JP2016138090A - 高温でのペプチド合成のための改良されたカップリング法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカー、カルボン酸、カルボジイミド、活性化添加剤、及び塩基を混合する工程と;そして活性化及びカップリングを30℃を超える温度で実施する工程とを含む固相ぺプチド合成方法。
【選択図】なし
Description
[0005]カップリング:活性化された種が既存のペプチド鎖に連結される。
[0007]おそらく、ペプチド合成のために最も一般的に使用され研究されている活性化法は、カルボジイミドの使用に基づく。ペプチド合成におけるそれらの使用は、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)がアミド結合形成を促進するために使用された1955年に遡る。カルボジイミドは、2個のわずかに塩基性の窒素原子を含有し、これが図1に示すようにアミノ酸誘導体のカルボン酸と反応して、高反応性のO−アシルイソ尿素化合物を形成する。形成されたO−アシルイソ尿素は、次いで直ちにアミンと反応し、ペプチド結合を形成できる(すなわち、図1で水平に示されている経路)。それとは別に、O−アシルイソ尿素は他の反応性種に変換されることもある。
DIC活性化の潜在的不利益を回避するため、より最近ではオニウム塩に基づく活性化法の開発が行われるようになった。オニウム塩に基づく活性化は塩基の使用を必要とする。塩基は、カルボン酸をまず脱プロトン化してカルボキシレートアニオンを生成させ、これがオニウム塩活性化剤と反応する。多くのオニウム塩で、改良されたカップリングが実証されている。例えば、室温条件下でのカルボジイミドに基づく活性化と比較した場合、とりわけ、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU);2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU);(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP);(3−ヒドロキシ−3H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジナト−O)トリ−1−ピロリジニル−ホスホラスヘキサフルオロホスフェート(PyAOP);及び2−(6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)が挙げられる。
[0017]カルボジイミド型活性化での塩基の使用
[0018]少数の報告ではあるが、カルボジイミドに基づくカップリング時の塩基の存在について、室温カップリング条件下で検討されている。Beyermannら(M.Beyermann,P.Henklein,A.Klose,R.Sohr及びM.Bienert,“カルボジイミド媒介ペプチド合成に及ぼす第三アミンの影響(Effect of tertiary amine on the carbodiimide-mediated peptide synthesis),”Int.J.Peptide Protein Res.,vol.37,pp.252−256,1991)は、以前、室温条件下でのカルボジイミドに基づく活性化は、ヒンダードアミン塩基の存在によって妨げられることを示した。これは、塩基の優先的プロトン化により、カルボジイミドのプロトン化が阻害されることによって起こるのであろう。カルボジイミドのプロトン化は、カルボジイミドに基づく活性化技術においてO−アシルイソ尿素を生成させるのに必要な第一歩である。しかしながら、Beyermannらは、アミノ酸と比べて1当量の同じヒンダードアミン塩基は、それが活性化過程の完了後に添加されると、室温でのカップリング過程を増強できることも示した。要するに、1当量の塩基を加えることにより、Beyermannは、オニウム塩活性化法とカルボジイミド活性化法のその後のアシル化条件を似せることができたため、類似した結果がもたらされた。
[0025]SPPSにおける基本的な初期工程は、当然ながら、第一のアミノ酸を、選択されたポリマー樹脂に、そうするための中間化合物(“リンカー”)を用いて接続(“連結(linking)”)する工程である。この初期連結工程は特別な条件を必要とすることがある。そのような変更された条件は、典型的には、カップリングのための求核試薬として働かねばならないヒドロキシル基を特徴とする標準的酸リンカーに必要とされる。アルコールのアセチル化は難しく、典型的には、アルコールのためのアセチル化触媒として働く4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)によって促進される;[X.Shangjie,I.Held,B.Kempf,H.Mayr,W.Steglich及びH.Zipse,“アルコールのDMAP触媒アセチル化−機構研究(The DMAP-Catalyzed Acetylation of Alcohols - A Mechanistic Study),”Chemistry,vol.11,pp.4751−4757,2005。酸リンカーの例は、とりわけ、広く使用されているHMPA及びWangリンカーなどである。これらの場合、変更されたカルボジイミド型カップリング技術が使用され、添加剤(例えば、HOBt、HOAt、及びOxyma)の不在下、カップリングを促進するために添加される1当量以下のDMAPで、高反応性の対称性無水物が生成する。DMAPは活性化過程中には避けるべきである。なぜならば、活性化を劇的に緩徐化しがちだからである(Carpinoら及びその他に示されている通り)。この手順はよく知られており、文献に記載されている(E.Atherton,N.L.Benoiton,E.Brown,R.Sheppard及びB.J.Williams,“活性化されウレタン保護されたアミノ酸のp−ジメチルアミノピリジンによるラセミ化。固相ペプチド合成における意義(Racemization of Activaterd, Urethane-protected Amino-acids by p-Dimethylaminopyridine. Significance in Solid-phase Peptide Synthesis),”J.C.S.Chem.Comm.,pp.336−337,1981;S.Wang,J.Tam,B.Wang及びR.Merrifield,“4−ジメチルアミノピリジンによるペプチドカップリング反応の増強(Enhancement of peptide coupling reactions by 4-dimethylaminopyridine),”Int.J.Peptide Protein Res.,vol.18,pp.459−467,1981;M.Pennington,“困難なカップリングを改良するための手順(Procedures to Improve Difficult Couplings),”Peptide Synthesis Protocols,Vols.Methods in Molecular Biology − vol.35,ニュージャージー州トトワ,Humana Press,1995,p.10)。残念なことに、方法は、室温でも広範なエピマー化を起こすことが知られており、システイン及びヒスチジンのような感受性アミノ酸誘導体を樹脂にローディング(連結)するのに問題がある。
[0027]別の因子として、近年、SPPS中にSPPS及びアミノ酸カップリングを改良するための方法として加熱工程又はマイクロ波照射工程が広く適用されている。マイクロ波照射又はその他の公知慣用加熱法は、標準的なカルボジイミド及びオニウム塩カップリング法の両方で使用されている。しかしながら、カップリング工程中に高温を使用することは、ペプチド合成にいくつかの課題を提示する。オニウム塩に基づく活性化法の間にはシステイン誘導体のエピマー化が実質的に増大する。このエピマー化は、高温での塩基(典型的にはDIEA、NMM)の存在に起因する。さらに、活性化中にアルギニンのδ−ラクタム形成の増大が観察され、ある配列では主なアルギニン欠失をもたらす;P.White,J.Collins及びZ.Cox,“従来式合成及びマイクロ波支援合成の比較研究(Comparative study of conventional and microwave assisted synthesis),”第19回米国ペプチドシンポジウム,カリフォルニア州サンジエゴ,2005。
[0034]このように、ペプチド化学者は、カルボジイミド又はオニウム塩に基づく活性化法のいずれかを用いるペプチド合成において、カップリング工程に高温を適用する場合、多数の、そして時に競合する制限に直面する。
[0058]オニウム塩に基づく方法の制限は、活性化を完了するためにアミノ酸と比べて少なくとも1当量の塩基と活性化剤を必要とすることである。これは、図2に示されているように、カルボキシレートアニオンがオニウム塩活性化剤に対して求核攻撃を実施できるように、活性化される各アミノ酸上で生成されねばならないからである。我々は、公知の困難な28マーペプチド(チモシン)を、表1に示すような様々な量の塩基(DIEA)を用いて合成することにより、塩基の必要性を検証した。図3は、活性化にHBTUと、塩基として2当量のDIEAを使用した実験のUPLCクロマトグラムである(エントリー5)。図3は、多数の(望ましくない)フラグメント及び全体的な純度不足を示している。
ペプチド配列(チモシン)=SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のAA/HBTU/DIEA(1:0.9:変数)
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0060]これに対し、この同じペプチド(チモシン)は、何ら塩基の存在なしに、カルボジイミドに基づく活性化(DIC)及び一般的な活性化添加剤Oxymaを用いて、より高純度(63%;表2、エントリー11)で合成できた。
ペプチド配列(チモシン)=SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のAA/DIC/添加剤(1:1:1)
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0064]図4及び6は、表2の各クロマトグラムであり、図5は、図4の実験に対応する質量スペクトルである。これらは、高温でのカルボジイミドに基づくカップリングの場合、塩基なし(図4、63%)と1当量の塩基(図6、59%)の間では成果が一般的に類似していることを示している。
ペプチド配列(チモシン)=SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のAA/DIC/Oxyma(1:1:1)
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0068]図7、8及び9は、表3の結果のUPLCクロマトグラム及び質量スペクトルであり、様々な温度でのチモシン合成について本発明の改良を示している。図7は90℃で0.1当量の塩基を用いて70%の純度を示しており;図8は100℃で0.1当量の塩基を用いて73%の純度を示しており;図9は図8の実験の質量スペクトルである。
ペプチド配列=DYING−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング(Fmoc−Asp(OtBu)−OHを除くすべてのアミノ酸)=4mL溶液中5倍過剰のAA/DIC/Oxyma(1:1:1)
カップリング(Fmoc−Asp(OtBu)−OH)=アミノ酸は、表4に記載のように予備活性化され、カップリングの前に室温に冷却された。その後のカップリングは90℃で2分間実施された。
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0073]水
[0074]Toftengら[A.Tofteng,S.Pedersen,D.Staerk及びK.Jensen,“ペプチド合成において試薬及び反応中間体の半減期に及ぼす残留水及びマイクロ波加熱の影響(Effect of Residual Water and Microwave Heating on the Half-Life of the Reagents and Reactive Intermediates in Peptide Synthesis),”Chemistry,vol.18,pp.9024−9031,2012]は、最近、水中での活性化アミノ酸の安定性に及ぼす水の影響について調べた。著者らは、DMF中の様々な量の水(50〜18,000ppm)を基に、ある種のカップリング試薬と活性化エステルの安定性の間の相関に気付いた。さらに、著者らは、DIC/Oxyma/DIEA(1:1:2)対DIC/Oxyma(1:1)の効率も比較し、10マーペプチドの合成純度における有意の差を観察しなかった。
ペプチド配列=Fmoc−Aib−Aib−IDYING−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のAA/DIC/Oxyma(1:1:1)
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0081]システイン
[0082]アミノ酸は活性化エステルに変換されると、アルファ(α)−炭素のプロトンの酸度が増大することは文書で十分に立証されている。システイン誘導体は、図11に示すように、側鎖の硫黄原子の電子求引効果のために、特にエピマー化を受けやすい。オニウム塩活性化戦略を用いた高温カップリング条件下ではシステインの顕著なエピマー化が観察されている。DIEA又はNMMをよりヒンダード塩基のTMPで置き換えると、HBTUカップリング中のシステインのエピマー化レベルが低下することが示されている(Palasek)。しかしながら、TMPは、困難なカップリングにはあまり有効でないようなので、DIEAの標準的代替品としては推奨されない。カップリング温度を50℃以下に下げると、システインのエピマー化は減少したが、排除されることはなかった。しかしながら、低いカップリング温度は不完全なカップリング及び長い反応時間をもたらしうるので、低温は理想的でない。最近、Collinsら(J.Collins,K.Porter,S.Singh及びG.Vanier,“高効率固相ペプチド合成(HE−SPPS),”Org.Lett.,vol.16,pp.940−943,2014)は、何の塩基も存在しないカルボジイミドに基づく活性化法(DIC/Oxyma)を使用すると、90℃もの高さのカップリング温度でもシステインのエピマー化が最少化したことを示した。しかしながら、本発明者らは、システインのエピマー化を著しく増大することなく少量の塩基をこの同じ方法に添加できることを見出した(表6、エントリー2及び6)。これは、Palasek及びCollinsら(J.Collins,K.Porter,S.Singh及びG.Vanier,“高効率固相ペプチド合成(HE−SPPS),”Org.Lett.,vol.16,pp.940−943,2014)が以前に研究した、システインカップリングを含有し、エピマー化を受けやすい同じペプチド配列で試験された。表6にこれらの結果をまとめた。
ペプチド配列(ABC 20マー)=VYWTSPFMKLIHEQCNRADG−NH2
合成規模=0.1mmol
樹脂=Rink Amide MBHA ポリスチレン樹脂(0.38mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のAA/DIC/Oxyma(1:1:1)
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
エピマー化分析=加水分解/ジュウテリウム標識を用いた誘導体化後、GC−MS(C.A.T.GmbH)
[0084]アルギニン
[0085]カップリング反応中、アルギニンの求核性側鎖がδ−ラクタムを形成しやすいことはよく知られている[M.Cezari及びL.Juliano,“N アルファ−N オメガ保護アルギニン誘導体のカップリング手順中のラクタム形成に関する研究(Studies on lactam formation during coupling procedures of N alpha-N omega-protected arginine derivatives),”J.Pept.Res.,vol.9,pp.88−91,1996]。図12に示されているように、カルボン酸の活性化は、高塩基性δ−グアニジノ基(pKa=12.5)による攻撃を促進する。この非可逆的反応は、活性化剤の放出により活性化アルギニン誘導体を不活性種に変換する。この分子内副反応は高温で増大し、顕著なアルギニン欠失をもたらす(P.White,J.Collins及びZ.Cox,“従来式合成及びマイクロ波支援合成の比較研究”,第19回米国ペプチドシンポジウム,カリフォルニア州サンジエゴ,2005)。可能性ある代替法として、アルギニンを室温で最初に長時間(例えば約30分間)、次いで高温で短時間カップリングさせてもよい。J.Collins,“ペプチド、タンパク質、及びペプチドミメティックのマイクロ波増強合成(Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics),”Organic Synthesis 第3版中,Microwaves,ドイツ・ワインハイム,Wiley−VCH Verlag & Co.KGaA,2013,pp.897−960。しかしながら、この方法は不都合なことに遅く、カップリングを反復せねばならないため、2倍のアルギニンを必要とする。
ペプチド配列(ABRF 1992)=GVRGDKGNPGWPGAPY
合成規模=0.1mmol
樹脂=Fmoc−Tyr(tBu)−Wang樹脂(0.64mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のアミノ酸
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析(エントリー1)=ペプチドは、Waters社製Atlantis C18カラム(2.1×150mm)にて、214nmで、5〜70%MeCN(0.1%ギ酸)のグラジエントを用い、0〜20分間分析された。質量分析は、LCQ Advantage イオントラップ質量分析計を用い、エレクトロスプレーイオン化により実施された(Thermo Electron社製)。
分析(エントリー2〜4)=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0088]図13〜16は、表7に掲載された実験のデータを反映している。特に、図13は、高温で2当量の塩基を使用した場合の比較的不良な結果を示しているが、図16は、同じ温度で0.1当量の塩基を使用した場合のはるかに良好な結果を示している。
[0091]SPPSにおける2−クロロトリチル及びトリチルのような超酸感受性リンカーは、主な副反応を克服し、ペプチド縮合反応に有用な十分保護されたペプチドフラグメントを生成する能力を有する。それでも、これらのリンカー結合の早期切断は、高温における懸念事項である(それらの不安定性が増すため)。SPPSで使用される一般的な活性化剤(HOBt、HOAt、6−Cl−HOBt、Oxyma)は酸性なので、一般的な切断酸(cleavage acid)(例えば酢酸)のように作用でき、ペプチド−樹脂結合を早期に切断する;R.E.−F.A.a.A.F.Subiros−Funosas,“塩基により推進される副反応の防止に使用されるpH調節剤としてのOxymaの使用及び2−クロロトリチルクロリド樹脂に対するその影響(Use of Oxyma as pH modulatory agent to be used in the prevention of base-driven side reactions and its effect on 2-chlorotrityl chloride resin),”Pept.Sci.,vol.98,pp.89−97,2012。高温は、酸性の活性化添加剤による早期切断を増大しがちである。
ペプチド配列(65−74ACP)=VQAAIDYING
合成規模=0.1mmol
樹脂=Fmoc−Gly−2−クロロトリチル−樹脂(0.68mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法=90℃で1分間
洗浄=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のアミノ酸
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0096]発明者らは、少量の塩基の添加で、よく知られた65−74ACPペプチドの収率が、トリチルリンカー上90℃で合成された場合、著しく向上することも見出した(表9)。0.1当量のDIEAの添加は、DIC/HOBt及びDIC/Oxyma活性化の両方で完全な安定性をもたらした。これは、DIC/HOBtの場合、35%の収率増大、DIC/Oxymaの場合153%の収率増大に表れている。一般に、トリチルリンカーの方がこれらの高温での条件下では2−クロロトリチルよりも多少安定性が高いようである。
ペプチド配列(65−74ACP)=VQAAIDYING
合成規模=0.1mmol
樹脂=Fmoc−Gly−NovaSyn−TGT−樹脂(0.19mmol/g)
装置=Liberty Blue マイクロ波ペプチド合成機(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)
脱保護=EtOH:NMP(1:9)中10%(w/v)ピペラジン3mL
マイクロ波脱保護法(エントリー1)=室温で5分間+10分間
マイクロ波脱保護法(エントリー2〜6)=90℃で1分間
洗浄(エントリー1)=脱保護後(5×5mL−DMF);カップリング後=(5×5mL−DMF)
洗浄(エントリー2〜6)=脱保護後(2mL、2mL、3mL−DMF);カップリング後=なし
カップリング=4mL溶液中5倍過剰のアミノ酸
切断(切り出し)=Accent MW 切断装置(CEM Corp.社製、ノースカロライナ州マシューズ)中38℃で30分間、5mLのTFA/TIS/H2O/DODt(92.5:2.5:2.5:2.5)
分析=ペプチドは、3100シングル四重極MSを備えたWaters社製UPLC ACQUITY H−Classにて、溶媒系としてアセトニトリル/水(0.1%TFA入り)を用い、C18カラム(1.7mm、2.1×100mm)で分析された
[0098]表10及び11に、本発明の比較利益をまとめる。
Claims (22)
- カルボン酸とアミンのカップリング法において、改良が、
アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、カルボン酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを混合し;そして
活性化及びカップリングを30℃を超える温度で実施する
ことを含む方法。 - 請求項1に記載の固相ペプチド合成法。
- リンカーがアミノ酸を樹脂に連結している、請求項1に記載の方法。
- 塩基を、活性化されるカルボン酸と比べて1当量未満の量で混合することを含む、請求項1に記載の方法。
- 塩基の量が、存在するアミノ酸の量を基にして0.2当量以下である、請求項4に記載の方法。
- 塩基の量が、存在するカルボン酸の量を基にして0.1当量以下である、請求項1に記載の方法。
- リンカーが、2−クロロトリチル及びトリチルからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- リンカーがペプチドを樹脂に連結している、請求項1に記載の方法。
- 10分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項1に記載の方法。
- 4分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項1に記載の方法。
- 2分未満の総カップリング時間内で実施される、請求項1に記載の方法。
- 塩基が、DIEA、NMM、TMP、TEA及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- カルボジイミドが、DCC、DIC、EDC、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項12に記載の方法。
- 活性化添加剤が、HOBt、HOAt、6−Cl−HOBt、Oxyma、NHS及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項13に記載の方法。
- 活性化及びカップリングが約30℃〜110℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 活性化及びカップリングが少なくとも約60℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 活性化及びカップリングが少なくとも約75℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 活性化及びカップリングが少なくとも約90℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、カルボン酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを混合し;そして
活性化及びカップリングを30℃を超える温度で実施する
ことによって製造されたアミンとカルボン酸の反応生成物を含む組成物。 - ペプチドを樹脂に連結する超酸感受性リンカーと、アミノ酸と、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを混合し;そして
活性化及びカップリングを30℃を超える温度で実施する
ことによって製造されたペプチド。 - アミンと樹脂を連結する超酸感受性リンカーと、
カルボン酸と、
カルボジイミドと、
活性化添加剤と、そして塩基とを含み;
30℃を超える温度で維持された混合物。 - カルボン酸とアミンのカップリング法であって、カルボン酸と、アミンと、カルボジイミドと、活性化添加剤と、そして塩基とを混合し、ここで塩基は酸と比べて1当量未満の量であり;そして活性化及びカップリングを30℃を超える温度で実施することを含む方法。
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