JP2016195974A - 予測ルール生成システム、予測システム、予測ルール生成方法及び予測方法 - Google Patents
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Abstract
Description
活性汚泥から約1.5mlの微生物群を含む溶液を採取し、室温で遠心する(13,000rpm×5分間)。上清を取り除いた後、滅菌生理食塩水を1ml加えて、5秒間ほど転倒混合した後、室温で遠心する(13,000rpm×5分間)。上清を除いた後、Lysis buffer(エイエムアール社製)を300μl加え、よく混合した後、得られた懸濁液をビーズの入ったチューブ(イージーエクストラクト for DNA(エイエムアール社製))に添加後、ボルテックスミキサーで2分間撹拌破砕する。破砕液に300μlのTE溶液(10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)(以下、TE)を添加し、4℃で遠心する(13,000rpm×5分間)。その後、上清液450μlを新しいチューブに入れ、これに600μlのフェノール混合液(イージーエクストラクト for DNAに付属(エイエムアール社製))を加え、1分間ボルテックスし攪拌した後、4℃で遠心する(13,000rpm×5分間)。上清300μlを回収して新しいチューブ(1.5ml)に入れ、これに1200μlのエタノール(99.5%)を加えて、4℃で遠心する(13,000rpm×5分間)。上清を除いた後、1000μlの冷エタノール(70%)を加えて、4℃で遠心し(13,000rpm×5分間)、得られたDNAペレットを真空乾燥し、ついで150μlのTEを加えて、細菌叢DNAの溶液とする。
細菌叢DNAの溶液中の二本鎖DNA濃度を測定し、その測定値に基づいて50ngのDNAを鋳型として、ユニバーサルプライマーセット(フォワードプライマーfw357F(配列番号1)とリバースプライマーRV926r(配列番号2))を用いて、16SリボソームRNA遺伝子(以下、16S遺伝子)のV3−V4領域をPCR増幅する。PCRはタカラバイオ社製の「Premix Ex Taq Hot Start Version」(登録商標)を用いて、各プライマーを50pmol含む反応液50μlを作成し、94℃で2分間のプレヒーティングを行った後、変性、アニーリング、伸長をそれぞれ98℃×10秒間、50℃×30秒間、72℃×80秒間で行い25サイクル繰り返す。
アダプターA配列(配列番号3)
5’−CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG−3’
ユニバーサルプライマー配列fw357F(配列番号1)
5’−cctacgggaggcagcag−3’
HA13619−RV926rの配列(配列番号4)
5’−CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGccgtcaattccttttragttt−3’
各々の細菌叢DNAから得られたPCR産物DNA(その細菌叢を構成する種々の細菌種の16S遺伝子のV3−V4領域を含むDNAの混合物)を混合し、DNAクリーナー(和光純薬社製)にて処理して、過剰のプライマーや基質のヌクレオチド等を除去し、精製する。精製DNAは200μlのTEで溶出し回収する。ついで、回収した精製DNA溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約570bpのDNA断片を切り出し、MinElute Gel ExtractionKit(キアゲン社製)にて抽出し、シークエンサー20に供するDNAを調製する。これを以下のシークエンスに用いるシークエンス用サンプルとする。
上記シークエンス用サンプルを、シークエンサー20であるロシュ社製GS FLX+ Systemシークエンサーに供しシークエンスを行う。シークエンスの条件・工程等はメーカー所定のプロトコールに従う。なお、このシークエンサーでは、上記で調製したPCR産物DNAの1分子を1つのビーズに固定して、ついで、水(シークエンス用鋳型DNAの増幅のためのPCRプライマー、基質ヌクレオチド、DNA合成酵素を含む)と油のエマルジョン中に独立して形成された微小水滴の1つ1つに1つ1つのビーズを捕獲して、その中でPCRを行ってシークエンス用鋳型DNAを増幅して調製するようになっている。よって、この増幅した鋳型DNAが固定された各ビーズをタイタープレート上に区画した後に、その区画位置上でシークエンス反応のシグナルを読み取ることによって、上記シークエンス用サンプル中に含まれるPCR産物DNA(その細菌叢を構成する種々の細菌種の16S遺伝子のV3−V4領域を含むDNAの混合物)の塩基配列を無作為に決定することができる。また、フォワードプライマーHA13621−fw357F中の上記バーコード配列を、各サンプルに由来する検体ごとに特徴的な任意の配列にしておけば、GS FLX+ Systemシークエンサーを用いて約100種類の細菌叢サンプルを同時解析でき、ある活性汚泥由来のサンプルにつき2,000〜10,000の16S遺伝子の配列データを、およそ10〜23時間で決定することができる。即ち、活性汚泥に含まれる細菌叢について菌種を限定せずに網羅的に解析することが可能となる。
Claims (7)
- 水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの存在割合又は当該活性汚泥中に存在する複数の塩基配列それぞれの存在割合の時系列データ、及び当該時系列データを構成する各時刻におけるデータに対応付けられた水処理後の水質を示す水質情報を入力する入力手段と、
前記入力手段によって入力された時系列データに対して主成分分析を行って、当該時系列データを構成する各時刻におけるデータの主成分スコアを算出する主成分分析手段と、
前記主成分分析手段によって算出された、時系列データを構成する各時刻におけるデータの主成分スコア、及び前記入力手段によって入力された当該時系列データを構成する各時刻におけるデータに対応付けられた水処理後の水質を示す水質情報に基づいて、複数の微生物それぞれの存在割合、又は複数の塩基配列それぞれの存在割合から水処理後の水質を予測するための予測ルールを生成する予測ルール生成手段と、
を備える予測ルール生成システム。 - 前記主成分分析手段は、相関行列を用いた主成分分析を行う請求項1に記載の予測ルール生成システム。
- 前記予測ルール生成手段は、前記主成分分析手段によって算出された、時系列データを構成する各時刻におけるデータの主成分スコアを前記予測ルールにおける入力とし、前記入力手段によって入力された当該時系列データを構成する各時刻におけるデータに対応付けられた水処理後の水質を示す水質情報を前記予測ルールにおける出力とした機械学習を行うことで前記予測ルールを生成する請求項1又は2に記載の予測ルール生成システム。
- 前記活性汚泥中に存在する複数の微生物から遺伝子の塩基配列を読み取る読取手段と、
前記読取手段によって読み取られた遺伝子の塩基配列に基づき前記時系列データを生成して入力手段に入力させるデータ生成手段と、
を更に備える請求項1〜3の何れか一項に記載の予測ルール生成システム。 - 請求項1〜4の何れか一項に記載の予測ルール生成システムによって生成された予測ルールに基づき、水処理後の水質を予測する予測システムであって、
予測対象となる複数の微生物それぞれの存在割合又は予測対象となる複数の塩基配列それぞれの存在割合のデータを入力する入力手段と、
前記予測ルール生成システムによる主成分分析に基づいて、前記入力手段によって入力された前記予測対象のデータの主成分スコアを算出する主成分分析手段と、
前記予測ルール生成システムによって生成された予測ルールに基づき、前記主成分分析手段によって算出された前記予測対象のデータの主成分スコアから水処理後の水質を予測する予測手段と、
を備える予測システム。 - 予測ルール生成システムの動作方法である予測ルール生成方法であって、
水処理を行う活性汚泥中に存在する複数の微生物それぞれの存在割合又は当該活性汚泥中に存在する複数の塩基配列それぞれの存在割合の時系列データ、及び当該時系列データを構成する各時刻におけるデータに対応付けられた水処理後の水質を示す水質情報を入力する入力ステップと、
前記入力ステップにおいて入力された時系列データに対して主成分分析を行って、当該時系列データを構成する各時刻におけるデータの主成分スコアを算出する主成分分析ステップと、
前記主成分分析ステップにおいて算出された、時系列データを構成する各時刻におけるデータの主成分スコア、及び前記入力ステップにおいて入力された当該時系列データを構成する各時刻におけるデータに対応付けられた水処理後の水質を示す水質情報に基づいて、複数の微生物それぞれの存在割合、又は複数の塩基配列それぞれの存在割合から水処理後の水質を予測するための予測ルールを生成する予測ルール生成ステップと、
を含む予測ルール生成方法。 - 請求項1〜4の何れか一項に記載の予測ルール生成システムによって生成された予測ルールに基づき、水処理後の水質を予測する、予測システムの動作方法である予測方法であって、
予測対象となる複数の微生物それぞれの存在割合又は予測対象となる複数の塩基配列それぞれの存在割合のデータを入力する入力ステップと、
前記予測ルール生成システムによる主成分分析に基づいて、前記入力ステップにおいて入力された前記予測対象のデータの主成分スコアを算出する主成分分析ステップと、
前記予測ルール生成システムによって生成された予測ルールに基づき、前記主成分分析ステップにおいて算出された前記予測対象のデータの主成分スコアから水処理後の水質を予測する予測ステップと、
を含む予測方法。
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