可变区的两种形式，差别在于相对于彼此的一个或两个氨基酸残基。人源化重链和轻链可变区为：
其他实施方案在以下权利要求内。尽管已经显示且描述了若干实施方案，但可以进行多种修改而不背离本发明的精神和范围。
Claims (26)
1.包含轻链可变区的重组抗原结合蛋白，所述轻链可变区包含选自以下的互补决定区(CDR) 1、CDR2和CDR3：
(l-a)包含SEQ ID NO:1的CDR1、包含SEQ ID NO:2的CDR2和包含SEQ ID NO:3的CDR3；
(l-b)包含SEQ ID NO:4的CDR1、包含SEQ ID NO:5的CDR2和包含SEQ ID NO:6的CDR3；
(l-c)包含SEQ ID NO:7的CDR1、包含SEQ ID NO:8的CDR2和包含SEQ ID NO:9的CDR3；
(l-d)包含SEQ ID NO:10的CDR1、包含SEQ ID NO:11的CDR2和包含SEQ ID NO:12的CDR3；
(l-e)包含SEQ ID NO:13的CDR1、包含SEQ ID NO:14的CDR2和包含SEQ ID NO:15的CDR3；
(l-f)包含SEQ ID NO:16的CDR1、包含SEQ ID NO:17的CDR2和包含SEQ ID NO:18的CDR3；
(l-g)包含SEQ ID NO:19的CDR1、包含SEQ ID NO:20的CDR2和包含SEQ ID NO:21的CDR3；
(l-h)包含SEQ ID NO:22的CDR1、包含SEQ ID NO:23的CDR2和包含SEQ ID NO:24的CDR3；
(l-i)包含SEQ ID NO:25的CDR1、包含SEQ ID NO:26的CDR2和包含SEQ ID NO:27的CDR3；
(l-j)包含SEQ ID NO:28的CDR1、包含SEQ ID NO:29的CDR2和包含SEQ ID NO:30的CDR3；
(l-k)包含SEQ ID NO:31的CDR1、包含SEQ ID NO:32的CDR2和包含SEQ ID NO:33的CDR3；
(l-l)包含SEQ ID NO:34的CDR1、包含SEQ ID NO:35的CDR2和包含SEQ ID NO:36的CDR3；
(l-m)包含SEQ ID NO:37的CDR1、包含SEQ ID NO:38的CDR2和包含SEQ ID NO:39的CDR3；
(l-n)包含SEQ ID NO:40的CDR1、包含SEQ ID NO:41的CDR2和包含SEQ ID NO:42的CDR3；
(l-o)包含SEQ ID NO:43的CDR1、包含SEQ ID NO:44的CDR2和包含SEQ ID NO:45的CDR3；
(l-p)包含SEQ ID NO:46的CDR1、包含SEQ ID NO:47的CDR2和包含SEQ ID NO:48的CDR3；
(l-q)包含SEQ ID NO:49的CDR1、包含SEQ ID NO:50的CDR2和包含SEQ ID NO:51的CDR3；
(l-r)包含SEQ ID NO:52的CDR1、包含SEQ ID NO:53的CDR2和包含SEQ ID NO:54的CDR3；
(l-s)包含SEQ ID NO:55的CDR1、包含SEQ ID NO:56的CDR2和包含SEQ ID NO:57的CDR3；
(l-t)包含SEQ ID NO:58的CDR1、包含SEQ ID NO:59的CDR2和包含SEQ ID NO:60的CDR3；
(l-u)包含SEQ ID NO:61的CDR1、包含SEQ ID NO:62的CDR2和包含SEQ ID NO:63的CDR3；
(l-v)包含SEQ ID NO:64的CDR1、包含SEQ ID NO:65的CDR2和包含SEQ ID NO:66的CDR3；
(l-w)包含SEQ ID NO:67的CDR1、包含SEQ ID NO:68的CDR2和包含SEQ ID NO:69的CDR3；
(l-x)包含SEQ ID NO:70的CDR1、包含SEQ ID NO:71的CDR2和包含SEQ ID NO:72的CDR3；
(l-y)包含SEQ ID NO:73的CDR1、包含SEQ ID NO:74的CDR2和包含SEQ ID NO:75的CDR3；
(l-z)包含SEQ ID NO:76的CDR1、包含SEQ ID NO:77的CDR2和包含SEQ ID NO:78的CDR3；
(l-a')包含SEQ ID NO:79的CDR1、包含SEQ ID NO:80的CDR2和包含SEQ ID NO:81的CDR3；
(l-b')包含SEQ ID NO:82的CDR1、包含SEQ ID NO:83的CDR2和包含SEQ ID NO:84的CDR3；
(l-c')包含SEQ ID NO:85的CDR1、包含SEQ ID NO:86的CDR2和包含SEQ ID NO:87的CDR3；
(l-d')包含SEQ ID NO:88的CDR1、包含SEQ ID NO:89的CDR2和包含SEQ ID NO:90的CDR3；
(l-e')包含SEQ ID NO:91的CDR1、包含SEQ ID NO:92的CDR2和包含SEQ ID NO:93的CDR3；
(l-f')包含SEQ ID NO:94的CDR1、包含SEQ ID NO:95的CDR2和包含SEQ ID NO:96的CDR3；
(l-g')包含SEQ ID NO:97的CDR1、包含SEQ ID NO:98的CDR2和包含SEQ ID NO:99的CDR3；
(l-h')包含SEQ ID NO:100的CDR1、包含SEQ ID NO:101的CDR2和包含SEQ ID NO:102的CDR3；
(l-i')包含SEQ ID NO:103的CDR1、包含SEQ ID NO:104的CDR2和包含SEQ ID NO:105的CDR3；
(l-j')包含SEQ ID NO:106的CDR1、包含SEQ ID NO:107的CDR2和包含SEQ ID NO:108的CDR3；
(l-k')包含SEQ ID NO:109的CDR1、包含SEQ ID NO:110的CDR2和包含SEQ ID NO:111的CDR3；
(l-l')包含SEQ ID NO:112的CDR1、包含SEQ ID NO:113的CDR2和包含SEQ ID NO:114的CDR3；
(l-m')包含SEQ ID NO:115的CDR1、包含SEQ ID NO:116的CDR2和包含SEQ ID NO:117的CDR3；
(l-n')包含SEQ ID NO:118的CDR1、包含SEQ ID NO:119的CDR2和包含SEQ ID NO:120的CDR3；
(l-o')包含SEQ ID NO:121的CDR1、包含SEQ ID NO:122的CDR2和包含SEQ ID NO:123的CDR3；
(l-p')包含SEQ ID NO:124的CDR1、包含SEQ ID NO:125的CDR2和包含SEQ ID NO:126的CDR3；
(l-q')包含SEQ ID NO:127的CDR1、包含SEQ ID NO:128的CDR2和包含SEQ ID NO:129的CDR3；
(l-r')包含SEQ ID NO:130的CDR1、包含SEQ ID NO:131的CDR2和包含SEQ ID NO:132的CDR3；和
(l-s')包含SEQ ID NO:133的CDR1、包含SEQ ID NO:134的CDR2和包含SEQ ID NO:135的CDR3；
其中所述抗原结合蛋白特异性结合巨细胞病毒（CMV）。
2.权利要求1的重组抗原结合蛋白，其中所述CDR1、CDR2和CDR3选自：
(l-b)包含SEQ ID NO:4的CDR1、包含SEQ ID NO:5的CDR2和包含SEQ ID NO:6的CDR3；
(l-g)包含SEQ ID NO:19的CDR1、包含SEQ ID NO:20的CDR2和包含SEQ ID NO:21的CDR3；
(l-k)包含SEQ ID NO:31的CDR1、包含SEQ ID NO:32的CDR2和包含SEQ ID NO:33的CDR3；
(l-o)包含SEQ ID NO:43的CDR1、包含SEQ ID NO:44的CDR2和包含SEQ ID NO:45的CDR3；
(l-u)包含SEQ ID NO:61的CDR1、包含SEQ ID NO:62的CDR2和包含SEQ ID NO:63的CDR3；
(l-b')包含SEQ ID NO:82的CDR1、包含SEQ ID NO:83的CDR2和包含SEQ ID NO:84的CDR3；
(l-d')包含SEQ ID NO:88的CDR1、包含SEQ ID NO:89的CDR2和包含SEQ ID NO:90的CDR3；
(l-f')包含SEQ ID NO:94的CDR1、包含SEQ ID NO:95的CDR2和包含SEQ ID NO:96的CDR3；
(l-l')包含SEQ ID NO:112的CDR1、包含SEQ ID NO:113的CDR2和包含SEQ ID NO:114的CDR3；
(l-m')包含SEQ ID NO:115的CDR1、包含SEQ ID NO:116的CDR2和包含SEQ ID NO:117的CDR3；和
(l-r')包含SEQ ID NO:130的CDR1、包含SEQ ID NO:131的CDR2和包含SEQ ID NO:132的CDR3；
其中所述抗原结合蛋白中和CMV。
3.权利要求1或权利要求2的重组抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
4.权利要求1的重组抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区结构域选自SEQ ID NO:631、632、635、636、639、640、642和643。
5.权利要求1的重组抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区还包含选自以下的FR1、FR2、FR3和FR4：
(a)(l-a)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:271的FR1、包含SEQ ID NO:272的FR2、包含SEQ ID NO:361的FR3和包含SEQ ID NO:362的FR4；
(b)(l-b)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:273的FR1、包含SEQ ID NO:274的FR2、包含SEQ ID NO:363的FR3和包含SEQ ID NO:364的FR4；
(c)(l-c)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:275的FR1、包含SEQ ID NO:276的FR2、包含SEQ ID NO:365的FR3和包含SEQ ID NO:366的FR4；
(d)(l-d)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:277的FR1、包含SEQ ID NO:278的FR2、包含SEQ ID NO:367的FR3和包含SEQ ID NO:368的FR4；
(e)(l-e)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:279的FR1、包含SEQ ID NO:280的FR2、包含SEQ ID NO:369的FR3和包含SEQ ID NO:370的FR4；
(f)(l-f)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:281的FR1、包含SEQ ID NO:282的FR2、包含SEQ ID NO:371的FR3和包含SEQ ID NO:372的FR4；
(g)(l-g)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:283的FR1、包含SEQ ID NO:284的FR2、包含SEQ ID NO:373的FR3和包含SEQ ID NO:374的FR4；
(h)(l-h)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:285的FR1、包含SEQ ID NO:286的FR2、包含SEQ ID NO:375的FR3和包含SEQ ID NO:376的FR4；
(i)(l-i)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:287的FR1、包含SEQ ID NO:288的FR2、包含SEQ ID NO:377的FR3和包含SEQ ID NO:378的FR4
(j)(l-j)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:289的FR1、包含SEQ ID NO:290的FR2、包含SEQ ID NO:379的FR3和包含SEQ ID NO:380的FR4；
(k)(l-k)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:291的FR1、包含SEQ ID NO:292的FR2、包含SEQ ID NO:381的FR3和包含SEQ ID NO:382的FR4；
(l)(l-l)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:293的FR1、包含SEQ ID NO:294的FR2、包含SEQ ID NO:383的FR3和包含SEQ ID NO:384的FR4；
(m)(l-m)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:295的FR1、包含SEQ ID NO:296的FR2、包含SEQ ID NO:385的FR3和包含SEQ ID NO:386的FR4；
(n)(l-n)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:297的FR1、包含SEQ ID NO:298的FR2、包含SEQ ID NO:387的FR3和包含SEQ ID NO:388的FR4；
(o)(l-o)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:299的FR1、包含SEQ ID NO:300的FR2、包含SEQ ID NO:389的FR3和包含SEQ ID NO:390的FR4；
(p)(l-p)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:301的FR1、包含SEQ ID NO:302的FR2、包含SEQ ID NO:391的FR3和包含SEQ ID NO:392的FR4
(q)(l-q)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:303的FR1、包含SEQ ID NO:304的FR2、包含SEQ ID NO:393的FR3和包含SEQ ID NO:394的FR4；
(r)(l-r)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:305的FR1、包含SEQ ID NO:306的FR2、包含SEQ ID NO:395的FR3和包含SEQ ID NO:396的FR4；
(s)(l-s)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:307的FR1、包含SEQ ID NO:308的FR2、包含SEQ ID NO:397的FR3和包含SEQ ID NO:398的FR4；
(t)(l-t)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:309的FR1、包含SEQ ID NO:310的FR2、包含SEQ ID NO:399的FR3和包含SEQ ID NO:400的FR4；
(u)(l-u)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:311的FR1、包含SEQ ID NO:312的FR2、包含SEQ ID NO:401的FR3和包含SEQ ID NO:402的FR4；
(v)(l-v)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:313的FR1、包含SEQ ID NO:314的FR2、包含SEQ ID NO:403的FR3和包含SEQ ID NO:404的FR4；
(w)(l-w)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:315的FR1、包含SEQ ID NO:316的FR2、包含SEQ ID NO:405的FR3和包含SEQ ID NO:406的FR4
(x)(l-x)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:317的FR1、包含SEQ ID NO:318的FR2、包含SEQ ID NO:407的FR3和包含SEQ ID NO:408的FR4；
(y)(l-y)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:319的FR1、包含SEQ ID NO:320的FR2、包含SEQ ID NO:409的FR3和包含SEQ ID NO:410的FR4；
(z)(l-z)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:321的FR1、包含SEQ ID NO:322的FR2、包含SEQ ID NO:411的FR3和包含SEQ ID NO:412的FR4；
(a')(l-a')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:323的FR1、包含SEQ ID NO:324的FR2、包含SEQ ID NO:413的FR3和包含SEQ ID NO:414的FR4；
(b')(l-b')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:325的FR1、包含SEQ ID NO:326的FR2、包含SEQ ID NO:415的FR3和包含SEQ ID NO:416的FR4；
(c')(l-c')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:327的FR1、包含SEQ ID NO:328的FR2、包含SEQ ID NO:417的FR3和包含SEQ ID NO:418的FR4；
(d')(l-d')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:329的FR1、包含SEQ ID NO:330的FR2、包含SEQ ID NO:419的FR3和包含SEQ ID NO:420的FR4；
(e')(l-e')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:331的FR1、包含SEQ ID NO:332的FR2、包含SEQ ID NO:421的FR3和包含SEQ ID NO:422的FR4；
(f')(l-f')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:333的FR1、包含SEQ ID NO:334的FR2、包含SEQ ID NO:423的FR3和包含SEQ ID NO:424的FR4；
(g')(l-g')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:335的FR1、包含SEQ ID NO:336的FR2、包含SEQ ID NO:425的FR3和包含SEQ ID NO:426的FR4；
(h')(l-h')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:337的FR1、包含SEQ ID NO:338的FR2、包含SEQ ID NO:427的FR3和包含SEQ ID NO:428的FR4；
(i')(l-i')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:339的FR1、包含SEQ ID NO:340的FR2、包含SEQ ID NO:429的FR3和包含SEQ ID NO:430的FR4；
(j')(l-j')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:341的FR1、包含SEQ ID NO:342的FR2、包含SEQ ID NO:431的FR3和包含SEQ ID NO:432的FR4；
(k')(l-k')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:343的FR1、包含SEQ ID NO:344的FR2、包含SEQ ID NO:433的FR3和包含SEQ ID NO:434的FR4；
(l')(l-l')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:345的FR1、包含SEQ ID NO:346的FR2、包含SEQ ID NO:435的FR3和包含SEQ ID NO:436的FR4；
(m')(l-m')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:347的FR1、包含SEQ ID NO:348的FR2、包含SEQ ID NO:437的FR3和包含SEQ ID NO:438的FR4；
(n')(l-n')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:349的FR1、包含SEQ ID NO:350的FR2、包含SEQ ID NO:439的FR3和包含SEQ ID NO:440的FR4；
(o')(l-o')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:351的FR1、包含SEQ ID NO:352的FR2、包含SEQ ID NO:441的FR3和包含SEQ ID NO:442的FR4；
(p')(l-p')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:353的FR1、包含SEQ ID NO:354的FR2、包含SEQ ID NO:443的FR3和包含SEQ ID NO:444的FR4；
(q')(l-q')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:355的FR1、包含SEQ ID NO:356的FR2、包含SEQ ID NO:445的FR3和包含SEQ ID NO:446的FR4；
(r')(l-r')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:357的FR1、包含SEQ ID NO:358的FR2、包含SEQ ID NO:447的FR3和包含SEQ ID NO:448的FR4；和
(s')(l-s')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:359的FR1、包含SEQ ID NO:360的FR2、包含SEQ ID NO:449的FR3和包含SEQ ID NO:450的FR4。
6.包含重链可变区的重组抗原结合蛋白，所述重链可变区包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：
(h-a)包含SEQ ID NO:136的CDR1、包含SEQ ID NO:137的CDR2和包含SEQ ID NO:138的CDR3；
(h-b)包含SEQ ID NO:139的CDR1、包含SEQ ID NO:140的CDR2和包含SEQ ID NO:141的CDR3；
(h-c)包含SEQ ID NO:142的CDR1、包含SEQ ID NO:143的CDR2和包含SEQ ID NO:144的CDR3；
(h-d)包含SEQ ID NO:145的CDR1、包含SEQ ID NO:146的CDR2和包含SEQ ID NO:147的CDR3；
(h-e)包含SEQ ID NO:148的CDR1、包含SEQ ID NO:149的CDR2和包含SEQ ID NO:150的CDR3；
(h-f)包含SEQ ID NO:151的CDR1、包含SEQ ID NO:152的CDR2和包含SEQ ID NO:153的CDR3；
(h-g)包含SEQ ID NO:154的CDR1、包含SEQ ID NO:155的CDR2和包含SEQ ID NO:156的CDR3；
(h-h)包含SEQ ID NO:157的CDR1、包含SEQ ID NO:158的CDR2和包含SEQ ID NO:159的CDR3；
(h-i)包含SEQ ID NO:160的CDR1、包含SEQ ID NO:161的CDR2和包含SEQ ID NO:162的CDR3；
(h-j)包含SEQ ID NO:163的CDR1、包含SEQ ID NO:164的CDR2和包含SEQ ID NO:165的CDR3；
(h-k)包含SEQ ID NO:166的CDR1、包含SEQ ID NO:167的CDR2和包含SEQ ID NO:168的CDR3；
(h-l)包含SEQ ID NO:169的CDR1、包含SEQ ID NO:170的CDR2和包含SEQ ID NO:171的CDR3；
(h-m)包含SEQ ID NO:172的CDR1、包含SEQ ID NO:173的CDR2和包含SEQ ID NO:174的CDR3；
(h-n)包含SEQ ID NO:175的CDR1、包含SEQ ID NO:176的CDR2和包含SEQ ID NO:177的CDR3；
(h-o)包含SEQ ID NO:178的CDR1、包含SEQ ID NO:179的CDR2和包含SEQ ID NO:180的CDR3；
(h-p)包含SEQ ID NO:181的CDR1、包含SEQ ID NO:182的CDR2和包含SEQ ID NO:183的CDR3；
(h-q)包含SEQ ID NO:184的CDR1、包含SEQ ID NO:185的CDR2和包含SEQ ID NO:186的CDR3；
(h-r)包含SEQ ID NO:187的CDR1、包含SEQ ID NO:188的CDR2和包含SEQ ID NO:189的CDR3；
(h-s)包含SEQ ID NO:190的CDR1、包含SEQ ID NO:191的CDR2和包含SEQ ID NO:192的CDR3；
(h-t)包含SEQ ID NO:193的CDR1、包含SEQ ID NO:194的CDR2和包含SEQ ID NO:195的CDR3；
(h-u)包含SEQ ID NO:196的CDR1、包含SEQ ID NO:197的CDR2和包含SEQ ID NO:198的CDR3；
(h-v)包含SEQ ID NO:199的CDR1、包含SEQ ID NO:200的CDR2和包含SEQ ID NO:201的CDR3；
(h-w)包含SEQ ID NO:202的CDR1、包含SEQ ID NO:203的CDR2和包含SEQ ID NO:204的CDR3；
(h-x)包含SEQ ID NO:205的CDR1、包含SEQ ID NO:206的CDR2和包含SEQ ID NO:207的CDR3；
(h-y)包含SEQ ID NO:208的CDR1、包含SEQ ID NO:209的CDR2和包含SEQ ID NO:210的CDR3；
(h-z)包含SEQ ID NO:211的CDR1、包含SEQ ID NO:212的CDR2和包含SEQ ID NO:213的CDR3；
(h-a')包含SEQ ID NO:214的CDR1、包含SEQ ID NO:215的CDR2和包含SEQ ID NO:216的CDR3；
(h-b')包含SEQ ID NO:217的CDR1、包含SEQ ID NO:218的CDR2和包含SEQ ID NO:219的CDR3；
(h-c')包含SEQ ID NO:220的CDR1、包含SEQ ID NO:221的CDR2和包含SEQ ID NO:222的CDR3；
(h-d')包含SEQ ID NO:223的CDR1、包含SEQ ID NO:224的CDR2和包含SEQ ID NO:225的CDR3；
(h-e')包含SEQ ID NO:226的CDR1、包含SEQ ID NO:227的CDR2和包含SEQ ID NO:228的CDR3；
(h-f')包含SEQ ID NO:229的CDR1、包含SEQ ID NO:230的CDR2和包含SEQ ID NO:231的CDR3；
(h-g')包含SEQ ID NO:232的CDR1、包含SEQ ID NO:233的CDR2和包含SEQ ID NO:234的CDR3；
(h-h')包含SEQ ID NO:235的CDR1、包含SEQ ID NO:236的CDR2和包含SEQ ID NO:237的CDR3；
(h-i')包含SEQ ID NO:238的CDR1、包含SEQ ID NO:239的CDR2和包含SEQ ID NO:240的CDR3；
(h-j')包含SEQ ID NO:241的CDR1、包含SEQ ID NO:242的CDR2和包含SEQ ID NO:243的CDR3；
(h-k')包含SEQ ID NO:244的CDR1、包含SEQ ID NO:245的CDR2和包含SEQ ID NO:246的CDR3；
(h-l')包含SEQ ID NO:247的CDR1、包含SEQ ID NO:248的CDR2和包含SEQ ID NO:249的CDR3；
(h-m')包含SEQ ID NO:250的CDR1、包含SEQ ID NO:251的CDR2和包含SEQ ID NO:252的CDR3；
(h-n')包含SEQ ID NO:253的CDR1、包含SEQ ID NO:254的CDR2和包含SEQ ID NO:255的CDR3；
(h-o')包含SEQ ID NO:256的CDR1、包含SEQ ID NO:257的CDR2和包含SEQ ID NO:258的CDR3；
(h-p')包含SEQ ID NO:259的CDR1、包含SEQ ID NO:260的CDR2和包含SEQ ID NO:261的CDR3；
(h-q')包含SEQ ID NO:262的CDR1、包含SEQ ID NO:263的CDR2和包含SEQ ID NO:264的CDR3；
(h-r')包含SEQ ID NO:265的CDR1、包含SEQ ID NO:266的CDR2和包含SEQ ID NO:267的CDR3；和
(h-s')包含SEQ ID NO:268的CDR1、包含SEQ ID NO:269的CDR2和包含SEQ ID NO:270的CDR3；
其中所述抗原结合蛋白特异性结合CMV。
7.权利要求6的重组抗原结合蛋白，其中所述CDR1、CDR2和CDR3选自：
(h-b)包含SEQ ID NO:139的CDR1、包含SEQ ID NO:140的CDR2和包含SEQ ID NO:141的CDR3；
(h-g)包含SEQ ID NO:154的CDR1、包含SEQ ID NO:155的CDR2和包含SEQ ID NO:156的CDR3；
(h-k)包含SEQ ID NO:166的CDR1、包含SEQ ID NO:167的CDR2和包含SEQ ID NO:168的CDR3；
(h-o)包含SEQ ID NO:178的CDR1、包含SEQ ID NO:179的CDR2和包含SEQ ID NO:180的CDR3；
(h-u)包含SEQ ID NO:196的CDR1、包含SEQ ID NO:197的CDR2和包含SEQ ID NO:198的CDR3；
(h-b')包含SEQ ID NO:217的CDR1、包含SEQ ID NO:218的CDR2和包含SEQ ID NO:219的CDR3；
(h-d')包含SEQ ID NO:223的CDR1、包含SEQ ID NO:224的CDR2和包含SEQ ID NO:225的CDR3；
(h-f')包含SEQ ID NO:229的CDR1、包含SEQ ID NO:230的CDR2和包含SEQ ID NO:231的CDR3；
(h-l')包含SEQ ID NO:247的CDR1、包含SEQ ID NO:248的CDR2和包含SEQ ID NO:249的CDR3；
(h-m')包含SEQ ID NO:250的CDR1、包含SEQ ID NO:251的CDR2和包含SEQ ID NO:252的CDR3；和
(h-r')包含SEQ ID NO:265的CDR1、包含SEQ ID NO:266的CDR2和包含SEQ ID NO:267的CDR3；
其中所述抗原结合蛋白中和CMV。
8.权利要求6或权利要求7的重组抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
9.权利要求6的重组抗原结合蛋白，其中所述重链可变区结构域选自SEQ ID NO:633、634、637、638、641、644和645。
10.权利要求6的重组抗原结合蛋白，其中所述重链可变区还包含选自以下的构架区（FR）1、FR2、FR3和FR4：
(a)(h-a)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:451的FR1、包含SEQ ID NO:452的FR2、包含SEQ ID NO:541的FR3和包含SEQ ID NO:542的FR4；
(b)(h-b)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:453的FR1、包含SEQ ID NO:454的FR2、包含SEQ ID NO:543的FR3和包含SEQ ID NO:544的FR4；
(c)(h-c)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:455的FR1、包含SEQ ID NO:456的FR2、包含SEQ ID NO:545的FR3和包含SEQ ID NO:546的FR4；
(d)(h-d)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:457的FR1、包含SEQ ID NO:458的FR2、包含SEQ ID NO:547的FR3和包含SEQ ID NO:548的FR4；
(e)(h-e)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:459的FR1、包含SEQ ID NO:460的FR2、包含SEQ ID NO:549的FR3和包含SEQ ID NO:550的FR4；
(f)(h-f)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:461的FR1、包含SEQ ID NO:462的FR2、包含SEQ ID NO:551的FR3和包含SEQ ID NO:552的FR4；
(g)(h-g)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:463的FR1、包含SEQ ID NO:464的FR2、包含SEQ ID NO:553的FR3和包含SEQ ID NO:554的FR4；
(h)(h-h)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:465的FR1、包含SEQ ID NO:466的FR2、包含SEQ ID NO:555的FR3和包含SEQ ID NO:556的FR4；
(i)(h-i)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:467的FR1、包含SEQ ID NO:468的FR2、包含SEQ ID NO:557的FR3和包含SEQ ID NO:558的FR4
(j)(h-j)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:469的FR1、包含SEQ ID NO:470的FR2、包含SEQ ID NO:559的FR3和包含SEQ ID NO:560的FR4；
(k)(h-k)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:471的FR1、包含SEQ ID NO:472的FR2、包含SEQ ID NO:561的FR3和包含SEQ ID NO:562的FR4；
(l)(h-l)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:473的FR1、包含SEQ ID NO:474的FR2、包含SEQ ID NO:563的FR3和包含SEQ ID NO:564的FR4；
(m)(h-m)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:475的FR1、包含SEQ ID NO:476的FR2、包含SEQ ID NO:565的FR3和包含SEQ ID NO:566的FR4；
(n)(h-n)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:477的FR1、包含SEQ ID NO:478的FR2、包含SEQ ID NO:567的FR3和包含SEQ ID NO:568的FR4；
(o)(h-o)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:479的FR1、包含SEQ ID NO:480的FR2、包含SEQ ID NO:569的FR3和包含SEQ ID NO:570的FR4；
(p)(h-p)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:481的FR1、包含SEQ ID NO:482的FR2、包含SEQ ID NO:571的FR3和包含SEQ ID NO:572的FR4
(q)(h-q)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:483的FR1、包含SEQ ID NO:484的FR2、包含SEQ ID NO:573的FR3和包含SEQ ID NO:574的FR4；
(r)(h-r)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:485的FR1、包含SEQ ID NO:486的FR2、包含SEQ ID NO:575的FR3和包含SEQ ID NO:576的FR4；
(s)(h-s)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:487的FR1、包含SEQ ID NO:488的FR2、包含SEQ ID NO:577的FR3和包含SEQ ID NO:578的FR4；
(t)(h-t)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:489的FR1、包含SEQ ID NO:490的FR2、包含SEQ ID NO:579的FR3和包含SEQ ID NO:580的FR4；
(u)(h-u)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:491的FR1、包含SEQ ID NO:492的FR2、包含SEQ ID NO:581的FR3和包含SEQ ID NO:582的FR4；
(v)(h-v)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:493的FR1、包含SEQ ID NO:494的FR2、包含SEQ ID NO:583的FR3和包含SEQ ID NO:584的FR4；
(w)(h-w)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:495的FR1、包含SEQ ID NO:496的FR2、包含SEQ ID NO:585的FR3和包含SEQ ID NO:586的FR4
(x)(h-x)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:497的FR1、包含SEQ ID NO:498的FR2、包含SEQ ID NO:587的FR3和包含SEQ ID NO:588的FR4；
(y)(h-y)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:499的FR1、包含SEQ ID NO:500的FR2、包含SEQ ID NO:589的FR3和包含SEQ ID NO:590的FR4；
(z)(h-z)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:501的FR1、包含SEQ ID NO:502的FR2、包含SEQ ID NO:591的FR3和包含SEQ ID NO:592的FR4；
(a')(h-a')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:503的FR1、包含SEQ ID NO:504的FR2、包含SEQ ID NO:593的FR3和包含SEQ ID NO:594的FR4；
(b')(h-b')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:505的FR1、包含SEQ ID NO:506的FR2、包含SEQ ID NO:595的FR3和包含SEQ ID NO:596的FR4；
(c')(h-c')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:507的FR1、包含SEQ ID NO:508的FR2、包含SEQ ID NO:597的FR3和包含SEQ ID NO:598的FR4；
(d')(h-d')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:509的FR1、包含SEQ ID NO:510的FR2、包含SEQ ID NO:599的FR3和包含SEQ ID NO:600的FR4；
(e')(h-e')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:511的FR1、包含SEQ ID NO:512的FR2、包含SEQ ID NO:601的FR3和包含SEQ ID NO:602的FR4；
(f')(h-f')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:513的FR1、包含SEQ ID NO:514的FR2、包含SEQ ID NO:603的FR3和包含SEQ ID NO:604的FR4；
(g')(h-g')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:515的FR1、包含SEQ ID NO:516的FR2、包含SEQ ID NO:605的FR3和包含SEQ ID NO:606的FR4；
(h')(h-h')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:517的FR1、包含SEQ ID NO:518的FR2、包含SEQ ID NO:607的FR3和包含SEQ ID NO:608的FR4；
(i')(h-i')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:519的FR1、包含SEQ ID NO:520的FR2、包含SEQ ID NO:609的FR3和包含SEQ ID NO:610的FR4；
(j')(h-j')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:521的FR1、包含SEQ ID NO:522的FR2、包含SEQ ID NO:611的FR3和包含SEQ ID NO:612的FR4；
(k')(h-k)的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:523的FR1、包含SEQ ID NO:524的FR2、包含SEQ ID NO:613的FR3和包含SEQ ID NO:614的FR4；
(l')(h-l')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:525的FR1、包含SEQ ID NO:526的FR2、包含SEQ ID NO:615的FR3和包含SEQ ID NO:616的FR4；
(m')(h-m')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:527的FR1、包含SEQ ID NO:528的FR2、包含SEQ ID NO:617的FR3和包含SEQ ID NO:618的FR4；
(n')(h-n')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:529的FR1、包含SEQ ID NO:530的FR2、包含SEQ ID NO:619的FR3和包含SEQ ID NO:620的FR4；
(o')(h-o')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:531的FR1、包含SEQ ID NO:532的FR2、包含SEQ ID NO:621的FR3和包含SEQ ID NO:622的FR4；
(p')(h-p')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:533的FR1、包含SEQ ID NO:534的FR2、包含SEQ ID NO:623的FR3和包含SEQ ID NO:624的FR4；
(q')(h-q')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:535的FR1、包含SEQ ID NO:536的FR2、包含SEQ ID NO:625的FR3和包含SEQ ID NO:626的FR4；
(r')(h-r')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:537的FR1、包含SEQ ID NO:538的FR2、包含SEQ ID NO:627的FR3和包含SEQ ID NO:628的FR4；和
(s')(h-s')的CDR1、CDR2和CDR 3以及包含SEQ ID NO:539的FR1、包含SEQ ID NO:540的FR2、包含SEQ ID NO:629的FR3和包含SEQ ID NO:630的FR4。
11.包含选自以下的轻链和重链的重组抗原结合蛋白：
(a)权利要求4的(a)的轻链和权利要求8的(a)的重链；
(b)权利要求4的(b)的轻链和权利要求8的(b)的重链；
(c)权利要求4的(c)的轻链和权利要求8的(c)的重链；
(d)权利要求4的(d)的轻链和权利要求8的(d)的重链；
(e)权利要求4的(e)的轻链和权利要求8的(e)的重链；
(f)权利要求4的(f)的轻链和权利要求8的(f)的重链；
(g)权利要求4的(g)的轻链和权利要求8的(g)的重链；
(h)权利要求4的(h)的轻链和权利要求8的(h)的重链；
(i)权利要求4的(i)的轻链和权利要求8的(i)的重链；
(j)权利要求4的(j)的轻链和权利要求8的(j)的重链；
(k)权利要求4的(k)的轻链和权利要求8的(k)的重链；
(l)权利要求4的(l)的轻链和权利要求8的(l)的重链；
(m)权利要求4的(m)的轻链和权利要求8的(m)的重链；
(n)权利要求4的(n)的轻链和权利要求8的(n)的重链；
(o)权利要求4的(o)的轻链和权利要求8的(o)的重链；
(p)权利要求4的(p)的轻链和权利要求8的(p)的重链；
(q)权利要求4的(q)的轻链和权利要求8的(q)的重链；
(r)权利要求4的(r)的轻链和权利要求8的(r)的重链；
(s)权利要求4的(s)的轻链和权利要求8的(s)的重链；
(t)权利要求4的(t)的轻链和权利要求8的(t)的重链；
(u)权利要求4的(u)的轻链和权利要求8的(u)的重链；
(v)权利要求4的(v)的轻链和权利要求8的(v)的重链；
(w)权利要求4的(w)的轻链和权利要求8的(w)的重链；
(x)权利要求4的(x)的轻链和权利要求8的(x)的重链；
(y)权利要求4的(y)的轻链和权利要求8的(y)的重链；
(z)权利要求4的(z)的轻链和权利要求8的(z)的重链；
(a')权利要求4的(a')的轻链和权利要求8的(a')的重链；
(b')权利要求4的(b')的轻链和权利要求8的(b')的重链；
(c')权利要求4的(c')的轻链和权利要求8的(c')的重链；
(d')权利要求4的(d')的轻链和权利要求8的(d')的重链；
(e')权利要求4的(e')的轻链和权利要求8的(e')的重链；
(f')权利要求4的(f')的轻链和权利要求8的(f')的重链；
(g')权利要求4的(g')的轻链和权利要求8的(g')的重链；
(h')权利要求4的(h')的轻链和权利要求8的(h')的重链；
(i')权利要求4的(i')的轻链和权利要求8的(i')的重链；
(j')权利要求4的(j')的轻链和权利要求8的(j')的重链；
(k')权利要求4的(k')的轻链和权利要求8的(k')的重链；
(l')权利要求4的(l')的轻链和权利要求8的(l')的重链；
(m')权利要求4的(m')的轻链和权利要求8的(m')的重链；
(n')权利要求4的(n')的轻链和权利要求8的(n')的重链；
(o')权利要求4的(o')的轻链和权利要求8的(o')的重链；
(p')权利要求4的(p')的轻链和权利要求8的(p')的重链；
(q')权利要求4的(q')的轻链和权利要求8的(q')的重链；
(r')权利要求4的(r')的轻链和权利要求8的(r')的重链；和
(s')权利要求4的(s')的轻链和权利要求8的(s')的重链。
12.包含选自以下的轻链可变区和重链可变区的重组抗原结合蛋白：
(a)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:1的互补决定区(CDR) 1、含有SEQ ID NO:2的CDR2和含有SEQ ID NO:3的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:136的CDR1、含有SEQ ID NO:137的CDR2和含有SEQ ID NO:138的CDR3；
(b)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:4的CDR1、含有SEQ ID NO:5的CDR2和含有SEQID NO:6的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:139的CDR1、含有SEQ ID NO:140的CDR2和含有SEQ ID NO:141的CDR3；
(c)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:7的CDR1、含有SEQ ID NO:8的CDR2和含有SEQID NO:9的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:142的CDR1、含有SEQ ID NO:143的CDR2和含有SEQ ID NO:144的CDR3；
(d)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:10的CDR1、含有SEQ ID NO:11的CDR2和含有SEQ ID NO:12的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:145的CDR1、含有SEQ ID NO:146的CDR2和含有SEQ ID NO:147的CDR3；
(e)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:13的CDR1、含有SEQ ID NO:14的CDR2和含有SEQ ID NO:15的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:148的CDR1、含有SEQ ID NO:149的CDR2和含有SEQ ID NO:150的CDR3；
(f)轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:16的CDR1、含有SEQ ID NO:17的CDR2和含有SEQ ID NO:18的CDR3，和重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:151的CDR1、含有SEQ ID NO:152的CDR2和含有SEQ ID NO:153的CDR3；
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其中所述抗原结合蛋白特异性结合巨细胞病毒（CMV）。
13.权利要求12的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
14.权利要求1-2、4-7和9-12中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白选自单克隆抗体、单链抗体、结构域抗体、双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv。
15.权利要求14的抗原结合蛋白，其是单克隆抗体。
16.权利要求15的抗原结合蛋白，其是人源化的单克隆抗体。
17.单克隆抗体，其在交叉阻断测定中交叉阻断权利要求11或12的抗原结合蛋白与CMV的结合。
18.结合巨细胞病毒(CMV)的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合与权利要求11或12的抗原结合蛋白结合的CMV表位相同或重叠的CMV表位。
19.重组核酸，其编码权利要求1-2、4-7或9-12中任一项的抗原结合蛋白。
20.表达载体，其包含权利要求19的重组核酸。
21.宿主细胞，其包含权利要求20的表达载体。
22.药物组合物，其包含权利要求1-2、4-7或9-12中任一项的抗原结合蛋白或权利要求3、8或13中任一项的人源化抗体以及药学上可接受的载体或稀释剂。
23.在主体中治疗CMV感染的方法，其包括向有需要的主体施用有效量的权利要求1-2、4-7或9-12中任一项的抗原结合蛋白或权利要求3、8或13中任一项的人源化抗体。
24.在患者中赋予针对CMV感染的被动免疫的方法，所述方法包括向所述患者施用：
(a) 权利要求1-2、4-7或9-12中任一项的一种或多种抗原结合蛋白；
(b) 权利要求3、8或13中任一项的一种或多种人源化抗体；或
(c) (a)和(b)的组合。
25.权利要求24的方法，其中所述一种或多种抗原结合蛋白是单克隆抗体。
26.产生权利要求1-2、4-7或9-12中任一项的抗原结合蛋白的方法，其包括：
a. 在培养基中在其中表达核酸序列的条件下培养权利要求21的宿主细胞，由此产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；和
b. 从所述宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160511 |