JP2015524790A - ケモカイン受容体結合性ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに特異的に結合するポリペプチド、特にＣＸＣＲ２からのシグナル伝達をモジュレートすることが可能なポリペプチドに関する。さらに本発明は、本発明のポリペプチドを発現することが可能な核酸、ベクターおよび宿主細胞、ポリペプチドを含む医薬組成物、ならびにＣＸＣＲ２の異常な機能が関与する疾患の処置のための前記ポリペプチドおよび組成物の使用に関する。

Description

本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに特異的に結合するポリペプチド、特にＣＸＣＲ２からのシグナル伝達をモジュレートすることが可能なポリペプチドに関する。さらに本発明は、本発明のポリペプチドを発現することが可能な核酸、ベクターおよび宿主細胞、ポリペプチドを含む医薬組成物、ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＣＸＣＲ２の異常な機能が関与する他の疾患の処置のための前記ポリペプチドおよび組成物の使用に関する。
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、ほとんどの場合進行性であり、有害粒子への肺の異常な炎症性応答と関連し、気道機能の減退をもたらす肺実質の破壊を伴う、空気流制限を特徴とする様々な障害を記載するために用いられる用語である（Barnes PJら、2003、Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms。Eur. Respir J、22、672〜688頁；Barnes PJら、2004、Mediators of chronic obstructive pulmonary disease。Pharmacol. Rev. 56、515〜548頁）。遺伝的および環境因子がＣＯＰＤの発達に寄与するが、喫煙が最も重要な単一の原因であり、肺機能の進行性の減退につながる再発性の肺感染を伴う。禁煙は、早期に適用される場合だけ疾患の進行を低減し、かなりの症状が続発した後はほとんど効果がない。喘息、心血管疾患、うつ病および筋肉消耗などのいくつかの共存症が、ＣＯＰＤと関連する（Mannino DMおよびBuist S、2007 Global burden of COPD: risk factors, prevalence and future trends。Lancet、370、765〜773頁）。
ケモカインは走化因子の中で優位を占め、したがって、ＣＯＰＤ肺の慢性炎症および急性増悪の間のそのさらなる増幅を統制することにおいて鍵となる役割を有する。ケモカインＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＧＲＯα（ＣＸＣＬ１）およびＥＮＡ−７８（ＣＸＣＬ５）の生物活性は、白血球および体全体の多くの他の細胞型に存在する、細胞表面受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の２つの集団によって媒介される。白血球の移動は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、β、γ、ＥＮＡ７８およびＧＣＰ−２を含むいくつかのリガンドに結合するＣＸＣＲ２を通して主に媒介される。対照的に、ＣＸＣＲ１はＩＬ−８によって選択的に、およびより少ない程度でＧＣＰ−２によって活性化される。ヒト好中球の化学走性がｉｎ ｖｉｖｏで一方または両方の受容体によって媒介されるかどうかは、不明なままである。
ＣＸＣＲ２はアミノ酸レベルでＣＸＣＲ１と７８％の相同性を共有し、両受容体は異なる分布パターンで好中球の上に存在する。ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ、単球、肥満細胞、上皮、内皮、平滑筋および中枢神経系での多数の細胞型を含む様々な細胞および組織の上でのＣＸＣＲ２の発現は、この受容体が、構成的条件下ならびにいくつかの急性および慢性疾患の病態生理の両方で幅広い機能的役割を有することができることを示唆する。ＣＸＣＲ２活性化はＧｉファミリーのグアニンヌクレオチド結合性タンパク質との受容体結合を刺激し、これは、細胞内のリン酸イノシトールの放出、細胞内Ｃａ２＋の増加および、ＥＲＫ１／２依存性機構による、ケモカイン勾配への誘導細胞移動と関連する細胞内タンパク質のリン酸化を次に刺激する。活性化されると、ＣＸＣＲ２はリン酸化され、アレスチン／ダイナミン依存性機構を通して速やかに内在化され、受容体脱感作をもたらす。この過程は他のほとんどのＧＰＣＲで観察されるものに類似しているが、アゴニストによって誘導されるＣＸＣＲ２の内在化の速度および程度は、ＣＸＣＲ１で見られるものより大きい（Richardson RM、Pridgen BC、Haribabu B、Ali H、Synderman R。1998 Differential cross-regualtion of the human chemokine receptors CXCR1 and CXCR2。Evidence for time-dependent signal generation。J Biol. Chem、273、23830〜23836頁）。
ＩＬ−８は、ＣＯＰＤでの好中球性炎症の媒介物として長く関連づけられている（Keatings VMら、1996、Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma。Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153、530〜534頁；Yamamoto Cら1997 Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8。Chest、112、505〜510頁）。ＣＯＰＤを有する患者からの気管支気道、小気道および肺実質の生検では、Ｔ細胞の浸潤および好中球数の増加が、特に気道内腔にある（Hogg JCら2004、The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease。N. Eng. J. Med. 350、2645〜2653頁）。好中球はＣＯＰＤを有する患者の肺で増加し、これは疾患の重症度と相関する（Keatings VMら、1996、Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma。Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153、530〜534頁）。さらに、ＴＮＦαのレベルはＣＯＰＤを有する患者の痰で上昇し、これは気道上皮細胞からＩＬ−８を誘導する（Keatings）。ＧＲＯα濃度は、正常な喫煙者および非喫煙者と比較して、ＣＯＰＤを有する患者の誘導された痰および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液で著しく上がる（Traves SLら2002、Increased levels of the chemokines GROα and MCP-1 in sputum samples from patients with COPD。Thorax、57、50〜595頁；Pesci A.ら1998、Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with COPD。Eur Respir J. 12、380〜386頁）。ＧＲＯαはＴＮＦα刺激に応じて肺胞マクロファージおよび気道上皮細胞によって分泌され、好中球および単球に化学走性であるＣＸＣＲ２を選択的に活性化する。ＣＯＰＤ患者でＧＲＯαへの単球の化学走性応答の増加があり、それは、これらの細胞でのＣＸＣＲ２の増加する代謝回転または再利用に関連しているかもしれない（Traves SLら、2004、Specific CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD: a role for CXCR2、J Leukoc. Biol. 76、441〜450頁）。ＣＯＰＤ患者では、気道での好中球数の増加を特徴とするウイルスおよび細菌性の肺感染は、重度の増悪をしばしばもたらす（Wedzicha JA、Seemungal TA.、2007、COPD exacerbations: defining their cause and prevention、Lancet 370（9589）：786〜96頁）。ＣＯＰＤの急性の重度の増悪患者の気管支生検では、ＥＮＡ−７８、ＩＬ−８およびＣＸＣＲ２のｍＲＮＡ発現量が有意に増加し（Qiu Yら、2003、Biopsy neutrophilia, neutrophil chemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease。Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 168、968〜975頁）、痰は好中球数が増加し（Bathoorn E、Liesker JJw、Postma DSら、Change in inflammation in out-patient COPD patients from stable phase to a subsequent exacerbation、（2009）Int J COPD、4（1）：101〜9頁）、ＣＯＰＤとこの疾患の重度の増悪の両方でのこの受容体の潜在的役割を示唆している。ＣＸＣＲ２のｍＲＮＡの発現増加は、気管支生検材料に存在し、それは組織好中球の存在と相関する（Qiu2003）。ＥＮＡ−７８は主に上皮細胞に由来し、ＣＯＰＤの増悪の間に上皮細胞ではＥＮＡ−７８発現の顕著な増加がある（Qiu2003）。ＩＬ−８、ＧＲＯαおよびＥＮＡ−７８の濃度はＣＯＰＤ気道で増加し、全ての３つのリガンドはＣＸＣＲ２を通してシグナル伝達するので、選択的アンタゴニストでこの共通受容体をブロックすることは、この疾患で有効な抗炎症性戦略になるであろう。
ＣＯＰＤは、遅く、次第に進展し、疾患の進行は、最大努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）の肺活量測定などの肺機能試験で伝統的に推定される。５０％未満の予測ＦＥＶ１を有する患者は、重度であると分類される。軽度から中等度の患者のわずか５％と比較して、重度のＣＯＰＤ患者のほぼ３５％は１２年以内にその疾患で死亡するので、肺機能は死亡率と緊密に関係する。ＣＯＰＤは、世界で第４の主要な死因であり（World Health Organization （WHO）、World Health Report、Geneva、2000。URL: http://www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdfから入手できる）、来たるべき数十年でその発生率および死亡率のさらなる増加を予測することができる（Lopez AD、Shibuya K、Rao Cら、2006、Chronic obstructive pulmonary disease: current burden and future projections、Eur Respir J、27（2）、397〜412頁）。増悪は不健康のらせん降下の鍵となる因子であり、大部分は大多数のＣＯＰＤ入院の原因となる（BTS（British Thoracic Society）、2006、Burden of Lung Disease Report、2版、http://www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeon of_lung_disease2007.pdf）。平均の年間レートは、症状で規定される憎悪では２．３、健康管理で規定される増悪では２．８であった（O'Reilly JF、Williams AE、Holt Kら、2006、Prim Care Respir J. 15（6）：346〜53頁）。患者の増悪のより早期の診断および向上した管理ならびに向上した予防は、既に引き伸ばされた資源にこれらの入院が掛ける緊張を低減するのを助ける。ＣＯＰＤのための利用可能な処置は主に待期的であり、疾患と関連する肺機能の減退または気道の進行性の破壊を止める、利用可能な療法はない。短時間作用性および持続性のβアドレナリン作用性気管支拡張剤、吸入抗コリン作働性薬（ムスカリン様アンタゴニスト）および吸入コルチコステロイドなどの現在の処置は、疾患の症状および増悪を処置するために用いられる。現在のコルチコステロイド治療での主要な限界は、患者がコルチコステロイドへの抵抗性を示し、これらの薬物の抗炎症性作用を不活性化するにつれて、それらが無効にさせられるということである。明らかに、ＣＯＰＤの進行を予防する新規薬物への満たされていない大きな医学的必要性がなおある。ＣＯＰＤで取引する炎症性細胞は複数のケモカインによって統制されるので、ケモカイン受容体アンタゴニストはＣＯＰＤ療法の魅力的なアプローチであり、したがって、ＬＭＷアンタゴニストによるケモカイン受容体の遮断はこの疾患で有効な抗炎症性戦略であるかもしれない。ＣＯＰＤの重要な特色は、正常な喫煙者で見られる炎症性応答の増幅であるので、療法の目的は、炎症性細胞浸潤を完全に抑制することではなく、ＣＯＰＤのない正常な喫煙者で見られるレベルまでそれを低減することである。特異的に作用することによって、抗ＣＸＣＲ２はステロイドと関連する一般的な免疫抑制を回避しよう−ＣＸＣＲ１活性の保存は、ＣＯＰＤおよびＣＦでの宿主防御にとって重要なベースライン好中球活性化を可能にする。ほとんどのＣＯＰＤ薬は、全身の副作用を低減するために現在吸入によって投与されるが、ケモカインアンタゴニストは循環炎症性細胞で発現される受容体に作用するので、全身投与が最適であろう。ＣＯＰＤで影響を受ける小気道および肺実質に到達するために、これは効率的な方法を提供するだろう。
ケモカイン受容体は、サイトカインおよびインターロイキン受容体と対照的に、７ＴＭ−ＧＰＣＲの高度に「ドラッガブル（druggable）」なスーパーファミリーに属する。これにもかかわらず、強力なアンタゴニストを見出す初期の試みは、小さなペプチドまたは生体アミンリガンドを有するＧＰＣＲでの経験に基づいて予想されたよりも多くの問題点に遭遇した。ケモカイン受容体アンタゴニストに重点を置いた小分子薬物発見プログラムに関する努力は、ケモカイン受容体の特異体質、およびアンタゴニストとして作用するために小分子に要求される構成要素を次第に理解し始めた。興味深いことに、同定された基本的に異なる化学系列の数によって表される、ＣＣ−ケモカイン受容体アンタゴニストの構造多様性は、ＣＸＣ−ケモカイン受容体アンタゴニストよりかなり高く、そのことは、アンタゴニストを見出す相対的困難度が２つのクラスの受容体の間で異なることを示唆する。
一般のケモカイン受容体は、拮抗するのが困難である標的であることが証明され、強力で選択的なＣＸＣＲ２アンタゴニストを同定するのに大きな努力が払われている。最初の低分子量ＣＸＣＲ２アンタゴニストは１９９８年に記載され、その後、いくつかの非競合性アロステリックＣＸＣＲ２アンタゴニストが開発され、そのいくつかは現在臨床試験に進んでいる。それにもかかわらず、ＣＸＣＲ２機能のより優れ、より強力なアンタゴニストへの必要性が明らかにある。
免疫グロブリンクラスの分子は、この１０年前後、それらの臨床利用で大きな拡張を目にしている。標的へのそれらの特異性および組換え技術を用いてそれらを操作する能力は、疾患のための高度に誘導された治療法を開発するための大きな可能性を提供する。好適な操作のために、従来の４鎖抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片、単一ドメイン抗体（Ｄ（ａｂ）ｓ）、単一鎖Ｆｖｓおよびナノボディを含め、多くの種類の免疫グロブリン分子および改変免疫グロブリン分子が潜在的に利用可能である。これらは、ＣＸＣＲ２の少なくとも２つのエピトープに対するものであるように構築されるポリペプチドに関する本発明に関連して、本明細書でさらに議論される。
したがって、本発明の目的は、慢性閉塞性肺障害すなわちＣＯＰＤ、およびケモカイン受容体ＣＸＣＲ２の異常な機能に関連する他の疾患の予防または処置の新しい手段を提供することである。
本発明のさらなる目的は、免疫療法である、ＣＯＰＤ、およびＣＸＣＲ２の異常な機能に関連する他の疾患の処置または予防の手段を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＣＸＣＲ２シグナル伝達のアンタゴニストである、免疫グロブリンＣＤＲを含むポリペプチドを提供することである。
本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに結合する、２つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドに関し、前記第１の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第１のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、前記第２の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第２のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、ポリペプチドのＣ末端は、抗原結合ドメインの配列への、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基の伸長部を含み；第１の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第１のエピトープを認識し、第２の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第２のエピトープを認識する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合することができる第１の抗原結合ドメイン、および前記線状ペプチドに結合不能であるか、またはより低い親和性で結合する第２の抗原結合ドメインを含む。配列番号７は、ヒトＣＸＣＲ２のＮ末端の最初の１９アミノ酸である。本発明の好ましいポリペプチドは、二パラトープ性である。本明細書で用いるように、用語「二パラトープ性」は、ポリペプチドが、同じタンパク質標的の上の２つの異なるエピトープを認識する２つの抗原結合ドメインを含むことを意味する。しかし、多パラトープ性、すなわち同じ標的タンパク質上の３つ、４つまたはそれ以上のエピトープを認識する抗原結合ドメインを含有するポリペプチドは、二パラトープ性または多パラトープ性であり、かつ多価性、すなわち１つまたは複数の他の標的タンパク質を認識する抗原結合ドメインも有するポリペプチドと同様に、本発明の範囲に包含される。
本発明の好ましいポリペプチドでは、第１の抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列、および第２の抗原結合ドメインを含むアミノ酸配列は、リンカー領域で連結される。本明細書でさらに詳細に議論されるように、リンカーは免疫グロブリンに由来するものであってもそうでなくてもよいが、好ましくはペプチドである。
ラクダ科動物から入手できる種類の重鎖だけの抗体からの、アミノ酸のＶＨＨ配列またはその断片もしくは変異体を有する免疫グロブリンの単一可変ドメインは、代わりに「ＶＨＨドメイン」もしくはその断片と、または「Ｎａｎｏｂｏｄｙ」（ナノボディ）と本明細書で呼ぶことができる。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびＮａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である点に注意されたい。
本発明のポリペプチドでは、各抗原結合ドメインは、本明細書に規定される少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つまたは３つのＣＤＲを含む。本発明の好ましいポリペプチドでは、免疫グロブリンの単一可変ドメインの好ましい構造は、ＶＨＨドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｙのそれであり、それは以下の構造：
ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ
を有し、式中、ＣＤＲおよびＦＲは、本明細書でさらに規定される通りである。
本発明による好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、以下の構造：
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−−リンカー−−ＨＬＥ−ＥＸＴ
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
・ ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
の１つを有し、式中、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第１の抗原結合ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第２の抗原ドメインを含み、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第２の抗原ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第１の抗原ドメインを含み、ＨＬＥはｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加を提供する結合単位であり、ＥＸＴは少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基のＣ末端伸長部である。
上の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙの断片または変異体、例えばＣＤＲおよびＦＲがラクダ科動物に由来する実施形態、またはＦＲのより多くの１つが少なくとも１つのヒト化置換を有し、好ましくは完全にヒト化される実施形態は、本発明によって包含される。
本発明による特に好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、本明細書において１６３Ｄ２／１２７Ｄ１、１６３Ｅ３／１２７Ｄ１、１６３Ｅ３／５４Ｂ１２、１６３Ｄ２／５４Ｂ１２、２Ｂ２／１６３Ｅ３、２Ｂ２／１６３Ｄ２、９７Ａ９／２Ｂ２および９７Ａ９／５４Ｂ１２と命名され、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含むＣ末端伸長部をさらに有し、そのアミノ酸配列を表１３に示すもの、ならびに、特に、ＦＲが、本明細書に規定される、例えば表３２の構成成分Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのために示すような配列最適化アミノ酸置換を含むその変異体である。
本発明によるさらなる特に好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは表３３に示すものであり、それは、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含むＣ末端伸長部をさらに有する。
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１（ＣＸＣＲ２）のアミノ酸Ｆ１１、Ｆ１４およびＷ１５を含むエピトープに結合する。本発明の好ましい二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性ナノボディでは、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＣＸＣＲ２の外部ループ中のエピトープに結合する（配列番号１のアミノ酸残基１０６〜１２０、１８４〜２０８および２７４〜２９４）。本発明の一実施形態では、前記エピトープは立体構造である。本発明の一実施形態では、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸残基Ｗ１１２、Ｇ１１５、Ｉ２８２およびＴ２８５を含む。
本発明は、本発明による任意のポリペプチドをコードする核酸分子ならびにその断片をコードする核酸、例えば、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの中に含まれる個々のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓをコードする核酸も包含する。本発明の核酸を含むベクターおよび前記ベクターを含み、本発明によるポリペプチドを発現することが可能である宿主細胞も、本発明の中に包含される。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされる本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明のポリペプチドは、ＣＸＣＲ２の活性をブロックする、阻害する、または低減することができるので、それらはＣＸＣＲ２からの異常なシグナル伝達が役割を果たす疾患の処置のために有益である。そのような疾患には、アテローム硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管形成、多発性硬化症、乾癬、壊疽性膿皮症、加齢性黄斑変性疾患、目のベーチェット病、ブドウ膜炎、非小細胞がん腫、結腸がん、膵がん、食道がん、黒色腫、肝細胞がんまたは虚血灌流損傷が含まれてよい。そのような疾患には、呼吸器官の状態、例えば、嚢胞性線維症、喘息、重度の喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、好中球性喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成を含めることもできる。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、喘息、特に重度の喘息および喘息の増悪を処置するために用いられる。
特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、白血球の移動、特に肺実質への好中球の移動、および以降のその散乱を特徴とする、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）またはＣＯＰＤの増悪を処置するために用いられ、その移動はＣＸＣＲ２シグナル伝達を通して媒介される。ＣＸＣＲ２活性をブロックする、阻害する、または低減する本発明のポリペプチドの能力は、それらをこの疾患の予防または処置で用いるための優れた候補にする。
ヒトの処置のためには、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに特異的に結合することが好ましい。しかし、前記ポリペプチドが霊長類のＣＸＣＲ２、特にカニクイザルのＣＸＣＲ２と正しく交差反応することができる場合は、前記サルで毒性試験を実行できることが好ましい。獣医学的使用が企図される場合は、本発明のポリペプチドは、他の種からのＣＸＣＲ２相同体に対するものであるか、またはそれに特異的に結合することができる。
本発明の他の態様は、本明細書のさらなる議論から明らかになる。
アゴニストＧｒｏ−αで刺激されたＣＨＯ−ＣＸＣＲ２膜からの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放出をブロックする本発明の２つのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙの能力を、Ｎａｎｏｂｏｄｙの濃度を増加させて測定するときに得られる応答曲線を示す図である。図１ａは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ ５４Ｂ１２（表９の配列番号９０）の結果を示し、図１ｂは、Ｎａｎｏｂｄｙ １６３Ｅ３（表９の配列番号４２）の結果を示し、図１ｃは、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ ５４Ｂ１２／１６３Ｅ３（表１３の配列番号６８）の結果を示す。 アゴニストＧｒｏ−αで刺激されたＣＨＯ−ＣＸＣＲ２膜からの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放出をブロックする本発明の２つのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙの能力を、Ｎａｎｏｂｏｄｙの濃度を増加させて測定するときに得られる応答曲線を示す図である。図１ａは、Ｎａｎｏｂｏｄｙ ５４Ｂ１２（表９の配列番号９０）の結果を示し、図１ｂは、Ｎａｎｏｂｄｙ １６３Ｅ３（表９の配列番号４２）の結果を示し、図１ｃは、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ ５４Ｂ１２／１６３Ｅ３（表１３の配列番号６８）の結果を示す。 ＧＲＯ−αの阻害による、２つの代表的ナノボディ１２７Ｄ１（図２ａ）、１６３Ｅ３（図２ｂ）および二パラトープ性１６３Ｅ−３５ＧＳ−１２７Ｄ１（図２ｃ）の効力および効能をＧＲＯ−αの様々な濃度でのナノボディ濃度に対する阻害％として示す図である。１２７Ｄ１は強力であるように見られるが、効果的でなく、他方、１６３Ｅ３はより低い効力を有するが、１２７Ｄ１より効果的である。２つの結合分子を組み合わせると、生じる二パラトープ性結合分子は強力であり、かつ効果的であることが示される。 ＧＲＯ−αの阻害による、２つの代表的ナノボディ１２７Ｄ１（図２ａ）、１６３Ｅ３（図２ｂ）および二パラトープ性１６３Ｅ−３５ＧＳ−１２７Ｄ１（図２ｃ）の効力および効能をＧＲＯ−αの様々な濃度でのナノボディ濃度に対する阻害％として示す図である。１２７Ｄ１は強力であるように見られるが、効果的でなく、他方、１６３Ｅ３はより低い効力を有するが、１２７Ｄ１より効果的である。２つの結合分子を組み合わせると、生じる二パラトープ性結合分子は強力であり、かつ効果的であることが示される。 下のパネルに表すように、本発明の代表的ポリペプチドを、ＣＸＣＲ１に勝るＣＸＣＲ２への特異性について試験した結果を示す図である。
試験した、精製された一価の抗ＣＸＣＲ２（ＡまたはＢ）または二パラトープ性ナノボディは、ＧＲＯαに応じてｈＣＸＣＲ２にｎＭの効力を示したが、ｈＣＸＣＲ１受容体に対しては、それらは、ＩＬ−８によって誘導される細胞内カルシウムの放出に応じてμＭ濃度で不活性であった。
ＡＡ Ｃ末端伸長部７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡを有する二パラトープ性の半減期延長ナノボディが、抗Ｎｂ ＩｇＧ反応性を雄では５０％から２０％に、雌では６１％から１６％に有意に低減したことを示す図である。さらに、Ｃ末端伸長部７９−７６−Ａｌｂ８および７９−８６−Ａｌｂ８のないナノボディと比較したとき、Ａｌａ−Ａｌａ Ｃ末端変異体７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡおよび７９−８６−Ａｌｂ８−ＡＡは、機能的活性を変化させなかった。 ｒｈＧＲＯ−αへの一次ヒト好中球の化学走性に及ぼす抗ＣＸＣＲ２ナノボディ、７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡの作用を示す図である。カルセイン−ＡＭで標識した、単離一次ヒト好中球を、ＲＴで３０分間、抗ＣＸＣＲ２ナノボディ、７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡ（●）の様々な濃度とプレインキュベートした。次に細胞を３μｍ多重ウェル挿入断片に加え、３７℃で９０分間、受けプレートで２ｎＭのｒｈＧＲＯ−αへの化学走性を起こさせた。次に受けプレートのウェルに移動した細胞からの蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーにより、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光で測定した。７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡは、ｒｈＧＲＯ−αで刺激された化学走性を、０．２５６±０．０２ｎＭ（ｎ＝４のドナーからの平均±ＳＥＭ）のＩＣ５０値で阻害した。
定義
本明細書、実施例および請求項においては：
ａ）特に明記または規定されない限り、用いられる全ての用語は当技術分野でのそれらの通常の意味を有し、それは当業者に明らかである。例えば、以下の通りに下で指摘する標準ハンドブックが参照される。Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（2版）、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）；F. Ausubelら編、「Current protocols in molecular biology」、Green Publishing and Wiley Interscience、New York（1987）；Lewin、「Genes II」、John Wiley & Sons、New York、N.Y.、（1985）；Oldら、「Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering」、2版、University of California Press、Berkeley、CA（1981）；Roittら、「Immunology」（6版）、Mosby/Elsevier、Edinburgh（2001）；Roittら、Roitt' s Essential Immunology、10版、Blackwell Publishing、UK（2001）；およびJanewayら、「Immunobiology」（6版）、Garland Science Publishing/Churchill Livingstone、New York（2005）。
ｂ）特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」または「免疫グロブリン配列」−本明細書で重鎖抗体または従来の４鎖抗体のいずれを指すものとして用いられようと−は一般用語として用いられ、フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメインまたは断片を含む（抗原結合性のドメインまたは断片、例えばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインを含むが、それらに限定されない）。さらに、本明細書で用いられる用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」のような用語で）は、文脈がより限定された解釈を要求しない限り、関連するアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列を含むものと一般に理解するべきである。
ｃ）特に明記しない限り、用語「免疫グロブリンの単一可変ドメイン」は、それらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメインまたはＶＨもしくはＶＬドメインなどの抗原結合性のドメインまたは断片を含む一般用語として用いられる。用語抗原結合分子または抗原結合タンパク質は互換的に用いられ、用語Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを含む。免疫グロブリンの単一可変ドメインは、さらに、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり；より具体的には、それらは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であってもよい。したがって、免疫グロブリンの単一可変ドメインは、ドメイン抗体、またはドメイン抗体、単一ドメイン抗体として用いるのに適する免疫グロブリン配列、または単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」として用いるのに適する免疫グロブリン配列、またはｄＡｂもしくはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓとして用いるのに適する免疫グロブリン配列、例えば、それらに限定されないがＶＨＨ配列であってよい。本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科動物の免疫グロブリン配列を含む、異なる起源の免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリンの単一可変ドメインは、完全にヒトの、ヒト化された、さもなければ配列最適化された、またはキメラの免疫グロブリン配列を含む。免疫グロブリンの単一可変ドメインおよび免疫グロブリンの単一可変ドメインの構造は−それらに限定されずに−「ＦＲ」の４つのフレームワーク領域で構成されるとみなすことができ、それらは当技術分野で、および本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれ、そのフレームワーク領域は、３つの相補決定領域または「ＣＤＲ」によって割り込まれ、それらは当技術分野で、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。
ｄ）特に明記しない限り、具体的に詳細に記載されない全ての方法、ステップ、技術および操作は、当業者に明らかになるように、それ自体公知の様式で実施することができ、実施されてきた。再度、例えば、標準ハンドブックおよび本明細書で指摘する一般的な背景技術、およびその中のさらなる引用文献；ならびに例えば以下のレビュー、Presta、Adv. Drug Deliv. Rev. 2006、58 (5〜6): 640〜56頁；LevinおよびWeiss、Mol. Biosyst. 2006、2(1): 49〜57頁；Irvingら、J. Immunol. Methods、2001、248(1〜2)、31〜45頁；Schmitzら、Placenta、2000、21 Suppl. A、S106〜12頁；Gonzalesら、Tumour Biol.、2005、26(1)、31〜43頁を参照し、それらはタンパク質工学の技術、例えば親和性成熟ならびに免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性および他の所望の特性を向上させる他の技術を記載する。
ｅ）アミノ酸残基は、標準の三文字または一文字アミノ酸コードによって示される。
ｆ）２個以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列の対応位置のヌクレオチドに同一である第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数］で割り、［１００％］を掛けることによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の「配列同一性」の百分率を計算もしくは判定することができ、そこにおいて、第２のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチド配列と比較してヌクレオチドの各欠失、挿入、置換もしくは付加は、単一のヌクレオチド（位置）での差とみなされ、または適するコンピュータアルゴリズムもしくは技術を用いることによって「配列同一性」の百分率を計算もしくは判定することができる。２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０などの配列アラインメントのための公知のコンピュータアルゴリズムを、標準の設定で用いて計算することができる。配列同一性の程度を判定するためのいくつかの他の技術、コンピュータアルゴリズムおよび設定は、例えば、ＷＯ０４／０３７９９９、ＥＰ０９６７２８４、ＥＰ１０８５０８９、ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ９８／４９１８５およびＧＢ２３５７７６８−Ａに記載される。通常、上に概説される計算法に従って２つのヌクレオチド配列の間の「配列同一性」の百分率を判定するために、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列が「第１の」ヌクレオチド配列としてとられ、他のヌクレオチド配列が「第２の」ヌクレオチド配列としてとられる。
ｇ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列の対応位置のアミノ酸残基に同一である第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］を掛けることによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間の「配列同一性」（本明細書で、「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）の百分率を計算もしくは判定することができ、そこにおいて、第２のアミノ酸配列中の第１のアミノ酸配列と比較してアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換もしくは付加は、単一のアミノ酸残基（位置）での差、すなわち、本明細書に規定される「アミノ酸差」とみなされ、または適するコンピュータアルゴリズムもしくは技術を用いることによって「配列同一性」の百分率を計算もしくは判定することができる。上に概説される計算法に従って２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」の百分率を判定するために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列としてとられ、他のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列としてとられる。
さらに、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を判定することにおいて、下のｖ）に開示されるように、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができる。
本明細書に記載されるポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換は、Schulzら、Principles of Protein Structure、Springer-Verlag、1978、によって開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸変異の頻度分析、ChouおよびFasman、Biochemistry 13: 211頁、1974およびAdv. Enzymol.、47: 45〜149頁、1978、によって開発された構造形成潜在性の分析、ならびに、Eisenbergら、Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140〜144頁、1984；Kyte & Doolittle、J Molec. Biol. 157: 105〜132頁、1981、およびGoldmanら、Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321〜353頁、1986、によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析に基づくこともでき、全ては参照により完全に本明細書に組み込まれる。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの一次および二次構造に関しては、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造が、例えば、Desmyterら、Nature Structural Biology、3巻、9、803頁（1996）；Spinelliら、Natural Structural Biology（1996）、3、752〜757頁およびDecanniereら、Structure、7巻、4、361頁（1999）によって与えられる。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差」は、第２の配列と比較して、第１の配列の位置での単一のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指し、２つのアミノ酸配列は、１つ、２つまたはそれ以上のそのようなアミノ酸差を含有することができると理解される。
ｉ）それぞれ、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」と言われる場合、または別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列「から本質的になる」と言われる場合は、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が最初に指摘したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にそれぞれ組み込まれていることを意味することができるが、より通常、これは、最初に指摘した配列が実際に生成されたか得られた（それは、例えば本明細書に記載される任意の適する方法によることができる）方法にかかわりなく、最初に指摘したヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をそれぞれ有するひと続きのヌクレオチドまたはアミノ酸残基をその配列内にそれぞれ含むことを一般に意味する。非限定例により、本発明の二パラトープ性の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＮａｎｏｂｏｄｙがＣＤＲ配列を含むと言われる場合、これは、前記ＣＤＲ配列が本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙに組み込まれていることを意味することができるが、より通常、これは、前記二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙが生成されたか得られた方法にかかわりなく、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙが、前記ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するひと続きのアミノ酸残基をその配列内に含有することを一般に意味する。後者のアミノ酸配列が特定の生物学的または構造的機能を有する場合は、それが、最初に指摘したアミノ酸配列と本質的に同じであるか、類似しているかまたは同等である生物学的または構造的機能を好ましくは有することにも注意すべきである（言い換えると、最初に指摘したアミノ酸配列は、好ましくは、後者の配列が本質的に同じであるか、類似しているかまたは同等である生物学的または構造的機能を発揮することが可能なものである）。例えば、本発明の二パラトープ性ＮａｎｏｂｏｄｙがＣＤＲ配列またはフレームワーク配列をそれぞれ含むと言われる場合は、ＣＤＲ配列およびフレームワークは、好ましくは前記二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ中でＣＤＲ配列またはフレームワーク配列としてそれぞれ機能することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合は、最初に指摘したヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現生成物（例えばポリペプチド）に発現されるとき、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が前記発現生成物の一部を形成するものである（言い換えると、後者のヌクレオチド配列が最初に指摘したより大きなヌクレオチド配列と同じ読み枠内にあるものである）。
ｊ）核酸配列またはアミノ酸配列は、−例えば、その天然の生物供給源および／またはそれが得られた反応媒体もしくは培地と比較して−前記供給源または媒体中でそれが通常関連する少なくとも１つの他の構成成分、例えば、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的構成成分または巨大分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物もしくは軽微な構成成分からそれが分離されている場合、「本質的に単離された（形）（に）」あるとみなされる。特に、核酸配列またはアミノ酸配列は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特定すると少なくとも１００倍、および１０００倍以上まで精製されている場合は、「本質的に単離されている」とみなされる。適する技術、例えば適するクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて測定したとき、「本質的に単離された形の」核酸配列またはアミノ酸配列は、好ましくは本質的に均一である。
ｋ）本明細書で用いる用語「抗原結合ドメイン」は、少なくとも１つのＣＤＲを含み、標的の抗原決定基またはエピトープを認識する立体構造である、免疫グロブリン中のアミノ酸配列を指す。
ｌ）本明細書で互換的に用いることもできる用語「抗原決定基」および「エピトープ」は、線状立体構造であるか非線状立体構造であるかどうかにかかわらず、抗原結合ドメインによって認識される、標的ＣＸＣＲ２中のアミノ酸配列を指す。
ｍ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質（または、その少なくとも１部分、断片またはエピトープ）に（特異的に）結合することができ、それへの親和性を有し、および／またはそれへの特異性を有する本発明のポリペプチド、例えば本明細書に記載される二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはその断片は、前記抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質「に対する（「ａｇａｉｎｓｔ」または「ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ」）ものであると言われる。
ｎ）用語「特異性」は、本発明のポリペプチドの特定の抗原結合ドメインが結合することができる異なる型の抗原または抗原決定基の数を指す。ポリペプチドと関係する抗原またはエピトープの間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術も記載する、ＷＯ０８／０２００７９（参照により本明細書に組み込まれる）の５３〜５６頁に記載されるように、任意の特定の抗原／エピトープに対する抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／または結合力に基づいて判定することができる。一般的に、各抗原結合タンパク質（例えば本発明のポリペプチド）では、各抗原結合ドメインは、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）、それらの抗原／エピトープに各々独立して結合することができる。１０４モル／リットルより大きい任意のＫＤ値（または、１０４Ｍ−１より低い任意のＫＡ値）リットル／モルは、非特異的結合を示すと一般にみなされる。好ましくは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で、所望の抗原に結合する。ＣＸＣＲ２への本発明のポリペプチドの特異的結合は、それ自体公知である任意の適する方法で、例えばスキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびにそれ自体当技術分野で公知であるその異なる変形体；ならびに、本明細書で指摘する他の技術で判定することができる。当業者に明らかになるように、およびＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６頁に記載される通りに、解離定数は実際であるか見かけの解離定数であってよい。解離定数を判定するための方法は当業者に明らかとなり、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の５３〜５６頁で指摘される技術を含む。
ｏ）本発明のポリペプチド、特に本発明による二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙの半減期は、本発明のポリペプチドの血清中濃度が、例えばポリペプチドの分解および／または天然の機構によるポリペプチドのクリアランスもしくは捕捉のために、ｉｎ ｖｉｖｏで５０％低減するのに要する時間と一般に規定することができる。本発明のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、それ自体公知である任意の方法で、例えば薬物動態学的分析によって判定することができる。適する技術は当分野の技術者に明らかになり、例えば一般に、ＷＯ０８／０２００７９の５７頁の段落ｏ）に記載されている通りであってよい。ＷＯ０８／０２００７９の５７頁の中で同様に指摘されるように、半減期はｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを用いて表すことができる。例えば、下の実験の部、ならびに標準のハンドブック、例えばKenneth, Aら：Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら、Pharmacokinete analysis: A Practical Approach（1996）を参照する。「Pharmacokinetics」、M Gibaldi & D Perron、Marcel Dekkerから出版、第2改訂版（1982）も参照する。用語「半減期の上昇」または「上昇した半減期」はｔ１／２−ベータの増加を指し、ｔ１／２−アルファおよび／またはＡＵＣ、または両方の増加を伴うか伴わない。
ｐ）本発明との関連で、適するｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞またはｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイを用いて測定されるような、ＣＸＣＲ２の活性の「ブロック、低減または阻害」は、ＣＸＣＲ２の関連するか意図される生物学的活性の活性を、同じ条件下であるが本発明のポリペプチドが存在しない同じアッセイでの活性ＣＸＣＲ２活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上、ブロック、低減または阻害することを意味することができる。
当業者に明らかであるように、阻害することは、本発明のポリペプチドが存在しないこと以外は同じである条件と比較して、そのリガンドもしくは結合パートナーの１つまたは複数へのＣＸＣＲ２の親和性、結合力、特異性および／もしくは選択性の低下を成し遂げること、ならびに／またはＣＸＣＲ２が存在する媒体もしくは環境中の１つまたは複数の条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、コファクターの存在など）へのＣＸＣＲ２の感受性の低下を成し遂げること、を含むこともできる。当業者に明らかであるように、これも、関与する標的または抗原に従い、任意の適する方法でおよび／またはそれ自体公知である任意の適するアッセイを用いて判定することができる。
ｑ）本明細書で用いるように、「モジュレートする」ことは、ＣＸＣＲ２のアロステリックモジュレーション；および／またはそのリガンドの１つへのＣＸＣＲ２の結合を低減もしくは阻害すること、および／またはＣＸＣＲ２への結合に関して天然のリガンドと競合することを意味することができる。モジュレートすることは、例えば、ＣＸＣＲ２の折畳みもしくは確認に関して、またはその確認を変化させる（例えば、リガンドの結合により）か、他の（サブ）単位と会合するか、もしくは解離するその能力に関して変化を成し遂げることを含むこともできる。モジュレートすることは、例えば、他の化合物を輸送するか、他の化合物（イオンなど）のためにチャネルの役割をするＣＸＣＲ２の能力の変化を成し遂げることを含むこともできる。
本発明のポリペプチド、特に、本発明の二パラトープ性ＮａｎｏｂｏｄｉｅｓによりＣＸＣＲ２活性をモジュレートすること、特にその阻害または低減は、可逆的であっても不可逆的であってもよいが、医薬および薬理学的目的のためには、通常可逆的様式である。
ｒ）本発明のポリペプチドは、それが第２の標的またはポリペプチドに結合する親和性の少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、および最高１０，０００倍またはそれ以上である親和性（前記のように、および好適にはＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度で表される）でＣＸＣＲ２に結合するとき、第２の標的または抗原と比較してＣＸＣＲ２に「特異的」であると言われる。例えば、本発明のポリペプチドは、それが別の標的またはポリペプチドまたはそのエピトープに結合するＫＤより少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、例えば１０，０００倍小さいか、またはさらに小さいＫＤ値でＣＸＣＲ２に結合することができる。
ｓ）用語「交差ブロック」、「交差ブロックされた」および「交差ブロックする」は本明細書で互換的に用いられ、所与の標的への本発明の免疫グロブリンの他の単一可変ドメインまたはポリペプチドの結合に干渉する、免疫グロブリンの単一可変ドメインまたはポリペプチドの能力を意味する。本発明の免疫グロブリンの単一可変ドメインまたはポリペプチドが別の標的の結合に干渉することができ、したがって本発明によってそれが交差ブロックすると言うことができる程度は、競合結合アッセイを用いて判定することができる。特に適する１つの定量的交差ブロックアッセイは、標的へのそれらの結合に関して、本発明による標識された（例えば、Ｈｉｓ標識、放射または蛍光標識された）免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドと、他の結合剤の間の競合を測定するために、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡをベースとしたアプローチを用いる。実験の部は、結合分子が本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを交差ブロックするか、または交差ブロックすることが可能かどうか判定するための、適するＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ置換をベースにしたアッセイを一般に記載する。本明細書に記載される免疫グロブリン単一可変ドメインまたは他の結合剤のいずれかと一緒に、このアッセイを用いることができることが理解される。したがって一般に、本発明による交差ブロックアミノ酸配列または他の結合剤は、上の交差ブロックアッセイで標的に結合するものであり、その結果、アッセイの間、および本発明の第２のアミノ酸配列または他の結合剤の存在下で、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録される置換は、試験される潜在的交差ブロック剤（例えば他の抗体断片、ＶＨＨ、ｄＡｂまたは類似のＶＨ／ＶＬ変異体）による理論的最大置換の５０％から１００％の間にある。
ｔ）本発明によるポリペプチドは、２つの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書に規定されるように）特異的である場合は、それらの異なる抗原または抗原決定基（例えば、ヒトおよびカニクイザルなどの哺乳動物の２つの異なる種からの血清アルブミンまたはＣＸＣＲ２）に関して「交差反応性」であると言われる。
ｕ）本明細書に規定されるように、保存的アミノ酸変化とは、アミノ酸残基が、類似した化学構造で、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性に対する影響をほとんど、または本質的に有しない別のアミノ酸残基で置き換えられる、アミノ酸置換を指す。そのような保存的アミノ酸置換は、例えばＷＯ０４／０３７９９９、ＧＢ−Ａ−３３５７７６８、ＷＯ９８／４９１８５、ＷＯ００／４６３８３およびＷＯ０１／０９３００から当技術分野で周知であり、そのような置換の（好ましい）種類および／または組合せは、ＷＯ０４／０３７９９９ならびにＷＯ９８／４９１８５、およびその中のさらなる引用文献からの関係する教示に基づいて選択することができる。
そのような保存的置換は、好ましくは、以下の（ａ）〜（ｅ）群の中の１つのアミノ酸が同じ群の中の別のアミノ酸残基によって置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族の、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の、負に荷電した残基およびそれらの（無電荷）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧＩｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族、無極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＨｅからＬｅｕまたはＶａｌへ；
ＬｅｕからＨｅまたはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＨｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＨｅまたはＬｅｕへ。
ｖ）本明細書で用いるように、ＣＤＲは本発明のポリペプチドの相補性決定領域である。ＣＤＲはひと続きのアミノ酸であり、それは単独で、または１つまたは複数の他のＣＤＲと一緒に、本発明のポリペプチドが認識する抗原またはエピトープとの相補性を確立する。ＣＤＲは、特定の番号付け規則によってアミノ酸配列で識別される。本明細書の請求項および具体的記載に関しては、Ｋａｂａｔの番号付けが用いられる。
ｗ）本明細書で用いるように、ＦＲはフレームワーク領域（時にはＦＷと呼ばれる）である。フレームワーク領域は、１つまたは複数のＣＤＲに連なり、抗原またはエピトープ認識のための正しい三次元構造でそれらを支える、ひと続きのアミノ酸である。ＦＲは標的抗原またはエピトープに特異的ではないが、それらが存在する免疫グロブリン分子の種の起源またはタイプに特異的である。本明細書に詳述するように、本発明のポリペプチドでは、免疫グロブリンの供給源、例えばラクダ科動物によって適用されるフレームワーク配列と異なるように操作するために、フレームワーク領域のアミノ酸配列に範囲がある。
ｘ）本明細書で用いるように、ＣＸＣＲ２は、少なくとも白血球の表面に存在し、その天然に存在するリガンドがＧｒｏ−α、β、γ、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８またはＧＣＰ−２であってもよいサイトカイン受容体を指す。本明細書で、ＣＸＣＲ２は、起源の種に関係なくＣＸＣＲ２機能を示す任意のタンパク質を一般に指す。しかし、本明細書で用いるように、ヒトＣＸＣＲ２は配列番号１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または任意のその対立遺伝子変異体もしくは相同分子種を指し、カニクイザルＣＸＣＲ２は配列番号３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、または任意のその対立遺伝子変異体もしくは相同分子種を指す。
ｙ）本明細書で用いるように、「配列最適化」は、天然の配列に存在しないであろう特定の特性または構造的特徴を確保するために、アミノ酸配列で置換、挿入または欠失を促進することを指す。そのような置換、挿入または欠失は、例えば、化学的安定化のために、製造の能力の向上のために、ピログルタミン酸形成、または酸化もしくは異性化を避けるために実行することができる。二パラトープ性ポリペプチド、特に本発明の特定の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのために採用することができるそのような特性の最適化を達成する方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０９５２３５に記載される。配列最適化技術は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを本明細書に記載される方法でヒト化するためにも実行することができる。したがって、配列最適化、配列の最適化、または配列最適化された、が本明細書で用いられるいかなる場合も、これは、ヒト化置換または挿入、および部分的または完全なヒト化二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓへの具体的な言及を包含する。
ｚ）本明細書で用いるように、「Ｃ末端伸長部」は、ポリペプチド鎖のＣ末端に加えられたアミノ酸残基を指す。そのような伸長部は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸残基の長さであり、さもなければ一部の個体の血清中に見出されるＩｇＧ分子と相互作用することができるかもしれないエピトープを覆い隠す働きをする。
第１の態様では、本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに結合する、２つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドを提供し、前記第１の抗原結合ドメインはラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第１のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、前記第２の抗原結合ドメインはラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第２のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、ポリペプチドのＣ末端は、抗原結合ドメインの配列への、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基の伸長部を含み、第１の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第１のエピトープを認識し、第２の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第２のエピトープを認識する。
任意の所与の実施形態で具体的に議論されるかどうかにかかわらず、本明細書に開示される全ての実施形態は、上記のように抗原結合ドメインへのＣ末端伸長部を含むことを理解すべきである。したがって、本発明のポリペプチドは、そのようなＣ末端伸長部を全て含む。
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸配列からなる線状ペプチドに結合することができる第１の抗原結合ドメイン、および前記線状ペプチドに結合不能であるか、またはより低い親和性で結合する第２の抗原結合ドメインを含む。配列番号７は、ヒトＣＸＣＲ２のＮ末端の最初の１９アミノ酸である。
一実施形態では、第１の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２のアミノ酸１〜１９を含むかその範囲内の第１のエピトープを認識し、前記第２の抗原結合ドメインはアミノ酸１〜１９以外のＣＸＣＲ２上の第２のエピトープを認識する。
重鎖抗体の単一鎖の可変領域はＶＨＨドメインとして知られ、Ｎａｎｏｂｏｄｙとして知られる抗体断片を含む。Ｎａｎｏｂｏｄｙは、全ＶＨＨドメインまたはその断片を含むことができる。重鎖抗体およびその可変ドメインの一般記載については、ＷＯ０８／０２００７９の５９頁に指摘される先行技術、および国際出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１〜４３頁で指摘される参考文献リストを参照する。ＶＨＨドメインは、単離されたＶＨＨドメイン（ならびに天然に存在するＶＨＨドメインと同じ構造および機能的特徴を有するそれに基づくＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）およびそれを含有するポリペプチドを機能的抗原結合ドメインまたはポリペプチドとして非常に有利にする、いくつかの特異な構造的特徴および機能的特性を有する。詳細には、ＶＨＨドメイン（軽鎖可変ドメインの存在なしに、またはそれとのいかなる相互作用なしに抗原に機能的に結合すると本来「設計」されている）およびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、単一の、比較的小さな、機能的抗原結合構造単位、ドメインまたはタンパク質として機能することができる。本明細書で用いるように、用語Ｎａｎｏｂｏｄｙは、本明細書に詳述するように、天然に存在するＶＨＨドメインおよびその断片だけでなく、その変異体および誘導体を包含する。
本発明の最も好ましい実施形態では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、前記第１の抗原結合ドメインが第１のＮａｎｏｂｏｄｙの中に含まれ、前記第２の抗原結合ドメインが第２のＮａｎｏｂｏｄｙの中に含まれ、前記第１および第２のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓはリンカーで連結されるものである。
ＶＨＨドメインの構造は、
ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ−ＣＤＲ−ＦＲ
で表すことができ、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、以下の構造：
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−−リンカー−−ＨＬＥ−ＥＸＴ
・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
・ ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
の１つを有することができ、式中、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第１の抗原結合ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第２の抗原ドメインを含み、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第２の抗原ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第１の抗原結合ドメインを含み、ＨＬＥはｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加を提供する結合単位であり、ＥＸＴは少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基のＣ末端伸長部である。
したがって、本明細書で用いるように、「本発明による二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ」は、リンカーで連結された２つの単一のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを含むポリペプチドを指す。
しかし、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、各Ｎａｎｏｂｏｄｙに僅か１つのＣＤＲを含むことができる。もしそうならば、好ましいＣＤＲは、ＣＤＲ３および／またはＣＤＲ６である。しかし、本発明による二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、Ｎ末端ＮａｎｏｂｏｄｙにはＣＤＲ１またはＣＤＲ２またはＣＤＲ３またはＣＤＲ１およびＣＤＲ２またはＣＤＲ１およびＣＤＲ３またはＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはＣＤＲ１およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、Ｃ末端Ｎａｎｏｂｏｄｙには以下の組合せのいずれか１つを含むことができる：ＣＤＲ４またはＣＤＲ５またはＣＤＲ６またはＣＤＲ４およびＣＤＲ５またはＣＤＲ４およびＣＤＲ６またはＣＤＲ５およびＣＤＲ６またはＣＤＲ４およびＣＤＲ５およびＣＤＲ６。上に示すように、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６の全てを含むことができ、各ＣＤＲにはＦＲが連なる。
ＦＲは、ラクダ科動物の供給源と一致するアミノ酸配列を有することができる。しかし、好ましい実施形態では、ＦＲの１つまたは複数は、少なくとも１つの配列最適化、アミノ酸置換を有し、ＦＲの好ましくは１つまたは複数、より好ましくは全ては、部分的または完全にヒト化される。配列最適化のための置換は、下でさらに詳細に議論される。
本明細書では、第１および第２の抗原結合ドメインが、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓではないが、上記の従来の抗体のドメインまたは断片、例えばヒト抗体、ドメインまたは断片の中にある第１および第２の免疫グロブリンの単一可変ドメインに含まれる本発明の実施形態では、その中のＣＤＲを少なくとも１つのラクダ化置換で改変し、任意選択で完全にラクダ化されたＣＤＲを生成することが可能であることも指摘される。
さらに本明細書に記載されるように、単一のＮａｎｏｂｏｄｙ中のアミノ酸残基の総数は１１０〜１２０の領域内にあってよく、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかし、Ｎａｎｏｂｏｄｙの部分、断片、類似体または誘導体（本明細書でさらに記載される）は、そのような部分、断片、類似体または誘導体が本明細書に概説されるさらなる必要条件を満たし、好ましくは本明細書に記載される目的のためにも適する限り、それらの長さおよび／またはサイズに関して特に限定されない点に留意するべきである。
さらに本明細書に記載されるように、Ｎａｎｏｂｏｄｙのアミノ酸残基は、RiechmannおよびMuyldermans、J. Immunol. Methods 2000年6月23日；240（1〜2）：185〜195頁の論文でラクダ科動物からのＶＨＨドメインに適用されるように、Kabatら（「Sequence of proteins of immunological interest」、US Public Health Services、NIH Bethesda、MD、Publication No. 91）によって与えられるＶＨドメインのための一般的番号付けに従って番号が振られ（例えばこの刊行物の図２を参照する）、したがって、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ１は、１〜３０位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ１は、３１〜３５位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ２は、３６〜４９位のアミノ酸を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ２は、５０〜６５位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ３は、６６〜９４位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ３は、９５〜１０２位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ４は、１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含むことができる。本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙでは、Ｎ末端Ｎａｎｏｂｏｄｙは、上で与えられる位置のＦＲおよびＣＤＲを有することができ、Ｃ末端Ｎａｎｏｂｏｄｙでは、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ５は、１〜３０位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ４は、３１〜３５位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ６は、３６〜４９位のアミノ酸を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ５は、５０〜６５位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ７は、６６〜９４位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＣＤＲ６は、９５〜１０２位のアミノ酸残基を含むことができ、ＮａｎｏｂｏｄｙのＦＲ８は、１０３〜１１３位のアミノ酸残基を含むことができる。
しかし、抗体、特にＮａｎｏｂｏｄｙ中のＣＤＲおよびＦＲは、Ｋａｂａｔの代わりの番号付け体系によって識別することができることが理解される。これらには、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴおよびＡＨｏ体系が含まれる。これらの代替の番号付け体系によって表９、１３、１９、３２、３３および３４で識別されるアミノ酸配列のいずれか１つのＣＤＲまたはＦＲの位置の同定は、配列の分析によって達成することができる。この目的のために、以下のウェブサイト：http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/（Ｃｈｏｔｈｉａ）；http://imgt.cines.fr（ＩＭＧＴ）およびhttp://www.bio.uzh.ch/antibody/index.html（ＡＨｏ）を参照することができる。具体的には、本明細書に記載される本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙでは、ＣＤＲ１、２、３、４、５または６は、Ｋａｂａｔの代わりのこれらの番号付け体系の１つによって規定できるが、なお本発明の範囲内である。
本発明によるいくつかのナノボディのためのＣｈｏｔｉａによるＣＤＲを、表３５に示す。
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、いわゆる「ＶＨ３クラス」（すなわちＤＰ−４７、ＤＰ−５１またはＤＰ−２９などのＶＨ３クラスのヒト生殖細胞系配列への高度の配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）であってよく、そのようなＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの構築のために好ましい。しかし、ＣＸＣＲ２に対する任意のタイプのＮａｎｏｂｏｄｙ、および例えば、ＷＯ０７／１１８６７０に例えば記載されるような、いわゆる「ＶＨ４クラス」（すなわちＤＰ−７８などのＶＨ４クラスのヒト生殖細胞系配列への高度の配列相同性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）に属するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓが、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの構築で用いられてもよい点に留意すべきである。
本発明による第１および第２の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドを連結するリンカー分子は、免疫グロブリンに由来するものであってもそうでなくてもよい。本発明のポリペプチドが二パラトープ性の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＮａｎｏｂｏｄｙである場合は、リンカーは、抗原結合ドメインを含む１つの免疫グロブリン単一可変ドメインのＣ末端を、抗原結合ドメインを含む別の免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端に連結する。
第１および第２の抗原結合ドメイン、特に２つのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを連結するための、本発明の二パラトープ性ポリペプチドで用いるのに適するスペーサーまたはリンカーは当業者に明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当技術分野で用いられる任意のリンカーまたはスペーサーであってよい。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、医薬使用を意図するタンパク質またはポリペプチドの構築での使用に適する。
例えば、リンカーは、適するアミノ酸配列、特に１〜５０、好ましくは１〜３０、例えば１〜１０のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってよい。そのようなアミノ酸配列の一部の好ましい例には、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のもの、例えば（ＷＯ９９／４２０７７に記載される（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、ならびに本明細書で指摘されるＡｂｌｙｎｘによる出願に記載されるＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカーなど（例えばＷＯ０６／０４０１５３およびＷＯ０６／１２２８２５を参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または同様の配列（例えばＷＯ９４／０４６７８に記載される）が含まれる。他のいくつかの可能なリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡなど）、ならびにリンカーＧＳ３０（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８５）およびＧＳ９（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８４）である。
本発明による好ましいリンカーは、長さが３〜５０アミノ酸のペプチドリンカー、例えばアミノ酸長３〜９、１０〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３５、３６〜４０、４１〜４５または４６〜５０のリンカーである。本発明の一実施形態では、ペプチドリンカーは長さが３５アミノ酸である。リンカーは、僅か２つの異なるアミノ酸からなることができる。前述の通り、これらはグリシンおよびセリンであってよい。あるいは、それらはプロリンおよびセリンであってよい。
本発明の一部の実施形態、特に本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓでは、ペプチドリンカーはアミノ酸配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２０）
からなる。
他の適するリンカーは、有機化合物またはポリマー、特に医薬用のタンパク質での使用に適するものを一般に含む。例えば、抗体ドメインを連結するためにポリ（エチレングリコール）部分が用いられており、例えばＷＯ０４／０８１０２６を参照されたい。
したがって別の態様では、本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに結合する、少なくとも２つのポリペプチドを含む分子に関し、第１のポリペプチドは第１の免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、第２のポリペプチドは第２の免疫グロブリン抗原結合ドメインを含み、前記第１および第２の抗原結合ドメインは、ＣＸＣＲ２上の第１および第２のエピトープを認識し、前記少なくとも２つのポリペプチドは非ペプチドリンカーによって連結される。
好ましくは、本発明の態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合することができ、前記第２の抗原結合ドメインは、前記線状ペプチドに結合することができないか、またはより低い親和性で結合する。好ましくは、第１のエピトープはＣＸＣＲ２のアミノ酸１〜１９を含むかその範囲内にあり、第２のエピトープはＣＸＣＲ２のアミノ酸１〜１９の外部にある。
好ましくは、本発明のこの態様では、第１および第２の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンの単一可変ドメインに含まれ、前記第１および第２の免疫グロブリンの単一可変ドメインは、好ましくはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ、特に本明細書で具体的に記載されるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのいずれかである。
本明細書に記載される本発明の全ての態様では、リンカーの必須の特性は、それが、第１および第２の抗原結合ドメインがＣＸＣＲ２上のそれらのそれぞれのエピトープに結合することを可能にする長さおよび立体構造であるということである。
用いられるリンカーは、本発明のポリペプチドに１つまたは複数の他の好ましい特性または官能性を付与することもでき、ならびに／または誘導体の形成および／もしくは官能基の付着のための１つまたは複数の部位を提供することもできる（例えば、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの誘導体について本明細書に記載されるように）。例えば、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基（国際出願ＷＯ０８／０２００７９の４８頁の表Ａ−２を参照）を含有するリンカーは、向上した親水性を提供することができるが、小さなエピトープまたはタグを形成または含有するリンカーは、検出、同定および／または精製のために用いることができる。前と同じように、本明細書の開示に基づき、当業者は、任意選択で多少の限定的なルーチン実験の後に、本発明の特定のポリペプチドで使用するのに最適なリンカーを判断することができる。
２個以上のリンカーが本発明のポリペプチドで用いられる場合は、これらのリンカーは同じであっても異なってもよい。前と同じように、本明細書の開示に基づき、当業者は、任意選択で多少の限定的なルーチン実験の後に、本発明の特定のポリペプチドで使用するのに最適なリンカーを判断することができる。
驚くべきことに、それらの個体は以前にナノボディに曝露していないが、一部の個体の血清が、本発明のＣＸＣＲ２ナノボディと相互作用することができるＩｇＧ分子を含有することが今や見出されている。これは、ＣＨ１ドメインによって抗体中に通常覆い隠されている領域である、ヒト化Ｖｈドメインの立体構造エピトープとのＩｇＧ分子の相互作用によることが分かっている。この問題点を克服するために、本発明は、Ｃ末端伸長部を含むＣＸＣＲ２に特異的な二パラトープ性ナノボディを提供する。このＣ末端伸長部は、ＩｇＧ分子とＮａｎｏｂｏｄｙの間での結合相互作用を効率的に阻害することが見出されている。この相互作用をブロックするために、様々なＣ末端伸長部（Ａ、ＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫＰ、ＧＧＧＳ）をナノボディ配列に加えることができることを発明者は見出した。好ましいＣ末端伸長部は、２つのアラニン残基（ＡＡ）である。
通常、発現および生成の容易さのために、本発明のポリペプチドは線状ポリペプチドである。しかし、本発明はその最も広い意味でそれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドがより多くのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの３つを含む場合は、３つ以上の「腕」を有するリンカーの使用によってそれらを連結することが可能であり、「星状」構築物を提供するために、各「腕」はＮａｎｏｂｏｄｙに連結される。通常、より好ましくないが、環状構築物の使用も可能である。
詳細には、上で特定される１つまたは複数のリンカーによる２つ以上のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの任意の配置を調製することができる。例えば、ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに結合する２つの免疫グロブリン結合ドメイン、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するものであるか、またはかそれに結合する１つまたは複数の免疫グロブリン結合ドメインを含む、二パラトープ性、二重特異的Ｎａｎｏｂｏｄｙを想定することができ、前記ＨＳＡ結合ドメインは、本明細書に規定されるリンカーを通して、任意の位置で、例えば２つのＣＸＣＲ２結合Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの間でＣＸＣＲ２結合Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓに連結されるＮａｎｏｂｏｄｙで構成されてもよい。
本発明者は、本発明による二パラトープ性ポリペプチドを調製した。多価性および二パラトープ性の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのアミノ酸配列は、本明細書の実施例の間の表１３に示す。これらの中で、本発明による特に好ましいポリペプチドは、表１３で、１６３Ｄ２−１２７Ｄ１、１６３Ｅ３−１２７Ｄ１、１６３Ｅ３−５４Ｂ１２、１６３Ｄ２−５４Ｂ１２、２Ｂ２−１６３Ｅ３、２Ｂ２−１６３Ｄ２、９７Ａ９−２Ｂ２、９７Ａ９−５４Ｂ１２、１２７Ｄ１−１６３Ｄ２、１２７Ｄ１−１６３Ｅ３、２Ｂ２−９７Ａ９、５４Ｂ１２−１６３Ｄ２、５４Ｂ１２−１６３Ｅ３、１６３Ｄ２−２Ｂ２および１６３Ｅ３−２Ｂ２と命名される二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ならびに１２７Ｄ１−９７Ａ９、５４Ｂ１２−９７Ａ９および９７Ａ９−１２７Ｄ１、および配列最適化されたその変異体である。これらの二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの全ては、配列番号７に示すアミノ酸の配列（ＣＸＣＲ２のアミノ酸１〜１９）からなる線状ペプチドに結合することができる第１の抗原結合ドメインを含む第１のＮａｎｏｂｏｄｙ、および前記線状ペプチドに結合することができないか、またはより低い親和性で結合する第２の抗原結合ドメインを含む第２のＮａｎｏｂｏｄｙを含む（表８を参照）。本発明によって特に好ましいものは、１６３Ｄ２−１２７Ｄ１、１６３Ｅ３−１２７Ｄ１、１６３Ｅ３−５４Ｂ１２、１６３Ｄ２−５４Ｂ１２、２Ｂ２−１６３Ｅ３、２Ｂ２−１６３Ｄ２、９７Ａ９−２Ｂ２および９７Ａ９−５４Ｂ１２である。
既に本明細書で論じられているように、１６３Ｄ２／１２７Ｄ１、１６３Ｅ３／１２７Ｄ１、１６３Ｅ３／５４Ｂ１２、１６３Ｄ２／５４Ｂ１２、２Ｂ２／１６３Ｅ３、２Ｂ２／１６３Ｄ２、９７Ａ９／２Ｂ２、９７Ａ９／５４Ｂ１２、１２７Ｄ１／１６３Ｄ２、１２７Ｄ１／１６３Ｅ３、１２７Ｄ１／９７Ａ９、２Ｂ２／９７Ａ９、５４Ｂ１２／１６３Ｄ２、５４Ｂ１２／１６３Ｅ３、５４Ｂ１２／９７Ａ９、９７Ａ９／１２７Ｄ１、１６３Ｄ２／２Ｂ２または１６３Ｅ３／２Ｂ２と命名される具体的な実施形態およびその変異体を含む本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓが、それらのフレームワーク領域の中に少なくとも１つの配列最適化されたアミノ酸置換を有し、前記フレームワーク領域が例えば部分的または完全にヒト化されるならば望ましい。配列最適化の程度が、少なくともフレームワーク領域に関して配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７、６１、５３、５４、４６、６９、６８、６７または６６と８０〜９０％の配列同一性を有する二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙをもたらすならば望ましい。
本発明の実施形態は、第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１３、２１４、２１６および２１９、またはこれらの１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１５、２１７および２１８、またはこれらの１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される、ポリペプチドをさらに含む。
（００７９−００７６）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１４１、２３６、１８１、１４６、２３７または１８６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１４１、２３６、１８１、１４６、２３７または１８６に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２１７、または配列番号２１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号２２１を含む。
（００７９−００８６）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１４１、２３６、１８１、１４５、１６５または１８５に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１４１、２３６、１８１、１４５、１６５または１８５に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２１８、または配列番号２１８と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号２２２を含む。
（００７９−００６１）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１４１、２３６、１８１、１４３、２３５または１８３に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１４１、２３６、１８１、１４３、２３５または１８３に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２２０のリンカーによって分離されている、配列番号２１５、または配列番号２１５と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
（０１０４−００７６）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１５１、１７１、１９１、１４６、２３７または１８６に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１５１、１７１、１９１、１４６、２３７または１８６に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２１７、または配列番号２１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号２２３を含む。
（０１０４-００８６）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１５１、１７１、１９１、１４５、１６５または１８５に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１５１、１７１、１９１、１４５、１６５または１８５に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２１８、または配列番号２１８と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは配列番号２２４を含む。
（０１０４−００６１）
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ１は配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ３は配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、さらに、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリン中に、ＣＤＲ４は配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５は配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、およびＣＤＲ６は配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５またはＣＤＲ６のアミノ酸配列は、配列番号１５１、１７１、１９１、１４３、２３５または１８３に示すアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、保存的アミノ酸変化だけが配列番号１５１、１７１、１９１、１４３、２３５または１８３に示すものと異なるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第１の抗原結合ドメイン、および配列番号２２０のリンカーによって分離されている、配列番号２１５、または配列番号２１５と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドから選択される第２の抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、ＣＸＣＲ２結合に関して一価であり、本発明の二パラトープ性ポリペプチドのための構成単位であり、その生成過程での中間体とみなすことができるポリペプチド、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｙを提供する。好ましい一価の免疫グロブリン単一可変ドメインは、表９に示す配列番号２５〜４３および９０のポリペプチド、または配列番号２５〜４３および９０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
好ましい一価のポリペプチドは、１３７Ｂ７と命名され、配列番号３６に示すアミノ酸配列、または配列番号３６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。好ましい実施形態では、配列番号３６のフレームワーク領域は、１つまたは複数の配列最適化するアミノ酸置換を有する。他の好ましい一価のポリペプチドは、フレームワーク領域で配列最適化されたものを含む、１２７Ｄ１、２Ｂ２、５４Ｂ１２、９７Ａ９、１６３Ｄ２および１６３Ｅ３と命名されたものである。
例えば、１２７Ｄ１は、表２６で意図される１つまたは複数の配列最適化アミノ酸置換が加えられている、配列番号３７のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１６に示すアミノ酸配列を含む。
２Ｂ２は、表２０で意図される１つまたは複数の配列最適化置換が加えられている、配列番号４３のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１３または２１４に示すアミノ酸配列を含む。
５４Ｂ１２は、表３０で意図される１つまたは複数の配列最適化置換が加えられている配列番号９０を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１９に示すアミノ酸配列を含む。
９７Ａ９は、表２２で意図される１つまたは複数の配列最適化置換が加えられている配列番号３９を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１５に示すアミノ酸配列を含む。
１６３Ｄ２は、表２８で意図される１つまたは複数の配列最適化置換が加えられている、配列番号４１のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１８に示すアミノ酸配列を含む。
１６３Ｅ３は、表２４で意図される１つまたは複数の配列最適化置換が加えられている、配列番号４２に示すアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドは配列番号２１７に示すアミノ酸配列を含む。
配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７または６１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有するポリペプチドで、ＣＸＣＲ２への結合を交差ブロックすることが可能である一価のポリペプチド、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓも本発明のこの態様の中に包含される。
本明細書に列挙される用途のために、例えばＣＯＰＤの処置で、上述の好ましい一価のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのいずれか、特に１３７Ｂ７を用いることができる。
その全てのラクダ化およびヒト化バージョンを含む本発明による二パラトープ性ポリペプチド、特に上述の好ましい二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＣＸＣＲ２のモジュレーターであり、特にＣＸＣ２シグナル伝達を阻害する。
好ましくは、二パラトープ性ポリペプチド、特に本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ配列およびＦＲ配列は、それらが：
−１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）ＣＸＣＲ２に結合するものであり；
および／または、それらが：
−１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の間のｋｏｎ速度でＣＸＣＲ２に結合するものであり；
および／または、それらが：
−１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（複数日のｔ１／２でほとんど不可逆的な複合体を提供する）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の間のｋｏｆｆ速度でＣＸＣＲ２に結合するものである。
好ましくは、本発明のポリペプチドおよび二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインに存在するＣＤＲ配列およびＦＲ配列は、それらが５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＣＸＣＲ２に結合するものである。
詳細には、本明細書の実施例に示すように、本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、２０ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣＸＣＲ２へのＧｒｏ−αの結合を阻害することができる。本発明による好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、ＣＸＣＲ２を運ぶＲＢＬ細胞からのアゴニスト誘導（Ｇｒｏ−α）Ｃａ放出を、１００ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害することもできる。本発明による好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、ＣＸＣＲ２−ＣＨＯ膜でのアゴニスト誘導（Ｇｒｏ−α）［３５ｓ］ＧＴＰγＳ蓄積を、５０ｎＭ未満のＩＣ５０で阻害することもできる。本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、Ｇｒｏ−αへの曝露によるヒト白血球形状変化を＜１ｎｍ未満のＩＣ５０で、またはカニクイザル白血球形状変化を＜２ｎｍ未満のＩＣ５０で阻害することもできる。
本発明の最も好ましい態様により、本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば本明細書に記載されるＮａｎｏｂｏｄｙは、配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７または６１に示すポリペプチドのいずれかまたは全部で、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＸＣＲ２ポリペプチドへの結合を交差ブロックする。交差ブロックは、当業者に周知である方法のいずれかで測定することができる。
医薬使用のために、本発明のポリペプチドは、ヒトＣＸＣＲ２、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに対するものであることが好ましく；他方、獣医学的目的のために、本発明のポリペプチドは、処置する種からのＣＸＣＲ２に対するものであり、または処置する種からのＣＸＣＲ２と少なくとも交差反応性であることが好ましい。
さらに、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、任意選択で、ＣＸＣＲ２に対して結合するための少なくとも２つの抗原結合ドメインに加えて、他のエピトープ、抗原、タンパク質または標的に対して結合するために、１つまたは複数のさらなる結合部位またはドメインを含有することができる。
本発明のポリペプチド、およびそれを含む組成物の効能は、異常なＣＸＣＲ２シグナル伝達が関与するＣＯＰＤまたは任意の他の疾患の処置ためにポリペプチドが有益であることを示すのに適する、それ自体公知である任意の適するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイおよび／または動物モデル、またはその任意の組合せを用いて試験することができる。適するアッセイおよび動物モデルは、当業者に明らかであろう。
さらに、本発明により、ヒトＣＸＣＲ２に対するものであるポリペプチドは、他の１種または複数種の温血動物からのＣＸＣＲ２と交差反応性を示しても示さなくてもよい。しかし、好ましくは、ヒトＣＸＣＲ２に対するものである本発明のポリペプチドは、毒性試験の目的のために、他の１種または複数種の霊長類（例えば、限定されずに、マカク属のサル（例えば、特にカニクイザル（Macaca fascicularis）および／またはアカゲザル（Macaca mulatta））、およびヒヒ（Papio ursinus））からのＣＸＣＲ２と交差反応性を示す。好ましい交差反応性は、カニクイザルからのＣＸＣＲ２とのものである。疾患のための動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ）、特にＣＸＣＲ２と関連する疾患および障害のための動物モデルでしばしば用いられる１種または複数種の動物との交差反応性が望ましいであろう。これに関して、存在する場合、そのような交差反応性は、ヒトＣＸＣＲ２に対するアミノ酸配列およびポリペプチドをそのような疾患モデルで試験することを可能にするので、薬剤開発の観点から有利となることができることが当業者に明らかになる。
より一般的には、複数種の哺乳動物からのＣＸＣＲ２と交差反応性である本発明のポリペプチドは、同じポリペプチドを複数の種を横断して用いることを可能にするので、獣医学的用途で使用するのに通常有利である。
好ましくは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ４と交差反応性でない。
本発明の二パラトープ性ポリペプチドでは、少なくとも１つの抗原結合部位を相互作用部位に、すなわちＣＸＣＲ２が別の分子、例えばその天然のリガンドと相互作用する部位に対するものであり得る。
二パラトープ性ポリペプチド、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、第２の抗原結合ドメインが配列番号７の線状ペプチドに結合せず、本明細書で配列番号８、９、１０、１１または１２で示すペプチドを含むかその中にあるエピトープを認識するようなものであってよい。さらに、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７のペプチドを含むかその中にあるエピトープを認識することができる。
カニクイザルＣＸＣＲ２と交差反応する本発明の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号４のペプチドを含むかその中にあるエピトープも認識する。そのような実施形態の第２の抗原結合ドメインは、配列番号５または６のペプチドを含むかその中にあるエピトープを認識することができる。
本発明の範囲内には、ＣＸＣＲ２の天然に存在するか合成された全ての類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分および断片に一般に結合するか、または、ＣＸＣＲ２（例えば配列番号１の野生型ＣＸＣＲ２）において本発明のポリペプチドが結合する抗原決定基もしくはエピトープと本質的に同じである１つまたは複数の抗原決定基もしくはエピトープを含有する、ＣＸＣＲ２の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分および断片に少なくとも結合する種類の二パラトープ性ポリペプチド、特に二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓも提供される。この場合は、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドが（野生型）ＣＸＣＲ２に結合するときの前述の親和性および明細書と同じであるか異なる（すなわち、より高いか低い）親和性および／または特異性でそのような類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分および断片に結合することができる。
さらに、当業者に明らかなように、二パラトープ性であるポリペプチドは、対応する単一の抗原結合ドメインポリペプチドより高い結合力でＣＸＣＲ２に結合する。
二パラトープ性ポリペプチド、特に本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインの部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子および／または誘導体を、本明細書で議論される様々な治療環境で用いることも本発明の範囲内であるが、但し、それらは完全ポリペプチドと同等の関連する機能的ドメインを常に含むものとする。そのような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子または誘導体は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドについて上で議論される全ての機能的特色を有することができる。
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の他の基、残基、部分または結合単位を任意選択でさらに含む、二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。そのようなさらなる基、残基、部分、結合単位またはアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドにさらなる官能性を提供しても提供しなくてもよく、その特性を改変しても改変しなくてもよい。
例えば、そのようなさらなる基、残基、部分または結合単位は、本発明が（融合）タンパク質または（融合）ポリペプチドであるように、１つまたは複数のさらなるアミノ酸配列であってもよい。好ましいが非限定的な態様では、前記１つまたは複数の他の基、残基、部分または結合単位は、免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、前記１つまたは複数の他の基、残基、部分または結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体として適するアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として適するアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして適するアミノ酸配列、またはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓからなる群から選択される。
あるいは、そのような基、残基、部分または結合単位は、例えば化学的な基、残基、部分であってもよく、それらは単独で生物学的および／または薬理的に活性であっても活性でなくてもよい。例えば、本明細書でさらに記載されるように、そのような基は、本発明のポリペプチドの「誘導体」を提供するように、本発明の１つまたは複数のポリペプチドに連結することができる。
そのような構築物では、本発明の１つまたは複数のポリペプチドおよび１つまたは複数の基、残基、部分または結合単位は、互いに直接におよび／または１つまたは複数の適するリンカーもしくはスペーサーを通して連結することができる。例えば、１つまたは複数の基、残基、部分または結合単位がアミノ酸配列である場合は、リンカーもアミノ酸配列であってよく、そのため生じる構築物は融合（タンパク質）または融合（ポリペプチド）である。
上のおよび本明細書のさらなる記載から明らかになるように、このことは、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが、本発明のさらなるポリペプチドを形成するための「構成単位」として用いること、すなわち、多パラトープ性であり、任意選択で多価性または多重特異的、二価／多価性および二重／多重特異的である、本明細書に記載される構築物を形成するために、それらを他の基、残基、部分または結合単位と好適に合わせることによって用いることができることを意味する。
本発明のこの態様のポリペプチドは、本発明の１つまたは複数のポリペプチドを、任意選択で１つまたは複数の適するリンカーを通して、１つまたは複数のさらなる基、残基、部分または結合単位に好適に連結する少なくとも１ステップを含む方法によって、一般に調製することができる。
本発明の具体的な一態様では、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、本発明の対応する未改変のポリペプチドと比較して増加した半減期を有するように改変される。一部の好ましいポリペプチドは、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者に明らかになり、例えば、その半減期を増加させるように化学改変された（例えば、ペグ化、パス化またはヘス化によって）本発明のアミノ酸配列またはポリペプチドを含み；本発明のポリペプチドは、血清タンパク質（血清アルブミンなど）への結合のための少なくとも１つのさらなる結合部位を含むことができ；または、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの半減期を増加させる少なくとも１つの部分（特に、少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことができる。そのような半減期延長部分またはアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチドの例には、１つまたは複数の血清タンパク質もしくは断片（例えば、（ヒト）血清アルブミンまたはその適する断片）、または血清タンパク質に結合することができる１つまたは複数の結合単位（例えば、血清タンパク質、例えば血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）に結合することができるドメイン抗体、ドメイン抗体として適するアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として適するアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして適するアミノ酸配列、またはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、血清免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、またはトランスフェリンに好適に連結するポリペプチド；Ｆｃ部分（ヒトＦｃなど）または適するその一部もしくは断片に連結するポリペプチドが含まれる。血清タンパク質に結合することができる１つまたは複数の小さなタンパク質またはペプチド（例えば、限定されずに、ＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６、ＷＯ０２／０７６４８９、および２００６年１２月５日に出願されたＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の「血清タンパク質に結合することが可能なペプチド」という表題のＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の米国特許仮出願（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８も参照）に記載されるタンパク質およびペプチドに連結する本発明のポリペプチドも、本発明の中に組み込まれる。
医薬用タンパク質の半減期を増加させるため、および／またはその免疫原性を低減するために最も広く使われている技術の１つは、適する薬理的に許容されるポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）の付着を含む。一般に、ペグ化の任意の適する形、例えば抗体および抗体断片（例えば、それらに限定されないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ）のために当技術分野で用いられるペグ化を用いることができる；例えば、Chapman、Nat. Biotechnol.、54、531〜545頁（2002）；VeroneseおよびHarris、Adv. Drug Deliv. Rev. 54、453〜456頁（2003）、HarrisおよびChess、Nat. Rev. Drug. Discov.、2、（2003）およびＷＯ０４／０６０９６５を参照する。タンパク質のペグ化のための様々な試薬も、例えばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＵＳＡ、から市販されている。
好ましくは、部位特異的ペグ化が、特にシステイン残基を通して用いられる（例えば、Yangら、Protein Engineering、16、10、761〜770頁（2003）を参照。例えば、この目的のために、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙに天然に存在するシステイン残基にＰＥＧを付着させることができる。ＰＥＧの付着のために１つまたは複数のシステイン残基を好適に導入するように本発明の二パラトープ性ポリペプチドを改変することができるか、または、ＰＥＧの付着のために１つまたは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を二パラトープ性ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合することができるが、これらの全ては、それ自体当業者に公知であるタンパク質工学技術を用いる。
好ましくは、本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドのために、ＰＥＧは、５０００を超える分子量で、例えば１０，０００を超えて２００，０００未満、例えば１００，０００未満；例えば２０，０００〜８０，０００の範囲で用いられる。
ペグ化は、免疫グロブリン可変ドメインおよび／または任意のペプチドリンカー領域の片方または両方に適用することができる。適するペグ化技術は、ＥＰ１６３９０１１に記載される。
ＰＥＧに代わるものとして、本発明のポリペプチドへのヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）誘導体の付着を含む、ＨＥＳ化として知られる技術によって半減期を延長することができる。用いられるヒドロキシエチルデンプンは、分子量を調整するために酸加水分解によって改変され、グルコース残基がヒドロキシエチル化されている、ろう状メイズデンプンに由来するアミロペクチンである。さらなる詳細は、Pavisic Rら、Int J Pharm（2010）3月15日、387（1〜2）：110〜9頁から得ることができる。
一般に、半減期の増加した本発明のポリペプチドは、好ましくは本発明の対応するポリペプチド自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍を超えてより長い半減期を有する。例えば、半減期の増加した本発明のポリペプチドは、本発明の対応するポリペプチド自体と比較して、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて増加する半減期を有することができる。
本発明の好ましい態様では、本発明のそのようなポリペプチドは、本発明の対応するポリペプチド自体と比較して、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて増加する血清中半減期を有する。
本発明の別の好ましい態様では、本発明のポリペプチドは、ヒトで、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日超（例えば約１４〜１９日）の半減期を有することができる。
本発明は、本明細書に記載される本発明のポリペプチド、核酸、宿主細胞および組成物を調製または生成する方法にさらに関する。
一般に、これらの方法は、以下のステップを含むことができる：
ａ）ポリペプチドのセット、集合またはライブラリーを提供するステップ；および
ｂ）ポリペプチドの前記セット、集合またはライブラリーを、ＣＸＣＲ２に結合することができ、および／またはそれへの親和性を有するアミノ酸配列についてスクリーニングするステップ；および
ｃ）ＣＸＣＲ２に結合することができ、および／またはそれへの親和性を有するアミノ酸配列を単離するステップ。
ポリペプチドのセット、集合またはライブラリーは、免疫グロブリン配列（本明細書に記載される）のセット、集合またはライブラリー、例えば免疫グロブリン配列のナイーブなセット、集合またはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成もしくは半合成のセット、集合またはライブラリー；および／または親和性成熟に曝した免疫グロブリン配列のセット、集合またはライブラリーであってよい。
さらに、そのような方法では、ポリペプチドのセット、集合またはライブラリーは、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなど）、または軽鎖可変ドメインのセット、集合またはライブラリーであってよい。例えば、ポリペプチドのセット、集合またはライブラリーは、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体のセット、集合またはライブラリーであってよいか、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体として機能することが可能であるアミノ酸配列のセット、集合またはライブラリーであってよい。
この方法の好ましい態様では、ポリペプチドのセット、集合またはライブラリーは、例えば、ＣＸＣＲ２、またはそれに基づくかそれに由来する、適する抗原決定基、例えば抗原性のその部分、断片、領域、ドメイン、ループもしくは他のエピトープで好適に免疫化された哺乳動物、例えばラマに由来する、免疫グロブリン配列の免疫セット、集合またはライブラリーであってよい。
上の方法では、ペプチドまたはポリペプチドのセット、集合またはライブラリーは、例えばスクリーニングを促進するために、ファージ、ファージミド、リボソームまたは適する微生物（酵母など）の上で提示することができる。アミノ酸配列（のセット、集合またはライブラリー）を提示およびスクリーニングするのに適する方法、技術および宿主生物体は、例えば本明細書のさらなる開示に基づいて当分野の技術者に明らかになる。Hoogenboom、Nature Biotechnology、23、9、1105〜1116頁（2005）によるレビューも参照する。
別の態様では、本発明による二パラトープ性ポリペプチドの構築で用いるためのポリペプチドを生成する方法は、少なくとも以下のステップを含む：
ａ）ポリペプチドを発現する細胞の集合または試料を提供するステップ；
ｂ）細胞の前記集合または試料を、ＣＸＣＲ２に結合することができ、および／またはそれへの親和性を有するポリペプチドを発現する細胞についてスクリーニングするステップ；および
ｃ）（ｉ）前記ポリペプチドを単離するステップ；または（ｉｉ）前記細胞から前記ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、続いて前記ポリペプチドを発現させるステップのいずれか。
例えば、所望のポリペプチドが免疫グロブリン配列である場合は、細胞の集合または試料は例えばＢ細胞の集合または試料であってよい。さらに、この方法では、細胞の試料は、ＣＸＣＲ２、またはそれに基づくかそれに由来する、適する抗原決定基、例えば抗原性のその部分、断片、領域、ドメイン、ループもしくは他のエピトープで好適に免疫化された哺乳動物、例えばラマに由来してもよい。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループまたは他の細胞外のエピトープであってよい。
本明細書で特定される本発明の好ましい二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの調製では、ヒトＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞、カニクイザルＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞、完全長ヒトＣＸＣＲ２をコードするＤＮＡ、Δ１−１７のヒトＣＸＣＲ２をコードするＤＮＡ、カニクイザルＣＸＣＲ２をコードするＤＮＡ、および表５に示すペプチドでラマを免疫化した。
上記のスクリーニング方法は、当業者に明らかになる任意の適する方法で実施することができる。例えば、ＥＰ０５４２８１０、ＷＯ０５／１９８２４、ＷＯ０４／０５１２６８およびＷＯ０４／１０６３７７を参照する。ステップｂ）のスクリーニングは、好ましくはＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー技術を用いて実施される。これのために、例えばLiebyら、Blood、97巻、12号、3820頁（2001）を参照する。
別の態様では、本発明によるポリペプチドの構築で用いるためのＣＸＣＲ２に対するポリペプチドを生成する方法は、少なくとも以下のステップを含むことができる：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリーを提供するステップ；
ｂ）核酸配列の前記セット、集合またはライブラリーを、ＣＸＣＲ２に結合することができ、および／またはそれへの親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列についてスクリーニングするステップ；および
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記ポリペプチドを発現させるステップ。
そのような方法では、ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリーは、例えば、免疫グロブリン配列のナイーブなセット、集合またはライブラリーをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリー；免疫グロブリン配列の合成または半合成のセット、集合またはライブラリーをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリー；および／または親和性成熟に曝した免疫グロブリン配列のセット、集合またはライブラリーをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリーであってよい。
さらに、そのような方法では、核酸配列のセット、集合またはライブラリーは、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインなど）、または軽鎖可変ドメインのセット、集合またはライブラリーをコードすることができる。例えば、核酸配列のセット、集合またはライブラリーは、ドメイン抗体または単一ドメイン抗体のセット、集合またはライブラリーをコードすることができるか、またはドメイン抗体または単一ドメイン抗体として機能することが可能であるアミノ酸配列のセット、集合またはライブラリーをコードすることができる。
この方法の好ましい態様では、核酸配列のセット、集合またはライブラリーは、例えば、ＣＸＣＲ２、またはそれに基づくかそれに由来する、適する抗原決定基、例えば抗原性のその部分、断片、領域、ドメイン、ループもしくは他のエピトープで好適に免疫化された哺乳動物に由来する、核酸配列の免疫セット、集合またはライブラリーであってよい。特定の一態様では、前記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループまたは他の細胞外のエピトープであってよい。
本発明のポリペプチドの生成では、上で説明される抗原でラマを免疫化した。
上の方法では、ヌクレオチド配列のセット、集合またはライブラリーは、例えばスクリーニングを促進するために、ファージ、ファージミド、リボソームまたは適する微生物（酵母など）の上で提示することができる。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、集合またはライブラリー）を提示およびスクリーニングするのに適する方法、技術および宿主生物体は、例えば本明細書のさらなる開示に基づいて当分野の技術者に明らかになる。Hoogenboom、Nature Biotechnology、23、9、1105〜1116頁（2005）によるレビューも参照する。
別の態様では、本発明による二パラトープ性ポリペプチドで用いることができるＣＸＣＲ２に対するポリペプチドを生成する方法は、少なくとも以下のステップを含むことができる：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸配列のセット、集合またはライブラリーを提供するステップ；
ｂ）核酸配列の前記セット、集合またはライブラリーを、ＣＸＣＲ２に結合することができ、および／またはそれへの親和性を有し、交差ブロックされているか、または本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ、例えば配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７または６１によってコードされるものを交差ブロックしているアミノ酸配列をコードする核酸配列についてスクリーニングするステップ；および
ｃ）前記核酸配列を単離し、続いて前記ポリペプチドを発現させるステップ。
本発明は、上の方法、あるいは上の方法の１つを含む方法によって、さらに少なくとも前記免疫グロブリン配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を判定するステップ；および前記アミノ酸配列をそれ自体公知である方法で、例えば適する宿主細胞もしくは宿主生物体での発現または化学合成により発現させるか合成するステップ、およびそこから二パラトープ性ポリペプチドを構築するステップ、によって得られる二パラトープ性ポリペプチドにも関する。
上の方法は、当業者に明らかになる、下でさらに詳細に議論される任意の適する方法で実施することができる。例えば、ＥＰ０５４２８１０、ＷＯ０５／１９８２４、ＷＯ０４／０５１２６８およびＷＯ０４／１０６３７７を参照する。例えば、ステップｂ）のスクリーニングは、好ましくはＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー技術を用いて実施される。これのために、例えばLiebyら、Blood、97巻、12号、3820頁を参照する。Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．による国際出願ＷＯ０６／０７９３７２に記載されるいわゆる「Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（商標）」技術を特に参照する。
ＣＸＣＲ２に対するＶＨＨ配列またはＮａｎｏｂｏｄｙ配列を得る別の技術は、重鎖抗体を発現することが可能であるトランスジェニック哺乳動物を好適に免疫化すること（すなわち免疫応答および／またはＣＸＣＲ２に対する重鎖抗体をもたらすために、前記ＶＨＨ配列またはＮａｎｏｂｏｄｙ配列（をコードする核酸配列）を含有する前記トランスジェニック哺乳動物から適する生体試料（例えば、血液試料、血清試料またはＢ細胞の試料）を得ること、ならびに次に、それ自体公知である任意の適する技術（例えば本明細書に記載される方法のいずれかまたはハイブリドーマ技術）を用いて、前記試料から出発して、ＣＸＣＲ２に対するＶＨＨ配列を生成することを含む。例えば、この目的のために、重鎖抗体を発現するマウス、およびＷＯ０２／０８５９４５、ＷＯ０４／０４９７９４およびＷＯ０６／００８５４８およびJanssensら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA。2006年10月10日；103（41）：15130〜5頁に記載されるさらなる方法および技術を用いることができる。例えば、そのような重鎖抗体を発現するマウスは、任意の適する（単一）可変ドメイン、例えば天然の供給源からの（単一）可変ドメイン（例えば、ヒトの（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物の（単一）可変ドメインまたはサメの（単一）可変ドメイン）、ならびに例えば合成または半合成の（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
天然に存在するＶＨ配列または好ましくはＶＨＨ配列から出発して、本発明で使用するためのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび／またはそれをコードする核酸を得るための他の適する方法および技術は当業者に明らかであり、例えば本明細書で指摘されるＷＯ０８／００２７９の６４頁で指摘される技術を含むことができる。
ＶＨＨドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、それらのＦＲ中の１つまたは複数の「ホールマーク残基」によって特徴付けることができる。ホールマーク残基は、ラクダ科動物、例えばラマ供給源などからのＦＲを特徴付ける残基である。したがって、ホールマーク残基は、置換、好ましくはヒト化置換のための望ましい標的である。
Ｋａｂａｔ番号付けにより、ホールマーク残基は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ中の１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４または１０８位にあってよい。そのようなフレームワーク配列および代替のホールマーク残基の（適する組合せ）の非限定例は、ＷＯ２００８／０２００７９の６５〜９８頁に与えられ、それらの頁は完全に本明細書に組み込まれる。当技術分野で公知である他のヒト化または部分的ヒト化配列も、本発明の中で企図され、包含される。
既に本明細書で論じられているように、本発明で用いられるＮａｎｏｂｏｄｙは、天然に存在するヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つにおいて少なくとも「１つのアミノ酸差」（本明細書に規定される）を有することができる。より具体的には、本発明の一非限定態様により、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、天然に存在するヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、ホールマーク残基（１０８、１０３および／または４５位の残基を含む）の少なくとも１つにおいて少なくとも「１つのアミノ酸差」（本明細書に規定される）を有することができる。通常、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、天然に存在するＶＨドメインとＦＲ２および／またはＦＲ４の少なくとも１つ、特にＦＲ２および／またはＦＲ４のホールマーク残基（前と同じように、１０８、１０３および／または４５位の残基を含む）の少なくとも１つで、少なくとも１つのそのようなアミノ酸差を有する。
さらに、本発明のヒト化Ｎａｎｏｂｏｄｙは本明細書に規定の通りであってよいが、但し、天然に存在するＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、それは少なくとも「１つのアミノ酸差」（本明細書に規定される）をフレームワーク領域の少なくとも１つに有するものとする。より具体的には、本発明の一非限定態様により、ヒト化または他の方法で配列最適化されたＮａｎｏｂｏｄｙは本明細書に規定される通りであってよいが、但し、天然に存在するＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、ホールマーク残基（１０８、１０３および／または４５位の残基を含む）の少なくとも１つにおいてそれが少なくとも「１つのアミノ酸差」（本明細書に規定される）を有するものとする。通常、ヒト化または他の方法で配列最適化されたＮａｎｏｂｏｄｙは、天然に存在するＶＨＨドメインとＦＲ２および／またはＦＲ４の少なくとも１つ、特にＦＲ２および／またはＦＲ４のホールマーク残基（前と同じように、１０８、１０３および／または４５位の残基を含む）の少なくとも１つで、少なくとも１つのそのようなアミノ酸差を有する。
本明細書の開示から明らかなように、本明細書に規定される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの天然または合成の類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、同族体およびオルソログ（本明細書で「類似体」と総称される）、特に配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７、６１、５３、５４、４６、６９、６８、６７または６６の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの類似体を用いることも、本発明の範囲内である。
一般に、そのような類似体では、本明細書に規定される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基が置き換えられ、削除されおよび／または加えられていてもよい。そのような置換、挿入または欠失は、フレームワーク領域の１つまたは複数に、および／またはＣＤＲの１つまたは複数に加えることができる。そのような置換、挿入または欠失がフレームワーク領域の１つまたは複数に加えられる場合は、ホールマーク残基の１つまたは複数で、および／またはフレームワーク残基の他の位置の１つまたは複数でそれらを加えることができるが、ホールマーク残基の置換、挿入または欠失は一般により好ましくない（これらが本明細書に記載される適切なヒト化置換でない限り）。
非限定例により、置換は例えば保存的な置換（本明細書に記載される）であってよく、および／またはアミノ酸残基は別のＶＨＨドメインの同じ位置に本来存在する別のアミノ酸残基と置き換えられてもよい（そのような置換の一部の非限定例についてはＷＯ２００８／０２００７９を参照）が、本発明は一般にそれに限定されない。したがって、例えば、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙで使用するためのＮａｎｏｂｏｄｙの特性を向上させるか、少なくとも、本発明の所望の特性、または所望の特性の均衡もしくは組合せを損ない過ぎる（すなわち、Ｎａｎｏｂｏｄｙまたは二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙがその使用目的にもはや適さない程度まで）ことのない任意の１つまたは複数の置換、欠失または挿入、またはその任意の組合せは、本発明の範囲内に含まれる。当業者は、本明細書の開示に基づき、および任意選択で、例えば限定された数の可能な置換を導入し、そのように得られたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの特性に対するそれらの影響を判定することを含むことができる、限定された程度のルーチンの実験の後に、適する置換、欠失または挿入、または適するその組合せを判定および選択することが一般にできる。
例えば、および本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを発現させるために用いられる宿主生物体に従い、そのような欠失および／または置換は、当分野の技術者の能力の範囲内であるような、翻訳後修飾のための１つまたは複数の部位（例えば１つまたは複数のグリコシル化部位）が除去されるような方法で設計することができる。あるいは、置換または挿入は、例えば部位特異的ペグ化（本明細書に記載される）を可能にするために、官能基（同じく本明細書に記載される）の付着のための１つまたは複数の部位を導入するように設計することができる。
一般に本明細書では、「ヒト化」置換を含む、天然の配列に存在しない特定の特性または構造的特徴を確保する目的で、アミノ酸配列の置換、挿入または欠失を促進することを、「配列最適化」と呼ぶ。これに関して、項目（ｙ）の本明細書の定義セクションを参照することができる。
類似体は、好ましくは、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓに関して本明細書に規定される親和性（本明細書でさらに記載されるように、好適にはＫＤ値（実際であるか見かけの）、ＫＡ値（実際であるか見かけの）、ｋｏｎ速度および／またはｋｏｆｆ速度、あるいはＩＣ５０値で測定および／または表現される）でそれらがＣＸＣＲ２に結合することができるようなものである。
類似体は、好ましくは、それらが本明細書に記載される二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの好ましい特性を保持するようなものでもある。
さらに、好ましい一態様により、類似体は、配列番号５８、５９、６２、６３、６４、６５、４７、６１、５３、５４、４６、６９、６８、６７または６６の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの１つと、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％または９９％以上の配列同一性の程度を有し；および／または、好ましくは、多くても２０、好ましくは多くても１０、さらに好ましくは多くても５、例えば４、３、２またはわずか１つのアミノ酸差（本明細書に規定される）を有する。
さらに、類似体のフレームワーク配列およびＣＤＲは、好ましくは、それらが本明細書に規定される好ましい態様に従うようなものである。より一般的には、本明細書に記載されるように、類似体は（ａ）１０８位にＱを；ならびに／または（ｂ）４５位に荷電アミノ酸もしくはシステイン残基を、および好ましくは４４位にＥを、およびより好ましくは４４位にＥおよび４５位にＲを；ならびに／または（ｃ）１０３位にＰ、ＲもしくはＳを有する。
本発明の二パラトープ性ＶＨＨドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの類似体の１つの好ましいクラスは、ヒト化されている（すなわち、天然に存在するＮａｎｏｂｏｄｙの配列と比較して）。指摘するように、そのようなヒト化は、天然に存在するＶＨＨの配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基を、ヒトＶＨ３ドメインなどのヒトＶＨドメイン中の同じ位置に存在するアミノ酸残基で置き換えることを一般に含む。可能なヒト化置換の例は本明細書の表２０、２２、２４、２６、２８および３０で具体的に開示されるものであるが、ヒト化置換の他の組合せは、Ｎａｎｏｂｏｄｙの配列と天然に存在するヒトＶＨドメインの配列の比較から、および既に本明細書に開示されているＷＯ２００８／０２００７９の開示から当業者に明らかになる。
一般に、ヒト化の結果、免疫グロブリン単一可変ドメイン、特に本発明のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、本明細書に記載される本発明のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの好都合の特性をなお保持しながら、より「ヒト様」になることができる。その結果、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して、そのようなヒト化Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは、低減された免疫原性などのいくつかの利点を有することができる。前と同じように、本明細書の開示に基づき、および任意選択で限定された程度のルーチン実験の後に、当業者は、一方のヒト化置換によって提供される好ましい特性と他方の天然に存在するＶＨＨドメインの好ましい特性の間の均衡を最適化するか所望のもしくは適する均衡を達成するヒト化置換またはヒト化置換の適する組合せを加えることができる。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓでの組込みのためのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、任意のフレームワーク残基、例えば１つまたは複数のホールマーク残基（本明細書に規定される）、または１つまたは複数の他のフレームワーク残基（すなわち、非ホールマーク残基）で、またはその任意の適する組合せで好適にヒト化することができる。「Ｐ，Ｒ，Ｓ−１０３基」または「ＫＥＲＥ基」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのための１つの好ましいヒト化置換は、Ｌ１０８へのＱ１０８である。他のホールマーク残基の少なくとも１つがラクダ科動物（ラクダ化）の置換（本明細書に規定される）を含有するならば、Ｌ１０８へのＱ１０８の置換によって「ＧＬＥＷクラス」のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓをヒト化することもできる。例えば、上記のように、ヒト化Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの１つの特に好ましいクラスは、４４〜４７位にＧＬＥＷまたはＧＬＥＷ様配列を；１０３位にＰ、ＲまたはＳ（特にＲ）を、１０８位にＬを有する。
ヒト化および他の類似体、およびそれをコードする核酸配列は、それ自体公知である任意の方法、例えばＷＯ０８／０２００７９の１０３頁および１０４頁で指摘される技術の１つまたは複数を用いて提供することができる。
その中で指摘される通り、本発明のＮａｎｏｂｏｄｙの配列を提供するために、および／またはそのように得られる配列にＮａｎｏｂｏｄｙの好ましい特性を付与するために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン（それらの類似体を含む）は、ヒトＶＨ配列（すなわち、アミノ酸配列または対応するヌクレオチド配列）から出発して、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１またはＤＰ−２９などのヒトＶＨ３配列から出発して、すなわち、１つまたは複数のラクダ化置換を導入すること（すなわち、前記ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基をＶＨＨドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基に変化させること）によって、設計および／または調製することができることも当業者に明らかになる。前と同じように、これは、前の段落で言及する様々な方法および技術を用い、出発点としてヒトＶＨドメインのアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列を用いて一般に実施することができる。
一部の好ましいが、非限定的なラクダ化置換は、ＷＯ２００８／０２００７９から導くことができる。ホールマーク残基の１つまたは複数でのラクダ化置換は、他のアミノ酸位置の１つまたは複数での置換より大きな影響を所望の特性に一般に及ぼすことも明らかになるが、その両方および任意の適する組合せは本発明の範囲内に含まれる。例えば、少なくともいくつかの所望の特性を既に付与する１つまたは複数のラクダ化置換を導入し、次に前記特性をさらに向上させ、および／またはさらなる好ましい特性を付与するさらなるラクダ化置換を導入することが可能である。前と同じく、当業者は、本明細書の開示に基づき、および任意選択で、例えば限定された数の可能なラクダ化置換を導入し、免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましい特性が得られるか向上する（すなわち、元のＶＨドメインと比較して）かを判定することを含むことができる、限定された程度のルーチンの実験の後に、適するラクダ化置換またはラクダ化置換の適する組合せを判定および選択することが一般にできる。しかし一般に、そのようなラクダ化置換は、好ましくは、生じるアミノ酸配列が少なくとも（ａ）１０８位にＱを；ならびに／または（ｂ）４５位に荷電アミノ酸もしくはシステイン残基を、および好ましくはさらに４４位にＥを、およびより好ましくは４４位にＥおよび４５位にＲを；ならびに／または（ｃ）１０３位にＰ、ＲもしくはＳを；ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなるラクダ化置換を含有するようなものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、それらが、本発明で用いるための免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／またはその類似体（本明細書に規定される）、例えばヒト化類似体および／または好ましくは前段落で規定される通りである類似体をもたらすようなものである。
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓなどの免疫グロブリン単一可変ドメインは、天然には稀であるが、それにもかかわらずＶＨドメインヒダに構造的に適合する置換の組込みによって、ＶＨドメインから誘導することもできる。例えば、しかし限定することなく、これらの置換は以下の１つまたは複数を含むことができる：３５位のＧｌｙ、３７位のＳｅｒ、ＶａｌまたはＴｈｒ、３９位のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、４５位のＧｌｕまたはＨｉｓ、４７位のＴｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＧｌｕ、５０位のＳまたはＲ。（BarthelemyらJ Biol Chem. 2008年2月8日；283（6）：3639〜54頁。Epub 2007年11月28日）
本発明は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドの誘導体も含む。そのような誘導体は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドおよび／または本発明の二パラトープ性ポリペプチドを形成するアミノ酸残基の１つまたは複数の改変によって、特に化学的および／または生物学的（例えば酵素的）改変によって一般に得ることができる。
そのような改変の例、ならびにこのような方法で（すなわち、タンパク質骨格の上、好ましくは側鎖の上で）改変することができるポリペプチド配列中のアミノ酸残基の例、そのような改変を導入するために用いることができる方法および技術、ならびにそのような改変の潜在的な用途および利点は当業者に明らかになる。
例えば、そのような改変は、本発明の二パラトープ性ポリペプチド中またはその上への１つまたは複数の官能基、残基または部分、特に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドに１つまたは複数の所望の特性または官能性を付与する１つまたは複数の官能基、残基または部分の導入（例えば、共有結合または他の適する方法での）を含むことができる。そのような官能基の例は、当業者に明らかになる。
例えば、そのような改変は、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性および／もしくは吸収を増加させ、本発明のポリペプチドの免疫原性および／もしくは毒性を低減し、本発明のポリペプチドの任意の望ましくない副作用を排除もしくは軽減し、ならびに／または本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび／もしくはポリペプチドの他の有利な特性を付与し、および／もしくはその望ましくない特性を低減し；または、前述の２つ以上を任意に組み合わせた、１つまたは複数の官能基の導入（例えば、共有結合または任意の他の適する方法での）を含むことができる。そのような官能基およびそれらを導入する技術の例は当業者に明らかであろうし、当技術分野で公知である全ての官能基、ならびに医薬タンパク質の改変、特に抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の改変のためにそれ自体公知である官能基および技術を一般に含むことができ、それに関しては、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、16版、Mack Publishing Co.、Easton、PA（1980）を参照する。前と同じように当業者に明らかになるように、そのような官能基は、例えば本発明の二パラトープ性ポリペプチドに直接に（例えば共有結合で）、または任意選択で適するリンカーもしくはスペーサーを通して連結することができる。
別の、通常より好ましくない改変は、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞に従い、通常翻訳と同時および／または翻訳後の修飾の一部として、Ｎ連結またはＯ連結のグリコシル化を含む。
さらに別の改変は、標識ポリペプチドまたはＮａｎｏｂｏｄｙの使用目的に従い、１つまたは複数の検出可能な標識または他のシグナル生成性の基もしくは部分の導入を含むことができる。適する標識ならびにそれらを付着、使用および検出する技術は当業者に明らかになり、例えば蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性同位体、金属、金属キレート、金属カチオン、発色団および酵素、例えばＷＯ０８／０２００７９の１０９頁で指摘されるものが含まれるが、これらに限定されない。他の適する標識は当業者に明らかになり、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が含まれる。
本発明のそのような標識された二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドは、例えば具体的な標識の選択に従い、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」などのそれ自体公知であるイムノアッセイを含む）、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの診断および画像化目的のために用いることができる。
当業者に明らかになるように、例えば上で言及する金属または金属カチオンの１つをキレート化するために、別の改変はキレート基の導入を含むことができる。適するキレート基には、例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
さらに別の改変は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの特異的結合対の１部分である官能基の導入を含むことができる。そのような官能基は、本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたはＮａｎｏｂｏｄｙを、すなわち結合対の形成を通して、結合対の残り半分に結合している別のタンパク質、ポリペプチドまたは化合物に連結するために用いることができる。例えば、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、ビオチンにコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートしている別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結することができる。例えば、そのようなコンジュゲートしている二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、例えば検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断系でリポーターとして用いることができる。そのような結合対は、例えば本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙを、医薬目的のために適する担体を含む担体に結合するために用いることもできる。１つの非限定例は、CaoおよびSuresh、Journal of Drug Targetting、8、4、257頁（2000）によって記載されるリポソーム製剤である。そのような結合対は、治療活性剤を本発明のＮａｎｏｂｏｄｙに連結するために用いることもできる。
一部の用途のために、特に本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたは免疫グロブリン単一可変ドメインが対象にするＣＸＣＲ２標的を発現する細胞を死滅させること（例えば、がんの処置で）、またはそのような細胞の成長および／もしくは増殖を低減するか遅らせることを意図する用途のために、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを、毒素または毒性の残基もしくは部分に連結することもできる。例えば細胞毒性化合物を提供するために本発明の二パラトープ性ポリペプチドに連結することができる毒性の部分、化合物または残基の例は当業者に明らかになり、例えば、前述の先行技術および／または本明細書のさらなる記載に見出すことができる。１つの例は、ＷＯ０３／０５５５２７に記載されるいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である。
他の潜在的な化学的および酵素的改変は、当業者に明らかになる。そのような改変は、研究目的のために（例えば、機能活性関係を研究するために）導入することもできる。例えば、LundbladおよびBradshaw、Biotechnol. Appl. Biochem.、26、143〜151頁（1997）を参照されたい。
好ましくは、誘導体は、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓに関して本明細書に規定される通りの親和性（本明細書でさらに記載されるように、好適にはＫＤ値（実際であるか見かけの）、ＫＡ値（実際であるか見かけの）、ｋｏｎ速度および／またはｋｏｆｆ速度、あるいはＩＣ５０値で測定および／または表現される）でそれらがＣＸＣＲ２に結合するようなものである。
上で指摘したように、本発明は、本発明の少なくとも１つの二パラトープ性ポリペプチドから本質的になるか、またはそれを含むタンパク質またはポリペプチドにも関する。「から本質的になる」は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、本発明の二パラトープ性ポリペプチドのアミノ酸配列と正確に同じであるか、または本発明のそのようなポリペプチドのアミノ酸配列に対応することを意味し、それは、二パラトープ性ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に加えられる、限定された数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基、例えば１〜１０アミノ酸残基、好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６アミノ酸残基を有する。
前記アミノ酸残基は、ポリペプチドの（生物学的）特性を変更するか、変化させるか、さもなければ影響を及ぼすことができるかできず、さらなる官能性をそれに加えることができるかできない。例えば、そのようなアミノ酸残基は：
−例えば異種宿主細胞または宿主生物体での発現の結果としてＮ末端Ｍｅｔ残基を含むことができる。
−合成の結果、宿主細胞からの二パラトープ性ポリペプチドの分泌を導くシグナル配列またはリーダー配列を形成することができる。適する分泌性リーダーペプチドは当業者に明らかになり、本明細書にさらに記載される通りであってよい。通常、そのようなリーダー配列は、二パラトープ性ポリペプチドのＮ末端に連結される；
−二パラトープ性ポリペプチドを特定の器官、組織、細胞もしくは細胞の部分もしくはコンパートメントに導き、および／もしくは透過もしくは侵入させ、ならびに／または二パラトープ性ポリペプチドを、生体障壁、例えば細胞膜、細胞層、例えば上皮細胞の層、固形腫瘍を含む腫瘍、もしくは血液脳関門に透過もしくは通過させる配列またはシグナルを形成することができる。そのようなアミノ酸配列の例は当業者に明らかになり、ＷＯ０８／０２００７９の１１２頁の段落ｃ）で指摘するものが含まれる。
−例えばその配列または残基に対する親和性技術を用いて、「タグ」、例えば二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙの精製を可能にするか促進するアミノ酸配列または残基を形成することができる。その後、前記配列または残基を除去して（例えば化学的または酵素的開裂による）、二パラトープ性ポリペプチド配列を提供することができる（この目的のために、タグは、任意選択で、開裂可能なリンカー配列を通して二パラトープ性ポリペプチド配列に連結することができるか、または開裂可能なモチーフを含有することができる）。そのような残基のいくつかの好ましいが、非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基およびｍｙｃタグである（例えば、ＷＯ０６／１２２８２の配列番号３１を参照）。
−官能基化されており、および／または官能基の付着のための部位の役割をすることができる１つまたは複数のアミノ酸残基であってよい。適するアミノ酸残基および官能基は当業者に明らかになり、本発明の二パラトープ性ポリペプチドまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの誘導体に関して本明細書に指摘するアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定されない。
別の態様により、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙを含み、それは、すなわち、本発明の前記二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙおよび１つまたは複数のさらなるペプチドまたはポリペプチドを含む融合タンパク質を提供するように、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端、またはそのアミノ末端およびそのカルボキシ末端の両方で、少なくとも１つのさらなるペプチドまたはポリペプチドと融合している。そのような融合は、本明細書において「Ｎａｎｏｂｏｄｙ融合」とも呼ばれる。
好ましくは、これらのさらなるペプチドまたはポリペプチドは、それが本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドに１つまたは複数の所望の特性または官能性を付与するようなものである。
例えば、これらのさらなるペプチドまたはポリペプチドは、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基またはエピトープ（本発明の二パラトープ性ポリペプチドが対象にする同じタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基もしくはエピトープ、または異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基もしくはエピトープを含むが、これらに限定されない）に対するものである得るさらなる結合部位を提供することもできる。
そのようなペプチドまたはポリペプチドの例は当業者に明らかになり、従来の抗体およびその断片（それらに限定されないが、ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）に基づくペプチド融合で用いられる全てのアミノ酸配列を一般に含むことができる。例えば、HolligerおよびHudson、Nature Biotechnology、23、9、1126〜1136頁（2005）によるレビューを参照されたい。
例えば、そのようなペプチドまたはポリペプチドは、本発明のポリペプチドそれ自体と比較して、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低減し、望ましくない副作用を排除もしくは軽減し、ならびに／または他の有利な特性をそれに付与し、および／もしくはその望ましくない特性を低減するアミノ酸配列であってよい。そのようなペプチドおよびポリペプチドのいくつかの非限定例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えばＷＯ００／２７４３５を参照）またはハプテン分子（例えば、循環抗体によって認識されるハプテン、例えばＷＯ９８／２２１４１を参照）である。
詳細には、半減期を増加させるために、免疫グロブリンの断片（ＶＨドメインなど）を血清アルブミンまたはその断片に連結することを用いることができることが、当技術分野で記載されている。ＷＯ００／２７４３５およびＷＯ０１／０７７１３７を参照。本発明により、二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、好ましくは、直接または適するリンカーを通して、特に、本発明のポリペプチドが遺伝子融合（タンパク質）として発現させることができるように連結された適するペプチドを通して、血清アルブミン（または、その適する断片）に連結される。１つの具体的態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、血清アルブミンのドメインＩＩＩまたはその一部を少なくとも含む血清アルブミンの断片に連結することができる。例えば、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．のＷＯ０７／１１２９４０を参照。
あるいは、本明細書で既に論じられているように、これらのさらなるペプチドまたはポリペプチドは、血清中の半減期を増加させるように、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＩｇＧなどの別の血清タンパク質）に対するさらなる結合部位または結合単位を提供することができる。そのようなアミノ酸配列には、例えば下記のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ならびにＷＯ９１／０１７４３、ＷＯ０１／４５７４６およびＷＯ０２／０７６４８９に記載される小さなペプチドおよび結合タンパク質、ならびにＷＯ０３／００２６０９およびＷＯ０４／００３０１９に記載されるｄＡｂが含まれる。Harmsenら、Vaccine、23（41）；4926〜42頁、2005 、ならびにＥＰ０３６８６８４、ならびにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０８／０２８９７７、ＷＯ０８／０４３８２１、ＷＯ０８／０４３８２２および2006年12月5日に出願された「Peptides capable of binding to serum proteins」という表題のＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の米国特許仮出願も参照（（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８も参照）。
そのようなペプチドまたはポリペプチドは、詳細には血清アルブミン（より詳細にはヒト血清アルブミン）に対するものであり、および／またはＩｇＧ（より詳細にはヒトＩｇＧ）に対するものであり得る。例えば、そのようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンに対するアミノ酸配列、およびＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することができるアミノ酸配列（例えばＷＯ０６／０１２２７８７を参照）、および／または血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することが可能であるアミノ酸配列（前と同じように例えばＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；半減期が増加したか増加させることができるアミノ酸配列（例えばＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０８／０２８９７７を参照）；哺乳動物の少なくとも１種からの血清アルブミンと、特に霊長類の少なくとも１種（例えば、限定されずに、マカク属のサル（例えば、特にカニクイザル（Macaca fascicularis）および／またはアカゲザル（Macaca mulatta））およびヒヒ（Papio ursinus）と交差反応を起こすヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列、前と同じようにＷＯ０８／０２８９７７を参照；血清アルブミンにｐＨ非依存的に結合することができるアミノ酸配列（例えば、「Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof」という表題のＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０８／０４３８２１を参照）、および／または条件的結合剤であるアミノ酸配列（例えば、「Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner」という表題のＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０８／０４３８２２を参照）であってよい。
別の態様により、１つまたは複数のさらなるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列は、従来の４鎖抗体（特にヒト抗体）および／または重鎖抗体の１つまたは複数の部分、断片またはドメインを含むことができる。例えば、通常より好ましくないが、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、前と同じように任意選択でリンカー配列を通して、従来の（好ましくはヒト）ＶＨもしくはＶＬドメインに、またはＶＨもしくはＶＬドメインの天然もしくは合成の類似体に連結することができる（他の（単一）ドメイン抗体、例えばWardらによって記載されるｄＡｂを含むが、これに限定されない）。
二パラトープ性ポリペプチドまたはＮａｎｏｂｏｄｙは、任意選択でリンカー配列を通して、１つまたは複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに連結することもできる。例えば、適するＣＨ１ドメインに連結される二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙは、例えば−適する軽鎖と一緒に−従来のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片に類似しているが、従来のＶＨドメインの１つまたは（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合は）１つもしくは両方が本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙと置き換えられている抗体断片／構造を生成するために用いることができた。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加した構築物を提供するために、２つの二パラトープ性ポリペプチドをＣＨ３ドメイン（任意選択でリンカーを通して）に連結することができた。
本発明のポリペプチドの１つの具体的態様により、本発明の１つまたは複数の二パラトープ性ポリペプチドまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、（任意選択で適するリンカーまたはヒンジ領域を通して）１つまたは複数の定常ドメイン（例えば、Ｆｃ部分の一部として／それを形成するために用いることができる２つまたは３つの定常ドメイン）に、Ｆｃ部分に、ならびに／または本発明のポリペプチドに１つまたは複数のエフェクター機能を付与し、および／もしくは１つまたは複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与することができる１つまたは複数の抗体の部分、断片またはドメインに連結することができる。例えば、この目的のために、およびそれに限定されずに、１つまたは複数のさらなるペプチドまたはポリペプチドは、例えば重鎖抗体（本明細書に記載される）、より好ましくは従来のヒト４鎖抗体からの、抗体の１つまたは複数のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むことができ；および／または、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）から、ＩｇＥから、または別のヒトＩｇ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＭから、（一部）およびＦｃ領域を形成することができる。例えば、ＷＯ９４／０４６７８は、各々ＮａｎｏｂｏｄｙならびにヒトＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む（しかし、ＣＨ１ドメインは含まない）２つの重鎖からなる免疫グロブリンを提供するように、ラクダ科のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインがヒトＣＨ２およびＣＨ３ドメインと置き換えられた、ラクダ科動物のＶＨＨドメインまたはそのヒト化誘導体（すなわちＮａｎｏｂｏｄｙ）を含む重鎖抗体を記載し、その免疫グロブリンは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインによって提供されるエフェクター機能を有し、いかなる軽鎖の存在なしで機能することができる。エフェクター機能を提供するように本発明のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに好適に連結することができる他のアミノ酸配列は当業者に明らかになり、所望のエフェクター機能に基づいて選択することができる。例えば、ＷＯ０４／０５８８２０、ＷＯ９９／４２０７７、ＷＯ０２／０５６９１０およびＷＯ０５／０１７１４８、ならびに上記のHolligerおよびHudsonによるレビューを参照。Ｆｃ部分へのポリペプチド、例えば本発明のＮａｎｏｂｏｄｙの結合は、本発明の対応するポリペプチドと比較して半減期の増加をもたらすこともできる。一部の適用については、いかなる生物学的に有意なエフェクター機能なしで半減期の増加を付与するＦｃ部分および／または定常ドメイン（すなわちＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン）の使用も、適するか、またはさらには好ましいものであり得る。１つまたは複数の二パラトープ性ポリペプチド、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび１つまたは複数の定常ドメインを含む、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加した他の適する構築物は当業者に明らかになり、例えば、任意選択でリンカー配列を通してＣＨ３ドメインに連結する２つのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを含むことができる。一般に、半減期の増加した任意の融合タンパク質または誘導体は、好ましくは腎臓吸収のカットオフ値である５０ｋＤを超える分子量を有する。
別の１つの具体的で、非限定的な態様では、本発明のポリペプチドを形成するために、本発明の１つまたは複数のアミノ酸配列を、二量体に自己会合する傾向が低減した（または本質的にない）（すなわち、従来の４鎖抗体に天然に存在する定常ドメインと比較して）、天然に存在する合成もしくは半合成の定常ドメイン（または、その類似体、変異体、突然変異体、部分もしくは断片）に（任意選択で適するリンカーまたはヒンジ領域を通して）連結することができる。そのようなモノマーの（すなわち自己会合していない）Ｆｃ鎖変異体またはその断片は、当業者に明らかになる。例えば、Helmら、J Biol Chem 1996 271 7494は、本発明のポリペプチド鎖で用いることができるモノマーのＦｃ鎖変異体を記載する。
さらに、そのようなモノマーのＦｃ鎖変異体は、好ましくは、相補配列または関連するＦｃ受容体（それらが由来するＦｃ部分によって）にそれらがなお結合することが可能なようなものであり、および／またはそれらが由来するＦｃ部分のエフェクター機能の一部もしくは全部を（または使用目的になお適する低減したレベルで）それらがなお有するようなものである。あるいは、本発明のそのようなポリペプチド鎖では、モノマーのＦｃ鎖は増加した半減期をポリペプチド鎖に付与するために用いることができ、その場合、モノマーのＦｃ鎖はエフェクター機能を有しないか、または本質的に有しなくてもよい。
さらなるペプチドまたはポリペプチドは、合成の結果宿主細胞からの本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドの分泌を導くシグナル配列またはリーダー配列を形成することもできる（例えば、本発明のポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞によって、本発明のポリペプチドのプレ−、プロ−またはプレプロ形を提供するために）。
さらなるペプチドまたはポリペプチドは、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを特定の器官、組織、細胞または細胞の部分もしくはコンパートメントに導き、および／もしくは透過もしくは侵入させ、ならびに／または本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを、生体障壁、例えば細胞膜、細胞層、例えば上皮細胞の層、固形腫瘍を含む腫瘍、または血液脳関門に透過または通過させる配列またはシグナルを形成することもできる。そのようなアミノ酸配列の適する例は当業者に明らかになり、例えば、ＷＯ０８／０２００７９の１１８頁で指摘するものが含まれるが、これらに限定されない。一部の用途のために、特に本発明の二パラトープ性ポリペプチドが対象にする標的を発現する細胞を死滅させること（例えば、がんの処置で）、またはそのような細胞の成長および／もしくは増殖を低減するか遅らせることを意図する用途のために、本発明の二パラトープ性ポリペプチドを、（細胞）毒性のタンパク質またはポリペプチドに連結してもよい。例えば本発明の細胞毒性ポリペプチドを提供するために本発明のＮａｎｏｂｏｄｙに連結することができるそのような毒性のタンパク質およびポリペプチドの例は当業者に明らかになり、例えば、前述の先行技術および／または本明細書のさらなる記載に見出すことができる。１つの例は、ＷＯ０３／０５５５２７に記載されるいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である。
１つの任意選択であるが、非限定的な態様により、前記１つまたは複数のさらなるペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも３つ、例えば４つ、５つまたはそれ以上のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを含む本発明のポリペプチドを提供するように、少なくとも１つのさらなるＮａｎｏｂｏｄｙを含み、そこにおいて、前記Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓは任意選択で１つまたは複数のリンカー配列（本明細書に規定される）を通して連結されてもよい。
最後に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドが２つ以上のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび１つまたは複数のさらなるペプチドまたはポリペプチド（本明細書に指摘される）を含有することができることも、本発明の範囲内である。
２つ以上のＶＨＨドメインを含有する多価性および多重特異的ポリペプチドならびにそれらの調製については、Conrathら、J. Biol. Chem.、276巻、10号。7346〜7350頁、2001；Muyldermans、Reviews in Molecular Biotechnology 74（2001）、277〜302頁；ならびに例えばＷＯ９６／３４１０３およびＷＯ９９／２３２２１も参照。本発明の一部の具体的な多重特異的および／または多価性ポリペプチドの一部の他の例は、本明細書で参照されるＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．による出願に見出すことができる。
本発明の多重特異的ポリペプチドの１つの好ましい例は、本発明の少なくとも１つの二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙおよび半減期の増加を可能にする少なくとも１つのＮａｎｏｂｏｄｙを含む。そのようなＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、例えば、血清タンパク質、特にヒト血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ、またはＷＯ０４／００３０１９に掲載される血清タンパク質の１つに対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓであってよい。これらの中で、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）、またはＩｇＧ（特にヒトＩｇＧ、例えば上記Muyldermansによるレビューに記載されるＮａｎｏｂｏｄｙＶＨ−１を参照）に結合することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓが特に好ましい（しかし、例えば、マウスまたは霊長類での実験については、それぞれマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）または前記霊長類からの血清アルブミンに対する、またはそれと交差反応をするＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを用いることができる。しかし、医薬用のためには、ヒト血清アルブミンまたはヒトＩｇＧに対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓが通常好ましい）。半減期の増加を可能にし、本発明のポリペプチドで用いることができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓには、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０６／１２２７８７、およびＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるさらなる特許出願に記載されている、血清アルブミンに対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ、例えば上で指摘するものが含まれる。
例えば、本発明で使用するための半減期の増加を可能にする一部の好ましいＮａｎｏｂｏｄｉｅｓには、ＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えばＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合することが可能であるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えばＷＯ０６／０１２２７８７を参照）；増加した半減期を有するか提供することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えば、本明細書に指摘するＡｂｌｙｎｘ Ｎ．ＶによるＷＯ０８／０２８９７７を参照）；哺乳動物の少なくとも１種からの血清アルブミンと、特に霊長類の少なくとも１種（例えば、限定されずに、マカク属のサル（例えば、特にカニクイザル（Macaca fascicularis）および／またはアカゲザル（Macaca mulatta））およびヒヒ（Papio ursinus））と交差反応を起こすヒト血清アルブミンに対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えばＡｂｌｙｎｘ Ｎ．ＶによるＷＯ０８／０２８９７７を参照））；ｐＨ非依存的に血清アルブミンに結合することができるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えば、本明細書に指摘するＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ２００８／０４３８２１を参照）、および／または条件的結合剤であるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（例えばＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．によるＷＯ０８／０４３８２２を参照）が含まれる。
半減期の増加を可能にし、本発明のポリペプチドで用いることができる一部の特に好ましいＮａｎｏｂｏｄｉｅｓには、ＷＯ０６／１２２７８７に開示されるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓＡＬＢ−１〜ＡＬＢ−１０（表ＩＩおよびＩＩＩを参照）が含まれ、その中でＡＬＢ−８（ＷＯ０６／１２２７８７の配列番号６２）が特に好ましい。
本発明の具体的態様により、本発明のポリペプチドは、２つ以上のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの他に、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つのＮａｎｏｂｏｄｙを含有する。
本発明の二パラトープ性ポリペプチドに付加、または付着、または融合させることができるさらなる追加のペプチドまたはポリペプチドには、プロリン、アラニンおよびセリンで構成されるポリマー（ＰＡＳ配列）が含まれる。ＰＡＳ配列は２００〜６００個の残基で構成することができ、劇的に増加する水力学的容量につながり、血漿半減期の延長をもたらすことができる。本発明の二パラトープ性ポリペプチドの血清中半減期は、Schellenbrgerら、（2009）、Nature Biotechnology 27、12号、1186〜1190頁に記載される通り、ＸＴＥＮと呼ばれる８６４アミノ酸ポリペプチドとの融合によって延長することもできる。
一般に、本発明の１つまたは複数の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを含有する、半減期の増加した本発明の任意のポリペプチド、および半減期の増加した本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓまたはそのようなポリペプチドの任意の誘導体は、好ましくは、本発明の対応するＮａｎｏｂｏｄｙ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍を超えてより長い半減期を有する。例えば、半減期の増加したそのような誘導体またはポリペプチドは、本発明の対応するＮａｎｏｂｏｄｙ自体と比較して、１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、または２４、４８もしくは７２時間さえも超えて増加する半減期を有することができる。
本発明の好ましい、非限定的態様では、そのような誘導体またはポリペプチドは、ヒトで、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の血清中半減期を示すことができる。例えば、そのような誘導体またはポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０〜１５日）、または少なくとも約１１日（例えば約１１〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２〜１８日以上）、または１４日超（例えば約１４〜１９日）の半減期を有することができる。
本発明の多重特異的ポリペプチドの別の好ましいが、非限定的な例は、本発明の少なくとも１つの二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ、ならびに本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞または細胞の部分もしくはコンパートメントに導き、および／または本発明のポリペプチドをそこに透過もしくは侵入させ、および／またはＮａｎｏｂｏｄｙを生体障壁、例えば細胞膜、細胞層、例えば上皮細胞の層、固形腫瘍を含む腫瘍、もしくは血液脳関門に透過もしくは通過させる少なくとも１つのＮａｎｏｂｏｄｙを含む。そのようなＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの例には、所望の器官、組織または細胞の特異的細胞表面タンパク質、マーカーまたはエピトープ（例えば、腫瘍細胞と関連する細胞表面マーカー）、ならびにＷＯ０２／０５７４４５およびＷＯ０６／０４０１５３に記載される単一ドメイン脳ターゲッティング抗体断片へと導かれるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓが含まれ、その中でＦＣ４４（ＷＯ０６／０４０１５３の配列番号１８９）およびＦＣ５（ＷＯ０６／０４０１５４の配列番号１９０）が好ましい例である。
本発明のポリペプチドでは、２つ以上のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび１つまたは複数のポリペプチドは、互いと直接に連結することができ（例えばＷＯ９９／２３２２１に記載されるように）、および／または１つまたは複数の適するスペーサーもしくはリンカー、もしくはその任意の組合せを通して互いと連結することができる。
本発明の一態様により、本発明のポリペプチドは、本明細書に規定されるような本質的に単離された形である。
本明細書のさらなる記載から当業者に明らかになる通り、本発明のアミノ酸配列、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ポリペプチドおよび核酸は、それ自体公知である方法で調製することができる。例えば、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（それらに限定されないが、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含む）の調製のためのそれ自体公知である任意の方法で調製することができる。アミノ酸配列、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、ポリペプチドおよび核酸を調製するための一部の好ましいが、非限定的な方法には、本明細書に記載される方法および技術が含まれる。
当業者に明らかになる通り、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙおよび／またはポリペプチドを調製するための１つの特に有益な方法は、一般に以下のステップを含む：
ｉ）適する宿主細胞もしくは宿主生物体（本明細書で「本発明の宿主」とも呼ばれる）、または別の適する発現系での、本発明の前記二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書で「本発明の核酸」とも呼ばれる）の発現、続いて、任意選択で：
ｉｉ）このように得られた本発明の前記二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを単離および／または精製するステップ。
詳細には、そのような方法は、以下のステップを含むことができる：
ｉ）本発明の宿主が本発明の少なくとも１つの二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙおよび／またはポリペプチドを発現および／または生成するようなものである条件下で本発明の宿主を培養および／または維持するステップ、続いて任意選択で：
ｉｉ）このように得られた本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを単離および／または精製するステップ。
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド（またはその適する断片）をコードする核酸分子に関する。そのような核酸は本明細書で「本発明の核酸」とも呼ばれ、例えば、本明細書でさらに記載される通り、遺伝子構築物の形であってもよい。
好ましい実施形態では、本発明は、表９および３２の具体的な個々のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに関する、配列番号２５〜４３、９０および配列番号２１３〜２１９に示すアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。あるいは、本発明による核酸分子は、配列番号４４〜６９の多価性および二パラトープ性のＮａｎｏｂｏｄｙ構築物をコードする核酸分子を含む。さらに、本発明による核酸分子は、表１８で特定されるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓに関する、配列番号１９２〜２１１の核酸配列を有する分子を含む。
本発明の核酸は、単一または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形であってよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡであってよい（例えば、意図する宿主細胞または宿主生物体での発現のために特異的に適合させたコドン利用を有するＤＮＡ）。
本発明の一態様により、本発明の核酸は、本明細書に規定されるような本質的に単離された形である。
本発明の核酸は、ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣの形であり、そこに存在し、および／またはその一部であってもよく、それは、前と同じように本質的に単離された形であってよい。
本発明の核酸は、本明細書で与えられる本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、それ自体公知である方法で調製するか、得ることができ、および／または、適する天然の供給源から単離することができる。類似体を提供するために、前記類似体をコードする本発明の核酸を提供するように、天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を、例えば部位特異的突然変異誘発にかけることができる。さらに、当業者に明らかになる通り、本発明の核酸を調製するために、さらにいくつかのヌクレオチド配列、例えば本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、および例えば１つまたは複数のリンカーをコードする核酸を適する方法で連結することができる。
本発明の核酸を生成する技術は当業者に明らかになり、例えば、限定されずに以下のものを含めることができる。自動化ＤＮＡ合成；部位特異的突然変異誘発；２つ以上の天然に存在するおよび／または合成の配列（または、その２つ以上の部分）を合わせること、トランケーションされた発現生成物の発現につながる突然変異の導入；１つまたは複数の制限部位の導入（例えば、適する制限酵素を用いて容易に消化および／またはライゲーションすることができるカセットおよび／または領域を形成するために）、ならびに／または例えば鋳型としてＣＸＣＲ２の天然に存在する形の配列を用いた、１つまたは複数の「ミスマッチ」プライマーを用いるＰＣＲ反応による突然変異の導入。これらおよび他の技術は当業者に明らかになり、前と同じように上記の標準のハンドブック、例えばSambrookらおよびAusubelら、ならびに下の実施例を参照されたい。
本発明の核酸は、遺伝子構築物の形であり、そこに存在し、および／またはその一部であってもよい。そのような遺伝子構築物は、それ自体公知である遺伝子構築物の１つまたは複数のエレメント、例えば１つまたは複数の適する調節エレメント（例えば、適するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）および本明細書で言及される遺伝子構築物のさらなるエレメントに任意選択で連結される、本発明の少なくとも１つの核酸を一般に含む。本発明の少なくとも１つの核酸を含むそのような遺伝子構築物は、本明細書で「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物は、意図された宿主細胞もしくは宿主生物体の形質転換に適する形、意図された宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに適する形、または意図された宿主生物体での独立した複製、維持および／もしくは遺伝に適する形であってもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンの形であってもよい。詳細には、ベクターは、発現ベクター、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ発現（例えば適する宿主細胞、宿主生物体および／または発現系での）を可能にすることができるベクターであってよい。
好ましいが、非限定的な態様では、本発明の遺伝子構築物は、以下を含む：
ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸であって、
ｉｉ）１つまたは複数の調節エレメント、例えばプロモーター、および任意選択で適するターミネーターに作動可能に接続されている核酸；
および任意選択で、さらに
ｉｉｉ）それ自体公知である遺伝子構築物の１つまたは複数のさらなるエレメント；
そこにおいて、用語「作動可能に接続される」および「作動可能に連結される」は、ＷＯ０８／０２００７９の１３１〜１３４頁に与えられる意味を有し；「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」および「さらなるエレメント」は、ＷＯ０８／０２００７９の１３１〜１３４頁に記載される通りであり；遺伝子構築物は、さらにＷＯ０８／０２００７９の１３１〜１３４頁に記載される通りであってよい。
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞または宿主生物体を形質転換するために、すなわち、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドの発現および／または生成のために用いることができる。適する宿主または宿主細胞は当業者に明らかになり、例えば、任意の適する真菌、原核生物または真核生物の細胞もしくは細胞系、または任意の適する真菌、原核生物または真核生物の生物体、例えばＷＯ０８／０２００７９の１３４頁および１３５頁に記載されるもの；ならびに、抗体および抗体断片（限定されずに、（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含む）の発現および生成のためにそれ自体公知である、当業者に明らかになる全ての他の宿主または宿主細胞であってもよい。上に引用される一般的な背景技術、ならびに例えばＷＯ９４／２９４５７；ＷＯ９６／３４１０３；ＷＯ９９／４２０７７；上記Frenkenら、（1998）；上記RiechmannおよびMuyldermans、（1999）；上記van der Linden、（2000）；上記Thomassenら、（2002）；上記Joostenら、（2003）；上記Joostenら、（2005）；および本明細書で引用されるさらなる文献も参照されたい。
ＷＯ０８／０２００７９の１３５頁および１３６頁ならびにＷＯ０８／０２００７９のさらなる引用文献でさらに記載される通り、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドは、例えば予防および／または治療目的（例えば遺伝子療法として）のために、多細胞生物の１つまたは複数の細胞、組織または器官に導入して、発現させることもできる。
細胞内でのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの発現のために、それらは、例えばＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８およびＵＳ−Ａ−７００４９４０；ＷＯ０３／０１４９６０；Cattaneo, A. & Biocca, S.（1997）Intracellular Antibodies: Development and Applications。Landes and Springer-Verlag；およびKontermann、Methods 34、（2004）、163〜170頁に記載の通り、いわゆる「イントラボディ」として発現させることもできる。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドは、例えばトランスジェニック哺乳動物のミルク、例えばウサギ、ウシ、ヤギもしくはヒツジのミルク（哺乳動物に導入遺伝子を導入する一般技術については例えばＵＳ−Ａ−６，７４１，９５７、ＵＳ−Ａ−６，３０４，４８９およびＵＳ−Ａ−６，８４９，９９２を）、植物または植物の部分、例えば、限定されずにそれらの葉、花、果実、種子、根もしくは塊茎（例えば、タバコ、メイズ、ダイズまたはアルファルファ）、または例えばカイコ（Bombix mori）の蛹で生成することもできる。
さらに、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドは、無細胞発現系で発現および／または生成させることもでき、そのような系の適する例は当業者に明らかになる。一部の好ましいが、非限定的な例には、コムギ胚芽系；ウサギ網状赤血球溶解物；または大腸菌（E. coli）のＺｕｂａｙ系での発現が含まれる。
上で指摘した通り、二パラトープ性ポリペプチドおよびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを用いることの利点の１つは、それに基づくポリペプチドが適する細菌系での発現を通して調製することができることであり、適する細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節エレメントなどは、例えば上の引用文献から当業者に明らかになる。しかし、本発明は、その最も広い意味で、細菌系での発現に限定されないことに留意するべきである。
好ましくは、本発明では、医薬使用に適する形で本発明のポリペプチドを提供する（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系、例えば細菌発現系が用いられ、そのような発現系は前と同じように当業者に明らかになる。同様に当業者に明らかになる通り、医薬使用に適する本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の技術を用いて調製することができる。
工業規模の生産のために、二パラトープ性ＮａｎｏｂｏｄｉｅｓまたはＮａｎｏｂｏｄｙ含有タンパク治療薬の（工業）生産のための好ましい異種宿主には、大規模発現／生産／発酵、特に大規模医薬（すなわちＧＭＰグレード）発現／生産／発酵に適する大腸菌（E. coli）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、酵母（S. cerevisiae）の株が含まれる。そのような株の適する例は、当業者に明らかになる。そのような株および生産／発現系は、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）などの会社によっても入手可能になる。
あるいは、哺乳動物細胞系、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模発現／生産／発酵、特に大規模医薬発現／生産／発酵のために用いることができる。前と同じように、そのような発現／生産系も、上記の会社のいくつかによって入手可能になる。
具体的な発現系の選択は、特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化のための必要条件に一部依存するであろう。グリコシル化が望まれるか必要とされるＮａｎｏｂｏｄｙ含有組換えタンパク質の生産は、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現宿主の使用を必要としよう。これに関して、得られるグリコシル化パターン（すなわち付着する残基の種類、数および位置）が、発現のために用いられる細胞または細胞系に依存することは、当業者に明らかになる。好ましくは、ヒトの細胞または細胞系（すなわち、ヒトグリコシル化パターンを本質的に有するタンパク質をもたらす）が用いられるか、あるいはヒトグリコシル化と本質的におよび／もしくは機能的に同じであるか、またはヒトグリコシル化を少なくとも模倣するグリコシル化パターンを提供することができる別の哺乳動物細胞系が用いられる。一般に、大腸菌（E. coli）などの原核生物宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有さず、酵母などのより下等の真核細胞の使用は、ヒトグリコシル化と異なるグリコシル化パターンを通常もたらす。それにもかかわらず、得られる所望の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドに従い、前述の全ての宿主細胞および発現系を本発明で用いることができることを理解すべきである。
したがって、本発明の一態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、グリコシル化される。本発明の別の非限定的態様により、本発明のアミノ酸配列、Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、グリコシル化されない。
本発明の１つの好ましいが、非限定的な態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、細菌細胞、特に大規模医薬生産に適する細菌細胞、例えば上で指摘した株の細胞で生成される。
本発明の別の好ましいが、非限定的な態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、酵母細胞、特に大規模医薬生産に適する酵母細胞、例えば上で指摘した種の細胞で生成される。
本発明のさらに別の好ましいが、非限定的な態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞またはヒト細胞系の細胞、より詳細には大規模医薬生産に適するヒト細胞またはヒト細胞系の細胞、例えば上で指摘した細胞系で生成される。
ＷＯ０８／０２００７９の１３８頁および１３９頁でさらに記載される通り、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドを生成するために宿主細胞での発現が用いられる場合は、これらは細胞内で生成され（例えばサイトゾル、ペリプラズマ（periplasma）または封入体で）、次に宿主細胞から単離され、任意選択でさらに精製されるか；または細胞外で生成され（例えば宿主細胞が培養される培地で）、次に培地から単離され、任意選択でさらに精製されてもよい。したがって、本発明の１つの非限定的態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、細胞内で生成され、宿主細胞から、特に細菌細胞または細菌細胞中の封入体から単離されたアミノ酸配列、Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドである。本発明の別の非限定的態様により、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、細胞外で生成され、宿主細胞が培養される培地から単離されたＮａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドである。
これらの宿主細胞で用いるための一部の好ましいが、非限定的なプロモーターには、ＷＯ０８／０２００７９の１３９頁および１４０頁で指摘されるものが含まれる。
これらの宿主細胞で用いるための一部の好ましいが、非限定的な分泌配列には、ＷＯ０８／０２００７９の１４０頁で指摘されるものが含まれる。
本発明の宿主または宿主細胞を形質転換するための適する技術は当業者に明らかになり、意図する宿主細胞／宿主生物体および用いる遺伝子構築物に依存してよい。前と同じように、上で指摘したハンドブックおよび特許出願を参照されたい。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物で首尾よく形質転換された宿主細胞または宿主生物体を検出および選択するステップを実施することができる。これは例えば、本発明の遺伝子構築物に存在する選択マーカーに基づく選択ステップ、または本発明のポリペプチドの、例えば特異抗体を用いた検出を含むステップであってもよい。
形質転換宿主細胞（それは、安定した細胞系の形であってよい）または宿主生物体（それは、安定した突然変異体の系統または株の形であってよい）は、本発明のさらなる態様を形成する。
好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物体は、それらが（宿主生物体の場合は、その少なくとも１つの細胞、部分、組織または器官で）、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドを発現するか、発現することが（少なくとも）可能である（例えば適する条件下で）ようなものである。本発明は、例えば細胞分裂または有性もしくは無性生殖によって得ることができる、本発明の宿主細胞または宿主生物体のさらなる世代、後代および／または子孫も含む。
本発明のアミノ酸配列を生成し／その発現を得るために、形質転換宿主細胞または形質転換宿主生物体を、一般に本発明の（所望の）二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドが発現／生成されるような条件下で保管、維持および／または培養することができる。適する条件は当業者に明らかになり、通常、用いる宿主細胞／宿主生物体に、ならびに本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存する。前と同じように、本発明の遺伝子構築物に関する段落中の、上で指摘したハンドブックおよび特許出願を参照されたい。
一般に、適する条件には、適する培地の使用、食物の適する供給源および／または適する栄養素の存在、適する温度の使用、ならびに任意選択で適する誘導因子または化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導可能なプロモーターの制御下にあるとき）を含めることができ；その全ては当業者が選択することができる。前と同じように、そのような条件下で、本発明のポリペプチドは、構成的方法、過渡的方法で、または適切に誘導されるときだけ発現させることができる。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、（当初）未熟な形（上で指摘した通り）で生成することができ、それは、用いる宿主細胞／宿主生物体に従い、次に翻訳後修飾にかけることができることも当業者に明らかになる。さらに、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、前と同じように用いる宿主細胞／宿主生物体に従いグリコシル化されてもよい。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドは、それ自体公知であるタンパク質単離および／または精製技術、例えば（調製用）クロマトグラフィーおよび／もしくは電気泳動技術、差別的沈殿技術、親和性技術（例えば本発明のアミノ酸配列、Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドと融合させた特異的、開裂可能なアミノ酸配列を用いる）ならびに／または調製用免疫学的技術（すなわち単離されるアミノ酸配列に対する抗体を用いる）を用いて、次に宿主細胞／宿主生物体から、および／または前記宿主細胞もしくは宿主生物体が培養された培地から単離することができる。
一般に、医薬使用のために、本発明のポリペプチドは、本発明の少なくとも１つのポリペプチドならびに少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意選択で１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む医薬調製物または組成物として製剤化することができる。非限定例により、そのような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入による）、局所投与、吸入（例えば、ネブライザー、メーター付薬用量吸入器（ＭＤＩ）または乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、または経鼻経路による）、皮膚パッチ、インプラント、坐薬、舌下経路などによる投与に適する形であってよい。そのような適する投与形−投与方法次第で固体、半固体または液体であってよい−ならびにその調製で用いられる方法および担体は当業者に明らかになり、本明細書にさらに記載される。
したがって、さらなる態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの二パラトープ性ポリペプチド、好ましくは本発明による少なくとも１つの二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメイン、より好ましくは少なくとも１つの二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ、および少なくとも１つの適する担体、希釈剤または賦形剤（すなわち医薬使用に適する）、および任意選択で１つまたは複数のさらなる活性物質を含有する医薬組成物に関する。
一般に、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、それ自体公知である任意の適する方法で製剤化および投与することができ、それに関しては、例えば上で引用した一般的な背景技術（特に、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６７およびＷＯ０８／０２００７９）、ならびに標準ハンドブック、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、18版、Mack Publishing Company、USA（1990）、Remington、Science and Practice of Pharmacy、21版、Lippincott Williams and Wilkins（2005）；またはHandbook of Therapeutic Antibodies（S. Dubel編）、Wiley、Weinheim、2007（例えば252〜255頁を参照）を参照されたい。
例えば、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、従来の抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびダイアボディを含む）ならびに他の薬学的に活性なタンパク質のための、それ自体公知である任意の方法で製剤化および投与することができる。そのような製剤およびそれを調製する方法は当業者に明らかになり、例えば、非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内またはクモ膜下投与）または局所（すなわち経皮または皮内）投与に適する調製物が含まれる。
非経口投与のための調製物は、例えば、注入または注射に適する無菌の溶液、懸濁液、分散液または乳濁液であってよい。そのような調製物のための適する担体または希釈剤には、例えばＷＯ０８／０２００７９の１４３頁で指摘されるものが含まれるが、これらに限定されない。通常、水溶液または懸濁液が好まれる。
二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインおよびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを含む本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、遺伝子療法の送達方法を用いて投与することもできる。例えば、参照により完全に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号を参照。遺伝子療法の送達方法を用いて、本発明の二パラトープまたはポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトさせた一次細胞は、特定の器官、組織、移植片、腫瘍または細胞を標的にするために組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトさせることができ、ならびに細胞下に局在化された発現のためのシグナルおよび安定化配列でさらにトランスフェクトさせることができる。
したがって、本発明の二パラトープおよびポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、不活性の希釈剤または同化性の食用に適する担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、例えば経口的に全身投与することができる。それらは硬質か軟質のシェルのゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、または患者の食事の食物に直接に組み込むことができる。経口による治療的投与のために、本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、１つまたは複数の賦形剤と組み合わせて、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形で用いることができる。そのような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の本発明の二パラトープ性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｙを含有するべきである。組成物および調製物中のそれらの百分率は、当然ながら変化させることができ、便利には所与の単位剤形の重量の約２〜約６０％であってよい。そのような治療的に有益な組成物中の本発明の二パラトープ性ポリペプチドは、有効な投薬レベルが得られるようなものである。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤および甘味料または着香剤、例えばＷＯ０８／０２００７９の１４３〜１４４頁で指摘されるものを含有することもできる。単位剤形がカプセル剤である場合は、それは、上記の種類の材料に加えて、液状担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の材料がコーティング剤として、さもなければその固形の単位剤形の物理形状を変えるために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤をゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖などでコーティングしてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチド、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびに香料、例えばチェリーまたはオレンジのフレーバーを含有することができる。当然ながら、任意の単位剤形の調製で用いられるいかなる材料も、使用される量で薬学的に許容されるべきで、実質的に非毒性であるべきである。さらに、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、徐放性調製物および装置に組み込むことができる。
経口投与のための調製物および製剤は、本発明の構築物が胃環境に抵抗して腸に到達することを可能にする腸溶コーティングで提供されてもよい。より一般には、経口投与のための調製物および製剤は、胃腸管の任意の所望の部分への送達のために、適切に製剤化することができる。さらに、胃腸管への送達のために適する坐薬を用いることができる。
ＷＯ０８／０２００７９の１４４頁および１４５頁でさらに記載される通り、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与することもできる。
局所投与については、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、すなわちそれらが液体の場合は純粋な形で塗布することができる。しかし、ＷＯ０８／０２００７９の１４５頁でさらに記載される通り、固体または液体であってよい皮膚科学的に許容される担体と一緒に、それらを組成物または製剤として皮膚に投与することが一般に望ましい。
一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドの濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％である。ゲルまたは粉末などの半固体または固体の組成物での濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％である。
処置で使用するために必要とされる本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドの量は、選択される特定の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙまたはポリペプチドだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には主治医または臨床医の裁量で決められる。さらに、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびポリペプチドの投薬量は、標的の細胞、腫瘍、組織、移植片または器官によって異なる。
所望の用量は、便利には、単一の用量で、または適当な間隔、例えば、１日につき２つ、３つ、４つまたはそれ以上の下位用量で投与される分割用量として提供されてもよい。下位用量はそれ自体、例えばいくつかの別個のゆるやかな間隔の投与、例えば、吹入器からの複数回の吸入、または目への複数の滴下剤の適用にさらに分割されてもよい。
投与レジメンは、長期の、毎日の処置を含むことができる。「長期」とは、少なくとも２週、好ましくは数週間、数カ月または数年の期間を意味する。この投薬量範囲で必要な修正は、本明細書の教示を考慮して、ルーチンの実験だけを用いて当業者が決定することができる。Remington's Pharmaceutical Sciences（Martin, E.W.、4版）、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照。合併症が発生した場合、投薬量を個々の医師が調整することもできる。
その態様の別の１つでは、本発明は、本発明によるポリペプチドまたは医薬組成物、好ましくは本発明による二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓまたはそれを含む組成物の有効量を投与することによって、ＣＸＣＲ２シグナル伝達の異常な機能が関与する疾患または状態を処置する方法に関する。本明細書に論じられる通り、ＣＸＣＲ２シグナル伝達は、肺実質の破壊を引き起こす慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹っている患者の肺で、炎症性応答を媒介する。ＣＯＰＤに罹っている患者の肺で数の上昇が見られる白血球の移動は、そのような細胞の表面でＣＸＣＲ２によって媒介され、それはＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、β、γ、ＥＭＡ７８およびＧＣＰ−２を含むいくつかのリガンドに結合する。肺での好中球の数の増加は、疾患の重症度と相関する。さらに、ＧＲＯ−α濃度は、ＣＯＰＤ患者の誘導された痰および気管支洗浄（ＢＡＬ）液で著しく上がる。したがって、ＣＸＣＲ２拮抗は、この疾患を予防するか、治療するか、またはその悲惨な症状を軽減すると予想される。
したがって、本発明は、二パラトープ性ポリペプチド、例えば本発明の二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ、特にその医薬組成物を投与することを含む、ＣＯＰＤまたはＣＯＰＤの増悪を予防または治療する方法に関する。本発明は、ＣＯＰＤおよびＣＯＰＤの増悪を治療するための、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを含む前記二パラトープ性ポリペプチドおよびそれらを含有する組成物の使用にも関する。
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、特に二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびその組成物が、ＣＸＣＲ２シグナル伝達の異常な機能が関与する他の疾患、例えば、呼吸器官の他の状態、例えば、嚢胞性線維症、重度の喘息、喘息の増悪、アレルギー性喘息、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成の処置でも有益であることは、熟練読者に容易に明らかになる。
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびその医薬組成物によって予防または治療することができるさらなる疾患および状態は、アテローム硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管形成、ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、加齢性黄斑変性疾患、目のベーチェット病、ブドウ膜炎、特発性のＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび関連ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、骨関節炎、非小細胞がん腫、結腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞がんまたは虚血再かん流傷害である。
本発明の二パラトープ性ポリペプチド、例えば二パラトープ性免疫グロブリン単一可変ドメインまたはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓおよびその医薬組成物によって予防または治療することができるさらなる疾患および状態は、鎌状赤血球症での溶血性の輸血誘導血管閉塞危機、虚血／再かん流傷害、急性の脳卒中／心筋梗塞、非開放性頭部損傷、外傷後炎症およびインスリン抵抗性糖尿病である。
上の方法のために、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれを含む組成物は、用いる具体的な医薬製剤または組成物に従い、任意の適する方法で投与されてもよい。したがって、本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれを含む組成物は、前と同じように用いる具体的医薬製剤または組成物に従って、例えば経口的、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または胃腸管を回避する任意の他の投与経路を通して）、鼻腔内、経皮的、局所的、坐薬、吸入により投与することができる。一般的に、ＣＯＰＤについては、吸入は好ましい経路でない。臨床医は、個々の患者の必要に従い、適する投与経路およびそのような投与で用いられる、適する医薬製剤または組成物を選択することができる。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれを含む組成物は、予防または治療する疾患または障害を予防および／または治療するのに適する処置体系に従って投与される。臨床医は、予防または治療する疾患または障害、治療する疾患の重症度および／またはその症状の重症度、用いる本発明の具体的な二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド、用いる具体的な投与経路および医薬製剤または組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、一般条件、ならびに臨床医に周知である類似した因子などの因子に従い、適する処置レジメンを決定することが一般にできる。
一般に、本明細書で指摘する疾患および障害、特にＣＯＰＤの予防および／または治療のために、投与される量は、用いる本発明の具体的な二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの効力、用いる具体的な投与経路および具体的な医薬製剤または組成物に依存する。一般に、それは、１日に体重１ｋｇにつき１グラム〜０．０１マイクログラム、好ましくは１日に体重１ｋｇにつき０．１グラム〜０．１マイクログラム、例えば１日に体重１ｋｇにつき約１、１０、１００または１０００マイクログラムの量で、連続的に（例えば注入による）、単一の日用量として、または１日に複数の分割用量として投与される。本明細書で指摘する因子に従い、臨床医は適する日用量を決定することが一般にできる。具体的な症例では、臨床医は、例えば前述の因子および専門的判断に基づいてこれらの量からの逸脱を選択することができることも明らかになる。
本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびポリペプチドは、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性な化合物または有効成分と一緒に、すなわち、相乗効果につながってもつながらなくてもよい併用処置レジメンとして用いることもできる。前と同じように、臨床医は、前述の因子および専門的判断に基づいて、そのようなさらなる化合物または有効成分、ならびに適する併用処置レジメンを選択することができる。
例えば、二パラトープ性ポリペプチド、例えば本発明の二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを、ＣＯＰＤのための従来の処置法、例えば短時間および長時間作用型のβアドレナリン作用性気管支拡張剤、吸入抗コリン作働性薬（ムスカリン様アンタゴニスト）ならびに吸入コルチコステロイドと併用することが可能であろう。
臨床医に明らかになる通り、本発明により用いられる処置レジメンの有効性は、関与する疾患または障害に関してそれ自体公知である任意の方法で判定および／または追跡することができる。臨床医は、適当な場合、およびケースバイケースで、所望の治療効果を達成するように、望ましくない副作用を回避、制限もしくは低減するために、および／または一方で所望の治療効果を達成することと他方で望ましくない副作用を回避、制限もしくは低減することの間で適当な均衡を達成するために、特定の処置レジメンを変更または修正することもできる。
一般に、処置レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および/または所望の治療効果を維持しようとする期間追跡される。前と同じように、これは臨床医が決定することができる。
処置対象は、任意の温血動物であってよいが、特に哺乳動物、より詳細にはヒトである。当業者に明らかになる通り、処置対象は、特に本明細書で指摘する疾患および障害に罹っているかその危険がある人である。
本発明は、以下の非限定的な好ましい態様、例および図面によってここからさらに記載される。
本明細書で参照され、参照によって本明細書に組み込まれる全ての刊行物。
１．ヒトおよびｃｙｎｏのＣＸＣＲ２のクローニング
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ７９０−２０）は、様々な哺乳動物細胞系でのハイレベルな構成的発現のために設計されている。それは、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーター、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、哺乳動物細胞のためのネオマイシン選択マーカーおよび大腸菌（E. coli）での選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子を含有する。
ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ２６０−２０）は、ＤＮＡワクチンのために設計されたプラスミドベクターである。それは、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーター、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび大腸菌（E. coli）での選択のためのカナマイシン抵抗性遺伝子を含有する。
２．ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２を発現するＣＨＯ、ＣａＫｉ、ＲＢＬおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の確立
ＣＨＯ−Ｋ１Δ１−１７ヒトＣＸＣＲ２（Ｎ末端３ｘＨＡタグ）
Ａｍａｘａエレクトロポレーションシステム（溶液ＴでプログラムＵ２３）を用いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をプラスミドｐｃＤＮＡ３．１＿３ｘＨＡ−Δ１−１７−ｈＣＸＣＲ２にトランスフェクトさせた。トランスフェクション細胞のプールを、トランスフェクション後の２日目から選択圧（１０００αｇ／ｍＬ Ｇ４１８）の下に置いた。８日後に、ヒトＣＸＣＲ２陽性集団を、ＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識ヒトＧＲＯ−αを使って同定した。ヒトＧｒｏ−α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＰＨＣ１０６３）のＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識は、製造業者の指示（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３２８４０８）に従ってＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ単官能反応性色素キットを用いて実行した。ＦＡＣＳａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、単細胞を９６ウェル細胞培養プレートに分配した。ＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識ヒトＧＲＯ−αを使って、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）デバイスで、成長するクローンをΔ１−１７ヒトＣＸＣＲ２発現について試験した。最も高い発現を有するＣＨＯ−Ｋ１クローンを選択した（９０００のＭＣＦ値）。
ＨＥＫ２９３ＴカニクイザルＣＸＣＲ２
ＦｕＧｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプラスミドｐｃＤＮＡ３．１＿ｃＣＸＣＲ２にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後、５０ｎＭのＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識ＧＲＯ−αを使って、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）デバイスで、細胞をｃＣＸＣＲ２発現について試験した。優れた発現（およそ１２０００のＭＣＦ値）を有する細胞をさらに用いた。
ＲＢＬ−２Ｈ３カニクイザルＣＸＣＲ２
３７℃／５％ＣＯ２で成長させ、１×非必須アミノ酸、０．１５％炭酸水素ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＭＥＭイーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でルーチンに継代培養したラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）を、製造業者のプロトコルに従ってエレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるヌクレオフェクションにかけた。トランスフェクション細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、トランスフェクションの２４時間後に、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度までジェネテシンを加えることによって、抗生物質選択を開始した。トランスフェクション細胞を選択培地で３〜５日の間成長させ、継代培養した後、連続希釈による９６ウェルプレートへの単細胞選別にかけた。およそ２週後に、活発に成長するコロニーを増殖させ、ｃｙｎｏＣＸＣＲ２転写産物発現についてその後分析した。分析のために、次に陽性クローンをさらに増殖させた。
ＣＨＯ−Ｔｒｅｘ（ＨＡ）３−ｈｕＣＸＣＲ２と（ＨＡ）３ｈｕＣＣＲ９−ＣＸＣＲ２のハイブリッド
１０％の無テトラサイクリンウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを加えた２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するハムのＦ１２培地で、チャイニーズハムスター卵巣Ｔ−Ｒｅｘ（Ｔ−Ｒｅｘ（商標）−ＣＨＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｒ７１８−０７）を単層培養として３７℃で維持した。このテトラサイクリンによって調節される発現（Ｔ−Ｒｅｘ（商標））細胞系は、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）を安定して発現する。ヌクレオフェクション手法（細胞系ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴ、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、プログラムＵ−２３）を用いて、次に両方のＣＸＣＲ２構築物を発現する安定細胞系を生成した。トランスフェクション細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、トランスフェクションの４８時間後に３００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎで処理した。陽性形質転換体の選択を可能にするために、Ｚｅｏｃｉｎの存在下で細胞を２週間培養し、その後、Ｍｏ−Ｆｌｏ ＦＡＣＳソーターを用いて単細胞選別を実行した。２週後に、３００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ濃度のそれらの通常の培地で維持しながら、活発に成長するコロニーを増殖させた。
３．ヒトＧｒｏ−ａ、カニクイザルＧｒｏ−ａ、ヒトＩＬ−８、ヒトＥＮＡ−７８
４．ペプチド
ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＲ２の異なるＮ末端および細胞外のループ（ＥＬ）のひと続きの配列を表すペプチドを、Ｂａｃｈｅｍに注文した（表５）。「環状」と表されるペプチドでは、最初および最後のアミノ酸はシステイン残基で置き換えられ、野生型配列の天然に存在する内部システインはロイシン残基で置き換えられた。これらのペプチドは、隣接システイン残基を通して環化された。
５．免疫化
３頭のラマを、ヒトＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞で７〜９回免疫化し、１頭のラマは、カニクイザルＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞で６回免疫化した。このレジメンに、（不）完全フロイントアジュバントに混合したペプチド−キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）コンジュゲートカクテルの４回の投与が続き、ペプチドは、ヒトとカニクイザルの両方のＣＸＣＲ２の細胞外ループ番号２および３を表す（表５を参照）。他の８頭のラマを、ヒト完全長ＣＸＣＲ２またはｐＶＡＸ１から発現されるΔ１−１７ＣＸＣＲ２をコードするＤＮＡで４〜５回免疫化し、その後、ヒト完全長ＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞の１回投与が続いた。３頭のさらなるラマを、ｐＶＡＸ１から発現されるカニクイザルＣＸＣＲ２をコードするＤＮＡで４回免疫化し、その後、カニクイザルＣＸＣＲ２を発現する哺乳動物細胞の１回投与が続いた。免疫性の血液およびリンパ節試料を、抗原の各々の投与から４および８日後にとった。
６．ライブラリー構築
ｃＤＮＡ試料は、免疫性血液およびリンパ節試料の全ＲＮＡ調製物から作製した。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓをコードするヌクレオチド配列は、プライマーＡＢＬ０５１、ＡＢＬ０５２およびＡＢＬ００３を用いて、一段階ＲＴ−ＰＣＲ反応でヒトまたはカニクイザルのＣＸＣＲ２で免疫化した全てのラマのｃＤＮＡ試料から増幅した。プライマー配列は、表６に示す。試料中のＩｇＧ２およびＩｇＧ３ｃＤＮＡから増幅させた７００ｂｐアンプリコンをゲルから単離し、その後、ＳｆｉＩ制限酵素部位を含有するＡＢＬ０５０プライマーおよびＡＢＬ００３プライマーを用いるネステッドＰＣＲ反応で鋳型として用いた。ＰＣＲ生成物をその後ＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩ（ＶＨＨ遺伝子のＦＲ４に天然に存在する）で消化し、ファージミドベクターｐＡＸ５０の対応する制限部位にライゲーションし、大腸菌（Escherichia coli）ＴＧ−１でのエレクトロポレーションの後にライブラリーを得た。ｐＡＸ５０は、ＬａｃＺプロモーター、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリンまたはカルベニシリンの抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位およびｇｅｎ３リーダー配列を含有するｐＵＣ１１９から誘導された発現ベクターである。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）コード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端のｃ−ｍｙｃタグおよび（Ｈｉｓ）６タグをコードした。ファージミドベクターは、ｇｅｎｅＩＩＩ生成物との融合タンパク質として個々のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを発現する、ファージ粒子の生成を可能にする。
７．選択
バクテリオファージの表面で発現された上述のｐＡＸ５０ Ｎａｎｏｂｏｄｙライブラリーは、ＣＸＣＲ２エピトープを提示するペプチド、膜抽出物および全細胞を用いて選択した。
ペプチドを用いた選択は、ニュートラビジンコート（Ｐｉｅｒｃｅ、３１０００）Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、４３０３４１）の上に捕捉された０〜１０００ｎＭのビオチン化ペプチド（表５を参照）の上でファージライブラリーをインキュベートすることからなった。あるいは、ファージライブラリーを１０ｎＭビオチン化ペプチドを含む溶液にインキュベートし、その後、ストレプトアビジンコートＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１２−０６Ｄ）の上でペプチド−ファージ複合体を補足した。ブロッキングは、１％カゼインを加えたＰＢＳを用いて実施した。ライブラリーから調製したファージを加え、１時間インキュベートした（０．１％カゼインおよび０．１％ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで）。未結合のファージを洗い流し（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで）；結合したファージは、トリプシン（ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌ）の添加によって１５分間溶出した。第２ラウンドの選択を、本質的に、上記の通りに実施した。
膜抽出物を用いた選択は、ヒトＣＸＣＲ２を発現する細胞から調製された５０μｇ／ｍＬ（総タンパク）の膜抽出物（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＥＳ−１４５−Ｍ４００ＵＡおよび６１１０５２４４００ＵＡ）でイムノチューブ（Ｎｕｎｃ、４４４４７４）をコーティングすることによって実施した。陰性対照として、ヒトＦＰＲ１を発現するＣＨＯ細胞から調製された膜抽出物（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、６１１０５２７４００ＵＡ）を並行してコーティングした。４％Ｍａｒｖｅｌ脱脂乳粉末を加えたＰＢＳを用いて、ブロッキングを実施した。ファージを２時間（１％Ｍａｒｖｅｌを加えたＰＢＳ中で）インキュベートした。未結合のファージをＰＢＳで洗い流し；結合したファージは、トリプシン（ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌ）の添加によって１５分間溶出した。第２ラウンドの選択を、本質的に、上記の通りに実施した。場合によっては、無関係な細胞のバックグラウンドエピトープに結合しているファージは、対照の膜抽出物でコーティングした連続した管またはウェルの上でファージを前吸収することによって、特異的に減少させた。次に、コーティングされたヒトＣＸＣＲ２膜抽出物の上でのインキュベーションを、溶液中の対照膜抽出物の存在下で実施した。他の実験では、ペプチド上での１、２ラウンドの選択の後に、膜抽出物上での１ラウンドの選択が続くか、その逆であった。
別のセットの実験では、ヒトまたはカニクイザルのＣＸＣＲ２を発現する１，０００，０００〜５，０００，０００個の哺乳動物細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％Ｍａｒｖｅｌ脱脂乳粉末を加えたＰＢＳ中のファージライブラリーとインキュベートした。非形質転換細胞系を、陰性対照として用いた。未結合のファージをＰＢＳで洗い流し；結合したファージは、トリプシン（ＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌ）の添加によって１５分間溶出した。本質的に上記の通りであるが、第１ラウンドと異なる細胞系バックグラウンドで第２ラウンドを実施した。
他の実験では、溶液中の１μＭのペプチド（表５を参照）の存在下で、ＣＸＣＲ２を発現する膜抽出物または哺乳動物細胞とファージをインキュベートして、これらのペプチドによって表される領域に結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを発現するファージを減少させた。
８．ペリプラズム抽出物の調製
溶出されたファージを指数的に成長するＴＧ−１細胞に感染させ、次にそれらをカルベニシリン含有ＬＢ寒天平板の上で平板培養した。カルベニシリン抵抗性クローンを挿入断片の存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。カルベニシリンを加えたＴＢ培地で対象のクローンを成長させ、発現のためにＩＰＴＧの添加によって誘導した。発現は３７℃で４時間継続させ、続いて細胞を遠心沈降させた。大腸菌（E. coli）発現培養物からの一晩冷凍細胞ペレットをＰＢＳ（元の培養容量の１／１０）に溶解し、穏やかな振盪条件下で４℃で１時間、インキュベートした。次に、細胞をもう一度遠心沈降させ、ペリプラズム間隙に分泌されたタンパク質を含有する上清を保存した。
９．スクリーニング
ペリプラズム抽出物（上記）を、ヒトＣＸＣＲ２への結合におけるＧｒｏ−αとの競合についてＦＡＣＳで分析した。２×１０５細胞を、４℃で３０分間、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｆ７５２４））中のペリプラズム抽出物の１／２希釈溶液とインキュベートした。次に、ＦＡＣＳ緩衝液中の６ｎＭのＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識ヒトＧｒｏ−αの等量を加え、暗所において４℃でさらに３０分間、インキュベーションを継続した。細胞を次にＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、最終的にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。死細胞は、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４１７０）で染色された。試料を次にＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。表７は、そのペリプラズム抽出物がヒトＣＸＣＲ２に関してＧｒｏ−αとの競合を示したＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを掲載する。
別のセットアップでは、ペリプラズム抽出物をＥＬＩＳＡによりヒト１〜１９ペプチドへの結合について分析した。ＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ、４３０３４１）をニュートラビジンで２時間コーティングし、続いて１時間ブロッキングした（ＰＢＳ、１％カゼイン）。１００ｎＭビオチン化ヒト１〜１９ペプチドをこれらのプレートに１時間加え（ＰＢＳ、０．１％カゼイン、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）、続いてペリプラズム抽出物の１０倍希釈溶液と１時間インキュベーションした。未結合のペリプラズム抽出物を洗い流し（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳ）、結合したＮａｎｏｂｏｄｉｅｓは、マウス抗ｍｙｃ（Ｒｏｃｈｅ、１１６６７１４９００１）、続いてウサギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｐ０２６０）を用いて検出した。表８は、無関係な対照Ｎａｎｏｂｏｄｙに対する抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの結合シグナルの比を要約する。
１０．配列
先導特徴づけ一価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ
１１．一価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの構築
Ｆｗｄ−ＥＶＱＬ−ＭｆｅＩおよびＲｅｖ−ＴＶＳＳ−ＢｓｔＥＩＩプライマー（表１）を有する機能的ファージミドクローンでのＰＣＲによって得られた、Ｎａｎｏｂｏｄｙ含有ＤＮＡ断片を、ＭｆｅＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、ｐＡＸ１００ベクターにライゲーションし、大腸菌（E. coli）ＴＧ−１コンピテント細胞に形質転換させた。ｐＡＸ１００は、ＬａｃＺプロモーター、カナマイシン抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位およびＯｍｐＡリーダー配列を含有するｐＵＣ１１９から誘導された発現ベクターである。Ｎａｎｏｂｏｄｙコード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端のｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓ６タグをコードした。カナマイシン抵抗性クローンを挿入断片の存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。
１２．小規模発現
対象のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓをコードする発現ベクターを含有するＴＧ−１細胞を、ＴＢ培地プラス１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するバッフル振盪フラスコで成長させ、発現のために１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。発現は３７℃で４時間継続させた。細胞を回収した後に、ペリプラズム抽出物を調製し、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ Ｃｒｕｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、続く脱塩（ＨｉＰｒｅｐ２６／１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰＢＳでのゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＨＲ１６／１０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、Ｈｉｓ６標識Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを精製した。
１３．リガンド競合アッセイ
ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイで、精製した一価の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを３ｎＭのＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識Ｇｒｏ−αに対して滴定した（表１０）。ヒトＣＸＣＲ２では、ブロッキング効力の範囲は二桁のｎＭからｎＭ未満であるが、カニクイザルＣＸＣＲ２では、それらは一桁から二桁のｎＭの間である。
１４．組換え細胞系を用いる機能アッセイ
（１）細胞内カルシウムのアゴニストによって誘導される放出の測定（ＦＬＩＰＲ）
ヒトまたはカニクイザルのＣＸＣＲ２受容体を発現するＲＢＬ細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。実験当日、Ｆｌｕｏ−４色素を３７℃で３０分の間細胞に加え、続いて精製した一価の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓと３０分の間インキュベーションした。最後に、蛍光定量的画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いてＧＲＯ−αの添加を実施し、続いて細胞内カルシウムの放出に対応する蛍光性シグナルを検出した。ヒトＣＸＣＲ１を発現するＬ２０７１細胞を用いて、選択アッセイを実施した。アッセイプロトコルはＣＸＣＲ２についての記載と同じであったが、アゴニストとしてＩＬ−８が用いられた。平均ＩＣ５０値の要約を表１１に示し、さらに、試験したＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのいずれも、ＣＸＣＲ１受容体での細胞内カルシウムのアゴニストによって誘導される放出の阻害を試験濃度（１μＭ最大濃度）で示さなかった。
（２）アゴニストによって刺激された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの蓄積の測定
精製した一価の抗ＣＸＣＲ２Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを、ヒトＣＸＣＲ２受容体を発現するＣＨＯ細胞から調製したＧＲＯ−α、ＧＤＰ、ＳＰＡビーズおよびＣＨＯ−ＣＸＣ２膜と一緒に、９６ウェルプレートで６０分の間インキュベートした。これに、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの添加、およびさらなる６０分間のインキュベーションが続いた。最後に、プレートを遠心分離した後、Ｔｏｐｃｏｕｎｔで読み取った。平均ＩＣ５０値の要約を表１１に示す。
１５．一次好中球を用いた機能アッセイ
（１）ヒト好中球全血形状変化アッセイ（ｈＷＢＳＣ）
ドナーは、全身薬物療法を受けていない健康な正常ボランティアであった（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｈｏｒｓｈａｍドナーパネル）。５２ｍＭのＥＤＴＡ（滅菌）で血液凝固を阻止した全血を、１ｍＬ ＥＤＴＡ対９ｍＬ血液の比で回収した。血液を室温で回収し、使用前に３７℃に予熱した。ケモカインによる刺激の前に、８０μＬの全血を、室温で１０分の間ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓとプレインキュベートした（用量応答につき１０ポイント（０．０３〜１．１４４×１０−７μＭ）；１０μＬの形状変化アッセイ緩衝液を加えた０化合物以外の全てのウェルに、１０μＬのｒｈＧＲＯα（２ｎＭの近似ＥＣ７０濃度）を加えた。試料を静かに振盪し、３７℃でさらなる５分間インキュベートした。管を次に氷上に置き、２５０μＬの氷冷最適化ＣｅｌｌＦｉｘ（商標）溶液を加え、管を静かに振盪し、さらなる５分間インキュベートし、その後、１．４ｍＬの１×塩化アンモニウム溶解溶液を全ての管に加え、さらなる２０分間氷上に放置した。赤血球溶血の後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で試料を分析した。細胞集団は、前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）ゲーティングと、続く第１のプロットからのゲート制御顆粒球を用いたＦＳＣ／ＦＬ−２プロットによって同定した。好中球はＦＬ−２プロットの上で好酸球と区別されたが、その理由は後者がより高い自己蛍光性を有するからである。１試料につき５０００個のイベントを計数した。
（２）ヒト好中球化学走性アッセイ
ドナーは、全身薬物療法を受けていない健康な正常ボランティアであった（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｈｏｒｓｈａｍドナーパネル）。５２ｍＭのＥＤＴＡ（滅菌）で血液凝固を阻止した全血を、１ｍＬ ＥＤＴＡ対９ｍＬ血液の比で回収した。白血球は、標準プロトコルを用いて単離した：４％デキストランを２０ｍＬの血液凝固を阻止した血液に加え、静かに混合し、次に３０分間氷上でインキュベートして赤血球を沈降させた。末梢血単核細胞（ＰＭＮ）を含有する上清をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配の上に次に重層し、１８℃で２５分間、３００×ｇで遠心分離した。ＰＭＮに富む分画を５００μＬの１ＸＰＢＳに再懸濁し、低張性ショックを使用して赤血球溶血を実行した。２０ｍＬの氷冷滅菌の無エンドトキシン蒸留水をペレットに加え、溶解を３０〜４０秒間起こさせた後に、２０ｍＬの２×ＰＢＳを加えた。試料を静かに混合し、１８℃で１０分間３００×ｇで遠心分離し、顆粒球を得た。顆粒球ペレットを５００μＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、５０ｍＬの×１ ＰＢＳで２回洗浄した。顆粒球ペレットをＲＰＭＩ１６４０、ｐＨ７．４、プラス２．５％ＦＢＳに再懸濁し、計数し、２ｅ６／ｍＬの最終濃度まで希釈した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからの３μｍ ＰＥＴ膜とトランスウェルプレートを用いて、移動を測定した。簡潔には、６ｎＭのＧＲＯα（ＥＣ８０−ＥＣ１００）をプレートの底ウェル（１０００μＬ／ウェル）に加えた後に、多重ウェル挿入断片を適正位置に下げ、ＲＴで３０分間様々な濃度のＮａｎｏｂｏｄｙ（一価については０．１３〜１０００ｎＭ、二パラトープについては０．６ｐＭ〜３０ｎＭ）とプレインキュベートしたＰＭＮを次に挿入断片に加えた（５００μＬ／ウェル）。プレートを次に３７℃で９０分間インキュベートし、底チャンバーに移動した細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて計数された。フローサイトメーターは、１試料につき２０秒の設定時間、ＦＳＣ／ＦＬ−２プロット上のＲ２ゲートの中でのイベント数を計数するように設定された。
（３）カニクイザル好中球全血形状変化アッセイ（ＣｙｎｏＷＢＳＣ）
前腕または脚のいずれかからとられた静脈血を、１ｍＬクエン酸ナトリウム対９ｍＬ血液の比の、３．８％クエン酸ナトリウム（滅菌）で血液凝固を阻止した。血液を室温で回収し、使用前に３７℃に予熱した。ケモカインによる刺激の前に、８０μＬの全血を、室温で１０分の間ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓとプレインキュベートした（用量応答につき１０ポイント（０．０３〜１．１４４×１０−７μＭ）；１０μＬの形状変化アッセイ緩衝液を加えた０化合物以外の全てのウェルに、１０μＬのｒｈＧＲＯα（３０ｎＭの近似ＥＣ７０〜９０濃度）を加えた。試料を静かに振盪し、３７℃でさらなる５分間インキュベートした。管を次に氷上に置き、２５０μＬの氷冷最適化ＣｅｌｌＦｉｘ（商標）溶液を加え、管を静かに振盪し、さらなる５分間インキュベートし、その後、２ｍＬの溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｒ７７５７）を全ての管に加え、さらなる４０〜６０分間氷上に放置した。赤血球溶血の後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で試料を分析した。細胞集団は、前方散乱／側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）ゲーティングと、続く第１のプロットからのゲート制御顆粒球を用いたＦＳＣ／ＦＬ−２プロットによって同定した。好中球はＦＬ−２プロットの上で好酸球と区別されたが、その理由は後者がより高い自己蛍光性を有するからである。１試料につき５０００個のイベントを計数した。
多価性Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ
１６．二価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの構築
二価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを構築するために２つのアプローチを用いた。
一価の構成単位をコードするプラスミドＤＮＡで、ＰＣＲ増幅を実行した。Ｆｗｄ−ＥＶＱＬ−ＭｆｅＩおよびＧｌｙＳｅｒリンカーの一部をコードするリバースプライマーを用いてＮ末端構成単位を増幅したのに対して、ＧｌｙＳｅｒリンカーの残りの部分をコードするフォワードプライマーおよびＲｅｖ−ＴＶＳＳ−ＢｓｔＥＩＩを用いてＣ末端構成単位を増幅した（表６）。Ｎ末端断片をＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｃ末端断片をＢａｍＨＩおよびＢｓｔＩＩで消化した。次にこれらを同時にｐＡＸ１００ベクターにライゲーションし、大腸菌（E. coli）ＴＧ−１コンピテント細胞に形質転換させた。
あるいは、一価の構成単位をコードするプラスミドＤＮＡで、異なるＰＣＲ増幅を実行した。Ｆｗｄ−ＥＶＱＬ−ＭｆｅＩおよびＲｅｖ−ＴＶＳＳ−ＢｓｐＥＩを用いてＮ末端構成単位を増幅したのに対して、Ｆｗｄ−ＥＶＱＬ−ＢａｍＨＩおよびＲｅｖ−ＴＶＳＳ−ＢｓｔＥＩＩを用いてＣ末端構成単位を増幅した（表６）。Ｎ末端断片をＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｃ末端断片をＢｓｐＥＩおよびＢｓｔＩＩで消化した。Ｎ末端断片をＧｌｙＳｅｒリンカーのコード情報を含有するｐＡＸ１００誘導体にライゲーションし（ＭｆｅＩ−ＢｓｐＥＩ）、大腸菌（E. coli）ＴＧ−１コンピテント細胞に形質転換させた。この形質転換混合物からのプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓｐＥＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、次にＣ末端断片をｐＡＸ１００ベクターにライゲーションし、大腸菌（E. coli）ＴＧ−１コンピテント細胞に形質転換させた。
カナマイシン抵抗性クローンを挿入断片の存在について分析し、陽性クローンの配列を検証した。
１７．多価性抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの配列
１８．リガンド競合アッセイ
ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイで、多価の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを３ｎＭのＦＭＡＴ Ｂｌｕｅ標識Ｇｒｏ−αに対して滴定した（表１４）。ヒトＣＸＣＲ２では、ブロッキング効力の範囲は二桁のｎＭからｎＭ未満の間であるが、カニクイザルＣＸＣＲ２では、それらは一桁から二桁のｎＭの間である。
１９．組換え細胞系を用いた機能アッセイ
（１）細胞内カルシウムのアゴニストによって誘導される放出の測定（ＦＬＩＰＲ）
ヒトまたはカニクイザルのＣＸＣＲ２受容体を発現するＲＢＬ細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。実験当日、Ｆｌｕｏ−４色素を３７℃で３０分の間細胞に加え、続いて精製した多価の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓと３０分の間インキュベーションした。最後に、蛍光定量的画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いてＧＲＯ−αの添加を実施し、続いて細胞内カルシウムの放出に対応する蛍光性シグナルを検出した。ＩＬ−８をアゴニストとしてヒトＣＸＣＲ１を発現するＬ２０７１細胞、およびＳＤＦ−１をアゴニストとしてヒトＣＸＣＲ４を内因的に発現するＣＥＭ細胞を用いて、選択性アッセイを実施したが、アッセイプロトコルはＣＸＣＲ２についての記載と同じであった。平均ＩＣ５０値の要約を表１５に示し、さらに、試験したＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのいずれも、ＣＸＣＲ１またはＣＸＣＲ４での細胞内カルシウムのアゴニストによって誘導される放出の阻害を試験濃度（１μＭ最大濃度）で示さなかった。
（２）アゴニストによって刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの蓄積の測定
精製した多価の抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを、ヒトＣＸＣＲ２受容体を発現するＣＨＯ細胞から調製したアゴニスト（ＧＲＯ−α、ＩＬ−８またはＥＮＡ−７８）ＧＤＰ、ＳＰＡビーズおよびＣＨＯ−ＣＸＣ２膜と一緒に、９６ウェルプレートで６０分の間インキュベートした。これに、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの添加、およびさらなる６０分間のインキュベーションが続いた。最後に、プレートを遠心分離した後、Ｔｏｐｃｏｕｎｔで読み取った。平均ＩＣ５０値の要約を、表１５に示す。
（３）抗ＣＸＣＲ２ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの作用機構を判断するＳｃｈｉｌｄ分析
Ｓｃｈｉｌｄ分析は、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αによって刺激された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ蓄積アッセイを用いて実行した。このアッセイフォーマットは、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの添加の前にアゴニストおよびＮａｎｏｂｏｄｙの平衡を可能にし、結果として、機構の誤解釈につながるかもしれない半平衡のいかなる人為産物も避けられるはずである。これを実行するために、Ｎａｎｏｂｏｄｙの漸増濃度の存在下でアゴニストの濃度反応曲線を求めた。２つの一価Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ、５４Ｂ１２および１６３Ｅ３と、生じた多価Ｎａｎｏｂｏｄｙのデータが例として与えられ、図１に示される。データはＧＲＯ−αの濃度反応曲線を示すが、ＩＬ−８を用いたときにも類似のデータが観察された。
一価のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ、５４Ｂ１２および１６３Ｅ３の両方は、アロステリック作用機構を示すが、アゴニストの阻害に差別的効果を及ぼす。５４Ｂ１２および他の１〜１９結合剤のアロステリック機構は、低いＮａｎｏｂｏｄｙ濃度でのアゴニスト濃度反応曲線の右への平行シフトによって例示され、それは、Ｎａｎｏｂｏｄｙの漸増濃度の存在下でさらに右にシフトしない（図１（ａ））。最大アゴニスト応答の減少のない、この効果の飽和的性質は、アゴニストの親和性に及ぼすアロステリック効果の指標となる。対照的に、１６３Ｅ３および他の非１〜１９結合剤のアロステリック機構は、より高いＮａｎｏｂｏｄｙ濃度での最大アゴニスト応答の低減と一緒に、アゴニスト濃度反応曲線の右平行シフトによって例示される（図１（ｂ））。この効果は飽和性であるかもしれないが、これは用いた濃度で観察されなかったが、鍵となる観察は、アゴニストの効能へのアロステリック効果の指標となる最大アゴニスト応答の低減である。最後に、二パラトープ性Ｎａｎｏｂｏｄｙ、５４Ｂ１２−１６３Ｅ３は、非常により低いＮａｎｏｂｏｄｙ濃度での右平行シフトおよび最大アゴニスト応答の有意な減少によって例示されるアゴニスト濃度反応曲線に対する影響をもたらす、両アロステリック機構を兼ね備える。（図１（ｃ））。二パラトープ性ナノボディ１２７Ｄ１−１６３Ｅ３、１２７Ｄ１−１６３Ｄ２および５４Ｂ１２−１６３Ｄ２も同様に試験し、類似した特性を有することが示された、（データは示さず）。
図１に例示するのと同じ特性は図２にも示され、その図は−ＧＲＯ−αを阻害する能力について試験したとき−代表的結合分子１２７Ｄ１は強力であるが、効果的でなく、他方、別の結合分子１６３Ｅ３はより低い効力を有するが、１２７Ｄ１より効果的であることを示す。２つの結合分子を組み合わせると、生じる二パラトープ性結合分子は強力であり、かつ効果的であることが示される。結論として、本発明の二パラトープ性分子は、効能および効力に関してモノマーのナノボディより優れた特性を有することが示された。ＩＣ５０値は、下の表に表す。
アロステリックモジュレーターの現在の定義は、それがアゴニスト（オルソステリックリガンド）結合部位と異なる部位で結合すること、およびオルソステリックリガンドとアロステリックモジュレーターの両方が同時に受容体に結合することである。発明者はこれを確認するデータを現在所有しないが、および理論により縛られることを望まないが、Ｎａｎｏｂｏｄｙ結合部位がアゴニスト結合部位と異ならず、結合部位が重複すると考えられている。アゴニストおよびＮａｎｏｂｏｄｙの両方が同時に受容体に結合することを示すデータも入手できないが、Ｓｃｈｉｌｄ分析データは、これらのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓがＣＸＣＲ２のアロステリックモジュレーターであることを示唆するようである。
２０．機能アッセイ−ＮＳＣ
セクション１５に記載されるのと同じ方法
リードパネル−ＣＤＲ＋ＦＲＣＸＣＲ２Ｋａｂａｔ
２１．配列最適化−ＣＸＣＲ２アンタゴニストポリペプチド
熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）：５μｌの精製した一価Ｎａｎｏｂｏｄｙ（８０ｍｇ／ｍｌ）を、１０μｌの緩衝液（１００ｍＭリン酸塩、１００ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭクエン酸塩、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、３．５から９の範囲の異なるｐＨで緩衝した）中の５μｌの蛍光性プローブＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ＃Ｓ６５５１）（最終濃度１０×）と混合した。次に試料を３７から９０℃まで４．４℃／ｓでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ機器（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で加熱し、その後、それらを３７℃まで２．２℃／ｓで冷却した。熱誘導アンフォールディングの結果、タンパク質の疎水性パッチが露出し、それにＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅが結合し、蛍光強度の増加をもたらす。蛍光強度曲線の一次導関数の屈折点は、融点（Ｔｍ）の尺度の役目をする。（Ericssonら2006（Annals of Biochemistry、357：289〜298頁）。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：実験は、製造業者の指示に従って、Ａｕｔｏ−Ｃａｐ ＶＰ−ＤＳＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）の融点測定は、３０℃から９５℃の温度範囲にわたって１℃／分の加熱速度で実施した。最終的な温度記録は、適切なベースライン減算の後に得た。ソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ７．０）によるピーク検出は、対応する融点を与えた。
強制酸化：Ｈ２Ｏ２なしの対照試料と平行して、Ｎａｎｏｂｏｄｙ試料（１ｍｇ／ｍＬ）を、ＲＴで４時間、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＨ２Ｏ２に暗所で曝し、続いて、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（０．５ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＰＢＳに緩衝液をスイッチした。次に、ストレス下の試料および対照試料を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の上で、１２００シリーズ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＲＰＣによって７０℃で分析した。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの酸化は、主要タンパクピークと比較して、酸化的ストレスの結果として起こるプレピークのピーク面積％の測定によって数量化した。
２Ｂ２配列最適化
親の２Ｂ２のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表２０、１４７頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を２Ｂ２、ＣＸＣＲ２００５９およびＣＸＣＲ２００６３から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で、または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した（表２１）。ＣＸＣＲ２００５９およびＣＸＣＲ２００６３でのＭ９３Ｌ突然変異は、強制酸化への親２Ｂ２の感受性を消滅させる。
９７Ａ９配列最適化
親の９７Ａ９のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表２２、１４７頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を９７Ａ９およびＣＸＣＲ２００６１から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で測定した（表２３）。
１６３Ｅ３配列最適化
親の１６３Ｅ３のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表２４、１４７頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を１６３Ｅ３およびＣＸＣＲ２００７６から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で測定した（表２５）。
１２７Ｄ１配列最適化
親の１２７Ｄ１のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表２６、１４７頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を１２７Ｄ１およびＣＸＣＲ２００７９から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で測定した（表２７）。ＣＸＣＲ２００７９でのＭ５７Ｒ突然変異は、強制酸化への親の１２７Ｄ１の感受性を消滅させる。
１６３Ｄ２配列最適化
親の１６３Ｄ２のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表２８、１４８頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を１６３Ｄ２およびＣＸＣＲ２００８６から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で測定した（表２９）。
５４Ｂ１２配列最適化
親の５４Ｂ１２のタンパク質配列を、ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）およびＪＨ５生殖細胞系と整列させた（表３０、１４８頁）。ヒト生殖細胞系配列と比較したアミノ酸の差は文字で表し、同一のアミノ酸はドットで表す。下線を引いたアミノ酸の差はヒト対応物への変換のために選択され、他はそのままにされた。
精製された一価の材料を５４Ｂ１２、ＣＸＣＲ２０１０３およびＣＸＣＲ２１０４から生成し、それを次に、ヒトおよびカニクイザルのＣＸＣＲ２でのＦＡＣＳリガンド競合アッセイおよび細胞内カルシウムアゴニスト誘導放出（ＦＬＩＰＲ）アッセイで特徴づけた。さらに、変異体の融点を熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）で測定した（表３１）。
２２．エピトープマッピング
ナノボディのエピトープマッピングは、彼らのショットガン突然変異誘発技術を用いてＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．、３７１１ Ｍａｒｋｅｔ ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｕｉｔｅ ９００、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ、www.integralmolecular.com、によって実行された。
ショットガン突然変異誘発技術要約
ショットガン突然変異誘発は、真核生物細胞中の大きなライブラリーの突然変異標的タンパク質の発現および分析を可能にする、所有権のあるハイスループット細胞発現技術を用いる。機能の変化をアッセイするために、タンパク質中のあらゆる残基は、通常複数の他のアミノ酸に個々に突然変異させられる。タンパク質は標準の哺乳動物細胞系の中で発現されるので、真核生物での翻訳または翻訳後のプロセシングを必要とする困難なタンパク質さえもマッピングすることができる。
エピトープマッピングの命名法は、以下の通りである：
ＲＤＨＢＣ ７９２＝ＣＸＣＲ２００７９
ＲＤＨＢＣ ７９３＝ＣＸＣＲ２００６１
ＲＤＨＢＣ ７９２＝ＣＸＣＲ２００７６
ショットガン突然変異誘発を用いて、抗ＣＸＣＲ２抗体ＲＤ−ＨＢＣ７９２（ＣＸＣＲ２００７９）、ＲＤ−ＨＢＣ７９３（ＣＸＣＲ２２００６１）およびＲＤ−ＨＢＣ７９４（ＣＸＣＲ２００７６）のエピトープを、以下の通りに単一のアミノ酸分解能でマッピングした。
親構築物：未標識の親遺伝子を高発現ベクターにクローニングし、配列決定をし、免疫検出によって発現を検証した。Ｎａｎｏｂｏｄｙ最適化：３９４ウェルマイクロプレートでナノボディ希釈溶液の一団をアッセイすることによって、ナノボディの検出をショットガン突然変異誘発フォーマットで最適化した。突然変異ライブラリーをスクリーニングするために、各ナノボディの最適濃度を選択した。突然変異ライブラリーを完成し、Ａｌａ置換へのあらゆる残基の突然変異を含む、保存的および非保存的変化に各アミノ酸位置を突然変異させた。ライブラリーを表面発現について試験し、免疫検出によりナノボディ結合について３反復でスクリーニングした。ナノボディ結合の減少についてのライブラリーの分析を実施し、重要な残基を特定し、マッピングした。
親構築物発現 一時的に発現された野生型親構築物の免疫検出は、免疫発光法および免疫蛍光法によって３８４ウェルフォーマットで実行した。全ての実験のために、精度および高い実験再現性を確保するために、細胞トランスフェクションおよび免疫染色に含まれる液体取扱い工程を、液体取扱いロボットを用いて実施した。
結論：対照ＭＡｂおよびポリクローナル血清を用いて頑強な表面発現および全発現が野生型親構築物のために検出されるので、野生型親構築物をショットガン突然変異誘発のために用いることができる。免疫発光アッセイは高いシグナル：バックグラウンドおよび低い変動性を示し、マッピング研究のために用いられる。
マッピングナノボディを用いて免疫検出を最適化した。野生型受容体またはベクターのみのプラスミドで一時的にトランスフェクトさせた細胞を用いて、免疫検出を３８４ウェルフォーマットで実行した。さらなるマッピング研究のために選択された濃度は、高いシグナル：バックグラウンドおよび低い変動性のほとんど最大のシグナルに基づいた。
突然変異ライブラリーをスクリーニングするための最終的なアッセイ条件
結論：３つのＣＸＣＲ２ナノボディの免疫検出およびエピトープマッピングの最終的な条件を決定した。最適化された条件はショットガン突然変異誘発フォーマットで高いシグナル：バックグラウンドおよび低い変動性をもたらし、したがって高い信頼性でエピトープマッピングのために用いることができた。エピトープマッピングは、ここで決定された同じアッセイ条件を適用することを含んだが、受容体変異体の突然変異ライブラリーが用いられた。
ナノボディエピトープのための重要な残基の同定
エピトープ情報のさらなる分析
ショットガン突然変異誘発マッピングによって同定された重要なアミノ酸は、３つのＣＸＣＲ２ ＭＡｂの結合部位を規定する。ＭＡｂ ＲＤ ＨＢＣ７９２は、ＣＸＣＲ２のＮ末端領域をマッピングし、重要な残基の近接性はエピトープが本来は線状であることを示唆する。ＭＡｂ ＲＤ ＨＢＣ７９３およびＲＤ ＨＢＣ７９４は、ＣＸＣＲ２のＥＣＬ１およびＥＣＬ３によって主に形成される高次構造が複雑なエピトープに結合するようである。ケモカイン受容体で細胞外ループを所定の位置に保つ２つのジスルフィド架橋を形成することが公知である細胞外Ｃｙｓ残基の突然変異は、ＭＡｂ ７９３および７９４の結合も排除するので、エピトープ相互作用に直接に関与するとは考えられていない。７９３および７９４のエピトープはかなり重複するが、２つの間の僅差が明白である。
２３．組換え細胞系でのＣＸＣＲ２選択性
細胞内カルシウムのアゴニストによって誘導される放出（ＦＬＩＰＲ）
ＣＸＣＲ２選択性をチェックするために、異なる一価の抗ＣＸＣＲ２ナノボディを、個々のナノボディ構成単位が３５ＧＳリンカーによって分離されている、一価、二価または二パラトープ性の構築物として合わせた。
ヒトＣＸＣＲ２受容体を発現するＲＢＬ細胞にＦｌｕｏ−４色素を３７℃で３０分間加え、その後精製した一価、二価または二パラトープ性のナノボディと３０分間インキュベーションした。最後に、蛍光定量的画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いてＧＲＯαの添加を実施し、続いて細胞内カルシウムの放出に対応する蛍光性シグナルを検出した。ヒトＣＸＣＲ１を発現するＬ２０７１細胞を用いて、選択アッセイを実施した。アッセイプロトコルはＣＸＣＲ２について記載したのと同じであったが、ＩＬ−８をアゴニストとして用いた。代表的な結果を図３に示す。
２４．抗ＨＳＡ（Ａｌｂ８）による半減期延長
好中球は、化学誘引を媒介する高レベルのＣＸＣＲ２受容体を発現する、炎症での主な炎症誘発性細胞の１つである。ＣＸＣＲ２リガンド（ＧＲＯα）または対照刺激（ＦＭＬＰ）による刺激の後の好中球の形状変化は、フローサイトメトリーによって数量化することができ、活性化マーカーとして用いることができる。
この研究では、半減期が延長したナノボディ（ＮＢ−ＮＢ（非ＨＬＥ：ＣＸＣＲ２００７６−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００７９（実施例では７６−７９とも呼ばれる）と比較してＨＬＥ：ＣＸＣＲ２００７６−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００７９−Ａｌｂ８（実施例では７６−７９−Ａｌｂ８とも呼ばれる））の薬力学的特性を判定するために、抗ＣＸＣＲ２ナノボディをｉｎ ｖｉｖｏでプロファイリングした。単一用量のナノボディを等モル用量でカニクイザルに静脈内注射した：フォーマットされていないナノボディ（ＮＢ−ＮＢ、０．３ｍｇ／ｋｇ）またはＡｌｂ８（抗ＨＳＡ）ドメインによって延長されたナノボディ（ＮＢ−ＮＢ−Ａｌｂ８、０．４５ｍｇ／ｋｇ）、血液を、投与前、および投与後３５日まで様々な時点で収集した。全ての構築物は、最初の試料採取時点（注射から１時間または３時間後）に、ｅｘ ｖｉｖｏで全血好中球形状変化（ＷＢＳＣ）を完全に阻害した。ＮＢ−ＮＢ非ＨＬＥナノボディの３０時間と比較して、ＮＢ−ＮＢ−Ａｌｂ８融合の９日間のより長い持続時間で明白な強力なＰＤ阻害（ＷＢＳＣ）。
２５．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ７９−７６−Ａｌｂ８および７９−８６−Ａｌｂ８は、ＣＸＣＲ２の機能的活性を完全にブロックする
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡおよび７９−８６−Ａｌｂ８−ＡＡは、機能的に同等であり、ＣＸＣＲ２の機能を完全にブロックする。したがって、これらの抗体は、Ｃ末端でのＡｌａ−Ａｌａ変異体の付加によって変化しない。
２６．健康なボランティアでのＣＸＣＲ２ナノボディと相互作用するＩｇＧ抗体の検出およびＣ末端伸長部の影響。
ヒト血清中のＣＸＣＲ２００７９−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００７６（７９−７６）、ＣＸＣＲ２００７９−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００７６−ＡＬＢ８（７９−７６−Ａｌｂ８）ＣＸＣＲ２００７９−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００８６（７９−８６）およびＣＸＣＲ２００７９−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００８６−ＡＬＢ８（７９−８６−Ａｌｂ８）に結合するＩｇＧ抗体の形成を、健康なドナーの血清（４４人の男性および４４人の女性）をサンドイッチＥＬＩＳＡでスクリーニングすることによって評価した。簡潔には、ナノボディＣＸＣＲ２００７９−３５ＧＳ−ＣＸＣＲ２００７６−ＡＬＢ８を、マイクロタイタープレートの上に直接に固定化する。抗ナノボディ抗体を固定化ナノボディによって捕捉し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合している抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異）抗体によって検出する。基質ＴＭＢとのインキュベーションの後、酵素反応の有色生成物の光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定する。用いる陽性対照抗体は、ヒト抗ＣＸＣＲ２抗体ＮＯＶ０２０５（１Ｍ８）（ファージディスプレイによって内部に生成される）、バッチＡＣＥ００２７７である。アッセイは検証されないので、予備的カットオフポイントを推定する、平均の標準化ＯＤ（ＯＤ試料／ＯＤ陰性対照）。
４４人の男性および４４人の女性の健康なドナー血清を試験し、男性の試料の５０％および女性の試料の６１％が、アッセイの予備的スクリーニングカットポイントの上で親ナノボディとの反応性を実証した（下の図面を参照する）。
いかなる説明、機構または仮説にも限定されずに、ＩｇＧが、ＣＨ１ドメインによって抗体中に通常覆い隠されている領域である、ヒト化Ｖｈドメイン中の立体構造エピトープと相互作用することを証拠は示唆する。この相互作用をブロックするために、様々なＣ末端伸長部（Ａ、ＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫＰ、ＧＧＧＳ）を生成し、抗Ｎｂ ＩｇＧおよび機能的活性について試験した。下の図面に示すデータは、ＡＡ Ｃ末端伸長部７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡを有する二パラトープ性の半減期延長ナノボディが、抗Ｎｂ ＩｇＧ反応性を男性では５０％から２０％に、女性では６１％から１６％に有意に低減したことを示す。さらに、Ｃ末端伸長部７９−７６−Ａｌｂ８および７９−８６−Ａｌｂ８のないナノボディと比較したとき、Ａｌａ−Ａｌａ Ｃ末端変異体７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡおよび７９−８６−Ａｌｂ８−ＡＡは、機能的活性を変化させなかった、図４を参照。
２７．ＣＸＣＲ２への二パラトープ性ナノボディを用いた化学走性の阻害
化学走性は、化学的濃度勾配に沿った、細胞の誘導された運動である。ｉｎ ｖｉｖｏでは、これは、内皮を通した、血管から組織への好中球などの食細胞の移動に関連する。参考文献については、Boyden S（1962）The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes。J Exp Med；115：453〜466頁およびFrevert C、Wong V、Goodman Rら（1998）Rapid fluorescence-based measurement of neutrophil migration in vitro。J Immunol Methods；213（1）：41〜52頁を参照。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの過程を模倣するために、我々はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製の３μｍポリエステル膜を用いて、トランスウェルアッセイを開発した。簡潔には、多重ウェル挿入断片を適切な位置に下げる前に、ＥＣ５０濃度のケモカイン（２ｎＭ ｒｈＧＲＯ−α）を受けプレートの底ウェルに加えた。末梢血から新たに単離し、生存力色素、カルセイン−ＡＭで標識したヒト好中球を、室温で３０分間、様々な濃度のナノボディ（０．００７〜３０ｎＭ）とプレインキュベートした。細胞を次に多重ウェル挿入断片に加えて３７℃で９０分間インキュベートした後、挿入断片を取り出し、廃棄した。次に受けプレートのウェルに移動した細胞からの蛍光を、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーにより、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光で測定した。抗ＣＸＣＲ２ナノボディ７９−７６−Ａｌｂ８−ＡＡは、ｒｈＧＲＯ−αで刺激された化学走性を、０．２５６±０．０２ｎＭ（ｎ＝４のドナーからの平均±ＳＥＭ）のＩＣ５０値で阻害した、図５を参照する。

Claims (57)

  1. ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２に対するものであるか、またはそれに結合する、２つの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、前記第１の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第１のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、前記第２の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の単一重鎖からの第２のＶＨＨドメインもしくはその断片に含まれるか、またはヒト化を含めて配列最適化されたその変異体であり、ポリペプチドのＣ末端は、抗原結合ドメインの配列への、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基の伸長部を含み；第１の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第１のエピトープを認識し、第２の抗原結合ドメインはＣＸＣＲ２上の第２のエピトープを認識するポリペプチド。
  2. 前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号７に示すアミノ酸の配列からなる線状ペプチドに結合することができ、前記第２の抗原結合ドメインが、前記線状ペプチドに結合することができないか、またはより低い親和性で結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 以下の構造：
    ・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
    ・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−−リンカー−−ＨＬＥ−ＥＸＴ
    ・ ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
    ・ ＨＬＥ−−リンカー−−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−−リンカー−−ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８−ＥＸＴ
    の１つを有し、式中、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第１の抗原結合ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第２の抗原ドメインを含み、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４が第２の抗原ドメインを含む場合は、ＦＲ５−ＣＤＲ４−ＦＲ６−ＣＤＲ５−ＦＲ７−ＣＤＲ６−ＦＲ８は第１の抗原ドメインを含み、ＨＬＥはｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加を提供する結合単位であり、ＥＸＴは少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基のＣ末端伸長部である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  4. ペプチドリンカーが３〜５０アミノ酸の長さである、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. リンカーがアミノ酸グリシンおよびセリンから構成される、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. ペプチドリンカーが配列番号２２０に示すアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. Ｃ末端伸長部がＡ、ＡＡ、ＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫＰまたはＧＧＧＳである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. Ｃ末端伸長部が２つのアラニン残基からなる、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１３、２１４、２１６および２１９、またはこれらの１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１５、２１７および２１８、またはこれらの１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項３に記載の構造を含む、請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  10. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  11. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１７、または配列番号２１７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 配列番号２２１、および２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  14. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１８、または配列番号２１８と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. 配列番号２２２、および２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１４１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号２３６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１８１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  17. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１６、または配列番号２１６と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１５、または配列番号２１５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項１６に記載のポリペプチド。
  18. 配列番号２２０のリンカーによって分離されている配列番号２１６および配列番号２１５を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３７に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８６に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  20. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１７、または配列番号２１７と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. 配列番号２２３、および２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号１６５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８５に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  23. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１８、または配列番号２１８と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. 配列番号２２４、および２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  25. 単一可変ドメインの前記第２の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ１が配列番号１５１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が配列番号１７１に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が配列番号１９１に示すアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインの前記第１の免疫グロブリンにおいて、ＣＤＲ４が配列番号１４３に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ５が配列番号２３５に示すアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ６が配列番号１８３に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の構造を含む請求項１〜８に記載のポリペプチド。
  26. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号２１９、または配列番号２１９と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択され、第２の抗原結合ドメインが、配列番号２１５、または配列番号２１５と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 配列番号２２０のリンカーによって分離されている配列番号２１９および配列番号２１５、ならびに２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. 前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸Ｆ１１、Ｆ１４およびＷ１５を含むエピトープに結合する、請求項１〜２７に記載のポリペプチド。
  29. 前記エピトープが線状である、請求項１〜２８に記載のポリペプチド。
  30. 前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＣＸＣＲ２の外部ループ中のエピトープ（配列番号１のアミノ酸残基１０６〜１２０、１８４〜２０８および２７４〜２９４）に結合する、請求項１〜２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記エピトープが配列番号１のアミノ酸残基１０６〜１２０の範囲内にある、請求項１〜３０に記載のポリペプチド。
  32. 前記エピトープが立体構造である、請求項１〜３１に記載のポリペプチド。
  33. 前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸残基Ｗ１１２、Ｇ１１５、Ｉ２８２およびＴ２８５を含む、ＣＸＣＲ２のエピトープに結合する、請求項１〜３２に記載のポリペプチド。
  34. １０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）でヒトＣＸＣＲ２に特異的に結合することができる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  35. １０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度（ｋｏｎ速度）でヒトＣＸＣＲ２に特異的に結合することができる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  36. １ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１の間の解離速度（ｋｏｆｆ速度）でヒトＣＸＣＲ２に特異的に結合することができる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. ５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でヒトＣＸＣＲ２に特異的に結合することができる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  38. ２０ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣＸＣＲ２へのＧｒｏ−αの結合を阻害することができる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. １００ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＣＸＣＲ２を発現するＲＢＬ細胞からのＧｒｏ−α誘導カルシウム放出を阻害することができる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. ５０ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＣＨＯ−ＣＸＣＲ２膜でのＧｒｏ−αによって誘導される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの蓄積を阻害することができる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  41. 請求項１２、１５、１８、２１、２４または２７のいずれか一項に記載のポリペプチドで、ＣＸＣＲ２への結合を交差ブロックすることができる、請求項１〜１００のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  42. いずれも２つのアラニン残基からなるＣ末端伸長部を有する、配列番号２２５、２２６または２２７から選択される配列からなる、請求項１〜１８または２８〜４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  43. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  44. 請求項４３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  45. 請求項４３に記載の核酸配列から請求項１〜４２に記載のポリペプチドを発現することができる宿主細胞。
  46. 請求項４５に記載の宿主細胞を培養することによって入手できる二パラトープ性または多パラトープ性のナノボディ。
  47. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
  48. 医薬として使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  49. 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびＣＯＰＤの増悪の処置において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 嚢胞性線維症、喘息、特に重度の喘息および喘息の増悪、急性の肺損傷、急性の呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成の処置において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. アテローム硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管形成ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、壊疽性膿皮症、加齢性黄斑変性疾患、目のベーチェット病、ブドウ膜炎、特発性のＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび関連ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、骨関節炎、非小細胞がん腫、結腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞がん、虚血再かん流傷害、鎌状赤血球症での溶血性輸血誘発血管閉塞危機、虚血／再かん流傷害、急性の脳卒中／心筋梗塞、非開放性頭部損傷、外傷後炎症またはインスリン抵抗性糖尿病の処置において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または（ＣＯＰＤ）の増悪を処置する方法。
  53. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を対象に投与することを含む、嚢胞性線維症、喘息、特に重度の喘息および喘息の増悪、急性の肺損傷、急性の呼吸窮迫症候群、特発性の肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成からなる群から選択される状態を処置する方法。
  54. アテローム硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管形成ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、壊疽性膿皮症、加齢性黄斑変性疾患、目のベーチェット病、ブドウ膜炎、特発性のＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび関連ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、骨関節炎、非小細胞がん腫、結腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞がん、虚血再かん流傷害、鎌状赤血球症での溶血性輸血誘発血管閉塞危機、虚血／再かん流傷害、急性の脳卒中／心筋梗塞、非開放性頭部損傷、外傷後炎症ならびにインスリン抵抗性糖尿病からなる群から選択される状態を、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの有効量を対象に投与することによって処置する方法。
  55. 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）またはＣＯＰＤの増悪の処置のための医薬の製造における、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  56. 喘息、特に重度の喘息および喘息の増悪、急性の肺損傷、急性の呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、気道リモデリング、閉塞性細気管支炎症候群または気管支肺異形成の処置のための医薬の製造における、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
  57. アテローム硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、血管形成ならびに黄斑変性症、糖尿病性網膜症および糖尿病性神経障害を含む新しい血管発達を特徴とする疾患、多発性硬化症、乾癬、壊疽性膿皮症、加齢性黄斑変性疾患、目のベーチェット病、ブドウ膜炎、特発性のＰＡＨ、家族性ＰＡＨおよび関連ＰＡＨを含む肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、慢性炎症性疾患、慢性関節リウマチ、骨関節炎、非小細胞がん腫、結腸がん、膵がん、食道がん、卵巣がん、乳がん、固形腫瘍および転移、黒色腫、肝細胞がん、虚血再かん流傷害、鎌状赤血球症での溶血性輸血誘発血管閉塞危機、虚血／再かん流傷害、急性の脳卒中／心筋梗塞、非開放性頭部損傷、外傷後炎症またはインスリン抵抗性糖尿病の処置のための医薬の製造における、請求項１〜４２のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
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