CN105837657B - 无氨基酸的多肽化学全合成法 - Google Patents

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Abstract

本发明为无氨基酸的多肽化学全合成法，属于生物分子的化学合成领域。所述的无氨基酸的多肽化学全合成的方法以酮酰胺类化合物为基本原料，通过缩酮保护条件下的还原胺化方式合成多肽。所述的无氨基酸的多肽化学全合成法为目前已知的唯一完全不使用氨基酸为原料的化学全合成多肽的方法，具有合成效率高，适用性广，副反应少，成本低廉，技术普及难度低的优势，是多肽化学中的一项重要革新和进展。

Description

无氨基酸的多肽化学全合成法
所属技术领域：
本发明涉及生物分子的化学合成领域，具体地说，涉及无氨基酸的多肽化学全合成法。此种无氨基酸的多肽化学全合成法是首创的一类不以氨基酸为原料进行多肽化学合成的方法，对多肽化学合成方法的革新与发展具有重要意义。
背景技术：
多肽是一类由氨基酸残基通过肽键连接组成的生物分子，在生物化学和医药研发领域具有极其重要的地位。多肽药物具有无蓄积性、毒副作用小、特异性高、药效显著、构效关系明显等优点，近来成为新药研究的热点。多肽被广泛应用于癌症、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、糖尿病等的治疗，也被作为测试剂、镇痛消炎药、抗菌药等使用。除了医疗用途，多肽也是许多新型农药和化妆品的有效成分。
多肽合成方法主要有化学合成与生物合成两种方法。其中生物合成方法的成本较低，但工艺可控性相对较差，不适用于合成一些非自然来源的多肽。化学合成方法几乎适用于所有多肽的合成；随着固相多肽合成法工艺的成熟，使多肽化学合成方法的可靠性得到提升，多肽生产门槛得以显著降低；但化学合成多肽的收率依然较低导致成本高企，影响了多肽药物在消费市场的普及。
多肽的化学合成研究已经有上百年的历史。多肽自发现以来就被视作为主要由氨基酸残基组成的化合物。作为示例，一个三肽的结构通式可以是：式中R1，R2，R3可以是自然氨基酸支链或非自然氨基酸支链；式中的虚线框中标识了一个传统生物化学中定义的组成多肽的基本化学单元，即氨基酸残基。至今公知的多肽合成方法的设计思路往往被局限于以氨基酸为基础原料，通过缩合或化学连接的方法合成多肽。在本发明中，跳出传统的生物观点来分析多肽的化学结构，多肽同样可以视作为一类主要由酰胺残基组成的化合物。作为示例，一个三肽的结构通式可以是：式中R1，R2，R3可以是自然氨基酸支链或非自然氨基酸支链；式中的虚线框中标识了一个本发明中定义的组成多肽的基本化学单元，即酰胺残基。
截至目前，尚未有完全不使用氨基酸为原料进行化学全合成多肽的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提出无氨基酸的多肽化学全合成法，以首创地实现不使用氨基酸为基本原料，而以酮酰胺类化合物为基本原料，通过缩酮保护下的还原胺化方式合成多肽的方法。所述的酮酰胺可以是含有自然氨基酸支链的酮酰胺、含有自然氨基酸支链前体的酮酰胺或含有非自然氨基酸支链的酮酰胺。
本发明中所述的酮酰胺的结构通式可以是：结构通式中的R可以是但不限于氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团。
作为示例，本发明提出的含有自然氨基酸支链的酮酰胺或含有自然氨基酸支链前体的酮酰胺，其命名参考自然或非自然氨基酸的命名方法。所述的含有自然氨基酸支链或自然氨基酸支链形成前体的酮酰胺包括甘酮酰胺、丙酮酰胺、缬酮酰胺、亮酮酰胺、异亮酮酰胺、苯丙酮酰胺、色酮酰胺、酪酮酰胺、天冬酮酰胺、谷酮酰胺、天冬胺酮酰胺、谷胺酮酰胺、组酮酰胺、鸟酮酰胺、离酮酰胺、精酮酰胺、半胱酮酰胺、甲硫酮酰胺、苏酮酰胺、前脯酮酰胺、脯酮酰胺。
所述甘酮酰胺具有甘氨酸的支链，结构式为
所述丙酮酰胺具有丙氨酸的支链，结构式为
所述缬酮酰胺具有缬氨酸的支链，结构式为
所述亮酮酰胺具有亮氨酸的支链，结构式为
所述异亮酮酰胺具有异亮氨酸的支链，结构式为
所述苯丙酮酰胺具有苯丙氨酸的支链，结构式为
所述色酮酰胺具有色氨酸的支链，结构式为
所述酪酮酰胺具有酪氨酸的支链，结构式为
所述天冬酮酰胺具有天冬氨酸的支链，结构式为
所述谷酮酰胺具有谷氨酸的支链结构式为
所述天冬胺酮酰胺具有天冬酰胺的支链，结构式为
所述谷胺酮酰胺具有谷氨酰胺的支链，结构式为
所述组酮酰胺具有组氨酸的支链，结构式为
所述鸟酮酰胺具有鸟氨酸的支链，结构式为
所述离酮酰胺具有离氨酸的支链，结构式为
所述精酮酰胺具有精氨酸的支链，结构式为
所述半胱酮酰胺具有半胱氨酸的支链，结构式为
所述甲硫酮酰胺具有甲硫氨酸的支链，结构式为
所述丝酮酰胺具有丝氨酸的支链，结构式为
所述苏酮酰胺具有苏氨酸的支链，结构式为
所述前脯酮酰胺具有脯氨酸未胺化前体的支链，结构式为
本发明采取的技术方案是：
步骤1，酮酰胺前体，即多酮酰胺的制备。参照文献[1][2]的方法，以乳酸衍生物为起始原料；在1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作用下，乳酸衍生物和氰基亚甲基三苯基膦反应生成酰基氰基三苯基膦衍生物；在低温条件下，以二氯甲烷为溶剂，通过臭氧分解得到二酮丁腈衍生物；通干燥氨气，添加硝酸银，反应得到邻羰基酰胺衍生物；以手性的二硫醇衍生物进行缩酮保护；以Jones试剂在丙酮中氧化乳酸衍生物上的羟基为羰基，再以乙二醇进行缩酮保护；得到缩酮保护的多酮酰胺，反应式可以是：
反应式中的R可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团。
步骤2，预载树脂的制备。根据树脂类型不同，参考文献[3]的方法使用适当的添加剂，将树脂和α羟基酸类化合物通过酯键连接；氧化羟基为羰基，其中优选的氧化剂是Jones试剂，优选的溶剂是丙酮；得到预载邻羰基酯的树脂，反应式可以是：
反应式中的是用于多肽合成的常用树脂；优选的树脂为Merrifield树脂、Wang树脂、PHB树脂；反应式中的R可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链前体或带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链。
步骤3，第一次还原胺化缩合。将通过步骤1方法合成的第一个多酮酰胺；将步骤2所得的预载树脂，与所得的酮酰胺，在氢供体添加剂和催化剂的作用下，发生还原胺化反应进行缩合，其中优选的氢供体添加剂为2-甲基吡啶-硼烷配合物，优选的催化剂是乙酸，优选的溶剂是甲醇，得到载有缩酮保护的一个酮酰胺残基的预载邻羰基酯树脂，反应式可以是：
反应式中的R1和R2可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团。
步骤4，第一次选择性脱缩酮保护。将步骤3所得的，加载有缩酮保护的一个酮酰胺残基的预载邻羰基酯树脂，进行选择性脱缩酮保护，优选的脱缩酮保护剂是碘的丙酮溶液，得到载有缩酮部分保护的一个酮酰胺残基的预载邻羰基酯树脂，反应式可以是：
反应式中的R1和R2可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链，包括但不限于氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团。
步骤5，若需要合成超过二肽长度的多肽，则反复依照步骤3的还原胺化缩合和步骤4的选择性脱缩酮保护操作。依次继续缩合添加目标产物的其他酮酰胺残基并脱缩酮保护，直至完成所有酮酰胺残基的添加，得到载有酮酰胺残基链的预载邻羰基酯树脂，反应式可以是：
反应式中的R1、R2、Rx、Rn可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；n是目标产物包含的最大氨基酸残基数目，x是大于2小于n的任一自然数，方括弧内代表依次连接的从第三至第n-1个酮酰胺残基链。
步骤6，末端酮酰胺上的酰基的还原胺化。在氢供体添加剂和催化剂的作用下，通入氨气或添加手性伯胺对步骤4或5所得的载有酮酰胺残基链之末端酮酰胺上的酰基进行胺化，其中优选的氢供体添加剂是2-甲基吡啶-硼烷配合物，优选的催化剂是乙酸，优选的溶剂是甲醇，优选的手性伯胺是甲基苄胺，得到载有末端胺化的酮酰胺残基链的预载邻羰基酯树脂，即载有n个缩酮保护氨基酸残基组成的肽链的树脂，反应式可以是：
反应式中的R1、R2、Rx、Rn可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；n是目标产物包含的最大氨基酸残基数目，x是大于2小于n的任一自然数，方括弧内代表依次连接的从第三至第n-1个酮酰胺残基链。
步骤7，最终脱缩酮保护。添加脱缩酮保护剂，对步骤6所得的载有n个缩酮保护氨基酸残基组成的肽链的树脂的肽链进行脱缩酮保护，其中优选的脱缩酮保护剂是SelectfluorTM试剂，优选的溶剂是体积混合比为95∶5的乙腈和水，得到载有n个氨基酸残基组成的肽链的树脂，反应式可以是：
反应式中的R1、R2、Rx、Rn可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；n是目标产物包含的最大氨基酸残基数目，x是大于2小于n的任一自然数，方括弧内代表依次连接的从第三至第n-1个酮酰胺残基链。
步骤8，树脂切割。根据树脂类型不同，参考文献[3]的方法使用适当的切割剂，将树脂上的肽链完整地切割下来，得到由n个氨基酸残基组成的最终产品多肽，反应式可以是：
反应式中的R1、R2、Rx、Rn可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；n是目标产物包含的最大氨基酸残基数目，x是大于2小于n的任一自然数，方括弧内代表依次连接的从第三至第n-1个酮酰胺残基链；需要注意的是，若R1、R2、Rx、Rn上存在其他保护基，则需要依据保护基类型，参考文献[4]的方法进行适当的脱保护。
特别地，若目标产品是内酰胺桥环肽，本发明提出的上述步骤1预载树脂的制备与步骤6的末端末端酮酰胺上的酰基的还原胺化可以被简化，得到由n个氨基酸残基组成的最终产品环肽。反应式可以是：
；反应式中的是用于多肽合成的常用树脂；优选的树脂为4-(4-甲酰基-3-甲氧基苯氧基)乙基树腊(FMP树脂)；R1、R2、Rx、Rn可以是带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链、带保护基或不带保护基的自然氨基酸支链的前体、带保护基或不带保护基的非自然氨基酸支链；需要注意的是，若R1、R2、Rx、Rn上存在其他保护基，则需要依据保护基类型，参考文献[4]的方法进行适当的脱保护；R’可以是但不限于是氢、烃基、卤素取代基、含氧官能团、含氮官能团、含磷官能团、含硫官能团；n是目标产物包含的最大氨基酸残基数目，x是大于2小于n的任一自然数，方括弧内代表依次连接的从第三至第n-1个酮酰胺残基链。
在此需要说明的是，若不考虑收率降低和操作繁复因素，本发明的技术方案中的树脂不是必需的。按照不同的多肽序列，树脂可以省略，或者可以被其他保护基代替，从而实现在液相中进行多肽合成。
本发明提供的无氨基酸的多肽化学全合成法，和目前以氨基酸为原料的多肽合成技术相比，具有如下创新与优势：
1.为目前已知的唯一完全不使用氨基酸为原料的化学全合成多肽的方法，打破了合成多肽必需使用氨基酸的传统思维，是多肽化学中的一项重要革新和进展。
2.通过霍夫曼重排，实现酮酰胺的缩硫酮保护和极性反转，使得酮酰胺的还原胺化缩合易于发生，反应速率和收率得以提高。
3.适用范围广，可用于各种直链和环肽的合成，对环肽的合成步骤更少，特别适用于合成以氨基酸为原料的方法难以合成的特种多肽。
4.原料易得，易于修饰，成本较氨基酸，特别是非自然氨基酸更低；合成用量少；在普及和大规模生产后的成本下降空间更大。
5.原料不具有羧基，缩合过程中不会发生主链羧基的副反应，成品纯度高。
6.还原胺化缩合剂的成本较传统氨基酸缩合剂更低；对特种多肽的合成有成本上的优势。
7.通过缩酮保护基的位阻效应，避免发生消旋；还原胺化缩合时间短，产率高。
8.实际的操作流程与传统固相合成方法类似，无需汰换原先的技术人员和设备，大大降低了初期投入，市场普及难度低。
附图说明：
图1是以无氨基酸的多肽化学全合成法制得的胆囊收缩素四肽CCK-4的高效液相色谱图。
图2是以无氨基酸的多肽化学全合成法制得的胆囊收缩素四肽CCK-4的质谱图。
图3是以无氨基酸的多肽化学全合成法制得的短杆菌肽S的高效液相色谱图。
图4是以无氨基酸的多肽化学全合成法制得的短杆菌肽S的质谱图。
具体实施方式：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的实验材料、试剂等均可通过商业途径或已知实验方法获得。
实施例1
应用无氨基酸的多肽化学全合成法对胆囊收缩素四肽CCK-4进行化学全合成。胆囊收缩素四肽CCK-4被用于人类焦虑症的研究。胆囊收缩素四肽CCK-4的氨基酸序列为Phe-Asp-Met-Trp。
步骤1，酮酰胺前体的制备。1)甲硫酮酰胺前体的合成：在加热条件下，将3.00g 3-甲硫甲基乳酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到6-甲硫基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈；将所得6-甲硫甲基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到5-甲硫基-3-羟基-2-酮戊酰胺；在冰浴条件下，将所得的5-甲硫基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的5-甲硫基-3-羟基-2-酮戊酰胺；将所得的缩硫酮保护的5-甲硫基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的5-甲硫基-3-羰基-2-酮戊酰胺；将所得的部分缩酮保护的5-甲硫基-3-羰基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮保护的(S)-甲硫二酮酰胺；反应式为：
2)天冬酮酰胺前体的合成：在氩气和冰水浴条件下，将3.24g 2-羟基丁二酸单乙酯溶于50.00mL二氯甲烷中，添加3.42g 1-乙基-(3，3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，搅拌反应1小时；在室温条件下，添加2.28mL叔丁醇和1.22g 4-二甲氨基吡啶，搅拌反应6小时；真空蒸馏后，将所得固体溶于10.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到2-羟基丁二酸-4-叔丁酯-1-乙酯；在轻微加热条件下，将所得的2-羟基丁二酸-4-叔丁酯-1-乙酯溶于20.00mL四氢呋喃中，添加10.00mL 10％氢氧化钠水溶液，回流反应1小时；真空蒸馏除去四氢呋喃，滴加1.00mol/L盐酸水溶液直到溶液pH值为6.5；以二氯甲烷萃取后，真空蒸馏，得到2-羟基丁二酸-4-叔丁酯；在加热条件下，将所得的2-羟基丁二酸-4-叔丁酯溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3，3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到6-叔丁酯基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈；将所得6-叔丁酯基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL 1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到5-叔丁酯基-3-羟基-2-酮戊酰胺；在冰浴条件下，将所得的5-叔丁酯基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的5-叔丁酯基-3-羟基-2-酮戊酰胺；将所得的缩硫酮保护的5-叔丁酯基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的5-叔丁酯基-2，3-二酮戊酰胺；将所得的部分缩酮保护的5-叔丁酯基-2，3-二酮戊酰胺溶于50mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮和叔丁酯保护的(S)-天冬二酮酰胺；反应式为：
3)苯丙酮酰胺前体的合成：在加热条件下，将3.32g 3-苯基乳酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到5-苯基基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基戊腈；将所得5-苯基基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基戊腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL 1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到4-苯基-3-羟基-2-酮丁酰胺；在冰浴条件下，将所得的54-苯基-3-羟基-2-酮丁酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的4-苯基-3-羟基-2-酮丁酰胺；将所得的缩硫酮保护的4-苯基-3-羟基-2-酮丁酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mLJones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的4-苯基-2，3-二酮丁酰胺；将所得的部分缩酮保护的4-苯基-2，3-二酮丁酰胺溶于50mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮保护的(S)-苯丙二酮酰胺；
步骤2，预载树脂的制备。将4.10g 3-吲哚乳酸溶于30.00mL二甲基甲酰胺中，添加碳酸铯直到溶液pH值为7.5，搅拌5分钟，得到3-吲哚乳酸铯盐溶液；称量4.00g Merrifield树脂(负载能力2.0-2.5mmol/g)，并添加10.00mL二甲基甲酰胺使树脂充分溶胀；将溶胀的Merrifield树脂、所得的3-吲哚乳酸铯盐溶液和33.40mg碘化钾在40.00mL二甲基甲酰胺中混合，震荡搅拌12小时；去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，得到预载有3-吲哚乳酸酯的Merrifield树脂；将所得的树脂和50mL丙酮混合，并在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以水冲洗四次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，真空干燥后得到预载有3-吲哚-2-羰基丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤3，第一次还原胺化缩合。添加10.00mL甲醇对所得的预载有部分缩酮保护的3-吲哚-2-羰基丙酯Merrifield树脂进行充分溶胀；在冰水浴的条件下，将所得的甲硫二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏。得到甲硫酮酰胺；所得甲硫酮酰胺与所得Merrifield树脂，4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合；在室温下，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的2-(S)-甲硫酮酰胺-3-(S)-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤4，第一次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的2-(S)-甲硫酮酰胺-3-(S)吲哚丙酸酯Merrifield树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的2-(S)-甲硫酮酰胺-3-(S)-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤5，第二次还原胺化缩合。在冰水浴的条件下，将所得的天冬二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL 10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到天冬酮酰胺；所得天冬酮酰胺与所得Merrifield树脂，4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合，在室温下，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的2-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤6，第二次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的2-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.10mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的2-(s)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤7，第三次还原胺化缩合。在冰水浴的条件下，将所得的苯丙二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到苯丙酮酰胺；所得苯丙酮酰胺与所得Merrifield树脂，4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的2-(S)-苯丙酮酰胺-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤8，第三次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的2-(S)-苯丙酮酰胺-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂中添加20.00mL0.10mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.10mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的2-(S)-苯丙酮酰胺-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂；反应式为：
步骤9，末端酮酰胺上的酰基的还原胺化。添加20.00mL甲醇对所得的加载有部分缩酮保护的2-(S)-苯丙酮酰胺-(S)-天冬酮酰胺-(S)-甲硫酮酰胺-3-吲哚丙酸酯Merrifield树脂进行充分溶胀；将4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和1.20mL乙酸溶于30.00mL甲醇溶液；将所得溶液和溶胀的Merrifield树脂混合，震荡搅拌1小时；添加2.34g乙酸铵，搅拌回流10小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次；真空干燥后，得到缩酮保护的Merrifield树脂-Trp-Met-Asp(OtBu)-Phe-NH2；反应式为：
步骤11，树脂切割，保护基脱除。向所得缩酮保护的Merrifield树脂-Trp-Met-Asp(OtBu)-Phe-NH2中添加含有2.00mL茴香硫醚、2.00mL苯酚、2.00mL水、0.20mL三异丙基硅烷和33.60mL三氟乙酸的混合溶液，在避光条件下，震荡搅拌30分钟，再以2.45GHz 60W微波照射处理5分钟后，过滤除去树脂部分；在加热至40℃条件下，将所得滤液真空蒸馏浓缩至约5.00-7.00mL；所得浓缩滤液在50.00mL冰乙醚中沉淀；离心获得固体沉淀后，以冰乙醚冲洗四次，冻干并以高效色谱法和手性色谱纯化后，得到序列为Phe-Asp-Met-Trp的胆囊收缩素四肽CCK-4；反应式为：
所得产品胆囊收缩素四肽CCK-4通过高效液相色谱法(图1)和ESI质谱法(图2)确认与比照品一致；总摩尔收率为57.84％；氨基酸分析法测得所得产品纯度为91.46％。
实施例2
应用无氨基酸的多肽化学全合成法对短杆菌肽S进行化学全合成。短杆菌肽S是著名的对革兰氏菌类多肽抗生素。短杆菌肽S的氨基酸序列为cyclo(-Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val-)2。
步骤1，酮酰胺前体的制备。1)鸟酮酰胺前体的合成：在氩气和冰水浴条件下，将2.67g3-胺基乙基-乳酸溶于50.00mL1，4-二氧六环中，依次添加2.12g碳酸钠和2.60g芴酰氯，搅拌反应4小时；真空蒸馏后，将所得固体溶于50mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，真空蒸馏；所得浓缩液以色谱法纯化后，得到2-羟基-5-芴甲氧酰胺基戊酸；在加热条件下，将所得2-羟基-5-芴甲氧酰胺基戊酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到7-芴甲氧酰胺基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈；将所得7-芴甲氧酰胺基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL 1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到6-芴甲氧酰胺基-3-羟基-2-酮戊酰胺；在冰浴条件下，将所得的6-芴甲氧酰胺基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的6-芴甲氧酰胺基-3-羟基-2-酮戊酰胺；将所得的缩硫酮保护的6-芴甲氧酰胺基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的6-芴甲氧酰胺基-3-羰基-2-酮戊酰胺；将所得的部分缩酮保护的6-芴甲氧酰胺基-3-羰基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮和芴甲氧酰基保护的(S)-鸟二酮酰胺；反应式为：
2)亮酮酰胺前体的合成：在加热条件下，将2.64g 3-异丙基乳酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到6-甲基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈；将所得6-甲基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL 1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到5-甲基-3-羟基-2-酮己酰胺；在冰浴条件下，将所得的5-甲基-3-羟基-2-酮己酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的5-甲基-3-羟基-2-酮己酰胺；将所得的缩硫酮保护的5-甲基-3-羟基-2-酮己酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的5-甲基-3-羰基-2-酮己酰胺；将所得的部分缩酮保护的5-甲基-3-羰基-2-酮己酰胺溶于50.00mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮保护的(S)-亮二酮酰胺；反应式为：
3)苯丙酮酰胺前体的合成：以3.33g 2-羟基-3-苯丙酸为起始原料；缩硫酮合成中，添加3.60mL(R)-苯乙二硫醇，其他操作按照实施例1中(S)-苯丙二酮酰胺前体合成的步骤，获得缩酮保护的(R)-苯丙二酮酰胺；反应式为：
4)前脯酮酰胺前体的合成：在加热条件下，将2.68g 3-羟乙基乳酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到4，7-二羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈；将所得4，7-二羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基庚腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到3，6-二羟基-2-酮己酰胺；在冰浴条件下，将所得的3，6-二羟基-2-酮己酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的3，6-二羟基-2-酮己酰胺；将所得的缩硫酮保护的5-甲基-3-羟基-2-酮己酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加20.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的3-羰基-6-醛基-2-酮己酰胺；将所得的部分缩酮保护的3-羰基-6-醛基-2-酮己酰胺溶于50.00mL二氯甲烷中，添加4.80mL乙二醇，93.20mg四氯化锆和6.64mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮保护的(S)-前脯二酮酰胺；反应式为：
5)缬酮酰胺前体的合成：在加热条件下，将2.36g 3-二甲基乳酸溶于50.00mL二氯甲烷溶液中，添加0.24g 4-二甲氨基吡啶和3.73g 1-乙基-3-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，搅拌一分钟后，添加4.02g氰基亚甲基三苯基膦；在室温条件下，搅拌反应4小时；以水冲洗两次，再以饱和碳酸氢钠水溶液冲洗三次，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到5-甲基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈；将所得5-甲基-4-羟基-3-羰基-2-三苯基膦亚甲基己腈溶于120.00mL二氯甲烷中；在低温条件下，通入臭氧反应30分钟后，以氩气置换体系内气体，并在正压条件下，通入干燥氨气反应4小时后，恢复室温，反应24小时；真空蒸馏后，向所得浓缩液添加50.00mL 1.00mol/L硝酸银四氢呋喃溶液，以水冲洗3次；真空蒸馏并色谱法纯化后，得到4-甲基-3-羟基-2-酮戊酰胺；在冰浴条件下，将所得的4-甲基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL负载1％高氯酸的5.00g/L二氧化硅胶体，并添加3.60mL(S)-苯乙二硫醇，搅拌反应1小时；离心除去沉淀，滴加1.00mol/L氢氧化钠水溶液直到溶液pH值为7.0，真空蒸馏后，得到缩硫酮保护的4-甲基-3-羟基-2-酮戊酰胺；将所得的缩硫酮保护的4-甲基-3-羟基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL丙酮中；在冷水浴的条件下，滴加10.00mL Jones试剂，撤去冷水浴，在室温下反应30分钟；滴加10.00mL异丙醇；将溶液转入冰水中，抽滤去除残液并水洗四次，真空干燥后，得到部分缩酮保护的4-甲基-3-羰基-2-酮戊酰胺；将所得的部分缩酮保护的4-甲基-3-羰基-2-酮戊酰胺溶于50.00mL二氯甲烷中，添加2.40mL乙二醇，46.60mg四氯化锆和3.32mL原甲酸三乙酯，搅拌反应30分钟，真空蒸馏；将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，再以饱和碳酸钠水溶液冲洗三次后，过滤去除沉淀；真空蒸馏并色谱法纯化后，获得缩酮保护的(S)-缬二酮酰胺；反应式为：
步骤2，预载树脂的制备。称量6.25g FMP树脂(负载能力0.60mmol/g)，并添加20.00mL甲醇使树脂充分溶胀；将所得的缩酮和芴甲氧酰基保护的(S)-鸟二酮酰胺溶于50.00mL含20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，搅拌反应10分钟；真空蒸馏，色谱法提纯后得到缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺；将溶胀的FMP树脂、所得缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺、4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸，在10.00mL甲醇中混合，震荡搅拌4小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤3，第一次的还原胺化缩合。向所得的加载有缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺的FMP树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，真空干燥后，得到加载有部分缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤4，第一次的还原胺化缩合。添加30.00mL甲醇对所得的加载有部分缩酮保护的(S)-鸟二酮酰胺的FMP树脂进行充分溶胀；在冰水浴的条件下，向溶胀的FMP树脂中添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液，震荡搅拌2小时；抽滤去除残液，以冰水冲洗三次，以冷甲醇冲洗三次，得到加载有部分缩酮保护的(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；同时，在冰水浴的条件下，将所得的(S)-亮二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL 10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到(S)-亮酮酰胺；所得亮酮酰胺与所得FMP树脂，4.30mg2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合；在室温下，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤5，第二次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤6，第二次的还原胺化缩合。在冰水浴的条件下，将所得的(R)-苯丙二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到(R)-苯丙酮酰胺；所得苯丙酮酰胺与所得加载有部分缩酮保护的(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂，4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合；在室温下，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤7，第二次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤8，第三次的还原胺化缩合。在冰水浴的条件下，将所得的(S)-前脯二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到(S)-前脯酮酰胺；所得(S)-前脯酮酰胺与所得加载有部分缩酮保护的(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂，4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.45mL乙酸在50.00mL甲醇中混合；在室温下，震荡搅拌1.5小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的(S)-前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤9，第四次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的(S)-前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂中添加40.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌10分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的(S)-前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤10，第五次的还原胺化缩合。在冰水浴的条件下，将所得的(S)-缬二酮酰胺溶于30.00mL甲醇中，添加2.38g次溴酸钠和8.00mL 10％氢氧化钠甲醇溶液；在室温条件下，搅拌反应2小时；真空蒸馏，将所得固体溶于50.00mL乙酸乙酯，以水冲洗两次，以32.60mL10％硝酸银溶液冲洗一次，再以水冲洗三次，过滤去除沉淀，真空蒸馏，得到(S)-缬酮酰胺；所得(S)-缬酮酰胺与所得加载有部分缩酮保护的(S)-前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂，8.60mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和1.20mL乙酸在50.00mL甲醇中混合；在室温下，震荡搅拌4小时；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤11，第五次选择性脱缩酮保护。向所得的加载有缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂中添加20.00mL 0.1mol/L含碘丙酮溶液，震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.1mol/L的硫代硫酸钠溶液冲洗一次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到加载有部分缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂；反应式为：
步骤12，第六到第九次还原胺化缩合和选择性脱缩酮保护。按照实施例2中的上述步骤的还原胺化缩合和选择性脱缩酮保护的反复操作，向加载有部分缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺的FMP树脂上，依次继续加载(S)-鸟酮酰胺、(S)-亮酮酰胺、(R)-苯丙酮酰胺、(S)-前脯酮酰胺，(S)-缬酮酰胺，得到部分缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂，反应式为：
步骤13，树脂上环化。将所得部分缩酮保护的(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺FMP树脂、4.30mg 2-甲基吡啶-硼烷配合物和0.60mL乙酸在50.00mL甲醇中混合，震荡搅拌30分钟，再以2.45GHz60W微波照射处理15分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以甲醇冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到缩酮保护的环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂；反应式为：
步骤14，最终脱缩酮保护。添加20.00mL体积混合比为95∶5的乙腈和水，对所得的缩酮保护的环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂，进行充分溶胀；将8.86g SelectfluorTM试剂溶于80.00mL体积混合比为95∶5的乙腈和水；将所得溶液和溶胀的FMP树脂混合，在冷水浴下震荡搅拌5分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以0.10mol/L氢氧化钠水溶液清洗两次，以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，得到环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂；反应式为：
步骤15，保护基脱除。向所得环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-(芴甲氧酰基)鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂中添加40mL含25％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，震荡搅拌15分钟；抽滤去除残液，将树脂部分以二甲基甲酰胺冲洗三次，以二氯甲烷冲洗三次，再以二甲基甲酰胺冲洗四次，真空干燥后得到环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂；反应式为：
步骤16，树脂切割。向所得环化[-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-(S)-缬酮酰胺-(S)-(环胺化)前脯酮酰胺-(R)-苯丙酮酰胺-(S)-亮酮酰胺-(S)-鸟酮酰胺-]FMP树脂中添加50.00mL 90％三氟乙酸的水溶液，震荡搅拌1小时，过滤除去树脂部分；在加热至40℃条件下，将所得滤液真空蒸馏浓缩至约5.00-7.00mL；所得浓缩滤液在50.00mL冰乙醚中沉淀；离心获得固体沉淀后，以冰乙醚冲洗四次；冻干并以高效色谱法和手性色谱纯化后，得到序列为cyclo(-Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val)2的短杆菌肽S；反应式为：
所得产品短杆菌肽S通过高效液相色谱法(图3)和ESI质谱法(图4)确认与比照品一致；总摩尔收率为24.06％；氨基酸分析法测得所得产品纯度为89.01％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。
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1.无氨基酸的多肽化学全合成法，其特征在于，不使用氨基酸为基本原料，而以指定结构的缩酮类保护下的酮酰胺为原料，通过还原胺化方式合成多肽的方法，包括如下基本步骤：(1)通过重复选择性脱缩酮类保护，还原胺化缩合和选择性脱缩酮类保护来延长肽链，(2)末端酮酰胺上的酰基的还原胺化，(3)最终脱保护处理，纯化得到对应的多肽产品；所述的指定结构的缩酮类保护下的酮酰胺的结构式是R可以是氢、甲基、 中的任意一种；所述的还原胺化缩合包括指定结构的缩酮类保护下的酮酰胺上的酮基与另一个指定结构的缩酮类保护下的酮酰胺上的胺基之间发生还原胺化反应并缩合，基本反应式为所述的选择性脱缩酮类保护包括指定结构的缩酮类保护下的酮酰胺的酮基被选择性脱去缩硫酮保护，而其他缩酮类保护下的基团不受影响，基本反应式为
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