JP2016099570A - 顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】光学系および撮像系等の装置状態および標本状態に依存せず、簡便かつ、より確実にムラのないＶＳ画像を作成する。【解決手段】対物レンズ３ａ，３ｂと、対物レンズ３ａ，３ｂにより集光された標本Ａからの光を撮影する撮像手段２４と、標本Ａと対物レンズ３ａ，３ｂとを光軸に直交する方向に相対的に移動させる移動手段２と、対物レンズ３ａ，３ｂと標本Ａとを相対的に移動させつつ取得された複数枚の顕微鏡画像群を結合してなるＶＳ画像を生成するＶＳ画像生成手段３０と、補正用画像を取得する補正用領域を探索する補正用領域探索手段３０と、探索された補正用領域について取得された補正用画像に基づいてシェーディング補正データを生成する補正データ生成手段３０と、生成されたシェーディング補正データを用いて補正するシェーディング補正手段３０とを備える顕微鏡システム１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡システムに関するものである。

従来、電動ステージ等を利用して視野を移動しながら、複数枚の画像を撮影し、それらを貼り合わせる（又は結合する）ことで、広視野かつ高解像な顕微鏡画像（バーチャルスライド画像、以下、ＶＳ画像ともいう。）を作成し、病理診断等に活用する顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１〜３参照。）。

ところで、顕微鏡で標本画像を撮像する場合、照明ムラや、光学系の不均一性、撮像素子の感度ムラ及び標本の状態（表面形状、表面特性、厚さ等）に起因して、撮像画像に明るさのムラ（シェーディング）が生じる。バーチャル顕微鏡システムにおいては、複数枚の画像を貼り合わせて作成されたＶＳ画像において、例えば、縦縞や横縞等の不自然な画像変化が主に画像接合部に顕著に現れるという問題がある。

シェーディングの問題を解決する方法として、校正用試料の顕微鏡画像からシェーディング補正用データを求め、そのシェーディング補正用データを用いて観察対象および測定対象の標本の撮像画像のシェーディングを補正する方法が知られている（例えば、特許文献４〜６参照。）。

特許文献４では、透過照明による観察時に無標本状態での背景を利用して校正用画像データを取得し、落射照明による観察時には顕微鏡システム内に設けられた反射専用部位を利用して校正用画像データを取得し、シェーディング補正を行っている。特許文献５では、均一な蛍光標本を校正標本として利用して、校正用画像データを取得し、シェーディング補正を行っている。また、特許文献６には、校正用資料を用いずに、観察対象および測定対象の標本自体を用いて、所定の位置を視野中心で撮像した場合と視野辺縁で撮像した場合の明るさの変化に基づいて、シェーディング補正用データを求める方法が開示されている。

特開平９−２８１４０５号公報 特開２００９−１４９３９９号公報 特開２０１３−２４６１８７号公報 特開２００６−１７１２１３号公報 特開２００８−５１７７３号公報 特開２０１３−２５７４２２号公報

しかしながら、校正用試料（背景含む）を利用してシェーディング補正用データを作成する特許文献４，５の方法では以下の問題がある。
第１に、工業系材料（金属、繊維等）を落射観察する場合、試料の表面形状、反射特性により異なるシェーディング補正を行うことは困難である。
第２に、蛍光色素で標識された蛍光観察を行う場合、標本の厚さに起因するシェーディング補正を行うことは困難である。また、蛍光色素や光学キューブ（励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタで構成される）毎に、均一な蛍光標本を用意することは困難である。そもそも観察対象および測定対象の標本と類似した蛍光特性を有する均一な蛍光標本を用意すること自体が困難である。
第３に、透過観察する場合には、標本の厚さ、標本濃度等に起因するシェーディング補正を行うことは困難である。

一方、特許文献６の方法では、上記の校正用試料と観察対象および測定対象の標本の性質の違いに起因するシェーディング問題は解決できるが、シェーディング補正用データを精度よく算出するためには、なるべく一様な輝度情報を有する部位で、かつ、情報欠落部位が少ない標本上部位から校正用画像データを取得しなければならない。
すなわち、蛍光観察や暗視野観察といった背景が暗く多様な発現形態を示す観察法では、低輝度環境や長時間露光環境で適切な領域を探索および決定することになり、手間がかかる上に、最適な部位を目視選択することは困難である。更に、蛍光観察では領域探索時に、長時間の励起光照射を行うと標本が褪色してしまうという不都合もある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、光学系および撮像系等の装置状態および標本状態に依存せず、簡便かつ、より確実にムラのないＶＳ画像を作成することができる顕微鏡システムを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された光を撮影する撮像手段と、前記標本と前記対物レンズとを光軸に直交する方向に相対的に移動させる移動手段と、該移動手段により前記対物レンズと前記標本とを相対的に移動させつつ前記撮像手段により取得された複数枚の顕微鏡画像群を相互に結合してなるバーチャルスライド画像を生成するＶＳ画像生成手段と、シェーディング補正データ作成用の補正用画像を取得する補正用領域を探索する補正用領域探索手段と、該補正用領域探索手段によって探索された前記補正用領域について前記撮像手段により補正用画像を取得させ、取得された補正用画像に基づいてシェーディング補正データを生成する補正データ生成手段と、該補正データ生成手段により生成されたシェーディング補正データを用いて、前記顕微鏡画像のシェーディングを補正するシェーディング補正手段とを備える顕微鏡システムを提供する。

本態様によれば、移動手段の作動により対物レンズと標本とを光軸に直交する方向に相対的に移動させながら、撮像手段を作動させるにより複数枚の顕微鏡画像群が取得され、ＶＳ画像生成手段が、取得された顕微鏡画像群を相互に結合することにより高視野のバーチャルスライド画像が生成される。この場合に、補正データ生成手段が、補正用領域探索手段の作動により探索された補正用領域について、撮像手段により補正用画像を取得させ、取得された補正用画像に基づいてシェーディング補正データが生成される。そして、生成されたシェーディング補正データを用いて、シェーディング補正手段によって顕微鏡画像のシェーディングが補正されるので、ＶＳ画像生成手段によりムラのないバーチャルスライド画像を取得することができる。

上記態様においては、前記補正データ生成手段が、前記ＶＳ画像生成手段による前記バーチャルスライド画像が生成される都度に、シェーディング補正データを生成してもよい。
このようにすることで、光学系や撮像形等の装置状態や標本状態が変化しても簡便かつ、より確実にムラのないバーチャルスライド画像を生成することができる。

また、上記態様においては、倍率を切り替える倍率変更手段と、低倍率の顕微鏡画像群から生成された低倍バーチャルスライド画像を用いて、より高倍率の高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域を指定する高倍ＶＳ画像領域指定手段とを備え、前記ＶＳ画像生成手段が、前記高倍ＶＳ画像領域指定手段により指定された標本領域について、前記高倍バーチャルスライド画像を生成してもよい。

このようにすることで、倍率変更手段により低倍率に設定された状態で、ＶＳ画像生成手段により生成された低倍バーチャルスライド画像において、高倍ＶＳ画像領域指定手段により高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域が指定され、倍率変更手段によって倍率が変更された後に、指定された標本領域についてＶＳ画像生成手段により高倍バーチャルスライド画像が生成される。高倍バーチャルスライド画像を構築する際に、既に取得されている低倍バーチャルスライド画像を用いるので、簡便に標本領域を指定することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像から前記高倍バーチャルスライド画像のシェーディングを補正するための前記補正用領域を探索してもよい。
このようにすることで、高倍バーチャルスライド画像のシェーディングを補正するための補正用領域が低倍バーチャルスライド画像から探索され、簡易に補正用領域を決定することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像から複数の候補領域を決定し、決定された複数の前記候補領域について、前記高倍バーチャルスライド画像用の顕微鏡画像を取得する倍率で前記撮像手段により画像を取得させ、取得された画像からシェーディング補正に適した画像情報を有する前記候補領域を前記補正用領域として選択してもよい。

このようにすることで、高倍バーチャルスライド画像を生成する撮影条件で取得された画像からシェーディング補正に適した画像情報を有する候補領域が補正用領域として探索される。これにより、より精度よくシェーディング補正を施した高倍バーチャルスライド画像を生成することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域内、かつ、前記高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域外の領域から、前記高倍バーチャルスライド画像のシェーディングを補正するための前記補正用領域を探索してもよい。

このようにすることで、実際に高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域外の標本領域に補正用領域を設定することができ、蛍光観察の場合に、標本の褪色を抑制することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、バーチャルスライド画像生成用の顕微鏡画像群からシェーディング補正に適した画像情報を有する標本領域を前記補正用領域として選択してもよい。
このようにすることで、既に取得されているバーチャルスライド画像内の補正用領域においてシェーディング補正に適した画像情報を有する領域が見つからない場合においても、バーチャルスライド画像生成用の顕微鏡画像群を用いて補正用領域を探索することができる。

また、上記態様においては、前記補正データ生成手段が、前記補正用領域内を複数区画に分割し、各区画の大きさ分だけずらして取得された複数の補正用画像間で、異なる２区画間の輝度値の比率によりシェーディング補正データを生成してもよい。
このようにすることで、基準となる補正用画像の中心区画の輝度値と、区画の大きさ分だけずらして取得された他の補正用画像の他の区画の輝度値との比率により簡易にシェーディング補正データを生成することができる。

また、上記態様においては、前記補正データ生成手段は、各前記区画の輝度値が所定の閾値より大きいときに、取得する補正用画像の数がより少ないシェーディング補正データの生成方式を選択してもよい。
このようにすることで、各区画の輝度値が大きい補正用領域においては、補正用画像の取得数を節約して、短時間にシェーディング補正データを生成することができる。一方、各区画の輝度値が小さい補正用領域の場合には、補正用画像の取得数を多くすることにより、時間はかかっても輝度値の大きな区画を有効利用して、精度よくシェーディング補正をすることができる。

また、上記態様においては、前記補正データ生成手段が、観察法に応じて前記生成方式を選択してもよい。
蛍光観察や暗視野観察のように、取得される顕微鏡画像の輝度値が小さい観察法の場合には、補正用画像の取得数を多くし、明視野観察のように取得される顕微鏡画像の輝度値が大きい観察法の場合には、取得する補正用画像数を少なくして時間短縮を図ることができる。

また、上記態様においては、前記高倍ＶＳ画像領域指定手段が、前記低倍バーチャルスライド画像を用いて、高倍バーチャルスライド画像を構築する複数の標本領域を指定し、前記シェーディング補正手段が、前記標本領域毎に、前記顕微鏡画像のシェーディングを補正してもよい。
このようにすることで、単一のスライドガラス上に配置された複数の標本について、スライドガラスを入れ替えることなく、効率的に、シェーディング補正がなされたバーチャルスライド画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域において、異なる区画のシェーディング補正部分データを生成し、生成されたシェーディング補正部分データを組み合わせてシェーディング補正データを生成してもよい。
このようにすることで、単一の補正用領域として、シェーディング補正に適した画像情報を有する領域が見つからない場合においても、複数の補正用領域の情報を集めて、精度よくシェーディングを補正するためのシェーディング補正データを生成することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域についてそれぞれ取得された補正用画像の輝度値を平均して得られた複数の平均補正用画像間で、異なる２区画間の輝度値の比率によりシェーディング補正データを生成してもよい。
このようにすることで、単一の補正用領域として、シェーディング補正に適した画像情報を有する領域が見つからない場合においても、複数の補正用領域の情報を集めて平均することにより、精度よくシェーディングを補正するためのシェーディング補正データを生成することができる。

また、上記態様においては、前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域についてそれぞれシェーディング補正データを生成し、該シェーディング補正データが生成されていない標本領域については、近傍の補正用領域との距離に基づいて補間することによりシェーディング補正データを生成してもよい。
このようにすることで、全ての標本領域において実測に基づくシェーディング補正用データを生成せずに済み、短時間にシェーディング補正されたバーチャルスライド画像を取得することができる。

本発明によれば、光学系および撮像系等の装置状態および標本状態に依存せず、簡便かつ、より確実にムラのないＶＳ画像を作成することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムを示す全体構成図である。 図１の顕微鏡システムにより観察する（Ａ）スライドガラス標本の一例、（Ｂ）標本領域の一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムによるＶＳ画像構築処理の流れを示すフローチャートである。 図１の顕微鏡システムによるフォーカスマップ作成を説明する標本の画像を示す図である。 図４のフォーカスマップのデータ構造の一例を示す図である。 （Ａ）〜（Ｅ）図１の顕微鏡システムにより取得されるシェーディング補正データの取得方法である２視野画像方式を説明する図、（Ｆ）シェーディング補正データを取得する区画を説明する図である。 （Ａ）〜（Ｈ）図６の２視野画像方式によるシェーディング補正データの取得に必要な適格区画の例を示す図である。 （Ａ）〜（Ｉ）図１の顕微鏡システムにより取得されるシェーディング補正データの取得方法である中央１／Ｎ方式を説明する図である。 図１の顕微鏡システムによるシェーディング補正処理の流れを示すフローチャートである。 図１の顕微鏡システムにおいて、観察法によって分岐するシェーディング補正データの取得方法を示すフローチャートである。 図１の顕微鏡システムにおいて、既存ＶＳ画像利用方式で既存ＶＳ画像を小区画に分割した一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムにおいて、プレスキャン方式で複数の補正用画像の取得領域を選択した一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムにより観察する、複数の標本が載置されたスライドガラス標本の一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムにより観察する（Ａ）標本領域、（Ｂ）複数の小区画に分割した標本領域の一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムにより、シェーディング補正データを補間演算で算出する場合を説明する図である。 図１の顕微鏡システムのホストシステム部分を示す部分構成図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システム１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、顕微鏡装置１００と処理装置２００とを備えている。
顕微鏡装置１００は、標本Ａを載せる電動ステージ（移動手段）２と、標本Ａの上方に対向して配置され標本Ａからの光を集光する対物レンズ３ａ，３ｂと、標本Ａの下方から照明光を入射させる透過照明用光学系４と、対物レンズ３ａ，３ｂを介して標本Ａの上方から照明光を入射させる落射照明用光学系５と、対物レンズ３ａ，３ｂにより集光された光を検出する検出光学系６とを備えている。

標本Ａは、例えば、図２に示されるスライドガラス標本（スライドガラス３８上に標本Ａが載せられたもの）４０である。図１では標本Ａのみを示しているが、実際にはスライドガラス標本４０が電動ステージ２上にセットされるようになっている。

電動ステージ２は、搭載した標本Ａを、対物レンズ３ａ，３ｂの光軸に沿う鉛直方向（ｚ方向）および対物レンズ３ａ，３ｂの光軸に直交する水平２方向（ｘ，ｙ方向）に移動させるようになっている。電動ステージ２は、図示しない原点センサによる原点位置検出機能を有しており、電動ステージ２に載置した標本Ａの各部に対して座標を設定することができるようになっている。

対物レンズ３ａ，３ｂは、倍率等の光学特性の異なるものが複数装着されており、レボルバ（倍率変更手段）７の作動によって、そのときの観察に使用するものが選択的に標本Ａに対向させられるようになっている。
透過照明用光学系４は、透過照明用光源８と、該透過照明用光源８の照明光を集光するコレクタレンズ９と、透過用フィルタユニット１０と、透過シャッタ１１と、透過視野絞り１２と、透過開口絞り１３と、コンデンサ光学素子ユニット１４と、トップレンズユニットとを備えている。

落射照明用光学系５は、落射照明用光源１６と、コレクタレンズ１７と、落射用フィルタユニット１８と、落射シャッタ１９と、落射視野絞り２０と、落射開口絞り２１とを備えている。
検出光学系６は、標本Ａからの光の波長を選択する光学フィルタユニット２２と、該光学フィルタユニット２２を透過した光を目視観察するための接眼レンズ２３および撮影するためのカメラ（撮像手段）２４と、接眼レンズ２３側およびカメラ２４側に光路を分岐するビームスプリッタ２５とを備えている。

光学フィルタユニット２２は、透過率特性の異なる複数の光学キューブ２２ａ，２２ｂを備え、いずれかの光学キューブ２２ａ，２２ｂを、観察法に応じて選択的に光路に挿入するようになっている。
上述した各構成部品は、電動化されており、その動作は後述する顕微鏡コントローラ３１によって制御されるようになっている。

処理装置２００は、ホストシステム３０と、該ホストシステム３０に接続された顕微鏡コントローラ３１、カメラコントローラ３２、ビデオボード３３、データ記録部３４、モニタ３５と、顕微鏡コントローラ３１に接続されたｘｙステージ駆動制御部３６およびｚステージ駆動制御部３７とを備えている。

顕微鏡コントローラ３１は、顕微鏡装置１００全体の動作を制御する機能を有するものであり、ホストシステム３０からの制御信号に応じて、観察法の変更、透過照明用光源８および落射照明用光源１６の調光を始め、各構成部品の制御を行うとともに、顕微鏡装置１００の各構成部品の現在の状態を検出して、これをホストシステム３０へ送出する機能を有している。また、顕微鏡コントローラ３１は、ｘｙステージ駆動制御部３６およびｚステージ駆動制御部３７を介して、電動ステージ２の制御も行うようになっている。

カメラコントローラ３２は、ホストシステム３０からの制御信号に応じて、カメラ２４に対して、自動ゲイン制御のＯＮ／ＯＦＦ、ゲイン設定、自動露出制御のＯＮ／ＯＦＦおよび露光時間の設定を行うようになっている。

カメラ２４内の撮像素子であるＣＣＤ（図示略）によって撮像された標本Ａの顕微鏡画像は、ビデオボード３３を介してホストシステム３０に取り込まれるようになっている。
また、ホストシステム３０は、カメラ２４から送られてきた顕微鏡画像を、画像データファイルとしてデータ記録部３４に保存するようになっている。データ記録部３４は、例えば、ハードディスクや大容量メモリ等である。

データ記録部３４に記録された画像データファイルは、任意のときに、例えば、ユーザ操作等に応じて、ホストシステム３０によって読み出されることにより、顕微鏡画像がモニタ３５に表示させられるようになっている。
さらに、ホストシステム３０は、カメラ２４によって撮像された顕微鏡画像のコントラストに基づいて合焦動作を行う、いわゆるビデオＡＦ機能も有している。

なお、ホストシステム３０は、特に図示しないが、制御プログラムの実行によって顕微鏡システム１全体の動作制御を司るＣＰＵ（中央演算装置）、このＣＰＵが必要に応じてワークメモリとして使用するメインメモリ、マウスやキーボード等のユーザからの各種の指示を取得するための入力部、この顕微鏡システム１の各構成要素との間で各種データの授受を管理するインタフェースユニット、および各種のプログラムやデータを記憶しておく、例えば、ハードディスク装置等の補助記憶装置、および、ディスプレイ等の表示装置を有しているコンピュータである。

そして、ホストシステム３０のＣＰＵが、補助記憶装置に記憶されている所定のアプリケーションプログラムをメインメモリ上に読み出して実行することにより、後述する各種処理が実現されるようになっている。これら処理の際、ホストシステム３０は、顕微鏡コントローラ３１に対して制御信号を送り、顕微鏡コントローラ３１によって、電動ステージ２の移動制御、観察法の変更等の顕微鏡装置１００の各構成部品の制御、または、各構成部品の状態検出等を行わせる場合があるが、以下ではこれらについては逐一説明しないものとする。すなわち、本実施形態においては、ホストシステム３０が、図１６に示されるように、ＶＳ画像生成部６１、補正用領域探索部６２、補正データ生成部６３、シェーディング補正部６４および高倍ＶＳ画像領域指定部６５を備えており、それぞれＶＳ画像生成手段、補正用領域探索手段、補正データ生成手段、シェーディング補正手段および高倍ＶＳ画像領域指定手段として機能するようになっている。

＜ＶＳ画像構築処理＞
次に、本実施形態に係る顕微鏡システム１によるＶＳ画像の構築処理について、図２および図３を参照して説明する。
ＶＳ画像の構築処理の詳細については本出願人による特許文献１〜３に記載されているので、ここでは概略を説明する。本実施形態においては、図２に示す標本ＡのＶＳ画像構築処理について図３に示すフローチャートを用いて説明する。

最初に、ＨＥ染色標本に代表される透過明視野標本の場合の処理フローについて説明し、続いて蛍光標本の場合について、透過明視野標本と異なる部分を説明する。
透過明視野標本の観察においては、まず、電動ステージ２に載置されたスライドガラス３８上の標本Ａの全体像が取得される（ステップＳ１００）。標本ＡはＨＥ染色された透過明視野標本とする。

そして、透過明視野観察法を実現すべく各種光学部材の光路への挿脱が行われる。すなわち、ホストシステム３０は、透過明視野観察状態を構築するために、顕微鏡コントローラ３１を介して、落射シャッタ１９を光路に挿入し、明視野観察用の光学キューブ２２ａを光路に挿入し、透過照明用光源８を点灯する制御を行う。

つまり、観察法を明視野観察法に切り替える制御が行われる。そして、例えば、倍率２倍程度の低倍の対物レンズ３ａを光路に挿入する。そして、図２（Ａ）に示すスライドガラス３８上の所定の標本サーチ範囲４１（例えば、縦２５mm×横５０mm）を、カメラ２４に投影される撮影領域幅に応じて分割する（換言すれば、光路に挿入した対物レンズ３ａの倍率に応じて分割する。）。

そして、標本サーチ範囲４１を分割した複数の各区画に対して、電動ステージ２をＸ，Ｙ方向に移動して、移動先の区画でカメラ２４を介して顕微鏡画像を取得することを繰り返し行う。これにより得られた複数の顕微鏡画像（低倍率による各区画の画像）を相互に結合することで、スライドガラス３８全体のＶＳ画像（図２（Ｂ）に示す標本サーチ範囲４１全体の画像。以下、全体ＶＳ画像という。）を生成し、データ記録部３４に記録する。

次に、ステップＳ１００において取得した全体ＶＳ画像の輝度情報を基に、スライドガラス３８上に実際に標本Ａが載っている領域（図２（Ｂ）に示す標本領域４２）を自動抽出する（ステップＳ１０２）。標本Ａの抽出方法については特許文献３に示されるような公知の方法を使用する。図中符号４３は、スライドガラス標本４０を識別するためのラベルである。

次いで、以後の高倍率の対物レンズ３ｂを用いたＶＳ画像（以下、高精細ＶＳ画像という。）を構築する際に用いる観察法に切り替える（ステップＳ１０４）。ここで、高倍率とは、ステップＳ１００で使用した低倍率の対物レンズ３ａの倍率よりも高い倍率であるという意味である。観察される標本Ａは透過明視野標本であり、ステップＳ１００にて既に透過明視野観察状態が構築されているので、特に制御は行われない。

そして、以後のステップＳ１２０〜Ｓ１６０での高精細ＶＳ画像を構築する際に使用する対物レンズ３ｂをオペレータが選択する（ステップＳ１１０）。
次いで、高精細ＶＳ画像を形成する範囲を、全体ＶＳ画像上で不図示のマウス操作にてオペレータが領域指定する（ステップＳ１２０）。

例えば、図２（Ｂ）に示すＳｃａｎ領域４４ａについて、「１０倍の対物レンズで高精細ＶＳ画像を形成する」等の指定がなされる。なお、画像上のＸ，Ｙ座標を実際の電動ステージ２上の物理的なＸ，Ｙ座標に変換する計算方法は、撮影倍率、撮影素子情報（画素数、画素サイズ）から算出するものであり、特許文献１に詳細が記述されている方法を用いることとし、ここでの説明は省略する。

次に、図４に示されるように、ステップＳ１１０にて選択されたＳｃａｎ領域４４ａを高倍率の対物レンズ３ｂの撮影領域を示す小区画に分割し、フォーカス位置を実測する小区画を自動選定する（ステップＳ１３０）。
そして、ステップＳ１３０で選択されたフォーカス位置を実測する小区画に対して、標本像を入力してコントラスト評価することで実測による合焦位置（Ｚ座標）を求める。

さらに、ステップＳ１３０においてフォーカス位置抽出ポイントとして抽出されなかった小区画については、その近傍のフォーカス位置抽出ポイントの実測合焦位置（Ｚ座標）に基づき補間演算により合焦位置（Ｚ座標）を求め、図５に示すフォーカスマップ５０を作成し、データ記録部３４に記録する（ステップＳ１４０）。フォーカスマップ作成の詳細については、特許文献３に記載されているように公知の方法を用いることとし、ここでの説明を省略する。

次に、ステップＳ１４０で作成したフォーカスマップ５０の情報を基に電動ステージ２を制御して、各小区画毎の画像を取得する（ステップＳ１５０）。
そして、入力した各小区画の画像をこれと隣接する小区画の画像と結合する。この画像入力処理および画像結合処理を、フォーカスマップ５０に登録された全小区画に対して完了するまで繰り返すことで、高倍率の対物レンズ３ｂを用いた高精細な顕微鏡画像を相互に結合した、広視野かつ高精細な顕微鏡画像である高精細ＶＳ画像の作成が完了する。作成された高精細ＶＳ画像は全体ＶＳ画像と位置情報が関連づけられて、データ記録部３４に画像データファイルとして格納される（ステップＳ１６０）。

追加で高精細ＶＳ画像を生成する場合には、ステップＳ１１０〜Ｓ１６０のＶＳ画像構築処理が繰り返される（ステップＳ１７０）。例えば、図２（Ｂ）に示すＳｃａｎ領域４４ａ内のＳｃａｎ領域４４ｂを、さらに高倍率の対物レンズ（例えば、４０倍）で観察したい場合には、ステップＳ１１０において４０倍の対物レンズを選択し、ステップＳ１２０においてＳｃａｎ領域４４ａに対して作成した高精細ＶＳ画像をモニタ３５上で参照して、不図示のマウス操作にてオペレータが領域指定する。

以後のステップＳ１３０〜Ｓ１６０の処理は同一なので説明は省略するが、結果として、透過明視野標本の全体ＶＳ画像、第１の高精細ＶＳ画像（Ｓｃａｎ領域４４ａについて１０倍対物レンズを用いて高精細ＶＳ画像を形成）および第２の高精細ＶＳ画像（Ｓｃａｎ領域４４ｂについて４０倍対物レンズを用いて高精細ＶＳ画像を形成）が、各々の位置情報が関連づけられた形態で、データ記録部３４にＶＳ画像が画像データファイルとして格納される。

次に、蛍光標本の場合の処理フローについて、透過明視野標本の場合と異なる部分について説明する。
ステップＳ１００のスライドガラス標本４０の全体像を取得する処理では、蛍光標識した標本Ａは未励起状態では透明であり、通常の明視野観察では標本Ａの位置を確認できない。

そこで、例えば、透過偏射照明、位相差観察あるいは微分干渉観察法にて標本Ａに明暗のコントラストをつけて、全体ＶＳ画像を構築する（特許文献２参照。）。また、開口絞りを絞る（低倍率の対物レンズ３ａでトップレンズがはねのけられる場合は、視野絞りが開口絞りとして機能する）ことにより標本Ａに明暗のコントラストをつけてもよい。

そして、ステップＳ１０２にて標本領域４２を抽出し、ステップＳ１０４にて落射蛍光観察法を実現すべく各種光学部材の光路への挿脱制御が行われる。すなわち、顕微鏡コントローラ３１を介して、透過照明用光源８を消灯し、蛍光観察用の光学キューブ２２ｂを光路に挿入し、落射シャッタ１９を開放する等の制御が行われる。

以後のＶＳ画像構築処理（ステップＳ１１０〜Ｓ１７０）は、透過明視野標本の場合と同様であり、蛍光標本の全体ＶＳ画像、第１の高精細ＶＳ画像（Ｓｃａｎ領域４４ａについて１０倍対物レンズを用いて高精細ＶＳ画像を形成）および第２の高精細ＶＳ画像（Ｓｃａｎ領域４４ｂについて４０倍対物レンズを用いて高精細ＶＳ画像を形成）が、各々の位置情報が関連づけられた形態で、データ記録部３４にＶＳ画像が画像データファイルとして格納される。

＜シェーディング補正処理＞
続いて、シェーディング補正処理の概要について図６〜図８を用いて説明する。
シェーディング補正処理としては、校正用試料を用いずに、観察対象および測定対象の標本Ａ自体を用いて、所定の位置を視野中心で撮像した場合と視野周辺で撮像した場合の明るさの変化に基づいて、シェーディング補正用データ（以下、補正ゲインデータという。）を求める方法を用いることとし、その概要について図６を用いて以下で説明する（特許文献６参照。）。

本実施形態では、図６に示すように基準視野画像５００の高さ方向（Ｙ方向）および／または幅方向（Ｘ方向）に１／３ずつ移動させる（分割数Ｎ＝３）場合を例にとって説明を行う。
図６に示すように、基準視野画像５００とその周辺視野画像５０１を４枚、計５枚の標本Ａの画像を撮像する。そして、基準視野画像５００と１つの周辺視野画像５０１とを用いて、図６（Ｆ）に示す９区画のうち、２区画のシェーディング補正データを算出できる。

例えば、図６（Ｂ）に示すように、基準視野画像５００の中央画像５０２を、対応する周辺視野画像５０１の左中央画像５０２で除算することにより、図６（Ｆ）に示す区画Ｄの補正ゲインデータを求めることができる。また、図６（Ｂ）において、周辺視野画像５０１の中央画像５０３を、対応する基準視野画像５００の右中央画像５０３で除算することにより、図６（Ｆ）に示す区画Ｆの補正ゲインデータを求めることができる。

以後、同様な処理を図６（Ｃ）〜（Ｅ）に図示する基準視野画像５００と周辺視野画像５０１の位置関係にて行うことにより、図６（Ｆ）に示す中央区画Ｅを除いた周辺８区画の補正ゲインデータを求めることができる。なお、中央区画Ｅは顕微鏡装置１の光軸中心近傍の画像であり光学性能が良好なので、補正ゲインデータとして「１」（無補正データ）を設定すればよい。
取得された標本Ａの顕微鏡画像のシェーディング補正（ムラ除去）は、撮像画像データに補正ゲインデータを乗算することにより行われる。

以後、上記方式で補正ゲインデータを求める方式を「２視野画像方式」と呼ぶことにする。
２視野画像方式では、（Ｎ×Ｎ＋１）／２で求まる回数（本実施形態では、分割数Ｎ＝３なので、５回）の校正用画像データの取得で済み、撮像回数が少ないことが特徴である。反面、図７に示すように、中央区画Ｅを含んだ隣接５区画（上記と同様な計算式で求まる）で、なるべく一様な輝度情報を有し、かつ、情報欠落部位が少なければならないという制約が生じる。

例えば、倍率１０倍程度の比較的低倍率の対物レンズ３ａで蛍光観察を行う場合には、撮像範囲の（Ｎ×Ｎ＋１）／（２×Ｎ×Ｎ）≒１／２の連続した領域で蛍光を発現する部位を求めることは非常に困難である。すなわち、蛍光観察や暗視野観察と等の背景が暗い（情報がない）観察手法では、補正ゲインデータを求めるための評価領域がより小さいことが望ましい。

そこで、「２視野画像方式」とは別に、以下で説明する「中央１／Ｎ方式」で、補正ゲインデータを算出することも有効である。
この中央１／Ｎ方式は、図８（Ａ）に示すように、基準視野画像５００の中央領域５０２に該当する標本Ａ上の領域のみを補正ゲインデータを求めるための評価領域とする方式である。

具体的には、基準視野画像５００と、８枚の周辺視野画像５０１の計９枚の標本Ａの画像を取得する。そして、基準視野画像５００の中央領域５０２を常に基準データとして採用し、図８（Ｂ）〜（Ｉ）に示す中央領域５０２に対応する周辺視野画像５０１上のデータで除算することにより、補正ゲインデータを算出する。

中央１／Ｎ方式は、２視野画像方式と比較すると、評価領域を２／（Ｎ×Ｎ＋１）≒２／（Ｎ×Ｎ）に削減することができる。その反面、中央１／Ｎ方式は、Ｎ×Ｎ回の撮像回数が必要となり、（２×Ｎ×Ｎ）／（Ｎ×Ｎ＋１）≒２となって、２視野画像方式の約２倍の撮像回数が必要となり、一長一短がある。

＜シェーディング補正（校正）用画像取得処理＞
続いて、本実施形態のシェーディング補正（校正）用に用いる画像データを取得する方法について説明する。対象標本領域の決定方法としては、以下に示す３種類の方法がある。
（１）Ｓｃａｎ領域を決定するために参照するナビ（低倍）画像から決定する（既存ＶＳ画像利用方式）。
（２）ＶＳ画像生成前のフォーカスマップ作成時のプレスキャン画像から決定する（プレスキャン方式）。
（３）ＶＳ画像生成用の隣接部位結合前の原画像から決定する（ＶＳ原画像利用方式）。

図９に示す校正用画像取得処理のフローチャートと、図３に示すＶＳ画像構築処理のフローチャートとを参照して、校正用画像取得部位の決定からシェーディング補正処理実行までの動作フローを説明する。そして、上記３方式の校正用画像取得部位決定処理の詳細説明については、その後に行う。

まず、既存のＶＳ画像を流用できるか否かを判定する（ステップＳ２００）。全体ＶＳ画像を含む既に生成されたＶＳ画像が存在し、これから生成予定のＶＳ画像と同一観察法でＶＳ画像が形成されている場合に、既存のＶＳ画像を利用することができる。例えば、前述の実施形態においては、以下の場合が該当する。

（Ａ）透過明視野標本において、図２に示すＳｃａｎ領域４４ａのＶＳ画像を構築する場合で、ステップＳ１００で生成した全体ＶＳ画像を利用する場合。
（Ｂ）透過明視野標本または蛍光標本において、Ｓｃａｎ領域４４ｂの高精細ＶＳ画像を生成する場合で、同一観察法で生成済みのＳｃａｎ領域４４ａの高精細ＶＳ画像を利用する場合。

そして、既存ＶＳ画像を利用できる場合には、既存ＶＳ画像を利用して校正画像を取得する既存ＶＳ画像上の領域を検索し、対応標本部位を決定し、シェーディング補正処理で説明した「２視野画像方式」または「中央１／Ｎ方式」により、校正用の画像データを取得し、補正ゲインデータを算出する（ステップＳ２１０）。

ステップＳ２００，Ｓ２１０の既存ＶＳ画像利用による補正ゲインデータの算出処理は、図３に示すＶＳ画像構築処理のステップＳ１２０のＳｃａｎ範囲を決定した後に実施される。そして、算出した補正ゲインデータを用いて、標本Ａの画像のシェーディング補正を行う処理は、ステップＳ１５０の高倍画像を取得するタイミングで、画像取得毎に行われる。補正ゲインデータが生成された場合には、処理を終了する（ステップＳ２１５）。

既存ＶＳ画像の流用による補正ゲインデータの作成ができない場合は、作成予定のＶＳ画像の取得条件（観察法、対物レンズ、光学キューブ等）で、複数箇所の部位の標本Ａの画像をサンプリング取得して（プレスキャン方式）、取得された画像を評価することにより校正画像を取得する標本Ａ上の部位を決定し、「２視野画像方式」または「中央１／Ｎ方式」により、校正用の画像データを取得し補正ゲインデータを算出する（ステップＳ２２０）。ステップＳ２２０の処理は、図３に示すＶＳ画像構築処理のステップＳ１２０〜Ｓ１６０の間のフォーカスマップ作成関連処理の中で実施される。

ステップＳ１３０で、作成予定のＶＳ画像のＳｃａｎ領域内のフォーカス位置を実測する小区画を選定し、ステップＳ１４０にて選定区画の合焦位置を求めるために標本Ａの画像を取得する。このフォーカス実測小区画の標本Ａの画像を利用して、校正画像取得領域として適切な標本Ａ上の部位を決定する。そして、補正方式に応じた校正用の画像データを取得して補正ゲインデータを算出する。作成した補正ゲインデータを用いて標本Ａの画像のシェーディング補正を行う処理は、ステップＳ１５０の高倍画像を取得処理にて画像取得毎に行われる。補正ゲインデータが生成された場合には、処理を終了する（ステップＳ２２５）。

プレスキャン方式による補正ゲインデータの作成ができなかった場合には、作成予定のＶＳ画像のＳｃａｎ領域からＶＳ画像形成用に実際に取得した標本原画像を評価することにより校正画像を取得する標本Ａ上の部位を決定する。そして、「２視野画像方式」または「中央１／Ｎ方式」に応じた方法で校正用の画像データを取得して補正ゲインデータが算出される（ステップＳ２３０）。

ステップＳ２３０の処理は、図３に示すＶＳ画像構築処理のステップＳ１５０の高倍画像取得完了後に実施される。続いて、補正方式に応じた校正用の画像データを取得して補正ゲインデータを算出し、算出された補正ゲインデータを用いて、ステップＳ１５０で取得済みの高倍画像のシェーディング補正を行う。そして、シェーディング補正済みの高倍画像（ＶＳ原画像）を用いてステップＳ１６０にて隣接画像の結合によるＶＳ画像形成処理が行われる。補正ゲインデータが生成された場合には、処理を終了する（ステップＳ２３５）。

なお、上述の３方式による補正ゲインデータ作成処理において、校正用の画像データを取得するための適切な標本領域が検索できなかった場合には、補正データなしを意味する値１で補正ゲインデータを埋める（ステップＳ２４０）。以上で、校正用画像取得部位の決定からシェーディング補正処理実行までの動作フローの説明を終了する。

なお、本実施形態では、指定されたＳｃａｎ領域のＶＳ画像を作成する場合に、毎回補正ゲインデータの作成を行っているが、同一標本内でＶＳ画像の取得条件（観察法、対物レンズ、光学キューブ等）が同じ条件の補正ゲインデータを既に作成済みの場合は、作成済みの補正ゲインデータを流用してもよい。

また、作成済みの補正ゲインデータを流用する際に、観察法（透過明視野、落射明視野、暗視野、蛍光等）に応じて流用するかしないかを設定してもよい。例えば、落射明視野観察で工業系標本を観察する場合、試料（標本Ａ）の部位によっては、反射率が異なる場合があり、毎回補正ゲインデータを算出することが望ましい場合が多い。一方、病理標本の代表的なＨＥ染色標本では、シェーディング特性はスライドガラス３８上の標本Ａの部位には依存しないことが多いので、作成済みの補正ゲインデータを流用することが望ましい。

また、作成済みの補正ゲインデータを流用する際に、オペレータが流用の可否を選択できることにしてもよい。
更に、補正ゲインデータが作成できなかった場合には、他標本または校正用標本で以前に作成して、データ記録部３４に保存されているＶＳ画像の取得条件（観察法、対物レンズ、光学キューブ等）が同じ条件の補正ゲインデータを流用してもよい。

＜既存ＶＳ画像利用方式＞
校正用画像取得部位を決定するための第一の方法である、既存ＶＳ画像利用方式について、図１０を用いて以下に説明する。
まず、観察法に応じて処理を振り分ける（ステップＳ３００，Ｓ３０１）。この観察法は図３に示すＶＳ画像構築処理のステップＳ１０４において決定される。
続いて、観察法に応じてシェーディング補正データ取得方式を決定する。すなわち、観察法が落射暗視野観察および蛍光観察である場合には、「中央１／Ｎ方式」が選択され（ステップＳ３１０，Ｓ３１１）、その他の観察では「２視野画像方式」が選択される（ステップＳ３１２）。

そして、校正用の標本部位決定において、優先度の高い既存ＶＳ画像上の領域を選択して、その画像内で望ましい輝度情報を有する部位を検索する。優先領域の選択は観察法により異なり、蛍光観察では退色防止を目的としてＳｃａｎ領域外が選択され（ステップＳ３２１）、その他の観察法ではＳｃａｎ領域内が選択される（ステップＳ３２０，Ｓ３２２）。
優先領域の検索の結果、適切な標本部位が見つかった場合には処理を終了し（ステップＳ３２３〜Ｓ３２５）、見つからなかった場合には、優先領域以外の領域で検索を行う（ステップＳ３３０〜Ｓ３３２）。

検索処理の概要について以下に説明する。
例えば、透過明視野標本において、図２に示すＳｃａｎ領域４４ａの高精細ＶＳ画像を構築する場合で、ステップＳ１００で生成した全体ＶＳ画像を利用する場合を例に挙げて説明する。

すなわち、観察法が透過明視野で、倍率２倍の対物レンズで全体ＶＳ画像を作成し、同一観察法で１０倍の対物レンズでＳｃａｎ領域４４ａの高精細ＶＳ画像を作成する場合である。本実施形態では観察法が透過明視野なので、シェーディング補正データ取得方式として「２視野画像方式」が選択され、検索する優先領域はＳｃａｎ領域４４ａ内となる。

まず、図１１に示すように検索領域を補正評価用の基本単位となる小区画（補正用小区画１１０）に分割する。一区画のサイズは下式（１），（２）により求める。
Ｗ＝（Ｗｉｄｔｈ／Ｎ）×（Ｍａｇ１／Ｍａｇ２） （１）
Ｈ＝（Ｈｉｇｈｔ／Ｎ）×（Ｍａｇ１／Ｍａｇ２） （２）

ここで、
Ｗ：小区画の横方向（Ｘ方向）の画素数、
Ｈ：小区画の縦方向（Ｙ方向）の画素数、
Ｗｉｄｔｈ：ＴＶカメラ３の横方向（Ｘ方向）の画素数、
Ｈｉｇｈｔ：ＴＶカメラ３の縦方向（Ｙ方向）の画素数、
Ｎ：シェーディング補正処理で用いる撮像画像１視野の分割数、
Ｍａｇ１：既存ＶＳ画像作成時に使用した対物レンズの倍率、
Ｍａｇ２：作成予定のＶＳ画像作成時に使用する対物レンズの倍率
である。

例えば、カメラ２４としてＸ方向およびＹ方向が１２００画素のカメラを使用した場合は、Ｗ＝Ｈ＝（１２００／３）×（２／１０）＝８０画素となる。そして、この補正用小区画１１０内の既存ＶＳ画像の輝度値Ｙが所定の範囲内（最小値≦Ｙ≦最大値）となる値が所定値（例えば、９０％）以上ある場合に、校正用画像部位として適格と判断される。

本実施形態では、シェーディング補正データ取得方式が「２視野画像方式」なので図７に示すように、３×３の領域で適格区画のパターン（網掛表示部）のいずれかを有する部位が検索領域内に存在するか否かを、検索領域の左上から右下に向かって、一区画単位でシフトしながら検索することにより、校正用画像取得部位として適切な標本領域４２上の部位を求める。
そして、適切な部位が存在しない場合は、図２に示す全体ＶＳ画像内の標本領域４２内で上記検索処理範囲を除いた領域を検索する。検索処理については同じなので省略する。

続いて、蛍光観察の場合について説明する。
例えば、蛍光標本において、図２に示すＳｃａｎ領域４４ｂの高精細ＶＳ画像を生成する場合で、同一観察法で生成済みのＳｃａｎ領域４４ａの高精細ＶＳ画像を利用する場合である。すなわち、観察法を蛍光として１０倍の対物レンズを用いてＳｃａｎ領域４４ａの高精細ＶＳ画像を作成し、同一観察法で４０倍の対物レンズを用いてＳｃａｎ領域４４ｂの高精細ＶＳ画像を作成する場合である。

本実施形態では観察法が蛍光なので、シェーディング補正データ取得方式として「中央１／Ｎ方式」が選択され、検索する優先領域はＳｃａｎ領域４４ａ内でＳｃａｎ領域４４ｂを除いた領域となる。
小区画のサイズは、前述の式を当てはめてＷ＝Ｈ＝（１２００／３）×（１０／４０）＝１００画素となる。そして、検索は、１区画のみの適格領域を求めればよいので、「２視野画像方式」と比較すると検索方法は単純であり、説明は省略する。

以上、詳述したように、本実施形態によれば、既存のＶＳ画像を用いて、校正用画像を取得するための標本部位を決定することができる。
なお、小区画領域を式（１），（２）を用いて求めたが、さらに細分化することにより検索精度を高めることが可能である。例えば、蛍光の例で、小区画サイズを更に１／４の２５画素に設定し、４×４の領域全体で評価する。検索する際は、１区画送りになるので、より精度よく適格部位を検索することが可能となる。また、「２視野画像方式」でも同様に小区画領域を細分化することが可能である。

また、シェーディング補正データ取得方式が「中央１／Ｎ方式」の場合に、標本Ａおよび観察法の特性により適格領域が限定されてくるので、その場合のみ小区画領域を細分化することにしてもよい。
また、蛍光観察では、標本Ａの褪色を考慮すると、校正用画像の取得回数が少ない「２視野画像方式」が望ましい。そこで、最初に「２視野画像方式」で領域検索して適格部位が見つかった場合には、「２視野画像方式」で校正用の画像データを取得して補正ゲインデータを算出することにしてもよい。

また、適格部位候補を複数求め、例えば、分散が一番小さい候補部位に決定することも可能である。
また、「２視野画像方式」に合致する方法で最初にＶＳ画像上の検索を実行して適格領域を求められなかった場合には、「中央１／Ｎ方式」に合致する方法でＶＳ画像上を再検索することにしてもよい。

また、蛍光観察では、標本Ａの褪色を考慮すると、同一部位から繰り返し校正用の画像データを取得すると褪色による精度の劣化を招く場合がある。したがって、一度校正用として取得した標本Ａ上の領域（基準視野画像５００とその周辺領域の近傍２視野領域）は、検索対象外とすることにしてもよい。

＜プレスキャン方式＞
校正用画像取得部位を決定するための第二の方法である、プレスキャン方式について、図１２を用いて以下に説明する。
プレスキャン方式は、任意に選択した複数部位から選択した標本Ａ上の領域において作成予定のＶＳ画像の取得条件で標本画像をサンプリング取得した画像を基に、校正用画像を取得するための標本部位を決定するものであり、どの画像を用いて領域検索を行うかが、前述の既存ＶＳ画像利用方式と基本的に異なる。観察法に基づいたシェーディング補正データ取得方式の決定は同様に行われる。

そして、どの部位からサンプリングするかについては、図９の校正用画像取得処理フローの中で、フォーカスマップ実測部位に該当する標本部位の撮像画像を取得することを説明済みである。

まず、取得したサンプリング画像（撮像視野１０１が示す領域に相当）を縦方向および横方向に１／Ｎの小区画（補正用小区画１１０）に分割する。ここでは、３×３の９区画に分割する場合を例示する。そして、サンプリング画像内を既存ＶＳ画像利用方式と同じ方法で検索し、適格領域が存在するか否かを調べる。なお、既存ＶＳ画像利用方式の場合と同様に補正用小区画１１０を更に細分化して、検索精度を高めることにしてもよい。

そして、取得した全てのサンプリング画像に対して同様な検索処理を行い、最適な校正用画像取得用の標本部位を決定する。そして、シェーディング補正データ取得方式に基づいた校正用画像の取得を行い、補正ゲインデータを作成する。
なお、蛍光観察の場合は、「中央１／Ｎ方式」が選択され、校正用画像取得部位を含め近傍領域でＮ×Ｎ回（本実施形態では９回）の画像取得が行われるので、蛍光の褪色が影響する場合がある。そこで、図８（Ａ）〜（Ｉ）に示すように中央１カ所＋その８近傍部位で画像を取得するのではなく、校正用画像の基準視野画像５００を取得する部位を複数に分散することにより、同一標本部位への励起光照射時間を削減し、退色の影響を軽減することが出来る。

例えば、図１２中に示す符号Ａ〜Ｉの８領域が、サンプリング画像の評価結果で適格領域が存在すると判定された（説明を簡単にするために、補正用小区画Ｅ’が適格と判断され、基準視野画像５００として選択された）場合を例にとって説明する。

符号Ａ〜Ｉに示す領域の各サンプル取得画像が基準視野画像５００となり、符号Ａ〜Ｉに示す領域で各々異なる周辺視野画像５０１、すなわち、図６（Ｆ）の区画内記載のアルファベットに該当する補正ゲインデータを取得すべく対応する位置関係にステージを移動して校正用画像を取得し、補正ゲインデータを算出する。

図１２中のＡ内の適格部位Ｅ’を中央座標とした基準画像（サンプリング画像を流用）と図８（Ｉ）の相対位置関係を有する周辺視野画像５０１を取得することにより、図６（Ｆ）のＡ区画の補正ゲインデータを算出する。同様な処理を符号Ｂ〜Ｉに示す領域に対して行い、中央区画Ｅに所定の値（値１）を設定すれば、符号Ａ〜Ｉの全区間の補正ゲインデータ作成が完了する。

また、蛍光観察や暗視野観察の場合に、基準視野画像５００の中央１／Ｎ区画で規定される評価領域内に、一様に発現する領域を求めることは困難な場合がある。したがって、例えばフォーカス位置抽出ポイントで取得したサンプリング画像の全てにおいて適格な領域が見つからなかった場合には、相対的に発現の高い複数の基準領域候補を抽出し、その平均をとって非発現部位を削減することにより、補正ゲインデータを作成することができる。

例えば、説明を簡略化するために、図１２中の符号Ａ，Ｄ，Ｇに示す区画の中央部が基準領域候補として算出されたとする。符号Ａ，Ｄ，Ｇに示す区画のサンプリング画像の中央評価領域の平均をとった中央領域平均画像が校正用画像部位として適格と判断された場合には、符号Ａ，Ｄ，Ｇに示す区画のそれぞれにおいて８近傍の周辺視野画像データを取得して、それらを平均した画像を用いることにより補正ゲインデータを作成することにしてもよい。

また、蛍光観察の場合には褪色の影響があり、ＶＳ画像生成範囲外の領域で校正用の画像データを取得することが望ましい。したがって、ＶＳ画像生成予定のＳｃａｎ範囲外の標本存在領域に任意の検索領域を設定し、上記同様な処理を行うことで、補正ゲインデータを作成することにしてもよい。

＜ＶＳ原画像利用方式＞
ＶＳ原画像利用方式は、基本的にプレスキャン方式と同様な処理となるので、校正用画像取得部位の決定方法についての説明は省略する。
プレスキャン方式が任意のサンプリングポイントで取得した画像を評価対象とするのに対して、ＶＳ原画像利用方式は、ＶＳ画像を作成するためにＳｃａｎ範囲内で取得した全画像が評価対象となる。したがって、サンプリングポイントの抽出が不適切なことに起因する校正用画像データ取得領域の検索エラー（適格領域が見つからない）を低減することができる。

また、本方式を用いることにより、図３のＶＳ画像構築処理フローのステップＳ１００で形成する全体ＶＳ画像をシェーディング補正することもできる。すなわち、倍率２倍の対物レンズで図２の標本サーチ範囲４１内を走査および取得した画像を基に、校正データ作成用の標本部位を決定し、校正用画像データを取得、シェーディング補正データの作成を行い、取得した倍率２倍の全体ＶＳ画像構築用の原画像のシェーディング補正を行った後、隣接画像を結合することにより、ムラの低減された全体ＶＳ画像を形成することができる。

さらに、本実施形態では、透過明視野標本または蛍光標本のいずれの場合も全体ＶＳ画像は透過明視野観察法で取得している。透過明視野標本では、背景部および標本部ともに明るい輝度情報を有するので、標本サーチ範囲４１内の任意の領域をサンプリングすることが可能となり、プレスキャン方式でシェーディング補正データを作成することも可能である。

＜応用例１：複数標本が載置された場合のシェーディング補正＞
病理診断においては、１つの検体包埋ブロックから連続的に薄切を行い、図１３に示すように１枚のスライドガラス３８上に複数の標本Ａを載置するケースがある。また、生検による小型検体の場合では、複数の包埋ブロックから薄切した標本Ａを同一スライドガラス３８上に載置して診断を効率的に行えるようにする場合もある。すなわち、異なる複数の標本Ａが１枚のスライドガラス３８上に載置されるので、それぞれの標本Ａに応じたシェーディング補正を行うことが望ましい。

そして、病理診断で用いる透過明視野病理標本（ＨＥ染色標本、特殊染色標本、免疫染色標本）は、解像力とファイル容量を考慮して倍率２０倍の対物レンズを用いてＶＳ画像が構築される場合が一般的に多く行われている。
したがって、図３に示すＶＳ画像構築処理フローのステップＳ１０４で透過明視野法を選択し、ステップＳ１１０の対物レンズ選択で倍率２０倍の対物レンズを選択する。また、ステップＳ１２０のＳｃａｎ範囲選択処理で、標本領域４２の外接矩形間に所定以上（例えば２ｍｍ以上）の距離があれば別標本として判断し、標本領域４２毎にＳｃａｎ領域を設定すれば、各々のＳｃａｎ領域でＶＳ画像を構築することになる。透過明視野観察の場合には、Ｓｃａｎ領域内で優先的にシェーディング補正データが算出されるので、各々の標本Ａに応じたムラ補正が自動に行えるようになる。

そして、特許文献３にはスライド搬送装置を用いて複数の病理標本のＶＳ画像ファイルを自動で連続的に作成する方法が開示されており、スライド搬送装置と組み合わせることにより、病理診断で日常的に検鏡する透過明視野病理標本（ＨＥ染色標本、特殊染色標本、免疫染色標本）のムラを適切に補正したＶＳ画像ファイルの連続自動生成が可能となる。

＜応用実施例２：補正領域分割＞
図１４（Ａ）に例示するような標本サーチ範囲４１をほぼ占有するような大きな標本Ａの全体について高倍率でＶＳ画像を作成する場合、すなわち、所定値以上の高さまたは幅を有するＳｃａｎ領域のＶＳ画像を作成する場合には、電動ステージ２の移動量が大きくなることで光軸と標本Ａとの直交度が変化することに起因するムラが生じる場合がある。

その場合は、図１４（Ｂ）に示すように、所定値以下の領域サイズとなるようにＳｃａｎ領域４４を複数区画に分割し、各区画単位でシェーディング補正データの取得とシェーディング補正を行うことにより、標本サイズに起因するムラを補正したＶＳ画像の作成が可能となる。

また、フォーカスマップ作成時の場合と同様に、任意の複数の標本Ａ上の部位でシェーディング補正データを求め、シェーディング補正データを算出していない領域は、既に取得された近傍の領域のシェーディング補正データを用いて補間演算により求めることにしてもよい。

例えば、図１５に示すように、近傍の実測区画の補正ゲインデータＧｉ、演算対象区画からの距離をＬｉとすると、演算対象区画の補正ゲインデータＧは、
Ｇ＝Σ（Ｇｉ／Ｌｉ）／Σ（１／Ｌｉ)
により求められる。

１ 顕微鏡システム
２ 電動ステージ（移動手段）
３ａ，３ｂ 対物レンズ
７ レボルバ（倍率変更手段）
２４ カメラ（撮像手段）
３０ ホストシステム（ＶＳ画像生成手段、補正用領域探索手段、補正データ生成手段、シェーディング補正手段、高倍ＶＳ画像領域指定手段）
４２ 標本領域
Ａ 標本

Claims (14)

1. 標本からの光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された光を撮影する撮像手段と、
   前記標本と前記対物レンズとを光軸に直交する方向に相対的に移動させる移動手段と、
   該移動手段により前記対物レンズと前記標本とを相対的に移動させつつ前記撮像手段により取得された複数枚の顕微鏡画像群を相互に結合してなるバーチャルスライド画像を生成するＶＳ画像生成手段と、
   シェーディング補正データ作成用の補正用画像を取得する補正用領域を探索する補正用領域探索手段と、
   該補正用領域探索手段によって探索された前記補正用領域について前記撮像手段により補正用画像を取得させ、取得された補正用画像に基づいてシェーディング補正データを生成する補正データ生成手段と、
   該補正データ生成手段により生成されたシェーディング補正データを用いて、前記顕微鏡画像のシェーディングを補正するシェーディング補正手段とを備える顕微鏡システム。
2. 前記補正データ生成手段が、前記ＶＳ画像生成手段による前記バーチャルスライド画像が生成される都度に、シェーディング補正データを生成する請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 倍率を切り替える倍率変更手段と、
   低倍率の顕微鏡画像群から生成された低倍バーチャルスライド画像を用いて、より高倍率の高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域を指定する高倍ＶＳ画像領域指定手段とを備え、
   前記ＶＳ画像生成手段が、前記高倍ＶＳ画像領域指定手段により指定された標本領域について、前記高倍バーチャルスライド画像を生成する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像から前記高倍バーチャルスライド画像のシェーディングを補正するための前記補正用領域を探索する請求項３に記載の顕微鏡システム。
5. 前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像から複数の候補領域を決定し、決定された複数の前記候補領域について、前記高倍バーチャルスライド画像用の顕微鏡画像を取得する倍率で前記撮像手段により画像を取得させ、取得された画像からシェーディング補正に適した画像情報を有する前記候補領域を前記補正用領域として選択する請求項３に記載の顕微鏡システム。
6. 前記補正用領域探索手段が、前記低倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域内、かつ、前記高倍バーチャルスライド画像を構築する標本領域外の領域から、前記高倍バーチャルスライド画像のシェーディングを補正するための前記補正用領域を探索する請求項３から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡システム。
7. 前記補正用領域探索手段が、バーチャルスライド画像生成用の顕微鏡画像群からシェーディング補正に適した画像情報を有する標本領域を前記補正用領域として選択する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
8. 前記補正データ生成手段が、前記補正用領域内を複数区画に分割し、各区画の大きさ分だけずらして取得された複数の補正用画像間で、異なる２区画間の輝度値の比率によりシェーディング補正データを生成する請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡システム。
9. 前記補正データ生成手段は、各前記区画の輝度値が所定の閾値より大きいときに、取得する補正用画像の数がより少ないシェーディング補正データの生成方式を選択する請求項８に記載の顕微鏡システム。
10. 前記補正データ生成手段が、観察法に応じて前記生成方式を選択する請求項９に記載の顕微鏡システム。
11. 前記高倍ＶＳ画像領域指定手段が、前記低倍バーチャルスライド画像を用いて、高倍バーチャルスライド画像を構築する複数の標本領域を指定し、
    前記シェーディング補正手段が、前記標本領域毎に、前記顕微鏡画像のシェーディングを補正する請求項３に記載の顕微鏡システム。
12. 前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、
    前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域において、異なる区画のシェーディング補正部分データを生成し、生成されたシェーディング補正部分データを組み合わせてシェーディング補正データを生成する請求項８に記載の顕微鏡システム。
13. 前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、
    前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域についてそれぞれ取得された補正用画像の輝度値を平均して得られた複数の平均補正用画像間で、異なる２区画間の輝度値の比率によりシェーディング補正データを生成する請求項８に記載の顕微鏡システム。
14. 前記補正用領域探索手段が、複数の前記補正用領域を探索し、
    前記補正データ生成手段が、探索された複数の前記補正用領域についてそれぞれシェーディング補正データを生成し、該シェーディング補正データが生成されていない標本領域については、近傍の補正用領域との距離に基づいて補間することによりシェーディング補正データを生成する請求項８に記載の顕微鏡システム。

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