JP2016520318A - Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場 - Google Patents

Abstract

本発明は、ゲノム標的化のためのCRISPR-Casシステムの分野の発明である。本発明は、新規の操作されたCas9足場およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ゲノム標的化のための方法、細胞工学および治療における応用に関する。本発明は、本発明の新規のCas9足場が用いられている、ベクター、組成物、およびキットにも関する。

Description

発明の分野
本発明は、ゲノム標的化のためのCRISPR-Casシステムの分野の発明である。本発明は、新規の操作されたCas9足場およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ゲノム標的化のための方法、細胞工学および治療における応用に関する。本発明は、本発明の新規のCas9足場が用いられている、ベクター、組成物、およびキットにも関する。

発明の背景
部位特異的ヌクレアーゼは、複雑なゲノム内のDNA配列を特異的かつ効率的に標的化および修飾するための強力な試薬である。部位特異的ヌクレアーゼによるゲノム工学の応用は数多く存在し、基礎研究から生物工業的応用およびヒト治療法にまで及ぶ。この目的のためにDNA結合タンパク質を再操作することは、天然に存在するLADLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ（LHE）、人工亜鉛フィンガータンパク質（ZFP）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALE-ヌクレアーゼ）などのタンパク質のデザインおよび作出に主に限定されてきた。

最近、原核生物のII型CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）獲得免疫系に由来する、RNA誘導型のCas9ヌクレアーゼ（Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012）に基づく新規のゲノム工学ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）システムは、細菌において最初に発見されたものであり、ウイルスまたはプラスミドのいずれかの外来DNAに対する防御として機能する。これまでに、3つの異なる細菌CRISPRシステムが特定され、I型、II型、およびIII型と呼ばれている。II型システムは、利用可能な現行のゲノム工学技術の基礎であり、単にCRISPRと呼ばれることが多い。II型CRISPR/Cas遺伝子座は、タンパク質Cas9、Cas1、Cas2、および/またはCsn2をコードする遺伝子のオペロン、リーダー配列とその後ろの複数の同一のリピートと当該リピート間に挿入されている特有のゲノム標的化スペーサーとからなるCRISPRアレイ、ならびにtrans-activating tracrRNAをコードする配列から構成される。

CRISPRを介する獲得免疫は、3つの異なる段階: 外来DNAの獲得、CRISPR RNA（crRNA）生合成、および標的の干渉で進行する（総説（Sorek, Lawrence et al. 2013）を参照のこと）。まず第一に、CRISPR/Cas機構は、CRISPR遺伝子座への組み込みのための特異的配列を標的化するものと思われる。組み込みのために選択された外来DNAにおける配列は、スペーサーと呼ばれ、これらの配列には多くの場合、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフが隣接している。II型システムにおけるcrRNA生合成は、trans-activating crRNA（tracrRNA）を要するという点で独特である。CRISPR遺伝子座は、初めは、リーダー中のプロモーター配列から長いcrRNA前駆体（プレcrRNA）として転写される。Cas9は分子アンカーとして作用し、後の宿主RNase IIIによるプレcrRNAリピートの認識と切断のために、tracrRNAとプレcrRNAとの塩基対形成を促進する（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）。プロセッシング事象の後、tracrRNAは、crRNAと対形成したままであり、Cas9タンパク質に結合したままである。この三者複合体において、tracrRNA:crRNA二本鎖構造体は、エンドヌクレアーゼCas9を同種の標的DNAへと誘導するガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的DNA中のプロトスペーサー配列と、crRNA中のスペーサー由来配列との間の相同性について侵入性DNA分子をスキャンすることによって開始される。DNAプロトスペーサー・crRNAスペーサー相補性に加えて、DNA標的化には、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ：PAM）の存在が必要になる。二本鎖RNAとプロトスペーサー配列との間の対形成の後、Cas9はその後、PAMモチーフの3塩基上流に平滑な二本鎖切断を導入する（Garneau, Dupuis et al. 2010）。

Cas9は、12〜20ヌクレオチドの任意の潜在標的および現在は2つのヌクレオチドに限定されている特異的PAMモチーフ（NGG;（Mali, Yang et al. 2013））を認識できる大きなエンドヌクレアーゼである。潜在標的は、統計的基礎に基づき原核生物ゲノムにおける特有の切断部位を確実とするのに十分であるが、しかし潜在標的配列が何度も見出されうる、真核細胞の場合のような、さらに大きなゲノムの場合には危険である。それゆえ、II型CRISPRシステムを用いる場合の特異性の改善および潜在的オフサイトの低減のための戦略を開発する必要がある。さらに、大きなサイズの天然Cas9（アミノ酸1200超）は、ゲノム工学CRISPRシステムのための遺伝子送達において不都合である。

本発明者らは、細胞へのCas9の遺伝子送達を改善するために、（D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A）（SEQ ID NO: 1）によって規定されるRuvCモチーフおよび/または（Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S）（SEQ ID NO: 2）によって規定されるHNHモチーフ（Xが20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表し、[I/L]がイソロイシンまたはロイシンを表す）を含む新規のCas9足場をデザインした。これらのコンパクトな足場は、ゲノムデータベースにおける上記の推定上のモチーフの存在を探索すること、および別個のORF上に存在するものを特定することにより得られた。本発明者らは、そのようなモチーフが別個のサブユニットタンパク質で見出されるなら、より短いタンパク質を特定し、ともに融合させて、より短い機能的融合タンパク質を得ることができるものと推測した。

本発明者らは、この戦略を進めることにより、RuvCおよびHNHドメインの境界を決定することを可能にし、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）に由来する新規の短いCas9またはその相同体をデザインすることを可能にした。それらのCas9相同体分析はさらに、ガイドRNAおよびPAMモチーフの結合に関与するこれまでに特徴付けられていないCas9残基の特定を可能にした。本発明者らは、これらのドメインを操作することにより、II型CRISPRシステムによって特異的に認識される標的ヌクレオチドの数を増加させて、オフサイトターゲットを回避する。

発明の概要
本発明は、互いに組み合わされて、よりコンパクトでありかつ/またはより特異的な組換えCas9足場（すなわち、アミノ酸1100個未満の人工融合タンパク質）を生じる新規のRuvC配列モチーフおよびHNH配列モチーフを提供する。Cas9タンパク質は、標的核酸配列をガイドRNAとともにまたはガイドRNAと別個にプロセッシングしうる2つの別個のスプリットCas9 RuvCおよびHNHドメインに分けることができる。これらの足場は遺伝子標的化のための方法において、特に遺伝子編集のための特異的ヌクレアーゼとして用いられる。これらの新規の足場をコードする発現ベクター、およびこれらのベクターで形質転換され操作された細胞も、本発明の主題である。

表の簡単な説明
（表１）Cas9相同体のRuvCドメインの多重配列アライメント。
（表２）化膿性連鎖球菌のCas9のRuvCドメインの二次構造予測およびRuvCドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 12）。
（表３）Cas9相同体のHNHドメインの多重配列アライメント。
（表４）化膿性連鎖球菌のCas9のHNHドメインの二次構造予測および関連するHNHドメイン配列（SEQ ID NO: 23）。
（表５）より短いCas9相同体の多重配列アライメント。
（表６）Cas9のより短いバージョンの二次構造予測および関連するより短い化膿性連鎖球菌のCas9配列。
（表７）化膿性連鎖球菌のCas9のDNA/RNA結合領域のリスト。
（表８）化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 61）およびサーモフィラス菌（S. thermophilus）のCas9（SEQ ID NO: 64）ならびに大腸菌（E.coli）およびサーモフィラス菌のRuvCドメインの2つのpdb構造の配列（SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 63）の間の多重配列アライメント。
（表９）8つの選択配列ならびに化膿性連鎖球菌の野生型Cas9およびサーモフィラス菌のCas9および4EP4 pdbcodeの多重配列アライメント。G247の位置は、黒矢印で印が付けられている。
（表１０）PSIPREDを用いた化膿性連鎖球菌の野生型Cas9配列の二次構造エレメント予測。当該配列は2つのスプリットドメイン: N末端ドメインおよびC末端ドメインに分けられている。当該C末端ドメインの配列中のバリンに変異したロイシン248は、太字で印が付けられている。

化膿性連鎖球菌のCas9のオリジナル配列および提案されたトランケーション体Y943、Y980、G1055。 化膿性連鎖球菌の配列の3Dモデルにおいてマッピングされた15箇所のDNA/RNA結合領域。 化膿性連鎖球菌の配列の3Dモデルにおいてマッピングされた15箇所のDNA/RNA結合領域。 トランスフェクション後4日目および7日目にフローサイトメトリー（Macsquant）によりGFPの低減として測定されたスプリットCas9ドメインのヌクレアーゼ活性。値は、各単一のスプリットドメインについて、または同時にトランスフェクションされた2つのスプリットドメインについて報告されている。 EndoT7アッセイ法を用いて試験されたGFP標的に対するスプリットCas9ドメインのヌクレアーゼ活性。 EndoT7アッセイ法を用いて試験されたCD52標的遺伝子に対するスプリットCas9ドメインのヌクレアーゼ活性。

発明の開示
本明細書において具体的に定義されない限り、用いられる全ての技術的および科学的用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、分子生物学および免疫学の分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書において記述されているものと類似または同等の全ての方法および材料を、本明細書において記述されている適当な方法および材料とともに、本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、特別の定めのない限り、限定することを意図するものではない。

本発明の実施では、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を利用するであろう。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition,（Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）; Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait ed., 1984）; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization（B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984）; Transcription And Translation（B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）; Culture Of Animal Cells（R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）; Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press, 1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）; the series, Methods In ENZYMOLOGY（J. Abelson and M. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc., New York）、特に154巻および155巻（Wu et al. eds.）ならびに185巻, 「Gene Expression Technology」（D. Goeddel, ed.）; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987）; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986）; ならびにManipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）を参照されたい。

新規Cas9変異体
Csn1（COG3513）とも名付けられているCas9は、crRNA生合成および侵入性DNAの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Cas9は、サーモフィラス菌（Sapranauskas NAR 2011）、リステリア菌（listeria innocua）（jinek Science 2012）および化膿性連鎖球菌（Deltcheva, Chylinski et al. 2011）などのさまざまな細菌種において記述されている。大きなCas9タンパク質（アミノ酸1200個超）は、予測される2つのヌクレアーゼドメイン、すなわち当該タンパク質の中央に位置するHNH（McrA様）ヌクレアーゼドメインと、分割されたRuvC様ヌクレアーゼドメイン（RNase Hフォールド）とを含む（Haft, Selengut et al. 2005; Makarova, Grishin et al. 2006）。RNAse HフォールドへのHNHヌクレアーゼドメインの挿入から、2つのヌクレアーゼ活性が密接に関係していることが示唆される。最近になって、HNHドメインは標的二本鎖DNAの一方の鎖のニッキングに関与しており、RuvC様RNase Hフォールドドメインは二本鎖DNA標的の他方の鎖の切断に関わっていることが実証された（Jinek, Chylinski et al. 2012）。ともに、これらの2つのドメインは各々、PAMのすぐ近くにおいてプロトスペーサー内の標的DNA鎖にニックを入れ、これによって侵入DNAの平滑切断をもたらす（Jinek, Chylinski et al. 2012）。本発明によれば、コンパクトなCas9変異体は、RuvCドメインおよびHNHドメインをコードする、1100個未満、好ましくは1000個未満、より好ましくは900個未満のアミノ酸、さらにより好ましくは800個未満のアミノ酸を含む、エンドヌクレアーゼである。

「Cas9変異体」とは、Cas9の操作エンドヌクレアーゼまたは相同体を意味し、これは、Cas9を核酸標的へと誘導するガイドRNAとして作用するcrRNA:tracrRNA二本鎖（または一本鎖ガイドRNA）と結合することができる。特定の態様において、Cas9変異体は、二本鎖切断または一本鎖切断のいずれかに対応しうる標的核酸配列中の切断を導入することができる。Cas9変異体は、自然界において天然には存在せず遺伝子操作またはランダム変異導入法により得られるCas9エンドヌクレアーゼであることができる。本発明によるCas9変異体は、例えば、化膿性連鎖球菌のCas9エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 3）中の少なくとも1つの残基の変異、すなわち欠失または挿入または置換により得ることができる。本発明の構成局面において、そのようなCas9変異体は機能的なままであり、すなわちそれらはcrRNA:tracrRNA二本鎖（または一本鎖ガイドRNA）に結合する能力を持ち続ける。Cas9変異体は、化膿性連鎖球菌のCas9のアミノ酸配列（SEQ ID NO: 3）内に少なくとも1つの残基の欠失または挿入または置換を含みうる、化膿性連鎖球菌のCas9の相同体であることもできる。最終的なコンストラクトが所望の活性、特にcrRNa:tracrRNA二本鎖（もしくは一本鎖ガイドRNA）または標的核酸配列と結合する能力を保有するという条件で、最終的なコンストラクトに到達するように欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせがなされてもよい。

RuvC/RNaseHモチーフは、RNAに対してもDNAに対しても作用する、広範囲の核酸分解機能を示すタンパク質（RNaseH、RuvC、DNAトランスポザーゼおよびレトロウイルスインテグラーゼならびにアオイガイ（Argonaut）タンパク質のPIWIドメイン）を含む。本発明において、Cas9タンパク質のRuvC触媒ドメインは、以下の配列モチーフによって特徴付けられることができる: D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表し、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンを表す（SEQ ID NO: 1）。換言すると、本発明は、少なくともD-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A配列を含むCas9変異体に関し、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表し、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンを表す（SEQ ID NO: 1）。

上記のRuvCモチーフの特徴付けによって、異なるCas9 RuvCドメイン相同体を抽出することが可能になる。より小さなRuvC相同体ドメイン（SEQ ID NO: 5〜SEQ ID NO: 12、およびSEQ ID NO: 51）と化膿性連鎖球菌のCas9との比較によって、化膿性連鎖球菌のCas9におけるruvCドメイン（SEQ ID NO: 4）の境界を決定することが可能になる。したがって、特定の態様において、Cas9変異体は、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 51からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むRuvCドメインを含む。Cas9相同体の多重配列アライメントから、化膿性連鎖球菌のCas9配列を分けるのに最適な位置（G247）を決定することが可能となる。したがって、RuvCドメインは、1位から247位までの残基を含むアミノ酸配列（SEQ ID NO: 52）またはCLUSTALW法を用いてCasファミリーメンバーの複数の相同体についてアライメントされた部位に対応しうる。

HNHモチーフは、コリシン、制限酵素およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む、二本鎖DNAに作用する多くのヌクレアーゼに特有である。ドメインHNH（SMART ID: SM00507, SCOP命名法:HNHファミリー）は、種々の結合機能および切断機能を行う様々なDNA結合タンパク質と関連している（Gorbalenya 1994; Shub, Goodrich-Blair et al. 1994）。これらのタンパク質のいくつかは、機能が明確に定義されていない仮定上または推定上のタンパク質である。機能が知られているものは、細菌毒性、I群・II群イントロンおよびインテインにおけるホーミング機能、組換え、発生的に制御されたDNA再構成、ファージパッケージング、ならびに制限エンドヌクレアーゼ活性を含む、様々な細胞プロセスに関与している（Dalgaard, Klar et al. 1997）。これらのタンパク質は、ウイルス、古細菌、真正細菌および真核生物において見出される。興味深いことに、LAGLI-DADGおよびGIY-YIGモチーフと同様、HNHモチーフは、インテイン、I群およびII群イントロンのような自己増殖エレメントのエンドヌクレアーゼドメインと関連していることが多い（Gorbalenya 1994; Dalgaard, Klar et al. 1997）。HNHドメインは、保存されたHis（アミノ末端）およびHis/Asp/Glu（カルボキシ末端）残基がある程度の距離で隣接している保存されたAsp/His残基の存在によって特徴付けることができる。これらのタンパク質の相当な数のものがまた、中央のAsp/His残基の両側にCX2Cモチーフを持ちうる。構造的に、HNHモチーフは、αヘリックスが両側に隣接しているねじれたβ鎖の中央のヘアピンとして現れる（Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999）。本発明において、HNHモチーフは以下の配列モチーフによって特徴付けることができる: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表す（SEQ ID NO: 2）。本発明は、少なくともY-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S配列を含むCas9変異体に関し、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表す（SEQ ID NO: 2）。

HNHドメインの最小領域および本研究において特徴付けられた種々のHNHドメイン相同体を用いて、Cas9変異体を遺伝子操作により作成することができる。したがって、本発明は、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 22より選択されるアミノ酸配列を含むHNHドメインを含むCas9変異体に関する。Cas9相同体の多重配列アライメントから、化膿性連鎖球菌のCas9配列を分けるのに最適な位置（G247）を決定することが可能となる。したがって、HNHドメインは、248位から1368位までの残基を含むアミノ酸配列（SEQ ID NO: 53）またはCLUSTALW法を用いてCasファミリーメンバーの複数の相同体についてアライメントされた部位に対応しうる。

化膿性連鎖球菌のCas9および相同体メンバーのアライメントは、Cas9のC末端領域が不必要であることを示唆している。したがって、Cas9のC末端ドメインは、HNHモチーフY-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sの後ろで、好ましくはHNHモチーフの後ろ1〜1000アミノ酸残基で、より好ましくはHNHモチーフの後ろ1〜500アミノ酸、より好ましくは後ろ1〜250アミノ酸でトランケーションされる。より具体的には、Cas9変異体は、SEQ ID NO: 23〜25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むHNHドメインを含む。

本発明者らは、別の手法において、より短い配列を有する4つの天然Cas9相同体を特定し、化膿性連鎖球菌のCas9のより短いバージョンを確定した。したがって、本発明は、SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むCas9にも関する。

特定の態様において、本発明のCas9は、Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S配列およびD-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A配列を含み、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表す。より具体的には、Cas9は、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12およびSEQ ID NO: 51からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むRuvCドメイン、ならびにSEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むHNHドメインを含む。

さらに特定の態様において、上記のRuvCドメインおよびHNHドメインは、あるペプチドドメインによって分離されている。このペプチドドメインは、非限定的な例として、非特異的リンカー（（GS）n）および小さなドメイン（すなわち免疫グロブリンドメイン、TPR、プミリオ（pumilo）、RRMフォールド）であることができる。特定の態様において、当該ペプチドドメインは、SEQ ID NO: 49およびSEQ ID NO: 50からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明者らは、RuvCおよびHNHドメインの上記の特徴付けから、Cas9タンパク質を操作してスプリットCas9タンパク質を作出することを促された。Cas9タンパク質を、2つの別個のRuvCおよびHNHドメインに分けた。驚いたことに、本発明者らは、これらの2つのスプリットCas9がともにまたは別々に核酸標的をプロセッシングしうることを明らかにした（実施例4参照）。この所見から、スプリットCas9タンパク質を用いて新規のCas9システムを開発することが可能となる。上記の各Cas9ドメインを、別々に調製および使用することができる。したがって、このスプリットシステムは、ベクター化のためのいくつかの利点を呈し、Cas9全体よりも短いタンパク質の送達、タンパク質精製、および特にPAM認識、DNA結合に関与する領域を操作するための、タンパク質操作を可能にする。

本明細書において、「スプリットCas9」とは、短縮型またはトランケーション型のCas9タンパク質またはCas9変異体を意味し、これは、RuvCドメインまたはHNHドメインのどちらかを含むが、しかしこれらのドメインの両方は含まない。そのような「スプリットCas9」は、独立にガイドRNAと共に用いることができ、または補完的なやり方で、例えば一方のスプリットCas9がRuvCドメインを提供し、もう一方がHNHドメインを提供するように用いることができる。RuvCおよび/またはNHNドメインのどちらかを有する異なるスプリットCas9がともに用いられてもよい。スプリットCas9は、好ましくは1000アミノ酸長未満、より好ましくは800アミノ酸長未満、さらにより好ましくは500アミノ酸長未満である。

RuvCドメインは概して、少なくともアミノ酸配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aを含み、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表し、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンを表す（SEQ ID NO: 1）。HNHドメインは概して、少なくともアミノ酸配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S配列を含み、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つを表す（SEQ ID NO: 2）。

好ましい態様において、スプリットcas9タンパク質は、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12ならびにSEQ ID NO: 51および53からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むRuvCドメイン、ならびに、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25および52からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むHNHドメインを含み、好ましくは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 52を含むRuvCドメインおよびアミノ酸配列SEQ ID NO: 53を含むHNHドメインを含む。好ましい態様において、HNHドメインは、より良好なコザックコンセンサス配列を有するように、SEQ ID NO: 53における最初のアミノ酸ロイシンがバリンに変異した配列を含む。

各Cas9スプリットドメインは、異なるCas9相同体に由来してもよく、または同じCas9に由来してもよい。各スプリットドメインは、N末端および/またはC末端において少なくとも1つの活性ドメインに融合されてもよく、前記活性ドメインは、ヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、転写活性化因子（例えばVP64、VP16）、転写阻害因子（例えば; KRAB）、DNA末端プロセッシング酵素（例えばTrex2、Tdt）、レポーター分子（例えば蛍光タンパク質、LacZ、ルシフェラーゼ）からなる群より選択することができる。

特定の態様において、蛍光分子エネルギードナーの発光スペクトルがエネルギーアクセプターの吸収スペクトルと重なり合うように、スプリットドメインをエネルギーアクセプターに融合させ、補完的なスプリットドメインをエネルギードナーに融合させることができる。スプリットCas9ドメインがともにDNAと結合し、かつエネルギードナーおよびアクセプターが互いに接近すると、励起状態にあるドナーからのエネルギーがアクセプターに移されるときにFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）が起こり、ドナー発光の強度が低減される。

別の特定の態様において、Cas9スプリットドメインは、結果的に生じるタンパク質を不活性化できるリンカーによって分離されている。スプリットドメインの立体配座構造を変化させる特異的小分子を加えることで、その活性が誘導される。別の特定の態様において、リンカーはプロテアーゼ切断部位（例えばHIV1プロテアーゼ切断部位）を含むことができる。特異的プロテアーゼの存在下において、リンカーが切断され、結果的に生じる単離されたRuvCドメインおよびHNHドメインが標的核酸と結合することができる。したがって、ともに連結されたRuvCドメインおよびHNHドメインを用いることは、所望の時点でCas9活性化を誘導するのに特に適している。

本発明の別の局面において、本発明者らは、Cas9特異性を調節するために、PAMモチーフおよびcrRNAの結合に関与する残基を特定した。したがって、本発明は、化膿性連鎖球菌のCas9の核酸結合領域において、好ましくはSEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなる群より選択されるアミノ酸配列において少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、Cas9変異体またはスプリットCas9ドメインを包含する。

本発明において特定されたCas9相同体ドメインは、操作されていてもよい。Cas9相同体のDNA/RNA結合領域は、実施例1および2の多重アライメント配列（表1、3および5における灰色で強調された配列）によって決定することができる。したがって、本発明は、上記の核酸結合領域において少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、Cas9変異体またはスプリットCas9ドメインに関する。当該スプリットCas9ドメインは、本発明による異なるCas9相同体または変異体に由来することができる。

特定の局面において、このCas9変異体は、20種の天然アミノ酸のいずれか1つの組み合わせを含む、より小さなまたはより大きなPAMモチーフ（非天然PAMモチーフ）と結合することができる。好ましくは、本発明によるCas9変異体またはスプリットCas9ドメインは、少なくとも3つ、好ましくは4つ、より好ましくは5つのヌクレオチドを含むPAMモチーフを特異的に認識することができる。crRNA（またはガイドRNA）の非存在下でゲノムDNA内のPAMモチーフと結合するCas9の能力は、Cas9が細胞内で過剰発現される場合に毒性作用を呈しうる。したがって、本発明者らは、この潜在的な毒性作用を回避するために、PAMモチーフと結合できないCas9変異体またはスプリットCas9ドメインを設計しようと努めた。本発明によるCas9変異体またはスプリットCas9ドメインは、PAM結合領域において、好ましくはSEQ ID NO: 3の残基T38からE57までのおよび/もしくはT146からL169までの領域において、またはCLUSTALW法を用いてCasファミリーメンバーの複数の相同体についてアライメントされた部位において、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。

別の局面において、Cas9変異体またはスプリットCas9ドメインは、標的核酸配列上でのガイドRNAのより小さなまたはより大きな相補的配列の結合を誘導することもできる。

これらのポリペプチドが由来するゲノムデータからはいくらかのバラツキが生じうるので、活性を大幅に消失させずに、これらのポリペプチドに存在するアミノ酸のいくつかを置換する可能性（機能的変異体）を考慮に入れるためにも、本発明は、本特許出願において提供される配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%およびさらにより好ましくは少なくとも95%の同一性を共有する上記のポリペプチドのポリペプチド変異体を包含する。したがって、本発明は、SEQ ID NO: 3〜SEQ ID NO: 53からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%または99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドに関する。

最近になって、HNHドメインは標的二本鎖DNAの一方の鎖のニッキングに関与しており、RuvC様RNase Hフォールドドメインは二本鎖DNA標的のもう一方の鎖の切断に関わっていることが実証された（Jinek, Chylinski et al. 2012）。ともに、これらの2つのドメインは各々、PAMのすぐ近くのプロトスペーサー内の標的DNA鎖にニックを入れ、これによって侵入DNAの平滑切断をもたらす（Jinek, Chylinski et al. 2012）。特定の態様において、Cas9変異体は1つのニッカーゼ活性を欠く。具体的には、Cas9変異体またはスプリットCas9は、HNHまたはRuvC様ドメインのいずれかの触媒残基において不活性化変異を含む。この結果として生じるCas9またはスプリットCas9は、ニッカーゼとして機能すること、および標的核酸配列における一本鎖切断を誘導することが知られている。非限定的な例として、Cas9タンパク質またはスプリットCas9ドメインの触媒残基は、SEQ ID NO: 3のD10、D31、H840、H868、N882およびN891、またはCLUSTALW法を用いてCasファミリーメンバーの複数の相同体についてアライメントされた部位であることができる。HNHまたはRuvCモチーフに含まれる残基は、上記の段落において記述されているものであることができる。これらの残基のいずれか1つを任意の他のアミノ酸によって、好ましくはアラニン残基によって置き換えることができる。触媒残基における変異は、cas9の触媒ドメインの少なくとも1つの不活性化を誘導する、別のアミノ酸による置換、またはアミノ酸の欠失もしくは付加のいずれかを意味する（Sapranauskas, Gasiunas et al. 2011; Jinek, Chylinski et al. 2012）。特定の態様において、Cas9変異体はRuvCおよびHNH触媒ドメインの2つのうち1つのみを含む。特定の態様において、単離されたRuvCおよび/またはHNHドメインは、上記の触媒残基において不活性化変異を含むことができる。

本発明の別の局面において、Cas9はエンドヌクレアーゼ活性を欠く。結果的に生じるCas9は、標的核酸配列と相補的な配列を含むようにデザインされたガイドRNAと同時に発現される。エンドヌクレアーゼ活性を欠くCas9の発現は、関心対象の遺伝子の特異的サイレンシングをもたらす。このシステムは、CRISPR干渉（CRISPRi）と名付けられている（Qi, Larson et al. 2013）。サイレンシングとは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことを意味する。サイレンシングは、転写段階または翻訳段階で起こりうる。本発明によれば、サイレンシングは、転写を直接的に遮断することによって、より具体的には転写伸長を遮断することによってまたは任意のプロモーター内の鍵となるシス作用性モチーフを標的化し、その同種のトランス作用性の転写因子の結合を立体的に遮断することによって起こりうる。エンドヌクレアーゼ活性を欠くCas9は、非機能的なHNHおよびRuvCドメインの両方を含む。具体的には、Cas9ポリペプチドは、RuvC様ドメインおよびHNHドメインの両方の触媒残基において不活性化変異を含む。例えば、Cas9の切断活性に必要な触媒残基は、SEQ ID NO: 3のD10、D31、H840、H865、H868、N882およびN891、またはCLUSTALW法を用いてCasファミリーメンバーの複数の相同体についてアライメントされた部位であることができる。HNHまたはRuvCモチーフに含まれる残基は、上記の段落において記述されているものであることができる。これらの残基のいずれかを他のアミノ酸のいずれか1つによって、好ましくはアラニン残基によって置き換えることができる。触媒残基における変異は、cas9の触媒ドメインの少なくとも1つの不活性化を誘導する、別のアミノ酸による置換、またはアミノ酸の欠失もしくは付加のいずれかを意味する。

本発明は、前述のポリペプチドおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチド、具体的にはDNAまたはRNAにも関係する。これらのポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的にはプラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。

本発明は、Cas9、スプリットCas9ポリヌクレオチド配列を、当該配列が導入される生物のコドン使用頻度に最適化されるように修飾することを企図している。したがって、例えば、化膿性連鎖球菌またはサーモフィラス菌に由来するCas9ポリヌクレオチド配列の、ヒトでの使用のために最適化されたコドンが、（Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）に記載されている。

特定の態様において、本発明によるCas9、スプリットCas9ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの細胞内局在化モチーフを含むことができる。細胞内局在化モチーフは、核、細胞質、原形質膜、小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、ペルオキシソームおよびミトコンドリアの少なくとも1つを含む規定の細胞内位置にタンパク質を輸送するまたは限定することを促進する配列をいう。細胞内局在化モチーフは、当技術分野において周知である。細胞内局在化モチーフは、特定の向き（例えばタンパク質のN末端側および/またはC末端側）であることが必要である。非限定的な例として、サルウイルス40大型T抗原の核局在化シグナル（NLS）は、N末端および/またはC末端に向けられうる。NLSは、核膜孔複合体を通じてタンパク質を細胞核へ標的化するように、かつ新たに合成されたタンパク質を核へ、サイトゾル核輸送受容体によるその認識を介して方向付けるように作用するアミノ酸配列である。典型的には、NLSは、リジンまたはアルギニンなどの正電荷アミノ酸の1つまたは複数の短い配列からなる。

特定の態様において、本発明によるCas9変異体またはスプリットCas9をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの制御下に配置される。適当なプロモーターは、組織特異的および/または誘導性プロモーターを含む。組織特異的プロモーターは、組織依存的におよび細胞の発生段階にしたがって遺伝子発現を制御する。これらのタイプのプロモーターによって駆動される導入遺伝子は、導入遺伝子産物が望まれる組織においてのみ発現され、残りの組織における導入遺伝子発現による修飾はないままとされよう。組織特異的プロモーターは内因性または外因性因子によって誘導されることができ、したがってそれらを誘導性プロモーターと分類することもできる。誘導性プロモーターは、それがある特定の（典型的には外的な）刺激に曝露された場合にだけ転写を開始するプロモーターである。本発明に特に好ましいのは、以下である: 光調節プロモーター、硝酸レダクターゼプロモーター、重金属レベルの増加によって誘導される真核生物メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド（IPTG）に応答して誘導される原核生物lacZプロモーター、ステロイド応答性プロモーター、テトラサイクリン依存性プロモーターおよび温度の上昇によって誘導される真核生物熱ショックプロモーター。

ゲノム標的化の方法
別の局面において、本発明は、標的核酸切断から標的遺伝子制御に及ぶさまざまな応用のための本発明によるポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの使用のための方法に関する。ゲノム操作実験において、本特許出願において言及されているCas9/CRISPRシステムの効率、例えばある遺伝子座の位置で所望の事象（相同遺伝子標的化、標的突然変異誘発、配列除去または切除）を誘導するその能力は、ヌクレアーゼの特異的活性、おそらく標的の接近可能性、ならびに所望の事象を引き起こす修復経路（遺伝子標的化のための相同修復、標的突然変異誘発のためのNHEJ経路）の効力および結果を含むいくつかのパラメータに依存する。

本発明は、上記のcas9を用いる遺伝子標的化のための方法に関する。本発明は、以下の段階の1つまたはいくつかを含む方法に関する:
（a）細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
（b）標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
（c）該細胞においてCas9が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9を該細胞内に導入する段階。

特定の態様において、当該方法は、
（a）細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
（b）標的核酸配列と相補的な配列を含むcrRNAを提供する段階;
（c）該crRNAの一部分と相補的な配列を含むTracrRNAおよび上記のCas9を提供する段階;
（d）該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNA、および該Cas9を該細胞内に導入する段階
を含む。

別の特定の態様において、前記方法は、
（a）細胞における、PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
（b）標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
（c）上記の少なくとも1つのスプリットCas9ドメインを提供する段階;
（d）該細胞において該スプリットCas9ドメインが該標的核酸配列をプロセッシングするように、該スプリットCas9ドメインを該細胞内に導入する段階
を含む。

前記Cas9スプリットドメイン（RuvCおよびHNHドメイン）は、当該スプリットCas9ドメインが標的核酸配列をプロセッシングするように同時にまたは逐次的に細胞内に導入されることができる。Cas9スプリットシステムは、誘導性のゲノム標的化法に特に適している。好ましい態様において、細胞内でのCas9過剰発現の潜在的毒性作用を回避するため、非機能的なスプリットCas9ドメインが、好ましくは該スプリットドメインをコードする導入遺伝子で前記細胞を安定的に形質転換させることにより、細胞内に導入される。その後、Cas9の相補的なスプリット部分が、所望の時点で機能的Cas9タンパク質が再構成されるように2つのスプリット部分が細胞内で新たに組み合わせられるように、細胞内に導入される。当該スプリットCas9は、同じCas9タンパク質に由来してもよく、または異なるCas9変異体、特に上記のRuvCドメインおよびHNHドメインに由来してもよい。

別の特定の態様において、スプリットcas9タンパク質を用いる遺伝子標的化の方法は、2つのスプリットCas9タンパク質間の界面に結合する抗体または小分子を添加する段階であって、それに伴って、機能的Cas9タンパク質が再構成されるようにスプリットCas9が新たに組み合わせられることが防止される、段階をさらに含むことができる。Cas9の活性化を誘導するためには、抗体または小分子が洗浄段階によって除去されなければならない。

本発明の別の局面においては、1つのスプリットCas9ドメインのみが細胞内に導入される。実のところ、驚いたことに、本発明者らは、上記のRuvCモチーフを含むスプリットCas9ドメインが、HNHモチーフを含むスプリットドメインとは無関係に標的核酸配列を切断できることを明らかにした。ガイドRNAは、標的核酸配列に結合するためにHNHドメインの存在を必要とせず、RuvCスプリットドメインと結合するのに十分に安定である。

好ましい態様において、前記スプリットCas9ドメインのみで前記標的核酸配列にニックを入れることができる。

このCas9スプリットシステムは、誘導性のゲノム標的化法に特に適している。好ましい態様において、細胞内でのCas9過剰発現の潜在的毒性作用を回避するために、HNHスプリットCas9ドメインが、好ましくは前記スプリットドメインをコードする導入遺伝子で前記細胞を安定的に形質転換させることにより、細胞内に導入されうる。その後、Cas9の相補的スプリット部分（RuvCドメイン）が、所望の時点で機能的Cas9タンパク質が再構成されるように2つのスプリット部分が細胞内で新たに組み合わせられるように、細胞内に導入される。

本明細書において用いられる「プロセッシング」という用語は、Cas9の結合のみによって配列が修飾されることを意味する。用いるCas9に依って異なるプロセッシング事象を標的核酸配列内で誘導することができる。非限定的な例として、Cas9は、切断、ニッカーゼ事象を誘導してもよく、または関心対象の遺伝子の特異的サイレンシングをもたらしてもよい。本発明の方法によって任意の標的核酸配列がプロセッシングされうる。標的核酸配列（またはDNA標的）は、染色体内、エピソーム内、オルガネラゲノム（例えばミトコンドリアゲノムもしくは葉緑体ゲノム）内、または遺伝物質の本体とは独立して存在できる遺伝物質（例えば、感染ウイルスゲノム、プラスミド、エピソーム、トランスポゾンなど）内に存在することができる。標的核酸配列は、遺伝子のコード配列内、転写された非コード配列（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンなど）内、または非転写配列（コード配列の上流もしくは下流のいずれか）内にあってもよい。標的核酸配列は、当該標的の一本鎖の5'→3'配列によって定義される。

本発明における任意の潜在的な選択標的核酸配列は、その3'末端に、プロトスペーサー隣接モチーフまたはプロトスペーサー関連モチーフ（PAM）と名付けられた、特異的配列を有していてもよい。PAMは、標的核酸配列には存在するが、該配列を標的化するために作られるガイドRNAには存在しない。好ましくは、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）は、リーダー遠位末端におけるプロト・スペーサーの直近または近傍で始まる2〜5ヌクレオチドに相当しうる。PAMの配列および位置は、種々のシステムの間で異なる。PAMモチーフは、非限定的な例として、例えばNNAGAA、NAG、NGG、NGGNG、AWG、CC、CC、CCN、TCN、TTCであることができる（shah SA, RNA biology 2013）。種々のII型システムは、異なるPAM要件を有する。例えば、化膿性連鎖球菌のシステムは、NGG配列（該配列中、Nは任意のヌクレオチドであることができる）を必要とする。サーモフィラス菌のII型システムは、NGGNG（Horvath and Barrangou 2010）およびNNAGAAW（Deveau, Barrangou et al. 2008）を必要とするが、異なる変異体（S. mutant）のシステムは、NGGまたはNAARを許容する（van der Ploeg 2009）。PAMは、プロトスペーサーに隣接する領域に限られるのではなく、プロトスペーサーの一部であってもよい（Mojica, Diez-Villasenor et al. 2009）。特定の態様において、Cas9タンパク質は、非天然PAMモチーフを認識するように操作されていてもよい。この場合、選択された標的配列は、アミノ酸の任意の組み合わせを有するより小さなまたはより大きなPAMモチーフを含みうる。好ましい態様において、選択された標的配列は、本発明によるCas9変異体によって認識される、少なくとも3つ、好ましくは4つ、より好ましくは5つのヌクレオチドを含むPAMモチーフを含む。好ましくは、Cas9変異体は、DNA/RNA結合領域において、好ましくはSEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなる群より選択されるアミノ酸配列において、少なくとも1つの変異残基を含み、非天然PAMモチーフを認識する。本発明において、Cas9相同体のアライメントされた領域（表1、3および5参照）を、非天然PAMモチーフを認識するように変異させることもできる。crRNA（またはガイドRNA）の非存在下でゲノムDNA内のPAMモチーフと結合するCas9の能力は、Cas9が細胞内で過剰発現される場合に潜在的な毒性作用を呈しうる。したがって、本発明者らは、この潜在的な毒性作用を回避するために、PAMモチーフと結合できないCas9またはスプリットCas9ドメインを設計しようと努めた。本発明によるCas9変異体またはスプリットCas9ドメインは、PAM結合を回避するために、PAM結合領域において、好ましくは、SEQ ID NO: 3の残基T38からE57までのおよび/もしくはT146からL169までの領域において、またはCasファミリーメンバーの相同体に対してCLUSTALW法を用いてアライメントされた部位において、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。

本発明の方法は、操作されたガイドRNAを提供する段階を含む。ガイドRNAは、標的核酸配列と相補的な配列を含む核酸に対応する。好ましくは、ガイドRNAは、別々に用いられてもまたはともに融合されていてもよいcrRNAおよびtracrRNAに対応する。天然のII型CRISPRシステムにおいて、CRISPR標的化RNA（crRNA）標的化配列は、プロトスペーサーとして知られるDNA配列から転写される。プロトスペーサーは、細菌ゲノムにおいてCRISPRアレイと呼ばれる群となってクラスタ形成されている。プロトスペーサーは、短い回文型のリピートによって分離されており、かつ将来の遭遇に対する記録のように保持された、既知の外来DNAの短い配列（およそ20 bp）である。crRNAを作出するため、CRISPRアレイが転写され、RNAがプロセッシングされて、リピート間の個々の認識配列が分離される。スペーサーを含むCRISPR遺伝子座が、長いプレcrRNAとして転写される。個々のcrRNAへのCRISPRアレイ転写産物（プレcrRNA）のプロセッシングは、回文型のリピートと相補的な配列を有するtrans-activating crRNA（tracrRNA）の存在に依存する。tracrRNAは、プレcrRNAのスペーサーを分離しているリピート領域とハイブリダイズし、内因性RNase IIIによるdsRNA切断が惹起され、その後にCas9による各スペーサー内での第2の切断事象が生じ、Cas9およびtracrRNAと相互作用したままの成熟crRNAが産生され、Cas9-tracrRNA:crRNA複合体が形成される。tracrRNAを用いることにより操作されたcrRNAは、選択された核酸配列を標的化することが可能であり、一般にcrRNAプロセッシングおよびRNase IIIの必要性をなくす（Jinek, Chylinski et al. 2012）。

本発明において、ガイドRNAは、標的核酸配列を標的化できるように、好ましくは該配列を切断できるように、標的核酸の一部分と相補的な配列を含むように操作される。特定の態様において、ガイドRNAは、標的核酸配列と相補的である5〜50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも12ヌクレオチドの配列を含む。さらに特定の態様において、ガイドRNAは、標的核酸配列と相補的な少なくとも10ヌクレオチド（好ましくは12ヌクレオチド）を含む少なくとも30ヌクレオチドの配列である。

本発明において、Cas9のRNA/DNA結合領域は、より大きなガイドRNA配列の認識を可能とするように操作されることができる。具体的には、Cas9のRNA/DNA結合領域は、標的核酸配列と特異的に結合するヌクレオチドの数が増えるように操作されることができる。特定の態様において、少なくとも12ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも20ヌクレオチドが、標的核酸配列と特異的に結合する。

別の局面において、ガイドRNAは、標的核酸と相補的なより大きな配列を含むように操作されることができる。実際に、本発明者らは、RuvCスプリットCas9ドメインがtracrRNA:crRNA複合体（ガイドRNA）のみを用いて標的核酸配列を切断できることを明らかにした。したがって、ガイドRNAは、HNHスプリットCas9ドメインの非存在下において標的核酸配列と結合することができる。ガイドRNAは、HNHスプリットドメイン結合の安定性効果を有する必要なしにDNA-RNA二本鎖間のアニーリングを増加させるため、より大きな相補的配列、好ましくは20 bp超を含むようにデザインされることができる。したがって、ガイドRNAは、20 bp超の標的核酸配列と相補的な配列を含むことができる。そのようなガイドRNAは、Cas9活性の特異性を増加させることを可能にする。

ガイドRNAは、標的核酸配列に結合するのにHNHドメインの存在を必要とせず、RuvCスプリットドメインに結合するのに十分に安定である。したがって、別の特定の態様において、前記ガイドRNAは、標的核酸配列と相補的な配列を含む核酸配列（好ましくはRNA配列）のみを含み、tracrRNA配列を含まない。当該相補的な配列は、少なくとも10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも20ヌクレオチドを含む。

ガイドRNAは、標的化の効率を改善するように、5'末端の4〜10ヌクレオチドの前に相補的配列を含んでもよい（Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）。好ましい態様において、ガイドRNAの相補的配列の後には、3'末端において、リピート配列または3'伸長配列と名付けられた核酸配列が続く。2つの異なる遺伝子と相補的な異なる領域を有し、両方の遺伝子を標的とする、いくつかのガイドRNAの共発現を、同時に用いることができる。したがって、特定の態様において、ガイドRNAは、異なる標的核酸配列を同時に認識するように操作されることができる。この場合、同じガイドRNAが、異なる標的核酸配列の一部分と相補的な少なくとも2つの異なる配列を含む。好ましい態様において、当該相補的な配列は、リピート配列によって間隔を空けられている。

本発明によるガイドRNAを修飾して、その二次構造安定性および/またはCas9に対するその結合親和性を増加させることもできる。特定の態様において、ガイドRNAは2',3'-環状リン酸エステルを含むことができる。2',3'-環状リン酸エステル末端は、多くの細胞プロセス、すなわちtRNAサイレンシング、いくつかのリボヌクレアーゼによるエンドヌクレアーゼ的切断、RNAリボザイムによる自己切断に関与するようであり、小胞体における折り畳まれていないタンパク質の蓄積および酸化ストレスを含むさまざまな細胞ストレスに応答するようである（Schutz, Hesselberth et al. 2010）。本発明者らは、2',3'-環状リン酸エステルが、ガイドRNAの安定性またはCas9に対する親和性/特異性を増強すると推測した。したがって、本発明は、2',3'-環状リン酸エステルを含む修飾ガイドRNA、および修飾ガイドRNAを用いるCRISPR/casシステム（Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）に基づくゲノム操作のための方法に関する。

ガイドRNAは、Trans-activating CRISPR RNA（TracrRNA）を含んでもよい。本発明によるTracrRNAは、ガイドRNA（gRNA）とも名付けられたtracrRNA:crRNAを形成するようにcrRNAの3'伸長配列の少なくとも一部分と塩基対を形成できるアンチリピート配列によって特徴付けられる。TracrRNAは、crRNAのある領域と相補的な配列を含む。tracrRNA-crRNA複合体を模倣するヘアピンを形成するcrRNAおよびtracrRNAの融合体を含む合成一本鎖ガイドRNA（sgRNA）（Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013）を用いて、Cas9エンドヌクレアーゼを介する標的核酸の切断を誘導することができる。このシステムは、ヒト、ゼブラフィッシュおよび酵母を含む、種々の真核細胞において機能することが明らかにされた。sgRNAは、好ましくはリピート配列によって間隔を空けられた、2つの標的核酸配列の一部分と相補的な2つの異なる配列を含みうる。

本発明の方法は、ガイドRNA、スプリットCas9またはCas9を細胞内に導入する段階を伴う。ガイドRNA、Cas9またはスプリットCas9ドメインは、RNAまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内への導入の結果として、細胞内でインサイチューで合成されてもよい。あるいは、ガイドRNA、スプリットCas9、Cas9 RNAまたはCas9ポリペプチドは、細胞外で産生され、その後に細胞内に導入されることができよう。細菌、植物、真菌および動物にポリヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法およびウイルス媒介性の方法を含む。ポリヌクレオチドは、例えば組換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどにより、細胞内に導入されうる。例えば、一過性形質転換法は、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または粒子衝突を含む。ポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的にはプラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。

本発明によるcas9は、通常は非相同末端結合（NHEJ）によって修復される標的核酸配列における切断事象から生じる遺伝子修飾を誘導することができる。NHEJは、少なくとも2つの異なるプロセスを含む。メカニズムには、残存している2つのDNA末端の直接再ライゲーション（Critchlow and Jackson 1998）またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合（Ma, Kim et al. 2003）による再連結が含まれる。非相同末端結合（NHEJ）による修復は、多くの場合、わずかな挿入または欠失を生じ、特異的な遺伝子ノックアウトの作出に用いられることができる。「切断事象」とは、二本鎖切断または一本鎖切断の事象を意図する。修飾は、遺伝物質の欠失、遺伝物質におけるヌクレオチドの挿入、またはヌクレオチドの欠失および挿入の両方の組み合わせでありうる。

本発明は、宿主細胞内でさらなる触媒ドメインを発現させる段階をさらに含む、標的核酸配列を修飾する方法にも関する。より好ましい態様において、本発明は、さらなる触媒ドメインがDNA末端プロセッシング酵素である、突然変異誘発を増強する方法に関する。DNA末端プロセッシング酵素の非限定的な例としては、5-3'エキソヌクレアーゼ、3-5'エキソヌクレアーゼ、5-3'アルカリエキソヌクレアーゼ、5'フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、および鋳型非依存性DNAポリメラーゼが挙げられる。そのような触媒ドメインの非限定的な例には、hExoI（EXO1_HUMAN）、酵母ExoI（EXO1_YEAST）、大腸菌ExoI、ヒトTREX2、マウスTREX1、ヒトTREX1、ウシTREX1、ラットTREX1、TdT（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ヒトDNA2、酵母DNA2（DNA2_YEAST）からなる群より選択されるタンパク質ドメインまたはタンパク質ドメインの触媒的に活性な誘導体が含まれる。好ましい態様において、さらなる触媒ドメインは3'-5'-エキソヌクレアーゼ活性を有し、より好ましい態様において、さらなる触媒ドメインは、TREXエキソヌクレアーゼ活性、より好ましくはTREX2活性を有する。別の好ましい態様において、触媒ドメインは単鎖TREXポリペプチドによってコードされる。さらなる触媒ドメインは、本発明によるヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質と、任意でペプチドリンカーにより、融合されていてもよい。

エンドヌクレアーゼ的切断は、相同組換え率を刺激することが知られている。それゆえ、別の好ましい態様において、本発明は、標的核酸配列と外因性核酸との間で相同組換えが起こるように、標的核酸配列の一部分に相同な配列を少なくとも含む外因性核酸を細胞に提供する段階をさらに含む、標的核酸配列における相同遺伝子標的化を誘導するための方法に関する。

特定の態様において、外因性核酸は、標的核酸配列の5'側および3'側の領域にそれぞれ相同な第1および第2の部分を含む。これらの態様における外因性核酸は、第1の部分と第2の部分との間に位置する、標的核酸配列の5'側および3'側の領域との相同性を含まない第3の部分を含んでもよい。標的核酸配列の切断後、標的核酸配列と外因性核酸との間で相同組換え事象が誘発される。好ましくは、少なくとも50 bpの、好ましくは100 bp超の、より好ましくは200 bp超の相同な配列がドナー基質内で用いられる。それゆえ、外因性核酸は、好ましくは200 bp〜6000 bp、より好ましくは1000 bp〜2000 bpである。実際に、共有される核酸相同性は、切断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入される核酸配列は、これら2つのアームの間に位置すべきである。

切断事象が起こった標的核酸配列の位置に応じて、そのような外因性核酸は、ある遺伝子をノックアウトするため（例えば該外因性核酸が該遺伝子の読み取り枠内に配置される場合）、または関心対象の新規の配列もしくは遺伝子を導入するために、用いることができる。そのような外因性核酸を用いることによる配列挿入は、既存の標的遺伝子を、該遺伝子の修正もしくは置換（非限定的な例として対立遺伝子交換）により修飾するために、または、標的遺伝子の発現の上方制御もしくは下方制御を、該標的遺伝子の修正もしくは置換（非限定的な例としてプロモーター交換）により実施するために用いることができる。

改変細胞およびキット
本発明による方法で用いるために種々の細胞が適している。細胞は、任意の原核生物または真核生物の生細胞、これらの生物に由来するインビトロ培養用の細胞株、動物または植物由来の初代細胞であることができる。

「初代細胞」とは、集団倍加をほとんど起こしていない、生きている組織（すなわち生検材料）から直接採取され、かつインビトロ増殖用に樹立された細胞を意図しており、それゆえ、腫瘍形成性の継代細胞株または人工不死化細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要な機能的構成要素および特徴をより忠実に代表する。したがって、これらの細胞は言及するインビボ状態にとっていっそう価値あるモデルである。

本発明の構成において、「真核細胞」とは、真菌、植物、藻類もしくは動物の細胞、または下記に列挙する生物に由来しかつインビトロ培養用に樹立された細胞株をいう。より好ましくは、真菌は、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、アクレモニウム属（Acremonium）、トリコデルマ属（Trichoderma）、クリソスポリウム属（Chrysoporium）、モルティエレラ属（Mortierella）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）またはピキア属（Pichia）のものである; より好ましくは、真菌は、アスぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium Chrysogenum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、モルティエレラ・アルピン（Mortierella alpine）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはピキア・シフェリイ（Pichia ciferrii）の種のものである。より好ましくは、植物は、アラビドプシス属（Arabidospis）、タバコ属（Nicotiana）、ナス属（Solanum）、アキノノゲシ属（lactuca）、アブラナ属（Brassica）、イネ属（Oryza）、アスパラガス属（Asparagus）、エンドウ属（Pisum）、ウマゴヤシ属（Medicago）、トウモロコシ属（Zea）、オオムギ属（Hordeum）、ライムギ属（Secale）、コムギ属（Triticum）、トウガラシ属（Capsicum）、キュウリ属（Cucumis）、カボチャ属（Cucurbita）、スイカ属（Citrullis）、ミカン属（Citrus）、モロコシ属（Sorghum）のものである; より好ましくは、植物は、シロイヌナズナ（Arabidospis thaliana）、タバコ（Nicotiana tabaccum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ナス（Solanum melongena）、トマト（Solanum esculentum）、レタス（Lactuca saliva）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ヤセイカンラン（Brassica oleracea）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima）、イネ（Oryza sativa）、アスパラガス（Asparagus officinalis）、エンドウ（Pisum sativum）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、トウモロコシ（zea mays）、オオムギ（Hordeum vulgare）、ライムギ（Secale cereal）、パンコムギ（Triticuma estivum）、デュラムコムギ（Triticum durum）、カプシカム・サティバス（Capsicum sativus）、ペポカボチャ（Cucurbita pepo）、スイカ（Citrullus lanatus）、メロン（Cucumis melo）、ライム（Citrus aurantifolia）、ザボン（Citrus maxima）、シトロン（Citrus medica）、マンダリン（Citrus reticulata）の種のものである。より好ましくは、動物細胞は、ヒト属（Homo）、クマネズミ属（Rattus）、ハツカネズミ属（Mus）、イノシシ属（Sus）、ウシ属（Bos）、ダニオ属（Danio）、イヌ属（Canis）、ネコ属（Felis）、ウマ属（Equus）、タイセイヨウサケ属（Salmo）、タイヘイヨウサケ属（Oncorhynchus）、ヤケイ属（Gallus）、シチメンチョウ属（Meleagris）、ショウジョウバエ属（Drosophila）、カエノラブディティス属（Caenorhabditis）のものである; より好ましくは、動物細胞は、ヒト（Homo sapiens）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ハツカネズミ（Mus musculus）、イノシシ（Sus scrofa）、ウシ（Bos taurus）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、タイリクオオカミ（Canis lupus）、イエネコ（Felis catus）、ウマ（Equus caballus）、タイセイヨウサケ（Salmo salar）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）、シチメンチョウ（Meleagris gallopavo）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）の種のものである。

本発明において、細胞は、好ましくは、植物細胞、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、あるいはこれらの生物に由来するインビトロ培養用の細胞株または生きている組織から直接採取されてインビトロ増殖用に樹立された初代細胞である。非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞; HEK293細胞; Caco2細胞; U2-OS細胞; NIH3T3細胞; NSO細胞; SP2細胞; CHO-S細胞; DG44細胞; K-562細胞, U-937細胞; MRC5細胞; IMR90細胞; Jurkat細胞; HepG2細胞; HeLa細胞; HT-1080細胞; HCT-116細胞; Hu-h7細胞; Huvec細胞; Molt 4細胞からなる群より選択されうる。本発明の範囲において、幹細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞（iPS）も包含される。

これらの全ての細胞株は、本発明の方法により、関心対象の遺伝子またはタンパク質を産生し、発現し、定量し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するように改変されうる; これらのモデルは、研究および生産ならびに非限定的な例として化学、バイオ燃料、治療学および農学などの種々の分野において、関心対象の生物学的に活性な分子をスクリーニングするためにも用いられうる。

本発明の特定の局面は、本発明による方法によって得られた、既述の単離された細胞に関する。典型的には、単離された細胞は、少なくともCas9変異体、または上記のスプリットcas9ドメインを、任意でガイドRNAとともに、含む。結果的に生じる単離された細胞は、修飾された標的核酸配列を含む。結果的に生じる改変細胞を、生物学的生産、動物遺伝子組換え（例えば幹細胞の使用による）、植物遺伝子組換え（例えばプロトプラストの使用による）から細胞治療（例えばT細胞の使用による）に及ぶ多様な応用のための細胞株として用いることができる。本発明の方法は、ゲノムを操作するのに、および細胞、とりわけiPS細胞およびES細胞を再プログラム化するのに有用である。本発明の別の局面は、既述のCas9変異体またはスプリットCas9タンパク質を含む細胞形質転換のためのキットである。このキットは、より具体的には、少なくとも1つのRuvCモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aまたは1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含む、RuvCおよび/またはHNHドメインをコードする1100個以下のアミノ酸を含むCas9変異体またはスプリットCas9タンパク質を含み、当該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つであり、[I/L]はイソロイシンまたはロイシンを表す。キットは、DNA/RNA結合領域において、好ましくはアミノ酸配列SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48において、少なくとも1つの変異残基を含む、Cas9変異体またはスプリットCas9ドメインを含んでもよい。キットは、上記のII型CRISPRシステムの1つまたはいくつかの構成要素、例えば核酸標的と相補的な配列を含むcrRNAまたはガイドRNAおよび少なくとも1つのtracrRNAをさらに含んでもよい。

動物/植物を作出するための方法
Cas9、スプリットCas9タンパク質、ガイドRNAを細胞または胚に導入することにより、動物が作出されうる。具体的には、本発明は、遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階; 本発明によるcas9を導入することによって標的核酸配列内に切断を生じさせる段階; および切断が起こった細胞またはその子孫から動物を作出する段階を含む、動物を作出するための方法に関する。典型的には、当該胚は、受精した1細胞期胚である。ポリヌクレオチドは、胚の核または細胞質へのマイクロインジェクションを含む当技術分野において公知の方法のいずれかにより細胞内に導入されうる。特定の態様において、動物を作出するための方法は、所望の外因性核酸を導入する段階をさらに含む。当該外因性核酸は、例えば、相同組換え後に遺伝子を破壊する核酸配列、相同組換え後に遺伝子を置換する核酸配列、相同組換え後に遺伝子に変異を導入する核酸配列、または相同組換え後に調節部位を導入する核酸配列を含むことができる。その後、当該胚を培養して動物を発生させる。本発明の1つの局面において、少なくとも関心対象の標的核酸配列が操作されている動物が提供される。例えば、操作された遺伝子は、それが転写されないかもしくは正しく翻訳されないように、または当該遺伝子の他の形態が発現するように、不活性になりうる。動物は、当該操作された遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性でありうる。

本発明は、遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む植物細胞を提供する段階; 本発明によるCas9またはスプリットCas9タンパク質を導入することによって標的核酸配列内に切断を生じさせる段階; および切断が起こった細胞またはその子孫から植物を作出する段階を含む、植物を作出するための方法にも関する。当該子孫には、特定の植物または植物系の後代が含まれる。特定の態様において、植物を作出するための方法は、所望の外因性核酸を導入する段階をさらに含む。当該外因性核酸は、細胞またはその子孫において標的核酸配列と当該外因性核酸との間で相同組換えが起こるように、少なくとも標的核酸配列の一部分と相補的な配列を含む。この方法を用いて産生された植物細胞を増殖させて、そのゲノム中に修飾された標的核酸配列を有する植物を作出することができる。そのような植物由来の種子を用いて、例えば、修飾されていない植物と比べて改変された増殖特性、改変された外観、または改変された組成などの表現型を有する植物を作出することができる。

特定の態様において、動物または植物は、1種のみのスプリットCas9タンパク質を導入することによって作出されうる。別の動物または植物は、相補的なスプリットCas9タンパク質を導入することによって作出されうる。結果的に生じる動物または植物をともに交配させて、標的核酸配列を切断しうる両方のスプリットCas9タンパク質を発現する後代を作出することができる。

本発明のポリペプチドは、ゲノム操作および細胞（とりわけiPS細胞およびES細胞）の再プログラム化に有用である。

治療への応用
本明細書において開示される方法には、種々の応用がありうる。1つの態様において、本方法は、臨床または治療への応用に用いることができる。本方法は、例えば鎌状赤血球病における単一ヌクレオチド変化のような疾患原因遺伝子を修復または修正するために用いることができる。本方法は、特定の疾患または疾患状態に関与している他の遺伝子または染色体配列におけるスプライス部位変異、欠失、挿入などを修正するために用いることができる。

上記から、本発明によるポリペプチドは、とりわけ遺伝子転写を、プロモーターレベルでまたはその触媒ドメインを通じて調節、活性化、または阻害するために、医薬として用いることができる。

本発明によるCas9またはスプリットCas9タンパク質は、特定の遺伝子座での変異を修正するために、または発現が有害である遺伝子を不活性化するために、遺伝的疾患の治療に用いることができる。そのようなタンパク質は、iPS細胞または初代細胞（例えばT細胞）を、そのような細胞が疾患または感染の治療のために患者に注射されることを考慮して、遺伝的に修飾するために用いることもできる。そのような細胞療法スキームは、より具体的には、がん、CMVもしくはHIVによって引き起こされるようなウイルス感染、または自己免疫疾患を治療するために開発される。

一般的定義
上記の説明のなかで、いくつかの用語が広く使われている。以下の定義は、本態様の理解を容易にするために提供される。

ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書においては一文字コードにより示され、一文字コードにおいては、例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置き換えを意味し、例えば、あるペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基による置き換えはアミノ酸置換である。

ヌクレオチドは次のように示される: ヌクレオシドの塩基を示すために一文字コードが用いられる: aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドの場合、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、aまたはtを表し、vはg、aまたはcを表し、bはg、tまたはcを表し、hはa、tまたはcを表し、nはg、a、tまたはcを表す。

本明細書において用いられる場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって作出された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって作出された断片などの、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドをいう。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（DNAおよびRNAなど）、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、またはその両方の組み合わせである単量体から構成されうる。修飾ヌクレオチドは、糖部分における改変および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分における改変を有しうる。糖修飾は、例えば、1つまたは複数のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による置換を含み、または糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化されることができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような結合に類似する結合によって連結されることができる。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。

「相補的配列」とは、標準的な低ストリンジェント条件下で別のポリヌクレオチド部分（例えば、それぞれ標的核酸配列またはcrRNA）とハイブリダイズしうるポリヌクレオチドの配列部分（例えば、crRNAまたはtracrRNAの一部分）を意味する。そのような条件は、例えば、25%ホルムアミド、4×SSC、50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩衝液; pH 7.0、5×デンハルト、1 mM EDTA、1 mg/ml DNA + 20〜200 ng/mlの試験されるプローブ（およそ20〜200 ng/ml）を含有する緩衝液を用いることによっては室温で2時間でありうる。これは、文献において提供されているように、室温での配列内の相補的塩基の数およびG-Cの含量を用いるハイブリダイゼーションの標準的な計算によって予測することもできる。優先的には、配列は、鎖間のワトソン・クリック塩基対形成（すなわち、アデニンとチミン（A-T）ヌクレオチドの間およびグアニンとシトシン（G-C）ヌクレオチドの間の固有の塩基対形成）に依る2つの核酸鎖間の相補性に従って互いに相補的である。ワトソン・クリック塩基対形成と同一視される正確な塩基対形成には、標準ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドとの間の塩基対形成および修飾ヌクレオシド間の塩基対形成が含まれ、ここで修飾ヌクレオシドは、ワトソン・クリック対形成による適切な標準ヌクレオシドに置き換わることができる。一本鎖オリゴヌクレオチドの相補的配列は、反応条件下での2つの一本鎖オリゴヌクレオチド間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支える任意の長さでありうる。相補的配列は一般に、3 bp超、好ましくは5 bp超、好ましくは10 bp超にわたりハイブリダイズされる2つのオリゴヌクレオチド間の部分的な二本鎖重複部分を認める。相補的配列は、好都合には、オフターゲット組換えまたはドナー基質全体を伴わない（すなわち1つのオリゴヌクレオチドだけの）組換えを回避するために、ゲノム中の任意の配列と相同ではないように選択される。

「相同な核酸配列」とは、より具体的には少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは98%の同一性を有する、配列間の相同組換えをもたらすのに十分な、別の核酸配列との同一性を有する核酸配列を意味する。「同一性」は、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較の目的のためにアライメントされうる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められるなら、分子はその位置で同一である。核酸またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一なまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用可能なFASTAまたはBLASTを含む、さまざまなアライメント・アルゴリズムおよび/またはプログラムを、2つの配列間の同一性を計算するために、例えばデフォルト設定で、用いることができる。

「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子をいう。本発明において「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸もしくは合成核酸からなりうる線状もしくは環状のDNAもしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されることはない。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自律複製能力を有するもの（エピソームベクター）および/または発現能力を有するもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが当業者に知られており、市販されている。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリア痘）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えばノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV- BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。

本発明を一般的に記述してきたが、さらなる理解は、例示のみの目的で本明細書において提供され、特別の定めのない限り、限定することを意図するものではない、ある特定の実施例を参照することによって得ることができる。

実施例1: Cas9相同体の保存された配列セグメントの特定
本発明者らは、トランスフェクションおよびベクター化の有効性を増加させるために、化膿性連鎖球菌のCas9タンパク質（gi|15675041|）のトランケーションを行う。トランケーションされた形態のCas9をNHEJおよびHRの有効性について哺乳類細胞で試験する。最初の戦略は、化膿性連鎖球菌のCas9の相同体の保存された配列セグメントの特定に基づく半合理的手法を意味する。この戦略は、化膿性連鎖球菌のCas9の配列の特徴に由来するデータ、すなわち配列相同体ならびに二次構造予測およびタンパク質ドメイン境界予測を用いることに基づく。

化膿性連鎖球菌のCas9の配列は、COG3513（McrA/HNHヌクレアーゼドメインおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインを含有する、予測上のCRISPR関連ヌクレアーゼ）に属する。COG3513の配列のメンバーのアライメントを用いて、それぞれが2つの既知の触媒ドメインRuvCおよびHNHの1つに隣接する、2つの配列モチーフを構築した。デザインされた2つのモチーフ、RuvCモチーフ（D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A）（SEQ ID NO: 1）およびHNHモチーフ（Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S）（SEQ ID NO: 2）は、ScanPrositeツールを用いUniProtKBデータベースにおいて提示されているタンパク質配列の全てを抽出するために用いられた（de Castro, Sigrist et al. 2006）。

RuvCモチーフ（D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A）（SEQ ID NO: 1）の使用によって358配列の抽出が可能となり、HNHモチーフ（Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S）（SEQ ID NO: 2）の使用によって187配列の抽出が可能となる。抽出された配列の全てを検査し、より小さなサイズ、異なる起源および/または遺伝子座の異なる構成などの興味深い特徴を有する推定上のcas9相同体を探した。各ドメインに対する相同体を別々に分析し、それらのうちの少数のものを抽出し、アライメントさせた。各ドメインの境界を特定した。

RuvC様ドメイン
RuvC配列モチーフを用いて見出された358配列のなかで、8つの配列（SEQ ID NO: 5〜SEQ ID NO: 12）を抽出し、化膿性連鎖球菌のCas9のオリジナル配列（SEQ ID NO: 3）とアライメントさせた。標準的な多重配列アライメントソフトウェア（DIALIGN 2.2.1ソフトウェア）（Morgenstern 2004）を用いてアライメントを作成した。Cas9相同体のアライメントを以下のように表1に提示する:
1） 化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 4） 1368アミノ酸（AA）
2） D8IJI3_LACSC （SEQ ID NO: 5） 183 AA
3） F0K1W4_LACD2 （SEQ ID NO: 6） 669 AA
4） E1NX15_9LACO （SEQ ID NO: 7） 142 AA
5） C5F1Z4_9HELI （SEQ ID NO: 8） 344 AA
6） F3ZS86_9BACE （SEQ ID NO: 9） 349 AA
7） H1D479_9FUS0 （SEQ ID NO: 10） 198 AA
8） K1M766_9LAC0 （SEQ ID NO: 11） 857 AA
9） Q7VG48_HELHP （SEQ ID NO: 12） 131 AA

PSIPRED二次構造予測法を用いてCas9のRuvC様ドメインのタンパク質二次構造を予測した（Jones 1999; Buchan, Ward et al. 2010）（表2参照）。

本発明者らは、この多重配列アライメントおよびDoBoサーバーから導かれる予測（Eickholt, Deng et al. 2011）を二次構造予測とともに用いて、化膿性連鎖球菌のCas9のRuvC様ドメインが位置166G（SEQ ID NO: 2）にまで及ぶと推測することができる。

HNHドメイン
HNH配列モチーフ（Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S）を用いて見出された187配列のなかで、9つの配列（SEQ ID NO: 14〜22）を抽出し、上記のようにDIALIGN 2.2.1ソフトウェアを用いて化膿性連鎖球菌のCas9のオリジナル配列（SEQ ID NO: 3）とアライメントさせた（表3参照）。Cas9相同体のアライメントを以下のように表3に提示する。
1） D8IJI4_LACSC （SEQ ID NO: 14） 897 AA
2） FOK1W6_LACD2 （SEQ ID NO: 15） 544 AA
3） D4FGK2_9LACO （SEQ ID NO: 16） 534 AA
4） E1NX12_9LACO （SEQ ID NO: 17） 667 AA
5） E7NSW3_TREPH （SEQ ID NO: 18） 591 AA
6） H1D477_9FUSO （SEQ ID NO: 19） 387 AA
7） C2KFJ4_9LACO （SEQ ID NO: 20） 544 AA
8） K1MRU9_9LACO （SEQ ID NO: 21） 206 AA
9） E3ZTQ9_LISSE （SEQ ID NO: 22） 874 AA
10）化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 3） 1368 AA

PSIPRED二次構造予測法を用いてCas9のHNHドメインのタンパク質二次構造を予測した（Jones 1999; Buchan, Ward et al. 2010）（表4参照）。

化膿性連鎖球菌のCas9相同体の多重配列アライメントならびにDoBOサーバー（Eickholt, Deng et al. 2011）および二次構造予測サーバー（psipred）を用いて、HNHドメインの境界を特定した。2つのバージョンのCas9 HNHドメインが予測された。各HNHドメインバージョンのN末端はP800に相当するが、C末端は、短い方のバージョンの場合はY981（SEQ ID NO: 23）に相当し、または長い方のバージョンの場合はG1055（SEQ ID NO: 13）に相当する。

特定された新規のRuvCドメイン（SEQ ID NO: 4）と、HNHドメインの2つのバージョン（SEQ ID NO: 13およびSEQ ID NO: 23）のうちの1つとを含むCas9を遺伝子操作により作成し、その活性を試験する。

実施例2: より短いCas9相同体の特定およびCas9のC末端ドメインの消化
本研究は、より短い配列を有する4種の推定上の天然Cas9相同体の特定（SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 29）をさらに可能とする。上記のようにDIALIGN 2.1.1ソフトウェアを用いて、これらの天然の、Cas9のより短いバージョンを化膿性連鎖球菌のCas9とアライメントさせた。より短いCas9相同体のアライメントを以下のように表5に提示する。
1） D4IZM9_BUTFI （SEQ ID NO: 26） 765 AA
2） Q9CLT2_PASMU （SEQ ID NO: 27） 1056 AA
3） E0G5X6_ENTFL （SEQ ID NO: 28） 936 AA
4） E0XXB7_9DELT （SEQ ID NO: 29） 1011 AA
5） 化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 3） 1368 AA

PSIPRED二次構造予測法を用いて、より短いCas9のタンパク質二次構造を予測した（Jones 1999; Buchan, Ward et al. 2010）（表6参照）。

短い配列相同体（D4IZM9_BUTFI、Q9CLT2_PASMU、E0G5X6_ENTFL、E0G5X6_ENTFL; SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 29）の全てで、位置T956はかなり保存されているようであり、いずれにしてもこの領域におけるCas9の二次構造予測から判断すると、Y943は、化膿性連鎖球菌のCas9のC末端を切断するのにいっそう良好な位置であるものと思われる。

本発明者らは、進行性の酵素消化を行うために、（Lutz, Ostermeier et al. 2001）によって記述されている修正プロトコルを用いる。本発明者らは、エキソヌクレアーゼおよび熱不活化を用いることによって、Cas9のC末端が少しずつトランケーションされたライブラリを作出する。本発明者らは、おおよそ1364 aaから始めて約900 aaまでのCas9の断片のライブラリを作出する。

Cas9全配列の短い3つのバージョン: Cas9_delta943（SEQ ID NO: 31）、Cas9_delta980（SEQ ID NO: 32）およびCas9_delta1055（SEQ ID NO: 33）を遺伝子操作により作成する（図1参照）。

2つの異なる戦略で得られた新規のcas9足場を、（Mali, Yang et al. 2013）に既述されている化膿性連鎖球菌に特異的なPAMおよびsgRNAキメラを用いて、哺乳類細胞において試験する。

実施例3: 化膿性連鎖球菌のCas9およびその相同体のDNA/RNA結合特異性に関与する残基の特定
本研究において、ガイドRNAおよびPAMモチーフの結合に関与するCas9残基を特定することにより、新規のCas9足場を遺伝子操作により作成することが可能となり、ひいては、選択された標的に対する親和性を調節することが可能となるであろう。

本発明者らは、上記のようにCas9相同体の多重配列アライメントを用いて、化膿性連鎖球菌のCas9の一次配列に関して最も保存された領域を特定した。本発明者らは、このデータを、配列の特徴からDNAおよびRNA結合残基を予測できるサーバー（すなわちBindN）から導出された結果と適合させた（Wang and Brown 2006）。同時に、Cas9の一次配列の二次構造予測および溶媒接近性を用いて、タンパク質表面上で最も曝露される残基を特定した。化膿性連鎖球菌のCas9上の予測されるDNAおよびRNA結合領域を表7に記載する。Cas9相同体上の予測されるDNAおよびRNA結合領域を、表1、3、および5（灰色で強調された配列）に示す。

自動化ソフトウェアを用いて化膿性連鎖球菌のCas9の構造を予測した。本発明者らは、図2および図3において、上記の予測されたDNA/RNA結合領域15箇所を最良の3次元モデル出力上にマッピングして、DNAまたはRNAと接触しやすい残基を決定した。

また、化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 61）およびサーモフィラス菌のCas9（SEQ ID NO: 64）ならびに大腸菌およびサーモフィラス菌のRuvCドメインの2つのpdb構造の配列（SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 63）の間の多重配列アライメントを、clustalwを用いて構築した（表8参照）。

2つのCas9配列と2つのRuvCドメインの多重配列アライメントから、PAMの特異性に関与しうる、RuvCドメインにおいては提示されていない一続きの残基が指摘されうる。RuvCドメインはCas9には存在しない切断特異性を有し、一方、一続きの残基38T〜57EおよびT146〜L169（これはRuvCドメインでは保存されていない）が、PAMの特異性に関与する領域に相当しうる。具体的には、これらの2つの領域における化膿性連鎖球菌のCas9とサーモフィラス菌のCas9との間の配列の差異は、各PAMの特異性にヒントを与えうる。残基39-DRHS-42ならびにE57およびD147およびI154は、化膿性連鎖球菌のCas9とサーモフィラス菌のCas9との間の主な違いであり、最終的にはそれらは、PAM特異性に関与する位置でありうる。大腸菌のRuvCドメインの活性に重要な2つの残基: lys 107およびlys 118（どちらの位置もCas9において保存されていない）の同一ループ上にある、高度に曝露される位置173D〜174Lおよび177Dも興味深い。

本発明者らは、これらの異なるデータ源の全てを集めることにより、化膿性連鎖球菌のCas9の最も可能性の高いDNA/RNA結合セグメントを正確に示すことが可能になる。本発明者らは、第一の手法において、各DNA/RNA結合領域に対して独立した（3〜5アミノ酸の）ライブラリを作出する。並行して、本発明者らは、その3D局在化に基づき、異なる領域に属しているが、考えられる荷電表面パッチに位置している、アミノ酸のクラスタを選択する。

具体的には、本発明者らは、PAMモチーフの認識に関与するCas9の残基を解明するために、各タンパク質のシード位置に無作為化残基を含むCas9変異体ライブラリを（すなわちNVK縮重コードで）作出する。当該Cas9変異体ライブラリを、人工的に合成された標的に対してさらにスクリーニングする。最初のセットアップとして、合成された標的は、複合体sgRNA::DNAに必要な20個の不変のヌクレオチドを含む一方で、PAMモチーフの認識に関与する塩基は修飾されよう。現在、化膿性連鎖球菌のCas9によって特異的に認識されるPAMヌクレオチドの数は、2（NGG;（Mali, Yang et al. 2013））に限定されている。ここで、本発明者らは、Cas9によって特異的に認識されるヌクレオチドの数を、その特異性を調節する手段として、増やすかまたは抑えることを計画する。

「非天然PAM」は、少なくとも5つの塩基から構成されよう; それらは、それぞれが1位〜5位から始まる3塩基の3つのスライディング・ウィンドウとして扱われよう。最後に、cas9ライブラリを、3つの異なるスライディング・ウィンドウを構成するそれぞれ64個の標的セットに対してスクリーニングする。

Cas9コンストラクトの全てを、酵母において高速大量処理スクリーニングプラットフォームを用いて分析する。「非天然PAM」を特定したら、2つ以上のタンパク質シードの同時（contemporary）変異の相乗効果を評価するために、さまざまなラウンドの精緻化を行う。

各「非天然PAM」を同様に、最も似ていない20塩基RNA標的の認識を持っている新規の標的のセットに対して試験する。このインビボ手法を補完して、本発明者らはまた、方法論を用いて、すなわちBind-n-Seqとして高速大量処理インビトロ・タンパク質-DNA相互作用の実験をセットアップする。「非天然PAM」およびタンパク質コンストラクトの最良の組み合わせを、哺乳類細胞において試験する。化膿性連鎖球菌のCas9において核酸の認識に関与する領域を特定したら、それらをまた、選ばれた相同体の配列上にプロットし、真核細胞において試験する。

実施例4: RNA誘導型ヌクレアーゼであるスプリットcas9の作出
化膿性連鎖球菌のCas9の配列は、COG3513（McrA/HNHヌクレアーゼドメインおよびRuvC様ヌクレアーゼドメインを含有する、予測上のCRISPR関連ヌクレアーゼ）に属する。COG3513の配列のメンバーのアライメントを用いて、2つの配列モチーフ（それぞれが2つの既知の触媒ドメイン: RuvCおよびHNHの1つに隣接する）を構築した。当該2つの配列モチーフを用いて、Uniprotに提示されているタンパク質配列のうち、2つのドメインの各々を持つ配列を全て（PROSITEを用いて）抽出した。RuvCモチーフ（D-[IL]-G-x(2)-S-x-G-W-A）の使用によって358配列の抽出が可能となり、HNHモチーフ（Y-2x-D-H-2x-P-x-S-3x-D-x-S）の使用によって187配列の抽出が可能となる。

RuvCモチーフを用いて抽出された配列の間で、異なる生物に由来する8つの配列を選択した。これらのRuvC様配列は、短いトランケーション形態（それらを、1368 aaから構成される化膿性連鎖球菌のCas9と比較した場合）で存在していること、また、推定上の独立したHNHドメインに関連していることなどの、興味深い特徴を共有する。

これらの8つのタンパク質のうち以下の6つには、特徴付けられていないタンパク質という注釈が付けられている: ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivaris）由来のD8IJI3_LACSC（SEQ ID NO: 5）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus Delbrueckii）由来のF0K1W4（SEQ ID NO: 6）、ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter Hepaticus）由来のQ7VG48（SEQ ID NO: 12）およびトレポネーマ・デンティコーラ（Treponema Denticola）由来のE9S0G6（SEQ ID NO: 51）およびヘリコバクター・プロラム（Helicobacter Pullorum）由来のC5F1Z4（SEQ ID NO: 8）。以下の2つのRuvC様ドメインには、Crispr関連タンパク質という注釈が付けられている: フソバクテリアム・ネクロフォラム（Fusobacterium Necrophorum）由来のH1D479（SEQ ID NO: 10）およびラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus Crispatus）由来のK1M766（SEQ ID NO: 11）。

本発明者らは、これらの天然に存在する独立したRuvC/HNH様ドメインの所見から、化膿性連鎖球菌のCas9の野生型配列を操作して、スプリットcas9タンパク質を作出するように促された。化膿性連鎖球菌のCas9の野生型配列を、同時トランスフェクションされ、組み立てられて化膿性連鎖球菌のCas9の野生型配列全体を再構成しうる2つの別々のポリペプチド鎖（RuvCドメインおよびHNH様ドメイン）に分けた。本発明者らは、化膿性連鎖球菌のCas9配列を分けるのに最適な位置を予測するために、大腸菌のRuVCドメインのPDB構造（Pdbcode 4EPA）とともに上記の8つの配列ならびに化膿性連鎖球菌およびサーモフィラス菌のCas9の野生型配列の間の多重配列アライメントを構築した（表9）。本発明者らはこれらの情報を、（PSIPREDを用いた）化膿性連鎖球菌のCas9配列に対する二次構造エレメントの予測と統合した（表10）。

本発明者らは、分ける点として考えられる位置: G247を用いて化膿性連鎖球菌のCas9の配列を2つの独立したポリペプチド鎖に分けるスプリットCas9を作出することを選択した。具体的には、本発明者らは、化膿性連鎖球菌のCas9の2つの別個のドメインを作出した。N末端側のドメインは、1位から247位（SEQ ID NO: 52）までの残基からなり、C末端側のドメインは、アミノ酸248から1368（SEQ ID NO: 53）までの残基を包含する。

標準的な生物学的ツールを用いてS-Tagに加えて1つのNLSをスプリットRuvCドメインの5'末端に融合させ、pCLS24814プラスミド（SEQ ID NO: 54）を得た。スプリットHNHドメインの3'末端には2NLS-BFP-HA-Tagを融合させ、その後、より良好なKozakコンセンサス配列を有するようにスプリットHNHドメインの最初のアミノ酸をLeuからValに変異させて、pCLS24813（SEQ ID NO: 55; pCLS24813）を得た。

これらの2つのスプリットドメインのヌクレアーゼ活性を、ガイドRNAを用いて、CHO-KI（π10）細胞における内因性GFP_C9_T01標的（SEQ ID NO: 56）に対して試験した。pCLS24814およびpCLS24813を3つの異なる用量で同時トランスフェクションした。陽性対照は、化膿性連鎖球菌の野生型Cas9およびガイドRNA（SEQ ID NO: 57; pCLS22972）のトランスフェクションに当たり、対照は、ガイドRNAの存在下で各スプリットドメインを別々にトランスフェクションしたものに当たる。

トランスフェクションから4日後および7日後に、MACSQuant Analyzer（Myltenyi Biotec.）を用いたフローサイトメトリーにより、スプリットcas9ドメインのヌクレアーゼ活性を、GFP蛍光の低減として測定した。この結果は、当該期間（D4からD7まで）にわたって安定であるGFP陽性細胞の割合の低減が、2つのスプリットドメインの同時トランスフェクションによって誘導されることを明確に示している（図4）。

また、T7 Endoアッセイ法を用いてスプリットcas9のヌクレアーゼ活性を試験した（図5）。図5に示されているように、（3つの異なる用量での）両スプリットドメインの同時トランスフェクションは、DNAの切断を誘導する。本発明者らの結果は、両スプリットドメインの同時トランスフェクションが当該期間にわたって明らかな毒性なく標的DNAを効率的に切断することを示している。

これらの2つのスプリットドメイン一緒の場合または各スプリット別々の場合のヌクレアーゼ活性も、ガイドRNAを用いて、CHO-KI（π10）細胞における内因性CD52標的に対し試験した。T7 Endoアッセイ法を用いてスプリットcas9のヌクレアーゼ活性を試験した（図6）。図6に示されているように、両スプリットドメインの同時トランスフェクションは、DNAの切断を誘導する。驚いたことに、RuvCスプリットCas9ドメイン（N末端ドメイン）だけのトランスフェクションによって、同じ切断プロファイルが示されている。本発明者らの結果は、N末端スプリットドメインがC末端スプリットドメインとは独立して活性であり、標的核酸配列を切断できることを示している。

材料および方法
染色体に組み込まれた、ガイドRNA認識配列を含むGFPレポーター遺伝子（SEQ ID NO: 56）を含有するCHO-KI（π10）細胞を、2 mM l-グルタミン、ペニシリン（100 IU/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、アンフォテリシンB（Fongizone: 0.25 μg/ml, Life Technologies,）および10% FBSを補充したF12-K完全培地中、5% CO₂にて37℃で培養した。Nucleofector機器（Amaxa, Cologne, Germany）を用いて製造元の使用説明書にしたがって細胞のトランスフェクションを行った。接着CHO-KI細胞を培養0日目に収集し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、トリプシン処理し、Tヌクレオフェクション溶液に細胞1×10⁶個/100 μLの濃度で再懸濁した。

本発明者らは、2つのスプリットドメインの同時トランスフェクションを、異なる3つの用量で行った（本発明者らは、ガイドRNAをコードするプラスミドの量を4μgに固定している）。本発明者らは、第一の用量として、N末端スプリットプラスミドの場合1μgおよびC末端プラスミドの場合2μgを用いた; 本発明者らはまた、2つのスプリットドメインの用量を2μgおよび4μgに倍増し、第三の用量として、2つのスプリットドメインプラスミドについて等しい量4μgを用いた。

本発明者らは、トランスフェクションの各時点で、CHO-KI（π10）細胞懸濁液（Tヌクレオフェクション溶液）0.1 mLを用いて、ガイドRNAプラスミドGFP_C9_T01（SEQ ID NO: 58）4μgと、2つのスプリットドメインについて選択した量のベクターを混合した。本発明者らは、この混合液を2.0 mmのエレクトロポレーションキュベットに移し、Amaxa Nucleofector機器のプログラムU23を用いてヌクレオフェクションを行った。

トランスフェクション効率を推定するために、BFP発現プラスミド250 ngをサンプルに加えた（C末端スプリットドメインを有する場合を除く）。ヌクレオフェクションから最大20分後に、予熱されたCHO-KI培地0.5 mLをエレクトロポレーションキュベットに加えた。サンプルごとに、細胞をその後、2つの部分に分けて2枚のペトリ皿（10 ml F12-K）に播種し、既述のように5% CO₂下、37℃で培養した。

トランスフェクション後4日目に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、トリプシン処理し、培地5 mLおよび一定の割合のGFP陰性細胞（細胞2×10⁵個/mLで200 μl）に再懸濁した。フローサイトメトリーMACSQuant Analyzer（Myltenyi Biotec）を用いて、D4およびD7の時点でGFP陰性細胞の割合をモニターした（図4）。トランスフェクションから4日後（4日目）に、ゲノムDNAを抽出し、関心対象の遺伝子座を遺伝子座プライマー1および2（SEQ ID NO: 59および60）で増幅させた。（Reyon, Tsai et al. 2012）に記述されているプロトコルにしたがって、EndoT7アッセイ法により単位複製配列を分析した。図5を参照されたい。

（表１）Cas9相同体: D8IJI3_LACSC（SEQ ID NO: 4）、F0K1W4_LACD2（SEQ ID NO: 5）、E1NX15_9LACO（SEQ ID NO: 6）、C5F1Z4_9HELI（SEQ ID NO: 7）、F3ZS86_9BACE（SEQ ID NO: 8）、H1D479_9FUS0（SEQ ID NO: 9）、K1M766_9LAC0（SEQ ID NO: 10）、Q7VG48_HELHP（SEQ ID NO: 11）のRuvCドメインと、化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 3）との多重配列アライメント。^＊は、化膿性連鎖球菌のCas9のRuvC様ドメインの、予測される3'末端アミノ酸（G166）に対応する。灰色で強調された配列: 予測されるDNA/RNA結合領域（実施例3参照）。

（表２）化膿性連鎖球菌のCas9のRuvCドメインの二次構造予測およびRuvCドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 12）。Hはヘリックスを表し、Sはシートを表し、Cはコイルを表す。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列（SEQ ID NO: 12）

化膿性連鎖球菌のCas9の二次構造

（表３）Cas9相同体: D8IJI4_LACSC（SEQ ID NO: 13）、FOK1W6_LACD2（SEQ ID NO: 14）、D4FGK2_9LACO（SEQ ID NO: 15）、E1NX12_9LACO（SEQ ID NO: 16）、E7NSW3_TREPH（SEQ ID NO: 17）、H1D477_9FUSO（SEQ ID NO: 18）、C2KFJ4_9LACO（SEQ ID NO: 19）、K1MRU9_9LACO（SEQ ID NO: 20）、E3ZTQ9_LISSE（SEQ ID NO: 21）のHNHドメインと、化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 3）との多重配列アライメント。^＊は、化膿性連鎖球菌のCas9のHNHドメインの、予測される5'側の最初の位置および3'末端の位置に対応する。灰色で強調された配列: 予測されるDNA/RNA結合領域（実施例3参照）。

（表４）化膿性連鎖球菌のCas9のHNHドメインの二次構造予測および関連するHNHドメイン配列（SEQ ID NO: 23）。Hはヘリックスを表し、Sはシートを表し、Cはコイルを表す。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列

二次構造予測（Psipred）

（表５）より短いCas9相同体: D4IZM9_BUTFI（SEQ ID NO: 24）、Q9CLT2_PASMU（SEQ ID NO: 25）、E0G5X6_ENTFL（SEQ ID NO: 26）、E0XXB7_9DELT（SEQ ID NO: 27）の、化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 3）との多重配列アライメント。^＊は、Cas9のより短いバージョンの、予測される3'末端位置に対応する。灰色で強調された配列: 予測されるDNA/RNA結合領域（実施例3参照）。

（表６）Cas9のより短いバージョンの二次構造予測および関連するより短い化膿性連鎖球菌のCas9配列。Hはヘリックスを表し、Sはシートを表し、Cはコイルを表す。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列

二次構造予測（Psipred）

（表７）化膿性連鎖球菌のCas9のDNA/RNA結合領域のリスト。

（表８）化膿性連鎖球菌のCas9（SEQ ID NO: 61）およびサーモフィラス菌のCas9（SEQ ID NO: 64）ならびに大腸菌およびサーモフィラス菌のRuvCドメインの2つのpdb構造の配列（SEQ ID NO: 62およびSEQ ID NO: 63）の間の多重配列アライメント。

（表９）8つの選択配列ならびに化膿性連鎖球菌の野生型Cas9およびサーモフィラス菌のCas9および4EP4 pdbcodeの多重配列アライメント。G247の位置は、黒矢印で印が付けられている。

（表１０）PSIPREDを用いた化膿性連鎖球菌の野生型Cas9配列の二次構造エレメント予測。当該配列は2つのスプリットドメイン: N末端ドメインおよびC末端ドメインに分けられている。当該C末端ドメインの配列中のバリンに変異したロイシン248は、太字で印が付けられている。
化膿性連鎖球菌のCas9の配列
N末端ドメイン

C末端ドメイン

二次構造予測（Psipred）
N末端ドメイン

C末端ドメイン

参考文献

発明の概要
本発明は、互いに組み合わされて、よりコンパクトでありかつ/またはより特異的な組換えCas9足場（すなわち、アミノ酸1100個未満の人工融合タンパク質）を生じる新規のRuvC配列モチーフおよびHNH配列モチーフを提供する。Cas9タンパク質は、標的核酸配列をガイドRNAとともにまたはガイドRNAと別個にプロセッシングしうる2つの別個のスプリットCas9 RuvCおよびHNHドメインに分けることができる。これらの足場は遺伝子標的化のための方法において、特に遺伝子編集のための特異的ヌクレアーゼとして用いられる。これらの新規の足場をコードする発現ベクター、およびこれらのベクターで形質転換され操作された細胞も、本発明の主題である。
[本発明1001]
HNHドメインを含むがRuvCドメインを含まないスプリットCas9であって、該HNHドメインが少なくとも1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
[本発明1002]
RuvCドメインを含むがHNHドメインを含まないスプリットCas9であって、該RuvCドメインが少なくとも1つのモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
[本発明1003]
500アミノ酸長未満である、本発明1001または1002のスプリットCas9。
[本発明1004]
RuvCドメインおよびHNHドメインを含む、アミノ酸が1100個未満のCas9変異体であって、これらのドメインが、少なくとも、1つのRuvCモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aまたは1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記Cas9変異体。
[本発明1005]
前記Cas9変異体のC末端ドメインが、HNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sの後ろでトランケーションされている、本発明1001〜1004のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1006]
前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1005のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1007]
前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、本発明1006のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1008]
前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1007のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1009]
前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、本発明1008のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1010]
前記RuvCドメインおよびHNHドメインが、ペプチドリンカーによって分離されている、本発明1001〜1009のいずれかのCas9変異体。
[本発明1011]
前記ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 49〜SEQ ID NO: 50の群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1010のCas9変異体。
[本発明1012]
SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1011のCas9変異体。
[本発明1013]
非機能的RuvCまたはHNH触媒ドメインのいずれかを含む、本発明1001〜1012のCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1014]
SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、本発明1001〜1013のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1015]
SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、本発明1001〜1014のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9。
[本発明1016]
標的核酸配列を切断するために、該標的核酸配列上で少なくとも1つのガイドRNAと複合体を形成させるための、本発明1001〜1015のいずれかにおいて定義されたCas9変異体またはスプリットCas9の使用。
[本発明1017]
以下の段階を含む、細胞におけるゲノム標的化の方法：
（a）PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
（b）該標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
（c）本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
（d）Cas9またはスプリットCas9が該細胞において該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
[本発明1018]
以下の段階を含む、本発明1017の細胞におけるゲノム標的化の方法：
（a）PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
（b）該標的核酸配列と相補的でありかつ3'伸長配列を有する配列を含むcrRNAを提供する段階;
（c）該crRNAの該3'伸長配列の一部分と相補的な配列を含むTracrRNAを提供する段階;
（d）本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
（e）該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
[本発明1019]
前記crRNAおよび前記tracrRNAが融合されて一本鎖のガイドRNAを形成する、本発明1018の方法。
[本発明1020]
標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な少なくとも1つの配列を含む外因性核酸配列を導入する段階をさらに含む、本発明1017〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記細胞が植物細胞である、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記細胞が哺乳類細胞である、本発明1017〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1015のいずれかのCas9変異体またはスプリットCas9を含む、単離された細胞。
[本発明1024]
以下の段階を含む、動物を作出するための方法：
（a）遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階;
（b）本発明1017〜1020のいずれかの方法により該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
（c）切断が起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階。
[本発明1025]
前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記細胞内に導入する段階、および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
以下の段階を含む、植物を作出するための方法：
（a）遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む植物細胞を提供する段階;
（b）本発明1017〜1020のいずれかの方法により、該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
（c）切断が起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階。
[本発明1027]
前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記植物細胞内に導入する段階; および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階をさらに含む、本発明1026の方法。

Claims (27)

1. HNHドメインを含むがRuvCドメインを含まないスプリットCas9であって、該HNHドメインが少なくとも1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
2. RuvCドメインを含むがHNHドメインを含まないスプリットCas9であって、該RuvCドメインが少なくとも1つのモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記スプリットCas9。
3. 500アミノ酸長未満である、請求項1または2に記載のスプリットCas9。
4. RuvCドメインおよびHNHドメインを含む、アミノ酸が1100個未満のCas9変異体であって、これらのドメインが、少なくとも、1つのRuvCモチーフ配列D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-Aまたは1つのHNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sを含み、該配列中、Xは20種の天然アミノ酸のいずれか1つである、前記Cas9変異体。
5. 前記Cas9変異体のC末端ドメインが、HNHモチーフ配列Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-Sの後ろでトランケーションされている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
6. 前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
7. 前記RuvCドメインが、SEQ ID NO: 4〜SEQ ID NO: 12からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、請求項6に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
8. 前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
9. 前記HNHドメインが、SEQ ID NO: 13〜SEQ ID NO: 25からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは90%の配列同一性を含む、請求項8に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
10. 前記RuvCドメインおよびHNHドメインが、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のCas9変異体。
11. 前記ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 49〜SEQ ID NO: 50の群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のCas9変異体。
12. SEQ ID NO: 26〜SEQ ID NO: 33からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜11に記載のCas9変異体。
13. 非機能的RuvCまたはHNH触媒ドメインのいずれかを含む、請求項1〜12に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
14. SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
15. SEQ ID NO: 34〜SEQ ID NO: 48からなるアミノ酸配列より選択されるRNA/DNA結合領域において少なくとも1つの変異残基を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9。
16. 標的核酸配列を切断するために、該標的核酸配列上で少なくとも1つのガイドRNAと複合体を形成させるための、請求項1〜15のいずれか一項において定義されたCas9変異体またはスプリットCas9の使用。
17. 以下の段階を含む、細胞におけるゲノム標的化の方法：
    （a）PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
    （b）該標的核酸配列と相補的な配列を含むガイドRNAを提供する段階;
    （c）請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
    （d）Cas9またはスプリットCas9が該細胞において該標的核酸配列をプロセッシングするように、該ガイドRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
18. 以下の段階を含む、請求項17に記載の細胞におけるゲノム標的化の方法：
    （a）PAMモチーフを任意で含む標的核酸配列を選択する段階;
    （b）該標的核酸配列と相補的でありかつ3'伸長配列を有する配列を含むcrRNAを提供する段階;
    （c）該crRNAの該3'伸長配列の一部分と相補的な配列を含むTracrRNAを提供する段階;
    （d）請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体または少なくとも1つのスプリットCas9を提供する段階;
    （e）該細胞においてCas9-tracrRNA:crRNA複合体が該標的核酸配列をプロセッシングするように、該crRNA、該TracrRNAおよび該Cas9変異体または該スプリットCas9を該細胞内に導入する段階。
19. 前記crRNAおよび前記tracrRNAが融合されて一本鎖のガイドRNAを形成する、請求項18に記載の方法。
20. 標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な少なくとも1つの配列を含む外因性核酸配列を導入する段階をさらに含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記細胞が植物細胞である、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
23. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のCas9変異体またはスプリットCas9を含む、単離された細胞。
24. 以下の段階を含む、動物を作出するための方法：
    （a）遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む真核細胞を提供する段階;
    （b）請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法により該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
    （c）切断が起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階。
25. 前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記細胞内に導入する段階、および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から動物を作出する段階をさらに含む、請求項24に記載の方法。
26. 以下の段階を含む、植物を作出するための方法：
    （a）遺伝子修飾を導入することが望まれる標的核酸配列を含む植物細胞を提供する段階;
    （b）請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法により、該細胞内で該標的核酸配列をプロセッシングする段階; および
    （c）切断が起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階。
27. 前記標的核酸配列の少なくとも一部分と相同な配列を含む外因性核酸を前記植物細胞内に導入する段階; および相同組換えが起こった該細胞またはその子孫から植物を作出する段階をさらに含む、請求項26に記載の方法。

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