JP2016208917A - フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するキメラタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【課題】酵素活性および熱安定性の両方が従来より向上した、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供すること。
【解決手段】フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２でコードされるポリペプチドに相当する第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、好熱性糸状菌由来のエクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする。
【選択図】図９
【解決手段】フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２でコードされるポリペプチドに相当する第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、好熱性糸状菌由来のエクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする。
【選択図】図９
Description
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するキメラタンパク質、該キメラタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記キメラタンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。
グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）は、血糖センサ用の酵素として古くから利用されており、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有している。しかし、グルコースオキシダーゼを用いた測定では、血液中の溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
一方、溶存酸素の影響を受けない酵素として、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用の酵素として知られている。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは、安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であるといった欠点があり、また、ＰＱＱＧＤＨは、基質特異性に乏しく、グルコース以外の糖類にも作用するという欠点がある。
このため、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、基質特異性にも優れた酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓの野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨは、ある程度の熱安定性を有している。しかし、グルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合や、保管時の環境温度が高温になる場合が考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は高い熱安定性を有していることが望ましい。
このため、特許文献１では、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で変異型ＦＡＤＧＤＨを発現させることにより、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性を有する変異型ＦＡＤＧＤＨが得られることが開示されている。また、特許文献２では、さらに熱安定性に優れたＦＡＤＧＤＨとして、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓなどの好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを用いることが開示されている。
特許文献１に開示される変異型ＦＡＤＧＤＨは、酵素活性に優れているものの、熱安定性は、特許文献２に開示される好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ程高いとは言えない。一方、特許文献２に開示される好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨは、極めて熱安定性が高いものの、酵素活性は、特許文献１に開示されるＦＡＤＧＤＨ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ等の好熱性糸状菌以外の特定のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌に由来するＦＡＤＧＤＨ程高いとは言えない。
本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、酵素活性および熱安定性の両方が従来より向上した、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。
〔１〕
フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の前記特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、
前記特定のアミノ酸配列は、前記好熱性糸状菌由来タンパク質のうち、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２でコードされるポリペプチドに相当する第１のポリペプチドを含み、
前記第１のポリペプチドが、前記好熱性糸状菌由来の前記エクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする、キメラタンパク質。
〔２〕
前記特定のアミノ酸配列は、前記好熱性糸状菌由来タンパク質のうち、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン３でコードされるポリペプチドに相当する第２のポリペプチドを含まない、〔１〕に記載のキメラタンパク質。
〔３〕
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔１〕または〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔４〕
前記好熱性糸状菌由来タンパク質は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質、または、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔５〕
前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または、配列番号４に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔４〕に記載のキメラタンパク質。
〔６〕
糖鎖が付加された、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔７〕
〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子。
〔８〕
（Ａ） 配列番号５に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４４〜９３９番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、または、
配列番号６に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４７〜９４２番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
〔９〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔１０〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。
〔１１〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１２〕
〔１０〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１３〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
〔１４〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたグルコースセンサ。
〔１５〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
〔１６〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の前記特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、
前記特定のアミノ酸配列は、前記好熱性糸状菌由来タンパク質のうち、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２でコードされるポリペプチドに相当する第１のポリペプチドを含み、
前記第１のポリペプチドが、前記好熱性糸状菌由来の前記エクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする、キメラタンパク質。
〔２〕
前記特定のアミノ酸配列は、前記好熱性糸状菌由来タンパク質のうち、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン３でコードされるポリペプチドに相当する第２のポリペプチドを含まない、〔１〕に記載のキメラタンパク質。
〔３〕
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔１〕または〔２〕に記載のキメラタンパク質。
〔４〕
前記好熱性糸状菌由来タンパク質は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質、または、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔５〕
前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または、配列番号４に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、〔４〕に記載のキメラタンパク質。
〔６〕
糖鎖が付加された、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質。
〔７〕
〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子。
〔８〕
（Ａ） 配列番号５に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４４〜９３９番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、または、
配列番号６に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４７〜９４２番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
〔９〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
〔１０〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を含む形質転換体。
〔１１〕
〔７〕または〔８〕に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１２〕
〔１０〕に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
〔１３〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
〔１４〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたグルコースセンサ。
〔１５〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
〔１６〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のキメラタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
本発明によれば、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、酵素活性および熱安定性の両方が従来より向上した、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質を提供することができる。さらに、ＦＡＤＧＤＨ酵素活性を有するタンパク質の基質親和性を高める（Ｋｍ値を低下させる）ことができる。
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもない。実施形態２以降では実施形態１と共通の事柄についての記述を省略し、異なる点についてのみ説明する。特に、同様の構成による同様の作用効果については実施形態毎には逐次言及しない。
（実施形態１）
本実施形態の発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、
特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２（５’末端側から２番目のエクソン）でコードされるポリペプチドに相当するポリペプチド（第１のポリペプチド）を含み、
第１のポリペプチドが、好熱性糸状菌由来のエクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする、キメラタンパク質である。
本実施形態の発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、
特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２（５’末端側から２番目のエクソン）でコードされるポリペプチドに相当するポリペプチド（第１のポリペプチド）を含み、
第１のポリペプチドが、好熱性糸状菌由来のエクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする、キメラタンパク質である。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなることが好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨは、本発明者らによってＦＡＤＧＤＨ活性を有し、高い酵素活性を有することが確認されている。なお、配列番号１は、「野生型のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。
シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えた後、その少なくとも一部が切除される（成熟タンパク質）。
また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなることが好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨは、特許文献１等においてＦＡＤＧＤＨ活性を有し、高い酵素活性を有することが本発明者らの本試験例によって確認されている。なお、配列番号２は、「野生型のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。
好熱性糸状菌は、ＦＡＤＧＤＨ活性を有し、かつ熱安定性に優れたタンパク質を産生するものであれば特に限定されないが、至適生育温度が３５°Ｃ以上であるか、あるいは、生育限界温度が５０°Ｃ以上である糸状菌であることが好ましい。
具体的な好熱性糸状菌としては、例えば、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ：ＮＢＲＣ３１２３２）、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｓｅｕｓ：ＮＢＲＣ９１２９，９８１６）、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＮＢＲＣ６７６６，９７４８）などが挙げられる。
なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、および、上記の好熱性糸状菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入することができる。
なお、上記の好熱性糸状菌の具体例は、本発明者らによってＦＡＤＧＤＨを産生することやアミノ酸配列等が確認された好熱性糸状菌であり、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｓｅｕｓ以外の好熱性糸状菌について、そのような知見は本願の出願時において公知のものではない。
本発明者らの検討結果から、好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列のうち、該ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のエクソン２でコードされる配列（第１のポリペプチド）が熱安定性を向上させる機能を有していると考えられる。したがって、酵素活性が高いＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の一部のポリペプチドを、好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン２でコードされるポリペプチドに置換することで、高い活性と高い熱安定性との両方を兼ね備えたキメラタンパク質（キメラＦＡＤＧＤＨ）を得ることができる。
また、本発明者らの検討結果から、本実施形態のキメラタンパク質（キメラＦＡＤＧＤＨ）は、予想外にも基質親和性が高い（Ｋｍ値が低い）ものである傾向を有することがわかっており、この点においても有利である。
上記特定のアミノ酸配列は、好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨをコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン３でコードされるポリペプチドに相当するポリペプチド（第２のポリペプチド）を含まないことが好ましい。第２のポリペプチドは、例えば、後述の図８に示すＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓのアミノ酸配列のＥ３で示される部分、または、図１３に示すＡ．ｏｒｙｚａｅのアミノ酸配列のＥ３で示される部分である。言い換えれば、この第２のポリペプチドの部分は、好熱性糸状菌由来のポリペプチドで置換されないことが好ましい。
この第２のポリペプチドは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質において、酵素活性を高める役割を担っていると考えられ、この第２のポリペプチドは、好熱性糸状菌由来のポリペプチドで置換しない方が酵素活性を高く維持できるからである。したがって、この場合、より確実に、極めて高い活性と熱安定性との両方を兼ね備えたキメラＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
なお、本発明者らの検討結果から、本実施形態のキメラタンパク質は、基質親和性が高い（Ｋｍ値が低い）ものである傾向を有することが分かっており、この点においても有利である。
本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。Ｋｍ値、ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。
（実施形態２）
本実施形態の発明は、上記実施形態１のキメラタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、例えば、（Ａ）配列番号５に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４４〜９３９番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、または、
配列番号６に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４７〜９４２番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、
（Ｂ）上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ）上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
本実施形態の発明は、上記実施形態１のキメラタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、例えば、（Ａ）配列番号５に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４４〜９３９番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、または、
配列番号６に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４７〜９４２番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、
（Ｂ）上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ）上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
配列番号５は、「野生型のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、イントロンを削除したエクソンのみからなる１７７９塩基の配列であり、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでおり、終止コドンを含む。
配列番号６は、「野生型のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、イントロンを削除したエクソンのみからなる１７８２塩基の配列であり、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでおり、終止コドンを含む。
配列番号７は、「野生型のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、イントロンを削除したエクソンのみからなる１７８２塩基の配列であり、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでおり、終止コドンを含む。
配列番号８は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、イントロンを削除したエクソンのみからなる１７５５塩基の配列であり、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含んでおり、終止コドンを含む。
「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエクソンとし、そのエクソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。
本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１のタンパク質（アミノ酸配列）をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。
（実施形態３）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態２の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして、宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態２の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして、宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えば、ＴａＫａＲａ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１；タカラバイオ）を用いても良い。
（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが使用できる。
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、酵母、糸状菌、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅが使用できる。
本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態３の組換えベクターで形質転換された酵母が挙げられる。
（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
本実施形態の発明は、実施形態２の遺伝子を用いたＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態４の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
所望のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態２の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された組換えベクターとして宿主に導入される。宿主については、上記実施形態４で説明した宿主と同様である。
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培地温度は、微生物が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、宿主が酵母の場合、好ましくは２０℃以上３５℃以下であり、宿主が大腸菌の場合、好ましくは２０℃以上４２℃以下である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常、培養時間は６時間以上７２時間以下である。培地ｐＨは、菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、好ましくはｐＨ５．０以上９．０以下である。
ＦＡＤＧＤＨを生産する微生物を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合、濾過、遠心分離などにより、タンパク質を含有する溶液と微生物とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが微生物の体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により微生物を採取し、次いで、この微生物を機械的方法、または、リゾチームなどを用いた酵素的方法で破壊する。また必要に応じて、微生物を含む液中にＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤などを添加して、ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、溶液としてＦＡＤＧＤＨを分離採取する。
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。
なお、ＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態２の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によってＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。
（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
グルコース濃度測定試薬は、実施形態５の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。
グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。
固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。
（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。
本実施形態の発明は、実施形態１のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（参考例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入したＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ３０５３６）を対象として、特許文献２の実施例１と同様の方法で、ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入したＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ３０５３６）を対象として、特許文献２の実施例１と同様の方法で、ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。
購入した糸状菌は、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の糸状菌からＷｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
なお、糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。このため、本発明者らは、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。
常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。
本参考例では、縮重ＰＣＲ用のプライマーとして、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーである以下のプライマーを用いて、糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。
縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’：配列番号９）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’：配列番号１０）、または、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’：配列番号１１）
を用いた。
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’：配列番号９）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’：配列番号１０）、または、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’：配列番号１１）
を用いた。
アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’：配列番号１２）、または、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’：配列番号１３）
を用いた。
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’：配列番号１２）、または、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’：配列番号１３）
を用いた。
なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。
上記の糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーのいずれかと上記２種のアンチセンスプライマーのいずれかとの組合せを用いた６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。
その結果、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ３０５３６）のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、約１．３〜２．０ｋｂの範囲でＤＮＡバンドが検出された（図１）。なお、図１において、レーンＭはマーカーであり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。
縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓのゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。
（比較例１：野生型）
本比較例では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ）由来の野生型ＦＡＤＧＤＨをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
本比較例では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ）由来の野生型ＦＡＤＧＤＨをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母を用いて製造した。以下、詳細について説明する。
（１）Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ（ＮＢＲＣ３０５３６）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行った。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
クローニングに先立ち、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行った。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋； ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダイゼーションを行った。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ； Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
その結果、ＸｈｏＩのレーンから約４．５ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約４．５ｋｂのＸｈｏＩ断片が、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−隣接領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ａｒｅａ）と、終始コドン近傍領域を含む３’−隣接領域のクローニングを試みた。ＸｈｏＩで切断したＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲル電気泳動に供し、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（タカラバイオ）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲの鋳型とした。
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー３０５３６ＧＳＰ３（５’−ＧＴＴＧＴＴＣＧＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’）、および、プライマー３０５３６ＧＳＰ５（５’−ＣＣＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行った結果、約３．５ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行ったところ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−隣接領域と３’−隣接領域の増幅に成功したことが分かった。
次に、５’−隣接領域および３’−隣接領域の配列に基づいて設計したプライマー３０５３６ＧＳＰ９（５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＣＧＴＴＴ−３’）と３０５３６ＧＳＰ１０（５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＧ−３’）を用いてＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った。その結果、単一の約２．５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることが分かった。
（２）Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図２に示す。
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、３つのエクソン（エクソン１；３４３ｂｐ、エクソン２；１２１８ｂｐ、エクソン３；２１５ｂｐ）から構成される１７７６ｂｐのＯＲＦ（５９２アミノ酸をコードする。終止コドンを含めると１７７９ｂｐ）を含んでいた（図２の下線部および図３参照）。
図４に、このようにして特定されたＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７７９ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。
図４に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１６番目のアラニン（Ａｌａ１６）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図４に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。
（３）Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより合成した。
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより合成した。
まず、各エクソンをＰＣＲ増幅した。エクソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３０５３６ＧＳＰ１１（５’−ＧＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴ−３’）と３０５３６Ｅ１Ａ（５’−ＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣ−３’）を用いた。エクソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３０５３６Ｅ２Ｓ（５’−ＡＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＣＣＧＡＡ−３’）と３０５３６Ｅ２Ａ（５’−ＡＧＡＧＣＧＡＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＴＴＣ−３’）を用いた。エクソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３０５３６Ｅ３Ｓ（５’−ＡＡＧＡＡＣＴＡＴＣＧＣＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣ−３’）と３０５３６ＧＳＰ１２（５’−ＴＧＴＣＴＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＴ−３’）を用いた。
増幅したエクソン１とエクソン２とをＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結した。さらに、連結したＤＮＡ断片とエクソン３とをＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲにより連結し、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。
次に、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー３０５３６Ｐｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＣＣＡＣＧ−３’）および３０５３６Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、シグナル配列を含まない成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅した成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。このようにして、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。
（４）Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。
Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。
培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行った。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ＭＷＣＯ１０（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。
（比較例２：野生型）
本比較例は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来の野生型ＦＡＤＧＤＨであり、特許文献２の実施例６と同様にして酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造したＦＡＤＧＤＨの精製標品である。
本比較例は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来の野生型ＦＡＤＧＤＨであり、特許文献２の実施例６と同様にして酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造したＦＡＤＧＤＨの精製標品である。
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図５に示す。このＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエクソン（エクソン１；３４６ｂｐ、エクソン２；５９８ｂｐ、エクソン３；６１４ｂｐ、エクソン４；２２１ｂｐ）から構成される１７７９ｂｐのＯＲＦ（５９３アミノ酸をコード）を含んでいた(図５の下線部および図６参照）。
図７に、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７８２ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。これらは、そのクローニング方法や解析方法とともに特許文献２に詳細に開示されている。
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製は、比較例１と同様の方法で行い、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを含むＦＡＤＧＤＨ精製標品を得た。
［試験例１］
本試験例では、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの一部のポリペプチドをＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン単位相当のポリペプチドで置換してなるキメラタンパク質を作製した。
本試験例では、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの一部のポリペプチドをＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン単位相当のポリペプチドで置換してなるキメラタンパク質を作製した。
本試験例では、図２に示されるＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の塩基配列が、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のエクソン１〜４の少なくともいずれかで置換された、図９の表に示される構造を有する、１４種類のキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。なお、本試験例では、図９の表に示される１４種類の構造を有するキメラタンパク質をそれぞれＣ１ｔｅ〜Ｃ１４ｔｅと表記している。なお、ＣはＣｈｉｍｅｒａの頭文字を、末尾の２文字は、ｔｅｒｒｅｕｓとｅｍｅｒｓｏｎｉｉの頭文字を表す。
まず、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のプロトコールに従って、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の各エクソン（Ｅ１〜Ｅ４）、および、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の各エクソンの塩基配列に該当するＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の各塩基配列（Ｅ１〜Ｅ４と定義する）を増幅するプライマーを作製し、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡）によるＰＣＲ増幅を行なった。
次に、図９に示される１４種類のキメラタンパク質の構造に該当するＰＣＲ増幅された各エクソン断片と、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９ベクターをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより連結させることで、キメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。作製した遺伝子はＤＮＡシークエンス解析により配列を確認した。
ＰＣＲ増幅に使用した１４種類のプライマーを以下に示す：
（１） ＣＰｉｃＧ１（５’−AAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC−３’）
（２） ＣＰｉｃＧ２（５’−CATGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGC−３’）
（３） Ｃ１ｔｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCGTTGATAGTGCTGGTTCCGC−３’）
（４） Ｃ１ｔｅＥ２Ｓ（５’−CTATCAACGGAATGGCCTATACGCGCGCCC−３’）
（５） Ｃ１ｔｅＥ３Ａ（５’−TAGAGCGATATGTCTCCTTCAGCCACGCCT−３’）
（６） Ｃ１ｔｅＥ４Ｓ（５’−AGGAGACATATCGCTCTAACTTCCACCCCG−３’）
（７） Ｃ４ｔｅＥ２Ａ（５’−AAGAACGCTTGGATTCCCAACCCCAGAGAG−３’）
（８） Ｃ４ｔｅＥ３Ｓ（５’−GGGAATCCAAGCGTTCTTCAAAAGTTCAAC−３’）
（９） Ｃ５ｔｅＥ２Ａ（５’−CAGAATGCTGGGGTTGCCAATCCCGGAAAG−３’）
（１０） Ｃ５ｔｅＥ３Ｓ（５’−GGCAACCCCAGCATTCTGAACAAATACAAC−３’）
（１１） Ｃ６ｔｅＥ１Ａ（５’−ACGCCATGCCATTGATCGTGCTCGTGCCTC−３’）
（１２） Ｃ６ｔｅＥ２Ｓ（５’−CGATCAATGGCATGGCGTATACGCGCGCCG−３’）
（１３） Ｃ６ｔｅＥ３Ａ（５’−TCGACCGATAGTTCTTGTCAAAGACCCATT−３’）
（１４） Ｃ６ｔｅＥ４Ｓ（５’−ACAAGAACTATCGGTCGAATTTCCATCCCG−３’）
ＣＰｉｃＧ１は、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン１の増幅に共通して使用できるセンスプライマーである。ＣＰｉｃＧ２は、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン４の増幅に共通して使用できるアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｔｅＥ１Ａは、Ｃ１ｔｅに該当するエクソン１を増幅するためのアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｔｅＥ２Ｓは、Ｃ１ｔｅに該当するエクソン２を増幅するためのセンスプライマーである。上記に示す残りのＣ４ｔｅＥ２Ａ〜Ｃ６ｔｅＥ４Ｓのプライマーも同様に、Ｃ４ｔｅ〜Ｃ６ｔｅに該当するエクソン１〜４を増幅するためのアンチセンス（またはセンス）プライマーである。
（１） ＣＰｉｃＧ１（５’−AAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC−３’）
（２） ＣＰｉｃＧ２（５’−CATGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGC−３’）
（３） Ｃ１ｔｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCGTTGATAGTGCTGGTTCCGC−３’）
（４） Ｃ１ｔｅＥ２Ｓ（５’−CTATCAACGGAATGGCCTATACGCGCGCCC−３’）
（５） Ｃ１ｔｅＥ３Ａ（５’−TAGAGCGATATGTCTCCTTCAGCCACGCCT−３’）
（６） Ｃ１ｔｅＥ４Ｓ（５’−AGGAGACATATCGCTCTAACTTCCACCCCG−３’）
（７） Ｃ４ｔｅＥ２Ａ（５’−AAGAACGCTTGGATTCCCAACCCCAGAGAG−３’）
（８） Ｃ４ｔｅＥ３Ｓ（５’−GGGAATCCAAGCGTTCTTCAAAAGTTCAAC−３’）
（９） Ｃ５ｔｅＥ２Ａ（５’−CAGAATGCTGGGGTTGCCAATCCCGGAAAG−３’）
（１０） Ｃ５ｔｅＥ３Ｓ（５’−GGCAACCCCAGCATTCTGAACAAATACAAC−３’）
（１１） Ｃ６ｔｅＥ１Ａ（５’−ACGCCATGCCATTGATCGTGCTCGTGCCTC−３’）
（１２） Ｃ６ｔｅＥ２Ｓ（５’−CGATCAATGGCATGGCGTATACGCGCGCCG−３’）
（１３） Ｃ６ｔｅＥ３Ａ（５’−TCGACCGATAGTTCTTGTCAAAGACCCATT−３’）
（１４） Ｃ６ｔｅＥ４Ｓ（５’−ACAAGAACTATCGGTCGAATTTCCATCCCG−３’）
ＣＰｉｃＧ１は、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン１の増幅に共通して使用できるセンスプライマーである。ＣＰｉｃＧ２は、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン４の増幅に共通して使用できるアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｔｅＥ１Ａは、Ｃ１ｔｅに該当するエクソン１を増幅するためのアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｔｅＥ２Ｓは、Ｃ１ｔｅに該当するエクソン２を増幅するためのセンスプライマーである。上記に示す残りのＣ４ｔｅＥ２Ａ〜Ｃ６ｔｅＥ４Ｓのプライマーも同様に、Ｃ４ｔｅ〜Ｃ６ｔｅに該当するエクソン１〜４を増幅するためのアンチセンス（またはセンス）プライマーである。
例えば、Ｃ１ｔｅ遺伝子を連結したｐＰＩＣ９プラスミドを作製する場合、表１に示す鋳型プラスミドとプライマーの組合せで各エクソンをＰＣＲ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９ベクターと連結できる。なお、鋳型プラスミドには野生型Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓまたは野生型Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を連結したｐＰＩＣ９（ｐＰＩＣ９＿３０５３６、およびｐＰＩＣ９＿３１２３２）のいずれかを使用する。
また、Ｃ１１ｔｅ遺伝子を連結したｐＰＩＣ９プラスミドを作製する場合、表２に示す鋳型プラスミドとプライマーの組合せで各エクソンをＰＣＲ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９ベクターと連結できる。
このようにして、上記に示す１４種類のプライマーを使用して、１４種類のキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。なお、作製したキメラＦＡＤＧＤＨのエクソン１には、比較例１および比較例２と同様、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓまたはＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨタンパク質のシグナル配列をコードする塩基配列は含まれていない。
作製したキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製は、比較例１と同様の方法で行った。
このようにして、図８にＥ１〜Ｅ４として示されるＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを構成する４つのポリペプチドの少なくともいずれかが、その各々に対応するＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のポリペプチド（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列のエクソン１〜４の各々でコードされるポリペプチド）で置換された、図９の表に示される構造を有する、１４種類のキメラタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）の精製標品を得た。
図８において、Ｅ１〜Ｅ４は、好熱性糸状菌（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）のエクソン１〜４の各々がコードするアミノ酸配列（ポリペプチド）に、それぞれ対応する配列を示している。なお、上述のとおり、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子は、３つのエクソンからなっており（図３）、図８のＥ１〜Ｅ４は、このエクソンの構成と一致するものではない。
（試験例１の確認試験）
次に、試験例１、比較例１および比較例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。まず、ＦＡＤＧＤＨ精製標品中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ； サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。
次に、試験例１、比較例１および比較例２で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。まず、ＦＡＤＧＤＨ精製標品中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ； サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。
得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行った。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ １０−２０％」（アトー）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ（１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０に示す。なお、各ＦＡＤＧＤＨのレーンの左側のレーンはタンパク質マーカーである。図１０に示されるように、いずれのＦＡＤＧＤＨについても、８０〜２５０ｋＤａ程度の位置にバンドが見られた。
なお、図１０において、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、各キメラＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列から推定されるＮ型糖鎖の付加部位数を示している。Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨでは９箇所、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨでは１２箇所の推定上の糖鎖付加部位数があるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は糖鎖付加部位が少ないＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの方がより高分子量であることを示しており、推定上の糖鎖付加部位数とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量との間に比例関係は見出だせない。しかし、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン３でコードされるポリペプチドのアミノ酸配列がキメラタンパク質に含まれている場合は８０〜１５０ｋＤａ付近に、同位置に相当するＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列がキメラタンパク質に含まれている場合は１５０〜２５０ｋＤａ付近に主バンドが現れる傾向が見られる。
（比較例３）
本比較例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ） Ｔ１株由来の野生型ＦＡＤＧＤＨであり、以下のようにして作製したＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを用いる点以外は、基本的に特許文献２の実施例６と同様にして酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造したＦＡＤＧＤＨの精製標品である。以下、本比較例で用いられるプラスミドの作製について説明する。
本比較例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ） Ｔ１株由来の野生型ＦＡＤＧＤＨであり、以下のようにして作製したＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを用いる点以外は、基本的に特許文献２の実施例６と同様にして酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造したＦＡＤＧＤＨの精製標品である。以下、本比較例で用いられるプラスミドの作製について説明する。
特許文献１の配列番号４１に記載のＡ．ｏｒｙｚａｅ Ｔ１株由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列を、人工合成により作製した。Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｔ１株由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含む塩基配列は公知であり（例えば、特許文献１の配列番号４１参照）、１７７９ｂｐのＯＲＦ（５９３アミノ酸）をコードし、終止コドンを含めると１７８２ｂｐを含んでいることが知られている。図１２に、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列（終止コドンを含めると１７８２ｂｐ）と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。
当該遺伝子の塩基配列を、ゲノムの塩基配列が既知であるＡ．ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０株などにおいてＢＬＡＳＴ検索したところ、ほとんどのＡ．ｏｒｙｚａｅ株は相同性が約９９％一致した遺伝子を有しており、いずれも４つのエクソンで構成され、かつ、共通した位置に３つのイントロンが含まれることが推測された。この結果より、Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｔ１株由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は４つのエクソンで構成され、エクソン１；３４６ｂｐ、エクソン２；５９８ｂｐ、エクソン３；６２０ｂｐ、エクソン４；２１５ｂｐから構成されることが推測された（図１１参照）。
次に、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマーＡＯＰｉｃ１（５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＧ−３’）およびＡ０Ｐｉｃ２（５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅した成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。このようにして、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。
［試験例２］
本試験例では、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨの一部のポリペプチドをＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン単位相当のポリペプチドで置換してなるキメラタンパク質を作製した。
本試験例では、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨの一部のポリペプチドをＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン単位相当のポリペプチドで置換してなるキメラタンパク質を作製した。
本試験例では、図１２に示されるＡ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域の塩基配列が、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のエクソン１〜４の少なくともいずれかで置換された、図９の表に示された構造（ここでは、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓではなくＡ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子）を有する、１４種類のキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。なお、本試験例では、１４種類の構造を有するキメラタンパク質をそれぞれＣ１ｏｅ〜Ｃ１４ｏｅと表記する。なお、ＣはＣｈｉｍｅｒａの頭文字を、末尾の２文字は、ｏｒｙｚａｅとｅｍｅｒｓｏｎｉｉの頭文字を表す。
試験に用いるプライマー以外は試験例１と同様の方法を用い、１４種類のキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。ＰＣＲ増幅に使用した１４種類のプライマーを以下に示す：
（１） ＣＰｉｃＧ１（５’−AAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC−３’）
（２） ＣＰｉｃＧ２（５’−CATGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGC−３’）
（３） Ｃ１ｏｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCATTGATTGTACTGGTTCCTC−３’）
（４） Ｃ１ｏｅＥ２Ｓ（５’−CAATCAATGGAATGGCCTATACGCGCGCCC−３’）
（５） Ｃ１ｏｅＥ３Ａ（５’−TGGAACGATATGTCTCCTTCAGCCACGCCT−３’）
（６） Ｃ１ｏｅＥ４Ｓ（５’−AGGAGACATATCGTTCCAACTTCCACCCCG−３’）
（７） Ｃ４ｏｅＥ２Ａ（５’−GAGGATGGTTGGATTCCCAACCCCAGAGAG−３’）
（８） Ｃ４ｏｅＥ３Ｓ（５’−GGGAATCCAACCATCCTCAAAAAGAACAAC−３’）
（９） Ｃ５ｏｅＥ２Ａ（５’−CAGAATGCTTGGGTTTCCAACTCCTGAAAG−３’）
（１０） Ｃ５ｏｅＥ３Ｓ（５’−GGAAACCCAAGCATTCTGAACAAATACAAC−３’）
（１１） Ｃ６ｏｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCATTGATCGTGCTCGTGCCTC−３’）
（１２） Ｃ６ｏｅＥ２Ｓ（５’−CGATCAATGGAATGGCCTATACCCGCGCAG−３’）
（１３） Ｃ６ｏｅＥ３Ａ（５’−TCGACCGATAGTTAGCCTTGAGCCATTCAA−３’）
（１４） Ｃ６ｏｅＥ４Ｓ（５’−AGGCTAACTATCGGTCGAATTTCCATCCCG−３’）
ＣＰｉｃＧ１は、Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン１の増幅に共通して使用できるセンスプライマーである。ＣＰｉｃＧ２は、Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン４の増幅に共通して使用できるアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｏｅＥ１Ａは、Ｃ１ｏｅに該当するエクソン１を増幅するためのアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｏｅＥ２Ｓは、Ｃ１ｏｅに該当するエクソン２を増幅するためのセンスプライマーである。上記に示す残りのＣ４ｏｅＥ２Ａ〜Ｃ６ｏｅＥ４Ｓのプライマーも同様に、Ｃ４ｏｅ〜Ｃ６ｏｅに該当するエクソン１〜４を増幅するためのアンチセンス（またはセンス）プライマーである。
（１） ＣＰｉｃＧ１（５’−AAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC−３’）
（２） ＣＰｉｃＧ２（５’−CATGTCTAAGGCGAATTAATTCGCGGCCGC−３’）
（３） Ｃ１ｏｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCATTGATTGTACTGGTTCCTC−３’）
（４） Ｃ１ｏｅＥ２Ｓ（５’−CAATCAATGGAATGGCCTATACGCGCGCCC−３’）
（５） Ｃ１ｏｅＥ３Ａ（５’−TGGAACGATATGTCTCCTTCAGCCACGCCT−３’）
（６） Ｃ１ｏｅＥ４Ｓ（５’−AGGAGACATATCGTTCCAACTTCCACCCCG−３’）
（７） Ｃ４ｏｅＥ２Ａ（５’−GAGGATGGTTGGATTCCCAACCCCAGAGAG−３’）
（８） Ｃ４ｏｅＥ３Ｓ（５’−GGGAATCCAACCATCCTCAAAAAGAACAAC−３’）
（９） Ｃ５ｏｅＥ２Ａ（５’−CAGAATGCTTGGGTTTCCAACTCCTGAAAG−３’）
（１０） Ｃ５ｏｅＥ３Ｓ（５’−GGAAACCCAAGCATTCTGAACAAATACAAC−３’）
（１１） Ｃ６ｏｅＥ１Ａ（５’−AGGCCATTCCATTGATCGTGCTCGTGCCTC−３’）
（１２） Ｃ６ｏｅＥ２Ｓ（５’−CGATCAATGGAATGGCCTATACCCGCGCAG−３’）
（１３） Ｃ６ｏｅＥ３Ａ（５’−TCGACCGATAGTTAGCCTTGAGCCATTCAA−３’）
（１４） Ｃ６ｏｅＥ４Ｓ（５’−AGGCTAACTATCGGTCGAATTTCCATCCCG−３’）
ＣＰｉｃＧ１は、Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン１の増幅に共通して使用できるセンスプライマーである。ＣＰｉｃＧ２は、Ａ．ｏｒｙｚａｅおよびＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのエクソン４の増幅に共通して使用できるアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｏｅＥ１Ａは、Ｃ１ｏｅに該当するエクソン１を増幅するためのアンチセンスプライマーである。Ｃ１ｏｅＥ２Ｓは、Ｃ１ｏｅに該当するエクソン２を増幅するためのセンスプライマーである。上記に示す残りのＣ４ｏｅＥ２Ａ〜Ｃ６ｏｅＥ４Ｓのプライマーも同様に、Ｃ４ｏｅ〜Ｃ６ｏｅに該当するエクソン１〜４を増幅するためのアンチセンス（またはセンス）プライマーである。
例えば、Ｃ３ｏｅ遺伝子を連結したｐＰＩＣ９プラスミドを作製する場合、表３に示す鋳型プラスミドとプライマーの組合せで各エクソンをＰＣＲ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断したｐＰＩＣ９ベクターと連結できる。なお、鋳型プラスミドには野生型Ａ．ｏｒｙｚａｅまたは野生型Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子を連結させたｐＰＩＣ９（ｐＰＩＣ９＿ＡＯ、およびｐＰＩＣ９＿３１２３２）のいずれかを使用する。
このようにして、上記に示す１４種類のプライマーを使用して、１４種類のキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の分泌発現型プラスミドを作製した。なお、作製したキメラＦＡＤＧＤＨのエクソン１には、比較例２および比較例３と同様、Ａ．ｏｒｙｚａｅまたはＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨタンパク質のシグナル配列をコードする塩基配列は含まれていない。
作製したキメラＦＡＤＧＤＨ遺伝子の酵母における発現と組換え酵素の精製は、比較例１と同様の方法で行った。
このようにして、試験例１と同様にして、図１３にＥ１〜Ｅ４として示されるＡ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨを構成する４つのポリペプチドの少なくともいずれかが、それぞれに相当するＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列のエクソン１〜４の各々でコードされるポリペプチドで置換された構造を有する、図１４に記載した３種類のキメラタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）の精製標品を得た。なお、本試験例では、これら３種類の構造を有するキメラタンパク質を、試験例１（図９の表）と同様に、Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅと表記する。なお、末尾の２文字は、ｏｒｙｚａｅとｅｍｅｒｓｏｎｉｉの頭文字を表す。
（試験例２の確認試験）
次に、試験例２（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ：図１４参照）、比較例３（Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来）および比較例２（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標を、上記試験例１の確認試験と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
次に、試験例２（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ：図１４参照）、比較例３（Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来）および比較例２（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標を、上記試験例１の確認試験と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１５に示す。なお、各ＦＡＤＧＤＨのレーンの左側のレーンはタンパク質マーカーである。図１５に示されるように、いずれのＦＡＤＧＤＨについても、８０〜２５０ｋＤａ程度の位置にバンドが見られた。図１５中には、Ａ．ｏｒｙａｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨ、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ、各キメラＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列から推定されるＮ型糖鎖の付加部位数を示している。Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨでは９箇所、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨでは１２箇所の推定上の糖鎖付加部位数があるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は糖鎖付加部位数が少ないＡ．ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨがより高分子量まで検出されており、推定上の糖鎖付加部位数とＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量との間に比例関係は見出だせない。
［評価試験］
試験例１、２（キメラタンパク質）および比較例１〜３（野生型）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（酵素活性、Ｋｍ値、温度安定性、基質特異性）に関する評価試験を行った。なお、本評価試験における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。
試験例１、２（キメラタンパク質）および比較例１〜３（野生型）で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（酵素活性、Ｋｍ値、温度安定性、基質特異性）に関する評価試験を行った。なお、本評価試験における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。
（酵素活性測定原理）
Ｄ−グルコース ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＦＡＤＧＤＨ
→ Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋ ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＰＩＰ
→ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。
Ｄ−グルコース ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＦＡＤＧＤＨ
→ Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋ ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型） ＋ ＤＣＰＩＰ
→ １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ＋ ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。
（酵素活性の定義）
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。
具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤTEST、ΔＯＤBLANK）から以下の式により求められる。
ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤTEST−ΔＯＤBLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）
なお、式中の各定数は、
３．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３ ： ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．１ ： ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。
（活性測定方法）
（１） キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０） １．５ｍＬ
１Ｍ グルコース溶液 ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ 2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ） ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate（1-mPMS） ０．０２１ｍＬ
１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０６ｍＬ
Ｈ２Ｏ ０．３９９ｍＬ
（２） ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３） ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を算出する。
（４） 対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を算出する。
（１） キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０） １．５ｍＬ
１Ｍ グルコース溶液 ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ 2,6-Dichlorophenolindophenol（ＤＣＰＩＰ） ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ 1-Methoxy-5-methylphenazium methylsulfate（1-mPMS） ０．０２１ｍＬ
１０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０６ｍＬ
Ｈ２Ｏ ０．３９９ｍＬ
（２） ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３） ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を算出する。
（４） 対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を算出する。
＜酵素活性、Ｋｍ＞
ここでは、酵素活性（反応速度）について検討した。具体的には、上記活性測定方法と同様にして、グルコース溶液の濃度を０〜２Ｍに変化させて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の酵素活性を測定した。
ここでは、酵素活性（反応速度）について検討した。具体的には、上記活性測定方法と同様にして、グルコース溶液の濃度を０〜２Ｍに変化させて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の酵素活性を測定した。
グルコース溶液の濃度（基質濃度）が３００ｍＭであるときの活性を図９の表（試験例１、比較例１および２）および図１４の表（試験例２（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ）、比較例３および２）に示す。なお、図９および図１４の表において、活性（Ｕ／ｍｇ）は酵素１ｍｇあたりの活性であり、活性（Ｕ／μｍｏｌ−ＦＡＤ）は酵素に結合しているＦＡＤ（ホロ化酵素）１μｍｏｌあたりの活性である。
さらに、上記測定結果に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ精製標品の各々について、イーディー−ホフステープロット（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ ｐｌｏｔ）を作成した。なお、Ｋｍはラインウィーバーバークプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅ ｐｌｏｔ）により求めることもできる。ラインウィーバーバークプロットにおいて、直線のＸ切片が−１／Ｋｍとなるため、グラフからＫｍを求めることができる。本評価試験では上記２つのプロットを行なった結果、イーディー−ホフステープロットの方が比較的精度の良いＫｍ値が得られたため、イーディー−ホフステープロットにより求めたＫｍ値を記載した。なお、Ｋｍはミカエリス定数であり、Ｖｍａｘは酵素が基質で飽和したときの最大速度である。
イーディーホフスティープロットから求めた試験例１のＣ４ｔｅ、比較例１および２のＦＡＤＧＤＨのＫｍ値およびＶｍａｘを表４に示す。また、試験例２（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ）、比較例３および２のＫｍ値およびＶｍａｘを図１４の表に示す。
＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、実施例で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。）
このＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜７０℃の範囲内の所定の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求め、変性の中点の温度の（Ｔｍ）を算出した。）結果を図９の表（試験例１、比較例１および２）および図１４の表（試験例２の一部（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ）、比較例３および２）に示す。
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、実施例で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて、終濃度５０ｍＭクエン酸バッファーを含有し、ｐＨ５．０であり、１×１０−３重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有し、酵素活性が１０Ｕ／ｍＬとなるように、酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。）
このＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて５℃〜７０℃の範囲内の所定の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求め、変性の中点の温度の（Ｔｍ）を算出した。）結果を図９の表（試験例１、比較例１および２）および図１４の表（試験例２の一部（Ｃ３ｏｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ）、比較例３および２）に示す。
図９の表に示されるＴｍの結果において、図８に示されるＥ２のポリペプチド（第１のポリペプチド）が好熱性糸状菌（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のポリペプチドに置換されたキメラタンパク質は、すべて比較例１（Ａ． ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）よりＴｍが高くなっており、他のキメラタンパク質はすべて比較例１よりもＴｍが同等かそれよりも低くなっていることがわかる。なお、図１４の表に示されるＴｍの結果も同様の傾向が示されている。このことから、好熱性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸のうち、該ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のエクソン２でコードされるポリペプチドが熱安定性を向上させる機能を有していると考えられる。
また、図９の表に示される活性の結果において、図８に示されるＥ３のポリペプチド（第２のポリペプチド）が好熱性糸状菌由来のポリペプチドに置換されたキメラタンパク質は活性が低く、Ｅ３のポリペプチドが置換されていないキメラタンパク質の方が活性が高い傾向があることが分かる。なお、図１４の表に示される活性の結果でも同様の傾向が示されている。このことから、第２のポリペプチド（Ｅ３）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質において、酵素活性を高める役割を担っていると考えられ、この第２のポリペプチドは、好熱性糸状菌由来のポリペプチドで置換しない方が酵素活性を高く維持できると考えられる。
また、表４および図１４の表に示されるＫｍの結果から、Ｃ４ｔｅ（試験例１）およびＣ４ｏｅ（試験例２）のキメラＦＡＤＧＤＨのＫｍ値は、意外にも比較例１〜３の野生型ＦＡＤＧＤＨのいずれに対しても低くなっていることが分かる。なお、酵素のＫｍ値が小さいほど、酵素の基質親和性が高いことを意味する。
＜基質特異性＞
ここでは、比較例１〜３の野生型ＦＡＤＧＤＨ、並びに、Ｃ４ｔｅ（試験例１）、Ｃ４ｏｅ（試験例２）およびＣ７ｏｅ（試験例２）のキメラＦＡＤＧＤＨについて、基質特異性（グルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうか）を確認した。
ここでは、比較例１〜３の野生型ＦＡＤＧＤＨ、並びに、Ｃ４ｔｅ（試験例１）、Ｃ４ｏｅ（試験例２）およびＣ７ｏｅ（試験例２）のキメラＦＡＤＧＤＨについて、基質特異性（グルコースおよびグルコース以外の糖類を基質とするかどうか）を確認した。
具体的には、まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように調製し、酵素活性を測定した。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、結果を表５にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、「Ｎ．Ｄ．」（Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）と表記した。
表５に示される結果から、キメラタンパク質（Ｃ４ｔｅ、Ｃ４ｏｅ、Ｃ７ｏｅ）は、比較例１〜３の野生型ＦＡＤＧＤＨと同様に、グルコースに対する基質特異性が高いものであることが分かる。
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
Claims (16)
- フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質の特定のアミノ酸配列が、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有する好熱性糸状菌由来タンパク質の前記特定のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列で置換されてなるキメラタンパク質であって、
前記特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン２でコードされるポリペプチドに相当する第１のポリペプチドを含み、
前記第１のポリペプチドが、前記好熱性糸状菌由来の前記エクソン２でコードされるポリペプチドで置換されていることを特徴とする、キメラタンパク質。 - 前記特定のアミノ酸配列は、該好熱性糸状菌由来タンパク質をコードする該好熱性糸状菌由来のＤＮＡ塩基配列のエクソン３でコードされるポリペプチドに相当する第２のポリペプチドを含まない、請求項１に記載のキメラタンパク質。
- 前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ｖａｒ． ａｕｒｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または、配列番号１に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のキメラタンパク質。 - 前記好熱性糸状菌由来タンパク質は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質、または、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
- 前記Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、配列番号３に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなり、
前記Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または、配列番号４に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドの少なくとも一部を除いたアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のキメラタンパク質。 - 糖鎖が付加された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子。
- （Ａ） 配列番号５に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４４〜９３９番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、または、
配列番号６に記載の塩基配列に対して、少なくとも３４７〜９４２番目の塩基配列を配列番号７または８に記載の塩基配列のエクソン２で置換する変異を導入してなるキメラＤＮＡ、
（Ｂ） 上記（Ａ）のＤＮＡの塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列の少なくとも一部を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、および、
（Ｃ） 上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ
のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。 - 請求項７または８に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項７または８に記載の遺伝子を含む形質転換体。
- 請求項７または８に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項１０に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を用いたグルコースセンサ。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
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| VILLBRANDT B. ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. Vol.13, No.9 (2000), JPN6019011468, pages 645 - 654, ISSN: 0004006879 * |
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