ES2696148T3 - Moléculas de unión al dominio de tipo III de c-Met-fibronectina y EGFR - Google Patents

Moléculas de unión al dominio de tipo III de c-Met-fibronectina y EGFR Download PDF

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Abstract

Una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 aislado que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en la que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y en la que el primer dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión al dominio de tipo III de c-Met-fibronectina y EGFR
Campo de la invención
La presente invención se refiere a moléculas de unión a EGFR y/o c-Met monoespecíficas o biespecíficas y a métodos de preparación y uso de las moléculas.
Antecedentes de la invención
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1 o HER1) es una glicoproteína transmembrana de 170 kDa que está codificada por el proto-oncogén c-erbB1. El EGFR es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) de las tirosina quinasas receptoras (RTK) que incluye HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4). La señalización del EGFR se inicia mediante la unión del ligando seguida de la inducción de cambio conformacional, homodimerización o la heterodimerización del receptor con otros miembros de la familia ErbB y autofosforilación trans del receptor (Ferguson et al., Annu Rev Biophys, 37: 353-73, 2008), que inicia una cascada de transducción de señales que afecta en última instancia a una amplia variedad de funciones celulares, incluida la proliferación celular y la supervivencia. Los aumentos en la expresión o la actividad de la quinasa del EGFR se han relacionado con una serie de cánceres humanos, lo que hace que el EGFR sea un objetivo atractivo para la intervención terapéutica (Mendelsohn et al., Oncogene 19: 6550-6565, 2000; Grünwald et al., J Natl Cancer Inst 95: 851-67, 2003; Mendelsohn et al., Semin Oncol 33: 369-85, 2006). Los aumentos tanto en el número de copias del gen EGFR como en la expresión de proteínas se han asociados con respuestas favorables al inhibidor de la tirosina quinasa EGFR, IRESSA™ (gefitinib), en el cáncer de pulmón no microcítico (Hirsch et al., Ann Oncol 18:752-60, 2007).
Las terapias con EGFR incluyen tanto moléculas pequeñas como anticuerpos anti-EGFR, aprobados para el tratamiento del cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer pulmonar no microcítico (CPNM) (Baselga y Arteaga, J Clin Oncol 23:2445-2459 (20005; Gill et al., J Biol Chem, 259:7755-7760, 1984; Goldstein et al., Clin Cancer Res, 1:131 1-1318; 1995; Prewett et al., Clin Cancer Res, 4:2957-2966.1998).
La eficacia de las terapias anti-EGFR puede depender del tipo de tumor y el estado de mutación/amplificación del EFGR en el tumor. Los efectos secundarios de las terapias actuales pueden incluir toxicidad para la piel (De Roock et al., Lancet Oncol 11 :753-762, 2010; Linardou et al., Nat Rev Clin Oncol, 6: 352-366, 2009; Li y Perez-Soler, Targ Oncol 4: 107-119, 2009). Los inhibidores de la tirosina quinasa EGFR (TKI) se usan habitualmente como terapias de segunda línea para el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), pero a menudo dejan de funcionar en doce meses debido a las vías de resistencia (Riely et al., Clin Cancer Res 12: 839-44, 2006).
c-Met codifica un receptor de tirosina quinasa. Se identificó por primera vez como un protooncogén en 1984, después de descubrir que el tratamiento con un carcinógeno daba como resultado una proteína de fusión constitutivamente activa TPR-MET (Cooper et al., Nature 311:29-33, 1984). La activación de c-Met por su ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), estimula una gran cantidad de procesos celulares, incluidos el crecimiento, la motilidad, la invasión, la metástasis, la transición epitelio-mesenquimatosa, la angiogénesis/cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos (Christensen et al., Cancer Lett 225:1-26.2005; Peters y Adjei, Nat Rev Clin Oncol 9:314-26, 2012). c-Met se sintetiza como proteína monocatenaria que se puede romper en una subunidad alfa de 50 kDa y una beta de 140 kDa unidas por un puente disulfuro ( (Ma et al.. Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). c-Met es estructuralmente similar a otros receptores de membrana como Ron y. La estequiometría exacta de la unión de HGF:c-Met no está clara, pero en general se cree que dos moléculas de HGF se unen a dos moléculas de c-Met que conducen a la dimerización del receptor y la autofosforilación en las tirosinas 1230, 1234 y 1235 (Stamos et al., The EMBO Journal 23: 2325-2335, 2004). La autofosforilación de C-Met independiente del ligando también puede producirse debido a la amplificación génica, la mutación o la sobreexpresión del receptor.
c-Met es frecuentemente amplificado, mutado o sobreexpresado en muchos tipos de cáncer, incluyendo cánceres gástricos, de pulmón, de colon, de mama, de vejiga, de cabeza y cuello, de ovario, de próstata, de tiroides, de páncreas y del SNC. Las mutaciones con sentido erróneo típicamente localizadas en el dominio de la quinasa se encuentran habitualmente en los carcinomas renales papilares hereditarios (PRCC) y en el 13 % de los PRCC esporádicos (Schmidt et al., Oncogene 18: 2343-2350, 1999). Las mutaciones de c-Met localizadas en los dominios de semaforina o yuxtamembrana de c-Met se encuentran con frecuencia en los cánceres gástricos, de cabeza y cuello, de hígado, de ovarios, CPNM y de tiroides (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003; Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305). Se ha detectado amplificación de c-Met en cánceres de cerebro, colorrectal, gástrico y de pulmón, que a menudo se correlacionan con progresión de la enfermedad (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). Hasta el 4 % y el 20 % del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y de los cánceres gástricos, respectivamente, exhiben amplificación de c-Met (Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305: Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011). Incluso en ausencia de amplificación génica, con frecuencia se observa sobreexpresión de c-Met en el cáncer de pulmón (Ichimura et al., Jpn J Cáncer Res, 87:1063-9, 1996). Además, en muestras clínicas, casi la mitad de los adenocarcinomas de pulmón mostraron niveles altos de c-Met y HGF, ambos correlacionados con una mayor velocidad de crecimiento tumoral, metástasis y mal pronóstico (Sierra and Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011; Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66: 1915-8, 1998). En casi el 60 % de todos los tumores que se hacen resistentes a los inhibidores de tirosina quinasa EGFR hay un incremento de la expresión de c-Met o se incrementa su único ligando conocido, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010), lo que sugiere que la existencia de una vía compensatoria para EGFR a través de la amplificación de c-Met c-Met se identificó por primera vez en células cultivadas que se hicieron resistentes al gefinitib, un inhibidor de la quinasa EGFR, y mostraron una supervivencia mejorada a través de la vía de Her3 (Engelrnan et al., Science, 316:1039-43, 2007). Esto se validó aún más en muestras clínicas en las que nueve de los 43 pacientes con resistencia adquirida a erlotinib o gefitinib presentaron amplificación de c-Met, en comparación con solo dos de 62 pacientes no tratados. Cuatro de los nueve pacientes tratados también adquirieron la mutación activadora de EGFR, T790M, demostrando vías de resistencia simultáneas (Beat et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104:20932-7, 2007). Los papeles individuales de EGFR y c-Met en el cáncer están bien establecidos, lo que hace que estos objetivos sean atractivos para la terapia de combinación. Ambos receptores señalizan a través de las mismas vías de supervivencia y antiapoptóticas (ERK y AKT); por lo tanto, inhibir el par en combinación puede limitar el potencial de activación de la vía compensatoria, mejorando así la eficacia general. Las terapias combinadas dirigidas a EGFR y c-Met se analizan en ensayos clínicos con Tarceva® (erlotinib) en combinación con anticuerpo monovalente anti-c-Met para el CPNM (Spigel et al., 2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011, Journal of Clinical Oncology: Chicago, IL. pág. 7505) y Tarceva (erlotinib) en combinación con ARQ-197, un inhibidor de molécula pequeña de c-Met (Adjei et al., Oncologist, 16:788-99.2011). Las terapias de combinación o las moléculas biespecíficas anti-EGFR/c-Met se han desvelado, por ejemplo, en: la publicación de patente internacional n.° WO2008/127710, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US2009/0042906, la publicación de patente internacional n°. WO2009/111691, la publicación de patente internacional n.° WO2009/126834, la publicación de patente internacional n.° WO2010/039248, la publicación de patente internacional n.° WO2010/115551.
Los enfoques terapéuticos actuales de molécula pequeña y molécula grande para antagonizar las vías de señalización de EGFR y/o c-Met para la terapia pueden ser subóptimos debido a la posible falta de especificidad, actividad potencial fuera del objetivo y toxicidad limitante de la dosis que pueden observarse en los inhibidores de molécula pequeña. Los anticuerpos bivalentes típicos pueden dar como resultado la agrupación de receptores unidos a la membrana y la activación no deseada de las vías de señalización descendentes. Los anticuerpos monovalentes (medios brazos) presentan una complejidad y un coste significativos para el proceso de fabricación. En consecuencia, existe la necesidad de más inhibidores de EGFR y/o c-Met monoespecíficos y biespecíficos con fines tanto terapéuticos como de diagnóstico.
El documento WO2011131746 se refiere a proteínas que contienen Fc de anticuerpos heterodiméricos, tales como anticuerpos biespecíficos y métodos para producirlos. El documento WO2011110642 se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a c-Met humano. Jacobs et al. (2012) estudian el diseño de nuevos dominios FN3 con alta estabilidad mediante un enfoque de secuencia de consenso. El documento US2011053842 se refiere a proteínas de un solo dominio que se unen a EGFR. El documento US2012244164 menciona nanocuerpos biespecíficos de unión a c-Met/EGFR. El documento US2012225870 comenta métodos para tratar el cáncer que es resistente al tratamiento con un agente terapéutico anti-ErbB y que está asociado con una mutación del gen MET de activación o una amplificación del gen MET. Los métodos implican administrar a un sujeto una combinación de un agente terapéutico anti-ErbB y un agente terapéutico anti-MET. El documento US2011274623 muestra un armazón proteico basado en una secuencia consenso de proteínas de fibronectina de tipo III (FN3), por ejemplo, tenascina. El documento US2010179094 se refiere a moléculas biespecíficas que comprenden un dominio de unión a EGFR y un dominio de unión a IGFIR distinto para su uso en aplicaciones de diagnóstico, investigación y terapéuticas. El documento US2011287009 comenta métodos para la producción eficiente de anticuerpos y otros complejos de proteínas multiméricas capaces de unirse específicamente a más de un objetivo. Zucali et al (2008) estudian el papel de la expresión de cMET en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico tratados con inhibidores de la tirosina quinasa EGFR.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La invención proporciona una molécula que contiene un dominio FN3 biespecífico aislado que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en el que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y en en el que el primer dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
En el presente documento se desvelan las moléculas que contienen dominio FN3 de unión biespecífica a EGFR/c-Met y unión monoespecífica a EGFR o c-Met que tienen ciertas secuencias.
La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, en el que el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada basada en la secuencia de aminoácidos de Tencon de la SEQ ID NO: 1, en la que el dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, en el que el dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la molécula de la invención. Otro aspecto de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención.
La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención.
La invención también proporciona un método para producir: (a) una molécula biespecífica, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la invención en condiciones tales que se expresa la molécula biespecífica y purificar la molécula biespecífica; (b) un dominio FN3 que se une específicamente a EGFR, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la invención en condiciones tales que se expresa el dominio FN3 que se une específicamente a EGFR, y purificar el dominio FN3; o (c) un dominio FN3 que se une específicamente a c-Met, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la invención en condiciones tales que se expresa el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met, y purificar el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la molécula de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de acuerdo con la invención, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de acuerdo con la invención, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) de acuerdo con la invención, o una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer.
En el presente documento también se desvela un método para tratar un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met biespecífico o el dominio FN3 que se une a EGFR o c-Met a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A y 1B. Alineación de aminoácidos de los dominios FN3 de unión a EGFR. Los bucles BC y FG están en recuadros en los residuos 22-28 y 75-86 de la SEQ ID NO: 18. Algunas variantes incluyen la estabilidad térmica que mejora las sustituciones L17A, N46K y E86I (numeración de residuos según Tencon SEQ ID NO: 1). Los residuos de paratopo P54AR4-83v2 (SEQ iD NO: 27) están subrayados (D23, F27, Y28, V77, G85 en la SEQ ID NO: 27).
Figura 2. Alineación de secuencia del armazón Tencon27 (SEQ ID NO: 99) y una biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 100) que tiene una superficie alternativa de C-CD-F-FG aleatorizada. Los residuos del bucle están encuadrados. Los bucles y las cadenas se indican encima de las secuencias.
Figura 3. Alineación de secuencias de los dominios FN3 de unión a c-Met. El bucle C y la cadena CD y el bucle F y la cadena FG están encuadrados y abarcan los residuos 29-43 y 65-81. Los residuos de paratopo P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41) están subrayados (R34S, F38S, M72S, e I79S).
Figura 4. Se muestra la inhibición de la fosforilación de c-Met en células H292 tratadas con moléculas que contienen dominios FN3 monoespecíficas o biespecíficas y se estimulan con HGF. Se observó un aumento sustancial en la potencia de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met (ECB1) cuando se comparó con un dominio FN3 monoespecífico de unión a c-Met (P114AR5P74-A5, que se muestra como A5 en la Figura) solo o en combinación con un dominio FN3 de unión a EGFR (P54AR4-83v2, que se muestra como 83v2 en la Figura). Figura 5. Inhibición de la fosforilación de EGFR y c-Met en células pro-tratadas con moléculas que contienen el dominio FN3 monoespecíficas o biespecíficas. En líneas celulares que expresan altos niveles de EGFR, NCI-H292 (Figura 5A) y H596 Figura 5 (B), las moléculas que contienen el dominio FN3 monoespecíficas y biespecíficas anti-EGFR son igualmente potentes para disminuir la fosforilación de EGFR. En las líneas celulares que expresan niveles bajos de EGFR en relación con c-Met, H441 (Figura 5C), las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met mejoran la potencia para la inhibición de la fosforilación de EGFR en comparación con el dominio FN3 monoespecífico de unión a EGFR. En líneas celulares con bajos niveles de c-Met, en relación con EGFR, H292 (Figura 5D) y H596 (Figura 5E), la inhibición de la fosforilación de c-Met se potencia significativamente con la molécula de EGFR/c-Met biespecífica, en comparación con el dominio FN3 de unión a c-Met monoespecífica. Las moléculas utilizadas en el estudio fueron: ECB5 biespecífico (mostrado como 17-A3 en la Figura), dominio FN3 de unión a EGFR monoespecífica P53A1R5 (mostrado como "17" en la Figura), molécula ECB3 EGFR/c-Met biespecífica (mostrada 83-H9 en la Figura) y dominio FN3 de unión a c-Met monoespecífica P114AR7P93-H9 (mostrado como H9 en la Figura).
Figura 6. Señalización farmacodinámica en tumores aislados de ratones a los que se les administraron moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met durante 6 horas o 72 horas. Todas las moléculas redujeron significativamente la fosforilación de c-Met, EGFR y ERK tanto a las 6 horas como a las 72 horas, el grado de inhibición dependía de la afinidad de los dominios FN3 a EGFR y/o c-Met. Las moléculas biespecíficas se generaron uniendo el dominio FN3 de unión a EGFR con una afinidad alta ("83" en la Figura es p54AR4-83v2) o media ("17v2" en la Figura es P53A1R5-17v2) al dominio FN3 de unión a a c-Met con afinidad alta ("A3" en la Figura es P114AR7P94-A3) o media ("A5" en la Figura es P114AR5P74-A5).
Figura 7: La acumulación en plasma (parte superior) y tumor (parte inferior) de moléculas biespecíficas de EGFR/cMet de afinidades variables unidas a un dominio de unión a la albúmina (ABD) se muestra 6 horas (izquierda) y 72 horas (derecha) después de la dosificación IP. Seis horas después de la dosificación, la acumulación de tumores es máxima en ratones a los que se les administró una molécula biespecífica que alberga un dominio de unión a EGFR de afinidad media (17v2) o un dominio de unión a EGFR de afinidad alta (83v2). Las moléculas biespecíficas incorporaron los dominios FN3 de unión a EGFR o c-Met de afinidad alta o media de la siguiente manera: 83v2-A5-ABD (ECB18; alta/media para EGFR/cMet) 83v2-A3-ABD (ECB38; alta/ala) 17v2-A5 (ECB28; media/media) 17v2-A3-ABD (ECB39; media/alta) . En la figura, 83v2 se refiere a p54AR4-83v2; 17v2 se refiere a p53A1R5-17v2; A3 se refiere a p1l4AR7P94-A3 y A5 se refiere a p114AR5P74-A5.
Figura 8. Se implantaron xenoinjertos de tumor H292-HGF en ratones SCID beige. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 80 mm3, los ratones recibieron dosis de moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met (25 mg/kg) o vehículo PBS tres veces a la semana. Todas las moléculas biespecíficas redujeron el crecimiento del tumor, siendo la inhibición del crecimiento del tumor (TGI) dependiente de las afinidades de las moléculas para c-Met y EGFR. (EGFR alta-cMet alta se refiere a p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3 (ECB38); EGFR alta-cMet media se refiere a p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5 (ECB18); EGFR media-cMet alta se refiere a p53A1R5-17v7-p11-118 A3 (ECB39); EGFR media -cMet media se refiere a p53A1R5-17-p114AR5P74-A 5 (ECB28)).
Figura 9. Se implantaron xenoinjertos de tumor H292-HGF en ratones SCID beige y se trataron con diferentes terapias. Se muestra la actividad antitumoral de las terapias. (La molécula biespecífica de EGFR/c-Met se refiere a p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3-ABD (ECB38); las otras terapias son crizotinib, erlotinib, cetuximab y la combinación de crizotinib y erlotinib).
Descripción detallada de la invención
El término "dominio de fibronectina de tipo III (FN3)" (dominio FN3) como se usa en el presente documento se refiere a un dominio que se produce con frecuencia en proteínas que incluyen fibronectinas, tenascina, proteínas del citoesqueleto intracelulares, receptores de citocinas y enzimas procarióticas (Bork y Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). Los dominios FN3 de ejemplo son los 15 dominios FN3 diferentes presentes en la tenascina C humana, los 15 dominios FN3 diferentes presentes en la fibronectina humana (FN) y los dominios FN3 sintéticos no naturales como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Pub1 N.° 2010/0216708. Se hace referencia a los dominios FN3 individuales por el número de dominio y el nombre de la proteína, por ejemplo, el tercer dominio FN3 de tenascina (TN3), o el décimo dominio FN3 de fibronectina (FN10).
El término "sustituir" o "sustituido" o "mutar" o "mutar" como se usa en el presente documento se refiere a alterar, eliminar la inserción de uno o más aminoácidos o nucleótidos en un polipéptido o secuencia de polinucleótido para generar una variante de esa secuencia.
El término "aleatorizar" o "aleatorizado" o "diversificado" o "diversificar" como se usa en el presente documento se refiere a hacer al menos una sustitución, inserción o eliminación en una secuencia de polinucleótido o polipéptido.
"Variante" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.
La expresión "se une específicamente" o "unión específica" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad del dominio FN3 de la invención para unirse a un antígeno predeterminado con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1 x 10-6 M o menos, por ejemplo aproximadamente 1 x 10-7 M o menos, aproximadamente 1 x 10-8 M o menos, aproximadamente 1 x 10-9 M o menos, aproximadamente 1 x 10-10 M o menos, aproximadamente 1 x 10-11 M o menos , aproximadamente 1 x 10-12 M o menos, o aproximadamente 1 x 10­ 13 M o menos. Típicamente, el dominio FN3 de la invención se une a un antígeno predeterminado (es decir, EGFR o c-Met) con una Kd que es al menos diez veces menor que su Kd para un antígeno no específico (por ejemplo, BSA o caseína) medido por resonancia de plasmón superficial utilizando, por ejemplo, un instrumento Proteon (BioRad). Por lo tanto, una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met FN3 de la invención se une específicamente a cada EGFR y c-Met con una afinidad de unión (Kd) de al menos 1 x 10-6 M o menos tanto para EGFR como para c-Met . Sin embargo, el dominio FN3 aislado de la invención que se une específicamente a un antígeno predeterminado puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno predeterminado de otras especies (homólogos).
El término "biblioteca" se refiere a una colección de variantes. La biblioteca puede estar compuesta por variantes de polipéptidos o polinucleótidos.
El término "estabilidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una molécula para mantener un estado plegado en condiciones fisiológicas de modo que retenga al menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, la unión a un antígeno predeterminado, tal como EGFR o c - Met.
"Receptor del factor de crecimiento epidérmico" o "EGFR" como se usa en el presente documento se refiere al EGFR humano (también conocido como HER-1 o Erb-B1 (Ullrich et al., Nature 309:418-425, 1984) que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 73 y en el número de acceso en GenBank NP_005219, así como las variantes de origen natural de las mismas. Dichas variantes incluyen el EGFRvlII bien conocido y otras variantes de corte y empalme alternativas (por ejemplo, identificadas por los números de acceso de SwissProt P00533-1 (tipo salvaje; idénticas a SEQ ID NO: 73 y NP_005219), P00533-2 (F404L/L405S), P00533-3 (628-705:
CTGPGLEGCP...GEAPNQALLR ^ PGNESLKAML...SVIITASSCH y 706-1210 eliminados), P00533-4 (C628S y 629-1210 eliminados), variantes Q98, R266, K521, 1674, G962 y p988 (Livingston et al., NIEHS) -SNPs, proyecto genoma ambiental, NIEHS ES15478), T790M, L858R/T790M y de1 (E746, A750).
El "ligando EGFR" como se usa en el presente documento abarca todos los ligandos (por ejemplo, fisiológicos) para EGFR, incluidos EGF, TGF-a, EGF de unión a heparina (HB-EGF), anfiregulina (AR) y epiregulina (EPI).
"Factor de crecimiento epidérmico" (EGF), como se usa en el presente documento, se refiere al EGF humano de 53 aminoácidos bien conocidos que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 74.
"Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos" o "c-Met", como se usa en el presente documento, se refiere al c-Met humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 101 o en el número de acceso en GenBank: NP_001120972 y variantes naturales de los mismos.
El "factor de crecimiento de hepatocitos" (HGF), como se usa en el presente documento, se refiere a1HGF humano bien conocido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 102 que se escinde para formar un dímero de una cadena alfa y beta unidas por un enlace disulfuro.
"Bloquea la unión" o "inhibe la unión", como se usa en el presente documento de manera intercambiable, se refiere a la capacidad de los dominios FN3 de la invención de la molécula que contiene el dominio EGFR/c-Met biespecífica para bloquear o inhibir la unión del ligando EGFR, tal como EGF a EGFR y/o HGF to c-Met, e incluyen el bloqueo/inhibición tanto parcial como completo. El bloqueo/inhibición del ligando de EGFR, tal como EGF a EGFR y/o HGF a c-Met, mediante el dominio FN3 o la molécula que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met FN3 biespecífica, reduce parcial o completamente el nivel normal de señalización de EGFR y/o señalización de c-Met en comparación con la unión del ligando de EGFR de unión de EGFR y/o unión de HGF a c-Met sin bloqueo ni inhibición. El dominio FN3 o la molécula que contiene el dominio FN3 DE EGFR/c-Met biespecífico de la invención "bloquea la unión" del ligando del EGFR, tal como EGF a EGFR y/o HGF a c-Met cuando la inhibición es de al menos 30 %, 35 % , 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. La inhibición de la unión puede medirse utilizando métodos bien conocidos, por ejemplo, midiendo la inhibición de la unión de EGF biotinilado en células A431 que expresan EGFR expuestas al dominio FN3 o la molécula que contiene el dominio FN3 de EFGR/c-Met biespecífica de la invención que utiliza FACS, y utilizando métodos descritos en el presente documento, o midiendo la inhibición de la unión de1HGF biotinilado en el dominio extracelular de c-Met utilizando métodos bien conocidos y métodos descritos en el presente documento.
La expresión "señalización de EGFR" se refiere a la transducción de señales inducida por la unión del ligando de EGFR a EGFR que da como resultado la autofosforilación de al menos un residuo de tirosina en el EGFR. Un ligando de EGFR de ejemplo es EGF.
"Neutraliza la señalización de EGFR" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad del dominio FN3 de la invención para inhibir la señalización de EGFR inducida por el ligando de EGFR, tal como EGF en al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
La expresión "señalización de c-Met" se refiere a la transducción de señales inducida por la unión de HGF a c-Met que da como resultado la autofosforilación de al menos un residuo de tirosina en el c-Met. Típicamente, al menos un residuo de tirosina en las posiciones 1230, 1234, 1235 o 1349 se autofosforila en la unión a HGF.
"Neutraliza la señalización de c-Met" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad del dominio FN3 de la invención para inhibir la señalización de c-Met inducida por HGF en al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %. 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % , 98 %, 99 % o 100 %.
"Sobreexpresión", "sobreexpresado" y "sobreexpresión" como se usa en el presente documento se refieren indistintamente a una célula cancerosa o maligna que tiene niveles considerablemente mayores de EGFR y/o c-Met en la superficie en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede ser causada por la amplificación de genes o por un aumento de la transcripción o traducción. La expresión y sobreexpresión de EGFR y/o c-Met se pueden medir usando ensayos bien conocidos que utilizan, por ejemplo, ELISA, inmunofluorescencia, citometría de flujo o radioinmunoensayo en células vivas o lisadas. Como alternativa, o adicionalmente, los niveles de EGFR y/o las moléculas de ácido nucleico codificantes de c-Met se pueden medir en la célula, por ejemplo, utilizando técnicas de hibridación fluorescente in situ, transferencia de tipo Southern o PCR. EGFR y/o c-Met se sobreexpresan cuando el nivel de EGFR y/o c-Met en la superficie de la célula es al menos 1,5 veces mayor en comparación con la célula normal.
"Tencon", como se usa en el presente documento, se refiere al dominio de fibronectina sintética de tipo III (FN3) que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 1 y se describe en la patente de Estados Unidos Publ. No. US2010/0216708.
Una "célula cancerosa" o una "célula tumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula cancerosa, precancerosa o transformada, ya sea in vivo, ex vivo y en cultivo de tejidos, que presenta cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no necesariamente implican la captación de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y la incorporación de un nuevo ácido nucleico genómico, o la captación de ácido nucleico exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, mutando así un gen endógeno. La transformación/cáncer se ilustra mediante, por ejemplo, cambios morfológicos, inmortalización de células, control de crecimiento aberrante, formación de focos, proliferación, malignidad, niveles de marcadores específicos de tumores, invasividad, crecimiento o supresión de tumores en huéspedes animales adecuados, tales como ratones atímicos y similares, in vitro, in vivo y ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3a ed. 1994)).
El término "vector" significa un polinucleótido capaz de ser duplicado dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos vectoriales típicamente contienen elementos, tales como orígenes de replicación, señales de poliadenilación o marcadores de selección que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estos.
La expresión "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.
El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos unida covalentemente por un esqueleto de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN bicatenarios y monocatenarios son ejemplos típicos de polinucleótidos.
El término "polipéptido" o "proteína" significa una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácidos unidos por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de aproximadamente 50 aminoácidos pueden denominarse "péptidos".
La expresión "molécula biespecífica de EGFR/c-Met" o "molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met FN3", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende un dominio FN3 de unión a EGFR y un dominio FN3 de unión a c-Met distinto que están unidos covalentemente ya sea directamente o a través de un enlazador. Una molécula biespecífica de unión a EGFR/c-Met de ejemplo comprende un primer dominio FN3 que se une específicamente a EGFR y un segundo dominio FN3 que se une específicamente a c-Met.
"Valente", como se usa en el presente documento, se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión específicos para un antígeno en una molécula. Como tales, los términos "monovalente", "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" se refieren a la presencia de uno, dos, cuatro y seis sitios de unión, respectivamente, específicos para un antígeno en una molécula.
"Mezcla", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra o preparación de dos o más dominios FN3 que no están unidos covalentemente entre sí. Una mezcla puede consistir en dos o más dominios FN3 idénticos o dominios FN3 distintos.
Composiciones de la materia
En el presente documento se desvelan moléculas monoespecíficas y biespecíficas que contienen el dominio FN3 de unión a EGFR y/o c-Met. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los dominios FN3 de la invención o ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para hacerlos y usarlos.
Moléculas monoespecíficas de unión a EGFR
En el presente documento se desvelan los dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que se unen específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquean la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, y por lo tanto, pueden usarse ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los dominios FN3 de la invención o ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para hacerlos y usarlos.
Los dominios FN3 de la invención se unen a EGFR con alta afinidad e inhiben la señalización de EGFR, y pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y reducción de la toxicidad fuera del objetivo cuando se comparan con los inhibidores de EGFR de molécula pequeña, y mejoran la penetración en los tejidos cuando se comparan con las terapias convencionales con anticuerpos.
La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR en el que el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia de aminoácidos Tencon de SEQ ID NO: 1 y en el que el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia de aminoácidos de Tencon de la SEQ ID NO: 1.
Los dominios FN3 de la invención en el presente documento descritos pueden bloquear la unión de EGF al EGFR con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 1 x 10-7 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-8 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-9 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-10 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-11 M, o inferior a aproximadamente 1 x 10-12 M en un ensayo de competición que emplea células A431 y detecta la cantidad de fluorescencia del EGF biotinilado unido utilizando estreptavidina-ficoeritrina conjugada a 600 nM en las células A431 incubadas con o sin los dominios FN3 de la invención. Los dominios FN3 de ejemplo pueden bloquear la unión de EGF al EGFR con un valor CI50 entre aproximadamente 1 x 10-9 M y aproximadamente 1 x 10-7 M, tales como los dominios FN3 de unión a EGFR que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122­ 137. Los dominios FN3 de la invención pueden bloquear la unión de EGF al EGFR en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la unión de EGF al EGFR en ausencia de los dominios FN3 de la invención usando las mismas condiciones de ensayo.
El dominio FN3 de la invención descrito en el presente documento puede inhibir la señalización de EGFR en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %. 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de señalización en ausencia de los dominios FN3 de la invención utilizando las mismas condiciones de ensayo.
La unión de un ligando, tal como EGF a EGFR, estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del dominio tirosina quinasa citoplasmático interno y el inicio de múltiples vías de transducción de señales y vías de transactivación involucradas en la regulación de la síntesis de ADN (activación del gen) y la progresión del ciclo celular o división. La inhibición de la señalización de EGFR puede dar como resultado inhibición en una o más vías de señalización de EGFR aguas abajo y, por lo tanto, neutralizar el EGFR puede tener varios efectos, incluida la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, la angiogénesis, la motilidad celular y la metástasis.
La señalización de EGFR puede medirse utilizando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en cualquiera de las tirosinas Y1068, Y1148 y Y1173(Downward et al., Nature 311:483-5, 1984) y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación se puede detectar utilizando métodos bien conocidos, como un ensayo ELISA o un gráfico Western utilizando un anticuerpo específico de fosfotirosina. Se pueden encontrar ensayos de ejemplo en Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 y Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998, y los ensayos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en la posición del residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 2,5 x 10-6 M, por ejemplo, inferior a aproximadamente 1 x 10-6 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-7 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-8 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-9 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-10 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-11 M, o inferior a aproximadamente 1 x 10-12 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en la posición del residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 entre aproximadamente 1,8 x 10-8 M y aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células A431 utilizando 50 ng/ml de EGF humano. Dichos dominios FN3 de ejemplo son aquellos que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención se une al EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 1 x 10-9 M, menos de aproximadamente 1 x 10-10 M, menos de aproximadamente 1 x 10-11 M, menos de aproximadamente 1 x 10-12 M, o menos de aproximadamente 1 x 10-13 M según se determina mediante resonancia de plasmón superficial o el método Kinexa, tal como lo practican los expertos en la materia. En algunas realizaciones, el dominio FN3 de la invención se une al EGFR humano con una Kd de aproximadamente 2 x 10'1° a aproximadamente 1 x 10'8 M. La afinidad de un dominio FN3 por EGFR puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992)); y procedimientos descritos en el presente documento). La afinidad medida de una interacción de antígeno-dominio FN3 particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por lo tanto, las medidas de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se preparan, preferentemente, con soluciones estandarizadas del armazón proteico y el antígeno, y un tampón estandarizado, tal como el tampón descrito en el presente documento.
Los dominios FN3 de ejemplo de la invención que se unen a EGFR incluyen los dominios FN3 de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137.
El dominio FN3 que se une específicamente a EGFR comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 que se une específicamente a EGFR comprende
un bucle FG que comprende la secuencia HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en la que X9 es M o I; y
un bucle BC que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181):
en la que
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; y
X8 es Y, F o L.
Los dominios FN3 de la invención que se unen específicamente a EGFR e inhiben la autofosforilación de EGFR como se describe en el presente documento pueden comprender como característica estructural un bucle FG que comprende la secuencia HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en la que Xg es M o I. Dichos dominios FN3 pueden comprender además un bucle BC de 8 o 9 aminoácidos de longitud y definido por la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), e inhibe la autofosforilación de EGFR con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 2,5 x 10-6 M, o con un valor de CI50 de entre aproximadamente 1,8 x 10­ 8 M a aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano.
Los dominios FN3 de la invención que se unen específicamente a EGFR e inhiben la autofosforilación de EGFR como se describe en el presente documento, comprenden además la secuencia de LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), o la secuencia LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8 DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183),
en la que
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
X8 es Y, F o L; y
Xg es M o I
Los dominios FN3 de unión a EGFR como se describen en el presente documento pueden generarse y analizarse para determinar su capacidad para inhibir la autofosforilación de EGFR usando métodos bien conocidos y métodos descritos en el presente documento.
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a EGFR, en donde el dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID No : 18-29, 107-110, 122-137 o 194-211.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los dominios FN3 de unión a EGFR comprenden una metionina iniciadora (Met) unida al término N o una cisteína (Cys) unida a un extremo C de un dominio FN3 en particular, por ejemplo para facilitar la expresión y/o conjugación de moléculas que prolongan la semivida.
El dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado de la invención que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF al EGFR, se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1. La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF al EGFR, en el que el dominio FN3 se une a EGFR con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27).
Los residuos de aminoácidos que contribuyen a la unión del dominio FN3 a EGFR pueden identificarse utilizando métodos, tales como mutagénesis y evaluando los residuos de unión/superficie por estructura cristalina. Las sustituciones en los residuos D23, F27, Y28, V77, G85 en el dominio F54 de unión a Eg FR P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27) redujeron la unión de EGFR al dominio FN3 en más de 100 veces. Los dominios FN3 de unión a EGFR P54AR4-48, P54AR4-81, P53A1R5-17v2, P54AR4-83v22 y P54AR4-83v23 comparten estos residuos y se puede esperar que se unan a EGFR con los mismos residuos de paratopo que P54AR4-83v2. Se pueden crear otros dominios FN3 de unión a EGFR manteniendo constantes las posiciones D23, F27, Y28, V77, G85 mientras se cambian los aminoácidos ubicados en las otras posiciones de los bucles BC y FG (posiciones 24, 25, 75, 76, 78, 79). , 80, 81, 82, 83, 84 y 86). Estos cambios se pueden realizar mediante el diseño de aminoácidos específicos en posiciones específicas o mediante la incorporación de estas posiciones en una biblioteca que reemplaza estos sitios con aminoácidos aleatorios. Los nuevos dominios FN3 diseñados de tal manera se pueden usar para detectar o seleccionar propiedades optimizadas, tales como la unión a EGFR, la solubilidad, la estabilidad, la inmunogenicidad o la semivida en suero.
Moléculas monoespecíficas de unión a c-met
En el presente documento se desvelan los dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que se unen específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquean la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y, por lo tanto, se pueden usar ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los dominios FN3 de la invención o ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para hacerlos y usarlos. Los dominios FN3 de la invención en el presente documento descritos en el presente documento se unen a c-Met con alta afinidad e inhiben la señalización de c-Met, y pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad reducida fuera del objetivo cuando se comparan con los inhibidores de molécula pequeña de c-Met y mejor penetración tisular en comparación con la terapéutica convencional de anticuerpos. Los dominios FN3 de la invención son monovalentes, por lo tanto evitan la agrupación y activación de receptores no deseados que pueden producirse con otras moléculas bivalentes.
La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met.
Los dominios FN3 de la invención descritos en el presente documento pueden bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 1 x 10-7 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-8 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-g M , inferior a aproximadamente 1 x 10-10 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-11 M o inferior a aproximadamente 1 x 10-12 M en un ensayo que detecta la inhibición de la unión de1HGF biotinilado a la proteína de fusión c-Met-Fc en La presencia de los dominios FN3 de la invención. Los dominios FN3 de ejemplo pueden bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de CI50 entre aproximadamente 2 x 10'1° M a aproximadamente 6 x 10'8 M Los dominios FN3 de la invención pueden bloquear la unión de HGF a c-Met al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % , 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la unión de HGF a c-Met en ausencia de los dominios FN3 de la invención usando las mismas condiciones de ensayo.
El dominio FN3 de la invención descrito en el presente documento puede inhibir la señalización de c-Met en al menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %. 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de señalización en ausencia de dominios FN3 de la invención utilizando las mismas condiciones de ensayo.
La unión de HGF a c-Met estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del dominio tirosina quinasa citoplasmático interno y el inicio de múltiples vías de transducción y transactivación de señales implicadas en la regulación de la síntesis de ADN (activación génica) y la progresión o división del ciclo celular. La inhibición de la señalización de c-Met puede dar como resultado la inhibición de una o más vías de señalización de c-Met aguas abajo y, por lo tanto, la neutralización de c-Met puede tener varios efectos, incluida la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, la angiogénesis, la motilidad celular y la metástasis.
La señalización de c-Met se puede medir utilizando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en al menos un residuo de tirosina Y1230, Y1234, Y1235 o Yl349, y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para la fosfotirosina en un ensayo ELISA o ensayos de transferencia de tipo Western para determinar la actividad tirosina quinasa (Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997; Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998), y los ensayos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en la posición 1349 del residuo c-Met con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 1 x 10-6 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-7 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-8 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-9 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-10 M, inferior a aproximadamente 1 x 10-11 M, o inferior a aproximadamente 1 x 10- 12 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano recombinante.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en la tirosina Y1349 de c-Met con un valor de CI50 entre aproximadamente 4 x 10-9 M y aproximadamente 1 x 10-6 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano recombinante.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención se une al c-Met humano con una constante de disociación (Kd) igual o inferior a aproximadamente 1 x 10'7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, 1 x 10-13 M, 1 x 10-14 M, o 1 x 10-15 M según se determina mediante resonancia de plasmón superficial o el método Kinexa, tal como lo practican los expertos en la materia. En algunas realizaciones, el dominio FN3 de la invención se une a c-Met humano con una Kd de aproximadamente 3 x 10'1° a aproximadamente 5 x 10'8 M. La afinidad de un dominio FN3 por c-Met puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992)); y procedimientos descritos en el presente documento). La afinidad medida de una interacción de antígeno-dominio FN3 particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por lo tanto, las medidas de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se preparan, preferentemente, con soluciones estandarizadas del armazón proteico y el antígeno, y un tampón estandarizado, tal como el tampón descrito en el presente documento.
Los dominios FN3 de ejemplo de la invención que se unen a c-Met incluyen dominios FN3 que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 32-49, 111-114 o 212-223.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met comprende
una cadena C y un bucle CD que comprende la secuencia DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en la que
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
una cadena F y un bucle FG que comprende la secuencia TEYX17VX18X19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en la que
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Y o L.
Los dominios FN3 de la invención que se unen específicamente a c-Met e inhiben la autofosforilación de c-Met descrita en el presente documento comprenden además la secuencia: LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX11VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186),
en la que:
Figure imgf000012_0001
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a c-Met, en el que el dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114.
En el presente documento se desvela un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF al c-Met, en el que el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1.
La invención también proporciona un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met, en el que el dominio FN3 se une a c-Met con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos R34, F38 , M72 y 179 en P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41).
Los residuos de aminoácidos que contribuyen a la unión del dominio FN3 a c-Met pueden identificarse utilizando métodos, tales como mutagénesis y evaluando los residuos de unión/superficie por estructura cristalina. Las sustituciones en los residuos R34S, F38S, M72S e I79S en el dominio Fn3 de unión a c-Met P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 27) redujeron la unión de c-Met al dominio FN3 en más de 100 veces. Las moléculas de los dominios FN3 de unión a c-Met P114AR7P92-F3, P114AR7P95-D3, P114AR7P95-F10 and P114AR7P95-H8 comparten estos residuos y se puede esperar que se unen a c-Met con los mismos residuos de paratopo que P114AR7P95-A3. Se pueden crear otros dominios FN3 de unión a c-Met manteniendo las posiciones R34S, F38S, M72S e I79S constantes mientras se cambian los aminoácidos ubicados en las otras posiciones de la cadena C, la cadena F, el bucle CD y/o los bucles FG (posiciones 32, 36, 39, 40, 68, 70, 78 y 81). Estos cambios se pueden realizar mediante el diseño de aminoácidos específicos en posiciones específicas o mediante la incorporación de estas posiciones en una biblioteca que reemplaza estos sitios con aminoácidos aleatorios. Los nuevos dominios FN3 diseñados de tal manera se pueden usar para detectar o seleccionar propiedades optimizadas, tales como la unión de c-Met, la solubilidad, la estabilidad, la inmunogenicidad o la semivida en suero.
Aislamiento de los dominios FN3 de unión a EGFR o c-Met de una biblioteca basada en la secuencia de Tencon
Tencon (SEQ ID NO: 1) es un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) no natural diseñado a partir de una secuencia de consenso de quince dominios FN3 de tenascina-C humana (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; patente de Estados Unidos Publ. N.° 2010/0216708). La estructura cristalina de Tencon muestra seis bucles expuestos en la superficie que conectan siete cadenas beta características de los dominios FN3, denominadas las cadenas beta A, B, C, D, E, F y G, y los bucles denominados AB, BC, CD, DE, EF y FG (Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; patentes de Estados Unidos N.° 6.673.901). Estos bucles, o residuos seleccionados dentro de cada bucle, se pueden aleatorizar para construir bibliotecas de dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que pueden usarse para seleccionar nuevas moléculas que se unen a EGFR o c-Met. La Tabla 1 muestra las posiciones y secuencias de cada bucle y cadena beta en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La biblioteca diseñada en función de la secuencia de Tencon puede, por tanto, tener un bucle FG aleatorio o bucles BC y FG aleatorios, tales como las bibliotecas TCL1 o TCL2, como se describe a continuación. El bucle Tencon BC tiene una longitud de 7 aminoácidos, por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos pueden ser aleatorizados en la biblioteca diversificada en el bucle BC y diseñados en base a la secuencia de Tencon. El bucle Tencon FG tiene una longitud de 7 aminoácidos, por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos pueden ser aleatorizados en la biblioteca diversificada en el bucle FG y diseñados en base a la secuencia de Tencon. La diversidad adicional en los bucles en las bibliotecas de Tencon se puede lograr mediante la inserción y/o deleción de residuos en los bucles. Por ejemplo, los bucles FG y/o BC pueden extenderse en 1-22 aminoácidos, o disminuirse en 1-3 aminoácidos. El bucle FG en Tencon tiene una longitud de 7 aminoácidos, mientras que el bucle correspondiente en las cadenas pesadas de anticuerpos varía de 4 a 28 residuos. Para proporcionar la máxima diversidad, el bucle de FG se puede diversificar en secuencia y en longitud para corresponder al rango de longitud del anticuerpo CDR3 de 4-28 residuos. Por ejemplo, el bucle FG se puede diversificar aún más en longitud extendiendo el bucle en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos adicionales.
La biblioteca diseñada en base a la secuencia de Tencon también puede tener superficies alternativas aleatorias que se forman en un lado del dominio FN3 y comprenden dos o más cadenas beta, y al menos un bucle. Una de estas superficies alternativas está formada por aminoácidos en las cadenas beta y C, y en los bucles CD y FG (una superficie C-CD-F-FG). Un diseño de biblioteca basado en la superficie C-CD-F-FG de Tencon alternativa que se muestra en la Figura 1 y la generación detallada de dichas bibliotecas se describe en la patente de Estados Unidos Publ. N.° US2013/0226834. La biblioteca diseñada con base en la secuencia de Tencon también incluye bibliotecas diseñadas con base en las variantes de Tencon, tales como las variantes de Tencon que tienen sustituciones en las posiciones de residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 o 86 (numeración de residuos correspondiente a la SEQ ID NO: 1), y cuyas variantes muestran mejor estabilidad térmica. Variantes de ejemplo de Tencon se describen en la patente de Estados Unidos Publ. N.° 2011/0274623, e incluyen Tencon27 (SEQ iD NO: 99) que tienen las sustituciones E11R, L17A, N46V y E86I en comparación con Tencon de la SEQ ID NO: 1.
Tabla 1.
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Tencon y otras bibliotecas basadas en la secuencia de FN3 se pueden aleatorizar en las posiciones de residuos seleccionadas utilizando un conjunto aleatorio o definido de aminoácidos. Por ejemplo, las variantes en la biblioteca que tienen sustituciones aleatorias pueden generarse usando los codones NNK, que codifican los 20 aminoácidos naturales. En otros esquemas de diversificación, los codones DVK se pueden usar para codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys. Como alternativa, los codones NNS pueden usarse para dar lugar a los 20 residuos de aminoácidos y al mismo tiempo reducir la frecuencia de los codones de terminación. Las bibliotecas de dominios FN3 con distribución de aminoácidos sesgada en las posiciones a diversificar se pueden sintetizar, por ejemplo, utilizando la tecnología Slonomics® (http:_//www_sloning_com). Esta tecnología utiliza una biblioteca de tripletes bicatenarios prefabricados que actúan como bloques componente universales suficientes para miles de procesos de síntesis de genes. La biblioteca de tripletes representa todas las posibles combinaciones de secuencias necesarias para construir cualquier molécula de ADN deseada. Las designaciones de codones son de acuerdo con el código IUB bien conocido.
Los dominios FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la invención como se describe en el presente documento se pueden aislar produciendo la biblioteca FN3 tal como la biblioteca Tencon usando la expresión en cis para ligar fragmentos de ADN que codifican las proteínas de armazón a un fragmento de ADN que codifica RepA para generar un conjunto de complejos de proteína-ADN formados después de la traducción in vitro, en el que cada proteína está asociada de manera estable con el ADN que la codifica (patentes de Estados Unidos No. 7.842.476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004), y analizando la biblioteca para detectar unión específica a EGFR y/o c-Met mediante cualquier método conocido en la técnica y descrito en el Ejemplo.. Ejemplos de métodos bien conocidos que pueden usarse son ELISA, inmunoensayos en sándwich y ensayos competitivos y no competitivos (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Los dominios FN3 identificados que se unen específicamente a EGFr o c-Met se caracterizan además por su capacidad para bloquear el ligando de EGFR, tal como la unión de EGF a EGFR, o la unión de HGF a c-Met, y por su capacidad para inhibir la señalización de EGFR y/o c-Met utilizando los métodos descritos en el presente documento.
Los dominios FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la invención como se describe en el presente documento pueden generarse usando cualquier dominio FN3 como molde para generar una biblioteca y cribar la biblioteca en busca de moléculas que se unan específicamente a EGFR o c-Met usando los métodos proporcionados en el mismo. Los dominios FN3 de ejemplo que se pueden usar son el tercer dominio FN3 de tenascina C (TN3) (SEQ ID NO: 75), Fibcon (SEQ ID NO: 76) y el décimo dominio FN3 de la fibronectina (FN10) (SEQ ID NO: 77). Se utilizan técnicas estándar de clonación y expresión para clonar las bibliotecas en un vector o sintetizar casetes de ADNc bicatenario de la biblioteca, para expresar o traducir las bibliotecas in vitro. Por ejemplo, se pueden usar expresión en ribosomas (Hanes y Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), expresión de ARNm (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997), u otros sistemas acelulares (patente de Estados Unidos n.° 5.643.768). Las bibliotecas de las variantes del dominio FN3 pueden expresarse como proteínas de fusión mostradas en la superficie, por ejemplo, de cualquier bacteriófago adecuado. Los métodos para presentar polipéptidos de fusión en la superficie de un bacteriófago son bien conocidos (publ. de patente de Estados Unidos N.° 2011/0118144; publ. de patente de Estados Unidos N.° WO2009/085462; patente de Estados Unidos N.° 6.969.108; patente de Estados Unidos N.° 6.172.197; patente de Estados Unidos N.° 5.223.409; patente de Estados Unidos N.° 6.582.915; patente de Estados Unidos N.° 6.472.147).
Los dominios FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la invención como se describe en el presente documento pueden modificarse para mejorar sus propiedades, tales como mejorar la estabilidad térmica y la reversibilidad del plegamiento y desplegamiento térmico. Se han aplicado varios métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de las proteínas y las enzimas, incluido el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables muy similares, el diseño de puentes disulfuro estabilizantes, las mutaciones para aumentar la propensión a la hélice alfa, la ingeniería de puentes salinos, la alteración del carga superficial de la proteína, la evolución dirigida y la composición de las secuencias de consenso (Lehmann y Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001) La alta estabilidad térmica puede aumentar el rendimiento de la proteína expresada, mejorar la solubilidad o la actividad, disminuir la inmunogenicidad y minimizar la necesidad de una cadena de frío en la fabricación. Los residuos que pueden ser sustituidos para mejorar la estabilidad térmica de Tencon (SEQ ID NO: 1) son las posiciones de residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 86, y se describen en la publicación de patente de Estados Unidos N.° 2011/0274623. Las sustituciones correspondientes a estos residuos pueden incorporarse en los dominios FN3 o a las moléculas biespecíficas que contienen dominios FN3 de la invención.
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF a EGFR, que comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137, que comprende además sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met, que comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114, que comprende además sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1).
Las sustituciones de ejemplo son las sustituciones E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y y E86I (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 1).
En algunas realizaciones, los dominios FN3 de la invención comprenden sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E86I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
Los dominios FN3 que se unen específicamente a EGFR como se describe en el presente documento (Figura 1) tienen un bucle FG extendido cuando se comparan con Tencon (SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, los residuos correspondientes a los residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1) son los residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 91 en los dominios FN3 del EGFR que se muestran en la Figura 1A y 1B, excepto el dominio FN3 de la SEQ ID NO: 24, en el que los residuos correspondientes son residuos 11, 14, 17, 38, 74 y 92 debido a una inserción de un aminoácido en el bucle BC.
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF a EGFR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122­ 137 o 194-211, teniendo opcionalmente una, dos o tres sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E86I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La invención también proporciona un dominio FN3 aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 32-49, 111-114 o 212-223, que tienen opcionalmente una, dos o tres sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E86I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La medición de la estabilidad proteica y la labilidad proteica se pueden ver como aspectos iguales o diferentes de la integridad de las proteínas. Las proteínas son sensibles o "lábiles" a la desnaturalización causada por calor, por radiación ultravioleta o ionizante, cambios en la osmolaridad ambiental y el pH si están en solución líquida, fuerza de corte mecánica impuesta por filtración en tamaño de poro pequeño, radiación ultravioleta, radiación ionizante, tal como por irradiación gamma, deshidratación química o por calor, o cualquier otra acción o fuerza que pueda causar la alteración de la estructura de la proteína. La estabilidad de la molécula se puede determinar utilizando métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede determinarse midiendo la temperatura de fusión térmica ("TF"), la temperatura en grados Celsius (°C) a la que se despliega la mitad de las moléculas, utilizando métodos estándar. Normalmente, cuanto más alta es la TF, más estable es la molécula. Además del calor, el entorno químico también cambia la capacidad de la proteína para mantener una estructura tridimensional particular.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los dominios FN3 que se unen a EGFR o c-Met de la invención exhiben estabilidad aumentada en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % o más en comparación con el mismo dominio antes de la ingeniería medida por el aumento en la TF.
La desnaturalización química también se puede medir mediante diversos métodos. Los desnaturalizantes químicos incluyen clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, acetona, disolventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (sulfato de amonio, bromuro de litio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenceno e hidruros, tales como borohidruro de sodio), detergentes no iónicos e iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (por ejemplo, fosfolípidos), y desnaturalizantes dirigidos. La cuantificación de la extensión de la desnaturalización puede depender de la pérdida de una propiedad funcional, tal como la capacidad para unirse a una molécula diana, o mediante propiedades fisicoquímicas, tal como la tendencia a la agregación, exposición de los residuos de disolvente antes inaccesibles o la rotura o formación de puentes disulfuro.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio FN3 de la invención que se une a EGFR o c-Met exhibe estabilidad aumentada en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%. , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% o más en comparación con el mismo armazón antes de la ingeniería, medido utilizando clorhidrato de guanidinio como producto químico desnaturalizante. El aumento de la estabilidad se puede medir en función de la disminución de la fluorescencia del triptófano en el tratamiento con concentraciones crecientes de clorhidrato de guanidina utilizando métodos bien conocidos.
Los dominios FN3 de la invención en el presente documento descritos pueden generarse como monómeros, dímeros o multímeros, por ejemplo, como un medio para aumentar la valencia y, por lo tanto, la avidez de la unión de la molécula diana, o para generar armazones biespecíficos o multiespecíficos que unen simultáneamente dos o más más moléculas diana diferentes. Los dímeros y multímeros pueden generarse mediante la unión de armazones proteicos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos, por ejemplo, mediante la inclusión de un enlazador de aminoácidos, por ejemplo, un enlazador que contiene poliglicina, glicina y serina, o alanina y prolina. El enlazador de ejemplo incluye (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGS)2 (SEQ ID NO: 224), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)-,0 (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (SEQ ID NO: 83) y A(EAAAK)sAAA (SEQ ID NO: 84). Los dímeros y multímeros se pueden unir unos a otros en una dirección N a C. El uso de enlazadores peptídicos artificiales y de origen natural para conectar polipéptidos a nuevos polipéptidos de fusión unidos es bien conocido en la literatura (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson y Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; patente de Estados Unidos n.° 5.856.456).
Moléculas biespecíficas de unión a EGFR/c/Met
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención descritas en el presente documento pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad reducida fuera del objetivo cuando se comparan con los inhibidores de EGFR de molécula pequeña, y mejoran la penetración en los tejidos cuando se comparan con los tratamientos terapéuticos convencionales con anticuerpos. La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención proporcionan un efecto inhibidor sinérgico significativamente mejorado cuando se comparan con una mezcla de dominios de unión a EGFR y de unión a c-Met. Las moléculas pueden adaptarse a una afinidad específica hacia EGFR y c-Met para maximizar la penetración y retención del tumor. Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de unión a EGFR/c-Met proporcionan una inhibición más eficiente de las vías de señalización de EGFR y/o c-Met e inhiben el crecimiento tumoral más eficazmente que el cetuximab (Eribtux®)
La invención también proporciona una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 aislada que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en el que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) ) a EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y en el que el primer dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 87 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención descritas en el presente documento pueden generarse uniendo covalentemente cualquier dominio FN3 de unión a EGFR y cualquier dominio FN3 de unión a c-Met-de la invención directamente o mediante un enlazador. Por lo tanto, el primer dominio FN3 de la molécula biespecífica puede tener las características descritas anteriormente para los dominios FN3 de unión a EGFR, y el segundo dominio FN3 de la molécula biespecífica puede tener las características descritas anteriormente para los dominios FN3 de unión a c-Met.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el primer dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano, y el segundo dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI 50 inferior a aproximadamente 1,5 x 106 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el primer dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 de entre aproximadamente 1,8 x 10'8 M y aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células NCI-H292 usando 50 ng/ml de EGF humano, y el segundo dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 entre aproximadamente 4 x 10-9 M y aproximadamente 1,5 x 10-6 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el primer dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met se une al EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M, y el segundo dominio FN3 de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met se une a c-Met humano con una Kd de menos de aproximadamente 5 x 10-8 M.
En la molécula biespecífica de unión a EGFR y c-Met como se describe en el presente documento, el primer dominio FN3 se une a EGFR humano con una Kd de entre aproximadamente 2 x 10-10 a aproximadamente 1 x 10-8 M, y el segundo dominio FN3 se une a c -Met con una Kd de entre aproximadamente 3 x 10-10 a aproximadamente 5 * 10-8 M.
La afinidad de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met por EGFR y c-Met se puede determinar como se describe en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 5 para las moléculas monoespecíficas.
El primer dominio FN3 en la molécula biespecífica de EGFR/c-Met de la invención puede bloquear la unión de EGF a EGFR con un valor de CI50 de entre aproximadamente 1 x 10-9 M y aproximadamente 1,5 x 10-7 M en un ensayo que emplea células A431 y la detección de la cantidad de fluorescencia del EGF biotinilado unido utilizando el conjugado de estreptavidina-ficoeritrina a 600 nM en células A431 incubadas con o sin el primer dominio FN3. El primer dominio FN3 en la molécula biespecífica de EGFR/c-Met de la invención puede bloquear la unión de EGF al EGFR en al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la unión de EGF a EGFR en ausencia de los primeros dominios FN3 usando las mismas condiciones de ensayo.
El segundo dominio FN3 en la molécula biespecífica de EGFR/c-Met de la invención puede bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de CI50 de entre aproximadamente 2 x 10-10 M y aproximadamente 6 x 10-8 M en un ensayo que detecta inhibición de la unión del HGF biotinilado a la proteína de fusión c-Met-Fc en presencia del segundo dominio FN3. El segundo dominio FN3 en la molécula biespecífica de EGFR/c-Met puede bloquear la unión de HGF a c-Met en al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % , 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con la unión de HGF a c -Met en ausencia del segundo dominio FN3 usando las mismas condiciones de ensayo.
La molécula biespecífica de EGFR/c-Met de la invención descrita en el presente documento puede inhibir la señalización de eGfR y/o c-Met en al menos un 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de señalización en ausencia de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met de la invención usando las mismas condiciones de ensayo.
La señalización de EGFR y c-Met se puede medir utilizando varios métodos bien conocidos como se ha descrito anteriormente para las moléculas monoespecíficas.
Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met de la invención como se describen en el presente documento que comprenden el primer dominio FN3 que se une específicamente a EGFR y el segundo dominio FN3 que se une específicamente a c-Met proporcionan una inhibición sinérgica significativamente aumentada de la señalización de EGFR y c/Met y la proliferación de células tumorales en comparación con la inhibición sinérgica observada por una mezcla del primer y segundo dominio FN3. La inhibición sinérgica puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la inhibición de la fosforilación de ERK por las moléculas biespecíficas que contienen el dominio f N3 de EGFR/c-Met y por una mezcla de dos moléculas monoespecíficas, una que se une a EGFR t la otra a c-Met. Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met de la invención pueden inhibir la fosforilación de ERK con un valor de CI50 al menos aproximadamente 100 veces más pequeño, por ejemplo, al menos 500, 1000, 5000 o 10,000 veces menor en comparación con el valor de CI50 para una mezcla de do dominios FN3 monoespecíficos, lo que indica al menos 100 veces más potencia para las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met cuando se comparan con la mezcla de dos dominios FN3 monoespecíficos. Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR-c-Met pueden inhibir la fosforilación de ERK con un valor de CI50 de aproximadamente 5 x 10-9 M o menos. La fosforilación de ERK se puede medir usando métodos estándar y métodos descritos el presente documento.
La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención como se describe en el presente documento puede inhibir la proliferación de células H292 con un valor de CI50 que es al menos 30 veces menos cuando se compara con el valor de CI50 de inhibición del crecimiento de células H292 con una mezcla del primer dominio FN3 y el segundo FN3, en el que la proliferación celular se induce con medio que contiene FBS al 10 % suplementado con 7,5 ng/ml de HGF. La molécula biespecífica de la invención como se describe en el presente documento puede inhibir la proliferación de células tumorales con un valor de CI50 que es aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o aproximadamente 1000 veces menor que el valor de la CI50 de inhibición de la proliferación de células tumorales con una mezcla del primer dominio FN3 y el segundo dominio FN3. La inhibición de la proliferación de células tumorales puede medirse utilizando métodos estándar y métodos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met se une a EGFR con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met se une a c-Met con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos R34, F38, M72 y 179 en P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41).
Los residuos de paratopo en las moléculas biespecíficas se pueden identificar mediante estudios de mutagénesis o a partir de estructuras de cocristales del dominio FN3 y se pueden emplear estudios de mutagénesis de EGFR o c-Met, por ejemplo, mediante el uso de barrido de alanina, y las variantes resultantes se pueden analizar para determinar su unión a EGFR o c-Met utilizando métodos estándar. Típicamente, los residuos de paratopo son aquellos residuos que, cuando se mutagenizan, dan como resultado variantes con una unión reducida o abolida a EGFR o c-Met. Los dominios FN3 de unión a EGFR con sustituciones en las posiciones de residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), cuando están sustituidos, reducen la unión al EGFR al menos 100 veces en comparación con el P54AR4-83v2 de tipo salvaje. Las moléculas biespecíficas ECB1, ECB2, ECB3, ECB4, ECB5, ECB6, ECB7, ECB15, ECB17, ECB60, ECB37, ECB94, ECB95, ECB96, ECB97, ECB91, ECB18, ECB28, ECB38, ECB39, ECB168 y ECB176 tienen D, F, Y, V y G en las posiciones de los residuos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 y se espera que se unan a EGFR con estos residuos. Los dominios FN3 de unión a c-Met con sustituciones en las posiciones de residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos R34, F38, M72 e I79 de P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41), cuando están sustituidos, eliminan o reducen la unión a c-Met al menos 100 veces en comparación con el P114AR7P95-A3 de tipo salvaje. Las moléculas biespecíficas ECB2, ECB5, ECB15, ECB60, ECB38 y ECB39 tienen R, F, M e I en las posiciones de residuos correspondientes a los residuos R34, F38, M72 y I79 de P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41) y se espera que se unan a c-Met con estos residuos.
La invención también proporciona una molécula biespecífica que contiene el dominio FN300000000000000000 que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en el que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (hGf ) a c-Met, en el que
el primer dominio FN3 comprende
un bucle FG que comprende la secuencia HNVYKDTNXgRGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en la que Xg es M o I; y
un bucle BC que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181),
en la que
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, P, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; y
X8 es Y, F o L; y
el segundo dominio FN3 comprende
una cadena C y un bucle CD que comprende la secuencia DSFX10TRYX11E X12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en la que
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
una cadena F y un bucle FG que comprende la secuencia TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en la que
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Y o L.
En algunas otras realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica comprende el primer dominio FN3 que se une a EGFR que comprende la secuencia:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNXgRGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), o la secuencia LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8 DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV LGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183),
en la que en las SEQ ID NO: 182 y 183;
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
X8 es Y, F o L; y
X9 es M o I.
En algunas otras realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica comprende el segundo dominio FN3 que comprende c-Met LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186),
en la que:
X10 es W
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K;
X16 es E o D;
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T R, H o K;
X22 es I, v o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Y o L.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met FN3 a modo de ejemplo comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121, 138-165, 170-178 o 190-193.
Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met de la invención como se describen en el presente documento comprenden ciertas características estructurales asociadas con sus características funcionales, tales como la inhibición de la autofosforilación de EGFR, tal como el bucle FG del primer dominio FN3 que se une a EGFR que comprende la secuencia HNVYKDTNXgRGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en la que Xg es M o I.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención
inhiben la fosforilación de EGFR inducida por EGF en los residuos de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 8 x 10-7 M cuando se mide en células H292 utilizando 50 ng/ml de EGF humano; inhiben la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 8,4 x 10-7 M cuando se mide en células NCI - H441 usando 100 ng/ml de HGF humano;
inhiben la proliferación de células NCI-H292 inducida por HGF con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 9,5 x 10-6 M, en el que la proliferación celular se induce con un 10 % de FBS que contiene 7,5 ng de HGF; se unen a EGFR con una Kd de menos de aproximadamente 2,0 x 10-8 M; o se unen a c-Met con una Kd de menos de aproximadamente 2,0x 10-8 M; en el que la Kd se mide utilizando resonancia de plasmón superficial como se describe en el Ejemplo 3 o el Ejemplo 5.
En otra realización, las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención inhiben la fosforilación de EGFR inducida por EGF en los residuos de EGFR Tirosina 1173 con una CI50 entre aproximadamente 4,2 x 10-9 M y 8 x 10-7 M cuando se mide en células H292 utilizando 50 ng/ml de EGF humano;
inhiben la fosforilación de c-Met inducida por HGF en los residuos de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 entre aproximadamente 2,4 x 10'8 M y aproximadamente 8,4 x 10-7 M cuando se mide en células NCI - H441 usando 100 ng/ml de HGF humano;
inhiben la proliferación de células NCI-H292 inducida por HGF con un valor de CI50 entre aproximadamente 2,3 x 10-8 M y aproximadamente 9,5 x 10-6M, en el que la proliferación celular se induce con un 10 % de FBS que contiene 7,5 ng de HGF;
se unen a EGFR con una Kd de entre aproximadamente 2 x 10'1° M y aproximadamente 2,0 x 10-8 M; o se unen a c-Met con una Kd entre aproximadamente 1 x 10-9 M y aproximadamente 2,0 x 10-8 M; en el que la Kd se mide utilizando resonancia de plasmón superficial como se describe en el Ejemplo 3 o el Ejemplo 5.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met comprenden el dominio FN3 de unión a EGFR que comprende la secuencia LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X1X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV HNVYKDTNX9RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), en la que
X1 es D;
X2 es D;
X3 es P;
X4 está ausente;
X5 es H o W;
X6 es A;
X7 es F
X8 es Y; y
Xg es M o I; y
el dominio FN3 de unión a c-Met que comprende la secuencia LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186),
en la que
X10 es W;
X11 es F;
X12 es F;
X13 es V o L;
X14 es G o S;
X15 es S o K;
X16 es E o D;
X17 es V;
X18 es N;
X19 es L o M;
X20 es G o S;
X21 es S o K;
X22 es I; y
X23 es P.
Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met de ejemplo son aquellas que tienen la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 5761, 62, 6364, 6566, 6768 o 190-193.
Las moléculas biespecíficas de la invención como se describe en el presente documento pueden comprender además sustituciones en una o más posiciones de residuos en el primer dominio FN3 y/o el segundo dominio FN3 correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon ( SEQ ID NO: 1) como se ha descrito anteriormente, y una sustitución en la posición 29. Las sustituciones de ejemplo son las sustituciones E11N, E14P, L17A, E37P, n46V, G73Y, E86I y D29E (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 1). Los expertos en la materia apreciarán que pueden usarse otros aminoácidos para sustituciones, tales como aminoácidos dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales como se describe a continuación. Las variantes generadas pueden analizarse para determinar su estabilidad y unión a EGFR y/o c-Met utilizando los métodos del presente documento.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met comprende el primer dominio FN3 que se une específicamente a EGFR y el segundo dominio FN3 que se une específicamente a c-Met, en el que el primer dominio FN3 comprende la secuencia:
LPAPKNLVVSX24 VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), en la que
X24 es E, N o R
X25 es E o P;
X26 es L o A;
X27 es H o W;
X28 es E o D;
X29 es E o P;
X30 es N o V;
X31 es G o Y;
X32 es M o I; y
X33 es E o I;
y el segundo dominio FN3 comprende la secuencia:
LPAPKNLWSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42
LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT (SEQ ID NO: 188); en la que
X34 es E, N o R
X35 es E o P;
X36 es L o A;
X37 es E o P;
X38 es V o L;
X39 es G o S;
es S o K;
X41 es E o D;
X42 es N o V;
X43 es L o M;
X44 es G o S;
X45 es S o K; y
X46 es E o I.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met comprende el primer dominio FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención como se describe en el presente documento pueden adaptarse a una afinidad específica hacia EGFR y c-Met para maximizar la acumulación de tumores.
En el presente documento se desvela una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 aislado que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en el que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (hGf ) a c-Met, en el que el primer dominio FN3 y el segundo dominio FN3 se aíslan de una biblioteca diseñada en base a la secuencia de Tencon de SEQ ID NO: 1.
La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención como se describe en el presente documento puede generarse mediante el acoplamiento covalente del dominio FN3 de unión a EGFR y el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención utilizando métodos bien conocidos. Los dominios FN3 pueden estar unidos a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador que contiene poli-glicina, glicina y serina, o alanina y prolina. El enlazador de ejemplo incluye (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGS)2 (SEQ ID NO: 224), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)-,0 (SEQ ID NO: 82), (AP)2 (SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84). El uso de enlazadores peptídicos artificiales y de origen natural para conectar polipéptidos a nuevos polipéptidos de fusión unidos es bien conocido en la literatura (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson y Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; patente de Estados Unidos n.° 5.856.456). Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met de la invención, tal como se describe en el presente documento, pueden estar unidas entre un extremo C del primer dominio FN3 al extremo N del segundo dominio FN3, o desde el extremo C del segundo dominio FN3. al extremo N del primer dominio FN3. Cualquier dominio FN3 de unión a EGFR puede estar unido covalentemente a un dominio FN3 de unión a C-Met. Los dominios FN3 de unión a EGFR de ejemplo son dominios que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137 o 194-211, y los dominios FN3 de unión a c-Met de ejemplo son dominios que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 32-49, 111-114 o 212-223. Los dominios FN3 de unión a EGFR para acoplar a una molécula biespecífica pueden comprender, adicionalmente, una metionina iniciadora (Met) en su extremo N.
Las variantes de las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 DE EGFR/c-Met como se describe en el presente documento están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones en la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met siempre que la variante resultante retenga una selectividad y una potencia similares hacia EGFR y c-Met en comparación con la molécula original. Las modificaciones de ejemplo son, por ejemplo, sustituciones conservadoras que darán como resultado variantes con características similares a las de las moléculas originales. Las sustituciones conservadoras son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéricamente se pueden dividir en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato; (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); y (4) polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones, los aminoácidos fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican en conjunto como aminoácidos aromáticos. Como alternativa, el repertorio de aminoácidos se puede agrupar como (1) ácidos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, arginina histidina), (3) alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), con la serina y la treonina opcionalmente agrupadas por separado como hidroxilo-alifáticas; (4) aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano); (5) amidas (asparagina, glutamina); y (6) que contienen azufre (cisteína y metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a ed, WH Freeman and Co., 1981). Se pueden realizar sustituciones no conservadoras en la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met que implica sustituciones de residuos de aminoácidos entre diferentes clases de aminoácidos para mejorar las propiedades de las moléculas biespecíficas. Se puede determinar fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o un fragmento del mismo en un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido o fragmento modificado para producir una respuesta de manera similar al polipéptido o fragmento no modificado utilizando los ensayos descritos en el presente documento. Los péptidos, polipéptidos o proteínas en los que se ha producido más de una sustitución se pueden someter a ensayo fácilmente del mismo modo.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención como se describe en el presente documento pueden generarse como dímeros o multímeros, por ejemplo, como un medio para aumentar la valencia y, por lo tanto, la avidez de la unión de la molécula diana. Los multímeros pueden generarse uniendo uno o más dominios FN3 de unión a EGFR y uno o más dominios FN3 de unión a c-Met para formar moléculas que comprenden al menos tres dominios FN3 individuales que son al menos biespecíficos para EGFR o c-Met, por ejemplo mediante la inclusión de un enlazador de aminoácidos utilizando métodos bien conocidos.
La invención también proporciona una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en el que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121, 138-165, 170-179 o l9o-193.
Restos de extensión de la semivida
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met o los dominios monoespecíficos FN3 de unión a EGFR o c-Met de la invención como se describe en el presente documento pueden incorporar otras subunidades, por ejemplo, mediante interacción covalente. En un aspecto de la invención, las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención comprenden además un resto que se extiende en la semivida. Los restos que extienden la semivida de ejemplo son albúmina, variantes de albúmina, proteínas y/o dominios de unión a albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos, y regiones Fc. Un dominio de unión a la albúmina de ejemplo se muestra en la SEQ ID NO: 117 y una variante de albúmina de ejemplo se muestra en la SEQ ID NO: 189.
La totalidad o una porción de una región constante de anticuerpo puede unirse a las moléculas de la invención para impartir propiedades similares a los anticuerpos, especialmente las propiedades asociadas con la región Fc, tales como funciones efectoras de Fc, tal como la unión a Clq, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , la unión al receptor de Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), y puede modificarse aún más modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades ( para su revisión, véase Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691,2009).
Pueden incorporarse restos adicionales en las moléculas biespecíficas de la invención, tales como moléculas de polietilenglicol (PEG), tal como PEG5000 o PEG20.000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato. behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligosacáridos o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estos restos pueden ser fusiones directas con las secuencias codificantes de armazón de proteínas y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Como alternativa, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir los restos a moléculas producidas de forma recombinante de la invención.
Se puede añadir un resto pegilo a las moléculas biespecíficas o monoespecíficas de la invención incorporando un residuo de cisteína al extremo C de la molécula y uniendo un grupo pegilo a la cisteína utilizando métodos bien conocidos.. Las moléculas biespecíficas de ejemplo con la cisteína C-terminal son aquellas que tienen la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 170-178.
Las moléculas monoespecíficas y biespecíficas de la invención como se describen en el presente documento que incorporan restos adicionales pueden compararse por su funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades alteradas de las moléculas monoespecíficas y/o biespecíficas debidas a la incorporación de los dominios Fc y/o las variantes del dominio Fc pueden analizarse en ensayos de unión al receptor DE Fc utilizando formas solubles de los receptores, tañes como los receptores FcyRI, FcyRII, FcyRIII o FcRn , o utilizando ensayos basados en células bien conocidos que miden, por ejemplo, la ADCC o la CDC, o que evalúan las propiedades farmacocinéticas de las moléculas de la invención en modelos in vivo.
Polinucleótidos, vectores, células huésped
La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los dominios FN3 de unión a EGFR o que se unen a c-Met o las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineales. incluidas las secuencias de a Dn lineales utilizadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con la expresión eucariota, procariota o en fagos filamentosos, la secreción y/o presentación de las composiciones o mutágenos dirigidos de los mismos. En el presente documento se desvelan ciertos polinucleótidos de ejemplo, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los dominios FN3 de unión a EGFR o de unión a c-Met o las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención también están dentro del alcance de la invención.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el dominio FN3 que se une específicamente a EGFR que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137 o 194-211.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49, 111-114 o 212­ 223.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la molécula biespecífica que contiene el dominio EGFR/-c-Met FN3 que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121, 138­ 165, 170-179 o 190-193.
La invención también proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 97, 98, 103, 104, 115, 76116 o 166-169.
Los polinucleótidos de la invención como se describen en el presente documento pueden producirse por síntesis química tal como la síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automático y ensamblarse en moléculas monocatenarias o bicatenarias completas. Como alternativa, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas, tales como una PCR seguida de clonación de rutina. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la materia. Los polinucleótidos de la invención como se describen en el presente documento pueden comprender al menos una secuencia no codificadora, tal como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación, una secuencia cis que facilita la unión de RepA, y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia marcadora, tal como un marcador de histidina o un marcador de HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, una proteína de fusión asociada, tal como RepA, Fc o proteína de la cubierta de bacteriófago, tal como pIX o pIII.
La invención también proporciona un vector que comprende al menos un polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo determinado o fondo genético por cualquier medio. Dichos vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de secuencia de ácido nucleico que pueden controlar, regular, causar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por dicho vector. Dichos elementos pueden comprender sitios de unión al potenciador de la transcripción, sitios de iniciación de la ARN polimerasa, sitios de unión al ribosoma y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Dichos sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o sistemas libres de células bien conocidos en la técnica.
La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la invención. Un dominio monoespecífico FN3 de unión a EGFR o de unión a c-Met o la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met de la invención pueden producirse opcionalmente por una línea celular, una línea celular mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, también conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
La célula huésped elegida para la expresión puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse entre COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, mieloma, linfoma, levadura, células de insecto o vegetales, o cualquier derivado, célula inmortalizada o transformada de las mismas. Como alternativa, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariótico, tal como BL21, BL21 (DE3), BL21-GOLD (DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174 (DE3), y cualquiera de las cepas de E. coli spp, Klebsiella spp., o Pseudomonas spp naturales o diseñadas por ingeniería.
Otra realización de la invención es un método para producir el dominio FN3 aislado que se une específicamente a EGFR o c-Met de la invención o la molécula que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met biespecífico aislado de la invención, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la invención en condiciones tales que el dominio FN3 aislado que se une específicamente a EGFR o c-Met o la molécula que contiene el dominio biespecífico EGFR/c-Met aislado se exprese, y purificar el dominio o la molécula.
El dominio FN3 que se une específicamente a EGFR o c-Met o la molécula biespecífica que contiene el dominio de FN3 EGFR/c-Met aislado de la invención se puede purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos, por ejemplo mediante purificación de la proteína A, precipitación en sulfato amónico o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Usos de las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met F y los dominios FN3 de unión a EGFR o de unión a c-Met de la invención
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 que se unen a EGFR o los dominios FN3 que se unen a c-Met de la invención, tal como se describe en el presente documento, pueden usarse para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de o reducir los síntomas de enfermedades humanas o patologías específicas en células, tejidos, órganos, fluidos o, en general, un huésped. Los métodos desvelados en el presente documento se pueden usar para tratar a un paciente animal que pertenece a cualquier clasificación. Ejemplos de tales animales incluyen mamíferos, tales como seres humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.
En el presente documento se desvela un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de células que expresan EGFR y/o c-Met, que comprende poner en contacto las células con la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met aislado, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención.
En el presente documento también se desvela un método para inhibir el crecimiento o la metástasis de células cancerosas o tumorales que expresan EGFR y/o c-Met en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met aislada, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención, de modo que se inhibe el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas o tumorales que expresan EGFR y/o c-Met.
En el presente documento también se desvela un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met aislada, el dominio FN3 de unión a EGFR, o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden usar para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una activación o producción anormal de EGFR, c-Met , EGF u otro ligando de EGFR o HGF, o trastorno relacionado con la expresión de EGFR o c-Met, que puede o no implicar malignidad o cáncer, en el que la activación y/o producción anormales de EGFR, c-Met, EGF u otro ligando de EGFR, o HGF se produce en células o tejidos de un sujeto que tienen la enfermedad o trastorno o que están predispuestos a sufrirla. La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden usar para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Los cánceres susceptibles de ser tratados mediante las moléculas biespecíficas de la invención incluyen aquellas que sobreexpresan EGFR y/o c-Met, los cánceres asociados con una actividad elevada de EGFR y/o los niveles de expresión (tal como, por ejemplo, una mutación activadora de EGFR, una amplificación del gen del EGFR o activación de EGFR mediada por ligando) y actividad y/o niveles de expresión elevados de c-Met (tales como, por ejemplo, mutación activadora de c-Met, una amplificación de genes de c-Met o activación de c-Met mediada por HGF.
Las mutaciones activadoras de EGFR de ejemplo que pueden estar asociadas con el cáncer incluyen mutaciones puntuales, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, inversiones o amplificaciones de genes que conducen a un aumento de al menos una actividad biológica de EGFR, tal como la actividad elevada de tirosina quinasa, la formación de homodímeros y heterodímeros de receptores, mayor unión al ligando, etc. Las mutaciones pueden localizarse en cualquier parte de un gen de EGFR o región reguladora asociada con un gen de EGFR e incluyen mutaciones en el exón 18, 19, 20 o 21 o mutaciones en el dominio de la quinasa. Las mutaciones de EGFR de activación a modo de ejemplo son las sustituciones G719A, L861X (siendo X cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o T790M, deleción de E746-A750, deleción de R748 -P753, inserción de Ala entre M766 y A767, inserción de SVA (Ser, Val, Ala) entre S768 y V769 e inserción de NS (Asn, Ser) entre P772 y H773. Otros ejemplos de mutaciones de activación de EGFR son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US2005/0272083). La información sobre EGFR y otros receptores de ErbB, incluidos los homodímeros y heterodímeros receptores, ligandos de receptores, sitios de autofosforilación y moléculas de señalización involucradas en la señalización mediada por ErbB se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Hynes y Lane, Nature Reviews Cancer 5: 341-354, 2005).
Las mutaciones de activación de c-Met de ejemplo incluyen mutaciones puntuales, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, inversiones o amplificaciones génicas que conducen a un incremento en al menos una actividad biológica de una proteína c-Met, tal como actividad tirosina quinasa elevada, formación de homodímeros y heterotrímeros receptores, mayor unión al ligando etc. Las mutaciones pueden localizarse en cualquier parte del gen de c-Met o en las regiones reguladoras asociadas con el gen, tales como las mutaciones en el dominio quinasa de c-Met. Las mutaciones de activación de c-Met a modo de ejemplo son mutaciones en las posiciones de los residuos N375, V13, V923, R175, V136, L229, S323, R988, S1058/T1010 y E168. Los métodos para detectar mutaciones de EGFR y c-Met o amplificaciones de genes son bien conocidos.
Los cánceres de ejemplo que son susceptibles de tratamiento por la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de boca, cáncer de esófago, cáncer de vagina , cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo, cáncer gástrico, cáncer de timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado o carcinoma renal papilar esporádico o hereditario (CCPR).
Los dominios FN3 que se unen específicamente a c-Met y bloquean la unión de HGF a c-Met de la invención pueden ser para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Los cánceres susceptibles de tratamiento por los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención incluyen aquellos que sobreexpresan los cánceres de ejemplo que son susceptibles de tratamiento por los dominios FN3 de la invención incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón cáncer, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de boca, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer de cuello uterino, cáncer de bazo, cáncer de testículo y cáncer del timo.
Los dominios FN3 que se unen específicamente a EGFR y bloquean la unión de EGF al EGFR de la invención se pueden usar para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Los cánceres susceptibles de ser tratados con los dominios FN3 de la invención incluyen aquellos que sobreexpresan EGFR o variantes. Los cánceres de ejemplo que son susceptibles de tratamiento con los dominios FN3 de la invención incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario , cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de boca, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer de cuello uterino, cáncer de bazo, cáncer de testículo y cáncer de timo.
En algunos métodos descritos en el presente documento, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden usar para tratar a un sujeto con un cáncer que es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con uno o más inhibidores de EGFR. Los inhibidores de EGFR de ejemplo para los cuales el cáncer puede adquirir resistencia son los anticuerpos anti-EGFR cetuximab (Erbitux®), pantinumumab (Vectibix®), matuzumab, nimotuzumab, inhibidores de EGFR de molécula pequeña Tarceva® (erlotinib), IRESSA (gefitinib), EKB-569 (pelitina, TKI de EGFR irreversible), pan-ErbB y otros inhibidores de la tirosina quinasa receptora lapatinib (inhibidor de EGFR y HER2), pelitinib (inhibidor de EGFR y HER2), vandetanib (ZD6474, ZACTIMA™, EGFR, VEGFR2 y RET TKI), PF00299804 (dacomitinib, pan-ErbB TKI irreversible), CI-1033 (pan-erbB TKI irreversible), afatinib (BIBW2992, pan-ErbB TKI irreversible), AV-412 (inhibidor doble de EGFR y ErbB2) EXEL-7647 (inhibidor de EGFR, ErbB2, GEVGR y EphB4), CO-1686 (EGFR TKI selectivo de mutante irrerversible), AZD9291 (EGFR TKI selectivo de mutante irrerversible) y HKI-272 (neratinib, inhibidor irreversible de EGFR/ErbB2). Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar el cáncer que es resistente o que ha adquirido resistencia al tratamiento con gefitinib, erlotinib, afatinib, CO-1686, AZD9291 y/o cetuximab. Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a C-Met que pueden usarse son los descritos en el presente documento que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137, 194-211, 32-49, 111-114, 212-223, 50-72, 106, 118-121, 138-165, 170-178 o 190-193.
En el presente documento también se describe un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met o el dominio FN3 que se une específicamente al EGFR a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en el que el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con erlotinib, gefitinib, afatinib, CO-1686 (número CAS: 1374640-70-6), AZD9291 o cetuximab.
Se pueden usar varios métodos cualitativos y/o cuantitativos para determinar si un sujeto es resistente, ha desarrollado o es susceptible de desarrollar una resistencia al tratamiento con un inhibidor de EGFR. Los síntomas que pueden asociarse con la resistencia a un inhibidor de EGFR incluyen, por ejemplo, una disminución o la meseta del bienestar del paciente, un aumento en el tamaño de un tumor, disminución detenida o ralentizada del del crecimiento de un tumor y/o la diseminación de células cancerosas en el cuerpo de un lugar a otros órganos, tejidos o células. El restablecimiento o el empeoramiento de varios síntomas asociados con el cáncer también puede ser una indicación de que un sujeto ha desarrollado o es susceptible de desarrollar resistencia a los inhibidores de EGFR, tal como anorexia, disfunción cognitiva, depresión, disnea, fatiga, trastornos hormonales, neutropenia, dolor , neuropatía periférica, y disfunción sexual. Los síntomas asociados con cáncer puede variar de acuerdo con el tipo de cáncer. Por ejemplo, los síntomas asociados con el cáncer cervical pueden incluir sangrado anormal, flujo vaginal pesado inusual, dolor pélvico que no está relacionado con el ciclo menstrual normal, dolor vesical o dolor durante la micción, y sangrado entre los períodos menstruales regulares, después de las relaciones sexuales, duchas vaginales, o examen pélvico. Los síntomas asociados con el cáncer de pulmón pueden incluir tos persistente, tos con sangre, dificultad para respirar, sibilancias, dolor en el pecho, pérdida de apetito, pérdida de peso sin intentarlo y fatiga. Los síntomas del cáncer de hígado pueden incluir pérdida de apetito y peso, dolor abdominal, especialmente en la parte superior derecha del abdomen que puede extenderse hacia la espalda y el hombro, náuseas y vómitos, debilidad general y fatiga, hepatomegalia, hinchazón abdominal (ascitis) y una decoloración amarilla de la piel y el blanco de los ojos (ictericia). Un experto en oncología puede identificar fácilmente los síntomas asociados con un tipo particular de cáncer.
Otros medios para determinar si un sujeto ha desarrollado una resistencia a un inhibidor de EGFR incluyen examinar la fosforilación de EGFR, la fosforilación de ERK1/2 y/o la fosforilación de AKT en células cancerosas, en las que el aumento de la fosforilación puede ser indicativo de que el sujeto ha desarrollado o es susceptible de desarrollar resistencia a un inhibidor de EGFR. Los métodos para determinar la fosforilación de EGFR, ERK1/2 y/o AKT son bien conocidos y se describen en el presente documento. La identificación de un sujeto que ha desarrollado una resistencia a un inhibidor de EGFR puede implicar la detección de niveles elevados de expresión de c-Met o actividad elevada de c-Met, por ejemplo, que surgen de niveles elevados de HGF circulante, una mutación activadora del gen de c-Met o amplificación del gen de c-met.
En el presente documento también se desvela un método para tratar CPNM en un paciente que tiene un tumor de CPNM o una metástasis tumoral que tiene una mutación activadora de EGFR o una amplificación del gen EGFR, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met , el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención.
La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden usar para tratar el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), que incluye carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma macrocítico. En algunas realizaciones, las células del CPNM tienen un fenotipo epitelial. En algunas realizaciones, el CPNM tiene resistencia adquirida al tratamiento con uno o más inhibidores del EGFR.
En el CPNM, mutaciones específicas en el gen de EGFR se asocian con tasas elevadas de respuesta (70-80 %) a los inhibidores de tirosina quinasa de EGFR (EGFR-TKI). Una deleción de 5 aminoácidos en el exón 19 o la mutación puntual L858R en EGFR se asocian con la sensibilidad a EGFR-TKI (Nakata y Gotoh, Expert Opin Ther Targets 16:771-781, 2012). Estas mutaciones dan como resultado una activación independiente de los ligando de la actividad de la quinasa del EGFR. Las mutaciones de activación de EGFR se producen en el 10-30 % de los pacientes con CPNM y son significativamente más frecuentes en asiáticos orientales, mujeres, no fumadores y pacientes con histología de adenocarcinoma (Janne y Johnson Clin Cancer Res 12(14 Suppl): 4416s-4420s, 2006). La amplificación del gen de EGFR también está fuertemente correlacionada con la respuesta después del tratamiento con EGFR-TKI (Cappuzzo et al., J Natl Cancer Inst 97:643-55, 2005).
Aunque la mayoría de los pacientes con CPNM con mutaciones del EGFR responden inicialmente a la terapia con EGFR TKI, prácticamente todos adquieren una resistencia que impide una respuesta duradera. El 50-60 % de los pacientes adquieren resistencia debido a una mutación puntual en el segundo sitio en el dominio de quinasa de EGFR (T790M). Casi el 60 % de todos los tumores que se vuelven resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa EGFR aumentan la expresión de c-Met, amplifican el gen de c-Met o aumentan su único ligando conocido, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010).
En el presente documento también se desvela un método para tratar un cáncer que tiene un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en el que el cáncer está asociado con una mutación activadora de EGFR, una amplificación del gen del EGFR, una mutación de activación dec-Met o una amplificación del gen de c-Met.
En algunas realizaciones, la mutación activadora de EGFR es G719A, G719X (siendo X cualquier aminoácido), L861X (siendo X cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o sustitución T790M, deleción de e746 -A750, deleción de R748-P753, inserción de Ala (A) entre M766 y A767, inserción de Ser, Val y Ala (SVA) entre S768 y V769, e inserción de Asn y Ser (NS) entre P772 y H773.
En el presente documento también se desvela un método para tratar un cáncer que tiene un paciente, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en el que el cáncer está asociado con una mutación de EGFR L858R, T790M o deleción de los residuos E746-A750 (del (E746, A750)), amplificación de EGFR o amplificación c-Met.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con EGFR de tipo salvaje y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con EGFR de tipo salvaje y amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con las mutaciones del EGFR L858R y T790M y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción del EGFR del(E764, A750) y c-Met de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción del EGFR del(E764, A750) y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción de EGFR (E764, A750), la amplificación de EGFR y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un CPNM asociado con las mutaciones del EGFR L858R y T790M y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un CPNM asociado con amplificación del EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un CPNM asociado con la amplificación de EGFR y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un CPNM asociado con deleción del EGFR del (E764, A750) y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un CPNM asociado con deleción de EGFR del (E764, A750) y amplificación de c-Met. La amplificación de EGFR o c-Met se puede evaluar mediante métodos estándar, por ejemplo, determinando el número de copias del gen de EGFR o c-Met mediante transferencia Southern, FISH o hibridación genómica comparativa (CGH)
Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, como el desarrollo o la diseminación del cáncer. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estable (es decir, que no empeora), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, alivio o paliación del estado de la enfermedad y remisión (parcial o total), sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la afección o trastorno, así como aquellos que son propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la afección o trastorno se va a prevenir.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los indicadores de ejemplo de un terapéutico de EGFR/c-Met efectivo que puede disminuir o abatir en asociación con la resistencia incluyen, por ejemplo, el bienestar mejorado del paciente, la disminución o la reducción del tamaño de un tumor, el crecimiento detenido o lento de un tumor y/o la ausencia de metástasis de células cancerosas a otras ubicaciones en el cuerpo.
Administración/Composiciones Farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del dominio o molécula como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Dichos vehículos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluidos los de origen en petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar 0,4 % de solución salina y 0,3 % de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de material particulada. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las moléculas de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir , de menos de aproximadamente 0,5 %, generalmente de al menos aproximadamente 1 % hasta 15 o 20 % en peso y se seleccionará principalmente en función de la dosis requerida, los volúmenes de fluidos, las viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionada. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluidas otras proteínas humanas, por ejemplo, seroalbúmina humana, se describen, por ejemplo, en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, véase especialmente pp. 958-989.
El modo de administración para el uso terapéutico de las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que libere el agente en el huésped, tal como como administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar; transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, rectal), utilizando una formulación en un comprimido, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringa, un dispositivo implantado, una bomba osmótica, un cartucho, una microbomba u otro medio apreciado por el experto en la técnica, como es bien conocido en la materia. La administración específica del sitio se puede lograr, por ejemplo, mediante administración intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardíaca, intraóstea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmica.
Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg o, más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, del dominio FN3 de la invención.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios fn3 de unión a c-Met de la invención pueden administrarse a un paciente por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parenteral mediante infusión intravenosa (IV) o inyección en bolo, intramuscular o subcutánea o intraperitoneal. La infusión intravenosa puede administrarse en tan solo 15 minutos, pero con más frecuencia durante 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos o incluso 2 o 3 horas. Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención también pueden inyectarse directamente en el sitio de la enfermedad (por ejemplo, el propio tumor). La dosis administrada a un paciente con cáncer es suficiente para aliviar o al menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando ("cantidad terapéuticamente eficaz") y puede ser algunas veces de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg, pero puede ser incluso mayor, por ejemplo 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg. También se puede administrar una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área de la superficie del paciente, por ejemplo, 400, 300, 250, 200 o 100 mg/m2. Por lo general, se pueden administrar entre 1 y 8 dosis (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar el cáncer, pero se pueden administrar 10, 12, 20 o más dosis. La administración de las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met , los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención se puede repetir después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles cursos repetidos de tratamiento, al igual que la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente.
Por ejemplo, una composición farmacéutica de las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención para infusión intravenosa se puede preparar para que contenga aproximadamente 200 ml de solución de Ringer estéril y de aproximadamente 8 mg a aproximadamente 2400 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 1600 mg, o de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg del anticuerpo biespecífico de EGFR/c-Met para la administración a un paciente de 80 kg. Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidas y se describen con más detalle en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15 a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención se pueden liofilizar para el almacenamiento y reconstituir en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha mostrado que esta técnica es eficaz con las preparaciones proteicas convencionales y se pueden emplear las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la materia.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención pueden administrarse a un sujeto en una dosis única o la administración puede repetirse, por ejemplo. después de un día, dos días, tres días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses o tres meses. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. La administración se puede repetir una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más.
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met FN3, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención pueden administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico de forma simultánea, secuencial o por separado. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico o un fármaco citotóxico. Cuando se usa para tratar el cáncer, las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met se pueden usar en combinación con terapias convencionales para el cáncer, tal como cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de los mismos. Los agentes de ejemplo que pueden usarse en combinación con los dominios FN3 de la invención son antagonistas de HER2, HER3, HER4, VEGF e inhibidores de la proteína tirosina quinasa, tales como Iressa® (gefitinib) y Tarceva (erlotinib).
Las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met pueden administrarse junto con uno cualquiera o más de los fármacos quimioterapéuticos u otros agentes terapéuticos anticancerosos conocidos por los expertos en la materia. Los agentes quimioterapéuticos son compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer e incluyen agentes inhibidores del crecimiento u otros agentes citotóxicos e incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, inhibidores antimicrotúbulos, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la tirosina quinasa del receptor, inhibidores de la angiogénesis y similares. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilaminasas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosfoamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azramerina, belomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenocex, zinostatina, zorubicina, zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-FU; análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de la purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (" Ara-C "); ciclofosfamida; tiotepa; miembros de la familia de taxoides o taxanos, tales como paclitaxel (TAXOL®docetaxel (TAXOTERE®) y análogos de los mismos; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tal como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido de platino (VP-16); ifosfamida; mitomicina c; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina; (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; inhibidores de tirosina quimasas receptoras y/o de la angiogénesis, incluyendo sorafenib (NEXAVAR®), sunitinib (SUTENT®), pazopanib (VOTRIENT ™), toceranib (PALLADIA ™), vandetanib (ZACTIMA ™), cediranib (RECENTIN®), regorafenib (BAY 73-4506), axitinib (AG013736), lestaurtinib (CEP-701), erlotinib (TARCEVA®), gefitinib (IRESSA™), BIBW 2992 (TOVOK™), lapatinib (TYKERB®), neratinib (HKI-272) y similares, y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como los antiestrogénicos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (FARESTON®); y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros compuestos químicos citotóxicos convencionales como los desvelados en Wiemann et al., 1985, in Medical Oncology (Calabresi et al, eds.), Chapter 10, McMillan Publishing, también son aplicables a los métodos de la presente invención.
Los agentes de ejemplo que se pueden usar en combinación con las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met incluyen inhibidores de la tirosina quinasa y terapias dirigidas contra el cáncer, tal como Iressa® ( gefitinib) y
Tarceva (erlotinib) y otros antagonistas de HER2, HER3, HER4 o VEGF. Los antagonistas de HER2 de ejemplo incluyen CP-724-714, HERCEPTIN ™ (trastuzumab), OMNITARG ™ (pertuzumab), TAK-165, lapatinib (inhibidor de EGFR y HER2) y GW-282974. Los antagonistas de HER3 de ejemplo incluyen anticuerpos anti-Her3 (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US2004/0197332). Los ejemplos de antagonistas de HER4 incluyen a Rnsí anti-HER4 (véase, por ejemplo, Maatta et al., Mol Biol Cell 17: 67-79, 2006,. Un antagonista de VEGF de ejemplo es Bevacizumab (Avastin™).
Cuando se usa una molécula pequeña en combinación con las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención, típicamente se administra más a menudo, preferiblemente una vez al día, pero también es posible 2, 3, 4 o más veces al día, como cada dos días, semanalmente o en algún otro intervalo. Los medicamentos de moléculas pequeñas a menudo se toman por vía oral, pero también es posible la administración parenteral, por ejemplo, mediante infusión IV o inyección de bolos o por vía subcutánea o intramuscular. Las dosis de medicamentos de molécula pequeña pueden ser típicamente de 1o a 1000 mg, o de aproximadamente 100, 150, 200 o 250 mg.
Cuando las moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c-Met, los dominios FN3 de unión a EGFR o los dominios FN3 de unión a c-Met de la invención se administran en combinación con un segundo agente terapéutico, la combinación puede tener lugar en cualquier período de tiempo conveniente . Por ejemplo, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y el segundo agente terapéutico se pueden administrar a un paciente el mismo día, e Incluso en la misma infusión intravenosa. Sin embargo, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y el segundo agente terapéutico también se pueden administrar en días alternos o semanas, quincenas o meses alternos y así sucesivamente. En algunos métodos, la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y el segundo agente terapéutico se administran suficientemente cercanos en el tiempo de modo que estén presentes de forma simultánea (por ejemplo en el suero) a niveles detectables en el paciente que se está tratando. En algunos métodos, un curso entero de tratamiento de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención que consiste en una serie de dosis en un periodo de tiempo es seguido o precedido por un curso de tratamiento del segundo agente terapéutico que también consiste en una serie de dosis. En algunos métodos, el tratamiento con la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención administrados en segundo lugar se inicia si el paciente tiene resistencia o desarrolla resistencia al segundo agente terapéutico administrado inicialmente. El paciente puede recibir un solo curso o múltiples cursos de tratamiento con uno o ambos de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y el segundo agente terapéutico. Se puede usar un período de recuperación de 1, 2 o varios días o semanas entre la administración de la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención y el segundo agente terapéutico. Cuando ya se ha establecido un régimen de tratamiento adecuado para el segundo agente terapéutico, ese régimen se puede usar en combinación con la molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met Dominio de la invención. Por ejemplo, Tarceva® (erlotinib) se toma como una píldora de 100 mg o 150 mg una vez al día, e Iressa® (gefitinib) se toma como un comprimido de 250 mg al día.
La molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met, el dominio FN3 de unión a EGFR o el dominio FN3 de unión a c-Met de la invención, opcionalmente en combinación con el segundo agente terapéutico, se pueden administrar junto con cualquier forma de radioterapia, incluyendo radiación de haz externo, radioterapia de intensidad modulada (IMRT) y cualquier tipo de radiocirugía, incluyendo Gamma Knife, Cyberknife, Linac, y radiación intersticial (por ejemplo, semillas radiactivas implantadas, globo GliaSite) y/o con cirugía. La combinación con radioterapia puede ser especialmente adecuada para el cáncer de cabeza y cuello y los tumores cerebrales.
Aunque se ha descrito la invención en términos generales, las realizaciones de la invención se desvelarán adicionalmente en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.
EJEMPLO 1. Construcción de bibliotecas de Tencon
Tencon (SEQ ID NO: 1) es un armazón similar a inmunoglobulina, dominio de fibronectina de tipo III (FN3), diseñado a partir de una secuencia de consenso de quince dominios FN3 de tenascina-C humana(Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; publicación de patente de Estados Unidos N.° 2010/0216708). La estructura cristalina de Tencon muestra seis bucles expuestos en la superficie que conectan siete cadenas beta. Estos bucles, o residuos seleccionados dentro de cada bucle, se pueden aleatorizar para construir bibliotecas de dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que se pueden usar para seleccionar nuevas moléculas que se unen a objetivos específicos.
Tencon:
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINL.TVPGSERSYDLTGLK
PGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ÍD NO 1):
Construcción de la biblioteca TCL1
Una biblioteca diseñada para aleatorizar solo el bucle FG de Tencon (SEQ ID NO: 1), TCL1, fue construido para su uso con el sistema de presentación en cis (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). En este sistema, se produce una secuencia de ADN de una sola cadena que incorpora secuencias para un promotor Tac, una secuencia de codificación de la biblioteca Tencon, una secuencia de codificación RepA, un elemento en cis y un elemento ori. Tras la expresión en un sistema de transcripción/traducción in vitro, se produce un complejo de la proteína de fusión Tencon-RepA unida en cis al ADN a partir del cual se codifica. Los complejos que se unen a una molécula diana se aíslan y amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe a continuación.
La construcción de la biblioteca de TCL1 para su uso con expresión en cis se logró mediante rondas sucesivas de PCR para producir moléculas de ADN lineales finales, bicatenarias en dos mitades; el fragmento 5' contiene el promotor y las secuencias de Tencon, mientras que el fragmento 3' contiene el gen repA y los elementos cis y ori. Estas dos mitades se combinan mediante una fracción digerida para producir toda la construcción. La biblioteca TCL1 se diseñó para incorporar aminoácidos aleatorios solo en el bucle FG de Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO: 86). Los codones NNS se usaron en la construcción de esta biblioteca, lo que dio como resultado la posible incorporación de los 20 aminoácidos y un codón de terminación en el bucle FG. La biblioteca TCL1 contiene seis sub-bibliotecas separadas, cada una con una longitud de bucle FG aleatoria diferente, de 7 a 12 residuos, para aumentar aún más la diversidad. El diseño de las bibliotecas basadas en tencon se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2.
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Para construir la biblioteca TCL1, se realizaron rondas sucesivas de PCR para añadir el promotor Tac, construir la degeneración en el bucle FG y añadir los sitios de restricción necesarios para el ensamblaje final. Primero, se generó una secuencia de ADN que contenía la secuencia promotora y la secuencia 5' de Tencon del bucle FG por PCR en dos etapas. El ADN correspondiente a la secuencia completa del gen Tencon se utilizó como molde de PCR con los cebadores POP2220 (SEQ ID NO: 2) y TC5' a FG (SEQ ID NO: 3). El producto de PCR resultante de esta reacción se usó como molde para la siguiente ronda de amplificación por PCR con los cebadores de 130 unidades (SEQID NO: 4) y Tc5' a FG para completar la adición de las secuencias promotoras a Tencon. A continuación, se introdujo la diversidad en el bucle de FG amplificando el producto de ADN producido en la primera etapa con el cebador directo POP2222 (SEQID NO: 5) y cebadores inversos TCF7 (SEQ ID NO: 6), TCF8 (SEQ ID NO: 7), TCF9 (SEQ ID NO: 8), TCF10 (SEQ ID NO: 9), TCF11 (SEQ ID NO: 10) o TCF12 (SEQ ID NO: 11), que contienen nucleótidos degenerados. Se realizaron al menos ocho reacciones de PCR de 100 ^l para cada sub-biblioteca para minimizar los ciclos de PCR y maximizar la diversidad de la biblioteca. Al menos 5 ^g de este producto de PCR se purificaron en gel y se usaron en una etapa posterior de PCR, con los cebadores POP2222 (SEQ ID NO: 5) y POP2234 (SEQ ID NO: 12), que da como resultado la unión de una cola de 6xHis y un sitio de restricción NotI al extremo3' de la secuencia de Tencon. Esta reacción de PCR se llevó a cabo utilizando solo quince ciclos de PCR y al menos 500 ng de ADN de molde. El producto de la PCR resultante se purificó en gel, se digirió con la enzima de restricción NotI y se purificó con una columna Qiagen.
El fragmento 3' de la biblioteca es una secuencia de ADN constante que contiene elementos para su presentación, incluido un sitio de restricción PspOMI, la región codificante del gen repA y los elementos cis y ori. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando un plásmido (pCR4Blunt) (Invitrogen) que contiene este fragmento de ADN con los cebadores directo M13 e inverso M13. Los productos de PCR resultantes se digirieron con PspOMI durante la noche y se purificaron en gel. Para ligar la porción 5' del ADN de la biblioteca al ADN 3' que contiene el gen repA, se ligaron 2 pmol de ADN 5' a una cantidad molar igual de ADN 3' repA en presencia de las enzimas NotI y PspOMI y la ligasa T4. Después de ligar durante la noche a 37 °C, una pequeña porción del ADN ligado se pasó en un gel para comprobar la eficacia del ligado. El producto de la biblioteca ligada se dividió en doce amplificaciones de PCR y se realizó una reacción de PCR de 12 ciclos con el par de cebadores POP2250 (SEQ ID NO: 13) y DidLigRev (SeQ ID NO: 14). El rendimiento de ADN para cada sub-biblioteca de la biblioteca TCL1 osciló entre 32 y 34 |jg.
Para evaluar la calidad de la biblioteca, una pequeña parte de la biblioteca de trabajo se amplificó con los cebadores Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) y Tcon6 (SEQ ID NO: 16) y se clonó en un vector pET modificado mediante clonación independiente de ligasa. El ADN plasmídico se transformó en células competentes BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) y se secuenciaron 96 colonias seleccionadas aleatoriamente usando un cebador del promotor de T7. No se encontraron secuencias duplicadas. En general, aproximadamente el 70-85 % de los clones tenía un promotor completo y una secuencia de codificación de Tencon sin mutación de cambio de marco. La tasa de secuencia funcional, que excluye los clones con codones de TERMINACIÓN, estaba entre 59 % y 80 %.
Construcción de la biblioteca TCL2
Se construyó la biblioteca TCL2 en la que se aleatorizaron los bucles BC y FG de Tencon y se controló estrictamente la distribución de aminoácidos en cada posición. La Tabla 3 muestra la distribución de aminoácidos en las posiciones de bucle deseadas en la biblioteca TCL2. La distribución de aminoácidos diseñada tenía dos objetivos. Primero, la biblioteca estaba sesgada hacia los residuos que se predijo que serían estructuralmente importantes para el plegamiento y la estabilidad de Tencon basándose en el análisis de la estructura cristalina de Tencon y/o en el modelo de homología. Por ejemplo, la posición 29 se fijó para ser solo un subconjunto de aminoácidos hidrófobos, ya que este residuo se enterró en el núcleo hidrófobo del plegamiento de Tencon. Una segunda capa de diseño incluyó sesgar la distribución de aminoácidos hacia la de los residuos encontrados preferentemente en la cadena pesada HCDR3 de los anticuerpos, para producir eficientemente aglutinantes de alta afinidad (Birtalan et al.. J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). Con este objetivo, la "distribución diseñada" de la Tabla 3 se refiere a la distribución de la siguiente manera: alanina al 6 %, arginina al 6 %, asparagina al 3,9 %, ácido aspártico al 7,5 %, ácido glutámico al 2,5 %, glutamina al 1,5 %, glicina al 15 %, histidina al 2,3 %, isoleucina al 2,5 %, leucina al 5 %, lisina al 1,5 %, fenilalanina al 2,5 %, prolina al 4 %, serina al 10 %, treonina al 4,5 %, triptófano al 4 %, tirosina al 17,3 % y valina al 4 %. Esta distribución está exenta de codones de metionina, cisteína y de TERMINACIÓN.
Tabla 3.
Posición del residuo* Residuos de WT Distribución en la librería TCL2
22 T distribución diseñada
23 A distribución diseñada
24 P 50 % de P diseñada diseñada
25 D distribución diseñada
26 A 20 % de A 20 % de G distribución diseñada
27 A distribución diseñada
28 F 20 % de F, 20 % de I, 20 % de L, 20 %
de V, 20 % de Y
29 D 33 % de D, 33 % de E, 33 % de T
75 K distribución diseñada
76 G distribución diseñada
77 G distribución diseñada
78 H distribución diseñada
79 R distribución diseñada
80 S 100 % de S
81 N distribución diseñada
82 P 50 % de P diseñada diseñada
*la numeración de residuos se basa en la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1
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El fragmento 5' de la biblioteca TCL2 contenía el promotor y la región de codificación de Tencon (SEQ ID NO: 1), que se sintetizó químicamente como un grupo de bibliotecas (Sloning Biotechnology). Este grupo de ADN contenía al menos 1 x 1011 miembros diferentes. Al final del fragmento, se incluyó un sitio de restricción BsaI en el diseño para el ligado a RepA.
El fragmento 3' de la biblioteca era una secuencia de ADN constante que contenía elementos para mostrar, incluida una cola 6xHis, la región codificante del gen repA y el elemento cis. El ADN se preparó mediante reacción de PCR utilizando una molde de ADN existente (anterior) y los cebadores LS1008 (SeQ iD NO: 17) y DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Para ensamblar la biblioteca TCL2 completa, se ligó un total de 1 |jg de ADN de la biblioteca Tencon 5' digerido con BsaI a 3,5 jg del fragmento 3' que se preparó mediante digestión de restricción con la misma enzima. Después del ligado durante la noche, el a Dn se purificó mediante una columna Qiagen y el ADN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. El producto de la biblioteca ligada se amplificó mediante una reacción de PCR de 12 ciclos con un par de cebadores POP2250 (SEQ ID NO: 13) y DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Se realizaron un total de 72 reacciones, cada una de las cuales contenía 50 ng de productos de ADN ligado como un molde. El rendimiento total de ADN de la biblioteca de trabajo de TCL2 fue de aproximadamente 100 jg. Una pequeña parte de la biblioteca de trabajo se subclonó y se secuenció, como se ha descrito anteriormente para la biblioteca TCL1. No se encontraron secuencias duplicadas. Aproximadamente el 80 % de las secuencias contenían el promotor completo y las secuencias de codificación de Tencon sin mutaciones de cambio de marco.
Construcción de la biblioteca TCL14
Los bucles superior (BC, DE y FG) e inferior (AB, CD y EF), por ejemplo, las superficies de unión indicadas en los dominios FN3 están separadas por las cadenas beta que forman el centro de la estructura de FN3. Las superficies alternativas que residen en los dos "lados" de los dominios FN3 que tienen formas diferentes a las superficies formadas por bucles solo se forman en un lado del dominio FN3 por dos cadenas beta-paralelas, las cadenas beta C y F, y los bucles CD y FG, y en el presente documento se denomina superficie C-CD-F-FG.
Se generó una biblioteca que aleatorizaba una superficie alternativa de Tencon mediante la aleatorización de residuos expuestos en la superficie seleccionados de las cadenas C y F, así como porciones de los bucles CD y FG como se muestra en la Figura 1. Una variante de Tencon, Tencon27 (SEQ ID NO: 99) que tiene las siguientes sustituciones en comparación con Tencon (SEQ ID NO: 1) se utilizó para generar la biblioteca; E11R L17A, N46V, E86I. Una descripción completa de los métodos utilizados para construir esta biblioteca se describe en la publicación de patente de Estados Unidos N.° US2013/0226834.
Ejemplo 2 Selección de dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que se unen a EGFR e inhiben la unión de EGF
Detección selectiva de la biblioteca
Se usó presentación en cis para seleccionar dominios de unión del EGFR de las bibliotecas TCL1 y TCL2. Se biotiniló un dominio extracelular humano recombinante del EGFR fusionado a un Fc de IgG1 (R&D Systems) usando métodos estándar y se usó para la exploración (residuos 25-645 de EGFR de longitud completa de la SEQ ID NO: 73). Para la transcripción y traducción in vitro (TTI), se incubaron 2-6 jg de ADN de la biblioteca con aminoácidos completos 0,1 mM, 1X componentes de premezcla S30 y 30 j l de extracto S30 (Promega) en un volumen total de 100 j l y se incubaron a 30 °C. Después de 1 hora, se añadieron 450 j l de solución de bloqueo (PBS pH 7,4, suplementado con 2 % de seroalbúmina bovina, 100 jg/ml de ADN de esperma de arenque y 1 mg/ml de heparina) y la reacción se incubó en hielo durante 15 minutos. minutos. Los complejos EGFR-Fc: eGf se ensamblaron en proporciones molares de 1:1 y 10:1 de EGFR:EGF mezclando EGF humano recombinante (R&D Systems) con EGFR-Fc recombinante biotinilado en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la unión, se mezclaron 500 j l de reacciones de TTI bloqueadas con 100 j l de complejos EGFR-Fc:EGF y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, tras lo cual los complejos unidos se extrajeron con esferas magnéticas de neutravidina o estreptavidina (Seradyne). Los miembros de la biblioteca no unidos se eliminaron mediante lavados sucesivos con PBST y PBS. Después del lavado, el ADN se eluyó de los complejos unidos calentando a 65 °C durante 10 minutos, se amplificó mediante PCR y se unió a un fragmento de ADN que codifica RepA mediante digestión de restricción y ligado para rondas adicionales de exploración de tipo panning. Los aglutinantes de alta afinidad se aislaron reduciendo sucesivamente la concentración de EGFR-Fc objetivo durante cada ronda de 200 nM a 50 nM y aumentando la rigurosidad del lavado. En las rondas 4 y 5, los dominios FN3 no unidos y unidos débilmente se eliminaron mediante lavado en presencia de un exceso molar de 10 veces de EGFR-Fc no biotinilado durante la noche en PBS.
Después de la exploración de tipo panning, los dominios FN3 seleccionados se amplificaron por PCR utilizando oligos Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) y Tcon6 (SEQ ID NO: 16), se subclonaron en un vector pET modificado para incluir un sitio de clonación independiente de la ligasa, y se transformaron en células BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) para la expresión soluble en E. coli utilizando técnicas estándar de biología molecular. Se añadió una secuencia génica que codifica un marcador de poli-histidina C-terminal a cada dominio FN3 para permitir la purificación y detección. Los cultivos se cultivaron hasta una densidad óptica de 0,6-0,8 en medio 2YT suplementado con 100 |jg/ml de carbenicilina en bloques de 96 pocillos de 1 ml a 37 °C antes de la adición de IPTG a 1 mM, momento en el cual la temperatura se redujo a 30 °C. Las células se recogieron aproximadamente 16 horas después mediante centrifugación y se congelaron a -20 °C. La lisis celular se logró incubando cada sedimento en 0,6 ml de tampón de lisis BugBuster® HT (Novagen EMD Biosciences) con agitación a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Selección de dominios FN3 que se unen a EGFR en las células
Para evaluar la capacidad de diferentes dominios FN3 para unirse a EGFR en un contexto más fisiológico, se midió su capacidad para unirse a células A431. Las células A431 (Colección Americana de Cultivos Tipo, n.° de cat. CRL-1555) sobreexpresan EGFR con ~ 2 x 106 receptores por célula. Las células se sembraron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocillos negras opacas y se dejaron unir durante la noche a 37°C, en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Los lisados bacterianos que expresan el dominio FN3 se diluyeron 1.000 veces en tampón de tinción FACS (Becton Dickinson) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Los lisados se eliminaron y las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-penta His-Alexa488 (Qiagen) diluido a 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual se llenaron los pocillos con 100 j l de tampón de tinción FACs y se leyó la fluorescencia a 488 nm usando un lector Acumen eX3. Se analizaron los lisados bacterianos que contenían dominios FN3 para determinar su capacidad para unirse a células A431 (1320 lisados bacterianos crudos para las bibliotecas de TCL1 y TCL2) y se identificaron 516 clones positivos, donde la unión fue >10 veces mayor que la señal de fondo. Se analizaron 300 lisados de la biblioteca de TCL14 para determinar su unión, lo que dio como resultado 58 secuencias únicas de dominio FN3 que se unen a EGFR.
Selección de dominios FN3 que inhiben la unión de EGF a EGFR en las células
Para caracterizar mejor el mecanismo de unión a EGFR, se midió la capacidad de varios clones del dominio FN3 identificados para unirse a EGFR de una manera competitiva para EGF utilizando células A431 y se ejecutó en paralelo con la selección del ensayo de unión a A431. Las células A431 se sembraron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocillos negras opacas y se dejaron unir durante la noche a 37 °C, en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Las células se incubaron con 50 jl/pocillo de lisado bacteriano diluido A 1:1.000 durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se añadió EGF biotinilado (Invitrogen, n.° de cat. E-3477) a cada pocillo para una concentración final de 30 ng/ml y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 jl/pocillo de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) diluido a 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual se llenaron los pocillos con 100 j l de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 600 nm usando un lector Acumen eX3.
Los lisados bacterianos que contenían los dominios FN3 se seleccionaron en el ensayo de competición de EGF descrito anteriormente. Se seleccionaron 1320 lisados bacterianos en bruto de las bibliotecas TCL1 y TCL2, lo que dio como resultado 451 clones positivos que inhibían la unión de EGF en > 50 %.
Expresión y purificación de dominios FN3 identificados que se unen a EGFR
Los dominios FN3 marcados con His se purificaron a partir de lisados de E. coli clarificados con placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) y se eluyeron en tampón que contenía fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM e imidazol 250 mM a pH 7,4. Las muestras purificadas se intercambiaron e PBS a pH 7,4 para su análisis utilizando placas PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare). Análisis de cromatografía de exclusión por tamaño
Se usó cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el estado de agregación de los dominios FN3 que se unen a EGFR. Se inyectaron alícuotas (10 jl) de cada dominio FN3 purificado en una columna Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) a un caudal de 0,3 ml/min en una fase móvil de PBS a pH 7,4. La elución de la columna se controló mediante absorbancia a 280 nm. Los dominios FN3 que exhibieron altos niveles de agregación por SEC se excluyeron de análisis posteriores.
Velocidad de disociación de dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados de EGFR-Fc
Dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados se sometieron a detección selectiva para identificar aquellos con velocidades de disociación (koff) lentas en la unión a EGFR-Fc en un instrumento ProteOn XPR-36 (Bio-Rad) para facilitar la selección de aquellos que se unían con afinidad alta. Se inmovilizó IgG Fc anti-humana de cabra (R&D systems), a una concentración de 5 pg/ml, directamente mediante acoplamiento de amina (a pH 5,0) en los 6 canales de ligando en orientación horizontal en el chip con un caudal de 30 pl/min en PBS que contenía 0,005 % de Tween-20. Las densidades de inmovilización promediaron aproximadamente 1.500 unidades de respuesta (UR) con menos de 5 % de variación entre los diferentes canales. EGFR-Fc se capturó en la superficie de IgG Fc anti-humana una densidad de aproximadamente 600 UR en orientación vertical de ligando. Todos los dominios FN3 analizados se normalizaron a una concentración de 1 pM y se analizó su unión en orientación horizontal. Los 6 canales de analito se utilizaron para los dominios FN3 para maximizar el rendimiento de la detección selectiva. La fase de disociación se controló durante 10 minutos a un caudal de 100 pl/min. Las señales de unión entre puntos se utilizaron como referencias para monitorizar la unión no específica entre los analitos y la superficie de IgG inmovilizada y se restaron de todas las respuestas de unión. Los datos de unión procesados se ajustaron localmente a un modelo de unión de Langmuir simple a 1:1 para extraer la koff para cada dominio FN3 de unión a EGFR-Fc capturado.
Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF
Se analizaron los dominios FN3 de unión a EGFR purificados para determinar su capacidad para inhibir la fosforilación de EGFR estimulada por EGF en células a 431 a una única concentración. La fosforilación de EGFR se monitorizó utilizando el kit EGFR fosfo (Tyr1173) (Meso Scale Discovery). Las células se sembraron en placas a 20.000/pocillo en placas transparentes tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI (Gibco) que contenía GlutaMAX™ con 10 % de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y se dejó unir durante la noche a 37 °°C en atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. El medio de cultivo se eliminó completamente y las células se dejaron sin alimento durante la noche en 100 pl/pocillo de medio que no contenía FBS a 37 °C en atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. A continuación, las células se trataron con 100 pl/pocillo de medio de inanición precalentado (37 °C) que contenía los dominios FN3 de unión a EGFR a una concentración de 2 pM durante 1 hora a 37 °C en atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Los controles se trataron con medio de inanición solamente. Las células se estimularon mediante la adición y mezcla suave de 100 pl/pocillo de medio de inanición precalentado (37 °C) que contenía EGF recombinante humano de 100 ng/ml (R&D Systems, n.° de cat. 236-EG), para concentraciones finales de 50 ng/ml de EGF y dominio FN3 de unión a EGFR 1 pM e incubación a 37 °C, CO2 al 5 % durante 15 minutos. Un conjunto de pocillos de control se dejó sin estimular como controles negativos. El medio se eliminó completamente y las células se lisaron con 100 pl/pocillo de tampón de lisis completo (Meso Scale Discovery) durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, según las instrucciones del fabricante.. Las placas de ensayo configuradas para medir el EGFR fosforilado en la tirosina 1173 (Meso Scale Discovery) se bloquearon con la solución de bloqueo provista según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente durante 1,5-2 horas. A continuación, las placas se lavaron 4 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado Tris 1X (Meso Scale Discovery). Se transfirieron partes alícuotas de lisado celular (30 pl/pocillo) a placas de ensayo, que se cubrieron con película de sellado de placa (VWR) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Las placas de ensayo se lavaron 4 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado Tris, después de lo cual se añadieron 25 pl de solución de anticuerpo de detección helada (Meso Scale Discovery) a cada pocillo, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora, seguido de 4 lavados con 200 pl/pocillo de tampón de lavado Tris. Las señales se detectaron mediante la adición de 150 pl/pocillo de tampón de lectura (Meso Scale Discovery) y se leyeron en un instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) usando las configuraciones predeterminadas específicas del ensayo instaladas por el fabricante. El porcentaje de inhibición de la señal de control positivo estimulada por EGF se calculó para cada dominio FN3 de unión a EGFR.
La inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se midió para 232 clones identificados de las bibliotecas TCL1 y TCL2. 22 de estos clones inhibieron la fosforilación de EGFR en > 50 % a una concentración de 1 pM. Después de la eliminación de los clones que se expresaron poco o se juzgó que eran multiméricos por cromatografía de exclusión por tamaño, se usaron nueve clones para una caracterización biológica adicional. Las secuencias de bucle BC y FG de estos clones se muestran en la Tabla 4. Ocho de los nueve clones seleccionados tenían una secuencia de bucle FG común (HNVYKDTNMRGL; SEQ ID NO: 95) y se observaron áreas de similitud significativa entre varios clones en sus secuencias de bucle BC.
Tabla 4.
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Ejemplo 3 Caracterización de los dominios FN3 de unión a EGFR que inhiben la unión a EGF
Expresión a gran escala, purificación y eliminación de endotoxinas
Los dominios FN3 mostrados en la Tabla 4 se ampliaron para proporcionar más material para una caracterización detallada. Se usó un cultivo durante la noche que contenía cada variante del dominio FN3 de unión a EGFR para inocular 0,8 l de medio de caldo Terrific suplementado con 100 pg/ml de ampicilina a una dilución de 1/80 del cultivo durante la noche en medio fresco, y se incubó con agitación a 37 °C. El cultivo se indujo cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó —1,2-1,5 mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y la temperatura se redujo a 30 °C. Después de 4 horas, las células se recogieron por centrifugación y el sedimento celular se almacenó a -80 °C hasta que fue necesario.
Para la lisis celular, el sedimento descongelado se resuspendió en 1X BugBuster® suplementado con 25 U/ml de Benzonase® (Sigma-Aldrich) y 1 kU/ml de rLysozyme™ (Novagen EMD Biosciences) en una proporción de 5 ml de BugBuster® por gramo de gránulo. La lisis procedió durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, seguido de centrifugación a 56.000 x g durante 50 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,2 pm, luego se cargó en una columna HisTrap FF de 5 ml previamente equilibrada con Tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) utilizando un sistema de cromatografía GE Healthcare ÁKTAexplorer 100s. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón A y se lavó adicionalmente con 16 % de tampón B (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM) durante 6 volúmenes de columna. Los dominios FN3 se eluyeron con 50 % de B para 10 volúmenes de columna, seguido de un gradiente de 50 a 100 % de B sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína del dominio FN3 se agruparon, se concentraron usando un concentrador Millipore 10K MWCO y se filtraron antes de cargarlas en una columna HiLoad™ 16/60 Superdex ™ 75 (GE Healthcare) preequilibrada con PBS. El pico de monómero de proteína que se eluye de la columna de exclusión por tamaño se retuvo.
Las endotoxinas se eliminaron utilizando un método discontinuo con resina ActiClean Etox (Sterogene Bioseparations). Antes de la eliminación de la endotoxina, la resina se trató previamente con NaOH 1 N durante 2 horas a 37 °C (o durante la noche a 4 °C) y se lavó extensamente con PBS hasta que el pH se estabilizó a —7 según lo medido con papel indicador de pH. La proteína purificada se filtró a través de un filtro de 0,2 pm antes de añadir 1 ml de resina Etox en una proporción de 10 ml de proteína a 1 ml de resina. La unión de la endotoxina a la resina se dejó proceder a temperatura ambiente durante al menos 2 horas con rotación suave. La resina se eliminó mediante centrifugación a 500 x g durante 2 minutos y se retuvo el sobrenadante de proteínas. Los niveles de endotoxinas se midieron utilizando cartuchos EndoSafe®-PTS™ y se analizaron en un lector EndoSafe®-MCS (Charles River). Si los niveles de endotoxinas estaban por encima de 5 UE/mg después del primer tratamiento con Etox, se repitió el procedimiento anterior hasta que los niveles de endotoxinas disminuyeron a < 5 UE/mg. En los casos en que el nivel de endotoxinas fue superior a 5 UE/mg y se estabilizó después de dos tratamientos consecutivos con Etox, se establecieron condiciones de cromatografía de intercambio aniónico o de interacción hidrofóbica para que la proteína eliminara las endotoxinas restantes.
Determinación de la afinidad de los dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados a EGFR-Fc (afinidad de EGFR-Fc)
La afinidad de unión de determinados dominios FN3 de unión a EGFR al dominio extracelular de EGFR recombinante se caracterizó adicionalmente por métodos de resonancia de plasmón superficial usando un Proteon Instrument (BioRad). La configuración del ensayo (preparación de chip, captura de EGFR-Fc) fue similar a la descrita anteriormente para el análisis de la velocidad de disociación. Los dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados se analizaron a una concentración de 1 pM en dilución en serie 3 veces en la orientación horizontal. También se inyectó una muestra de tampón para controlar la estabilidad basal. La fase de disociación para todas las concentraciones de cada dominio FN3 de unión a EGFR se monitorizó a un caudal de 100 pl/min durante 30 minutos (para aquellos con una koff — 10-2 s-1 a partir del cribado de la velocidad de disociación), o 1 hora ( para aquellos con koff — 10-3 s-1 o más lento). Se restaron dos conjuntos de datos de referencia de los datos de respuesta: 1) las señales entre puntos para corregir las interacciones inespecíficas entre el dominio FN3 de unión a EGFR y la superficie de IgG inmovilizada; 2) las señales del canal de tampón para corregir la desviación basal debido a la disociación de la superficie de EGFR-Fc capturada en el tiempo. Los datos de unión procesados en todas las concentraciones para cada dominio FN3 se ajustaron globalmente a un modelo de unión de Langmuir simple 1:1 para extraer estimaciones de las constantes cinéticas (kon, koff) y de afinidad (Kd). La Tabla 5 muestra las constantes cinéticas para cada una de las construcciones, con una afinidad que varía de 200 pM a 9,6 nM.
Unión de dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados al EFGR en las células ("Ensayo de unión en células A431")
Las células A431 se sembraron en placas a 5.000/pocillo en placas negras opacas de 96 pocillos y se dejaron unir durante la noche a 37 °C, en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Se añadieron dominios FN3 de unión a EGFR purificados (1,5 nM a 30 pM) a las células (en 50 ul) durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACs . Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-penta His-Alexa488 (Qiagen) diluido a 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual se llenaron los pocillos con 100 pl de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 488 nm usando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como señal de fluorescencia sin procesar frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3 y se ajustaron a una curva de dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (software GraphPad) para calcular los valores de CE50. La Tabla 5 muestra los valores de CE50 para cada una de las construcciones que van desde 2,2 nM hasta > 20 pM.
Inhibición de la unión de EGF a EGFR en células utilizando dominios FN3 de unión a EGFR seleccionados (ensayo de competición DE EGF EN células A431)
Las células A431 se sembraron en placas a 5.000/pocillo en placas negras opacas de 96 pocillos y se dejaron unir durante la noche a 37 °C, en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Los dominios FN3 de unión a EGFR purificados (1,5 nM a 30 pM) se añadieron a las células (50 pl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se añadió EGF biotinilado (Invitrogen, n.° de cat: E-3477) a cada pocillo para dar una concentración final de 30 ng/ml y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) diluido a 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual se llenaron los pocillos con 100 pl de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 600 nm usando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como la señal de fluorescencia en bruto frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3 y se ajustaron a una curva de dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (software GraphPad) para calcular los valores de CI50. La Tabla 5 indica los valores de CI50 que van desde 1,8 nM a 121 nM.
Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF (ensayo de Fosfo-EGRF)
Los dominios FN3 seleccionados que inhibieron significativamente la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se evaluaron más completamente midiendo los valores de CI50 para la inhibición. La inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se evaluó a concentraciones variables del dominio FN3 (0,5 nM a 10 pM) como se ha descrito anteriormente en la "inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF". Los datos se representaron como una señal de electroquimioluminiscencia frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3 y los valores de la CI50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). La Tabla 5 muestra los valores de CI50 que variaron de 18 nM a > 2,5 pM.
Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (ensayo de crecimiento NCI-H292 y de crecimiento NCI-H322)
La inhibición del crecimiento de células dependientes de EGFR se evaluó mediante la medición de la viabilidad de las líneas celulares de tumores humanos con sobreexpresión de EGFR, NCI-H292 y NCI-H322 (Colección Americana de Cultivos Tipo, n.° cat. CRL-1848 & # CRL-5806, respectivamente), siguiendo
Tabla 5.
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exposición a los dominios FN3 de unión a EGFR. Las células se sembraron en placas a 500 células/pocillo (NCI-H292) o 1.000 células/pocillo (NCI-H322) en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI (Gibco) que contenía GlutaMAX™ con HEPES 10 mM suplementado con 10 % de suero bovino fetal inactivado con calor (FBS) (Gibco) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco) y se dejó unir durante la noche a 37 °C en atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. Las células se trataron mediante la adición de 5 pl/pocillo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un intervalo de concentración de dominios FN3 de unión a EGFR. Los controles se trataron con 5 pl/pocillo de PBS solo o ácido etilendiaminotetraacético 25 mM en PBS. Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 120 horas. Las células viables se detectaron mediante la adición de 75 pl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega), seguido de la mezcla en un agitador de placas durante 2 minutos e incubación en oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. Las placas se leyeron en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) configurado en modo de luminiscencia, con un tiempo de lectura de 0,5 segundos/pocillo contra un blanco de medio solamente.
Los datos se representaron como un porcentaje del crecimiento celular tratado con PBS frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3. Los valores de la CI50 se determinaron ajustando los datos a la ecuación para una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). La Tabla 5 muestra los valores de la CI50 que van desde 5,9 nM a 1,15 pM y de 9,2 nM a > 3,1 pM, utilizando las células NCI-H292 y NCI-H322 respectivamente. La Tabla 5 muestra el resumen de las propiedades biológicas de los dominios FN3 de unión a EGFR para cada ensayo.
Ejemplo 4 Ingeniería de los dominios FN3 de unión a EGFR
Un subconjunto de los dominios FN3 de unión a EGFR se diseñó para aumentar la estabilidad conformacional de cada molécula. Las mutaciones L17A, N46V y E86I que han demostrado mejorar la estabilidad del dominio FN3 (descritas en la publicación de patente de e86I que han demostrado mejorar la estabilidad del dominio FN3 (descritas en la publicación de patente de Estados Unidos n.° US2011/0274623) se incorporaron en los clones P54AR4-83, P54CR4-31 y P54AR4-37 por síntesis de ADN. Los nuevos mutantes, P54AR5-83v2, P54CR431-v2 y P54AR4-37v2 se expresaron y purificaron como se ha descrito anteriormente. Se usó calorimetría diferencial de barrido en PBS para evaluar la estabilidad de cada mutante para compararla con la de la molécula original correspondiente. La tabla 6 muestra que cada molécula variante se estabilizó significativamente, con un aumento promedio en la Tm de 18,5 °C.
Tabla 6.
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Ejemplo 5 Selección de dominios de fibronectina de tipo III (FN3) que se unen a c-Met e inhiben la unión a HGF
Exploración de tipo panning en c-Met humano
La biblioteca TCL14 se analizó frente al dominio extracelular c-Met humano biotinilado (bt-c-Met) para identificar dominios FN3 capaces de unirse específicamente a c-Met. Para las selecciones, 3 pg de la biblioteca TCL14 se transcribieron y tradujeron in vitro (TTIV) en el extracto lineal S30 de E. coli (Promega, Madison, WI) y la biblioteca expresada se bloqueó con Cis Block (BSA al 2 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 100 pg/ml de ADN de esperma de arenque (Promega), 1 mg/ml de heparina (Sigma-Aldrich)). Para las selecciones, se añadió bt-c-Met a concentraciones de 400 nM (Ronda 1), 200 nM (Rondas 2 y 3) y 100 nM (Rondas 4 y 5). Los miembros de la biblioteca unidos se recuperaron usando esferas magnéticas de neutravidina (Thermo Fisher, Rockford, IL) (Rondas 1, 3 y 5) o esferas magnéticas de estreptavidina (Promega) (Rondas 2 y 4) y los miembros de la biblioteca no unidos se eliminaron lavando las esferas 5 -14 veces con 500 ul de PBS-T, seguido de 2 lavados con 500 j l de PBS.
Se realizaron rondas de selección adicionales para identificar las moléculas de los dominios FN3 con afinidades mejoradas. En resumen, los resultados de la ronda 5 se prepararon como se ha descrito anteriormente y se sometieron a rondas de selección iterativas adicionales con los siguientes cambios: la incubación con bt-c-Met se redujo de 1 hora a 15 minutos y la captura de las esferas se redujo de 20 minutos a 15 minutos , bt-c-Met disminuyó a 25 nM (Rondas 6 y 7) o 2,5 nM (Rondas 8 y 9), y se realizó un lavado adicional de 1 hora en presencia de un exceso de c-Met no biotinilado. El objetivo de estos cambios fue seleccionar simultáneamente los ligadores con una velocidad de asociación potencialmente más rápida y una velocidad de disociación más lenta, que produzca una Kd sustancialmente menor.
Los resultados de las rondas 5, 7 y 9 se clonaron por PCR en un vector pET 15 modificado (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ) que contiene un sitio de clonación independiente de la ligasa (pET15-LIC) utilizando los cebadores TCON6 (SEQID NO 30) y TCON5 E86I corto (SEQ ID NO 31) y las proteínas se expresaron como proteínas marcadas con His6 en el extremo C después de las transformaciones y la inducción de IPTG (1 mM final, 30 °C durante 16 horas) utilizando protocolos estándar. Las células se recogieron por centrifugación y posteriormente se lisaron con Bugbuster HT (EMD Biosciences) suplementado con 0,2 mg/ml de lisozima blanca de huevo de pollo (Sigma-Aldrich). Los lisados bacterianos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se transfirieron a nuevas placas de 96 pocillos profundos.
Detección de dominios FN3 que inhiben la unión de HGF a c-Met
Se realizó un cribado de los dominios FN3 en lisados de E. coli para determinar su capacidad para inhibir la unión de HGF al dominio extracelular de c-Met purificado en un formato bioquímico de quimera de cMet Fc humana recombinante (0,5 jg/ml en PBS, 100 jl/pocillo) se recubrió en placas de 96 pocillos White Maxisorp (Nunc) y se incubó durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron dos veces con 300 jl/pocillo de solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,05 % (TBS-T, Sigma-Aldrich) en una lavadora de placas Biotek. Las placas de ensayo se bloquearon con StartingBlock T20 (200 jl/pocillo, Thermo Fisher Scientific, Rockland, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con agitación y nuevamente se lavaron dos veces con 300 j l de TBS-T. Los lisados del dominio FN3 se diluyeron en StartingBlock T20 (de 1:10 a 1:100.000) usando el sistema de robótica Hamilton STARplus. Los lisados (50 jl/pocillo) se incubaron en placas de ensayo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Sin lavar las placas, se añadió bt-HGF (1 jg/ml en StartingBlock T20, 50 jl/pocillo, biotinilado) a la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Los pocillos de control que contenían lisados Tencon27 recibieron el bloque de inicio T20 o bt-HGF diluido. Las placas se lavaron a continuación cuatro veces con 300 jl/pocillo de TBS-T y se incubaron con 100 jl/pocillo de estreptavidina-HRP (1:2000 en TBS-T, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 30-40 minutos a temperatura ambiente con agitación. Nuevamente, las placas se lavaron cuatro veces con TBS-T. Para desarrollar la señal, se añadió sustrato de quimioluminiscencia POD (50 jl/pocillo, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a la placa y en aproximadamente 3 minutos se leyó la luminiscencia en Molecular Devices M5 utilizando SoftMax Pro. El porcentaje de inhibición se determinó usando el siguiente cálculo: 100-((ULRmuestra-ULR mediasin bt-HGF control)/(ULR mediabt-HGF control-ULR mediasin bt-HGF control)))* 100). Los valores del porcentaje de inhibición del 50 % o más se consideraron aciertos.
Expresión y purificación de alto rendimiento de dominios FN3
Los dominios FN3 marcados con His se purificaron a partir de lisados de E. coli clarificados con placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) y se eluyeron en tampón que contenía fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM e imidazol 250 mM a pH 7,4. Las muestras purificadas se intercambiaron en PBS a pH 7,4 para su análisis utilizando placas PD MultiTrap ™ G-25 (GE Healthcare).
Determinación de la CI 50 de la inhibición de la unión de HGF a c-Met
Los dominios FN3 seleccionados se caracterizaron aún más en el ensayo de competición HGF. Las curvas de respuesta a la dosis para dominios FN3 purificados se generaron utilizando el ensayo descrito anteriormente (concentraciones iniciales de 5 jM). Se calcularon los valores de porcentaje de inhibición. Los datos se representaron como el % de inhibición frente al logaritmo de las concentraciones molares del dominio FN3 y los valores de la CI50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta de dosis sigmoidea con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4.
Se identificaron 35 secuencias únicas de la Ronda 5 para mostrar actividad a diluciones de 1:10, con valores de CI50 que van desde 0,5 a 1500 nM. La ronda 7 produjo 39 secuencias únicas con actividad a diluciones de valores de 1:100 y CI50 que oscilan entre 0,16 y 2,9 nM. Se identificaron 66 secuencias únicas de la Ronda 9, en la que los aciertos se definieron como activos a diluciones de 1:1000. Se observaron valores de CI50 de tan solo 0,2 nM en la Ronda 9 (Tabla 8).
Determinación de afinidad de los dominios FN3 de de unión a c-Met seleccionados a c-Met -Fc (afinidad de c-Met-Fc)
Las afinidades se determinaron para los dominios FN3 de unión a c-Met seleccionados de acuerdo con el protocolo descrito para la determinación de las afinidades al dominio de FN3 de unión a EGFR en el Ejemplo 3, excepto que en los experimentos se usó la proteína de fusión c-Met-Fc.
Ejemplo 6 Caracterización de los dominios FN3 que se unen a c-Met e inhiben la unión de HGF
Los dominios FN3 se expresaron y se purificaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. La cromatografía de exclusión por tamaño y el análisis cinético se realizaron como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. La Tabla 7 muestra las secuencias de la cadena C, el el bucle CD, la cadena F y el bucle FG, y una SEQ ID NO: para la secuencia completa de aminoácidos para cada dominio.
Tabla 7.
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Unión de los dominios FN3 de c-Met seleccionados a c-Met en células ("Ensayo de unión en células H441") Se sembraron células NCI-H441 (n.° de cat. HTB-174, Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA) a 20.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo negro transparente recubiertas con poli-D-lisina (BD Biosciences, San Jose, CA) y se dejó unir durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %. Se añadieron los dominios FN3 purificados (50 pl/pocillo; 0 a 1000 nM) a las células durante 1 hora a 4 °C en placas duplicadas. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo, BD Biosciences, n.° de cat. 554657). Las células se incubaron con anticuerpo anti-HIS biotinilado (diluido a 1:160 en tampón de tinción FACS, 50 pl/pocillo, R&D Systems, n.° de cat. BAM050) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo), tras lo cual los pocillos se incubaron con anticuerpo conjugado IgG1-Alexa 488 anti-ratón (diluidos a 1:80 en tampón de tinción FACS, 50 pl/pocillo, Life Technologies, n.° de cat. A21121) durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo) y se dejaron en el tampón de tinción FACS ( 50 pl/pocillo). La fluorescencia total se determinó utilizando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como señal de fluorescencia sin procesar frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3 y se ajustaron a una curva de dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (software GraphPad) para calcular los valores de CE50. Se encontró que los dominios FN3 exhibían un rango de actividades de unión, con valores de CE+ entre 1,4 nM y 22,0 nM, como se muestra en la Tabla 8.
Inhibición de la fosforilación de C-Met estimulada por HGF
Los dominios FN3 purificados se analizaron para determinar su capacidad para inhibir la fosforilación de c-Met estimulada por HGF en NCI-H441, utilizando el kit c-Met fosfo (Tyr1349) de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD). Las células se sembraron en placas a 20.000/pocillo en placas transparentes tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI (que contenía GlutaMAX y HEPES, Life Technologies) con seroalbúmina bovina fetal al l0 % (FBS; Life Technologies) y se dejó unir durante la noche a 37 °C Con CO2 al 5 %. El medio de cultivo se eliminó completamente y las células se dejaron sin alimento durante la noche en medio RPMI sin suero (100 pl/pocillo) a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se rellenaron con medio RPMI libre de suero fresco (100 pl/pocillo) que contenía dominios FN3 a una concentración de 20 pM e inferior durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %. Los controles se trataron con medio solamente. Las células se estimularon con 100 ng/ml de HGF humano recombinante (100 pl/pocillo, R&D Systems n. ° de cat. 294-HGN) y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 15 minutos. Un conjunto de pocillos de control se dejó sin estimular como controles negativos. El medio se eliminó completamente y las células se lisaron con tampón de lisis completa (50 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, según las instrucciones del fabricante. Las placas de ensayo configuradas para medir c-Met fosforilado se bloquearon con la solución de bloqueo provista según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron después tres veces con tampón de lavado Tris (200 pl/pocillo, Meso Scale Discovery). Los lisados celulares (30 pl/pocillo) se transfirieron a placas de ensayo y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Las placas de ensayo se lavaron después cuatro veces con tampón de lavado Tris, después de lo cual se añadió solución de anticuerpo de detección helada (25 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) a cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las placas se enjuagaron de nuevo cuatro veces con tampón de lavado Tris. Las señales se detectaron mediante la adición de 150 tampón de lectura (150 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) y la lectura en un instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) usando las configuraciones predeterminadas específicas del ensayo instaladas por el fabricante. Los datos se representaron como una señal de electroquimioluminiscencia frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3 y los valores de CI50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4. Se encontró que los dominios FN3 inhibían c-Met fosforilado con valores de CI50 que varían de 4,6 nM a 1415 nM, como se muestra en la Tabla 8.
Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas
La inhibición del crecimiento de células dependientes de c-Met se evaluó midiendo la viabilidad de las células U87-MG (Colección Americana de Cultivos Tipo, n.° de cat. HTB-14), después de la exposición a los dominios FN3 que se unen a c-Met. Las células se sembraron en placas a 8000 células/pocillo en placas opacas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI suplementado con FBS al 10 % y se dejó unir durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Veinticuatro horas después de la siembra, se aspiró el medio y las células se rellenaron con medio RPMI sin suero.
Tabla 8.
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Veinticuatro horas después de la inanición del suero, las células se trataron mediante la adición de un medio sin suero que contenía los dominios FN3 de unión a c-Met (30 pl/pocillo). Las células se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 72 horas. Las células viables se detectaron mediante la adición de 100 pl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega), seguido de la mezcla en un agitador de placas durante 10 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) configurado en modo de luminiscencia, con un tiempo de lectura de 0,5 segundos/pocillo. Los datos se representaron como unidades de luminiscencia sin procesar (ULR) frente al logaritmo de la concentración molar del dominio FN3. Los valores de CI50 se determinaron ajustando los datos a una ecuación para una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4. La Tabla 8 indica valores de CI50 que van desde 1 nM hasta > 1000 nM.
Las características de los dominios FN3 de unión a c-Met se resumen en la Tabla 8.
Estabilidad térmica de los dominios FN3 de unión a c-Met
Se usó calorimetría diferencial de barrido en PBS para evaluar la estabilidad de cada dominio FN3. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9.
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EJEMPLO 7. Generación y caracterización de moléculas biespecíficas anti-EGFR/c-Met
Generación de moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met
Numerosas combinaciones de los dominios FN3 de unión a EGFR y c-Met descritos en los Ejemplos 1-6 se unieron en moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a EGFR como a c-Met. Además, los dominios FN3 de unión a EGFR que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 107-110 y los dominios FN3 de unión a c-Met que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 111-114 se hicieron y se unieron en moléculas biespecíficas. Se crearon genes sintéticos para codificar las secuencias de aminoácidos descritas en las SEQID NO: 50-72, 106, 118-121 o 190-193 (Tabla 10) de manera que se mantuvo el siguiente formato: dominio FN3 de unión a EGFR seguido de un enlazador peptídico seguido de un dominio FN3 de unión a c-Met. Se incorporó una cola de poli-histidina en el extremo C-terminal para ayudar a la purificación. Además de las moléculas descritas en la Tabla 10, el enlazador entre los dos dominios FN3 se varió según la longitud, la composición de la secuencia y la estructura de acuerdo con las enumeradas en la Tabla 11. Está previsto que se puedan usar otros numerosos enlazadores para unir dichos dominios FN3. Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met se expresaron y se purificaron a partir de E. coli como se describe para los dominios FN3 monoespecíficos de EGFR o de c-Met usando etapas de IMAC y de cromatografía de filtración en gel. Es evidente para los expertos en la materia que las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met pueden contener o no una metionina iniciadora. Las moléculas de ejemplo con la metionina iniciadora son moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 106, 118-121, 138-165, 190 y 192, y las moléculas de ejemplo sin metionina iniciadora se muestran en las SEQ ID NO: 50-72, 191 y 193. La presencia de la metionina iniciadora para los dominios FN3 de unión a EGFR asegura una actividad adecuada; la metionina iniciadora tiene menos impacto en los dominios FN3 de c-Met.
Tabla 10.
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Tabla 11.
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Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met mejoran la potencia en comparación con las moléculas monoespecíficas solas, lo que sugiere avidez
Las células NCI-H292 se sembraron en placas de 96 pocilios en medio RPMI que contenía FBS al 10 %. 24 horas después, el medio se reemplazó con RpMI sin suero. 24 horas después de la inanición del suero, las células se trataron con concentraciones variables de dominios FN3: un dominio EGFR FN3 monoespecífico de alta afinidad (P54AR4-83v2), un dominio FN3 monoespecífico de c-Met de afinidad débil (P114AR5P74-A5), la mezcla de los dos los dominios FN3 monoespecíficos de EGFR y c-Met o moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met que comprenden el dominio FN3 de c-Met de baja afinidad unido al dominio FN3 de EGFR de alta afinidad (ECB1). Las células se trataron durante 1 hora con las moléculas monoespecíficas o biespecíficas y luego se estimularon con EGF, HGF o una combinación de EGF y HGF durante 15 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se lisaron con tampón de lisis de MSD y la señalización celular se evaluó utilizando las placas de ensayo de MSD adecuadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se ha descrito anteriormente.
El dominio FN3 de c-Met de baja afinidad inhibió la fosforilación de c-Met con una CI50 de 610 nM (Figura 4). Como era de esperar, el dominio FN3 de EGFR no pudo inhibir la fosforilación de c-Met y la mezcla de las moléculas monoespecíficas parecía idéntica al dominio FN3 de c-Met solo. Sin embargo, la molécula biespecífica de EGFR/c-Met inhibió la fosforilación de c-Met con una CI50 de 1 nM (Figura 4), proporcionando un cambio de más de 2 log en la mejora de la potencia en relación con el monoespecífico de c-Met solo.
El potencial de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met para mejorar la inhibición de la fosforilación de c-Met y/o EGFR a través de un efecto de avidez se evaluó en múltiples tipos de células con densidades y proporciones variables de c-Met y EGFR (Figura 5). Las células NCI-H292, NCI-H441 o NCI-H596 se sembraron en placas de 96 pocillos en medio RPMI que contenía FBS al 10 %. 24 horas después, el medio se reemplazó con RPMI sin suero.
24 horas después de la inanición del suero, las células se trataron con concentraciones variables de cualquiera de los dominios FN3 monoespecíficos de unión a EGFR, del dominio FN3 monoespecífico de c-Met o de una molécula biespecífica de EGFR/c-Met (ECB5, compuesta por P53A1R5-17v2 y P114AR7P94-A3) . Las células se trataron durante 1 hora con las moléculas monoespecíficas o biespecíficas y luego se estimularon con EGF, HGF o una combinación de EGF y HGF durante 15 minutos a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se lisaron con tampón de lisis de MSD y la señalización celular se evaluó utilizando las placas de ensayo de MSD adecuadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se ha descrito anteriormente.
La Figura 5 (A-C) muestra la inhibición de EGFR utilizando un dominio monoespecífico FN3 de unión a EGFR en comparación con una molécula biespecífica de EGFR/cMet en tres líneas celulares diferentes. Para evaluar la avidez en un ensayo de fosforilación de EGFR, se comparó un dominio FN3 de unión a EGFR de afinidad media (1,9 nM) (P53A1R5-17v2) con una molécula biespecífica de EGFR/c-Met que contiene el mismo dominio FN3 de unión a EGFR unida a un dominio FN3 de unión a c-Met de alta afinidad (0,4 nM) (P114AR7P94-A3). En las células H292 y H596, la inhibición de la fosforilación de EGFR fue comparable para las moléculas monoespecíficas y biespecíficas (Figuras 5A y 5B), probablemente debido a que estas líneas celulares tienen una alta proporción de EGFR a receptores de c-Met. Para probar esta teoría, se evaluó la inhibición de la fosforilación de EGFR en células NCI-H441 que exhiben más receptores de C-Met que EGFR. El tratamiento de las células NCI-H441 con la molécula biespecífica de EGFR/c-Met redujo la CI50 para la inhibición de la fosforilación de EGFR en comparación con el dominio FN3 monoespecífico de unión a EGFr en 30 veces (Figura 5C).
El potencial de la potencia mejorada con una molécula biespecífica de EGFR/c-Met se evaluó en un ensayo de fosforilación de c-Met utilizando una molécula con una alta afinidad por EGFR (0,26 nM) y afinidad media por c-Met (10,1 nM). Tanto en las células NCI-H292 como en las células NCI-H596, la inhibición de la fosforilación de c-Met se mejoró con la molécula biespecífica en comparación con el dominio FN3 monoespecífico de unión a c-Met, en 134 y 1012 veces, respectivamente (Figura 3D y 3E).
Se verificó que la potencia mejorada para la inhibición de la fosforilación de EGFR y c-Met con las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met se tradujo en una inhibición mejorada de la señalización y la proliferación. Para estos experimentos, la mezcla de dominios FN3 de unión a EGFR y de unión a c-Met se comparó con una molécula biespecífica de EGFR/c-Met. Como se describe en las Tablas 12 y 13, los valores de CI50 para la fosforilación de ERK (Tabla 12) y la proliferación de células H292 (Tabla 13) disminuyeron cuando las células se trataron con la molécula biespecífica de EGFR/c-Met en comparación con la mezcla de los enlazadores monoespecíficos. La CI50 para la inhibición de la fosforilación de ERK para la molécula bifásica de EGFR/c-Met fue 143 veces más baja en comparación con la mezcla de los dos dominios FN3 monoespecíficos de EGFR y c-Met, mostrando el efecto de la avidez en la potencia de las moléculas en este ensayo. En la Tabla 12, los dominios monoespecíficos FN3 de unión a EGFR y c-Met no inhiben completamente la actividad y, por lo tanto, los valores de CI50 mostrados deben considerarse límites inferiores. El ensayo de proliferación se completó utilizando diferentes combinaciones de dominios FN3 de unión a EGFR y c-Met, ya sea como una mezcla o enlazados en un formato biespecífico. La CI50 para la inhibición de la proliferación de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met fue 34-236 veces más baja con respecto a la mezcla de los dominios FN3 monoespecíficos de unión a EGFR o c-Met parental. Esto confirmó que el efecto de avidez observado a nivel de los receptores (Figura 4 y Figura 5) se traduce en una mejora en la inhibición de la señalización celular (Tabla 12) y la proliferación celular (Tabla 13).
Tabla 12.
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Tabla 13.
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Xenoinjertos tumorales in vivo: PK/PD
Con el fin de determinar la eficacia de las moléculas monoespecíficas y biespecíficas de dominios FN3 in vivo, las células tumorales se diseñaron para secretar HGF humano (el HGF murino no se une a Met humano). E1HGF humano se expresó de manera estable en las células NCI-H292 utilizando una infección lentiviral (vector de ADN lentiviral que expresa HGF humano (número de registro X16322) y un kit de empaquetamiento lentiviral de Genecopoeia). Después de la infección, se seleccionaron células que expresaban HGF con 4 pg/ml de puromicina (Invitrogen). La proteína HGF humana se detectó en el medio acondicionado de las células reunidas utilizando placas de ensayo de MesoScale Discovery.
Se inoculó a los ratones SCID Beige por vía subcutánea células NCI-H292 que expresaban HGF humano (2,0x106 células en Cultrex (Trevigen) en un volumen de 200 pl) en el flanco dorsal de cada animal. Las mediciones del tumor se realizaron dos veces a la semana hasta que los volúmenes del tumor oscilaron entre 150 y 250 mm3 A continuación, se administró a los ratones una única dosis i.p. de moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met (unidas a un dominio de unión a la albúmina para aumentar la semivida) o vehículo PBS. A las 6 h o 72 h después de la dosificación, los tumores se extrajeron y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción cardíaca en inhibidores de proteasa que contienen citrato al 3,8 %. Inmediatamente después de la recolección, las muestras de sangre se centrifugaron y el plasma resultante se transfirió a los tubos de muestra y se almacenó a - 80 °C. Los tumores se pesaron, se cortaron en trozos pequeños y se lisaron en tubos Lysing Matrix A (LMA) que contenían tampón RIPA con inhibidores de proteasa/fosfatasa HALT (Pierce), fluoruro de sodio 50 mM (Sigma), ortovanadato de sodio activado 2 mM (Sigma) y PMSF 1 mM (MesoScale Discovery). Los lisados se eliminaron de la matriz de LMA y se centrifugaron para eliminar la proteína insoluble. La proteína tumoral soluble se cuantificó con un ensayo de proteína BCA y se diluyó hasta niveles de proteína equivalentes en un tampón de lisis tumoral. C-Met fosforilada, EGFR y ERK se midieron utilizando placas de ensayo de MesoScale Discovery (según el protocolo del fabricante y como se ha descrito anteriormente).
La figura 6 muestra los resultados de los experimentos. Cada molécula biespecífica de EGFR/c-Met redujo significativamente los niveles de c-Met, EGFR y ERK fosforilados tanto a las 6 como a las 72 horas. Los datos presentados en la Figura 6 muestran la importancia de inhibir tanto c-Met como EGFR simultáneamente y cómo la afinidad de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met para cada receptor desempeña un papel en la inhibición de ERK aguas abajo . Las moléculas que contenían los dominios FN3 de unión a EGFR de alta afinidad (P54AR4-83v2; mostradas como "8" en la Figura, Kd = 0,26 nM) inhibieron la fosforilación de EGFR en mayor medida en comparación con las que contienen los dominios FN3 de unión a EGFR con afinidad media (P53A1R5-17v2; mostrados como "17" en la figura Kd = 1,9 nM) tanto a las 6 h como a las 72 horas. Las cuatro moléculas biespecíficas analizadas inhibieron completamente la fosforilación de ERK en el punto de tiempo de 6 horas, independientemente de la afinidad. En el punto de tiempo de 72 horas, las moléculas que contienen el dominio de unión a c-Met de afinidad estrecha (P114AR7P94-A3; mostradas como "A3" en la figura Kd = 0,4 nM) inhibieron significativamente la fosforilación de ERK en comparación con el dominio FN3 de unión a c-Met de afinidad media (P114AR5P74-A5; mostrado como "A5" en la Figura; Kd = 10,1 nM; Figura 6).
La concentración de cada molécula biespecífica de EGFR/c-Met se midió a las 6 y 72 horas después de la dosificación en la sangre y en el tumor (Figura 7). Curiosamente, la molécula biespecífica con el dominio de unión a EGFR de afinidad media (P53A1R5-17v2; Kd = 1,9 nM) pero el dominio FN3 de unión a c-Met de alta afinidad (P114AR7P94-A3; Kd = 0,4 nM) tuvo significativamente más acumulación tumoral a las 6 horas en relación con las otras moléculas, mientras que la diferencia disminuye en 72 horas. Se puede suponer que las células fuera del tumor tienen niveles más bajos de expresión en superficie tanto de EGFR como de c-Met y, por lo tanto, la molécula de EGFR de afinidad media no se une al tejido normal en comparación con el dominio FN3 de unión a EGFR de mayor afinidad. Por lo tanto, hay más dominio FN3 de unión a EGFR de afinidad media libre disponible para unirse al tumor. Por lo tanto, la identificación de las afinidades apropiadas para cada receptor puede permitir la identificación de un agente terapéutico con toxicidades sistémicas disminuidas y una mayor acumulación de tumores.
Estudios de eficacia tumoral con moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met
Se inoculó a los ratones SCID Beige por vía subcutánea células NCI-H292 que expresaban HGF humano (2,0x106 células en Cultrex (Trevigen) en un volumen de 200 pl) en el flanco dorsal de cada animal. Una semana después de la implantación, los ratones se estratificaron en grupos con volúmenes tumorales equivalentes (volumen tumoral medio = 77,9 /- 1,7 mm3). Los ratones recibieron dosis tres veces a la semana de las moléculas biespecíficas y los volúmenes tumorales se registraron dos veces a la semana. Se observó inhibición del crecimiento tumoral (ICT) con cuatro moléculas biespecíficas diferentes, con afinidades variables para c-Met y EGFR. La Figura 8 muestra el beneficio de inhibir tanto c-Met como EGFR, ya que se observó un retraso en el crecimiento del tumor en los ratones tratados con moléculas que contenían el dominio FN3 de unión a EGFR de alta afinidad en comparación con el dominio FN3 de unión a EGFR de afinidad media cuando el dominio FN3 de unión a C-met era de afinidad media (triángulos abiertos frente a cerrados, P54AR4-83v2- P114AR5P74-A5 en comparación con P53A1R5-17-P114AR5P74-A5). Además, los datos muestran la importancia de tener un dominio FN3 de unión a c-Met de alta afinidad como moléculas biespecíficas que contienen el dominio FN3 de unión a EGFR de afinidad alta o media, pero el dominio FN3 de unión a c-Met de alta afinidad mostró la mayor eficacia ( líneas de puntos grises y negras, P54AR4-83v2- P114AR7P94-A3 y P53A1R5-17v2- P114AR7P94-A3).
Eficacia de la molécula biespecífica y otros inhibidores de EGFR y c-Met
Las eficacias terapéuticas in vivo de una molécula biespecífica de EGFR/c-Met (ECB38) y los inhibidores de molécula pequeña crizotinib (inhibidor de c-Met) y erlotinib (inhibidor de EGFR), cetuximab (anticuerpo anti-EGFR), cada uno como agente único. y la combinación de crizotnib y erlontinib, se evaluaron en el tratamiento del modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H292-HGF subcutáneo en ratones SCID/Beige.
Las células H292-HGF se mantuvieron in vitro en medio RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal (10 % v/v) y L-glutamina (2 mM) a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % en aire. Las células se subcultivaron de forma rutinaria dos veces a la semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células que crecían en una fase de crecimiento exponencial se recogieron y se contaron para la inoculación del tumor.
Tabla 14.
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A cada ratón se inocularon por vía subcutánea en la región del flanco derecho células tumorales H292-HGF (2 x 6 ) en 0,1 ml de PBS con Cultrex (1:1) para el desarrollo del tumor. Los tratamientos se iniciaron cuando el tamaño medio del tumor alcanzó 139 mm3. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo de estudio se mostraron en la siguiente tabla de diseño experimental. La fecha de la inoculación de las células tumorales se denota como día 0. La tabla 14 muestra los grupos de tratamiento.
Antes del comienzo del tratamiento, se pesaron todos los animales y se midieron los volúmenes del tumor. Dado que el volumen del tumor puede afectar a la efectividad de cualquier tratamiento dado, se asignó a los ratones a grupos utilizando un diseño de bloques al azar en función de sus volúmenes tumorales. Esto asegura que todos los grupos sean comparables a nivel basal. El diseño de bloques al azar se usó para asignar animales experimentales a grupos. Primero, los animales experimentales se dividieron en bloques homogéneos de acuerdo con su volumen tumoral inicial. En segundo lugar, dentro de cada bloque, se realizó la aleatorización de animales experimentales a los tratamientos. El uso de un diseño de bloques al azar para asignar animales experimentales aseguró que cada animal tuviera la misma probabilidad de ser asignado a un tratamiento dado y, por lo tanto, se redujo el error sistemático.
En el momento de la monitorización de rutina, se comprobaron los efectos del crecimiento del tumor y los tratamientos sobre el comportamiento normal, tal como la movilidad, la estimación visual del consumo de alimentos y agua, la ganancia/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron dos veces a la semana), la matización de los ojos/pelos y cualquier otro efecto anormal.
El criterios de valoración fue si el crecimiento del tumor puede retrasarse o los ratones portadores de tumores pueden curarse. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana en dos dimensiones con un calibrador y el volumen se expresó en mm3 con la fórmula: V = 0,5 a x b2 donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. A continuación, el tamaño del tumor se usó para los cálculos de los valores tanto de T-C como de T/C. T-C se calculó con T como el tiempo (en días) requerido para que el tamaño medio del tumor del grupo de tratamiento alcance 1000 mm3, y C fue el tiempo (en días) para que el tamaño medio del tumor del grupo control alcanzara el mismo tamaño. El valor T/C (en porcentaje) fue una indicación de la eficacia antitumoral; T y C fueron el volumen tumoral medio de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día determinado. La regresión tumoral completa (RC) se define como los tumores que se reducen por debajo del límite de palpación (62,5 mm3). La regresión tumoral parcial (RP) se define como los tumores que se reducen desde el volumen inicial del tumor. Se requiere una duración mínima de RC o RP en 3 o más mediciones de tumores sucesivas para que se considere que una RC o RP es duradera.
Se sacrificó a los animales para los cuales la pérdida de peso corporal superó el 20 %, o para los cuales el tamaño medio del tumor del grupo excede los 2000 mm3. El estudio finalizó después de dos semanas de observación después de la dosis final.
Las estadísticas de resumen, que incluyen la media y el error estándar de la media (SEM), se proporcionan para el volumen del tumor de cada grupo en cada punto de tiempo que se muestra en la Tabla 15. Los análisis estadísticos de la diferencia en el volumen del tumor entre los grupos se evaluaron utilizando un ANOVA de una vía seguido de comparaciones individuales utilizando Games-Howell (no se supone la misma varianza). Todos los datos se analizaron utilizando SPSS 18,0. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Tabla 15.
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El tamaño medio del tumor del grupo tratado con vehículo (Grupo 1) alcanzó 1.758 mm3 el día 23 después de la inoculación del tumor. El tratamiento con la molécula biespecífica de EGFR/c-Met biespecífica a un nivel de dosis de 25 mg/kg (Grupo 2) llevó a la regresión completa del tumor (RC) en todos los ratones, que fue duradera en> 3 mediciones sucesivas del tumor (VT promedio = 23 mm3, valor T/C = 1 %, p = 0,004 comparado con el grupo de vehículo el día 23).
El tratamiento con crizotinib como agente único a un nivel de dosis de 50 mg/kg (Grupo 3) no mostró actividad antitumoral; el tamaño medio del tumor fue de 2.102 mm3 el día 23 (valor T/C = 120 %, p = 0,944 en comparación con el grupo del vehículo).
El tratamiento con erlotinib como agente único a un nivel de dosis de 50 mg/kg (Grupo 4) mostró una actividad antitumoral menor, pero no se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo del vehículo; el tamaño medio del tumor fue de 1.122 mm3 el día 23 (valor T/C = 64 %, p = 0,429 en comparación con el grupo del vehículo), con 4 días de retraso del crecimiento del tumor en el tamaño del tumor de 1.000 mm3 en comparación con el grupo del vehículo.
La combinación de crizotinib (50 mg/kg, Grupo 5) y erlotinib (50 mg/kg, Grupo 5) mostró una actividad antitumoral significativa; el tamaño medio del tumor fue de 265 mm3 el día 23 (T/C = 15 %; I = 0,008), con 17 días de retraso en el crecimiento del tumor al tamaño del tumor de 1.000 mm3 en comparación con el grupo del vehículo.
El cetuximab a nivel de dosis de 1 mg/ratón como agente único (Grupo 6) mostró actividades antitumorales significativas; el tamaño medio del tumor fue de 485 mm3 el día 23 (T/C = 28 %; p = 0,018), con 17 días de retraso del crecimiento del tumor en el tamaño del tumor de 1.000 mm3 en comparación con el grupo del vehículo. La Figura 9 y la Tabla 16 muestran las actividades antitumorales de las diversas terapias.
Tabla 16.
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Se observó una pérdida de peso corporal media a grave en el grupo del vehículo, lo que podría deberse al aumento de la carga tumoral; murieron 3 ratones y se sacrificó a 1 ratón cuando BWL> 20 % al día 23. Se observó una ligera toxicidad de la molécula biespecífica de EGFR/c-Met en el Grupo 2; se sacrificó a 3 ratones cuando BWL> 20 % durante el período de tratamiento; el peso corporal se recuperó gradualmente cuando se retiró el tratamiento durante las 2 semanas del período de observación. Se observó una pérdida de peso corporal más grave en el grupo de monoterapia con crizotinib o erlotinib en comparación con el grupo del vehículo, lo que sugiere la toxicidad relacionada con el tratamiento. La combinación de crizotinib y erlotinib fue generalmente tolerada durante la fase de dosificación, pero al final del estudio se observó una pérdida de peso corporal grave, que podría deberse a la reanudación del rápido crecimiento del tumor durante el período sin tratamiento. La monoterapia de cetuximab fue bien tolerada en el estudio; la pérdida de peso corporal solo se observó al final del estudio debido a la reanudación del crecimiento del tumor.
En resumen, la molécula biespecífica de EGFR/c-Met a 25 mg/kg (3 veces/semana x 3 semanas) produjo una respuesta completa en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H292-HGF en ratones SCID/Beige. El tratamiento fue tolerado en 7 de cada 10 ratones y resultó en una pérdida de peso corporal intensa en 3 de cada 10 ratones. La Figura 9 muestra el impacto de las diversas terapias en el tamaño del tumor durante los puntos de tiempo posteriores al tratamiento.
Ejemplo 8: Extensión de la semivida de las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met
Se han descrito numerosos métodos para reducir la filtración renal y, por lo tanto, extender la semivida sérica de las proteínas, incluida la modificación con polietilenglicol (PEG) u otros polímeros, la unión a la albúmina, la fusión a los dominios de proteínas que se unen a la albúmina u otras proteínas del suero, la fusión genética a la albúmina, la fusión a los dominios Fc de IgG y la fusión a secuencias de aminoácidos largas y no estructuradas.
Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met se modificaron con PEG para aumentar el radio hidrodinámico incorporando una cisteína libre en el extremo C de la molécula. Más habitualmente, el grupo tiol libre del residuo de cisteína se usa para unir moléculas de PEG que están funcionalizadas con grupos de maleimida o yodoacetemida usando métodos estándar. Se pueden usar varias formas de PEG para modificar la proteína, incluido PEG lineal de 1000, 2000, 5000, 10.000, 20.000 o 40.000 kDa. Las moléculas de PEG ramificadas de estos pesos moleculares también se pueden usar para la modificación. Los grupos PEG también pueden unirse a través de aminas primarias en las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met en algunos casos.
Además de la PEGilación, la semivida de las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met se extendió al producir estas proteínas como moléculas de fusión con un dominio de unión a la seroalbúmina (ABD) del haz de 3 hélices de origen natural o un dominio de unión a la albúmina de consenso (ABDCon) . Estos dominios de proteínas se unieron al extremo C-C del dominio FN3 de unión a c-Met a través de cualquiera de los enlazadores descritos en la Tabla 12. El dominio ABD o ABDCon también se puede colocar entre el dominio FN3 de unión a EGFR y el dominio FN3 de unión a c-Met en la secuencia primaria. En algunos casos, la albúmina o variante de albúmina (SEQ ID NO: 189) se unió a las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met al extremo C del dominio FN3 de unión a c-Met.
Ejemplo 9: Caracterización de ciertas moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met
Las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met selectas se caracterizaron por su afinidad con EGFR y c-Met, su capacidad para inhibir la autofosforilación de EGFR y c-Met, y su efecto sobre la proliferación de células HGF. La afinidad de unión de las moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met al EGFR recombinante y/o al dominio extracelular de c-Met se analizó adicionalmente mediante métodos de resonancia de plasmón superficial utilizando un Proteon Instrument (BioRad) de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3. Los resultados de la caracterización se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17.
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Ejemplo 10. Paratopos de los dominios FN3 de unión a EGFR y c-Met
Se realizaron una serie de mutaciones en la molécula P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27) con el fin de definir residuos críticos para la unión al dominio extracelular de EGFR. Para este análisis, cada posición de aminoácido en los bucles BC y FG se mutó a alanina de una en una para producir 18 nuevas moléculas. La afinidad con la que estos mutantes se unen a EGFR se determinó mediante análisis SPR utilizando un instrumento Proteon. Los resultados se muestran en la Tabla 18. 10 posiciones resultaron en una pérdida de afinidad de unión mayor a 10 veces, lo que indica que estas posiciones contribuyen a la unión a EGFR. La cantidad de cambio indica la cantidad de cambio del valor Kd de una variante cuando se compara con el P54AR4-83v2 parental. Una combinación de residuos de los bucles BC y FG conforma la superficie de unión. Se demostró que 1o posiciones debilitaban la unión a EGFR en más de 10 veces, y se demostró que 5 posiciones debilitaban la unión a EGFR en más de 100 veces (D23, F27, Y28, V77, G85). Además de P54AR4-83v2, las moléculas de unión a EGFR P54AR4-48, P54AR4-81, P53A1R5-17v2, P54AR4-83v22 y P54AR4-83v23 (SEQ ID NO: 21, 25, 107, 108 y 109, respectivamente) tienen residuos idénticos en las posiciones de los paratopos que debilitan la unión de EGFR en más de 100 veces cuando se mutan. Varias moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met generadas comprenden P54AR4-83v2, P54AR4-48, P54AR4-81, P53A1R5-17v2, P54AR4-83v22 o P54AR4-83v2 como su dominio FN3 de unión a EGFR como se muestra en la Tabla 10.
Tabla 18.
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
Del mismo modo, se realizaron una serie de mutaciones en la superficie de interacción presunta de c-Met de la molécula P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41) con el fin de definir posiciones críticas para el enlace de destino. Este análisis se realizó en el contexto de la molécula biespecífica ECB15 (SEQ ID NO: 145) y se usó serina como reemplazo en lugar de alanina como se ha descrito anteriormente. Se eligió la serina para disminuir la hidrofobicidad de los mutantes resultantes. La Tabla 19 describe los resultados de SPR con la numeración de cada posición de mutación en relación con la de la molécula A3 (SEQ ID NO: 41). Se demostró que 7 posiciones debilitaban la unión a c-Met en más de 10 veces. No se pudo medir la unión de los mutantes M72S, R34S e I79S. La mutación F38S redujo la unión a c-Met en más de 100 veces. Estos datos demuestran que las posiciones que contribuyen a la unión de c-Met se distribuyen entre la cadena C, la cadena F, el bucle CD y el bucle FG. La cantidad de cambios indica el cambio del valor Kd de una variante en comparación con el P114AR7P95-A3 parental. Además de P114AR7P94-A3, las moléculas de unión a c-Met P114AR7P92-F3, P114AR7P95-D3, P114AR7P95-F10 y P114AR7P95-H8 (SEQ ID NO: 34, 44, 47 y 49, respectivamente) tienen residuos idénticos en las posiciones de los paratopos que debilitan la unión de c-Met en más de 100 veces cuando se mutan.
Tabla 19.
Figure imgf000051_0002
Ejemplo 11. Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas por moléculas biespecíficas de EGFR/c-Met
La inhibición del crecimiento de células tumorales humanas se evaluó en un cultivo de unión estándar como se describe en los Ejemplos 3 o 6, o en condiciones de unión baja. Para evaluar la supervivencia en condiciones de unión baja, las células se sembraron en placas de 96 pocillos de fijación ultra baja (Corning Costar) en 50 pl/pocillo de medio RPMI (Invitrogen) que contenía GlutaMAX y Hepes 25 mM, suplementado con piruvato de sodio 1 mM (Gibco), NEAA 0,1 mM (Gibco) y suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (Gibco), y se dejó unir durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se trataron con concentraciones variables de anticuerpos (0,035 - 700 nM final), junto con HGF (7,5 ng/ml, R&D Systems n° de cat. 294-HGN), luego se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 72 horas. Algunos pocillos se dejaron sin tratar con HGF o anticuerpos como controles. Las células viables se detectaron utilizando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega), y los datos se analizaron como se ha descrito anteriormente en "Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (crecimiento de NCI-H292 y ensayo de crecimiento de NCI-H322)" en el Ejemplo 3, excepto que los lisados fueron transferido a placas blancas opacas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos (PerkinElmer) antes de leer la luminiscencia.
La línea celular se clasificó como un fuerte respondedor a la molécula biespecífica EGFR/c-Met en aquellos casos en que la inhibición máxima del crecimiento celular fue> 40 % y la CI50 relativa <5 mM.
La actividad inhibitoria de ECB15 se evaluó en múltiples líneas celulares que tenían EGFR de tipo salvaje, amplificado o mutante y c-Met amplificada o de tipo salvaje. ECB15 inhibió el crecimiento de células tumorales de líneas celulares que se muestra en la Tabla 20. ECB15 también inhibió el crecimiento de la línea celular NCI-H1975 que tiene la mutación T790M, que se ha demostrado que produce resistencia a los TKI, como erlotinib.
Tabla 20.
Figure imgf000052_0001
Listado de secuencias
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SEQ ID NO: 73, PRT, Homo Sapiens, EGFR
1.1‘nrpsqr.aq'aa 1 l a i l a a l c p a s r a l e a k k v c per p s n k 1.1 q I g t f e c l h f i s i q r m f r ] n c e v 61. v 1 g n l e i l y v q r n y d l s f I k i ' . j . q e v a g y v l i a l P t.v e 'r i p ].er¡ l.q.i ir .qr¡ P i y y e n s y a l a 121 v i s n y cia n .11 g l k e i p m r n l q e i l P q a v r f -snnpalcnve s l q w r d i v s s d f isruTi-sradi 181 q n b l g s c q k c dpscpngs cw o; a q e a n c q k l t k i i c a q q c s q r c r q k s p s d c c h n q c a a g c 241 t q p r e s d c l v o r k i r d e a Lc k d t . o p p l r u l y n p t t . yqrqdvn p e q k y s f g a. t c v k k c p r r . y v
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1321 p y t v 11 h g e v r gh s t rp 1 a v a v v t e d 1 p q i. cfála vse vc g d q l r ln w t a a d n a. y e li f v i q 1381 vqevnkveaa qrj 1 t i p a s 1 r a v d l p g lea a L p y rv a ly g v 1 r g y r t p v l s a e a s ta k ep e 1441 i g n l n v s d i t pesfnl.swrrLá t d g i f e - t f t i e i i d c n r l l e t v e y n i s g a e r t a h i s g l p p 1501 s t d f i v v l s g l a p s i r t k t i s a t a t t e a i p l i e n i t i s d i n p y g f t v t v/nt a s e n a f d s f l 1561 v t vvdsqkl. ]. dpcre f 1.1 s g t qr k l e l r g I r t ct i g ye v rn v s q f t qgh qt. k p i r a e j - V t e a e 1621 p e v d n l i v s d a t p d g f ri-3w t a d e g v f d n f v l k i r d t k k q s e p l e i t H a p e r t r d i t g i 1631 reatta/e l e í y g is k g i r z s q t v s a i a t t a m g s p k e v i r s d insr isa tvsw rapt iaqves f 1 ?41 rj-LVvn.it.cTg t p s rn v t v dq t k t q t r .1 v k 1 i. pgve y l v s 1 i. a re k q f e e s e p vscís f t. de Id 1801 q p s g l v t a n i td s e a ia r v íq p a i a t v d s y v i s y t g e k v p e i t r t v s g n t v e y a i t d l e p a 136 ]. O ey t l r i f a e kgpqkss t I d a k l l t - d ld s p r d i t a Lev cps e da ].J. Lwrpp i. a sv 0qyj_l v 1921 y e s a.'d g t v k e v i v q p d t t ay a lad Isn st .h Vda K iq a Incr p i r annd.cTr.i f t t.icrl l y p f 1931 pkdcEqaniin g d n t s g l v t i y ln g d k a e a i e v f cdratsdg g g w i v f I r r k ngrentyqnw 2041 kay& aq fgdr r e e f v l g l d r Ink lO aggqy e l r v d l r d h g et .a .tavydkf o v g d a k l r y k 2101 Ikveqysg t .a qdsrRayhngr s t j s t f dkdtd se i.dr¡ cedí sy kga fvyr r ;ch rva l irq jjygd 2161 nnhsqgvnwf hwkcfhehs icq fa en ik i rp í n f r n l e g r r k r a
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>SEQ ID NO: 101
PRT
Homo sapiens
cMet
j T tk a p a v l a p g i 1 v ’ : l v q r. s a g e c k e a . i akserr-r j v nm k yqd.pr¡ í_ PSE-t. p i. qn v i dh e h 61 h . i f l q a t n y f y v i n e e cllq 'k v a e y k t q p v i e h p d e f p c q d c s s k o n l t q q Yo­k d n i n m a l 121 \ í V d Ly y d d q l 130 g a v n r g t o q r h v f p l n h t a d l q s e v h c l e e p s go p d c t v s a ].
181 ga .kv I s s v k c i r f i n f f v g n - i n s s y f p d h p l h s i s v r r l k e t k d g f m f l t d g s y r d v l p a 241 f r d s Y P i k y v h a f s s r¡ n £ i y f l r v q r e t l d a q t f h r r i i r f e o i n s g l n o Y'f-e m p l e c i l 301 t e k r k k r s '5 k k e v f o l I q a o y t o k p g a q . l a r q i ge i I h g v f a q a k p d s a e p a d r s 361 arica. f p i k y v n d f £ a k i v n k n n v r c i q h f y g pn h e h e l a r t i l r n a s g a s a r r á e y r l e f 421 t r a l q r v d l f mgq f s e v_l I t s i s t f i k g d l t i a n i g r s e g r fm q v v v a r s gp S t p h .V I i f l 43 1 I d s h pv a p e v 1 v e h o l y t l ^ i d q k k i t k 1 P l n g l g r n h f q s c s q c l na p p l ^ g c q w 541 c h d k c v r s e e c l s g t o t q q i c l p a i y k v f p n s a p l e g g r r I t i c g v í d f g f r e i ' i n k l d l k k 601 t r v l l g r . e s c 11a 1s e s tmn t i k c tvgpam nkhf’rím£ 1.1.1 sn g h g t tq y o t f s yv d'p v i t 661 s j. sp tygpraa g g t l l t l t g n y ln s g n s r h i s.iggk.t c 11. k s v s n s i l e c y t p a q t i s t e l 721 a v k ik ic i la n r G t s i f s y i P d p i v y e i k p t k s f i s t WVtkG p d n i v s f i f c f a s g g s t i t g 181 vqkrilnsivsv p r t iv invhea g r n t t v a c q h i c c t t p s l q g l n i q l'p i k t k a f fra 841 1 dq r i s .ay 1 ct 1 iy v h n p v fk piekpvrt'isrri g n en v l e i k g nd.ldpeavkg evkkvgnkxtc 901 e n ih lh s e a v Ic t v p r x d i lk in s o l á i s w k qa i t s t v l g k v a v q p d q n f t g l i a g v v s i . s 961 t a l ].111 g f t Iv/1 kk.rkcai k d .1 ese.: v ryd a rv h tp l i ld r I v s a r s v s p t temvanesad y i a t . f p e d q f p xri s 3 qr¡ g s c r qvqyp.it. diría p i l t s g d sd i s s p l i q n t v h i d l s a l n p e l 1081 vqavodwvi . g p s s 1 i v h f n e v h g n l i dndg k k ih c a v k s l n r i t d i g e v s
] 41 q f . l t e g l Itik. d i o h p n v l s l i g r a I r s e g a P lavlpyrnkti g d l r t f t r a e alai p t v k d l t 201 g f g :.qva kc'iri k y .1 a s k k fv i . t á r t a r a can.1. dek fLukvad f g lardrnydk e y y svhnktg 261 a k ip vkwmal e s i q t q k f t t k s d v w s íg v i Iwelrntrgap p y p d v n a £ d i t v y l l q g r r l 321 l e p e y cpdp 1 yevnt l.kc whp kaenvrps f s e Ivsr iñS ' j . fS t f .1 g e h y v h v a a t yvnvkcv 381 apyp .3l l s s e drtaddevdtx p a s fw e t s
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>SEQ ID NO: 179
PRT
Artificial
Un Bucle FG del dominio FN3 de unión a EGFR HNVYKDTNXgRGL;
en el que Xg es M o I
>SEQ ID NO: 180
PRT
Artificial
Un bucle FG del dominio FN3 de unión a EGFR
LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180),
>SEQ ID NO: 181
PRT
Artificial
Un bucle BC del dominio FN3 de unión a EGFR
X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); en el que
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o d está ausente;
es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; and
es Y, F o L.
ID NO: 182
PRT
Artificial
Dominio FN3 de unión a EGFR LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
es Y, F o L; and
X9 es M o I
ID NO: 183
PRT
Artificial
Dominio FN3 de unión a EGFR LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8 DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 183), en el que
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; and
X8 es Y, F o L.
ID NO: 184
PRT
Artificial
Una secuencia de cadena C y del bucle CD del dominio FN3 de unión a C-met DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en el que
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
>SEQ ID NO: 185
PRT
Artificial
Cadena F y un bucle FG del dominio FN3 de unión a C-met
TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en el que
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o 1;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; and
X23 es V, T, H, I, P, Y o L.
>SEQ ID NO: 186
PRT
Artificial
un dominio FN3 de unión a c-Met
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT (SEQ ID NO: 186),
en el que
X10 es W, F o V; and
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K;
X16 es E o D;
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o 1;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; and
X23 es V, T, H, I, P, Y o L.
>SEQ ID NO: 187
PRT
Artificial
Dominio FN3 de EGFR de una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-Met LPAPKNLVVSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT (SEQ ID NO: 187), en el que
X24 es E, N o R;
X25 es E o P;
X26 es L o A;
X27 es H o W;
X28 es E o D;
X29 es E o P;
X30 es N o V;
X31 es G o Y;
X32 es M o I; and
X33 es E o I;
>SEQ ID NO: 188
Dominio FN3 de c-Met de una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de EGFR/c-MetLPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42 LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT (SEQ ID NO: 188); en el que
X34 es E, N o R;
X35 es E o P;
X36 es L o A;
X37 es E o P;
2 2
3 2 íZ 'v2
£¿ 22 «r H 5' Z Ü G' u W ,rrr~i 2 > c¿j 2 O Q
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LRAPKNLVV8RVTEDSARL8WTAPDAAFD8FWIRYFEFLG8GEAIVLTVPG SERSYDLTGLKPGTEYWNILSVKGGSISFPLSAIFTT
>SEQ ID NO: 194
83v2 D22A
Lpapknlvvsevtedsarlswadpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdtnmrgjplsaiftí
>SEQ ID NO: 195
>83v2 D23A
LpapkolwsevtedsarlswdapwafyesfliqyqesekvgeaiYltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdínmrglplsaifit
>SEQ ID NO: 196
>83v2 P24A
Lpapknlwsevtedsarlswddawafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvim vykdínmrglplsaiftí
>SEQ ID NO: 197
>83v2 W25A
Lpapknlwsevtedsarlswddpaafyesfliqyqesekvgeaivítvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdíxmirglpis aifit
>SEQ ID NO: 198
>83v2 F27A
Lpapkxilwscvtcdsarlswddpwaaycsfliqyqcsckvgcaivltvpgscrsydltglkpgtcytvsiygvhn vykdtnmrglplsaiftt
>SEQ ID NO: 199
>83v2 Y28A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwafeesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdtnmrglpl saiftt
>SEQ ID NO:200
>83v2 H75A
Lpapknlwsevíedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgfeytvsiygvan vykdtnmrglplsaiftí
>SEQ ID NO: 201
>83v2 N76A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwaíyesfliqyqesekvgeaivítvpgsersydltglkpgteytvsiygvha vykdtnmrglplsaiftí
>SEQ ID NO: 202
>83v2 V77a
Lpapkiilwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvbn aykdtnmrglpl saifít
>SEQ ID NO: 203
>83v2 Y78A
LpapknlvvsevtedsarLswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vakdtnmrglplsaiñt
>SEQ ID NO: 204
>83v2 K79A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vyadínmrglplsaíftí
>SEQ ID NO: 205
>83v2 D80A
Lpapkrdvvsevtedsailswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersyditgikpgteytvsiygvhn vykatnmrgJplsai ftl
>SEQ ID NO: 206
>83v2 M83A
LpapknlwsevtedsarJswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdtnarglpl saiñt
>SEQ ID NO: 207
>83v2 R84A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltgikpgíeyívsiygvhn vykdtnmaglp k ai ftl
>SEQ ID NO: 208
>83v2 G85A
Lpapknlvvsevíedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivítvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdtnmralplsaiftt
>SEQ ID NO: 209
>83v2 L86A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivltvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdiimirgaplsaiñt
>SEQ ID NO: 210
>83v2 T81A
Lpapknlwsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivítvpgsersydltglkpgteytvsiygvhn vykdanmrglplsaiftt
>SEQ ID NO: 211
>83v2 N82A
Lpapknlvvsevtedsarlswddpwafyesfliqyqesekvgeaivítvpgsersydltglkpgteytvsiygvhr! vykdtamrglpísaiftt
SEQ ID NO: 212
>K78S
lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgeaivltvpgsersydltglkpgteyvvnimgvkgg Sispplsaiñt
SEQ ID NO: 213
>G40S
Ipapknh^smedsailswíapdaafdsfwiryíefiSsgeaivltvpgsersydlígikpgteyvynimgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 214
>L39S
lpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeíSgsgeaivltvpgsersydltglkpgteyvvnimgykg gkispplsaiftí
SEQ ID NO: 215
>V68S
lpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgeaivltvpgsersydltglkpgteySvnimgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 216
>N70S
lpapknlwsMedsarlswtapdaafdsfwiryíeílgsgearvltvpgsersydltglkpgteyvvSimgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 217
>P81S
lpapkiilvvsrvtedsarlswtapdaafdsfwiryfeflgsgeaivltvpgsersydltglkpgteyvvmmgvkgg kisSpísaiñt
SEQ ID NO: 218
>F36S
IpapknlvvsrvtedsarlswtapdaafdsfwirySeflgsgeaivlívpgsersyditgikpgíeyvviiimgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 219
>W32S
lpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfSiryfeflgsgeaivltvpgsersydltglJkpgteywnimgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 220
>M72S
lpapknlv'vsrvtedsarlswfapdaafdsfwiryfeflgsgeaivltvpgsersydltglkpgteywniSgvkgg kispplsaiftt
SEQ ID NO: 221
>R34S
JpapknlwsrvtedsarlswtapdaafdsfwiSyfeflgsgeaivltvpgsersydltglkpgteywnimgvkgg kispplsaiftt

Claims (13)

Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Trp 20 25 30lie Arg Tyr Phe Glu Phe Leu Gly Ser Gly Glu Ala lie Val Leu Thr 35 40 45Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60Thr Glu Tyr Val Val Asn lie Met Gly Val Lys Gly Gly Lys Ser Ser 65 70 75 80Pro Pro Leu Ser Ala lie Phe Thr Thr85<210> 224<211> 10<212> PRT<213> Secuencia artificial<220><223> Enlazador<400> 224Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 REIVINDICACIONES
1. Una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 aislado que comprende un primer dominio de fibronectina de tipo III (FN3) y un segundo dominio FN3, en la que el primer dominio FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, y el segundo dominio fN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y en la que el primer dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
2. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en la que:
a) el primer dominio FN3 inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células A431 utilizando 50 ng/ml de EGF humano, y el segundo dominio FN3 inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 1,5 x 10-6 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano;
b) el primer dominio FN3 inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 de entre aproximadamente 1,8 x 10-8 M y aproximadamente 2,5 x 10-6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano, y el segundo dominio FN3 inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF- en el residuo dec-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 entre aproximadamente 4 x 10-9 M y aproximadamente 1,5 x 10-6 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano; c) el primer dominio FN3 se une al EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M, y el segundo dominio FN3 se une al c-Met humano con una Kd de menos de aproximadamente 5 x 10-8 M , en el que la Kd se mide utilizando resonancia de plasmón superficial; o d) el primer dominio FN3 se une al EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de entre aproximadamente 2 x 10'1° M y aproximadamente 1 x 10-8 M, y el segundo dominio FN3 se une a c-Met humano con una Kd de entre aproximadamente 3 x 10'10 M y aproximadamente 5 x 10-8 M, en el que la Kd se mide utilizando resonancia de plasmón superficial; y/o
e) la molécula biespecífica inhibe la proliferación de células NCI-H292 con un valor de CI50 que es al menos 30 veces menor cuando se compara con el valor de CI50 de inhibición del crecimiento de células NCI-H292 con una mezcla del primer dominio f N3 y el segundo dominio FN3 , en el que la proliferación celular se induce con FBS al 10 % que contiene 7,5 ng/ml de HGF; y/o
f) la molécula biespecífica:
i) inhibe la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 8 x 10-7 M cuando se mide en células NCI-H292 utilizando 50 ng/ml de EGF humano;
ii) inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 8,4 x 10-7 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano;
iii) inhibe la proliferación de células NCI-H292 inducida por HGF con un valor de CI50 inferior a aproximadamente 9,5 x 10-6 M, en el que la proliferación celular se induce con FBS al 10 % que contiene 7,5 ng de HGF;
iv) se une a EGFR con una Kd inferior a aproximadamente 2,0 x 10-8 M; o
v) se une a c-Met con una Kd inferior a aproximadamente 2,0 x 10-8 M, en el que la Kd se mide utilizando resonancia de plasmón superficial como se describe en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 5.
3. La molécula biespecífica de la reivindicación 1 o 2, en la que:
a) el primer dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 107 o 108, y el segundo dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114;
b) el primer dominio FN3 se une a EGFR con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27), opcionalmente en el que el segundo dominio FN3 se une a c-Met con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos R34, F38, M72 y 179 en P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41):
c) el primer dominio FN3 comprende
i) un bucle FG que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179 o la secuencia de aminoácidos de s Eq ID nO 180; y
ii) un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 181; y
el segundo dominio FN3 comprende
i) una cadena C y un bucle CD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184; y ii) una cadena F y un bucle FG que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 185;
d) el primer dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 183; y el segundo dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 186;
e) el primer dominio FN3 y/o el segundo dominio FN3 comprenden sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1), opcionalmente, en el que el primer dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 187; y el segundo dominio FN3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 188;
f) el primer dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en una de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137 o 194-211, y el segundo dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en una de las SEQ ID NO: 32-49, 111­ 114 o 212-223, en el que opcionalmente el primer dominio FN3 y el segundo dominio FN3 comprenden la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 y 32, respectivamente; 27 y 41, respectivamente; 27 y 40, respectivamente; 27 y 33, respectivamente; 107 y 41, respectivamente; 107 y 40, respectivamente; 107 y 33, respectivamente; 107 y 32, respectivamente; 107 y 114, respectivamente; 108 y 111, respectivamente; 108 y 112, respectivamente; 108 y 113, respectivamente; 108 y 114, respectivamente; 109 y 111, respectivamente; 109 y 112, respectivamente; 109 y 113, respectivamente; 109 y 114, respectivamente; 110 y 111, respectivamente; 110 y 112, respectivamente; 110 y 113, respectivamente; o 110 y 114, respectivamente,
por ejemplo, en el que el primer dominio FN3 y/o el segundo dominio FN3 comprenden una o más sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46v y E86I en Tencon (SEQ ID NO: 1); y/o
g) el primer dominio FN3 y/o el segundo dominio FN3 se aíslan de una biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1.
4. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1-3:
a) en la que el primer dominio FN3 y el segundo dominio FN3 están acoplados por un enlazador, opcionalmente en la que el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en una de las SEQ ID NO: 78-84 o 224;
b) que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121, 138-165 o 190-193, y que comprende opcionalmente una metionina (Met) unida al extremo N de la molécula, que además comprende opcionalmente una cisteína unida al extremo C de la molécula ; y/o
c) acoplado a un resto de extensión de la semivida, en el que opcionalmente el resto de extensión de la semivida es una molécula de unión a albúmina, un polietilenglicol (PEG), una albúmina, una variante de albúmina, o al menos una parte de una región Fc de una inmunoglobulina y, opcionalmente, en la que el resto de extensión de la semivida es la variante de albúmina de la SEQ ID NO: 189.
5. Un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, en el que el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia de aminoácidos de Tencon SEQ ID NO: 1, en el que:
a) el dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 87 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27; y opcionalmente
b) el dominio FN3 se une a EGFR con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos D23, F27, Y28, V77 y G85 de P54AR4-83v2 (SEQ ID NO: 27):
c) el dominio FN3 comprende
i) un bucle FG que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 179 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 180; y
ii) un bucle BC que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 181, y comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 182 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 183;
d) el dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en una de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122-137 o 194-211; y/o
e) el dominio FN3 comprende sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID nO: 1), opcionalmente, en el que el dominio FN3 comprende una o más sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E86I en la secuencia de aminoácidos Tencon de la SEQ ID NO: 1.
6. Un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, en el que:
a) el dominio FN3 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 83 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; y opcionalmente
b) el dominio FN3 se une a c-Met con uno o más residuos de aminoácidos correspondientes a los residuos R34, F38, M72 y 179 en P114AR7P95-A3 (SEQ ID NO: 41):
c) el dominio FN3 comprende:
i) una cadena C y un bucle CD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 184; y ii) una cadena F y un bucle FG que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 185, y comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 186;
d) el dominio FN3 comprende la secuencia mostrada en una de las SEQ ID NO: 32-49, 111-114 o 212-223; opcionalmente, en el que el dominio FN3 comprende sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 de la secuencia de aminoácidos Tencon de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente en el que el dominio FN3 comprende una o más sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E86I de la secuencia de aminoácidos de Tencon de la SEQ ID NO: 1; y/o e) el dominio FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia de aminoácidos de Tencon de la SEQ ID NO: 1.
7. Un polinucleótido aislado que codifica:
a) la molécula biespecífica de la reivindicación 1;
b) el dominio FN3 de la reivindicación 5; o
c) el dominio FN3 de la reivindicación 6.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7.
9. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 9.
10. Un método para producir:
a) una molécula biespecífica, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la reivindicación 9, como dependiente de la reivindicación 7a), en condiciones tales que se expresa la molécula biespecífica, y purificar la molécula biespecífica;
b) un dominio FN3 que se une específicamente a EGFR, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la reivindicación 9, como dependiente de la reivindicación 7b), en condiciones tales que el dominio FN3 que se une específicamente a EGFR se expresa, y purifica el dominio FN3; o
c) un dominio FN3 que se une específicamente a c-Met, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la reivindicación 9, como dependiente de la reivindicación 7c), en condiciones tales que se expresa el dominio FN3 que se une específicamente a EGFR, y purifica el dominio FN3 que se une específicamente a c-Met.
11. Una composición farmacéutica que comprende:
a)
i) la molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4; o
ii) el dominio FN3 de la reivindicación 5 o 6; y
c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. Una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la reivindicación 5, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) de la reivindicación 6, o una composición de la reivindicación 11 para su uso en terapia.
13. Una molécula biespecífica que contiene el dominio FN3 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de acuerdo con la reivindicación 5, un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) de acuerdo con la reivindicación 6, o una composición de la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que, opcionalmente:
a) el cáncer es un cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón microcítico, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de faringe, cáncer de nariz, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de boca, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer de cuello uterino, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer gástrico, cáncer del timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (CHC) o carcinoma de células renales papilar esporádico o hereditario (CCP); y/o
b) el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con erlotinib, gefitinib, afatinib, CO-1686, AZD9192 o cetuximab.
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