JP2016504291A - Ｅｇｆｒ及びｃ−ｍｅｔフィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン結合分子 - Google Patents

Ｅｇｆｒ及びｃ−ｍｅｔフィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン結合分子 Download PDF

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Abstract

単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、該分子をコードする単離ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及びこれらの作製方法が開示される。これらの単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、癌などの疾患及び障害の治療及び診断のための治療用組成物の製造に有用である。

Description

本発明は、単一特異性又は二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ結合分子及びその分子の作製方法及び使用方法に関する。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢｌ又はＨＥＲ１）は、癌原遺伝子ｃ−ｅｒｂＢｌによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーであり、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）が挙げられる。ＥＧＦＲシグナル伝達は、リガンド結合後、立体配座の変化、その他ＥｒｂＢファミリーメンバーによる受容体のホモ二量体化又は受容体のヘテロ二量体化及び受容体のトランス自己リン酸化の誘導によって開始され（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３〜７３，２００８）、これにより、細胞の増殖及び生存など、最終的に多種多様な細胞機能に影響を及ぼすシグナル伝達のカスケードが開始される。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増加は、ヒト癌の範囲に連動しており、ＥＧＦＲは治療的介入のための魅力的な対象となった（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０〜６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９５：８５１〜６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３：３６９〜８５，２００６）。非小細胞肺癌細胞において、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数及びタンパク質の発現がいずれも増加することは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質（ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ））への好ましい反応と関連付けられてきた（Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：７５２〜６０，２００７）。
ＥＧＦＲ治療としては、低分子及び抗ＥＧＦＲ抗体を双方ともが挙げられ、大腸癌、膵癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）の治療として認可された（Ｂａｓｅｌｇａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２４４５〜２４５９（２０００５；Ｇｉｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５〜７７６０，１９８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：１３１ １〜１３１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４：２９５７〜２９６６，１９９８）。
抗ＥＧＦＲ治療の有効性は、腫瘍型及びＥＦＧＲの突然変異／増幅状態に依存し得る。現在の治療の副作用としては、皮膚毒性を挙げることができる（Ｄｅ Ｒｏｏｃｋら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１：７５３〜７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，６：３５２〜３６６，２００９；Ｌｉ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７〜１１９，２００９）。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）は、一般に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の二次選択治療として使用されるが、多くの場合、耐性経路により１２ヶ月以内に効かなくなる（Ｒｉｅｌｙら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：８３９〜４４，２００６）。
ｃ−Ｍｅｔは、チロシンキナーゼ受容体をコードする。発癌性物質を用いた治療により、恒常的に活性化する融合タンパク質ＴＰＲ−ＭＥＴが発生することが判明した後、ｃ−Ｍｅｔは、１９８４年に癌原遺伝子として最初に同定された（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１１：２９〜３３，１９８４）。そのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）によりｃ−Ｍｅｔが活性化することにより、成長、運動性、浸潤、転移、上皮間葉転換、血管新生／創傷治癒、及び組織再生など、過多の細胞プロセスが刺激される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２２５：１〜２６，２００５；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９：３１４〜２６，２０１２）。ｃ−Ｍｅｔは、タンパク質分解により、５０ｋＤａのα−サブユニット及び１４０ｋＤａのβ−サブユニットに分割される、ジスルフィド結合により連結した単鎖タンパク質として合成される（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。ｃ−Ｍｅｔは、Ｒｏｎなど、他の膜受容体に構造的に類似している。ＨＧＦの厳密な化学量論としての、ｃ−Ｍｅｔ結合は、明確でないが、概して、２つのＨＧＦ分子が、２つのｃ−Ｍｅｔ分子に結合し、受容体の二量化及びチロシン１２３０、１２３４及び１２３５での自己リン酸化をもたしていると考えられている（Ｓｔａｍｏｓら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２３：２３２５〜２３３５，２００４）。遺伝子増幅、突然変異、又は、受容体過剰発現により、リガンド−非依存性のｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化も発生し得る。
ｃ−Ｍｅｔは、胃癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵癌、及び中枢神経系癌など、多くの型の癌において、高い頻度で、増幅、突然変異又は過剰発現する。典型的には、キナーゼドメインに局在化するミスセンス突然変異は、一般に、遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）に見出され、散在性ＰＲＣＣの１３％に見られる（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２３４３〜２３５０，１９９９）。セマフォリン又はｃ−Ｍｅｔの膜近傍ドメインに局在化するｃ−Ｍｅｔ突然変異は、高い頻度で胃癌、頭頸部癌、頭頸部、肝臓癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ及び甲状腺癌において見られる（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５）。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、脳腫瘍、大腸癌、胃癌及び肺癌にて検出され、多くの場合、疾患の進行に関連する（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の最大４％及び胃癌の最大２０％が、それぞれ、ｃ−Ｍｅｔ増幅を示す（Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５：Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１）。遺伝子増幅がない状態であっても、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現は、肺癌にて高い頻度で観察される（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，８７：１０６３〜９，１９９６）。更に、臨床サンプルでは、ほぼ半数の肺腺癌が高レベルのｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦを示し、いずれも腫瘍増殖率、転移及び予後不良の憎大と相関した（Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６６：１９１５〜８，１９９８）。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に耐性を示すようになる全腫瘍のほぼ６０％がｃ−Ｍｅｔの発現の増加、ｃ−Ｍｅｔの増幅、又はその唯一の既知のリガンドである、ＨＧＦの増加を示し（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８８，２０１０）、ｃ−Ｍｅｔを介する、ＥＧＦＲの代償経路の存在を示している。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに耐性を示すようになった培養細胞において、ｃ−Ｍｅｔの増幅が最初に確認され、Ｈｅｒ３経路を介して、生存率の向上を示した（Ｅｎｇｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９〜４３，２００７）。この点は、ｃ−Ｍｅｔの増幅を示したエルロチニブ又はゲフィチニブの一方に対して耐性を得た４３名中９名の患者を６２名中２名のみの未治療患者と比較した臨床サンプルにおいて、更に確認された。治療を受けた患者９名中、４名が、ＥＧＦＲ活性化突然変異体、Ｔ７９０Ｍも獲得し、同時的な耐性経路を示した（Ｂｅａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０４：２０９３２〜７，２００７）。
癌内でのＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ双方の各役割が十分に確立され、これらの標的を、併用治療にとって魅力的なものとしている。いずれの受容体も同一の生存経路及び抗アポトーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を介して、シグナル伝達するため、このペアを組み合わせて阻害することにより、代償経路活性化の可能性が制限され、全体の有効性を向上させ得る。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔを標的にした併用療法の試験が、ＮＳＣＬに対して、タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）と抗−ｃ−Ｍｅｔ一価抗体とを併用する治験（Ｓｐｉｇｅｌら、２０１１ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）において、また、タルセバ（エルロチニブ）とＡＲＱ−１９７（ｃ−Ｍｅｔの低分子阻害剤）とを併用する治験（Ａｄｊｅｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１６：７８８〜９９，２０１１）において、行われる。併用療法又は二重特異性抗−ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、例えば、以下に開示されている。国際特許公開第２００８／１２７７１０号、米国特許公開第ＵＳ２００９／００４２９０６号、国際特許公開第２００９／１１１６９１号、国際第２００９／１２６８３４号、国際特許公開第２０１０／０３９２４８号、国際第２０１０／１１５５５１号。
治療のためにＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路をアンタゴナイズする、現在の小分子及び大分子治療手段は、特異性の欠如の可能性、潜在的な非標的活性及び低分子阻害物質により遭遇し得る用量制限毒性により、次善の手段であり得る。典型的な二価抗体により、膜結合型受容体のクラスター形成及び下流シグナル伝達経路の不必要な活性化がもたらされ得る。一価抗体（ハーフアーム）では、製造工程が著しく複雑になり、それにかかる費用が発生する。
したがって、治療用途及び診断用途のために、更なる単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ阻害物質が必要とされている。
本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、ここで該第１のＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
また、本発明は、特定の配列を有する、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子、及び単一特異性ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子も提供する。
また、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメインも提供する。
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
また、本発明は、本発明の分子をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、また、二重特異性分子を作製する方法であって、本発明の単離宿主細胞を、該二重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製することと、を含む、方法。
本発明は、また、本発明の分子及び製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、また、癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の前記二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は前記ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する方法を提供する。
ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。 ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２〜２８及び７５〜８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。 Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号９９）及びランダム化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ代替表面を有するＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アラインメントを示す図である。ループ残基は、四角内に表示される。ループ及びストランドは、配列の上に示す。 ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９〜４３及び６５〜８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。 ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９〜４３及び６５〜８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。 単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理し、ＨＧＦにより刺激を与えたＨ２９２細胞中におけるｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効力は、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図中、Ａ５として示す）単独の場合、又は、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインをＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図中、８３ｖ２として示す）と組み合わせた場合と比較すると、顕著に上昇した。 単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理した細胞における、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。ＥＧＦＲ、ＮＣＩ−Ｈ２９２（図５Ａ）及びＨ５９６図５（Ｂ）が高レベルで発現している細胞株中では、抗−ＥＧＦＲ単一特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲリン酸化が低下する時点で、ほぼ同じ効力を示す。ｃ−Ｍｅｔに対して低いレベルのＥＧＦＲが発現する細胞株である、Ｈ４４１では（図５Ｃ）、単一特異性ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲリン酸化の阻害の効力を向上させる。ＥＧＦＲに対して、低いレベルのｃ−Ｍｅｔを有する細胞株である、Ｈ２９２（図５Ｄ）及びＨ５９６（図５Ｅ）では、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害が、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により大幅に増強される。本試験において、次の分子を使用した：二重特異性ＥＣＢ５（図中、１７−Ａ３として示す）、単一特異性ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図中、「１７」として示す）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図中、８３−Ｈ９として示す）、及び単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図中、Ｈ９として示す）。 二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を投与したマウスから単離された腫瘍内における薬力学的シグナル伝達を示す、６時間又は７２時間の場合の図である。６時間及び７２時間のいずれにおいても、いずれの分子も、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのリン酸化を大幅に減少させた。その程度は、阻害がＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔへの親和性に依存していた。高い（図中の「８３」は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中程度（図中の「１７ｖ２」は、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）の親和性を有するＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインを、高い（図中「Ａ３」は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中程度（図中の「Ａ５」は、Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）の親和性を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して連結することによって、二重特異性分子を調製した。 アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に連結された様々な（variable）親和性の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ分子の、ＩＰ投与後６時間（左）及び７２時間（右）の、血漿集積（上）及び腫瘍集積（下）を示す。投与後６時間では、中程度の親和性のＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）又は高親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（８３ｖ２）を内部に有する二重特異性分子を投与されたマウスで、腫瘍集積は、最大である。高い又は中程度の親和性のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを組み込んだ二重特異性分子は、以下の通りである；８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔに対して高い／中程度）、８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高い／高い）、１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中程度／中程度）、１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中程度／高い）。図中では、８３ｖ２は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を指し、１７ｖ２は、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を指し、Ａ３は、ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を指し、また、Ａ５は、ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を指す。 Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤベージュマウスに埋め込んだ。腫瘍の平均体積が、約８０ｍｍ3に到達すると、マウスは、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳビヒクルの投与を３回／週受けた。二重特異性分子はいずれも腫瘍増殖を減少させ、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲについては、その分子の親和性に依存する。（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を指し、高ＥＧＦＲ−中ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を指し、中ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を指し、中ＥＧＦＲ−中−ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を指す）。 Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片は、ＳＣＩＤベージュマウスに埋め込み、異なる治療法で処置した。本治療法の抗腫瘍活性を示す（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を指し、その他の治療法は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ及びクリゾチニブエルロチニブとの併用である）。
本明細書で用いられる用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質類、サイトカイン受容体及び原核酵素を含む、タンパク質中に頻繁に存在するドメインを指す（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。例えば、例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、及び米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号に記載されているような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３ ＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの第１０ ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と称される。
本明細書で用いられる用語「置換する」若しくは「置換される」、又は「変異する」若しくは「変異させられる」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列における１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、削除、挿入し、その配列の変異体を生成することを指す。
本明細書で用いられる用語「ランダム化する」若しくは「ランダム化される」、又は「多様化される」若しくは「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列において少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
本明細書で用いられる「変異体」は、例えば、置換、挿入、又は欠失などのうちの１つ以上の修飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書で用いられる用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約１×１０-6Ｍ以下、例えば、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、又は約１×１０-13Ｍ以下の解離定数（ＫD）にて、所定の抗原に結合する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。典型的には、本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定したとき、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又は力ゼイン）に対するＫDの少なくとも１０倍以下であるＫDにて、所定の抗原（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ）に結合される。したがって、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、各ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、結合親和性（ＫD）は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対して、少なくとも１×１０-6Ｍ以下である。しかし、所定の抗原に特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメインは、他の関連した抗原、例えば、その他の種（同族体類）からの同一の所定の抗原に対して、交差反応性を有し得る。
用語「ライブラリ」は、変異体の集合を指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌクレオチド変異体からなっていてよい。
本明細書で用いられる用語「安定性」は、生理学的条件下において、例えば、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔなどの所定の抗原に結合しているなど、正常な機能的活動のうちの少なくとも１つを保持するように、折り畳まれた状態を維持するための分子の能力を指す。
本明細書で用いられる用語「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」は、配列番号７３及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５２１９に示される配列を有するヒトＥＧＦＲ（また、ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても既知である（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８〜４２５，１９８４））並びにこれらの天然の突然変異体を指す。こうした変異体としては、周知のＥＧＦＲｖＩＩＩ及び他の代替スプライス変異体が挙げられ、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ００５３３−１（野生型；配列番号７３及びＮＰ＿００５２１９と同一）、Ｐ００５３３−２（Ｆ４０４Ｌ／Ｌ４０５Ｓ）、Ｐ００５３３−３（６２８〜７０５：ＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰ．．．ＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ→ＰＧＮＥＳＬＫＡＭＬ．．．ＳＶＩＩＴＡＳＳＣＨ及び７０６〜１２１０欠失）、Ｐ００５３３−４（Ｃ６２８Ｓ及び６２９〜１２１０欠失）、変異体Ｑ９８、Ｒ２６６、Ｋ５２１、Ｉ６７４、Ｇ９６２及びＰ９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥＨＳ ＥＳ１５４７８），Ｔ７９０Ｍ，Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ及びｄｅｌ（Ｅ７４６，Ａ７５０）によって同定されるものがある。
本明細書で用いられる用語「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）及びエピレグリン（ＥＰＩ）など、ＥＧＦＲの全ての（例えば、生理学的）リガンド、を包含する。
本明細書で用いられる用語「上皮成長因子」（ＥＧＦ）は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有する既知の５３のアミノ酸ヒトＥＧＦを指す。
本明細書で用いられる用語「肝細胞増殖因子受容体」又は「ｃ−Ｍｅｔ」は、配列番号１０１又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃ−Ｍｅｔ及びこれらの天然変異体を指す。
本明細書で用いられる用語「肝細胞増殖因子」（ＨＧＦ）は、分割されて、ジスルフィド結合によって連結したα鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されたアミノ酸配列を有する周知のヒトＨＧＦを指す。
本明細書で用いられる用語「結合をブロッキングする」又は「結合を阻害する」は同じ意味で用いられ、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどの、ＥＧＦＲリガンドの結合をブロッキング又は阻害する能力を指し、そして、部分的なブロッキング／阻害、及び完全なブロッキング／阻害の両方を包含する。ブロッキング又は阻害のない場合の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較したとき、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子による、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどの、ＥＧＦＲリガンドのブロッキング又は阻害は、ＥＧＦＲシグナル伝達及び／又はｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達の正常レベルを部分的に又は完全に低下させる。本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、阻害が、少なくとも、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である場合、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの「結合をブロッキングする」。結合の阻害は、例えば、ＦＡＣＳを用いて、かつ本明細書に記載の方法を用いて、ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子にさらされたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞上でのビオチン化ＥＧＦの結合の阻害を測定するか、又は周知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン上のビオチン化ＨＧＦ結合の阻害を測定するなどの、周知の方法を用いて、測定することができる。
用語「ＥＧＦＲシグナル伝達」は、ＥＧＦＲに結合しているＥＧＦＲリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を指し、ＥＧＦＲ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化をもたらす。例示的なＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。
本明細書で用いられる用語「ＥＧＦＲシグナル伝達を中和する」は、ＥＧＦなどのＥＧＦＲリガンドによって引き起こされるＥＧＦＲシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
用語「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達」は、ｃ−Ｍｅｔに結合しているＨＧＦによって引き起こされるシグナル伝達を指し、ｃ−Ｍｅｔ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化をもたらす。典型的には、１２３０、１２３４、１２３５又は１３４９位において、少なくとも１つのチロシン残基が、ＨＧＦ結合時に自己リン酸化される。
本明細書で用いられる用語「ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を中和する」は、ＨＧＦによって引き起こされるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
本明細書で用いられる用語「過剰発現」、「過剰発現した」、「過剰発現している」は、同じ意味であり、同一組織型の正常細胞と比較して、表面上で測定可能なほど高レベルのＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを有する癌又は悪性細胞を指す。このような過剰発現は、遺伝子増幅又は転写若しくは転換の増加によって引き起こされる場合がある。ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、例えば、生細胞又は溶解細胞でのＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー又はラジオイムノアッセイを使用する、既知のアッセイにて測定することができる。あるいは、又は更には、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ−コード核酸分子のレベルは、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法、サザンブロット法又はＰＣＲ法を用いて、細胞中において測定してもよい。細胞表面上のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔレベルが正常細胞と比較して、少なくとも１．５倍以上高いときは、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔが過剰発現している。
本明細書で用いられる用語「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号に記述されている配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
本明細書で用いられる用語「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、必ずしも新規遺伝物質の取り込みを伴わない、自然発生的又は誘発性表現型の変化を有する、インビボ、エクスビボ及び組織培養液のいずれかにおける、癌性、前癌性又は形質転換細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染及び新規ゲノム核酸の取り込み又は外因性核酸の摂取から発生し得るが、自然発生的に又は発癌性物質への暴露後に発生することもあり、これによって、内在性遺伝子の突然変異が起こり得る。形質転換／癌の例としては、ヌードマウスなどの好適な動物宿主、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態的変化、細胞不死化、異常増殖制御、病巣形成、増殖、悪性疾患、腫瘍特異性マーカーレベル、侵襲性、腫瘍増殖又は抑制などがある（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。
用語「ベクター」は、生物系内で複製することができる、又はこうした系の間で移動可能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持しやすくするために機能する複製源、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的構成要素を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
「発現ベクター」という用語は、生物系又は再構成された生物系において、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために使用することができるベクターを意味する。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のアミノ酸の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
本明細書で用いられる用語「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子」又は「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子」は、直接的に又はリンカーを介してのいずれかによって、共有結合により１つに連結される、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及び異なるｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む分子を指す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子としては、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン、及びｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインが挙げられる。
本明細書では、「価」は、分子中において、指定された数の、抗原特異的な結合部位の存在を意味する。そのため、用語「一価の」、「二価の」、「四価の」及び「六価の」は、それぞれ、分子中において抗原特異的な１個、２個、４個及び６個の結合部位の存在を意味する。
本明細書で用いられる用語「混合物」は、共有結合により、共に連結されてない２つ又はそれ以上のＦＮ３ドメインのサンプル又は製剤を指す。混合物は、２つ又はそれ以上の同一のＦＮ３ドメイン又は異なるＦＮ３ドメインから構成されていてよい。
物質の組成
本発明は、単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方法を提供する。
単一特異性ＥＧＦＲ結合分子
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、これにより、治療用途及び診断用途において幅広く使用することができる。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方法を提供する。
本発明のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲと高い親和性で結合し、ＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害し、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をもたらし得る。
本発明は、また、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、かつ、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を用い、本発明のＦＮ３ドメインと共に又は本発明のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベートしたＡ４３１細胞において、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートを使用して、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出する競合アッセイにおいて、約１×１０-7Ｍ未満、又は約１×１０-8Ｍ未満、又は約１×１０-9Ｍ未満、又は約１×１０-10Ｍ未満、又は約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインなど、約１×１０-9Ｍ〜約１×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る。
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を使用した、本発明のＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し得る。
ＥＧＦなどのリガンドのＥＧＦＲへの結合は、受容体二量体化、自己リン酸化、受容体内部の活性化、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性化）及び細胞周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始を刺激する。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害により、１つ以上のＥＧＦＲ下流のシグナル伝達経路を阻害することもあり、また、このために、ＥＧＦＲの中和が、細胞増殖及び分化、脈管形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
ＥＧＦＲシグナル伝達は、種々の周知の方法、例えば、チロシンＹ１０６８、Ｙ１１４８及びＹ１１７３のいずれかの受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３１１：４８３〜５，１９８４）及び／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定すること、を用いて測定することもできる。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロット法など、周知の方法で、ホスホチロシン特異抗体を用いて検出できる。例示的なアッセイは、Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８で見られ、また、本明細書に記載したアッセイが挙げられる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満、例えば、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲのリン酸化を阻害する。こうした例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインである。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、当業者によって行われているような、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは、約１×１０-8Ｍ未満、例えば、約１×１０-9Ｍ未満又は約１×１０-10Ｍ未満又は約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ又は約１×１０-13Ｍの解離定数（ＫD）にて、ヒトＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲのＦＮ３ドメインの親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原−結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。
ＥＧＦＲに結合する本発明のＦＮ３ドメインの例としては、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０，又は１２２〜１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、構造的特徴として、ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含み、ここで、Ｘ9はＭ又はＩである、ＦＧループを含み得る。こうしたＦＮ３ドメインは、長さ８又は９個のアミノ酸からなり、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）によって定義される、ＢＣループを更に含み得る。また、前記ＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満又は約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する。
本明細書に記載される、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する、本発明のＦＮ３ドメインは、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）を更に含み、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
本明細書に記載のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、作製し、周知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する能力の試験を行うことができる。
本発明は、また、ＥＧＦＲに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインを提供し、ここで該ＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７又は１９４〜２１１に示す配列を含む。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、半減期延長分子の発現及び／又は共役を促進させるために、Ｎ末端に連結される開始剤メチオニン（Ｍｅｔ）又は特定のＦＮ３ドメインのＣ末端に連結されるシステイン（Ｃｙｓ）を含む。
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている。
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する。
ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲへの結合に寄与するアミノ酸残基は、突然変異誘発などの方法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定することができる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５での置換は、ＦＮ３ドメインへのＥＧＦＲの結合を１００倍超減少させる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４−４８、Ｐ５４ＡＲ４−８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２３は、これらの残基を共有し、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２と同じパラトープ残基によりＥＧＦＲと結合すると予想できる。その他のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、ＢＣループ及びＦＧループの他の位置（２４、２５、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４及び８６位）にあるアミノ酸を変更する一方で、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５位を変更せず保持することによって作製できる。これらの変更は、特定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによって、又はこれらの位置を、ランダムなアミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラリに取り込むことによって、行うことができる。このような方法で設計された新規ＦＮ３ドメインを使用して、ＥＧＦＲ結合性、溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期などの最適化された特性をスクリーニング又は選択することができる。
単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングし、これにより、治療用途及び診断用途において幅広く使用することができる、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方法を提供する。
本明細書に記載される本発明のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔと高い親和性で結合し、ｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達を阻害し、低分子ｃ−Ｍｅｔ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をもたらし得る。本発明のＦＮ３ドメインは一価であり、このため、他の二価の分子により発生することがある不要な受容体のクラスター形成及び活性化を妨げる。
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの存在下で、ビオチン化ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、約２×１０-10Ｍ〜約６×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔと結合するＨＧＦをブロッキングし得る。本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いたＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合と比較したとき、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る。
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を使用して、本発明のＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害し得る。
ＨＧＦのｃ−Ｍｅｔへの結合は、受容体二量体化、自己リン酸化、受容体内部の活性化、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性化）及び細胞周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始を刺激する。ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の阻害により、１つ以上のｃ−Ｍｅｔ下流のシグナル伝達経路を阻害することもあり、また、このために、ｃ−Ｍｅｔの中和が、細胞増殖及び分化、脈管形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、種々の周知の方法、例えば、少なくとも１つのチロシン残基、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５又はＹ１３４９上の受容体の自己リン酸化及び／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定すること、を用いて測定することもできる。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法において、又はウェスタンブロット法においてリン酸化に対して特異的な抗体を用いて、検出することができる。チロシンキナーゼ活性のアッセイ（Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３：１４３３〜４４，１９９７；Ｂａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３〜５０，１９９８）及び本明細書に記載のアッセイ。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞中で測定したとき、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基位置１３４９でのＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞中で測定したとき、４×１０-9Ｍ〜約１×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ−ＭｅｔチロシンＹ１３４９でのＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、当業者によって行われているような、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは、約１×１０-7Ｍ以下、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ，１×１０-11Ｍ、１×１０-12Ｍ、１×１０-13Ｍ、１×１０-14Ｍ又は１×１０-15Ｍの解離定数（ＫD）にて、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約３×１０-10Ｍ〜約５×１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。ｃ−ＭｅｔのＦＮ３ドメイン親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原−結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。
ｃ−Ｍｅｔに結合する本発明のＦＮ３ドメインの例としては、配列番号３２−４９、１１１〜１１４又は２１２〜２２３のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含む。
本明細書に記載する、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する、本発明のＦＮ３ドメインは、配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を更に含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
本発明は、また、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインを提供し、ここで該ＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９又は１１１〜１１４に示す配列を含む。
本発明は、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとのの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている。
本発明は、また、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ−Ｍｅｔに結合する。
ＦＮ３ドメインのｃ−Ｍｅｔへの結合に寄与するアミノ酸残基は、突然変異誘発などの方法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定することができる。ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号２７）の残基Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓでの置換により、ＦＮ３ドメインへのｃ−Ｍｅｔの結合が１００倍超減少した。ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン分子Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９２−Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｆ１０及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｈ８は、これらの残基を共有し、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３と同じパラトープ残基によりｃ−Ｍｅｔと結合すると予想できる。その他のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及び／又はＦＧループの他の位置（３２、３６、３９、４０、６８、７０、７８及び８１位）にあるアミノ酸を変更する一方で、Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ位を変更せず保持することによって作製できる。これらの変更は、特定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによって、又はこれらの位置を、ランダムなアミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラリに取り込むことによって、行うことができる。このような方法で設計された新規ＦＮ３ドメインを使用して、ｃ−Ｍｅｔ結合性、溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期などの最適化された特性をスクリーニング又は選択することができる。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリからのＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン−Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通配列から設計された非天然のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特有であるが、７つのβストランドを接続する６つの表面露出ループを示す。このβストランドは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧとし、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ及びＦＧループと呼ばれる（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基は、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔと結合する新規分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために、ランダム化できる。表１には、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の各ループ及びβストランドの位置及び配列を示す。
したがって、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、以下に示すように、ライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２など、ランダム化ＦＧループ又はランダム化ＢＣループ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、７個の長いアミノ酸であり、したがって、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＢＣループで多様化され、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは、７個の長いアミノ酸であり、したがって、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＦＧループで多様化され、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリ内のループでの更なる多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることができる。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループは、アミノ酸１〜２２個分だけ延長されるか、又はアミノ酸１〜３個分だけ減少させることができる。Ｔｅｎｃｏｎ内のＦＧループは、７個のアミノ酸の長さであり、抗体の重鎖内の対応するループは、４〜２８個の残基の範囲である。最大の多様性を提供するため、ＦＧループは、配列及び長さを多様化させて、４〜２８の残基の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応させることができる。例えば、ＦＧループは、更に１、２、３、４又は５個のアミノ酸でループを延長することによって、長さを更に多様化することができる。
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、また、ＦＮ３ドメインの側面に形成されるランダム化された代替表面を有し、かつ、２つ又はそれ以上のβストランド及び少なくとも１つのループを含み得る。このような１つの代替表面は、Ｃ及びＦβストランド並びにＣＤループ及びＦＧループ（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）内でアミノ酸によって形成される。Ｔｅｎｃｏｎの代替Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づくライブラリ設計は、図１に示されており、かつ、こうしたライブラリの詳細な作製は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記述されている。また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリとしては、１１、１４、１７、３７、４６、７３又は８６の残基位置に置換を有し（配列番号１に対応してナンバリングした残基）、かつ、変異体が熱安定性の改善性を示すＴｅｎｃｏｎ変異体などの、Ｔｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されたライブラリが挙げられる。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体は、米国特許第２０１１／０２７４６２３号に記述されており、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１と比較して、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）が挙げられる。
Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３配列ベースのライブラリは、ランダムな又は定義されたアミノ酸セットを用いて、選択した残基位置にてランダム化することができる。例えば、ランダム置換を有するライブラリ中の変異体は、２０の天然のアミノ酸全てをコードするＮＮＫコドンを用いて生成できる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンが使用できる。あるいは、２０全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンが使用できる。多様化される位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）法（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成できる。この手法は、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な普遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。このトリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コドン指定は、よく知られているＩＵＢコードによる。
本明細書に記載の、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３ドメインは、ｃｉｓディスプレイを用いて、スカフォールドタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントにライゲートし、インビトロ翻訳後に形成されたタンパク質ＤＮＡ錯体のプールを作製して（ここで、各タンパク質は、安定的にそれをコードするＤＮＡと結びついている（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，２８０６〜２８１０，２００４））、ＴｅｎｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを作製し、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するためのライブラリを、当該技術分野で周知の、または、実施例に記載の任意の方法で分析することにより、単離することができる。使用できる例示的な周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、並びに競合アッセイ及び非競合アッセイが挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインについては、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦ又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合などのＥＧＦＲリガンドをブロッキングする能力、及びＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害する能力の特性を更に決定する。
本明細書に記載のように、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３ドメインは、ライブラリを作製するためのテンプレートとして、任意のＦＮ３ドメインを用いて、また、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する分子のライブラリをスクリーニングして、作製することができる。使用できる例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣ（配列番号７５）の第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、フィブコン（Fibcon）（配列番号７６）及びフィブロネクチン（配列番号７７）の第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。インビトロでライブラリを発現又は翻訳させるために、ライブラリをベクターにクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成するために、標準的なクローニング及び発現法が使用される。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）などが使用され得る。ＦＮ３ドメイン変異型のライブラリは、例えば、任意の好適なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパク質として発現され得る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを提示する方法は、よく知られている（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第２００９／０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。
本明細書に記載の、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３ドメインは、変化させて、熱安定性及び熱的フォールティング並びにアンフォールディングの可逆性の改善などの特性を向上させることができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋の安定化設計、α−ヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物を含む、いくつかの方法が適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高い熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を向上させるために、置換することができる残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６であり、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記述されている。これらの残基に対応する置換は、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子に組み込むことができる。
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７に示す配列を含み、更に、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
本発明は、また、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングし、配列番号３２〜４９又は１１１〜１１４に示す配列を含み、更に、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
例示的な置換は、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ及びＥ８６Ｉ（ナンバリングは、配列番号１に従う）である。
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。
本明細書に記載のとおり、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイン（図１）は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して、延長されたＦＧループを有する。したがって、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６に対応する残基は、図１Ａ及び１Ｂに示される、配列番号２４のＦＮ３ドメインを除くＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインの、残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び９１であり、ここで、対応する残基は、ＢＣループでの１つのアミノ酸の挿入により、残基１１、１４、１７、３８、７４及び９２となる。
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７又は１９４〜２１１で示すアミノ酸配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換に対応する、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメインを提供する。
本発明は、また、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅとの結合をブロッキングし、配列番号３２〜４９、１１１〜１１４又は２１２〜２２３で示すアミノ酸配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換に対応する、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメインを提供する。
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性と同じ又は異なる側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、（溶液中の場合は）周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過による機械的剪断力、紫外線放射、γ線照射などの電離放射線、化学的又は熱的な脱水、又は、タンパク質構造の破壊を引き起こし得る他の任意の作用又は力に対して感受性があるか、又は「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分がアンフォールディングされる温度（℃）である、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することによって決定され得る。典型的には、ＴＭが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本発明の、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合するＦＮ３ドメインは、改変前の同一ドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の、ＴＭの上昇によって測定される増加した安定性を示す。
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤としては、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン（dinitrothiobenzene）、及び、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸類（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び標的変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子に結合する能力などの機能特性の損失、又はあるいは凝集傾向、これまで溶媒が到達しにくかった残基が露出する傾向、ジスルフィド結合が破壊若しくは形成する傾向などの物理化学的性質による損失に依存し得る。
本明細書に記載するいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合する本発明のＦＮ３ドメインは、化学変性剤としてグアニジン塩酸塩を用いて測定した、改変前の同じスカフォールドと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の安定性の増加を示す。増加した安定性は、よく知られている方法を使用して塩酸グアニジンの濃度を増加させる処理における、減少したトリプトファン蛍光によって測定され得る。
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、標的分子の原子価及びしたがって結合活性を増加させるための手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重若しくは多特異性スカフォールドを生成するための手段として、単量体、二量体、若しくは多量体として、生成できる。二量体及び多量体は、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含有するリンカーの含有によって、単一特異性、二重又は多特異性タンパク質スカフォールドを結合することによって生成できる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2（配列番号７８）、（ＧＧＧＳ）2（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20（配列番号８３）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。二量体及び多量体は、互いにＮ−Ｃ方向に連結され得る。ポリペプチドを新規の結合融合ポリペプチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリンカーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本明細書に記載される本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をもたらし得る。本発明は、少なくとも一部は、ＥＧＦＲ結合及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較したとき、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子が、大幅に改善された相乗的阻害効果をもたらすとの驚くべき発見に基づく。分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの双方に対して、特異的親和性となるように調節して、腫瘍侵入及び保持率を最大化してもよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路のより効果的な阻害をもたらし、セツキシマブ（Ｅｒｉｂｔｕｘ（登録商標））より効率的に、腫瘍増殖を阻害する。
本発明は、また、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、本発明の任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの直接的又はリンカーを介しての共有結合による連結により、生成することができる。このため、二重特異性分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインについて、上述の特徴を有し得る。また、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインについて、上述の特徴を有し得る。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約４×１０-9Ｍ〜約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。
本明細書に記載される、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの双方に結合する二重特異性分子では、第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDにて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ−Ｍｅｔと、約３×１０-10〜約５×１０-8ＭのＫDにて結合する。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する親和性は、単一特異性分子の実施例３及び実施例５に記載されているように決定することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を用い、第１のＦＮ３ドメインと共に又は第１のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベートしたＡ４３１細胞において、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲートを使用して、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出するアッセイにおいて、約１×１０-9Ｍ〜約１．５×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、第１のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子内の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの存在下で、ビオチン化ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約２×１０-10Ｍ〜約６×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子内の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いてＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合と比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、同じアッセイ条件を使用した、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を阻害し得る。
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達は、単一特異性分子について、上記のとおり種々の周知の方法を用いて測定することができる。
ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン及びｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインを含む、本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅ分子は、第１のＦＮ３ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインの混合物によって観察される相乗的阻害と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達及び腫瘍細胞増殖の相乗的阻害の大幅な向上をもたらす。相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子及び２つの単一特異性分子（一方はＥＧＦＲに結合し、他方はｃ−Ｍｅｔに結合する）の混合物による、ＥＲＫリン酸化の阻害を測定することによって、評価できる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、２つの単一特異性ＦＮ３ドメインの混合物についてのＩＣ50値と比較した場合、少なくとも１００倍小さい、例えば、少なくとも５００、１０００、５０００、１０，０００倍小さいＩＣ50値にて、ＥＲＫのリン酸化を阻害することができ、これは、この二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子が、２つの単一特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、能力が少なくとも１００倍増大されていることを示す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値にて、ＥＲＫのリン酸化を阻害することができる。ＥＲＫのリン酸化は、標準的な方法及び本明細書に記載の方法を用いて測定できる。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物を用いたＨ２９２細胞の増殖阻害のＩＣ50値と比較したとき、少なくとも３０倍以下のＩＣ50値にて、Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し得、ここで、この細胞増殖は、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加した１０％ ＦＢＳ含有培地により誘発される。本明細書に記載の本発明の二重特異性分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物による腫瘍細胞の増殖阻害のＩＣ50値と比較したとき、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又は約１０００倍以下のＩＣ50値にて、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準的な方法及び本明細書に記載の方法を用いて測定できる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ−Ｍｅｔに結合する。
二重特異性分子中のパラトープ残基は、突然変異誘発研究で同定できるか、又はＦＮ３ドメイン及びＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔの共結晶構造から同定することができる。突然変異誘発研究では、例えば、アラニンスキャニング法を利用してもよく、得られた変異体のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔへの結合について、標準的な方法により、試験を行ってもよい。典型的に、パラトープ残基は、突然変異が誘発されたときの残基であり、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔへの結合の低減又は消失に伴い変異体が発生する。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応するアミノ酸残基位置にて置換を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるときに、野生型Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２と比較すると、ＥＧＦＲの結合が少なくとも１００倍減少する。二重特異性分子ＥＣＢ１、ＥＣＢ２、ＥＣＢ３、ＥＣＢ４、ＥＣＢ５、ＥＣＢ６、ＥＣＢ７、ＥＣＢ１５、ＥＣＢ１７、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３７、ＥＣＢ９４、ＥＣＢ９５、ＥＣＢ９６、ＥＣＢ９７、ＥＣＢ９１、ＥＣＢ１８、ＥＣＢ２８、ＥＣＢ３８、ＥＣＢ３９、ＥＣＢ１６８及びＥＣＢ１７６は、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する残基位置にて、Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｖ及びＧを有し、これらの残基により、ＥＧＦＲと結合することが予測される。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応するアミノ酸残基位置にて置換を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるとき、野生型Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３と比較すると、ｃ−Ｍｅｔ結合を少なくとも１００倍消失又は低減する。二重特異性分子ＥＣＢ２、ＥＣＢ５、ＥＣＢ１５、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３８及びＥＣＢ３９は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する残基位置にて、Ｒ、Ｆ、Ｍ及びＩを有し、これらの残基によりｃ−Ｍｅｔに結合すると予測される。
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、
該第１のＦＮ３ドメインは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
該第２のＦＮ３ドメインは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含む。
本明細書に記載のその他のいくつかの実施形態では、二重特異性分子は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のＦＮ３ドメインを含み、
配列番号１８２及び１８３では、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
本明細書に記載のその他のいくつかの実施形態では、二重特異性分子は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を含むｃ−Ｍｅｔに結合する第２のＦＮ３ドメインを含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含む。
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５、１７０〜１７８又は１９０〜１９３で示すアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲの自己リン酸化の阻害などの、その機能的特性に関連する特定の構造特性を含んでおり、即ち、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）（ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである）を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のＦＮ３ドメインのＦＧループなどである。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約８×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を阻害し、ここで該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発されるか、
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか；又は
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ｃ−Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３又は実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
別の実施形態においては、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約４．２×１０-9Ｍ〜８×１０-7ＭのＩＣ50にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約２．４×１０-8Ｍ〜約８．４×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約２．３×１０-8Ｍ〜約９．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発されるか、
約２×１０-10Ｍ〜約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか、又は
約１×１０-9Ｍ〜約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ｃ−Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３又は実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインであって、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）を含み、ここで、
Ｘ1は、Ｄであり；
Ｘ2は、Ｄであり；
Ｘ3は、Ｐであり；
Ｘ4は、存在せず；
Ｘ5は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ6は、Ａであり；
Ｘ7は、Ｆであり；
Ｘ8は、Ｙであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと；
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインであって、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗであり；
Ｘ11は、Ｆであり；
Ｘ12は、Ｆであり；
Ｘ13は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ14は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｖであり；
Ｘ18は、Ｎであり；
Ｘ19は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉであり；
Ｘ23は、Ｐである、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと、を含む。
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、配列番号５７、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８又は１９０〜１９３に示す配列を有する分子である。
本明細書に記載の本発明の二重特異性分子は、上述のとおり、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する第１のＦＮ３ドメイン及び／又は第２のＦＮ３ドメインにおける１つ以上の残基位置にて、及び２９位にて、置換を更に含み得る。例示的な置換は、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ及びＥ８６Ｉ及びＤ２９Ｅ（ナンバリングは、配列番号１に従う）である。当業者であれば、後に述べるように、側鎖内で関連付けられるアミノ酸ファミリー内のアミノ酸など、その他のアミノ酸を置換に使用できることは、理解するであろう。
生成した変異体については、その安定性及び本明細書の方法を用いたＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔへの結合に関して試験を行うことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲと特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインと、を含み、該第１のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号：１８７）を含み、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩであり、
第２のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）を含み；
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む第１のＦＮ３ドメインを含み、少なくとも８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一である、アミノ酸配列を含む第２のＦＮ３ドメインを含む。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して、特異的親和性となるように調節して、腫瘍集積を最大化してもよい。
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメイン及び該第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインされたライブラリから単離される、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法を用いた本発明のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの共有結合により、生成することができる。ＦＮ３ドメインは、リンカー、例えばポリグリシン、グリシンとセリン又はアラニンとプロリンを含有するリンカーを介して連結させることもできる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2、（配列番号７８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。ポリペプチドを新規の結合融合ポリペプチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリンカーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３ドメインのＣ末端から第２のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ末端から第１のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、共に連結されてもよい。いずれのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインも、共有結合により、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結されてよい。例示的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７、１９４〜２１１に示されたアミノ酸配列を有するドメインであり、例示的なｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９、１１１〜１１４又は２１２〜２２３に示されたアミノ酸配列を有するドメインである。二重特異性分子と結合したＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインは、更に、Ｎ末端にて、反応開始剤メチオニン（Ｍｅｔ）を含んでもよい。
本明細書に記載されているような二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子における置換は、その結果得られた変異体において、親分子と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する同様の感度及び効力が保持される限り、行われてもよい。例示的な一時的変異は、例えば、それらの親分子に類似の特徴を有する変異体となる同類置換である。同類置換とは、側鎖で関連したアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）電荷を持たない極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、の４つのファミリーに分類され得る。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として共に分類される場合もある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、以下のように分類され得る；（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニンヒスチジン）；（３）脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリン及びスレオニンは、任意選択的に、脂肪族水酸基として別に、分類される）；（４）芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミドアミノ酸（アスパラギン、グルタミン）；（６）硫黄含有アミノ酸（システイン及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。非同類置換は、異なる分類のアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に行って、二重特異性分子の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はそのフラグメントのアミノ酸配列における変化が機能的相同体をもたらすかどうかは、本明細書に記載のアッセイを用いて、改変されていないポリペプチド又はフラグメントと同様のやり方で、この改変ポリペプチド又はフラグメントによる反応性を評価することによって、容易に評価され得る。１箇所以上で置換が生じたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり方で容易に試験することができる。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば、原子価を増加させることで、結合している標的分子の結合活性を増大させる手段として、単量体又は二量体として生成され得る。多量体は、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔのいずれかに対して少なくとも二重特異性である少なくとも３つの独立したＦＮ３ドメインを含む分子を形成するために、例えば、周知の方法を用いて、アミノ酸リンカーを含めることによって、１つ以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、１つ以上のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを連結することによって、作製してもよい。
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５、１７０〜１７９又は１９０〜１９３で示すアミノ酸配列を含む、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
半減期延長部分
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は単一特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合による相互作用を介して他のサブユニットを組み込むことができる。本発明の一態様では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン−結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにそのフラグメント及び類縁体並びにＦｃ領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号１１７に示されており、例示的なアルブミン変異体は、配列番号１８９に示す。
抗体定常領域の全部又は一部分を、本発明の分子に付着させて、抗体様特性、特に、Ｆｃ領域と関連した特性（例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などのＦｃエフェクター機能）を付与してもよく、また、これらの活性に関与するＦｃ中の残基を修飾することによって更に修飾することもできる（概観のために、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５〜６９１，２００９を参照されたい）。
ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るために本発明の二重特異性分子に組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質スカフォールドコード配列との直接融合であってもよく、標準的なクローニング及び発現法によって生成できる。別の方法としては、周知の化学カップリング法を使用して、この部分を組換えにより生成された本発明の分子に付着させてもよい。
例えば周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ末端に組み込み、ＰＥＧ基（pegyl group）をシステインに付着させることによって、ＰＥＧ部分を本発明の二重特異性又は単一特異性分子に付加してもよい。Ｃ末端システインを有する例示的な二重特異性分子としては、配列番号１７０〜１７８に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
追加部分を組み込まれている本明細書に記載の本発明の単一特異性及び二重特異性分子は、いくつかの周知のアッセイによって、機能を比較してもよい。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメインの変異体の取り込みによる単一特異性及び／又は二重特異性分子の変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ又はＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶型を使用したＦｃ受容体結合アッセイで、又は例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するか、又はインビボモデル中での本発明の分子の薬物動態的特性を評価する、周知の細胞ベース分析評価を使用して、分析できる。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、単離したポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、若しくは、転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ配列の一部として、ＥＧＦＲ−結合又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする核酸類及び組成物又はこれらの定方向突然変異原（directed mutagen）の原核、真核、線状ファージの発現、分泌及び／又は提示と適合性のあるベクターを提供する。特定の例示的なポリヌクレオチドは、本明細書にて開示されるが、所与の発現システムにおける、遺伝暗号の縮退又はコドン選択を考慮した、本発明のＥＧＦＲ−結合ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする、その他のポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。
本発明は、また、配列番号１８〜２９、１０７又は１１０、１２２〜１３７又は１９４〜２１１のアミノ酸配列を有する、ＥＧＦＲに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。
本発明は、また、配列番号３２〜４９、１１１〜１１４又は２１２〜２２３のアミノ酸配列を有する、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。
本発明は、また、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５、１７０〜１７９又は１９０〜１９３のアミノ酸配列を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、また、配列番号９７、９８、１０３、１０４、１１５、１１６又は１６６〜１６９のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により製造され得、完全一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。別の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを行うなどの他の手法により製造され得る。特定の既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、シス配列促進ＲｅｐＡ結合など、少なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質の精製又は検出を促進するために、例えば、マーカー又はヒスチジンタグ若しくはＨＡタグなどのタグ配列をコードする追加のアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。
本発明は、また、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってもよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列因子を含む発現ベクターであってもよい。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の単一特異性ＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意選択的に、当該技術分野において周知のとおり、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって、製造することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７〜２００１）を参照されたい。
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導物質、不死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然又は改変大腸菌種、クレブシエラ種、又はシュードモナス種の菌株などの原核細胞又は生物、から選択できる。
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメイン又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子を作製する方法であって、本発明の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメイン若しくは単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子が発現するような条件下で培養することと、該ドメイン又は該分子を精製することと、を含む。
ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメイン又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法、例えば、プロテインＡ精製法、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーとレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、組換え細胞培養物から精製できる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子及びＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、ヒトの疾患症状又は細胞、組織、器官、流体又は一般に、宿主内での特定の病理の診断、モニター、調整、治療、軽減、発生の予防の補助、減少を行うことができる。本発明の方法を用いて任意の分類に属する患畜を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
本発明の一態様は、細胞を、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに接触させることを含む、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現させる細胞の成長又は増殖を阻害する方法である。
本発明の別の態様は、被験体において、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞又は癌細胞の増殖又は転移を阻害する方法であって、この方法は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞又は癌細胞の増殖又は転移が阻害されるように、有効量の本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを被験体へ投与することを含む。
本発明の別の態様は、治療的に有効な量の本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、癌の治療を行うために十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する方法である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ若しくは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化又は産生により特徴付けられる任意の疾患又は障害、又は、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔの発現に関連する障害の治療に使用してもよく、これらは、悪性腫瘍又は癌に関係がある場合もない場合もあり、また、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ若しくは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化及び／又は産生は、疾患又は障害を有する又は素因になる被験体の細胞又は組織に発生する。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に使用できる。本発明の二重特異性分子によって、治療を適用できる癌としては、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを過剰発現させる癌、並びにＥＧＦＲ活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅又はリガンド媒介ＥＧＦＲ活性化など）及びｃ−Ｍｅｔ活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ｃ−Ｍｅｔ活性化突然変異、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅又はリガンド媒介ｃ−Ｍｅｔ活性化など）に関連する癌が挙げられる。
癌と関連付けることができる例示的なＥＧＦＲ活性化突然変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、ＥＧＦＲの少なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変異、逆位又は遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子の任意の部分又はＥＧＦＲ遺伝子に関連付けられる制御領域の任意の部分に位置していてもよく、エクソン１８、１９、２０若しくは２１中の突然変異又はキナーゼドメイン中の突然変異が挙げられる。例示的な活性化ＥＧＦＲ突然変異としては、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍ置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６〜Ａ７６７間のＡｌａの挿入、Ｓ７６８〜Ｖ７６９間のＳＶＡ（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ）の挿入及びＰ７７２〜Ｈ７７３間のＮＳ（Ａｓｎ、Ｓｅｒ）の挿入が挙げられる。ＥＧＦＲ活性化突然変異の他の例は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号を参照されたい）。受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、並びにＥｒｂＢ媒介シグナル伝達に関与しているシグナル伝達分子などの、ＥＧＦＲ及び他のＥｒｂＢ受容体に関する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１〜３５４，２００５を参照されたい）。
例示的なｃ−Ｍｅｔ活性化突然変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変異、逆位又は遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の任意の位置、又は遺伝子に関連付けられる調節領域にあり得、ｃ−Ｍｅｔキナーゼドメイン内での突然変異などがある。例示的なｃ−Ｍｅｔ活性化突然変異は、残基位置Ｎ３７５、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｒ１７５、Ｖ１３６、Ｌ２２９、Ｓ３２３、Ｒ９８８、Ｓ１０５８／Ｔ１０１０及びＥ１６８での突然変異である。ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ又は遺伝子増幅を検出する方法は、周知である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによって、治療を受けることができる例示的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）が挙げられる。
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする本発明のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる治療を適用できる癌には、ｃ−Ｍｅｔを過剰発現するものも含まれる。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及び胸腺癌などが挙げられる。
ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングする本発明のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のＦＮ３ドメインによる治療を適用できる癌には、ＥＧＦＲ又は変異型を過剰発現するものも含まれる。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及び胸腺癌などが挙げられる。
本明細書に記載されたいくつかの方法においては、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、１つ以上のＥＧＦＲ阻害物質での治療に対して耐性を示す又は耐性を得た、癌を有する被験体の治療を行ってよい。癌に耐性を付与し得る例示的なＥＧＦＲ阻害剤としては、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標））、マツズマブ、ニモツズマブ、低分子ＥＧＦＲ阻害剤タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）、イレッサ（ゲフィチニブ）、ＥＫＢ−５６９（ペリチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ｐａｎ−ＥｒｂＢ及び他の受容体型チロシンキナーゼ阻害剤ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、ザクチマ（商標）、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴ ＴＫＩ）、ＰＦ００２９９８０４（ダコミチニブ、不可逆的ｐａｎ−ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＣＩ−１０３３（不可逆的Ｐａｎ−ｅｒｂＢ ＴＫＩ）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、不可逆的ｐａｎ−ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＡＶ−４１２（二重ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２阻害剤）ＥＸＥＬ−７６４７（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＧＥＶＧＲ及びＥｐｈＢ４阻害剤）、ＣＯ−１６８６（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ＡＺＤ９２９１（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、及びＨＫＩ−２７２（ネラチニブ、不可逆性ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９２９１及び／又はセツキシマブを用いた治療への耐性を示す又は耐性を得た癌の治療に使用してもよい。使用できる例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７、１９４〜２１１、３２〜４９、１１１〜１１４、２１２〜２２３、５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５、１７０〜１７８又は１９０〜１９３に示すアミノ酸配列を有する、本明細書に記載のものである。
本発明の別の態様は、治療的に有効な量の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインを癌の治療に十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する方法であり、該被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６（ＣＡＳ番号：１３７４６４０−７０−６）、ＡＺＤ９２９１又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示す又は耐性を得ている。
様々な定性的及び／又は定量的方法を使用して、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に対して、患者が耐性を示しているかどうか、耐性を発達させているかどうか、又は耐性が発達しやすいかどうかなどを判断してもよい。ＥＧＦＲ阻害剤への耐性に関連があり得る症状としては、例えば、患者の健康状態の低下又は横ばい状態、腫瘍の大きさの増加、腫瘍増殖低下の抑制又は減速、及び／又は１つの部位から他の器官、組織又は細胞への、身体内における癌細胞の伝播が挙げられる。また、食欲不振、認知機能障害、鬱病、呼吸困難、疲労、ホルモン障害、好中球減少、疼痛、末梢神経障害と性的機能不全など、癌に関連する種々の症状の再発又は悪化は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験体が耐性を発達させたか、又は発達させやすいこと示し得る。癌に関連する症状は、癌の種類によって異なる。例えば、子宮頸癌に伴う症状としては、異常出血、異常な大量の膣分泌物、正常な月経周期に関連がない骨盤痛、膀胱痛又は排尿時の痛み及び規則的な月経期間での出血、性交、腟洗浄又は内診後の出血を挙げることができる。肺癌に伴う症状としては、持続性の咳、喀血、息切れ、喘鳴、胸痛、食欲不振、努力することのない体重減少、及び疲労を挙げることができる。肝臓癌の症状としては、食欲及び体重の低下、腹痛（特に腹部の上部右部におけるもの、背部と肩に広がる場合もある）、悪心及び嘔吐、全身の虚弱と疲労、肝臓肥大、腹部膨満（腹水）、並びに皮膚及び白目の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学分野の当業者は、特定の癌種に伴う症状を容易に識別し得る。
ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を被験体が発達したか否かを判断するその他の方法としては、癌細胞中におけるＥＧＦＲリン酸化、ＥＲＫ１／２リン酸化及び／又はＡＫＴリン酸化を調べることが挙げられ、ここで、リン酸化の増加は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験体が耐性を発達させたか、又は発達させやすいことを示し得る。ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２及び／又はＡＫＴのリン酸化を判定する方法は、周知であり、かつ、本明細書に記述されている。ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性が発達した被験体の識別には、例えば、ＨＧＦ循環レベルの上昇、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子活性化変異又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅に起因するｃ−Ｍｅｔ発現レベルの上昇又はｃ−Ｍｅｔ活性の上昇の検出を含み得る。
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを患者に投与することを含む、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅を有するＮＳＣＬＣ腫瘍又は腫瘍転移を有する患者における、ＮＳＣＬＣを治療する方法である。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、扁平上皮細胞癌、腺癌及び大細胞癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を行うことができる。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣの細胞は、上皮表現型を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、１つ以上のＥＧＦＲ阻害剤での治療に対する耐性を獲得している。
ＮＳＣＬＣでは、ＥＧＦＲ遺伝子中の特定の突然変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）に対する高い応答率（７０〜８０％）と関連している。エクソン１９における５個のアミノ酸欠失又はＥＧＦＲにおけるＬ８５８Ｒの点変異は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの感応性に関連がある（Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｇｏｔｏｈ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １６：７７１〜７８１，２０１２）。これらの突然変異により、ＥＧＦＲキナーゼ活性のリガンド非依存性活性化がもたらされる。ＥＧＦＲ活性突然変異は、ＮＳＣＬＣ患者の１０〜３０％に発生し、東アジア人、女性、非喫煙者及び腺癌組織像を有する患者において、有意によく見られる（Ｊａｎｎｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（１４ Ｓｕｐｐｌ）：４４１６ｓ〜４４２０ｓ，２００６）。また、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療後の応答と強く相関している（Ｃａｐｐｕｚｚｏら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９７：６４３〜５５，２００５）。
ＥＧＦＲ突然変異を有する多くのＮＳＣＬＣ患者は、初期に、ＥＧＦＲ ＴＫＩ療法に応答を示すが、事実上、全てが、持続的反応を妨げる耐性を獲得する。患者の５０〜６０％は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン（Ｔ７９０Ｍ）の第２位での点変異により、耐性を獲得する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に対して耐性を示すようになる全腫瘍のほぼ６０％がｃ−Ｍｅｔの発現の増加、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又はその唯一の既知のリガンドであるＨＧＦの増加を示す（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８８，２０１０）。
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、ｃ−Ｍｅｔ活性化突然変異又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある。
いくつかの実施形態では、前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６〜Ａ７６７間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８〜Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２〜Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である。
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ、若しくは残基Ｅ７４６〜Ａ７５０（ｄｅｌ（Ｅ７４６、Ａ７５０））、ＥＧＦＲ増幅又はｃ−Ｍｅｔ増幅と関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、野生型ＥＧＦＲ及び野生型ｃ−Ｍｅｔと関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、野生型ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ増幅と関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ突然変異並びに野生型ｃ−Ｍｅｔと関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲＬ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及び野生型ｃ−Ｍｅｔと関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲＬ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及びｃ−Ｍｅｔ増幅と関連がある。
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）、ＥＧＦＲ増幅及びｃ−Ｍｅｔ増幅と関連がある。
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ突然変異並びに野生型ｃ−Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ増幅及び野生型ｃ−Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ増幅及びｃ−Ｍｅｔ増幅と関連があるＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及び野生型ｃ−Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及びｃ−Ｍｅｔ増幅と関連があるＮＳＣＬＣを有する。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔの増幅は、例えば、サザンブロット法、ＦＩＳＨ法、又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）法によって、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子のコピー数を測定することなどの、標準的な方法によって評価することができる。
用語「治療する」又は「治療」は、治療的処置及び保護的又は予防的措置のいずれをも指し、その目的は、癌の成長又は伝播など、望ましくない生理学的変化又は障害を予防する又は遅らせる（軽減する）ことである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、以下に限定されないが、症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患の安定（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、病態の改善又は緩和、及び寛解（部分、又は、全体）などが、検出可能か又は検出不可能であるかにかかわらず、含まれる。「治療」は、また、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。治療が必要な対象としては、これらの状態若しくは障害をすでに有する対象、及びこれらの状態若しくは障害を有する傾向にある対象、又はこれらの状態若しくは障害を予防すべき対象が挙げられる。
「治療的に有効な量」は、望む治療結果を達成するために、必要な用量、時間で、効果的な量を意味する。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的に有効な量は、病態、年齢、性別及び個体重量、並びに個体において、所望の応答を引き出す本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの性能などの因子によって異なり得る。耐性と関連して、減少又は低下し得る有効なＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ治療を示すものの例としては、患者の健康状態の改善、腫瘍の大きさの減少又は収縮、腫瘍増殖の抑制又は減速、及び／又は身体内の他の位置への癌細胞転移の欠如が挙げられる。
投与／医薬組成物
本発明は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び製薬上許容できる担体である医薬組成物を提供する。治療に使用するために、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、製薬上許容できる担体中において、有効成分として有効量の前記ドメイン又は分子を含む医薬組成物として、調製することができる。「担体」という用語は、活性化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルのことを指す。かかるビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件におおよそ近づけるために必要とされる製薬上許容できる補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含むことができる。かかる医薬製剤中の本発明の分子の濃度は広範囲にわたって様々であってよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％〜１５又は２０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法にしたがって、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方法は、宿主に薬剤を送達する、任意の好適な投与法であってよく、タブレット、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子内の製剤；シリンジ、埋め込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに収容された製剤を使用した；又は当該技術分野で周知の、当業者には理解される他の手段を使用した、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺；経粘膜的（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；などがある。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含有するように調製することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、静脈内（ＩＶ）注入、ボーラス注入、筋肉内又は皮下若しくは腹膜腔注入などの非経口注入など、任意の好適な経路によって、患者に投与され得る。ＩＶ注入は、１５分間ほどで投与し得るが、多くの場合、３０分間、６０分間、９０分間、又は２時間若しくは３時間、投与することもできる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、疾患部位（例えば、腫瘍自体）に直接注入してもよい。癌を有する患者への投与量は、治療対象の疾患を軽減する又は少なくとも一部、阻止するために十分な量であり（「治療的に有効な量」）、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよいが、更に多量、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。固定単位用量（例えば、５０、１００、２００、５００若しくは１０００ｍｇ）を投与してもよく、又はこの用量は、患者の表面積に基づいて、例えば、４００、３００、２５０、２００若しくは１００ｍｇ／ｍ2であってもよい。癌治療には、通常、１〜８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８回）を投与してもよいが、しかし、１０、１２、２０回以上の用量を投与してもよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７週、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又はそれ以上経過後、反復して行ってもよい。長期投与と同様に、治療コースを繰返し行うことも可能である。反復投与は、同じ用量で行っても、異なる用量で行ってもよい。
例えば、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの静脈内注射用医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与するために、滅菌リンガー溶液約２００ｍＬ、及び二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ抗体約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１６００ｍｇ又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇを含むように、構成してもよい。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、保管のために凍結乾燥され、かつ、使用前に好適な担体中で再構成されてもよい。この技術は従来のタンパクの調製において有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、被験体に単回投与してもよく、又は、例えば、１日、２日、３日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７週、２ヵ月又は３ヵ月経過後、反復投与してもよい。反復投与は、同じ用量で、又は異なる用量で行ってもよい。投与は１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回以上反復して行うことができる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、第２の治療薬と併用して、同時に、逐次的に又は別途に投与されてもよい。第２の治療薬は、化学療法剤、抗血管新生阻害剤又は細胞毒性薬であってもよい。癌治療に使用するとき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、外科手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせなど、従来の癌治療と組み合わせて使用することもできる。本発明のＦＮ３ドメインと組み合わせて使用できる例示的な薬剤は、アンタゴニストＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦ及びイレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）などのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、同業者に既知の化学療法剤又は他の抗癌治療剤のいずれか１つ以上と共に投与してもよい。化学療法剤は、癌治療に有用な化学物質であり、増殖阻害剤又は他の細胞毒性剤が挙げられ、また、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤が挙げられる。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる；アルキル化剤（例えばチオテパとシクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）代謝拮抗薬、例えばメトトレキセート及び５−ＦＵ；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン）；アンドロゲン（例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクォン；エフロールニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類又はタキサンファミリのメンバー、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））及びその類似体；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えば、シスプラチンとカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤及び／又は血管形成阻害剤、例えば、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（商標））、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標））、セディラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（登録商標））、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、レストールチニブ（ＣＥＰ−７０１）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、ＢＩＢＷ ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）など、及び上記のいずれかの製薬上許容できる塩、酸又は誘導体。この定義にも含まれるものとしては、腫瘍上でのホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗エストロゲンなどの抗ホルモン剤が挙げられ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンとトレミフェン（フェアストン（登録商標）；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドとゴセレリン；上記のいずれかの製薬上許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。Ｗｉｅｍａｎｎら、１９８５，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅｔ ａＬ，ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １０，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，に開示されているような他の従来の細胞毒性化学物質は、また、本発明の方法に適用できる。
前記二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用できる例示的な薬剤としては、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）、タルセバ（エルロチニブ）などのチロシンキナーゼ阻害剤及び標的抗癌治療剤及びＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＶＥＧＦなどの他のアンタゴニストが挙げられる。例示的なＨＥＲ２アンタゴニストとしては、ＣＰ−７２４−７１４、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、オムニターグ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）（商標）（ペルツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、及びＧＷ−２８２９７４が挙げられる。例示的なＨＥＲ３アンタゴニストとしては、抗−Ｈｅｒ３抗体が挙げられる（例えば、米国特許第２００４／０１９７３３２号を参照されたい）。例示的なＨＥＲ４アンタゴニストとしては、抗−ＨＥＲ４ ｓｉＲＮＡが挙げられる（例えば、Ｍａａｔｔａら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １７：６７〜７９，２００６を参照されたい）。例示的なＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマブ（アバスチン（商標））である。
低分子を本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用するとき、典型的に、より頻回に、好ましくは、１日１回投与してもよいが、２、３，４回／日以上であってもよく、２日毎、毎週、又他の何らかの間隔毎に投与してもよい。多くの場合、低分子薬剤は、経口投与されるが、例えば、例えば、ＩＶ注入又はボーラス注入又は皮下投与又は筋肉内投与などの非経口的投与も可能である。低分子薬剤の用量は、通常、１０〜１０００ｍｇ、又は約１００、１５０、２００若しくは２５０ｍｇである。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、第２の治療薬と組み合わせて投与するとき、その組み合わせは、従来の任意の時間枠を超えて行われてもよい。例えば、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、同じ日に患者に投与されてもよく、また同じ静脈内注射において投与されてもよい。しかし、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、隔日、隔週及び２週間毎又は隔月などで患者に投与されてもよい。いくつかの方法では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、治療対象の患者において、検出可能なレベルで（例えば血清中に）同時に存在する時間内にて、十分に近接して投与される。いくつかの方法では、任意の期間にわたり、いくつかの投与回数からなる本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの全治療過程に続いて、又は、それに先立って、いくつかの投与回数からなる第２の治療薬の治療過程が行われる。いくつかの方法では、最初に投与した第２の治療薬に対して、患者が耐性を有するか、又は耐性を発達させた場合、二番目に本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが投与される治療が開始される。患者は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬のいずれか１つ又は双方による単回治療過程又は複数回治療過程を受けてよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与と、第２の治療薬の投与との間に、１日、２日又は数日又は数週間の回復期間を使用してもよい。第２の治療薬の好適な投与計画がすでに構築されている場合、投与計画は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて、その計画を使用してもよい。例えば、タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）は、１日１回、１００ｍｇ又は１５０ｍｇピルとして投与され、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）は、２５０ｍｇ錠剤として毎日投与される。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、任意選択的に、第２の治療薬と組み合わせて、外照射療法、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）及びガンマナイフ、サイバーナイフ、リニアックなどの任意の形態の放射線外科手術、及び組織内照射（例えば、放射線シードインプラント、ＧｌｉａＳｉｔｅ ｂａｌｌｏｏｎ）などの任意の形態の放射線、並びに／又は外科手術などと合わせて投与してもよい。放射線治療との併用は、特に、頭頸部癌及び脳腫瘍に適切であり得る。
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
実施例１．Ｔｅｎｃｏｎライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン−Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通配列から設計された免疫グロブリン様スカフォールドである、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのβストランドを接続する６つの表面露出ループを示す。これらのループ、又は各ループ内の選択された残基は、特定の標的と結合する新規分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために、ランダム化できる。
Ｔｅｎｃｏｎ：
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号１）
ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみランダム化するように設計されたライブラリである、ＴＣＬ１は、ｃｉｓ−ディスプレイ系で使用するために構築された（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）。この系では、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓ−エレメント及びｏｒｉエレメントの一本鎖ＤＮＡ組み込み配列を作製する。インビトロ転写／翻訳系での発現時に、コードされているＤＮＡに、ｃｉｓにおいて結合するＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の錯体が生成される。次に、標的分子に結合する錯体は、単離され、前述のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、増幅される。
ｃｉｓ−ディスプレイで使用するためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、連続的に複数回ＰＣＲを行い、最終的な線状二本鎖ＤＮＡ分子の２つの半体を生成することによって達成され、該ＤＮＡの５’フラグメントは、プロモーター及びＴｅｎｃｏｎ配列を含み、３’フラグメントには、ｒｅｐＡ遺伝子並びにｃｉｓ−及びｏｒｉ−エレメントを含む。これらの各２つの半体は、全体構造を作製するために消化を制限することによって結合される。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号８６）のみで、ランダムアミノ酸を組み込むように設計された。このライブラリの構造内にＮＮＳコドンを使用した結果、２０の全アミノ酸及び１つの終止コドンをＦＧループ内に取り込むことができた。ＴＣＬ１ライブラリは、それぞれが、更に多様性を増大させるために、長さ７〜１２の残基を有する異なるランダム化ＦＧループを有する、６つのサブライブラリを別途に包含する。Ｔｅｎｃｏｎベースのライブラリの設計を表２に示す。
*ＴＡＰＤＡＡＦＤ：配列番号１の残基２２〜２８
**ＫＧＧＨＲＳＮ：配列番号８６
Ｘは、ＮＮＳコドンによりコードされたアミノ酸の変性を指す。
＃は、本文に記述されている「設計されたアミノ酸分布」を指す。
ＴＣＬ１ライブラリを構築するために、連続的に複数回ＰＣＲを行い、Ｔａｃプロモーターが付加され、ＦＧループに変性を組み込み、最終的なアセンブリのために、必要な制限酵素部位を加えた。第１に、プロモーター配列及びＦＧループのＴｅｎｃｏｎ配列５’を含むＤＮＡ配列は、２工程で、ＰＣＲによって作製された。全Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子配列に対応するＤＮＡは、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５’ｔｏＦＧ（配列番号３）と共に、ＰＣＲテンプレートとして、使用した。この反応から得られたＰＣＲ産物は、プライマー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴｃ５’ｔｏＦＧを用いて、次の回のＰＣＲ増幅を行うために、テンプレートとして使用し、５’及びプロモーター配列を完全にＴｅｎｃｏｎに加えた。次に、縮重ヌクレオチドを含む、順方向プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）、及び逆方向プライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８（配列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配列番号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）を用い、第１工程で作製されたＤＮＡ産物を増幅することによって、多様性をＦＧループ内に導入した。各サブライブラリに対して、１００μＬ ＰＣＲ反応を少なくとも８回行い、ＰＣＲサイクルを最小化し、ライブラリの多様性を最大化させた。少なくとも５μｇの、このＰＣＲ産物に対して、ゲル精製を行い、プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）を用いた、次のＰＣＲ工程で使用し、その結果、６ｘＨｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限酵素部位がＴｅｎｃｏｎ配列の３’末端部に結合された。このＰＣＲ反応は、１５ＰＣＲサイクルのみ、少なくとも５００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いて行った。得られたＰＣＲ産物は、ゲル精製を行い、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムによって精製した。
このライブラリの３’フラグメントは、ｒｅｐＡ遺伝子及びｃｉｓ−及びｏｒｉ−エレメントのコード領域、ＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位などの、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、このＤＮＡフラグメントを含有するプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１３順方向及びＭ１３逆方向プライマーにより実施した。得られたＰＣＲ産物は、ＰｓｐＯＭＩにより一晩消化させ、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５’部位をｒｅｐＡ遺伝子を含む３’ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌの５’ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で、同じモル量の３’ｒｅｐＡ ＤＮＡにライゲートさせた。３７℃で一晩ライゲーションさせた後、ライゲートさせたＤＮＡのごく一部をゲル上で泳動させて、ライゲーション効率を確認した。ライゲートさせたライブラリ産物を１２のＰＣＲ増幅に分割し、プライマー対、ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）、を用いて、１２サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＴＣＬ１ライブラリの各サブライブラリのＤＮＡ収率は、３２〜３４μｇの範囲であった。
ライブラリの質を評価するために、作業ライブラリのごく一部をプライマーＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号：１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号：１６）により増幅し、リガーゼ非依存クローン化を介して、改変ｐＥＴベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡは、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ランダムに選択した９６個のコロニーをＴ７プロモータープライマーを用いて、配列決定した。重複した配列は、検出されなかった。全体的に、約７０〜８５％のクローンが、フレームシフト突然変異のない、完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を有していた。終止コドンとクローンを除いた機能シーケンス率は５９％〜８０％であった。
ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣループ及びＦＧループのいずれもランダム化され、各位置でのアミノ酸の分布を厳密に管理したＴＣＬ２ライブラリが構築された。表３には、ＴＣＬ２ライブラリ内での所望のループ位置における、アミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布には、２つの目的がある。第１に、このライブラリは、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析に基づき、かつ／又は相同モデリングから、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性に、構造上重要であることが予測された残基に対してバイアスがある点である。例えば、位置２９は、疎水性アミノ酸のサブセットのみであるように固定された。これは、この残基が、Ｔｅｎｃｏｎフォールドの疎水性コアに埋め込まれた（buried）変化したためである。第２層の設計には、高親和性結合剤を効率的に作製するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３内に優先的に見られる残基に対するアミノ酸分布のバイアスが含まれる（Ｂｉｒｔａｌａｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８〜２８，２００８；Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６〜８４，２００７）。この目標値に対して、表３の「設計された分布」は、以下の分布を示す。アラニン６％、アルギニン６％、アスパラギン３．９％、アスパラギン酸７．５％、グルタミン酸２．５％、グルタミン１．５％、グリシン１５％、ヒスチジン２．３％、イソロイシン２．５％、ロイシン５％、リジン１．５％、フェニルアラニン２．５％、プロリン４％、セリン１０％、スレオニン４．５％、トリプトファン４％、チロシン１７．３％、バリン４％。この分布には、メチオニン、システイン及び終止コドンは含まれない。
*残基のナンバリングは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づく。
ＴＣＬ２ライブラリの５’フラグメントは、プロモーター及びＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）のコード領域を包含し、ライブラリプール（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として、化学的合成された。このＤＮＡプールには、少なくとも１×１０11の異なるメンバーが包含された。フラグメントの端部では、ＢｓａＩ制限酵素部位がＲｅｐＡへのライゲーションのため、設計に含まれた。
このライブラリの３’フラグメントは、６ｘＨｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子及びｃｉｓ−エレメントのコード領域などの、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮＡ配列である。このＤＮＡは、既存のＤＮＡテンプレート（上述）及びプライマーＬＳ１００８（配列番号１７）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ反応によって調製した。完全なＴＣＬ２ライブラリを組み立てるために、ＢｓａＩ−消化５’ＴｅｎｃｏｎライブラリＤＮＡ合計１μｇを同じ酵素を用いて、制限消化によって作製された３’フラグメント３．５μｇにライゲートした。一晩ライゲートした後、ＤＮＡはＱｉａｇｅｎカラムにより精製し、このＤＮＡは、吸光度２６０ｎｍで測定することによって、定量化した。ライゲートされたライブラリ産物は、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、１２サイクルのＰＣＲ反応によって増幅させた。合計７２の反応を行い、それぞれがテンプレートとして、５０ｎｇのライゲートされたＤＮＡ産物を含有していた。ＴＣＬ２ワーキングライブラリＤＮＡの全収率は、約１００μｇであった。ワーキングライブラリのごく一部は、ＴＣＬ１ライブラリに関して上述のように、サブクローン化され、配列決定された。重複した配列は、検出されなかった。約８０％の配列は、フレームシフト変異のない完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を含んでいた。
ＴＣＬ１４ライブラリの構築
頂部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び底部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、ＦＮ３ドメイン中の報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドによって分離される。ループによって形成された表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメインの２つの「側面」にある代替表面は、２つの逆並行βストランド、Ｃ及びＦβストランドとＣＤ及びＦＧループ（本明細書では、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ばれている）によって、ＦＮ３ドメインの片面に形成される。
Ｔｅｎｃｏｎの代替表面をランダム化するライブラリは、図１に示すように、Ｃ及びＦストランドの残基並びにＤ及びＦＧループの部分に露出された選択表面をランダム化することによって作製した。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較したときに、Ｅ１１Ｒ Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ変異体、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）、を使用して、ライブラリを作製した。このライブラリを構築するために使用した方法の全詳細は、特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。
実施例２．ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
Ｃｉｓ−ディスプレイを使用して、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから、ＥＧＦＲ結合ドメインを選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に融合された組換え型ヒト細胞外ＥＧＦＲドメインは、標準的な方法を用いて、ビオチン化し、パニングのために使用した（配列番号７３の全長ＥＧＦＲの残基２５〜６４５）。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）のために、ライブラリＤＮＡ ２〜６μｇを、全アミノ酸０．１ｍＭ、１Ｘ Ｓ３０プレミックス成分及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μＬ、合計量１００μＬを用いてインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキング溶液４５０μＬ（２％ウシ血清アルブミン、ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ １００μｇ／ｍＬ及びヘパリン１ｍｇ／ｍＬを加えたＰＢＳ ｐＨ ７．４）を添加し、その反応物を氷上で１５分間インキュベートした。ＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ錯体は、ＥＧＦＲ対ＥＧＦのモル比１：１及び１０：１で、ブロッキング溶液中、室温にて１時間、組換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチン化組換え型ＥＧＦＲ−Ｆｃを混合することによって、組み込んだ。結合させるためにブロッキングＩＴＴ反応生成物５００μＬをＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ錯体１００μＬと混合し、結合した錯体は、磁性ニュートラアビジン又はストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）を用いてプルダウン（pulled down）した後、室温で１時間インキュベートした。非結合ライブラリメンバーは、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続洗浄して除去した。洗浄後、更にパニング操作のために、１０分間、６５℃まで加熱することによって、結合錯体からＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによって増幅し、制限消化及びライゲーションによって、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントに付着させた。高親和性結合剤は、連続的に標的ＥＧＦＲ−Ｆｃ濃度を低下させることによって、各操作２００ｎＭ〜５０ｎＭで、洗浄の厳密性を増大させて単離した。４回目及び５回目では、非結合及び低結合ＦＮ３ドメインは、ＰＢＳ中において、非ビオチン化ＥＧＦＲ−Ｆｃの１０倍のモル過剰存在下で、一晩、洗浄することによって除去した。
パニング後、選択されたＦＮ３ドメインは、ｏｌｉｇｏｓ Ｔｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非依存性クローニングサイトを含むように改変されたｐＥＴベクターにサブクローン化し、標準的な分子生物学的技術を用いて、大腸菌中で、可溶性として発現させるために、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換させた。Ｃ末端ポリ−ヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、精製及び検出が可能になるように、各ＦＮ３ドメインに付加した。培養物は、温度を３０℃まで低下させて、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加する前に、１−ｍＬの９６−ウェルブロック中、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン添加２ＹＴ培地において、３７℃で、吸光度０．６〜０．８になるまで増殖させた。細胞は、遠心分離によって、約１６時間後に収集し、−２０℃で凍結した。室温で、４５分間振盪させながら、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で各ペレットをインキュベートすることによって、細胞溶解物を得た。
細胞上でＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの選択
より生理学的な場合において、異なるＦＮ３ドメインがＥＧＦＲに結合する能力を評価するために、Ａ４３１細胞に結合する能力を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）は、１細胞当たり約２×１０6個の受容体にて、ＥＧＦＲを過剰発現する。細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。ＦＮ３ドメイン発現細菌溶解物は、ＦＡＣＳ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で１，０００倍希釈し、３つのプレートで、室温にて１時間インキュベートした。細菌溶解物を除去し、細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１００に希釈した抗−ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ−Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルで、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取った。Ａ４３１細胞（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリの１３２０の粗細菌溶解物）に結合する能力に関して、細菌溶解物含有ＦＮ３ドメインをスクリーニングし、５１６の陽性クローンが同定された。ここで、結合は、バックグランドシグナルの１０倍以上であった。ＴＣＬ１４ライブラリからの３００の細菌溶解物の結合をスクリーニングし、その結果、ＥＧＦＲに結合する５８のユニークなＦＮ３ドメイン配列を得た。
細胞上でＥＧＦに対するＥＧＦＲの結合を阻害するＦＮ３ドメインの選定
ＥＧＦＲ結合の機序を更によく特徴決定するために、種々の同定ＦＮ３ドメインクローンが、ＥＧＦに競合するようにＥＧＦＲに結合する能力を、Ａ４３１細胞を用いて測定し、Ａ４３１結合アッセイスクリーニングと並行して実施した。Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、１対１，０００に希釈した細菌溶解物５０μＬ／ウェルで、３つのプレートにおいて、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｅ−３４７７）は、各ウェルに添加し、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとし、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光を読み取った。
ＦＮ３ドメインを含有する細菌溶解物を、上記のＥＧＦ競合アッセイでスクリーニングした。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからの１３２０の粗細菌溶解物をスクリーニングし、その結果、５０％超のＥＧＦ結合を阻害する４５１の陽性クローンが得られた。
同定されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの発現と及び精製
Ｈｉｓ−タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替えた。
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの凝集状態を測定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコット（１０μＬ）を、移動相（ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）中にて、流速０．３ｍＬ／分で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集状態が示されたＦＮ３ドメインは、更なる分析から除外した。
ＥＧＦＲ−Ｆｃからの選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのオフレート
選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ−３６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でＥＧＦＲ−Ｆｃへの結合において、低オフレート（ｋoff）を有するものを同定し、高親和性結合剤を選択しやすくした。０．００５％のＰＢＳを含有するＴｗｅｅｎ−２０中で、流速３０μＬ／分、チップ上での水平配向の６つの全リガンドチャネル上での、アミンカップリング（ｐＨ ５．０）を介し、５μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗−ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、直接固定化した。固定化密度は、平均約１５００応答単位（ＲＵ）であり、チャネル間で、５％未満の変動があった。ＥＧＦＲ−Ｆｃは、抗ヒトＦｃ ＩｇＧ表面上で、密度約６００ＲＵにて、縦のリガンド配向で捕捉した。試験対象のＦＮ３ドメインは全て、濃度１μＭに正規化し、水平配向における結合の試験を行った。ＦＮ３ドメインには、６つ全ての検体チャネルを使用して、スクリーニング能力を最大化した。解離フェーズは、１０分間、１００μＬ／分の流速にてモニターした。中間スポット結合シグナルは、基準として使用し、検体と固定化ＩｇＧ表面との間の非特異的結合をモニターし、全ての結合応答から差し引いた。処理した結合データは、１対１の単純なラングミュアの結合モデルに局所的にフィッティングし、捕捉したＥＧＦＲ−Ｆｃに結合する各ＦＮ３ドメインのｋoffを抽出した。
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、Ａ４３１細胞において、単一濃度で、精製ＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインの試験を行った。ＥＧＦＲリン酸化は、ＥＧＦＲリン酸化（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてモニターした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）と共に、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を含有する、１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）の入った、透明な９６ウェル組織培養処理プレート（Ｎｕｎｃ）に、２０，０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％ ＣＯ2を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。培地は、完全に除去し、細胞は、ＦＢＳ非含有培地１００μＬ／ウェル中、５％ＣＯ2を含む増湿大気中、３７℃で、一晩、飢餓させた。次に、細胞は、濃度２μＭの予熱した（３７℃）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン含有飢餓培地１００μＬ／ウェルで、５％ ＣＯ2を含む増湿大気中、１時間、３７℃にて処理した。対照は、飢餓培地のみで処理した。最終濃度がＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍＬ及びＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン１μＭとなるように、組換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２３６−ＥＧ）１００ｎｇ／ｍＬを含む予熱済み（３７℃）飢餓培地１００μＬ／ウェルを、添加して、穏やかに混合し、３７℃にて、５％ ＣＯ2で１５分間インキュベートすることによって、細胞を刺激した。陰性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。培地を完全に除去して、細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液１００μＬ／ウェル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させながら、溶解させた。チロシン１１７３上でリン酸化されたＥＧＦＲの測定のために構成されたアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造者の指示に従って、１．５〜２時間、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロッキングした。次いで、プレートは、１Ｘトリス洗浄緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。細胞溶解物アリコット（３０μＬ／ウェル）は、アッセイプレートに移し、プレートシーリングフィルム（ＶＷＲ）で覆い、室温で、１時間振盪させながら、インキュベートした。アッセイプレートは、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄し、その後、気泡が入らないように注意して、氷冷検出抗体溶液２５μＬ／ウェル、（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに添加した。プレートは、室温で、１時間振盪させながら、インキュベートし、その後、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄した。シグナルは、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１５０μＬ／ウェル、を添加することによって検出され、製造業者によるアッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦにより刺激された陽性対照シグナル伝達の阻害率を算出した。
ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから同定された２３２のクローンについて、ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定した。これらのクローンうちの２２個は、１μＭの濃度で５０％以上のＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。発現が不完全であるか、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって多量体であると判断されたクローンを除去後、９つのクローンについて、更なる生物学的特徴決定を行った。これらのクローンのＢＣ及びＦＧループ配列は、表４に示す。９個の選択されたクローン中８個は、共通のＦＧループ配列（ＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ、配列番号９５）を有し、有意な類似性を示す領域は、ＢＣループ配列中のいくつかのクローン間で見られた。
実施例３：ＥＧＦ結合を阻害するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの特徴決定
大規模発現、精製及びエンドトキシン除去
表４に示すＦＮ３ドメインをスケールアップさせて、詳細な特徴決定のために更なる物質を提供した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変異体を含む一晩培養物を使用して、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを一晩培養物の１／８０に希釈して、新鮮培地に添加した、テリフィックブロス（Terrific broth）培地０．８Ｌに接種し、３７℃で、振盪させながらインキュベートした。６００ｎｍでの吸光度が約１．２〜１．５に到達したとき、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって培養物を誘導し、温度を３０℃まで低下させた。４時間後、遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットは、必要になるまで、−８０℃で保管された。
細胞溶解のため、解凍したペレットを、２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した、１Ｘバグバスター（登録商標）中に、ペレット１グラム当たりバグバスター（登録商標）５ｍＬの比率で、再懸濁した。溶解を、穏やかに攪拌しながら室温で１時間進行させ、その後、４℃で、５０分間、５６，０００×ｇで遠心分離した。上清を採取して、０．２μｍフィルターで濾過し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ｓクロマトグラフィーシステムを用いて、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ ７．５、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ）で事前に平衡化させた５−ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラムに仕込んだ。このカラムを、２０カラム容量分の緩衝液Ａで洗浄し、更に、６カラム容量分の１６％緩衝液Ｂ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、イミダゾール２５０ｍＭ）で洗浄した。ＦＮ３ドメインを１０カラム容量分の５０％ Ｂで溶出させ、その後、６カラム容量超の５０〜１００％Ｂからの勾配で溶出させた。ＦＮ３ドメインタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮器Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １０Ｋ ＭＷＣＯを用いて濃縮し、ＰＢＳで事前に平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に仕込む前に濾過した。サイズ排除カラムから溶出されるタンパク質モノマーのピークが保持された。
エンドトキシンは、ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いるバッチ法を用いて除去した。エンドトキシン除去前、この樹脂を、３７℃で２時間（又は４℃で一晩）、１Ｎ ＮａＯＨで前処理し、ｐＨ試験紙で計測したとき、ｐＨが約７に安定するまで、ＰＢＳで広範囲にわたり洗浄した。精製されたタンパク質は、樹脂１ｍＬに対してタンパク質１０ｍＬの比率で、Ｅｔｏｘ樹脂１ｍＬに添加する前に、０．２μｍフィルターで濾過した。エンドトキシンの樹脂への結合は、少なくとも２時間、室温で、ゆっくり回転させながら進行させた。この樹脂には、２分間、５００×ｇの遠心分離によって除去が行われ、タンパク質の上清は保持された。エンドトキシンレベルは、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）ＰＴＳ（商標）カートリッジを使用して測定し、読み取り機のＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＭＣＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）で分析した。第１のＥｔｏｘ処理後、エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超である場合、エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ以下に低下するまで、この手順を繰り返し行った。エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超であり、Ｅｔｏｘで２回連続処理した後にも安定していた場合は、残留エンドトキシンを除去するために、そのタンパク質に対して、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー条件を確立した。
選択されたＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ−Ｆｃに対する親和性（ＥＧＦＲ−Ｆｃ親和性）測定
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの組換え型ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合親和性について、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた表面プラズモン共鳴法から、更に特性を決定した。アッセイ設定（チップの調製、ＥＧＦＲ−Ｆｃの捕捉）は、上述のオフレート分析と同様であった。選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの試験は、１μＭの濃度で、３倍希釈系列で、水平方向で行った。緩衝液サンプルも注入して、ベースラインの安定性をモニターした。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの全ての濃度に対して、解離相（dissociation phase）を、流速１００μＬ／分で、３０分間、（オフレートスクリーニングから、ｋoffが約１０-2ｓ-1以上の場合）又は１時間（ｋoffが約１０-3ｓ-1以下の場合）モニターした。次の２つの参照データのセットを、応答データから減算した：１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと固定化ＩｇＧ表面間の非特異的相互作用を修正するためのスポット間シグナル、２）経時的な、捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の解離による、ベースライン変動を修正するための緩衝液チャネルシグナル。各ＦＮ３ドメインに対する全ての濃度における、処理後の結合データを、１対１の単純なラングミュアの結合モデルに全体的にフィッティングし、動力学的定数（ｋon、ｋoff）及び親和性（ＫD）定数の推定値を抽出した。表５には、各構造の動力学的定数について、２００ｐＭ〜９．６ｎＭで親和性が変化することが示されている。
細胞上での選択ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとＥＧＦＲとの結合（「Ａ４３１細胞結合アッセイ」）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５ｎＭ〜３０μＭ）を細胞（５０μＬ中）に添加し、３つのプレートで、室温にて１時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈した抗−ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ−Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取った。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＥＣ50値を算出した。表５には、各構造のＥＣ50が、２．２ｎＭ〜２０μＭ超にわたることが示されている。
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いた、細胞上でのＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５ｎＭ〜３０μＭ）を細胞（５０μＬ／ウェル）に添加し、３つのプレートで、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｅ−３４７７）は、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように、各ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光を読み取った。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、このＩＣ50値が、１．８ｎＭ〜１２１ｎＭにわたることが示されている。
ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害（リン酸化ＥＧＲＦアッセイ）
ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化が著しく阻害された選択ＦＮ３ドメインについて、阻害に対するＩＣ50値を測定することによって、更に完全に評価した。ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を、上記の「ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害」に記載されたように、ＦＮ３ドメインの濃度を変化させて（０．５ｎＭ〜１０μＭ）評価した。データは、電気化学発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、このＩＣ50値が、１８ｎＭ〜２．５μＭ超にわたることが示されている。
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）
ＥＧＦＲ依存性細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインへの暴露の後に、ＥＧＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号はそれぞれ、ＣＲＬ−１８４８、ＣＲＬ−５８０６）の生存度を測定することによって評価した。
不透明な白色９６ウェル組織培養処理済みプレート（Ｎｕｎｃ）中にて、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬ／ウェルに、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞５００個／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ２９２）又は細胞１，０００個／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ３２２）で、細胞を播種し、５％ＣＯ2を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、ある濃度範囲のＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインを含むリン酸塩−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５μＬ／ウェルを添加することによって、処理した。対照は、５μＬ／ウェルのＰＢＳのみ又は２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むＰＢＳで処理した。細胞は１２０時間にわたって、３７℃、５％ ＣＯ2にてインキュベートした。生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）７５μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレートシェイカーで２分間混合し、暗所で、室温で、更に１０分間、インキュベートした。培地のみのブランクに対して、読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定した、プレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対するＰＢＳ処理細胞増殖率として、プロットした。可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応式にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２細胞を用いたＩＣ50値が、それぞれ５．９ｎＭ〜１．１５μＭ及び９．２ｎＭ〜３．１μＭ超にわたることが示されている。表５は、各アッセイに対するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの生物学的特性の一覧を示す。
実施例４：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの改変
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットは、各分子の立体配座の安定性を高める設計がなされた。ＦＮ３ドメイン安定性の向上を示した突然変異Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ（米国特許第２０１１／０２７４６２３号に記載されている）は、ＤＮＡ合成によりクローンＰ５４ＡＲ４−８３、Ｐ５４ＣＲ４−３１及びＰ５４ＡＲ４−３７に組み込んだ。新規突然変異Ｐ５４ＡＲ５−８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１−ｖ２及びＰ５４ＡＲ４−３７ｖ２は、前述のように発現させ、精製した。ＰＢＳでの示差走査熱量測定を用いて、対応する親分子の安定性と比較するために各変異体の安定性を評価した。表６は、各変異体分子のＴm １８．５℃の平均増加により、大幅に安定化したことを示す。
実施例５．ｃ−Ｍｅｔに結合し、ＨＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ヒトｃ−Ｍｅｔのパニング
ＴＣＬ１４ライブラリについて、ビオチン化−ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔ）に対するスクリーニングを行い、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合できるＦＮ３ドメインを同定した。選択のために、ＴＣＬ１４ライブラリ３μｇは、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ３０ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＣｉｓ−ブロック（２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１００μｇ／ｍＬ Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））でブロッキングした発現ライブラリにおいてインビトロ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）した。選択のために、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを４００ｎＭ（１回目）、２００ｎＭ（２及び３回目）及び１００ｎＭ（４及び５回目）の濃度で添加した。ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（１、３及び５回目）又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２及び４回目）を用いて、結合ライブラリメンバーを回収し、５００μＬのＰＢＳ−Ｔで、５〜１４回ビーズを洗浄し、その後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
更に選択操作を実施して、改善された親和性を有するＦＮ３ドメイン分子を同定した。要約すると、上記のとおり、５回目からの産出物を調製し、以下の点を変更して追加の反復選択操作を行った：ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔによるインキュベーションを１時間から１５分に短縮、ビーズ捕捉を２０分から１５分に短縮、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを２５ｎＭ（６及び７回目）又は２．５ｎＭ（８及び９回目）まで低減、かつ、過剰な非ビオチン化ｃ−Ｍｅｔの存在下で更に１時間洗浄を実施。これらの変更の目的は、より高いオンレート及びより低いオフレートを有し得、実質的に低いＫDが得られるバインダを同時に選択することであった。
５、７及び９回目の産生物は、ＴＣＯＮ６（配列番号３０）及びＴＣＯＮ５ Ｅ８６Ｉ ｓｈｏｒｔ（配列番号３１）プライマーを用いて、リガーゼ非依存クローニングサイト（ｐＥＴ１５−ＬＩＣ）を含有する改変ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にＰＣＲクローン化し、タンパク質は、標準プロトコールを使用して、形質転換及びＩＰＴＧ導入（最終濃度１ｍＭ、３０℃で１６時間）後、Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグ付きタンパク質として発現された。細胞を、遠心分離によって収集し、続いて、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．２ｍｇ／ｍＬを加えたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で溶解させた。細菌溶解物は、遠心分離によって浄化し、上清は、新しい９６ディープウェルプレートに移した。
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害するＦＮ３ドメインのスクリーニング
大腸菌溶解物に存在するＦＮ３ドメインについて、生化学的形式での、精製ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対するＨＧＦの結合を阻害する能力をスクリーニングした。組換え型ヒトｃ−Ｍｅｔ Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、９６ウェルのＷｈｉｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）上にコーティングし、一晩、４℃で、インキュベートした。これらのプレートを、Ｂｉｏｔｅｋ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ上で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）含有トリス緩衝生理食塩水３００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。アッセイプレートは、室温（ＲＴ）で、１時間、振盪させながらＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ）でブロッキングし、再び、ＴＢＳ−Ｔ３００μｌで２回洗浄した。ＦＮ３ドメイン溶解物は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓ ｒｏｂｏｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中に希釈した（１：１０〜１：１００，０００）。溶解物（５０μＬ／ウェル）は、振盪させながら、室温で１時間、アッセイプレート上でインキュベートした。これらのプレートを洗浄することなく、ｂｔ−ＨＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル、ビオチン化）を振盪させながら、室温で３０分間、プレートに添加した。Ｔｅｎｃｏｎ２７溶解物を含有する対照ウェルには、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０又は希釈ｂｔ−ＨＧＦのいずれかを入れた。次いで、プレートを、ＴＢＳ−Ｔ３００μＬ／ウェルで４回洗浄し、３０〜４０分間、室温で、振盪させながら、ストレプトアビジン−ＨＲＰ１００μｌ／ウェルでインキュベートした（ＴＢＳ−Ｔで１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。再び、これらのプレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。シグナルを発達させるために、製造業者の指示に従って調製されたＰＯＤ化学発光基材（５０μＬ／ウェル、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに添加し、約３分以内に、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５で発光を読み取った。阻害率は、以下の式を用いて求めた。１００−（（ＲＬＵsample−平均ＲＬＵNo bt-HGF control）／（平均ＲＬＵbt-HGF control−平均ＲＬＵNo bt-HGF control）*１００）。５０％以上の阻害率は、ヒットとみなされた。
ＦＮ３ドメインのハイスループットな発現及び精製
Ｈｉｓ−タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替えた。
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合の阻害のＩＣ50測定
選択されたＦＮ３ドメインは、ＨＧＦ競合アッセイにおいて、更に特性決定された。精製ＦＮ３ドメインの用量反応曲線は、上記のアッセイを用いて作成した（出発濃度５μＭ）。阻害率を算出した。データは、阻害率として、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。
５回目からは、１対１０の希釈において、活性を示す３５個のユニークな配列が同定され、ＩＣ50値は、０．５〜１５００ｎＭの範囲であった。７回目では、１対１００の希釈において、活性を有する、３９個のユニークな配列が産生し、ＩＣ50値は、０．１６〜２．９ｎＭの範囲であった。１対１０００の希釈で活性があることをヒットと定義して、９回目からは６６個のユニークな配列が同定された。９回目で観察されたＩＣ50値は、０．２ｎＭという低さであった（表８）。
選択されたｃ−Ｍｅｔ−結合ＦＮ３ドメインのｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃに対する親和性（ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ親和性）測定
ｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質を実験で使用したことを除き、実施例３のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに対する親和性の測定のために記述されたプロトコールに従って、選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して、親和性を測定した。
実施例６：ｃ−Ｍｅｔと結合し、ＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの特徴決定
上記の実施例２に記載のように、ＦＮ３ドメインを発現させ、精製する。それぞれ、上述の実施例１及び実施例２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー及び動力学的解析を行った。表７は、各ドメインの全アミノ酸配列に対する、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆストランド及びＦＧループの配列並びに配列番号を示す。
Ｃループ残基は、配列番号に示した残基２８〜３７に対応する
ＣＤストランド残基は、配列番号に示した残基３８〜４３に対応する
Ｆストランド残基は、配列番号に示した残基６５〜７４に対応する
ＦＧストランド残基は、配列番号に示した残基７５〜８１に対応する
細胞上での選択ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔとの結合（「Ｈ４４１細胞結合アッセイ」）
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１７４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ポリ−Ｄ−リジンをコーティングした、底部が透明な黒色の９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中、細胞２０，０００個／セルで播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。精製ＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル；０〜１０００ｎＭ）は、４℃で、１時間、２つのプレートで細胞に添加した。上清を除去し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５４６５７）で３回洗浄した。細胞は（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１６０に希釈、５０μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＢＡＭ０５０）、４℃で、３０分間、ビオチン化抗ＨＩＳ抗体と共にインキュベートした。細胞を、３回、ＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル）で洗浄した後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲート抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対８０に希釈、５０μＬ／ウェル、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１１２１）で、４℃で、３０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し（１５０μＬ／ウェル）、ＦＡＣＳ染色緩衝液に放置した（５０μＬ／ウェル）。全蛍光量は、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を使用して測定した。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＥＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＥＣ50値が１．４ｎＭ〜２２．０ｎＭの間である、結合活性範囲を示すことがわかった。
ＨＧＦにより刺激されたｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ−Ｍｅｔリン酸化（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１において、ｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、精製ＦＮ３ドメインの試験を行った。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＨＥＰＥＳ含有、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入った、透明な９６ウェル組織培養処理プレートに、２０，０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。培養培地は、完全に除去して、細胞は、血清非含有ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）中で、３７℃で、５％ ＣＯ2にて、一晩飢餓させた。次に、細胞に、１時間、３７℃にて、５％ ＣＯ2で、２０μＭ以下の濃度の、ＦＮ３ドメインを含有する新鮮な血清非含有ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を補充（replenish）した。対照は、培地のみで処理した。細胞は、組換え型ヒトＨＧＦ（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９４−ＨＧＮ）１００ｎｇ／ｍＬで刺激し、３７℃、５％ ＣＯ2、１５分間インキュベートした。陰性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。次に、培地を完全に除去して、細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液（５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させながら、溶解させた。リン酸化されたｃ−Ｍｅｔの測定のために構成されたアッセイプレートを、製造者の指示に従って、１時間、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロッキングした。次いで、プレートは、トリス洗浄緩衝液（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で３回洗浄した。細胞溶解物（３０μＬ／ウェル）は、アッセイプレートに移し、室温で、振盪させながら１時間インキュベートした。アッセイプレートは、トリス洗浄緩衝液で４回洗浄し、その後、氷冷検出抗体溶液（２５μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに、１時間、室温で、振盪させながら添加した。プレートは、再び、トリス洗浄緩衝液で４回、すすぎ洗いをした。シグナルは、１５０ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（１５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加することによって検出され、製造業者によるアッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。データは、電気化学発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＩＣ５０値４．６ｎＭ〜１４１５ｎＭにて、リン酸化ｃ−Ｍｅｔを阻害することがわかった。
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ｃ−Ｍｅｔ依存性細胞増殖の阻害は、Ｕ８７−ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＨＴＢ−１４）の生存度を測定し、その後、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに暴露することによって評価した。１０％ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェルの入った不透明な白色９６ウェル組織培養処理済みプレート（Ｎｕｎｃ）中、細胞８０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。プレーティングから２４時間後、培地を吸引し、細胞に、無血清ＲＰＭＩ培地を補充した。
血清飢餓から２４時間後、細胞はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有無血清培地の添加によって処理した（３０μＬ／ウェル）。細胞は７２時間にわたって、３７℃、５％ ＣＯ2にてインキュベートした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレートシェイカーで１０分間混合した。読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定した、プレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対する生蛍光単位（ＲＬＵ）として、プロットした。可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応式にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表８に、１ｎＭ〜１０００ｎＭ超の範囲のＩＣ50値を示す。
表８に、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの特性をまとめる。
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの熱安定性
ＰＢＳ中の示差走査熱量測定は、各ＦＮ３ドメインの安定性を評価するために使用した。実験結果は、表９に示す。
実施例７：二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の生成及び特徴決定
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の生成
実施例１〜６に記載のＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせを、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの双方と結合できる二重特異性分子へと接合した。更に、配列番号１０７〜１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、及び配列番号１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを作製し、二重特異性分子へと接合した。以下のフォーマットを維持するように、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１又は１９０〜１９３（表１０）に示すアミノ酸配列をコードする合成遺伝子を作製した。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインにペプチドリンカーが続き、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが続く。ポリ−ヒスチジンタグは、精製を補助するため、Ｃ末端で組み込まれた。表１０に記載されているこれらの分子に加え、２つのＦＮ３ドメイン間のリンカーを、表１１に記載されているものに従い、長さ、配列の組成及び構造によって変化させた。いくつかの他のリンカーが、こうしたＦＮ３ドメインに連結するために使用できると考えられている。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、単一特異性ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインについて記載されているように、ＩＭＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィー方法を用いて、大腸菌から発現させ、精製した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、開始剤メチオニンを含んでいても、含んでいなくてもよいことは、当業者に明らかである。開始剤メチオニンを有する例示的な分子は、配列番号１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５、１９０及び１９２に示すアミノ酸配列を有する分子であり、開始剤メチオニンを有さない例示的な分子は、配列番号５０〜７２、１９１及び１９３に示す。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのための開始剤メチオニンの存在により、適切な活性が確保され、この開始剤メチオニンは、ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインに対して影響が少ない。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により、単一特異性分子のみと比較して、効力が向上し、これは、結合活性を示す。
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。血清飢餓の２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（高親和性単一特異性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２）、低親和性単一特異性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン（ＥＣＢ１）に連結する低親和性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の混合物のいずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処理し、その後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％ ＣＯ2で１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達は、適切なＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、評価した。
低親和性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、６１０ｎＭのＩＣ50にて、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害した（図４）。予想されたとおり、ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害することができず、また、単一特異性分子の混合物は、ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン単体と同様であった。しかし、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、１ｎＭのＩＣ50（図４）にて、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、ｃ−Ｍｅｔ単一特異性単体と比較した効力の向上は、２−ｌｏｇ超もシフトした。
結合活性効果を介して、ｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲのリン酸化の阻害を向上させる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の可能性は、変動するｃ−ＭｅｔとＥＧＦＲの密度及び比率を有する複数の細胞型において評価された（図５）。ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１又はＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。血清飢餓の２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３から構成されるＥＣＢ５）のいずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処理し、その後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％ ＣＯ2で１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達は、適切なＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、評価した。
図５（Ａ〜Ｃ）は、３つの異なる細胞株において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較して、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いるＥＧＦＲの阻害を示す。ＥＧＦＲリン酸化アッセイにおいて、結合活性を評価するために、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２）を、高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）に連結された同一のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。Ｈ２９２及びＨ５９６細胞では、単一特異性及び二重特異性分子についてＥＧＦＲのリン酸化の阻害は同等であった（図５Ａ及び図５Ｂ）。これはおそらく、これらの細胞株は、ＥＧＦＲ対ｃ−Ｍｅｔ受容体の比率が高いためである。この理論を試してみるために、ＥＧＦＲよりｃ−Ｍｅｔ受容体が多いＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害を評価した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子で処理することにより、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害を示すＩＣ50が３０倍低下した（図５Ｃ）。
ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイで、ＥＧＦＲ親和性が高く（０．２６ｎＭ）、ｃ−Ｍｅｔ親和性が中程度（１０．１ｎＭ）である分子を用いて、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により能力が増大する可能性を評価した。ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ５９６細胞では、いずれも、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害が二重特異性分子により、単一特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較して、それぞれ、１３４倍及び１０１２倍、増大した（図３Ｄ及び３Ｅ）。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害の効力が増大されることにより、シグナル伝達及び増殖の阻害の増大がもたらされることが確認された。これらの実験では、ＦＮ３ＥＧＦＲ結合とｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの混合物を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。表１２及び１３に記載されている通り、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子で処理したとき、単一特異性結合剤の混合物と比較して、ＥＲＫリン酸化のＩＣ50値（表１２）及びＨ２９２細胞の増殖（表１３）は、低下した。二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子のＥＲＫリン酸化の阻害に対するＩＣ50は、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの混合物と比べて、１４３倍低く、本アッセイにおける、分子の効力に対する結合活性の効果を示している。表１２では、単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、十分に活性が阻害されることはなく、このため、示されるＩＣ50値は、下限値を考慮する必要がある。増殖アッセイは、混合物又は二重特異性の形式で連結されたもののいずれかで、異なるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの組み合わせを用いて、完了した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の増殖阻害を示すＩＣ50値は、単一特異性親ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、３４〜２３６倍低かった。受容体レベルで観察された結合活性効果（図４及び図５）は、細胞シグナル伝達（表１２）及び細胞増殖（表１３）の阻害の改善に変換されることが確認された。
インビボでの腫瘍の異種移植片：ＰＫ／ＰＤ
単一特異性ＦＮ３ドメイン分子及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子のインビボでの有効性を判断するために、ヒトＨＧＦ（マウスＨＧＦはヒトｃ−Ｍｅｔに結合しない）を分泌するように腫瘍細胞を改変した。ヒトＨＧＦは、レンチウィルス感染（レンチウィルスＤＮＡベクター発現ヒトＨＧＦ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｘ１６３２２）及びレンチウイルスパッケージングキット（Genecopoeia））を用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞内に安定して発現させた。感染後、ＨＧＦ発現細胞を、プロマイシン４μＧ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択した。ヒトＨＧＦタンパク質は、アッセイプレート（MesoScale Discovery）を用いて、プールされた細胞のコンディショニングした培地で検出された。
ＳＣＩＤベージュマウスの各動物の背側腹部に、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞発現ヒトＨＧＦ（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下接種した。腫瘍の測定は、腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ3となるまで、週２回行った。マウスには、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（半減期を増大するアルブミン結合ドメインに連結される）又はＰＢＳビヒクルを腹腔内に単回投与した。腫瘍は、投与の６時間又は７２時間後に抽出され、すぐに液体窒素で凍結した。血液サンプルを心穿刺を介してプロテアーゼ阻害剤を含有する３．８％クエン酸に採取した。採取直後、血液試料を遠心分離し、得られた血漿をサンプルチューブに移し、−８０℃で保管した。腫瘍は、重量を計測し、小さな断片に切断し、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、フッ化ナトリウム５０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、活性化オルトバナジウム酸塩２ｍＭ（シグマ）及びＰＭＳＦ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１ｍＭを含む、ＲＩＰＡ緩衝液の入った溶解マトリックスＡチューブ（ＬＭＡ）で溶解した。溶解物は、ＬＭＡマトリックスから除去し、遠心分離し、不溶性タンパク質を除去した。可溶性腫瘍タンパク質は、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量化し、腫瘍溶解緩衝液で同等のタンパク質レベルに希釈した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫは、（製造業者のプロトコールに従って、上述のとおり）アッセイプレート（MesoScale Discovery）を用いて測定した。
図６は、実験の結果を示す。各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子により、６時間及び７２時間の両方の時点で、リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのレベルが大幅に減少した。図６に提示されたデータから、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に阻害する重要性及び各受容体の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性の下流ＥＲＫの阻害における役割がわかる。高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図では「８」として示す、ＫD＝０．２６ｎＭ）は、中程度の親和性を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、図では「１７」として示す、ＫD＝１．９ｎＭ）を含むものと比較して、６時間及び７２時間の両方で、より大きな程度でＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。試験した４つの全ての二重特異性分子では、親和性に関係なく、６時間の時点で、完全にＥＲＫのリン酸化が阻害された。７２時間の時点で、高い親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを含有する分子（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；図では「Ａ３」として示す、ＫD＝０．４ｎＭ）は、中程度の親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５；図中「Ａ５」として示す；ＫD＝１０．１ｎＭ；図６）と比較して、ＥＲＫのリン酸化が大幅に阻害された。
各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の濃度は、血液及び腫瘍に投与後、６時間及び７２時間の時点で、測定した（図７）。興味深いことに、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；ＫD＝０．４ｎＭ）を有する二重特異性分子ではなく、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２；ＫD＝１．９ｎＭ）が、６時間の時点で、他の分子に対して、大幅に多い腫瘍集積を有したが、この差は、７２時間で減少した。腫瘍外の細胞では、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの表面発現レベルはいずれも低く、このため、高親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、中程度の親和性ＥＧＦＲ分子は、正常組織に強く結合しないと仮定できる。このため、腫瘍内では、結合できる中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有していない。したがって、各受容体に対する適切な親和性を同定することにより、全身毒性の低下及び腫瘍集積の増大を伴う治療法が特定できると考えられる。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍有効性の研究
ＳＣＩＤベージュマウスの各動物の背側腹部に、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞発現ヒトＨＧＦ（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下接種した。注入後１週間、マウスを同等の腫瘍体積を有する群に階層化した（平均腫瘍容積＝７７．９＋／−１．７ｍｍ3）。マウスは、週３回、二重特異性分子の投与を受け、腫瘍体積を週２回記録した。ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対して異なる親和性を有する４つの異なる二重特異性分子により、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を観察した。図８に、高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処置したマウスにおいて、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが中程度の親和性であるとき、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、腫瘍増殖の遅延が観察されたため、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を阻害する利点を示す（白三角ｖｓ黒三角、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２〜Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７〜Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５と比較）。更に、データから、高親和性又は中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性分子として、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有することの重要性が明らかであり、高親和性のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが、最も高い有効性を示した（灰色及び黒の点線、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２〜Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３及びＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２〜Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）。
二重特異性分子並びにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの他の阻害剤の有効性
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）及び低分子阻害剤クリゾチニブ（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗−ＥＧＦＲ抗体）（それぞれ単剤として）、及びクリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたもののインビボ治療有効性を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスのＨ２９２−ＨＧＦヒト肺癌異種移植皮下モデルの治療において、評価した。
Ｈ２９２−ＨＧＦ細胞は、インビトロで、ウシ胎児血清（１０％ ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、大気中、５％ ＣＯ２雰囲気で、３７℃で維持した。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により、２回／週、定期的に、継代培養した。指数関数的増殖フェーズにおいて、増殖した細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。
Ｎ：動物数；ｐ．ｏ．：経口投与；ｉ．ｐ．：腹腔内投与３回／週：週の第１日目、第３日目、第５日目に投与
ＱＤ：１日に１回Ｑ４ｄ：４日に１回；クリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたものの間隔は、０．５時間；投与量は、体重（１０ｌ／ｇ）を基準に調整した；ａ：グルーピング後、第１４日目には投与しなかった。
それぞれのマウスには、右腹部に、腫瘍成長のために、ｃｕｌｔｒｅｘを含むＰＢＳ、０．１ｍＬ（１：１）中の、Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０6個）を皮下接種した。治療は、平均腫瘍サイズが１３９ｍｍ3に達したときに開始された。各研究群における試験品の投与及び動物数は、以下の実験デザイン表に示す。腫瘍細胞の接種日は、第０日目と示した。表１４は、治療群を示す。
治療開始前に、全動物の重量を計量し、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は任意の所与の治療の有効性に影響を及ぼし得るため、マウスは、腫瘍体積に基づく、無作為化ブロックデザインを用いて各群に割り当てた。これにより、全群がベースライン値で比較できる。無作為化ブロックデザインを用いて、各群に実験動物を割り当てた。第１に、実験動物は、初期腫瘍体積によって、同種ブロックに分けた。第２に、各ブロック内で、治療に対する実験動物のランダム化を行った。無作為化ブロックデザインを用いて、実験動物を割り当てることによって、所与の治療に割り当てるにあたって、各動物が確実に同じ確率を有するようにして、系統誤差を低減させた。
定期的モニター時に、腫瘍増殖及び治療が通常の行動に及ぼすあらゆる影響（運動性、摂餌量及び摂水量の視覚的評価、体重増加／減少（体重は、週２回測定した）、眼／毛のつや、並びに他のあらゆる異常作用など）について、各動物を調べた。
エンドポイントは、腫瘍増殖を遅延させることができるか、又は腫瘍を有するマウスを治癒することができるかのどちらかとした。腫瘍サイズは、２つの寸法を、キャリパを用いて週２回測定し、体積は、以下の式を用いて、ｍｍ3で表された：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2（ここで、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長径と短径を指す）。次に、腫瘍サイズを、Ｔ−Ｃ値及びＴ／Ｃ値の両方の計算に使用した。Ｔ−Ｃ値は、治療群の平均腫瘍サイズが１０００ｍｍ3に到達するまでの所要時間（日）をＴ値として、また、対照群の平均腫瘍サイズが同サイズに到達するまでの所要時間（日）をＣ値として算出した。Ｔ／Ｃ値（％）は、抗腫瘍効果を示し、Ｔ値及びＣ値は、所与の日の治療群及び対照群のそれぞれの平均腫瘍体積とした。完全な腫瘍退縮（ＣＲ）は、触診の下限値（６２．５ｍｍ3）未満まで縮小した腫瘍と定義する。一部腫瘍退縮（ＰＲ）は、初期の腫瘍体積から縮小された腫瘍と定義する。持続的と考え得るＣＰ又はＰＲには、最短期間として、３回以上の連続した腫瘍測定の間でのＣＲ又はＰＲが必要とされる。
２０％を超える重量減少が認められた場合、又は、群の平均腫瘍サイズが２０００ｍｍ3を超えた場合、動物を安楽死させた。本研究は、最終投与から２週間観察後に終了した。
表１５に示すように、各時点での各群の腫瘍体積について、平均値及び標準誤差（ＳＥＭ）などの統計概要を示す。一方向ＡＮＯＶＡに続いて、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌを用いて個別に比較することにより（等分散性は想定せず）、腫瘍体積の群間差に関する統計解析を、評価した。全データを、ＳＰＳＳ１８．０を使用して解析した。ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると考えられた。
ビヒクル治療群（群１）の平均腫瘍サイズは、腫瘍接種後第２３日目に１，７５８ｍｍ3に達した。２５ｍｇ／ｋｇの投与レベル（群２）での二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による治療により、全マウスにおいて、完全腫瘍退縮（ＣＲ）となり、これは、３回超の連続した腫瘍測定において持続性が認められた（第２３日のビヒクル群と比較して、平均ＴＶ＝２３ｍｍ3、Ｔ／Ｃ値＝１％、ｐ＝０．００４）。
投与レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としての、クリゾチニブ治療群（群３）は、いかなる抗腫瘍活性も示さず、第２３日において、平均腫瘍サイズは２，１０２ｍｍ3であった（ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝１２０％、ｐ＝０．９４４）。
投与レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としての、エルロチニブ治療群（群４）は、わずかに抗腫瘍活性を示したが、ビヒクル群と比較して、有意な差は認められず、第２３日に、平均腫瘍サイズ１，１２２ｍｍ3（ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝６４％、ｐ＝０．４２９）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、４日の腫瘍増殖遅延であった。
クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）及びエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）の組み合わせは、有意に抗腫瘍活性を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ２６５ｍｍ3（Ｔ／Ｃ値＝１５％、ｐ＝０．００８）であり、腫瘍増殖遅延１７日目には、ビヒクル群と比較して、腫瘍サイズ１，０００ｍｍ3であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、１７日の腫瘍増殖遅延であった。
投与レベル１ｍｇ／マウスの単剤としてのセツキシマブ（群６）は、有意に抗腫瘍活性を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ４８５ｍｍ3（Ｔ／Ｃ値＝２８％、ｐ＝０．０１８）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、１７日の腫瘍増殖遅延であった。図９及び表１６は、様々な治療法の抗腫瘍活性を示す。
ビヒクル群では、腫瘍量の増加によると考えられる中程度から重篤な体重減少が認められた。マウス３匹が死に、１匹のマウスを、２３日目にＢＷＬ２０％超のとき安楽死させた。群２では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子のわずかな毒性が認められ、治療期間中、ＢＷＬ２０％超のとき３匹のマウスを安楽死させ、治療終了後２週間の観察期間中、体重は徐々に回復した。クリゾチニブ又はエルロチニブ単剤療法群では、ビヒクル群と比較して、更に重篤な体重減少が認められ、治療と毒性との関連が示唆された。クリゾチニブとエルロチニブとの組み合わせは、投与段階中には、全般的に許容されたが、研究終了時に重篤な体重減少が認められ、これは非治療期間中の急速な腫瘍増殖の再開によるものと考えられる。セツキシマブ単独療法は、本研究において、十分に許容され、体重減少は、腫瘍増殖の再開により、研究終了時のみに観察された。
要約すると、２５ｍｇ／ｋｇでの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（３回／週ｘ３週間）により、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでのＨ２９２−ＨＧＦヒト肺癌異種移植モデルにおいて、完全奏効が得られた。マウス１０匹中７匹が、治療に耐性を示し、その結果、１０匹中３匹のマウスに重篤な体重減少が認められた。図９は、治療後の時間内での、様々な治療が腫瘍サイズに及ぼす影響を示す。
実施例８：二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期延長
腎臓での濾過作用を低減することで、タンパク質の血中半減期を延長する多数の方法が公開されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその他のポリマーによる修飾、アルブミンへの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に結合するタンパク質ドメインとの融合、アルブミンとの遺伝的融合、ＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合及び長く、構造化されていないアミノ酸配列との融合などが挙げられる。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、遊離システインを分子のＣ末端に組み込むことによって、流体力学的半径を増大させるために、ＰＥＧにより修飾された。最も一般的には、システイン残基の遊離チオール基を使用して、標準的な方法を用いて、マレイミド基又はイオドアセタマイド（iodoacetemide）基により官能基化できるＰＥＧ分子を結合させる。ＰＥＧの様々な形態を使用して、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの線状ＰＥＧを含むタンパク質を修飾できる。これらの分子量の分鎖状ＰＥＧ分子を修飾に使用することもできる。場合によっては、ＰＥＧ基は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子中において、第１級アミンを介して結合されてもよい。
ＰＥＧ化のほかに、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期を、天然の３−ヘリックスバンドル血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子としてこれらのタンパク質を生成することによって、延長させた。これらのタンパク質のドメインは、表１２に記載されているリンカーのいずれかを介して、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。ＡＢＤ又はＡＢＤＣｏｎドメインは、一次配列において、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの間に配置されてもよい。場合によっては、アルブミン又はアルブミン変異体（配列番号：１８９）は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。
実施例９．選択二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の特性決定
選択二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの双方に対する親和性、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する能力、及びＨＧＦ細胞の増殖への影響に関して特性決定した。組換え型ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインへの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の結合親和性は、実施例３に記載されているプロトコールに従って、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、表面プラズモン共鳴法によって更に分析した。特性決定結果を表１７に示す。
*ＥＣＢ１５８は、配列番号：２２４の（ＧＧＧＧＳ）2リンカーを介して、ヒト血清アルブミン変異体Ｃ３４ＳにコンジュゲートされたＥＣＢ１６８である。
実施例１０：ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのパラトープ
ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合に重要な残基を決定するために、分子Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号：２７）に対して一連の突然変異体を作製した。この分析のため、ＢＣループ及びＦＧループ中の全てのアミノ酸位置を、１つずつアラニンに変異させ、１８個の新しい分子を生成した。これらの変異体がＥＧＦＲに結合する親和性は、Ｐｒｏｔｅｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いたＳＰＲ分析によって測定された。その結果は、表１８に示す。１０個の位置において、１０倍以上の結合親和性の損失がもたらされ、これにより、これらのタンパク質が、ＥＧＦＲへの結合に寄与していることがわかる。倍率変化（fold change）は、親分子Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２と比較したときの変異体のＫD値の倍率変化を示す。ＢＣループ及びＦＧループからの残基の組み合わせは、結合面を構成する。１０個の位置が、ＥＧＦＲへの結合を１０倍以上弱め、５個の位置では、ＥＧＦＲへの結合を１００倍以上弱めることがわかった（Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５）。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２のほかに、ＥＧＦＲ結合分子Ｐ５４ＡＲ４−４８、Ｐ５４ＡＲ４−８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２３（それぞれ、配列番号：２１、２５、１０７、１０８及び１０９）は、変異時に１００倍以上ＥＧＦＲ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。生成されたいくつかの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、表１０に示すように、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとしてＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４−４８、Ｐ５４ＡＲ４−８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２２又はＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２を含む。
同様に、標的の結合に重要な位置を定義するために、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号：４１）分子の推定ｃ−Ｍｅｔ相互作用表面に対して一連の突然変異体を作製した。この分析は、二重特異性分子ＥＣＢ１５（配列番号：１４５）の場合において行われ、上記のとおり、アラニンの代わりに、セリンを置換として使用した。セリンは、得られる突然変異体の疎水性を低下させるために選択された。表１９は、分子Ａ３（配列番号：４１）の番号に関連する、各突然変異位置の番号と共に、ＳＰＲ結果を示す。７つの位置が、ｃ−Ｍｅｔとの結合を１０倍以上弱めることが示された。Ｍ７２Ｓ、Ｒ３４Ｓ及びＩ７９Ｓ変異体については、測定可能な結合は認められなかった。Ｆ３８Ｓ変異体により、１００倍以上、ｃ−Ｍｅｔとの結合が低減した。このデータから、ｃ−Ｍｅｔ結合に寄与する位置は、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及びＦＧループに分布していることがわかる。倍率変化は、親分子Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３と比較したときの変異体のＫD値の倍率変化を示す。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３に加えて、ｃ−Ｍｅｔ結合分子Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９２−Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｆ１０及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｈ８（それぞれ、配列番号：３４、４４、４７及び４９）は、変異時に１００倍以上ｃ−Ｍｅｔ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。
実施例１１．二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によるヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害を、実施例３又は６によって、若しくは低付着状態で、標準付着培養物において評価した。低付着状態での生存を評価するために、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ含有ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルの入ったＵｌｔｒａ Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中に、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。細胞は、異なる濃度（最終濃度０．０３５〜７００ｎＭ）の抗体で、ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９４−ＨＧＮ）と共に処理し、３７℃、５％ ＣＯ2で、７２時間インキュベートした。いくつかのウェルは、対照として、ＨＧＦ又は抗体のいずれかで処理されないままとした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、データは、発光を読み取る前に、溶解物を、不透明な白い９６ウェルの組織培養処理済プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した点以外は、実施例３の「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）」に上述されているとおり分析した。
これらの場合のうち、細胞増殖の最大阻害が４０％超えであり、相対ＩＣ50が５ｍＭ未満であるときには、細胞株は、ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ二重特異性分子に対する強力な応答因子として分類された。
ＥＣＢ１５の阻害活性は、野生型、増幅型又は変異型ＥＧＦＲ及び野生型又は変異型ｃ−Ｍｅｔを有する、複数の細胞株において評価した。ＥＣＢ１５は、表２０に示す細胞株の腫瘍細胞増殖を阻害した。ＥＣＢ１５は、また、エルロチニブなどのＴＫＩに耐性を示すことが明らかである変異型Ｔ７９０Ｍを有するＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞株の増殖を阻害した。
ＷＴ：野生型
ＡＭＰ：増幅
Ｄｅｌ：欠失
配列番号：７３，ＰＲＴ，Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ，ＥＧＦＲ
配列番号：７５，ＰＲＴ，Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ，Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ
＞配列番号１０１
ＰＲＴ
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ｃＭｅｔ
＞配列番号１７９
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ；
ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
＞配列番号１８０
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号：１８０）
＞配列番号１８１
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）；ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
＞配列番号１８２
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
＞配列番号１８３
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
＞配列番号１８４
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｃストランド及びＣＤループ配列
ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである。
＞配列番号１８５
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｆストランド及びＦＧループ
ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20Ｖ ＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）、ここで、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
＞配列番号１８６
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
＞配列番号１８７
ＰＲＴ
人工
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号Ｏ：１８７）、ここで、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩである。
＞配列番号１８８
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のｃ−Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）、ここで、
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
＞配列番号１８９
ＨＳＡ変異体Ｃ３４Ｓ
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
＞配列番号１９０
ＥＣＢ１６８
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＩＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
＞配列番号１９１
ＭｅｔのないＥＣＢ１６８
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＩＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
＞１９２
ＥＣＢ、名前なし、リスト１７ｖ２−Ｃ５ｖ２の最後（last in the list 17v2-C5v2）
ｍＬｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔａｐａｐａｐａｐａｐ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
＞１９３
ＥＣＢ、名前なし、ｍｅｔなし、リスト１７ｖ２−Ｃ５ｖ２の最後
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔａｐａｐａｐａｐａｐ ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
＞配列番号１９４
８３ｖ２ Ｄ２２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号１９５
＞８３ｖ２ Ｄ２３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄａｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号１９６
＞８３ｖ２ Ｐ２４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄａｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号１９７
＞８３ｖ２ Ｗ２５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐａａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号１９８
＞８３ｖ２ Ｆ２７Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａａｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号１９９
＞８３ｖ２ Ｙ２８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆａｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２００
＞８３ｖ２ Ｈ７５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖａｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０１
＞８３ｖ２ Ｎ７６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈａｖｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０２
＞８３ｖ２ Ｖ７７ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎａｙｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０３
＞８３ｖ２ Ｙ７８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖａｋｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０４
＞８３ｖ２ Ｋ７９Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙａｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０５
＞８３ｖ２ Ｄ８０Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋａｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０６
＞８３ｖ２ Ｍ８３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎａｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０７
＞８３ｖ２ Ｒ８４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍａｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０８
＞８３ｖ２ Ｇ８５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒａｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２０９
＞８３ｖ２ Ｌ８６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔｎｍｒｇａｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２１０
＞８３ｖ２ Ｔ８１Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄａｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞配列番号２１１
＞８３ｖ２ Ｎ８２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋｄｔａｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１２
＞Ｋ７８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇＳｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１３
＞Ｇ４０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌＳｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１４
＞Ｌ３９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆＳｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１５
＞Ｖ６８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙＳｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１６
＞Ｎ７０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖＳｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１７
＞Ｐ８１Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓＳｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１８
＞Ｆ３６Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙＳｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２１９
＞Ｗ３２Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆＳｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２２０
＞Ｍ７２Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉＳｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２２１
＞Ｒ３４Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉＳｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２２２
＞Ｆ３８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅＳｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２２３
＞Ｉ７９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋＳｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
配列番号２２４
ＰＲＴ
人工
リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

Claims (71)

  1. 第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子。
  2. 請求項１に記載の二重特異性分子であって、
    ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
    ｂ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約４×１０-9Ｍ〜約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
    ｃ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ−Ｍｅｔと、約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて結合し、該ＫDは、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定されるか、又は
    ｄ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDにて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ−Ｍｅｔと、約３×１０-10〜約５ｘ１０-8ＭのＫDにて結合し、該ＫDは、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
  3. 前記二重特異性分子は、前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインの混合物によるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖阻害のＩＣ50値と比較した場合、少なくとも３０倍小さいＩＣ50値にて、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発される、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、前記二重特異性分子は、
    ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定したとき、約８×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
    ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
    ｃ）約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発されるか、
    ｄ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてＥＧＦＲに結合するか、又は
    ｅ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてｃ−Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３及び実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
  5. 前記第１のＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  6. 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１０７又は１０８のアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  7. 前記第１のＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  8. 前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ−Ｍｅｔと結合する、請求項７に記載の二重特異性分子。
  9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
    ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、
    ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧループと、
    ｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含み、
    ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、
    ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
    ｉｉ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、二重特異性分子。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
    ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含み、
    ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、二重特異性分子。
  11. 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  12. 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性分子。
  13. 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７、又は１９４〜２１１のうちの１つに示される配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９、１１１〜１１４、又は２１２〜２２３のうちの１つに示される配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  14. 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、
    ａ）それぞれ、２７及び３２、
    ｂ）それぞれ、２７及び４１、
    ｃ）それぞれ、２７及び４０、
    ｄ）それぞれ、２７及び３３、
    ｅ）それぞれ、１０７及び４１、
    ｆ）それぞれ、１０７及び４０、
    ｇ）それぞれ、１０７及び３３、
    ｈ）それぞれ、１０７及び３２、
    ｉ）それぞれ、１０７及び１１４、
    ｊ）それぞれ、１０８及び１１１、
    ｋ）それぞれ、１０８及び１１２、
    ｌ）それぞれ、１０８及び１１３、
    ｍ）それぞれ、１０８及び１１４、
    ｎ）それぞれ、１０９及び１１１、
    ｏ）それぞれ、１０９及び１１２、
    ｐ）それぞれ、１０９及び１１３、
    ｑ）それぞれ、１０９及び１１４、
    ｒ）それぞれ、１１０及び１１１、
    ｓ）それぞれ、１１０及び１１２、
    ｔ）それぞれ、１１０及び１１３、又は
    ｕ）それぞれ、１１０及び１１４、の配列番号のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の二重特異性分子。
  15. 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  16. 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  17. 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、リンカーによって連結される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  18. 前記リンカーは、配列番号７８〜８４又は２２４のうちの１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の二重特異性分子。
  19. 配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、１３８〜１６５又は１９０〜１９３で示すアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記分子のＮ末端に連結されるメチオニン（Ｍｅｔ）を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  20. 前記分子のＣ末端に連結されるシステインを更に含む、請求項１９に記載の二重特異性分子。
  21. 半減期延長部分に連結される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
  22. 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項２１に記載の二重特異性分子。
  23. 前記半減期延長部分は、配列番号１８９の前記アルブミン変異体である、請求項２２に記載の二重特異性分子。
  24. 請求項５に記載の二重特異性分子をコードする、単離ポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
  27. 二重特異性分子を作製する方法であって、請求項２６に記載の単離宿主細胞を、該二重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製することと、を含む、方法。
  28. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の二重特異性分子と、製薬上許容できる担体と、を含む医薬組成物。
  29. 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の請求項１に記載の二重特異性分子を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する方法。
  30. 癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、ｃ−Ｍｅｔ活性化突然変異又はｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６〜Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８〜Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６〜Ａ７６７間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８〜Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２〜Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請求項２９に記載の方法。
  33. 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、請求項２９に記載の方法。
  34. 第２の治療薬を投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記第２の治療薬は、化学療法剤又は標的抗癌治療剤である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記第２の治療薬は、シスプラチン、ビンブラスチン、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４若しくはＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害物質、エルロチニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第２の治療薬は、前記二重特異性分子と同時に、逐次的に又は別途に投与される、請求項３４に記載の方法。
  38. 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメイン。
  39. 請求項３８に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
    ｂ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ〜約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
    ｃ）約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実施例３に記載の条件を用いて測定されるか、又は
    ｄ）約２×１０-10〜約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
  40. 少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３８又は３９に記載のＦＮ３ドメイン。
  41. 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
  42. 請求項３８〜４１のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧループと、
    ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
  43. 配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のＦＮ３ドメイン。
  44. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７又は１９４〜２１１のうちの１つに示される配列を含む、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
  45. 前記ＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項４４に記載のＦＮ３ドメイン。
  46. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項４５に記載のＦＮ３ドメイン。
  47. 請求項４０に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
  48. 請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  49. 請求項４８に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
  50. ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、請求項４８に記載の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような条件下で培養することと、該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
  51. 肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ−Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
  52. 請求項５１に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
    ｂ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定したとき、約４×１０-9Ｍ〜約１．５ｘ１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ−Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
    ｃ）約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３に記載の条件下で測定されるか、又は
    ｄ）約３×１０-10〜約５ｘ１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
  53. 少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５１又は５２に記載のＦＮ３ドメイン。
  54. 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ−Ｍｅｔに結合する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
  55. 請求項５１〜５４のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
    ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
    ｂ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
  56. 配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のＦＮ３ドメイン。
  57. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９、１１１〜１１４、又は２１２〜２２３のうちの１つに示される配列を含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
  58. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項５７に記載のＦＮ３ドメイン。
  59. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項５８に記載のＦＮ３ドメイン。
  60. 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
  61. 請求項５３に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
  62. 請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  63. 請求項６２に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
  64. ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、請求項６３に記載の単離宿主細胞を、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような条件下で培養することと、ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
  65. 請求項３８又は５１に記載のＦＮ３ドメインと、製薬上許容できる担体と、を含む医薬組成物。
  66. 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の請求項６５に記載の医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する方法。
  67. 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ−１６８６、ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請求項６６に記載の方法。
  68. 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、請求項６６に記載の方法。
  69. 請求項１〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの、治療のための使用。
  70. 癌の治療に使用するための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
  71. 請求項７０に記載の使用のための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、前記癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）である、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、単離ＦＮ３ドメイン。
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