TWI619725B - 趨化激素受體結合多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於針對或具體而言結合至趨化激素受體CXCR2之多肽，且特定而言係關於能夠調節來自CXCR2之信號轉導之多肽。本發明亦係關於核酸、載體及能夠表現本發明多肽之宿主細胞、包含該等多肽之醫藥組合物，及該等多肽及組合物用於治療涉及CXCR2功能異常之疾病之用途。

Description

趨化激素受體結合多肽
本發明係關於針對或具體而言結合至趨化激素受體CXCR2之多肽，且特定而言係關於能夠調節來自CXCR2之信號轉導之多肽。本發明亦係關於核酸、載體及能夠表現本發明多肽之宿主細胞、包含該等多肽之醫藥組合物，及該等多肽及組合物治療慢性阻塞性肺病(COPD)及涉及CXCR2功能異常之其他疾病的用途。
慢性阻塞性肺病(COPD)係用於描述一系列特徵在於氣流限制之病症之術語，氣流限制在大部分情形下為進行性的且與肺對有害顆粒之異常炎症反應相關，其中肺薄壁組織之破壞導致氣道功能之衰退(Barnes PJ等人，2003,Chronic obstructive pulmonary disease：molecular and cellular mechanisms.Eur.Respir J,22,672-688；Barnes PJ等人，2004,Mediators of Chronic obstructive pulmonary disease.Pharmacol.Rev. 56,515-548)。儘管遺傳及環境因子會促使罹患COPD，但吸煙為最重要之單一原因，其中復發性肺感染會導致肺功能逐漸衰退。停止吸煙僅在早期實施時才會減緩疾病進展，且在發生顯著症狀後幾乎沒有影響。若干共病條件與諸如氣喘、心血管疾病、抑鬱症及肌肉萎縮等COPD相關(Mannino DM及Buist S,2007 Global burden of COPD：risk factors,prevalence and future trends.Lancet,370,765-773)。
趨化激素在趨化因子中佔主導，且因此在協調COPD肺中之慢性 炎症及其在急性惡化期間之進一步放大中起關鍵作用。趨化激素IL-8(CXCL8)、GROα(CXCL1)及ENA-78(CXCL5)之生物活性係由兩個細胞表面受體CXCR1及CXCR2群介導，該等細胞表面受體係存在於全身各處之白細胞及許多其他細胞類型上。白細胞遷移主要係經結合包括IL-8、GROα、β、γ、ENA78及GCP-2之若干配體之CXCR2介導。相比之下，CXCR1係由IL-8選擇性激活且在較小程度上由GCP-2激活。人類嗜中性趨化作用活體內是否係由一或兩種受體介導仍不明瞭。
CXCR2在胺基酸含量上與CXCR1共享78%同源性，且兩種受體係以不同分佈模式存在於嗜中性球上。CXCR2於各種細胞及組織(包括CD8+ T細胞、NK、單核細胞、肥胖細胞、上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞及中樞神經系統中之許多細胞類型)上之表現推測，此受體可在兩種組成條件下且在許多急性及慢性疾病之病理生理學中具有廣泛功能作用。CXCR2激活刺激與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白之Gi家族之受體偶合，此進而刺激細胞內肌醇磷酸鹽、增加之細胞內Ca2+之釋放，以及藉由ERK1/2依賴性機制達成之與至趨化激素梯度之定向細胞遷移相關之細胞內蛋白質磷酸化。在激活後，使CXCR2磷酸化，並使其藉助抑制蛋白(arrestin)/發動蛋白(dynamin)依賴性機制迅速內化，從而導致受體去敏化。此過程類似於利用大部分其他GPCR所觀察到之過程，但CXCR2之激動劑誘導內化之速率及程度高於利用CXCR1所見(Richardson RM、Pridgen BC、Haribabu B、Ali H、Synderman R.1998 Differential cross-regualtion of the human chemokine receptors CXCR1 and CXCR2.Evidence for time-dependent signal generation.J Biol.Chem,273,23830-23836)。
IL-8長時間以來已經證明為COPD中之嗜中性炎症之介質(Keatings VM等人，1996,Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma.Am.J.Respir.Crit.Care Med. 153,530-534；Yamamoto C et al.1997 Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8.Chest,112,505-510)。在COPD患者之枝氣管氣道、小氣道及肺薄壁組織之生檢中，T細胞會浸潤且嗜中性球的數量會增加，特別是在氣道管腔(Hogg JC et al.2004,The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease.N.Eng.J.Med. 350,2645-2653)。COPD患者肺中的嗜中性球會增加，且此與疾病嚴重性程度具有相關性(Keatings VM等人，1996,Differences in IL-8 and tumor necrosis factor-α in induced sputum from patients with COPD and asthma.Am.J. Respir.Crit.Care Med. 153,530-534)。另外，在COPD患者之痰中TNFα之含量升高，且此誘導來自氣道上皮細胞之IL-8(Keatings)。與普通吸煙者及非吸煙者相比，GROα濃度在COPD患者之誘導痰及枝氣管肺泡灌洗(BAL)流體中明顯地升高(Traves SL等人2002,Increased levels of the chemokines GROα and MCP-1 in sputum samples from patients with COPD.Thorax,57,50-595；Pesci A.等人1998,Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with COPD.Eur Respir J. 12,380-386)。GROα係因應TNFα刺激而由肺泡巨噬細胞及氣道上皮細胞分泌，並選擇性激活CXCR2，從而對嗜中性球及單核細胞具有趨化性。在COPD患者中對GROα之單核細胞趨化反應增加，此可與該等細胞中CXCR2之增加之周轉或循環相關(Traves SL等人，2004,Specific CXC but not CC chemokines cause elevated monocyte migration in COPD：a role for CXCR2,J Leukoc.Biol. 76,441-450)。病毒性及細菌性肺感染常常導致COPD患者嚴重惡化，其特徵在於氣道中增加數量之嗜中性球(Wedzicha JA、Seemungal TA.,2007,COPD exacerbations：defining their cause and prevention,Lancet 370(9589)：786-96)。COPD急性嚴重惡化之患者之枝氣管生檢具有顯著增加之ENA-78、IL-8及CXCR2 mRNA表現量(Qiu Y等人，2003,Biopsy neutrophilia,neutrophil chemokine and receptor gene expression in severe exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease.Am.J. Respir.Crit.Care.Med.168,968-975)，且痰具有增加之嗜中性計數(Bathoorn E、Liesker JJw、Postma DS等人，Change in inflammation in out-patient COPD patients from stable phase to a subsequent exacerbation,(2009)Int J COPD,4(1)：101-9)，此表明此受體在COPD及此疾病之嚴重惡化中之潛在作用。CXCR2 mRNA之增加之表現係存在於枝氣管生檢試樣中，此與組織嗜中性球之存在相關(Qiu 2003)。ENA-78主要係來源於上皮細胞，且在COPD惡化期間上皮細胞中之ENA-78表現顯著增加(Qiu 2003)。由於在COPD氣道中IL-8、GROα及ENA-78之濃度增加，且所有三種配體均藉助CXCR2進行信號傳導，故利用選擇性拮抗劑阻斷此共同受體將係此疾病中之有效抗炎症策略。
COPD緩慢且逐漸地演化，且利用肺功能測試(例如用力呼氣量(FEV1)之肺量量度)以傳統方式估計疾病進展。將<50%預測FEV1之患者分類為嚴重。肺功能與死亡率緊密相關，此乃因與僅5%之輕度至中度患者相比，12年內幾乎35%之嚴重COPD患者死於該疾病。COPD係世界上死亡之第四主要原因(世界衛生組織(World Health Organization，WHO),World Health Report,Geneva,2000。獲得自URL：http：//www.who.int/whr/2000/en/whr00_annex_en.pdf)，且可預測在未來數十年中其盛行率及死亡率進一步提高(Lopez AD、Shibuya K、Rao C等人，2006,Chronic obstructive pulmonary disease：current burden and future projections,Eur Respir J,27(2),397-412)。惡化係健康不佳之惡性循環之關鍵因素，且係絕大部分COPD住院之主要原因 (BTS(英國胸科協會，British Thoracic Society),2006,Burden of Lung Disease Report，第2版，http：//www.brit-thoracic.org.uk/Portals/0/Library/BTS%20Publications/burdeon of_lung_disease2007.pdf)。平均年速率對於症狀界定之惡化而言為2.3且對於保健界定之惡化而言為2.8(O’Reilly JF、Williams AE、Holt K等人，2006,Prim Care Respir J.15(6)：346-53)。患者惡化之早期診斷及改良管理以及改良預防將有助於減少該等住院對已經捉襟見肘之資源之壓力。COPD之可用治療主要為舒減性的，且沒有停止與該疾病相關之肺功能衰退或氣道逐步破壞之可用療法。諸如短效及長效β-腎上腺素枝氣管擴張藥、吸入型抗副交感神經劑(草蕈鹼拮抗劑)及吸入型皮質類固醇等當前治療係用於治療該疾病之症狀及惡化。當前皮質類固醇療法之主要限制為其經證明為無效的，此乃因患者對皮質類固醇顯示抗性，使該等藥物之抗炎作用不起作用。顯然，業內仍對預防COPD進展之新穎藥物存在巨大且未滿足之醫學需求。趨化激素受體拮抗劑係COPD療法之有吸引力之方法，此乃因COPD中之炎症細胞運輸係藉由多種趨化激素來協調，故利用LMW拮抗劑阻斷趨化激素受體可係此疾病之有效抗炎症策略。COPD之決定性特徵為在普通吸煙者中所見之炎症反應之放大，故療法目標並非完全阻抑炎症細胞浸潤，而是將其降低至在無COPD之普通吸煙者中所見之程度。藉由特異性起作用，抗CXCR2將避免與類固醇相關之一般免疫阻抑-CXCR1活性之保留將允許基線嗜中性球激活，此對COPD及CF中之宿主防禦甚為重要。當前大部分COPD藥物係藉由吸入來投與，以降低全身性副作用，然而，由於趨化激素拮抗劑對循環炎症細胞中所表現之受體起作用，故全身性投與將係最優的。此將提供到達在COPD中受影響之小氣道及肺薄壁組織之有效方式。
與細胞激素及介白素受體相比，趨化激素受體屬於7TM-GPCR之 高度‘可藥化’超家族。除此以外，基於具有小肽或生物胺配體之GPCR之經驗，預期尋找強效拮抗劑之早期嘗試遇到比其更多之困難。集中於趨化激素受體拮抗劑之小分子藥物發現項目之努力開始逐步瞭解趨化激素受體之特應性及小分子充當拮抗劑所需要之結構元件。令人感興趣地，CC-趨化激素-受體拮抗劑之結構多樣性(如由所鑑別之根本上不同之化學系列之數量所代表)顯著高於CXC-趨化激素-受體拮抗劑，此表明尋找拮抗劑之相對困難在兩種類別之受體之間可係不同的。
已證明趨化激素受體通常係拮抗之困難標靶，且鑑別強效選擇性CXCR2拮抗劑需要巨大努力。第一低分子量CXCR2拮抗劑係闡述於1998年，自彼時起已研發許多非競爭性異位CXCR2拮抗劑，其中若干種現已進展至臨床試驗。然而，顯然業內需要CXCR2功能之更好且更強效之拮抗劑。
在過去十年左右中，免疫球蛋白類別之分子已看見其臨床效用之巨大擴展。其對標靶之特異性及使用重組技術改造其之能力提供研發疾病之高度定向治療之巨大潛力。許多類型之免疫球蛋白分子及經修飾免疫球蛋白分子潛在地可用於適當改造，包括習用四鏈抗體、Fab及F(ab)2片段、單一結構域抗體(D(ab)s)、單鏈Fvs及奈米抗體。該等分子將在本文中結合本發明進一步論述，本發明係關於經構築以針對CXCR2之至少兩個表位之多肽。
因此本發明之目標係提供預防或治療慢性阻塞性肺病或COPD及與趨化激素受體CXCR2功能異常相關之其他疾病之新方式。
本發明之另一目標係提供治療或預防COPD及與CXCR2功能異常相關之其他疾病之方式，其係免疫療法。
本發明之又一目標係提供包含為CXCR2信號轉導之拮抗劑之免疫球蛋白CDR之多肽。
本發明係關於包含兩個免疫球蛋白抗原結合結構域之多肽，該多肽係針對或結合至趨化激素受體CXCR2，其中該第一抗原結合結構域係包含於來自源自於駱駝科(Camelid)之重鏈抗體之單一重鏈之第一VHH結構域或其片段內或係其經序列最佳化(包括經人類化)變體，且該第二抗原結合結構域係包含於來自源自於駱駝科之重鏈抗體之單一重鏈之第二VHH結構域或其片段內或係其經序列最佳化(包括經人類化)變體，且其中該多肽之C端包含對該等抗原結合結構域之序列之至少一個額外胺基酸殘基之延伸；且其中該第一抗原結合結構域識別CXCR2上之第一表位，且該第二抗原結合結構域識別CXCR2上之第二表位。本發明之較佳多肽包含第一抗原結合結構域及第二抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域能夠結合至由SEQ ID NO.7所示之胺基酸序列組成之線性肽，該第二抗原結合結構域不能夠結合或以較低親和力結合至該線性肽。SEQ ID NO.7係人類CXCR2之前19個N端胺基酸。本發明之較佳多肽為雙互補位的。本文所用術語「雙互補位」意指包含兩個抗原結合結構域之多肽，該兩個抗原結合結構域識別相同蛋白質標靶上之兩個不同表位。然而，為多互補位(即含有識別相同標靶蛋白質上之三個、四個或更多個表位之抗原結合結構域)之多肽涵蓋於本發明範圍內，為雙互補位或多互補位且多價(即亦具有抗原結合結構域識別一或多種其他標靶蛋白質)之多肽亦屬於本發明範圍內。
在本發明之較佳多肽中，包含該第一抗原結合結構域之胺基酸序列及包含該第二抗原結合結構域之胺基酸序列係藉由連接體區域鏈接。如本文更詳細論述，該連接體可為或可不為免疫球蛋白來源，但較佳為肽。
具有可自駱駝科獲得之類型之僅重鏈抗體之VHH胺基酸序列或其 片段或變體的免疫球蛋白單一可變結構域可在本文中替代地稱為「VHH結構域」或其片段或稱為「奈米抗體」。必須注意到，奈米抗體®(Nanobody®、Nanobodies®)及奈米選殖體®(Nanoclone®)係Ablynx N.V.之注冊商標。
在本發明之多肽中，每一抗原結合結構域包含至少一個本文所定義之CDR且較佳較佳兩個或三個CDR。在本發明之較佳多肽中，免疫球蛋白單一可變結構域之較佳結構係VHH結構域或奈米抗體之結構且其具有以下結構：FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
其中CDR及FR係如本文中所進一步定義。
本發明之較佳雙互補位奈米抗體具有以下結構中之一者：
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--連接體-HLE-EXT
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--HLE--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
˙HLE--連接體--FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結合結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原結構域，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結合結構域：HLE係提供延長之活體內半衰期之結合單元，且EXT係至少一個額外胺基酸殘基之C端延伸。
以上較佳雙互補位奈米抗體之片段或變體係涵蓋於本發明中， 本發明包括其中CDR及FR為駱駝科來源之實施例或其中FR中之一或多者具有至少一個人類化取代且較佳完全經人類化之實施例。
本發明之尤佳雙互補位奈米抗體係在本文中指定為163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2及97A9/54B12之彼等，其進一步具有包含至少一個其他胺基酸殘基之C端延伸(其胺基酸序列係顯示於表13中)且特定而言其變體，其中FR包括本文中所定義之序列最佳化胺基酸取代，且例如表32中針對組份奈米抗體所顯示。
本發明之額外尤佳雙互補位奈米抗體係表33中所顯示之彼等，其進一步具有包含至少一個其他胺基酸殘基之C端延伸。
本發明之較佳多肽結合至包含SEQ ID No.1(CXCR2)之胺基酸F11、F14及W15之表位。在本發明之較佳雙互補位多肽(例如雙互補位奈米抗體)中，該第二抗原結合結構域結合至人類CXCR2之外環(SEQ ID No.1之胺基酸殘基106-120、184-208及274-294)內之表位。在本發明之一實施例中，該表位為構象的。在本發明之實施例中，該表位包含SEQ ID No.1之胺基酸殘基W112、G115、I282及T285。
本發明亦涵蓋編碼任一本發明多肽之核酸分子以及編碼其片段之核酸，例如編碼包含於雙互補位奈米抗體內之個別奈米抗體之核酸。包含本發明核酸之載體及包含該等載體且能夠表現本發明多肽之宿主細胞亦涵蓋於本發明內。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明多肽與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合之醫藥組合物。由於本發明多肽能夠阻斷、抑制或降低CXCR2之活性，故其可用於治療CXCR2信號轉導異常起作用之疾病。該等疾病可包括動脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎症性腸疾病(克隆氏病(Crohn’s))、血管生成、多發性硬化症、牛皮癬、壞疽性膿皮病、年齡相關性黃斑退化性疾病、眼部貝賽特氏疾病 (Ocular Behcet Disease)、眼色素層炎、非小細胞癌瘤、結腸癌、胰臟癌、食管癌、黑色素瘤、肝細胞癌瘤或缺血再灌注損傷。該等疾病亦可包括呼吸道之病狀，例如囊性纖維素化、氣喘、嚴重氣喘、氣喘之惡化、過敏性氣喘、嗜中性氣喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、自發性肺纖維化、氣道重塑、閉塞性小枝氣管炎症候群或肺枝氣管發育不全。
在一實施例中，本發明多肽係用於治療氣喘、特定而言嚴重氣喘及氣喘之惡化。
在尤佳實施例中，本發明多肽係用於治療慢性阻塞性肺病(COPD)或COPD之惡化，其特徵在於白血球、特定而言嗜中性球遷移至肺薄壁組織及其後續破壞，該遷移係藉助CXCR2信號轉導介導。本發明多肽阻斷、抑制或降低CXCR2活性之能力使其稱為用於預防或治療此疾病之優良候選物。
為治療人類，本發明多肽較佳針對或具體而言結合至人類CXCR2。然而，較佳地，若該多肽可與靈長類CXCR2、特定而言食蟹猴CXCR2交叉反應，以便可在該等猴中實施適當毒性測試。若預期獸醫使用，則本發明多肽可針對或特異性結合至來自其他物種之CXCR2同系物。
根據本文中之進一步論述，本發明之其他態樣將變得顯而易見。
定義
在本說明書中，實例及申請專利範圍：
a)除非另有說明或定義，否則所用之所有術語具有其業內常用含義，此為熟習此項技術者所明瞭。例如參見下文中如下所提及之標準手冊。Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1卷至第3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人編輯，「Current protocols in molecular biology」,Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)；Lewin,「Genes II」,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,(1985)；Old等人，「Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering」，第2版，University of California Press,Berkeley,CA(1981)；Roitt等人，「Immunology」(第6版),Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001)；；Roitt等人，Roitt’s Essential Immunology，第10版，Blackwell Publishing,UK(2001)；及Janeway等人，「Immunobiology」(第6版),Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York(2005)。
b)除非另有指示，否則術語「免疫球蛋白」或「免疫球蛋白序列」-無論在本文中用於指重鏈抗體還是習用4鏈抗體-係用作包括全長抗體、其個別鏈以及其所有部分、結構域或片段(包括(但不限於)抗原結合結構域或片段，例如分別VHH結構域或VH/VL結構域)之一般術語。另外，除非上下文需要更受限解釋，否則本文所用術語「序列」(例如在諸如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中)通常應理解為包括相關 胺基酸序列以及編碼其之核酸序列或核苷酸序列。
c)除非另有指示，否則術語「免疫球蛋白單一可變結構域」係用作之一般術語包括(但不限於)抗原結合結構域或片段，例如分別VHH結構域或VH或VL結構域。術語抗原結合分子或抗原結合蛋白質可互換使用，且亦包括術語奈米抗體。免疫球蛋白單一可變結構域進一步係輕鏈可變結構域序列(例如VL-序列)，或重鏈可變結構域序列(例如VH序列)；更具體而言，其可係源自於習用四鏈抗體之重鏈可變結構域序列或源自於重鏈抗體之重鏈可變結構域序列。因此，免疫球蛋白單一可變結構域可係結構域抗體或適於用作結構域抗體之免疫球蛋白序列、單一結構域抗體或適於用作單一結構域抗體之免疫球蛋白序列、「dAb」或適於用作dAb之免疫球蛋白序列或奈米抗體，包括(但不限於)VHH序列。本發明包括不同來源之免疫球蛋白序列，包含小鼠、大鼠、兔、驢、人類及駱駝科免疫球蛋白序列。免疫球蛋白單一可變結構域包括完全人類、經人類化、以其他方式經序列最佳化或嵌合免疫球蛋白序列。免疫球蛋白單一可變結構域及免疫球蛋白單一可變結構域之結構可認為包含(然而並不限於)四個框架區域「FR」，其在業內及本文中分別稱為「框架區域1」或「FR1」；「框架區域2」或「FR2」；「框架區域3」或「FR3」；及「框架區域4」或「FR4」；該等框架區域雜有三個互補決定區域或「CDR」，其在業內分別稱為「互補決定區域1」或「CDR1」；「互補決定區域2」或「CDR2」；及「互補決定區域3」或「CDR3」。
d)除非另有指示，否則可實施且已以本身已知之方式實施未詳細具體闡述之所有方法、步驟、技術及操作，如熟習此項技術者所明瞭。例如再次參見標準手冊及本文所提及之一般背景技術及本文中所引用之其他參考文獻；以及(例如)以下綜述Presta,Adv.Drug Deliv.Rev.2006,58(5-6)：640-56；Levin及Weiss,Mol.Biosyst.2006,2(1)： 49-57；Irving等人，J.Immunol.Methods,2001,248(1-2),31-45；Schmitz等人，Placenta,2000,21 Suppl.A,S106-12,Gonzales等人，Tumour Biol.,2005,26(1),31-43，其闡述用於蛋白質改造之技術(例如親和力成熟)及用於改良蛋白質(例如免疫球蛋白)之特異性及其他期望性質之其他技術。
e)將根據標準的三個字母或一個字母胺基酸代碼指示胺基酸殘基。
f)出於比較兩個或更多個核苷酸序列之目的，可以以下方式計算或測定第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間之「序列一致性」百分比：藉由將[該第一核苷酸序列中與該第二核苷酸序列中之相應位置處之核苷酸一致之核苷酸數]除以[該第一核苷酸序列中之總核苷酸數]並乘以[100%]，其中該第二核苷酸序列中之核苷酸之每一缺失、插入、取代或添加-與該第一核苷酸序列相比-視為單一核苷酸(位置)處之差異；或使用適宜電腦演算法或技術。可使用用於序列比對之已知電腦演算法(例如NCBI Blast v2.0)並使用標準設定計算兩個或更多個核苷酸序列之間之序列一致性程度。用於測定序列一致性程度之一些其他技術、電腦演算法及設定係闡述於(例如)WO 04/037999、EP 0 967 284、EP 1 085 089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185及GB 2 357 768-A中。常常，出於依照上文所概述之計算方法測定兩個核苷酸序列之間之「序列一致性」百分比之目的，具有最大核苷酸數之核苷酸序列將視為「第一」核苷酸序列，且另一核苷酸序列將視為「第二」核苷酸序列。
g)出於比較兩個或更多個胺基酸序列之目的，可以以下方式計算或測定第一胺基酸序列與第二胺基酸序列之間之「序列一致性」百分比(在本文中亦稱為「胺基酸一致性」)：將[該第一胺基酸序列中與該第二胺基酸序列中之相應位置處之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基 數]除以[該第一胺基酸序列中之總胺基酸殘基數]並乘以[100%]，其中該第二胺基酸序列中之胺基酸殘基之每一缺失、插入、取代或添加-與該第一胺基酸序列相比-視為單一胺基酸殘基(位置)處之差異，即本文所定義之「胺基酸差異」；或使用適宜電腦演算法或技術。出於依照上文所概述之計算方法測定兩個胺基酸序列之間之「序列一致性」百分比之目的，具有最大胺基酸殘基數之胺基酸序列將視為「第一」胺基酸序列，且另一胺基酸序列將視為「第二」胺基酸序列。
而且，在測定兩個胺基酸序列之間之序列一致性程度中，熟習此項技術者可考慮所謂「保守」胺基酸取代，如下文v)中所揭示。
施加至本文所述多肽之任何胺基酸取代亦可基於Schulz等人，Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,1978所研發之對不同物種之同源蛋白質間之胺基酸變異頻率的分析；Chou及Fasman,Biochemistry 13：211,1974及Adv.Enzymol.,47：45-149,1978所研發之對結構形成潛力之分析；及Eisenberg等人，Proc.Nad.Acad Sci.USA 81：140-144,1984；Kyte及Doolittle；J Molec.Biol.157：105-132,198 1及Goldman等人，Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353,1986所研發之對蛋白質之疏水性模式之分析，所有文獻均以引用的方式全文併入本文中。關於奈米抗體之一級及二級結構，來自駱馬之VHH結構域之晶體結構係由(例如)Desmyter等人，Nature Structural Biology，第3卷，9,803(1996)；Spinelli等人，Natural Structural Biology(1996)；3,752-757；及Decanniere等人，Structure，第7卷，4,361(1999)給出。
h)當比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指與該第二序列相比該第一序列之位置上之單一胺基酸殘基之插入、缺失或取代；應理解，兩個胺基酸序列可含有一個、兩個或更多個該等胺基酸差異。
i)當稱核苷酸序列或胺基酸序列分別「包含」另一核苷酸序列或胺基酸序列，或「基本上由另一核苷酸序列或胺基酸序列組成」時，此可意指後一核苷酸序列或胺基酸序列已分別納入前一核苷酸序列或胺基酸序列中，但更常常地，此一般而言意指前一核苷酸序列或胺基酸序列在其序列內分別包含具有分別與後一序列相同之核苷酸序列或胺基酸序列之核苷酸或胺基酸殘基之段，無論前一序列實際上係如何生成或獲得(其可(例如)藉由本文所闡述之任一適宜方法)。藉助非限制性實例，當稱本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域(例如奈米抗體)包含CDR序列時，此可意指該CDR序列已納入本發明之雙互補位奈米抗體中，但更常常地，此一般而言已知本發明之雙互補位奈米抗體在其序列內含有具有與該CDR序列相同之胺基酸序列之胺基酸殘基之段，無論該雙互補位奈米抗體係如何生成或獲得。亦應注意，當後一胺基酸序列具有特殊生物或結構功能時，其較佳在前一胺基酸序列中具有基本上相同、類似或等效之生物或結構功能(換言之，前一胺基酸序列較佳使得後一序列能夠執行基本上相同、類似或等效之生物或結構功能)。例如，當稱本發明之雙互補位奈米抗體分別包含CDR序列或框架序列時，CDR序列及框架較佳能夠在該雙互補位奈米抗體中中分別作為CDR序列或框架序列起作用。而且，當稱核苷酸序列包含另一核苷酸序列時，前一核苷酸序列較佳使得當將其表現成表現產物(例如多肽)時，由後一核苷酸序列編碼之胺基酸序列形成該表現產物之一部分(換言之，後一核苷酸序列係在與前一較大核苷酸序列相同之讀碼框)。
j)例如，與獲得核酸序列或胺基酸序列之天然生物來源及/或反應培養基或培養培養基(cultivation medium)相比，當核酸序列或胺基酸序列已與常常在該來源或培養基中與其相關聯之至少一種其他組份(例如另一核酸、另一蛋白質/多肽、另一生物組份或大分子或至少一 種污染物、雜質或次要組份)分離時，認為核酸序列或胺基酸序列「(呈)基本上分離(形式)」。特定而言，當核酸序列或胺基酸序列已經純化至少2倍、特定而言至少10倍、更特定而言至少100倍且高達1000倍或更多倍時，認為核酸序列或胺基酸序列「基本上分離」。「呈基本上分離形式」之核酸序列或胺基酸序列較佳基本上均勻，如使用適宜技術所測定，例如適宜層析技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳；
k)本文所用術語「抗原結合結構域」係指免疫球蛋白中包含至少一個CDR且具有識別標靶抗原決定簇或表位之構形之胺基酸序列。
l)術語「抗原決定簇」及「表位」在本文中亦可互換使用，其係指標靶CXCR2內由抗原結合結構域識別之胺基酸序列，無論呈線性還是非線性構形。
m)據稱本發明之可(特異性地)結合至具體抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或表位)、對其具有親和力及/或對其具有特異性之多肽(例如本文中所闡述之雙互補位奈米抗體)或其片段係「針對」(「against」或「directed against」)該抗原決定簇、表位、抗原或蛋白質。
n)術語「特異性」係指本發明多肽之特定抗原結合結構域可結合之不同類型抗原或抗原決定簇之數量。可基於親和力及/或親合力來測定抗原結合蛋白質對任一特定抗原/表位之特異性，如WO 08/020079(以引用的方式併入本文中)之第53頁至第56頁所闡述，該文獻亦闡述一些用於量測多肽與有關抗原或表位間之結合之較佳技術。通常，在每一抗原結合蛋白質(例如本發明多肽)中，每一抗原結合結構域可各自獨立地以10-5至10-12莫耳/公升(moles/litre)或更少、且較佳10-7至10-12莫耳/公升或更小且更佳10-8至10-12莫耳/公升之解離常數(KD)(即以105至1012公升/莫耳或更多、且較佳107至1012公升/莫耳或更多且更佳108至1012公升/莫耳之締合常數(KA))結合至其抗原/表 位。通常認為任一大於10-4莫耳/公升之KD值(或任一低於104M-1之KA值)指示非特異性結合。較佳地，本發明之雙互補位多肽將以小於500nM、較佳小於200nM、更佳小於10nM、例如小於500pM之親和力結合至期望抗原。本發明多肽至CXCR2之特異性結合可以任一本身已知之適宜方式測定，包括(例如)斯卡查德分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心式競爭分析)及其本身業內已知之不同變體；以及本文中所提及之其他技術。如熟習此項技術者所明瞭，且如WO 08/020079之第53頁至第56頁所闡述，解離常數可為實際或表觀解離常數。測定解離常數之方法將為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如)WO 08/020079之第53頁至第56頁所提及之技術。
o)本發明多肽、特定而言本發明之雙互補位奈米抗體之半衰期通常可定義為本發明多肽之血清濃度因(例如)多肽降解及/或藉由天然機制進行之多肽清除或嵌合而活體內降低50%所需之時間。本發明多肽之活體內半衰期可以本身已知之任一方式(例如藉由藥物動力學分析)來量測。適宜技術為熟習此項技術者所明瞭，且通常可如(例如)WO 08/020079之第57頁之段落o)中所闡述。如WO 08/020079之第57頁其中所亦提及，可使用諸如t1/2-α、t1/2-β及曲線下面積(AUC)等參數表達半衰期。例如，參見下文實驗部分以及標準手冊，例如Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinete analysis：A Practical Approach(1996)。亦參見「Pharmacokinetics」，M Gibaldi及D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)。術語「半衰期之延長」或「延長之半衰期」係指t1/2-β之延長，且t1/2-α及/或AUC或二者延長或不延長。
p)在本發明之上下文中，使用適宜活體外、細胞或活體內分析 所量測之「阻斷、降低或抑制」CXCR2之活性可意指，與在相同分析中在相同條件下但在不存在本發明多肽之情況下之CXCR2活性相比，阻斷CXCR2之相關或預期生物活性，使活性降低或抑制至少1%、較佳至少5%，例如至少10%或至少25%，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或90%或更多。
如熟習此項技術者所明瞭，抑制亦可涉及實現CXCR2對其配體或結合配偶體中之一或多者之親和力、親合力、特異性及/或選擇性的降低，及/或實現與相同條件但不存在本發明多肽之情況相比，CXCR2對存在CXCR2之培養基或環境中之一或多個條件(例如pH、離子強度、輔助因子之存在等)之敏感性的降低。如熟習此項技術者所明瞭，此可再次以任一適宜方式及/或使用任一本身已知之適宜分析測定，此取決於所涉及之標靶或抗原。
q)本文所用「調節」可意指CXCR2之異位調節；及/或降低或抑制CXCR2與其配體中之一者之結合及/或與結合至CXCR2之天然配體競爭。調節亦可涉及(例如)實現關於CXCR2之摺疊或構形或關於其改變其構形(例如在結合配體後)以與其他(亞)單元締合或以解離之能力之變化。調節亦可涉及(例如)實現CXCR2轉運其他化合物或充當其他化合物(例如離子)之通道之能力之變化。
藉由本發明多肽、特定而言本發明之雙互補位奈米抗體調節、特定而言抑制或降低CXCR2活性可係可逆的或不可逆的，但出於醫藥及藥理目的，常常將呈可逆方式。
r)當本發明多肽以為其結合第二標靶或多肽之親和力之至少10倍、例如至少100倍、且較佳至少1000倍且高達10,000倍或更多的親和力(如上文所闡述，且適宜地表達為KD值、KA值、Koff速率及/或Kon速率)結合至CXCR2時，稱本發明多肽與第二標靶或抗原相比對CXCR2具有「特異性」。例如，本發明多肽可以為其結合至其另一標 靶或多肽或表位之KD之至多1/10倍、例如至多1/100、且較佳至多1/1000、例如1/10.000或甚至大於彼倍數的KD值結合CXCR2。
s)術語「交叉阻斷」(「cross-block」、「cross-blocked」及「cross-blocking」)可本文中互換使用，以意指免疫球蛋白單一可變結構域或多肽干擾本發明之其他免疫球蛋白單一可變結構域或多肽結合至給定標靶之能力。可使用競爭結合分析測定本發明之免疫球蛋白單一可變結構域或多肽能夠干擾另一標靶之結合、且從而可稱其根據本發明交叉阻斷之程度。一種尤其適宜之定量交叉阻斷分析使用基於FACS或ELISA之方法來量測本發明之經標記(例如經His標記、經放射性標記或經螢光標記)免疫球蛋白單一可變結構域或多肽與另一結合劑之間在其結合至標靶方面之競爭。實驗部分通常闡述用於確定結合分子是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷本發明之免疫球蛋白單一可變結構域或多肽之適宜的基於FACS-及ELISA-置換之分析。應瞭解，該分析可利用本文所闡述之免疫球蛋白單一可變結構域或其他結合劑中之任一者來使用。因此，一般而言，本發明之交叉阻斷胺基酸序列或其他結合劑係如下者：在上文交叉阻斷分析中其將結合至標靶，以使得在該分析期間且在本發明之第二胺基酸序列或其他結合劑存在下，本發明之免疫球蛋白單一可變結構域或多肽之經記錄置換係介於可能欲測試之交叉阻斷劑(例如其他抗體片段、VHH、dAb或類似VH/VL變體)之最大理論置換的50%與100%之間。
t)若本發明多肽對兩種不同抗原或抗原決定簇(例如來自兩種不同哺乳動物物種(例如人類及食蟹猴)之血清白蛋白或CXCR2)均具有特異性(如本文中所闡述)，則稱本發明多肽對該等不同抗原或抗原決定簇均具有「交叉反應性」。
u)本文所定義之保守胺基酸變化係指其中胺基酸殘基經具有類似化學結構之另一胺基酸殘基替代且對該多肽之功能、活性或其他生 物性質具有極小影響或或基本上無影響之胺基酸取代。該等保守胺基酸取代為業內所熟知，例如來自WO 04/037999、GB-A-3 357 768、WO 98/49185、WO 00/46383及WO 01/09300；且可基於來自WO 04/037999以及WO 98/49185且來自本文所引用之其他參考文獻之有關教示選擇該等取代之(較佳)類型及/或組合。
該等保守取代較佳係其中以下群組(a)至(e)內之一胺基酸經同一群組內之另一胺基酸殘基取代的取代：(a)小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及GIy；(b)極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷)醯胺：Asp、Asn、GIu及GIn；(c)極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(d)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、He、VaI及Cys；及(e)芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。
尤佳保守取代係如下：Ala取代為GIy或取代為Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為GIn或取代為His；Asp取代為GIu；Cys取代為Ser；GIn取代為Asn；GIu取代為Asp；GIy取代為Ala或取代為Pro；His取代為Asn或取代為GIn；He取代為Leu或取代為VaI；Leu取代為He或取代為VaI；Lys取代為Arg、取代為GIn或取代為GIu；Met取代為Leu、取代為Tyr或取代為He；Phe取代為Met、取代為Leu或取代為Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp；及/或Phe取代為VaI、取代為He或取代為Leu。
v)本文所用CDR係本發明多肽之互補決定區域。CDR係單獨地或與一或多個其他CDR組合建立與本發明多肽識別之抗原或表位之互補性之胺基酸之段。藉由某些編碼慣例在胺基酸序列中鑑別CDR。關於本文中之申請專利範圍及具體闡述，使用Kabat編碼。
w)本文所用FR係框架區域(有時稱為FW)。框架區域係側接一或多個CDR並支撐其呈正確三維構形用於抗原或表位識別之胺基酸之段。FR對標靶抗原或表位無特異性，但對其所存在之物種來源或免 疫球蛋白分子類型具有特異性。如本文中所詳細論述，在本發明多肽中，該框架區域之胺基酸序列仍存在經改造以與免疫球蛋白之來源(例如駱駝科)所施加之框架序列不同之空間。
x)本文所用CXCR2係指至少存在於白血球表面上且其天然存在之配體可係Gro-α、β、γ、IL-8、ENA-78或GCP-2之細胞激素受體。CXCR2在本文中通常係指呈現CXCR2功能之任一蛋白質，無論何種來源之物種。然而，本文所用人類CXCR2係指包含SEQ ID No.1所示之胺基酸序列或其任一對偶基因變體或直系同源物之蛋白質，且食蟹猴CXCR2係指包含SEQ ID No.3所示之胺基酸序列或其任一對偶基因變體或直系同源物之蛋白質。
y)本文所用「序列最佳化」係指出於獲得天然序列中可能不存在之特定性質或結構特性之目的促進胺基酸序列中之取代、插入或缺失。可(例如)出於化學穩定之目的、用於改良製造能力、用於避免焦麩胺酸鹽形成或氧化或異構化，實施該等取代、插入或缺失。針對雙互補位多肽、特定而言本發明之雙互補位奈米抗體可採用之達成該等性質之最佳化的方法係闡述於WO 2009/095235中，其以引用的方式併入本文中。亦可出於使本發明之雙互補位多肽人類化之目的以本文所闡述之方式實施序列最佳化技術。因此，在本文中任何地方使用序列最佳化(sequence optimisation、sequence optimising或sequenced-optimised)時，此涵蓋對人類化取代或插入及經部分或完全人類化之雙互補位多肽、較佳雙互補位奈米抗體之具體提及。
z)本文所用「C端延伸」係指已添加至多肽鏈之C端之胺基酸殘基。此一延伸之長度為至少一個、較佳至少兩個胺基酸殘基，且其用於遮蔽原本可能夠與在一些個體之血清中發現之IgG分子相互作用之表位。
圖1顯示當在增加之奈米抗體濃度下量測兩種奈米抗體及本發明雙互補位奈米抗體阻斷[35S]GTPγS自經激動劑Gro-α刺激之CHO-CXCR2膜釋放之能力時所獲得之反應曲線。
圖1a顯示奈米抗體54B12(表9中之SEQ ID No.90)之結果，圖1b顯示奈米抗體163E3(表9中之SEQ ID No.42)之結果，且圖1c顯示雙 互補位奈米抗體54B12/163E3(表13中之SEQ ID No.68)之結果。
圖2藉由GROα抑制顯示兩種代表性奈米抗體127D1(圖2a)、163E3(圖2b)及雙互補位163E-35GS-127D1(圖2c)之效能及效力，表示為在各種濃度之GRO-α下抑制%對奈米抗體濃度。可見127D1強效，但並非有效，而163E3具有較低效能，但比127D1更有效。當組合兩種結合分子時，顯示所得雙互補位結合分子既強效又有效。
圖3顯示測試本發明代表性多肽對CXCR2之特異性超過CXCR1之結果，如下圖中所繪示。
所測試之經純化單價抗CXCR2(A或B)或雙互補位奈米抗體顯示hCXCR2因應GROα之nM效能，而關於hCXCR1受體，其在μM濃度下因應細胞內鈣之IL-8誘導之釋放無活性。
圖4顯示具有AA C端延伸79-76-Alb8-AA之半衰期延長之雙互補位奈米抗體在雄性中將抗Nb IgG反應性自50%顯著降低至20%且在雌性中自61%降低至16%。另外，當與不具有C端延伸79-76-Alb8及79-86-Alb8之奈米抗體相比時，Ala-Ala C端變體79-76-Alb8-AA及79-86-Alb8-AA未改變功能活性。
圖5顯示抗CXCR2奈米抗體79-76-Alb8-AA對主要人類嗜中性球對rhGRO-α之趨化作用之影響。在室溫下將經鈣黃綠素-AM標記之經分離之主要人類嗜中性球與不同濃度之抗CXCR2奈米抗體79-76-Alb8-AA(˙)一起預培育30分鐘。然後將細胞添加至3μm多孔插入物中，且使接收板中至2nM rhGRO-α之趨化作用在37℃下進行90分鐘。然後於BioTek Synergy板讀數器上在485nm激發及520nm發射下 量測來自已遷移至接收板之孔中之細胞之螢光。79-76-Alb8-AA抑制rhGRO-α刺激之趨化作用，且IC50值為0.256±0.02nM(來自n=4個供體之平均值±SEM)。
在第一態樣中，本發明提供包含兩個免疫球蛋白抗原結合結構 域之多肽，該多肽係針對或結合至趨化激素受體CXCR2，其中該第一抗原結合結構域係包含於來自源自於駱駝科之重鏈抗體之單一重鏈之第一VHH結構域或其片段內或係其經序列最佳化(包括經人類化)變體，且該第二抗原結合結構域係包含於來自源自於駱駝科之重鏈抗體之單一重鏈之第二VHH結構域或其片段內或係其經序列最佳化(包括經人類化)變體，且其中該多肽之C端包含對該等抗原結合結構域之序列之至少一個額外胺基酸殘基之延伸；且其中該第一抗原結合結構域識別CXCR2上之第一表位，且該第二抗原結合結構域識別CXCR2上之第二表位。
應理解，本文所揭示之所有實施例均包含上文所提及之抗原結合結構域之C端延伸，無論此是否針對任一給定實施例具體論述。因此，本發明多肽均包含此一C端延伸。
本發明之較佳多肽包含第一抗原結合結構域及第二抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域能夠結合至由SEQ ID NO.7中所闡述之胺基酸序列組成之線性肽，該第二抗原結合結構域不能夠結合或以較低親和力結合至該線性肽。SEQ ID NO.7係人類CXCR2之前19個N端胺基酸。
在一實施例中，該第一抗原結合結構域識別包含CXCR2之胺基酸1至19或在其內之第一表位，且該第二抗原結合結構域識別CXCR2上於胺基酸1至19外面之第二表位。
重鏈抗體之單鏈之可變區域係稱為VHH結構域，且包含稱為奈米抗體之抗體片段。奈米抗體可包含整個VHH結構域或其片段。對於重鏈抗體及其可變結構域之一般闡述，參見WO08/020079之第59頁所提及之先前技術及國際申請案WO06/040153之第41頁至第43頁所提及之參考文獻之列表。VHH結構域具有許多獨特結構特性及功能性質，此使得經分離VHH結構域(以及基於其之具有與天然存在之VHH結構域相 同之結構及功能特性的奈米抗體)及含有其之多肽極有利地作為功能性抗原結合結構域或多肽。特定而言，VHH結構域(其已經天然「設計」以在不存在輕鏈可變結構域或不與輕鏈可變結構域相互作用之情況下功能結合至抗原)及奈米抗體可用作單一且相對較小之功能性抗原結合結構單元、結構域或蛋白質。本文所用術語奈米抗體不僅涵蓋天然存在之VHH結構域及其片段且涵蓋本文所詳細論述之變體及其衍生物。
在本發明之最佳實施例中，本發明之雙互補位多肽係如下：其中該第一抗原結合結構域係包含於第一奈米抗體內，且該第二抗原結合結構域係包含於第二奈米抗體內，且該第一及該第二奈米抗體係藉由連接體鏈接。
VHH結構域之結構可以如下來代表；FR-CDR-FR-CDR-FR-CDR-FR
且本發明之雙互補位多肽可具有以下結構中之一者：
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--連接體-HLE-EXT
˙FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--HLE--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
˙HLE--連接體--FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT
其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第一抗原結合結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第二抗原結構域，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含第二抗原結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含第一抗原結合結構 域：HLE係延長活體內半衰期之結合單元，且EXT係至少一個額外胺基酸殘基之C端延伸。
因此，本文所用之「本發明之雙互補位奈米抗體」係指包含兩個藉由連接體鏈接之單一奈米抗體之多肽。
然而，本發明之雙互補位奈米抗體可在每一奈米抗體中僅包括一個CDR。若如此，則較佳CDR為CDR3及/或CDR6。然而，本發明之雙互補位奈米抗體可在N端奈米抗體中包括CDR1或CDR2或CDR3或CDR1及CDR2或CDR1及CDR3或CDR2及CDR3或CDR1及CDR2及CDR3且在C端奈米抗體中包括以下組合中之任一者：CDR4或CDR5或CDR6或CDR4及CDR5或CDR4及CDR6或CDR5及CDR6或CDR4及CDR5及CDR6。如上文所指示，本發明之雙互補位奈米抗體可包含CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5及CDR6中之所有，每一CDR均由FR側接。
FR可具有與駱駝科來源一致之胺基酸序列。然而，在較佳實施例中，一或多個FR具有至少一個序列最佳化胺基酸取代，且較佳一或多個且更佳所有FR係經部分或完全人類化。下文中詳細論述用於序列最佳化之取代。
本文中亦提及，在其中第一及第二抗原結合結構域係包含於並非奈米抗體但存於上文所論述習用抗體之結構域或片段(例如人類抗體、結構域或片段)中之第一及第二免疫球蛋白單一可變結構域中的本發明實施例中，可利用至少一個駱駝化取代修飾其中之CDR並視情況生成經完全駱駝化CDR。
如本文所進一步闡述，單一奈米抗體中之總胺基酸殘基數可為110至120左右，較佳為112至115，且最佳為113。然而，應注意，奈米抗體之部分、片段、類似物或衍生物(如本文所進一步闡述)並未特別限制其長度及/或大小，只要該等部分、片段、類似物或衍生物滿 足本文中所概述之其他要求且亦較佳適於本文中所闡述之目的即可。
如本文所進一步闡述，根據Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，公開案第91號)所給之針對VH結構域之通用編碼對奈米抗體之胺基酸殘基進行編碼，如文章Riechmann and Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000 Jun 23；240(1-2)：185-195中應用於來自駱駝科之VHH結構域(例如參見該公開案之圖2)，且因此奈米抗體之FR1可包含位置1至30處之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR1可包含位置31至35處之胺基酸殘基，奈米抗體之FR2可包含位置36至49處之胺基酸，奈米抗體之CDR2可包含位置50至65處之胺基酸殘基，奈米抗體之FR3可包含位置66至94處之胺基酸殘基，奈米抗體之CDR3可包含位置95至102處之胺基酸殘基，且奈米抗體之FR4可包含位置103至113處之胺基酸殘基。在本發明之較佳雙互補位奈米抗體中，N端奈米抗體可具有上文所給位置處之FR及CDR，且在C端奈米抗體中，該奈米抗體之FR5可包含位置1至30處之胺基酸殘基，該奈米抗體之CDR4可包含位置31至35處之胺基酸殘基，該奈米抗體之FR6可包含位置36至49處之胺基酸，該奈米抗體之CDR5可包含位置50至65處之胺基酸殘基，該奈米抗體之FR7可包含位置66至94處之胺基酸殘基，該奈米抗體之CDR6可包含處位置95至102之胺基酸殘基，且該奈米抗體之FR8可包含位置103至113處之胺基酸殘基。
然而，應瞭解，可藉由替代Kabat之編碼系統鑑別抗體、且特定而言奈米抗體中之CDR及FR。該等編碼系統包括Chothia、IMGT及AHo系統。可藉由分析序列來達成根據該等替代編碼系統對表9、13、19、32、33及34中所鑑別之胺基酸序列中之任一者之CDR或FR之位置的鑑別。出於此目的，可能必須參見以下網站：http：//www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/(Chothia)； http：//imgt.cines.fr(IMGT)及http：//www.bio.uzh.ch/antibody/index.html(AHo)。具體而言，在本文中所闡述之本發明較佳雙互補位奈米抗體中，CDR 1、2、3、4、5或6可藉由該等替代Kabat之編碼系統中之一者來界定，但將仍屬於本發明之範圍內。
本發明一些奈米抗體之Chotia CDR係顯示於表35中。
奈米抗體可為所謂「VH3類」(即與VH3類之人類種系序列(例如DP-47、DP-51或DP-29)具有較高序列同源性程度之奈米抗體)，該等奈米抗體較佳係用於構築本發明之雙互補位奈米抗體。然而，應注意，如(例如)WO 07/118670中所闡述針對CXCR2之任何類型之奈米抗體及例如屬於所謂「VH4類」之奈米抗體(即與VH4類之人類種系序列(例如DP-78)具有較高序列同源性程度之奈米抗體)可用於構築本發明之雙互補位奈米抗體。
鏈接一或多個本發明之包含該第一及該第二抗原結合結構域之肽或多肽之連接體分子可為或可不為免疫球蛋白來源。若本發明多肽為雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域，例如奈米抗體，則該連接體將一個包含抗原結合結構域之免疫球蛋白單一可變結構域之C端鏈接至另一個包含抗原結合結構域之免疫球蛋白單一可變結構域之N端。
在本發明雙互補位多肽中用於將該第一及該第二抗原結合結構域連接在一起、特定而言將兩個奈米抗體連接在一起之適宜間隔基因或連接體將為熟習此項技術者所明瞭，且通常可為業內用於連接胺基酸序列之任一連接體或間隔基因。較佳地，該連接體或間隔基因係適用於構築意欲用於醫藥用途之蛋白質或多肽。
例如，連接體可係適宜胺基酸序列、且特定而言具有介於1個與50個之間、較佳介於1個與30個之間、例如介於1個與10個胺基酸殘基之間之胺基酸序列。該等胺基酸序列之一些較佳實例包括如WO 99/42077中所闡述之(例如)(glyxsery)z類型(例如(gly4ser)3或(gly3ser2)3)之gly-ser連接體；及本文中所提及之Ablynx之申請案中所闡述之GS30、GS15、GS9及GS7連接體(例如參見WO 06/040153及WO 06/122825)；以及鉸鏈樣區域，例如天然存在之重鏈抗體或類似序列之鉸鏈區域(例如WO 94/04678中所闡述)。
一些其他可能連接體為聚丙胺酸(例如AAA)以及連接體GS30(WO 06/122825中之SEQ ID NO：85)及GS9(WO 06/122825中之SEQ ID NO：84)。
本發明之較佳連接體為長度介於3個與50個胺基酸之間之肽連接體，例如胺基酸長度為3至9、10至15、16至20、21至25、26至35、36至40、41至45或46至50之連接體。在本發明之一實施例中，肽連接體為35個胺基酸長。該連接體可僅由兩種不同胺基酸組成。如前所述，該等胺基酸可為甘胺酸及絲胺酸。另一選擇為，其可為脯胺酸及絲胺酸。
在本發明之一些實施例、特定而言本發明之雙互補位奈米抗體中，肽連接體係由如下胺基酸序列組成：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.220)。
其他適宜連接體通常包含有機化合物或聚合物、特定而言適於在用於醫藥用途之蛋白質中使用之彼等。例如，聚(乙二醇)部分已用於連接抗體結構域，例如參見WO 04/081026。
因此，在另一態樣中，本發明係關於包含至少兩個多肽之分子，該分子針對或結合至趨化激素受體CXCR2，其中第一多肽包含第一免疫球蛋白抗原結合結構域，且第二多肽包含第二免疫球蛋白抗原結合結構域，其中該第一及該第二抗原結合結構域識別CXCR2上之第一及第二表位，且其中該至少兩個多肽係藉由非肽連接體來鏈 接。
較佳地，在本發明之該態樣中，該第一抗原結合結構域能夠結合至由SEQ ID No.7所示之胺基酸序列組成之線性肽，且該第二抗原結合結構域不能夠結合或以較低親和力結合至該線性肽。較佳地，該第一表位包含CXCR2之胺基酸1至19或在其內，且該第二表位係在CXCR2之胺基酸1至19外面。
較佳地，在本發明之此態樣中，第一及第二抗原結合結構域係包含於免疫球蛋白單一可變結構域中，其中該第一及該第二免疫球蛋白單一可變結構域較佳為奈米抗體且特定而言本文中所具體闡述之奈米抗體中之任一者。
在本文中所闡述之所有本發明態樣中，連接體之基本性質為其具有容許第一及第二抗原結合結構域結合至其於CXCR2上之各別表位之長度及構形。
所用之連接體亦可賦予本發明多肽一或多種其他有利性質或官能性，及/或提供一或多個用於形成衍生物及/或附接官能團之位點(例如如本文中所闡述用於本發明雙互補位奈米抗體之衍生物)。例如，含有一或多個帶電荷之胺基酸殘基之連接體(參見國際申請案WO 08/020079之第48頁之表A-2)可提供改良之親水性質，而形成或含有小表位或標籤之連接體可用於檢測、鑑別及/或純化之目的。再次，基於本文之揭示內容，視情況在一些有限的常規實驗後，熟習此項技術者將能夠確定用於具體本發明多肽之最優連接體。
當在本發明多肽中使用兩個或更多個連接體時，該等連接體可為相同或不同的。再次，基於本文之揭示內容，視情況在一些有限的常規實驗後，熟習此項技術者將能夠確定用於具體本發明多肽之最優連接體。
現已驚奇地發現，一些個體之血清含有可與本發明CXCR2奈米 抗體相互作用之IgG分子，但該等個體先前尚未暴露於奈米抗體。已發現，此係歸因於IgG分子與經人類化Vh結構域中之構形表位(即通常藉由CH1結構域遮蔽於抗體中之區域)之相互作用。為了克服此問題，本發明提供包括C端延伸之對CXCR2具有特異性之雙互補位奈米抗體。已發現此C端延伸有效抑制IgG分子與奈米抗體之間之結合相互作用。本發明者已發現，為了阻斷此相互作用，可將各種C端延伸(A、AA、AS、AST、ASTKP、GGGS)添加至奈米抗體序列中。較佳C端延伸係兩個丙胺酸殘基(AA)。
常常，為便於表現及產生，本發明多肽將為線性多肽。然而，本發明在其最廣泛意義上並不限於其。例如，當本發明多肽包含更多奈米抗體中之三者時，可藉由使用具有三個或更多個「臂」之連接體連接其，其中將每一「臂」連接至奈米抗體，以提供「星形」構築體。亦可以、但常常較不佳使用圓形構築體。
特定而言，可製備兩個或更多個奈米抗體與一或多個上文所鑑別之連接體之任一佈置。例如，可設想包含兩個針對或結合至CXCR2之免疫球蛋白結合結構域及一或多個針對或結合至人類血清白蛋白(HSA)之免疫球蛋白結合結構域的雙互補位、雙特異性奈米抗體，該HSA結合結構域可包含有於任一位置處、例如在兩個CXCR2結合奈米抗體之間經由上文所定義之連接體連接至CXCR2結合奈米抗體的奈米抗體。
本發明者已製備本發明之雙互補位多肽。多價且雙互補位抗CXCR2奈米抗體之胺基酸序列係顯示於表13及本文實例中。其中，本發明之尤佳多肽為表13中指定為163D2-127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2、97A9-54B12、127D1-163D2、127D1-163E3、2B2-97A9、54B12-163D2、54B12-163E3、163D2-2B2及163E3-2B2以及127D1-97A9、 54B12-97A9及97A9-127D1之雙互補位奈米抗體及其經序列最佳化變體。所有該等雙互補位奈米抗體包含第一奈米抗體及第二奈米抗體，該第一奈米抗體包含能夠結合至由SEQ ID No.7所示之胺基酸序列(CXCR2之胺基酸1至19)組成之線性肽的第一抗原結合結構域，該第二奈米抗體包含不能夠結合或以較低親和力結合至該線性肽之第二抗原結合結構域(參見表8)。本發明尤佳者為163D2-127D1、163E3-127D1、163E3-54B12、163D2-54B12、2B2-163E3、2B2-163D2、97A9-2B2及97A9-54B12。
如本文中已論述，若本發明之包括指定為163D2/127D1、163E3/127D1、163E3/54B12、163D2/54B12、2B2/163E3、2B2/163D2、97A9/2B2、97A9/54B12、127D1/163D2、127D1/163E3、127D1/97A9、2B2/97A9、54B12/163D2、54B12/163E3、54B12/97A9、97A9/127D1、163D2/2B2或163E3/2B2之具體實施例及其變體之較佳雙互補位奈米抗體在其框架區域內具有至少一個序列最佳化胺基酸取代且該等框架區域可(例如)經完全或部分人類化，則係期望的。若序列最佳化之程度導致雙互補位奈米抗體與SEQ ID No.58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66至少就框架區域而言具有80%至90%序列一致性，則係期望的。
本發明實施例進一步包含多肽，其中第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.213、214、216及219或與該等中之一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，且第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.215、217及218或與該等中之一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
(0079-0076)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第 二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.141所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.236所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.181所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.146所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.237所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.186所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.141、236、181、146、237或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.141、236、181、146、237或186所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.217或與SEQ ID No.217具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在又一實施例中，該多肽包含SEQ ID No.221。
(0079-0086)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.141所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.236所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.181所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.145所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.165所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.185所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、 CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.141、236、181、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.141、236、181、145、165或185所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.218或與SEQ ID No.218具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在又一實施例中，該多肽包含SEQ ID No.222。
(0079-0061)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.141所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.236所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.181所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.143所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.235所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.183所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.141、236、181、143、235或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.141、236、181、143、235或183所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.216或與SEQ ID No.216具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.215或與SEQ ID No.215具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，其由具有SEQ ID No.220之連接體隔開。
(0104-0076)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.151所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.171所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.191所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.146所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.237所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.186所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.151、171、191、146、237或186所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.151、171、191、146、237或186所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.217或與SEQ ID No.217具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在又一實施例中，該多肽包含SEQ ID No.223。
(0104-0086)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.151所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.171所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.191所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.145所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.165所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.185所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.151、171、191、145、165或185所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.151、171、191、145、165或185所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.218或與SEQ ID No.218具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽。
在又一實施例中，該多肽包含SEQ ID No.224。
(0104-0061)
在本發明之一實施例中，該多肽在具有單一可變結構域之該第二免疫球蛋白中包含含有SEQ ID No.151所示之胺基酸序列之CDR1、含有SEQ ID No.171所示之胺基酸序列之CDR2及含有SEQ ID No.191所示之胺基酸序列之CDR3，且在具有單一可變結構域之該第一免疫球蛋白中進一步包含含有SEQ ID No.143所示之胺基酸序列之CDR4、含有SEQ ID No.235所示之胺基酸序列之CDR5及含有SEQ ID No.183所示之胺基酸序列之CDR6。在其他實施例中，CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5或CDR6之胺基酸序列與SEQ ID No.151、171、191、143、235或183所示之胺基酸序列中之任一者具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%胺基酸一致性。
在另一實施例中，該多肽包含僅在保守胺基酸變化方面與SEQ ID No.151、171、191、143、235或183所示之彼等不同之胺基酸序列。
在另一實施例中，該多肽包含第一抗原結合結構域係選自SEQ ID No.219或與SEQ ID No.219具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，及該第二抗原結合結構域係選自SEQ ID No.215或與SEQ ID No.215具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%一致性之多肽，其由具有SEQ ID No.220之連接體隔開。
在另一態樣中，本發明提供多肽、且特定而言免疫球蛋白單一可變結構域，例如VHH結構域或如下之奈米抗體：其在CXCR2結合方面為單價，且為本發明雙互補位多肽之建構組元，且可視為其產生過程中之中間體。較佳單價免疫球蛋白單一可變結構域係彼等表9中所顯示具有SEQ ID No.25至43及90之多肽或與SEQ ID No.25至43及90中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之多肽。
較佳單價多肽為指定為137B7且包含SEQ ID No.36所示之胺基酸序列或與SEQ ID No.36具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%胺基酸序列一致性之胺基酸序列者。在較佳實施例中，SEQ ID No.36之框架區域具有一或多個序列最佳化胺基酸取代。其他較佳單價多肽為指定為127D1、2B2、54B12、97A9、163D2及163E3之彼等，包括已在框架區域中經序列最佳化之彼等。
例如，127D1可包含SEQ ID No.37之胺基酸序列，其中已進行一 或多個表26中所涵蓋之序列最佳化胺基酸取代且該多肽較佳包含SEQ ID No.216所示之胺基酸序列。
2B2可包含SEQ ID No.43之胺基酸序列，其中已進行一或多個表20中所涵蓋之序列最佳化取代且該多肽較佳包含SEQ ID No.213或214所示之胺基酸序列。
54B12可包含SEQ ID No.90，其中已進行一或多個表30中所涵蓋之序列最佳化取代且該多肽較佳包含SEQ ID No.219所示之胺基酸序列。
97A9可包含SEQ ID No.39，其中已進行一或多個表22中所涵蓋之序列最佳化取代且該多肽較佳包含SEQ ID No.215所示之胺基酸序列。
163D2可包含SEQ ID No.41之胺基酸序列，其中已進行表28中所涵蓋之序列最佳化取代中之一或多者且該多肽較佳包含SEQ ID No.218所示之胺基酸序列。
163E3可包含SEQ ID No.42所示之胺基酸序列，其中已進行一或多個表24中所涵蓋之序列最佳化取代且該多肽較佳包含SEQ ID No.217所示之胺基酸序列。
本發明之此態樣內亦涵蓋單價多肽、特定而言免疫球蛋白單一可變結構域，例如能夠交叉阻斷CXCR2與具有SEQ ID No.58、59、62、63、64、65、47或61中之任一者所示之胺基酸序列之多肽之結合的奈米抗體。
上文所論述之較佳單價奈米抗體中之任一者且特定而言137B7可用於本文所列舉之應用，例如用於治療COPD。
本發明之雙互補位多肽、特定而言上文所論述之較佳雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域論述(包括其所有經駱駝化及經人類化形式)係CXCR2之調節劑，且特定而言抑制CXC2信號轉導。
較佳地，雙互補位多肽、特定而言本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域中之CDR序列及FR序列使得其：- 以10-5莫耳/公升至10-12莫耳/公升或更小、且較佳10-7莫耳/公升至10-12莫耳/公升或更小且更佳10-8莫耳/公升至10-12莫耳/公升之解離常數(KD)(即以105公升/莫耳至1012公升/莫耳或更多、且較佳107公升/莫耳至1012公升/莫耳或更多且更佳108公升/莫耳至1012公升/莫耳之締合常數(KA))結合至CXCR2；及/或使得其：- 以介於102M-1s-1至約107M-1s-1之間、較佳介於103M-1s-1與107M-1s-1之間、更佳介於104M-1s-1與107M-1s-1之間、例如介於105M-1s-1與107M-1s-1之間之kon速率結合至CXCR2；及/或使得其：- 以介於1s-1(t1/2=0.69s)與10-6s-1(提供t1/2為數天之近不可逆複合物)之間、較佳介於10-2s-1與10-6s-1之間、更佳介於10-3s-1與10-6s-1之間、例如介於10-4s-1與10-6s-1之間之koff速率結合至CXCR2。
較佳地，本發明之多肽及雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域中存在之CDR序列及FR序列使得其以小於500nM、較佳小於200nM、更佳小於10nM、例如小於500pM之親和力結合至CXCR2。
特定而言，如本文實例中所顯示，本發明之較佳雙互補位奈米抗體能夠以小於20nM之IC50抑制Gro-α結合至人類CXCR2。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於100nM之IC50抑制激動劑誘導(Gro-α)之自攜帶CXCR2之RBL細胞之Ca釋放。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於50nM之IC50抑制CXCR2-CHO膜中之激動劑誘導(Gro-α)之[35S]GTPγS累積。本發明之較佳雙互補位奈米抗體亦可以小於<1nm之IC50抑制暴露於Gro-α後之人類白血球形狀變化或以小於<2nm之IC50抑制食蟹猴白血球形狀變化。
依照本發明之最佳態樣，本發明之雙互補位多肽、例如雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域(例如本文中所闡述之奈米抗體)將交叉阻斷SEQ ID No.58、59、62、63、64、65、47或61所示之多肽中之任一者或所有結合至具有SEQ ID No.1之胺基酸序列之CXCR2多肽。交叉阻斷可藉由熟習此項技術者所熟知之任一方法來量測。
對於醫藥用途，本發明多肽較佳針對人類CXCR2、例如包含SEQ ID No.1所示之胺基酸序列之多肽；而出於獸醫目的，本發明多肽較佳針對來自欲治療物種之CXCR2，或至少與來自欲治療物種之CXCR2具有交叉反應性。
此外，本發明之雙互補位多肽可視情況且除至少兩個用於針對CXCR2結合之抗原結合結構域以外含有一或多個用於針對其他表位、抗原、蛋白質或標靶結合之其他結合位點或結構域。
本發明多肽及包含其之組合物之效力可使用本身已知之任一適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或動物模型或其任一組合來測試，該等分析及模型適於指示該多肽可用於治療COPD或任一涉及異常CXCR2信號轉導之其他疾病。適宜分析及動物模型將為熟習此項技術者所明瞭。
而且，根據本發明，針對人類CXCR2之多肽可與來自一或多種其他溫血動物物種之CXCR2顯示或可不顯示交叉反應性。然而，較佳地，出於毒性測試之目的，本發明之針對人類CXCR2之多肽將與來自一或多種其他靈長類物種(例如但不限於來自獼猴屬(genus Macaca)之猴(例如且特定而言食蟹猴(Macaca fascicularis)及/或恒河猴(Macaca mulatta))及狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))之CXCR2顯示交叉反應性。較佳與來自食蟹猴之CXCR2具有交叉反應性。可期望與一或多種常用於疾病之動物模型之動物物種(例如小鼠、大鼠、兔、豬或狗)、且特定而言用於與CXCR2相關之疾病及病症之動物模 型之動物物種具有交叉反應性。在此態樣中，熟習此項技術者將明瞭，自藥物研發觀點來看，該交叉反應性在存在時可具有優勢，此乃因其允許在該等疾病模型中測試針對人類CXCR2之胺基酸序列及多肽。
更一般而言，本發明之與來自多種哺乳動物物種之CXCR2具有交叉反應性之多肽將常常有利地用於獸醫應用，此乃因其將允許在多種物種之間使用同一多肽。
較佳地，本發明之雙互補位多肽與CXCR1或CXCR4無交叉反應性。
在本發明之雙互補位多肽，至少一個抗原結合位點可針對相互作用位點，即CXCR2將與另一分子(例如其天然配體或配體)相互作用之位點。
本發明之雙互補位多肽(例如免疫球蛋白單一可變結構域)可使得第二抗原結合結構域不結合SEQ ID No.7之線性肽(其識別包含本文中闡釋為SEQ ID No.8、9、10、11或12之肽或於其內之表位)。另外，第一抗原結合結構域可識別包含SEQ ID No.7之肽或於其內之表位。
在本發明之與食蟹猴CXCR2交叉反應之實施例中，第一抗原結合結構域亦識別包含SEQ ID No.4之肽或於其內之表位。該第二抗原結合結構域在此一實施例中可識別包含SEQ ID No.5或6之肽或於其內之表位。
本發明之範圍內亦提供如下之雙互補位多肽、特定而言雙互補位奈米抗體之類型：其通常將結合至CXCR2之所有天然存在之或合成類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段；或至少結合至CXCR2之如下彼等類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段：含有一或多個與CXCR2中(例如在SEQ ID No.1之野生型CXCR2中)本發明多肽所結合之抗原決定簇或表位基本上相同之抗原決定簇 或表位。在此一情形下，本發明多肽可以與上文所論述本發明多肽結合至(野生型)CXCR2之親和力及特異性相同或與其不同(即高於或低於)之親和力及/或特異性結合至該等類似物、變體、突變體、對偶基因、部分及片段。
而且，如熟習此項技術者所明瞭，雙互補位多肽以高於相應單一抗原結合結構域多肽之親合力結合至CXCR2。
使用雙互補位多肽、特定而言本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域之部分、片段、類似物、突變體、變體、對偶基因及/或衍生物用於本文所論述之各種治療情況亦屬於本發明之範圍，限制條件始終係其包括與全多肽等效之相關功能結構域。該等部分、片段、類似物、突變體、變體、對偶基因或衍生物可具有上文針對本發明之雙互補位多肽所論述之所有功能特徵。
在另一態樣中，本發明係關於視情況進一步包含一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域。該等其他基團、殘基、部分、結合單元或胺基酸序列可或可不向本發明多肽提供其他功能，且可或可不改變其性質。
例如，該等其他基團、殘基、部分或結合單元可係一或多個額外胺基酸序列，以使得本發明係(融合)蛋白質或(融合)多肽。在較佳但非限制性態樣中，該一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元係免疫球蛋白序列。甚至更佳地，該一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元係選自由結構域抗體、適於用作結構域抗體之胺基酸序列、單一結構域抗體、適於用作單一結構域抗體之胺基酸序列、「dAb」、適於用作dAb之胺基酸序列或奈米抗體組成之群。
另一選擇為，該等基團、殘基、部分或結合單元可係(例如)化學基團、殘基、部分，其自身可或可不具有生物及/或藥理活性。例如，該等基團可連接至一或多個本發明多肽，以提供本發明多肽之 「衍生物」，如本文所進一步闡述。
在該等構築體中，一或多個本發明多肽及一或多個基團、殘基、部分或結合單元可直接及/或經由一或多個適宜連接體或間隔基因彼此連接。例如，當一或多各基團、殘基、部分或結合單元為胺基酸序列時，連接體亦可為胺基酸序列，以使得所得構築體為融合(蛋白質)或融合(多肽)。
如根據上文及此處之其他闡述所明瞭，此意指本發明之雙互補位多肽可用作「建構組元」來進一步形成本發明多肽，即藉由以適宜方式將其與其他基團、殘基、部分或結合單元組合，以形成本文中所闡述為多互補位且視情況多價或多特異性、二/多價且雙/多特異性之構築體。
本發明之此態樣之多肽通常可藉由至少包含一個如下步驟之方法來製備：視情況經由一或多個適宜連接體將一或多個本發明多肽以適宜方式連接至一或多個其他基團、殘基、部分或結合單元。
在本發明之一具體態樣中，本發明之雙互補位多肽係經修飾以與本發明之相應未經修飾多肽相比具有延長之半衰期。基於本文中之其他揭示內容，一些較佳多肽將變得為熟習此項技術者所明瞭，且包含(例如)本發明之已經化學修飾以延長其半衰期(例如藉助聚乙二醇化、pas化或hes化)之胺基酸序列或多肽；本發明多肽可包含至少一個用於結合至血清蛋白質(例如血清白蛋白)之額外結合位點；或本發明多肽可包含至少一個連接至至少一個延長本發明多肽之半衰期之部分(且特定而言至少一個胺基酸序列)的胺基酸序列。本發明之包含該等延長半衰期之部分(moiety)或胺基酸序列之多肽之實例包括以適宜方式連接至一或多種血清蛋白質或其片段(例如(人類)血清白蛋白或其適宜片段)或連接至一或多個結合單元之多肽，該一或多個結合單元可結合至血清蛋白質(例如，結構域抗體、適於用作結構域抗體之胺基 酸序列、單一結構域抗體、適於用作單一結構域抗體之胺基酸序列、「dAb」、適於用作dAb之胺基酸序列或可結合至諸如血清白蛋白(例如人類血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(例如IgG)或轉鐵蛋白等血清蛋白質之奈米抗體)；連接至Fc部分(portion)(例如人類Fc)或其適宜部分(part)或片段之多肽。本發明之連接至一或多種可結合至血清蛋白質(例如但不限於WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489及Ablynx N.V.於2006年12月5日申請之標題為「Peptides capable of binding to serum proteins」之AblynxN.V.美國臨時申請案(亦參見PCT/EP2007/063348)中所闡述之蛋白質及肽)之小蛋白質或肽之多肽亦納入本發明內。
最廣泛用於延長半衰期及/或降低醫藥蛋白質之免疫原性之技術中之一者包含附接適宜的藥理上可接受之聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可使用任一適宜形式之聚乙二醇化，例如業內用於抗體及抗體片段(包括(但不限於)(單一)結構域抗體及ScFv)之聚乙二醇化；例如參見Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veroneseji Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)、Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)及WO 04/060965。用於蛋白質之聚乙二醇化之各種試劑亦購自(例如)Nektar Therapeutics,USA。
較佳地，使用定點聚乙二醇化，特定而言經由半胱胺酸殘基(例如參見Yang等人，Protein Engineering,16,10,761-770(2003)。例如，出於此目的，可將PEG附接至本發明之雙互補位奈米抗體中天然存在之半胱胺酸殘基。本發明之雙互補位多肽可經修飾，以以適宜方式引入一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基，或可將包含一或多個用於附接PEG之半胱胺酸殘基之胺基酸序列與雙互補位多肽之N-及/或C端融合，用於蛋白質改造之所有技術本身為熟習此項技術者所已 知。
較佳地，對於本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域及多肽，使用分子量超過5000、例如超過10.000且小於200.000、例如小於100.000；例如在20.000至80.000之範圍內之PEG。
可將聚乙二醇化施加至免疫球蛋白可變結構域中之一或二者及/或任一肽連接體區域。適宜聚乙二醇化技術係闡述於EP 1639011中。
作為PEG之替代方案，可藉由稱為Hes化之技術來延長半衰期，該技術涉及將羥乙基澱粉(HES)衍生物附接至本發明多肽。所用之羥乙基澱粉為源自於糯玉米澱粉之支鏈澱粉，其已藉助酸水解經修飾以調整分子量且其中葡萄糖殘基已經羥乙基化。其他細節可獲得自Pavisic R等人，Int J Pharm(2010)3月15日，387(1-2)：110-9。
通常，本發明之具有延長之半衰期之多肽的半衰期較佳為本發明相應多肽本身之半衰期的至少1.5倍、較佳至少2倍、例如至少5倍、例如至少10倍或超過20倍。例如，與本發明之相應多肽本身相比，本發明之具有延長之半衰期之多肽的半衰期延長超過1小時、較佳超過2小時、更佳超過6小時、例如超過12小時或甚至超過24小時、48小時或72小時。
在本發明之較佳態樣中，與本發明之相應多肽本身相比，該等本發明多肽之血清半衰期延長超過1小時、較佳超過2小時、更佳超過6小時、例如超過12小時或甚至超過24小時、48小時或72小時。
在本發明之另一較佳態樣中，本發明多肽在人類中呈現至少約12小時、較佳至少24小時、更佳至少48小時、甚至更佳至少72小時或更長之血清半衰期。例如，本發明多肽之半衰期為至少5天(例如約5至10天)、較佳至少9天(例如約9至14天)、更佳至少約10天(例如約10至15天)、或至少約11天(例如約11至16天)、更佳至少約12天(例如約12至18天或更多)、或超過14天(例如約14至19天)。
本發明進一步係關於製備或生成本文中所闡述之本發明多肽、核酸、宿主細胞及組合物的方法。
通常，該等方法可包含以下步驟：a)提供多肽之組合、聚積或藏庫；及b)針對可結合至CXCR2及/或對CXCR2具有親和力之胺基酸序列篩選該多肽組合、聚積或藏庫；及c)分離可結合至CXCR2及/或對CXCR2具有親和力之胺基酸序列。
多肽之組合、聚積或藏庫可係免疫球蛋白序列(如本文中所闡述)之組合、聚積或藏庫，例如免疫球蛋白序列之純真組合、聚積或藏庫；免疫球蛋白序列之合成或半合成組合、聚積或藏庫；及/或已經受親和力成熟之免疫球蛋白序列之組合、聚積或藏庫。
而且，在此一方法中，多肽之組合、聚積或藏庫可係重鏈可變結構域(例如VH結構域或VHH結構域)或輕鏈可變結構域之組合、聚積或藏庫。例如，多肽之組合、聚積或藏庫可係結構域抗體或單一結構域抗體之組合、聚積或藏庫，或可係能夠用作結構域抗體或單一結構域抗體之胺基酸序列之組合、聚積或藏庫。
在此方法之較佳態樣中，多肽之組合、聚積或藏庫可係源自於(例如)哺乳動物、例如已經CXCR2或基於其或源自其之適宜抗原決定簇(例如其抗原部分、片段、區域、結構域、環或其他表位)適宜免疫之駱馬之免疫球蛋白序列的免疫組合、聚積或藏庫。
在上文方法中，可於噬菌體、噬菌粒、核糖體或適宜微生物(例如酵母)上展示肽或多肽之組合、聚積或藏庫，以致於能夠幫助篩選。例如基於本文中之其他揭示內容，用於展示及篩選胺基酸序列(之組合、聚積或藏庫)之適宜方法、技術及宿主生物將為熟習此項技術者所明瞭的。亦參見Hoogenboom於Nature Biotechnology,23,9, 1105-1116(2005)中之綜述。
在另一態樣中，生成用於構築本發明雙互補位多肽之多肽的方法至少包含以下步驟：a)提供表現多肽之細胞的聚積或樣品；b)篩選該細胞聚積或樣品，以得到表現可結合至CXCR2及/或對CXCR2具有親和力之多肽之細胞；及c)(i)分離該多肽；或(ii)自該細胞分離出編碼該多肽之核酸序列，隨後表現該多肽。
例如，當期望多肽為免疫球蛋白序列時，細胞之聚積或樣品可能為(例如)B-細胞之聚積或樣品。而且，在此方法中，細胞樣品可源自經以CXCR2或基於其或源自於其之適宜抗原決定簇(例如其抗原部分、片段、區域、結構域、環或其他表位)適當免疫之於哺乳動物，例如駱馬。在一特定態樣中，該抗原決定簇可係細胞外部分、區域、結構域、環或其他細胞外表位。
在本文中所鑑別之本發明較佳雙互補位奈米抗體之製備中，用可表現人類CXCR2之哺乳動物細胞、表現食蟹猴CXCR2之哺乳動物細胞、編碼全長人類CXCR2之DNA、編碼△1-17人類CXCR2之DNA、編碼食蟹猴CXCR2之DNA及表5所示之肽對駱馬進行免疫。
上文所闡述之篩選方法可以任一適宜方式來實施，如熟習此項技術者所明瞭。例如，參見EP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268及WO 04/106377。較佳使用流式細胞術(例如FACS)實施步驟b)之篩選。對於此，參見(例如)Lieby等人，Blood，第97卷，第12期，3820(2001)。
在另一態樣中，生成用於構築本發明多肽之針對CXCR2之多肽的方法可至少包含以下步驟：a)提供編碼該多肽之核酸序列之組合、聚積或藏庫； b)針對編碼可結合至CXCR2及/或對CXCR2具有親和力之胺基酸序列之核酸序列篩選該核酸序列組合、聚積或藏庫；及c)分離該核酸序列，隨後表現該多肽。
在此一方法中，編碼該多肽之核酸序列之組合、聚積或藏庫可係(例如)編碼免疫球蛋白序列之純真組合、聚積或藏庫之核酸序列之組合、聚積或藏庫；編碼免疫球蛋白序列之合成或半合成組合、聚積或藏庫之核酸序列之組合、聚積或藏庫；及/或編碼已經受親和力成熟之免疫球蛋白序列之組合、聚積或藏庫之核酸序列之組合、聚積或藏庫。
而且，在此一方法中，核酸序列之組合、聚積或藏庫可編碼重鏈可變結構域(例如VH結構域或VHH結構域)或輕鏈可變結構域之組合、聚積或藏庫。例如，核酸序列之組合、聚積或藏庫可編碼結構域抗體或單一結構域抗體之組合、聚積或藏庫、或能夠用作結構域抗體或單一結構域抗體之胺基酸序列之組合、聚積或藏庫。
在此方法之較佳態樣中，核酸序列之組合、聚積或藏庫可係源自於(例如)已經CXCR2或基於其或源自於其之適宜抗原決定簇(例如其抗原部分、片段、區域、結構域、環或其他表位)適宜免疫之哺乳動物之核酸序列的免疫組合、聚積或藏庫。在一特定態樣中，該抗原決定簇可係細胞外部分、區域、結構域、環或其他細胞外表位。
在本發明多肽之生成中，如上文所解釋用抗原對駱馬進行免疫。
在上文方法中，可於噬菌體、噬菌粒、核糖體或適宜微生物(例如酵母)上展示核苷酸序列之組合、聚積或藏庫，例如以促進篩選。例如基於本文中之其他揭示內容，用於展示及篩選編碼胺基酸序列之核苷酸序列(之組合、聚積或藏庫)之適宜方法、技術及宿主生物將為熟習此項技術者所明瞭。亦參見Hoogenboom於Nature Biotechnology, 23,9,1105-1116(2005)中之綜述。
在另一態樣中，生成可用於本發明雙互補位多肽之針對CXCR2之多肽的方法可至少包含以下步驟：a)提供編碼多肽之核酸序列之組合、聚積或藏庫；b)針對編碼可結合至CXCR2及/或對CXCR2具有親和力且經交叉阻斷或交叉阻斷本發明雙互補位奈米抗體(例如由SEQ ID NO 58、59、62、63、64、65、47或61所編碼者)之胺基酸序列之核酸序列篩選該核酸序列組合、聚積或藏庫；及c)分離該核酸序列，隨後表現該多肽。
本發明亦係關於雙互補位多肽，該等雙互補位多肽係藉由上文方法、或另一選擇為藉由包含上文方法中之一者及另外至少以下步驟之方法獲得：測定該免疫球蛋白序列之核苷酸序列或胺基酸序列；及以本身已知方式(例如，藉由在適宜宿主細胞或宿主生物中表現，或藉由化學合成)表現或合成該胺基酸序列並自其構築雙互補位多肽。
上文方法可以任一適宜方式實施，如熟習此項技術者所明瞭並在下文中所更詳細論述。例如，參見EP 0 542 810、WO 05/19824、WO 04/051268及WO 04/106377。例如，較佳使用流式細胞術(例如FACS)實施步驟b)之篩選。對於此，參見(例如)Lieby等人，Blood，第97卷，第12期，3820。特定參見Ablynx N.V.之國際申請案WO 06/079372中所闡述之所謂「NanocloneTM」技術。
獲得針對CXCR2之VHH序列或奈米抗體序列之另一技術涉及：對能夠表現重鏈抗體之轉基因哺乳動物進行適宜免疫(即以致能引起免疫反應及/或針對CXCR2之重鏈抗體)，自該轉基因哺乳動物獲得含有該等VHH序列或奈米抗體序列(編碼該等VHH序列或奈米抗體序列之核酸序列)之適宜生物樣品(例如血液樣品、血清樣品或B-細胞樣品)，且然後自該樣品開始並使用任一本身已知之適宜技術(例如本文中所闡 述方法中之任一者或融合瘤技術)來生成針對CXCR2之VHH序列。例如，出於此目的，可使用WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548及Janssens等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41)：15130-5中所闡述之表現重鏈抗體之小鼠及其他方法及技術。例如，該等表現重鏈抗體之小鼠可表現具有任一適宜(單一)可變結構域、例如來自天然來源之(單一)可變結構域(例如人類(單一)可變結構域、駱駝科(單一)可變結構域或鯊魚(單一)可變結構域)以及(例如)合成或半合成(單一)可變結構域之重鏈抗體。
自天然存在之VH序列或較佳VHH序列開始來獲得用於本發明之奈米抗體及/或編碼其之核酸的其他適宜方法及技術將為熟習此項技術者所明瞭，且可(例如)包括本文中所提及之WO 08/00279之第64頁所提及之技術。
VHH結構域或奈米抗體之特徵可在於其FR內之一或多個「標誌殘基」。標誌殘基係表徵FR為來自駱駝科(例如駱馬來源)之彼等殘基。因此，標誌殘基為取代、較佳人類化取代之期望標靶。
根據Kabat編碼，標誌殘基可在奈米抗體中之位置11、37、44、45、47、83、84、103、104或108處。該等框架序列及替代標誌殘基(之適宜組合)之非限制性實例係於WO 2008/020079之第65頁至第98頁給出，該等頁全文併入本文中。亦預期業內已知之其他經人類化或經部分人類化序列，且其涵蓋於本發明中。
如本文中已論述，與天然存在之人類VH結構域之相應框架區域相比、且特定而言與DP-47之相應框架區域相比，用於本發明之奈米抗體在框架區域中之至少一者中可具有至少「一個胺基酸差異」(如本文中所定義)。更具體而言，根據本發明之一非限制性態樣，與天然存在之人類VH結構域之相應框架區域相比、且特定而言與DP-47之相應框架區域相比，奈米抗體於標誌殘基中之至少一者(包括於位置 108、103及/或45處之彼等)處可具有至少「一個胺基酸差異」(如本文中所定義)。常常，奈米抗體將與FR2及/或FR4中之至少一者中之天然存在之VH結構域、且特定而言FR2及/或FR4中之標誌殘基中之至少一者(再次，包括於位置108、103及/或45處之彼等)具有至少一個該胺基酸差異。
而且，本發明之經人類化奈米抗體可如本文中所定義，但限制條件係與天然存在之VHH結構域之相應框架區域相比，其在框架區域中之至少一者中具有至少「一個胺基酸差異」(如本文中所定義)。更具體而言，根據本發明之一非限制性態樣，經人類化或以其他方式經序列最佳化奈米抗體可如本文中所定義，但限制條件係與天然存在之VHH結構域之相應框架區域相比，其於標誌殘基中之至少一者(包括於位置108、103及/或45處之彼等)處具有至少「一個胺基酸差異」(如本文中所定義)。常常，經人類化或以其他方式經序列最佳化奈米抗體將與FR2及/或FR4中之至少一者中之天然存在之VHH結構域、且特定而言於FR2及/或FR4中之標誌殘基中之至少一者(再次，包括於位置108、103及/或45處之彼等)處具有至少一個該胺基酸差異。
如根據本文中之揭示內容所明瞭，使用本文中所定義之本發明免疫球蛋白單一可變結構域之天然或合成類似物、突變體、變體、對偶基因、同系物及直系同源物(在本文中共同稱為「類似物」)、且特定而言SEQ ID NO.58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66之雙互補位奈米抗體之類似物亦屬於本發明之範圍。
通常，與本文中所定義之本發明免疫球蛋白單一可變結構域相比，在該等類似物中，可已替代、缺失及/或添加一或多個胺基酸殘基。可在框架區域中之一或多者及/或CDR中之一或多者中進行該等取代、插入或缺失。當在框架區域中之一或多者中進行該等取代、插 入或缺失時，其可於標誌殘基中之一或多者及/或框架殘基中之其他位置中之一或多者處進行，但標誌殘基處之取代、插入或缺失通常較不佳(除非存在本文中所定義之適宜人類化取代)。
藉助非限制性實例，取代可係(例如)保守取代(如本文中所闡述)，及/或胺基酸殘基可經於另一VHH結構域中之相同位置處天然存在之另一胺基酸殘基替代(對於該等取代之一些非限制性實例，參見WO 2008/020079)，但本發明通常不限於此。因此，改良(例如)用於本發明雙互補位奈米抗體之奈米抗體之性質或至少不過分背離本發明之期望性質或期望性質之平衡或組合(即至奈米抗體或雙互補位奈米抗體不再適於其預期用途之程度)的任何一或多個取代、缺失或插入或其任一組合係包括於本發明之範圍內。基於本文中之揭示內容且視情況在有限程度之常規實驗後，熟習此項技術者通常將能夠確定並選擇適宜取代、缺失或插入或其適宜組合，該常規實驗可涉及(例如)引入有限數量之可能取代及測定其對由此獲得之奈米抗體之性質之影響。
例如，且視用於表現本發明雙互補位奈米抗體或多肽之宿主生物而定，該等缺失及/或取代可經設計，以使得移除一或多個轉譯後修飾位點(例如一或多個糖基化位點)，如屬於熟習此項技術者之能力內。另一選擇為，取代或插入可經設計，以引入一或多個附接官能團之位點(如本文中所闡述)，例如以允許位點特異性聚乙二醇化(再次如本文中所闡述)。
在本文中通常，出於獲得天然序列中不存在之特定性質或結構特性之目的促進胺基酸序列中之取代、插入或缺失(包括「人類化」取代)係稱為「序列最佳化」。在此態樣中，可參見本文中之定義部分第(y)項。
類似物較佳使得其可以如本文中針對本發明雙互補位奈米抗體 所定義之親和力(以適宜方式量測及/或表達為KD值(實際或表觀)、KA值(實際或表觀)、kon速率及/或koff速率，或另一選擇為IC50值，如本文所進一步闡述)結合至CXCR2。
類似物較佳亦使得其保持雙互補位奈米抗體之有利性質，如本文中所定義。
而且，根據一較佳態樣，類似物與SEQ ID No.58、59、62、63、64、65、47、61、53、54、46、69、68、67或66之雙互補位奈米抗體中之一者具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、例如至少95%或99%或更多之序列一致性程度；及/或較佳具有至多20個、較佳至多10個、甚至更佳至多5個、例如4個、3個、2個或僅1個胺基酸差異(如本文中所定義)。
而且，類似物之框架序列及CDR較佳使得其與本文中所定義之較佳態樣一致。更一般而言，如本文中所闡述，類似物將具有(a)於位置108處之Q；及/或(b)於位置45處之帶電荷之胺基酸或半胱胺酸殘基、且較佳於位置44處之E、且更佳於位置44處之E及於位置45處之R；及/或(c)於位置103處之P、R或S。
本發明之雙互補位VHH結構域或奈米抗體之一較佳類似物類別已經人類化(即與天然存在之奈米抗體之序列相比)。如所提及，該人類化通常涉及用人類VH結構域(例如人類VH3結構域)中相同位置處存在之胺基酸殘基替代天然存在之VHH之序列中之一或多個胺基酸殘基。除本文中表20、22、24、26、28及30中所具體揭示之彼等以外存在可能人類化取代之實例，但根據奈米抗體之序列與天然存在之人類VH結構域之序列之間之比較並根據本文中已揭示之WO 2008/020079之揭示內容，人類化取代之其他組合將為熟習此項技術者所明瞭。
通常，由於人類化，免疫球蛋白單一可變結構域、特定而言本發明之奈米抗體可變得更「類人型」，同時仍保持本文中所闡述之本 發明奈米抗體之有利性質。因此，與相應的天然存在之VHH結構域相比，該等經人類化奈米抗體可具有若干優勢，例如降低之免疫原性。再次，基於本文中之揭示內容且視情況在在有限程度之常規實驗後，熟習此項技術者將能夠進行人類化取代或人類化取代之適宜組合，該等人類化取代最佳化或達成一方面由人類化取代提供之有利性質與另一方面天然存在之VHH結構域之有利性質之間的期望或適宜平衡。
用於納入本發明雙互補位奈米抗體之奈米抗體可於任何框架殘基處、例如於一或多種標誌殘基(如本文中所定義)處或於一或多種其他框架殘基(即非標誌殘基)處或其任一適宜組合以適宜方式經人類化。「P,R,S-103群組」或「KERE群組」之奈米抗體之一較佳人類化取代為Q108變為L108。「GLEW類別」之奈米抗體亦可藉由Q108變成L108之取代經人類化，限制條件係其他標誌殘基中之至少一者含有駱駝科(駱駝化)取代(如本文中所定義)。例如，如上文所提及，一尤佳的經人類奈米抗體類別具有於位置44至47處之GLEW或GLEW樣序列；於位置103處之P、R或S(且特定而言R)；及於位置108處之L。
經人類化及其他類似物以及編碼其之核酸序列可以任一本身已知之方式(例如使用WO 08/020079之第103頁及第104頁所提及技術中之一或多者)提供。
如上文所提及，熟習此項技術者亦將明瞭，本發明之免疫球蛋白單一可變結構域(包括其類似物)可自人類VH序列(即胺基酸序列或相應核苷酸序列)、例如自人類VH3序列(例如DP-47、DP-51或DP-29)開始來設計及/或製備，即藉由引入一或多個駱駝化取代(即將該人類VH結構域之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基變為VHH結構域中相應位置處存在之胺基酸殘基)，以提供本發明奈米抗體之序列及/或以向由此獲得之序列賦予奈米抗體之有利性質。再次，此通常可使用先前段落中所提及之各種方法及技術並使用人類VH結構域之胺基酸序 列及/或核苷酸序列作為起點來實施。
一些較佳但非限制性駱駝化取代可源自於WO 2008/020079。亦將明瞭，標誌殘基中之一或多者處之駱駝化取代對期望性質的影響通常將大於其他胺基酸位置中之一或多者處之取代，但兩者及其任一適宜組合係包括於本發明之範圍內。例如，可引入一或多個已至少賦予一些該等期望性質之駱駝化取代，且然後進一步引入進一步改良該等性質及/或賦予額外有利性質之駱駝化取代。再次，基於本文中之揭示內容且視情況在有限程度之常規實驗後，熟習此項技術者通常將能夠確定並選擇適宜駱駝化取代或駱駝化取代之適宜組合，該常規實驗可涉及(例如)引入有限數量之可能駱駝化取代及確定是否獲得或改良免疫球蛋白單一可變結構域之有利性質(即與原始VH結構域相比)。然而，通常，該等駱駝化取代較佳使得所得胺基酸序列至少含有(a)於位置108處之Q；及/或(b)於位置45處之帶電荷之胺基酸或半胱胺酸殘基、且較佳另外於位置44處之E、且更佳於位置44處之E及於位置45處之R；及/或(c)於位置103處之P、R或S；且視情況一或多個其他駱駝化取代。更佳地，駱駝化取代使得其導致用於本發明之免疫球蛋白單一可變結構域及/或其類似物(如本文中所定義)，例如經人類化類似物及/或較佳如前述段落中所定義之類似物。
免疫球蛋白單一可變結構域(例如奈米抗體)亦可藉由納入自然界中罕見但仍與VH結構域摺疊結構相容之取代而自VH結構域得到。例如，但不限於，該等取代可包括以下中之一或多者：於位置35處之Gly；於位置37處之Ser、Val或Thr；於位置39處之Ser、Thr、Arg、Lys、His、Asp或Glu；於位置45處之Glu或His；於位置47處之Trp、Leu、Val、Ala、Thr或Glu；於位置50處之S或R。(Barthelemy等人J Biol Chem.2008年2月8日；283(6)：3639-54。電子出版物2007年11月28日)
本發明亦包含本發明之雙互補位多肽之衍生物。該等衍生物通常可藉由本發明雙互補位多肽及/或形成本發明雙互補位多肽之胺基酸殘基中之一或多者之修飾、且特定而言化學及/或生物(例如酶促)修飾來獲得。
該等修飾之實例、以及可以此一方式經修飾(即於蛋白質骨架上，但較佳於側鏈上)之多肽序列內之胺基酸殘基之實例、可用於引入該等修飾之方法及技術、及該等修飾之可能用途及優勢為熟習此項技術者所明瞭。
例如，此一修飾可涉及將一或多個官能團、殘基或部分引入(例如藉由共價連接或以另一適宜方式)至本發明雙互補位多肽中或其上，且特定而言引入一或多個向本發明雙互補位多肽賦予一或多個期望性質或官能性之官能團、殘基或部分。該等官能團之實例為熟習此項技術者所明瞭。
例如，該修飾可包含引入(例如藉由共價結合或以任一其他適宜方式)一或多個如下官能團：其延長本發明多肽之半衰期、提高其溶解性及/或吸收，其降低本發明多肽之免疫原性及/或毒性，其消除或減弱本發明多肽之任何不期望副作用，及/或其賦予其他有利性質及/或減少本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽之不期望性質；或前述中之兩者或更多者之任一組合。該等官能團之實例及引入其之技術為熟習此項技術者所明瞭，且通常可包含業內已知之所有官能團以及本身已知用於修飾醫藥蛋白質、且特定而言用於修飾抗體或抗體片段(包括ScFv及單一結構域抗體)之官能團及技術，對於此參見(例如)Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing公司，Easton,PA(1980)。該等官能團可(例如)直接(例如以共價方式)或視情況經由適宜連接體或間隔基因連接至本發明雙互補位多肽，如再次為熟習此項技術者所明瞭。
另一常常較不佳修飾包含N-連接或O-連接糖基化，通常作為共轉譯及/或轉譯後修飾之一部分，此取決於用於表現本發明之雙互補位奈米抗體或多肽之宿主細胞。
又一修飾可包含引入一或多個可檢測標記或其他生成信號之基團或部分，此取決於經標記多肽或奈米抗體之預期用途。適宜標記及附接、使用及檢測其之技術為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如，但不限於)螢光標記、磷光標記、化學發光標記、生物發光標記、放射性同位素、金屬、金屬螯合物、金屬陽離子、發色團及酶，例如WO 08/020079之第109頁所提及之彼等。其他適宜標記為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如)可使用NMR或ESR光譜法檢測之部分。
本發明之該等經標記雙互補位奈米抗體及多肽可用於(例如)活體外、活體內或原位分析(包括本身已知之免疫分析，例如ELISA、RIA、EIA及其他「夾心式分析」等)以及活體內診斷及成像目的，此取決於具體標記之選擇。
如熟習此項技術者所明瞭，另一修飾可涉及引入螯合基團，以(例如)螯合上文所提及之金屬或金屬陽離子中之一者。適宜螯合基團包括(例如，但不限於)二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
又一修飾可包含引入為特異性結合對(例如生物素-(鏈黴)抗生物素蛋白結合對)之一部分之官能團。此一官能團可用於將本發明之雙互補位多肽或奈米抗體連接至結合至結合對之另一半之另一蛋白質、多肽或化學化合物，即藉助形成結合對。例如，本發明之雙互補位奈米抗體可與生物素偶聯，並連接至與抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白偶聯之另一蛋白質、多肽、化合物或載劑。例如，此一經偶聯雙互補位奈米抗體可用作(例如)可檢測信號產生劑係與抗生物素蛋白或鏈 黴抗生物素蛋白偶聯之診斷系統中之報告基因。該等結合對亦可用於(例如)將本發明之雙互補位奈米抗體結合至載劑(包括適宜於醫藥目的之載劑)。一非限制性實例為Cao及Suresh,Journal of Drug Targetting,8,4,257(2000)所闡述之脂質體調配物。該等結合對亦可用於將治療活性劑連接至本發明奈米抗體。
對於一些應用、特定而言對於意欲殺死表現本發明雙互補位多肽或免疫球蛋白單一可變結構域所針對(例如在癌症治療中)之CXCR2標靶之細胞或降低或減緩此一細胞之生長及/或增殖之彼等應用，本發明雙互補位多肽亦可連接至毒素或毒性殘基或部分。可連接至本發明雙互補位多肽以提供(例如)細胞毒性化合物之毒性部分、化合物或殘基之實例為熟習此項技術者所明瞭，且可參見(例如)上文所引用之先前技術及/或本文中之其他闡述。一實例為WO 03/055527中所闡述之所謂ADEPTTM技術。
其他可能化學及酶促修飾為熟習此項技術者所明瞭。亦可引入該等修飾用於研究目的(例如以研究功能-活性關係)。例如，參見Lundblad及Bradshaw,Biotechnol.Appl.Biochem.,26,143-151(1997)。
較佳地，該等衍生物較佳使得其以如本文中針對本發明雙互補位奈米抗體所定義之親和力(以適宜方式量測及/或表達為KD值(實際或表觀)、KA值(實際或表觀)、kon速率及/或koff速率，或另一選擇為IC50值，如本文所進一步闡述)結合至CXCR2。
如上文所提及，本發明亦係關於基本上由至少一個本發明雙互補位多肽組成或包含其之蛋白質或多肽。「基本上由組成」意指本發明多肽之胺基酸序列與本發明雙互補位多肽之胺基酸序列完全相同或與本發明之具有有限數量之胺基酸殘基、例如1個至20個胺基酸殘基、例如1個至10個胺基酸殘基且較佳1個至6個胺基酸殘基、例如1 個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸殘基之此一多肽之胺基酸序列相對應，該等胺基酸殘基係於雙互補位多肽之胺基酸序列之胺基末端處、於其羧基末端處或於其胺基末端及羧基末端二者處添加。
該等胺基酸殘基可或可不改變、更改或以其他方式影響多肽之(生物)性質，且可或可不向其添加其他功能。例如，該等胺基酸殘基：
- 由於(例如)在異源宿主細胞或宿主生物中之表現，可包含N端Met殘基。
- 可形成指導雙互補位多肽在合成後自宿主細胞分泌之信號序列或前導序列。適宜分泌前導肽為熟習此項技術者所明瞭，且可如本文所進一步闡述。常常，此一前導序列將連接至雙互補位多肽之N端；
- 可形成允許雙互補位多肽引導至及/或穿透或進入具體器官、組織、細胞或部分或細胞隔室中及/或允許雙互補位多肽穿透或跨越生物障壁(例如細胞膜、諸如上皮細胞層等細胞層、包括實體瘤之腫瘤或血腦障壁)之序列或信號。該等胺基酸序列之實例為熟習此項技術者所明瞭，且包括WO 08/020079之第112頁段落c)中所提及之彼等。
- 可形成「標籤」，例如允許或促進使用(例如)針對該序列或殘基之親和力技術純化雙互補位奈米抗體之胺基酸序列或殘基。其後，該序列或殘基可經移除(例如藉由化學或酶促裂解)，以提供雙互補位多肽序列(出於此目的，該標籤視情況可經由可裂解連接體序列連接至雙互補位多肽序列或含有可裂解模體)。該等殘基之一些較佳但非限制性實例為多個組胺酸殘基、麩胱甘肽殘基及myc標籤(例如參見WO 06/12282之SEQ ID NO：31)。
- 可為一或多個已經官能化及/或可充當官能團之附接位點之胺 基酸殘基。適宜胺基酸殘基及官能團為熟習此項技術者所明瞭，且包括(但不限於)本文中針對本發明雙互補位多肽或奈米抗體之衍生物所提及之胺基酸殘基及官能團。
根據另一態樣，本發明之雙互補位多肽包含本發明之雙互補位奈米抗體，其於其胺基末端處、於其羧基末端處或於其胺基末端處及於其羧基末端處二者與至少一個其他肽或多肽融合，即以提供包含該本發明雙互補位奈米抗體及一或多個其他肽或多肽之融合蛋白。此一融合在本文中已將稱為「奈米抗體融合」。
較佳地，該其他肽或多肽使得其向本發明之雙互補位奈米抗體或多肽賦予一或多個期望性質或官能性。
例如，該其他肽或多肽亦可提供另一結合位點，該結合位點可針對任一期望蛋白質、多肽、抗原、抗原決定簇或表位(包括(但不限於)本發明雙互補位多肽所針對之相同蛋白質、多肽、抗原、抗原決定簇或表位或不同蛋白質、多肽、抗原、抗原決定簇或表位)。
該等肽或多肽之實例為熟習此項技術者所明瞭，且通常可包含基於習用抗體及其片段(包括(但不限於)ScFv及單一結構域抗體)用於肽融合之所有胺基酸序列。例如，參見Holliger及Hudson,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005)之綜述。
例如，此一肽或多肽可為與本發明多肽本身相比延長半衰期、提高溶解性或吸收、降低免疫原性或毒性、消除或減弱不期望副作用及/或向本發明多肽賦予其他有利性質及/或減少其不期望性質之胺基酸序列。該等肽及多肽之一些非限制性實例為血清蛋白質，例如人類血清白蛋白(例如參見WO 00/27435)或不完全抗原分子(例如由循環抗體識別之不完全抗原，例如參見WO 98/22141)。
特定而言，業內已闡述，將免疫球蛋白之片段(例如VH結構域)連接至血清白蛋白或其片段可用於延長半衰期。參見WO 00/27435及 WO 01/077137。根據本發明，雙互補位多肽、較佳本發明之雙互補位奈米抗體較佳直接或經由適宜連接體、且特定而言經由所連接之適宜肽連接至血清白蛋白(或其適宜片段)，以使得本發明多肽可表現為遺傳融合(蛋白質)。根據一具體態樣，本發明之雙互補位奈米抗體可連接至至少包含血清白蛋白之結構域III或其部分之血清白蛋白片段。例如，參見Ablynx N.V.之WO 07/112940。
另一選擇為，如本文中已論述，該其他肽或多肽可提供針對血清蛋白質(例如，人類血清白蛋白或另一血清蛋白質，例如IgG)之另一結合位點或結合單元，以提供在血清中之延長之半衰期。該等胺基酸序列包括(例如)下文所闡述之奈米抗體以及WO 91/01743、WO 01/45746及WO 02/076489中所闡述之小肽及結合蛋白質及WO 03/002609及WO 04/003019中所闡述之dAb。亦參見Harmsen等人，Vaccine,23(41)；4926-42,2005以及EP 0 368 684以及Ablynx N.V.之WO 08/028977、WO 08/043821、WO 08/043822及Ablynx N.V.於2006年12月5日申請之標題為「Peptides capable of binding to serum proteins」之美國臨時申請案(亦參見PCT/EP2007/063348)。
特定而言，該等肽或多肽可針對血清白蛋白(且更特定而言人類血清白蛋白)及/或針對IgG(且更特定而言人類IgG)。例如，該等胺基酸序列可為針對(人類)血清白蛋白之胺基酸序列，及可結合至(人類)血清白蛋白上在血清白蛋白結合至FcRn中未涉及之胺基酸殘基的胺基酸序列(例如參見WO 06/0122787)，及/或能夠結合至血清白蛋白上不形成血清白蛋白之結構域III之一部分之胺基酸殘基的胺基酸序列(例如再次參見WO 06/0122787)；具有或可提供延長之半衰期之胺基酸序列(例如參見Ablynx N.V.之WO 08/028977)；與來自至少一個哺乳動物物種、且特定而言至少一個靈長類物種(例如但不限於來自獼猴屬之猴(例如且特定而言，食蟹猴(Macaca fascicularis)及/或恒河猴 (Macaca mulatta))及狒狒(豚尾狒狒))之血清白蛋白具有交叉反應性且針對人類血清白蛋白之胺基酸序列，再次參見WO 08/028977；可以pH獨立方式結合至血清白蛋白之胺基酸序列(例如參見Ablynx N.V.之標題為「Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH,compounds comprising the same,and uses thereof」之WO 08/043821)，及/或為條件結合劑之胺基酸序列(例如參見Ablynx N.V.之標題為「Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner」之WO 08/043822)。
根據另一態樣，該一或多個其他肽、多肽或蛋白質序列可包含習用4鏈抗體(且特定而言人類抗體)及/或重鏈抗體之一或多個部分、片段或結構域。例如，儘管常常較不佳，但本發明之雙互補位奈米抗體可再次視情況經由連接體序列(包括(但不限於)其他(單一)結構域抗體，例如Ward等人所闡述之dAb)連接至習用(較佳人類)VH或VL結構域或連接至VH或VL結構域之天然或合成類似物。
雙互補位多肽或奈米抗體亦可視情況經由連接體序列連接至一或多個(較佳人類)CH1、CH2及/或CH3結構域。例如，連接至適宜CH1結構域之雙互補位奈米抗體可(例如)用於(與適宜輕鏈一起)生成與習用Fab片段或F(ab’)2片段類似之抗體片段/結構，但其中習用VH結構域中之一者或(在F(ab’)2片段情形下)一或兩者已經本發明雙互補位奈米抗體替代。而且，兩個雙互補位多肽可連接至CH3結構域(視情況經由連接體)，以提供具有延長之活體內半衰期之構築體。
根據本發明多肽之一具體態樣，一或多個本發明雙互補位多肽或奈米抗體可連接(視情況經由適宜連接體或鉸鏈區域)至一或多個恆定結構域(例如，2個或3個可用作Fc部分之一部分/用以形成其之恆定結構域)、連接至Fc部分及/或連接至一或多個賦予本發明多肽一或多 個效應子功能及/或可賦予結合至一或多個Fc受體之能力的抗體部分、片段或結構域。例如，出於此目的，且並不限於此，該一或多個其他肽或多肽可包含抗體、例如來自重鏈抗體(如本文中所闡述)且更佳來自習用人類4鏈抗體之一或多個CH2及/或CH3結構域；及/或可形成(之一部分)及來自(例如)IgG(例如來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、來自IgE或來自另一人類Ig(例如IgA、IgD或IgM)之Fc區域。例如，WO 94/04678闡述包含駱駝科VHH結構域或其經人類化衍生物(即奈米抗體)之重鏈抗體，其中駱駝科CH2及/或CH3結構域已經人類CH2及CH3結構域替代，以提供由2個重鏈組成之免疫球蛋白，每一重鏈包含奈米抗體及人類CH2及CH3結構域(但無CH1結構域)，該免疫球蛋白具有CH2及CH3結構域所提供之效應子功能，且該免疫球蛋白可在不存在任何輕鏈之情況下起作用。可以適宜方式連接至本發明奈米抗體以提供效應子功能之其他胺基酸序列為熟習此項技術者所明瞭，且可基於期望效應子功能來選擇。例如，參見WO 04/058820、WO 99/42077、WO 02/056910及WO 05/017148以及Holliger及Hudson(參見上文)之綜述。與本發明之相應多肽相比，多肽、例如本發明奈米抗體與Fc部分之偶合亦可導致半衰期延長。對於一些應用，賦予延長之半衰期且無任何生物上顯著之效應子功能之Fc部分及/或恆定結構域(即CH2及/或CH3結構域)之使用亦可為適宜的或甚至較佳。包含一或多個雙互補位多肽(例如奈米抗體)及一或多個恆定結構域且具有延長之活體內半衰期之其他適宜構築體為熟習此項技術者所明瞭，且可包含(例如)兩個視情況經由連接體序列連接至CH3結構域之奈米抗體。通常，具有延長之半衰期之任何融合蛋白或衍生物將較佳具有超過50kD(即腎吸收之截止值)之分子量。
在另一具體但非限制性態樣中，為形成本發明多肽，一或多個本發明胺基酸序列可連接(視情況經由適宜連接體或鉸鏈區域)至具有 減小(或基本上無)之自結合成二聚體之趨勢(即與習用4鏈抗體中天然存在之恆定結構域相比)的天然存在、合成或半合成恆定結構域(或其類似物、變體、突變體、部分或片段)。該等單體(即並非自結合)Fc鏈變體或其片段為熟習此項技術者所明瞭。例如，Helm等人，J Biol Chem 1996 271 7494闡述可用於本發明多肽鏈之單體Fc鏈變體。
而且，該等單體Fc鏈變體較佳使得其仍能夠結合至補體或相關Fc受體(取決於衍生其之Fc部分)及/或使得其仍具有衍生出其之Fc部分之一些或所有效應子功能(或以降低之位準仍適宜於預期用途)。另一選擇為，在此一多本發明肽鏈中，單體Fc鏈可用於賦予多肽鏈延長之半衰期，在該情形下單體Fc鏈亦可不具有或基本上不具有效應子功能。
該等其他肽或多肽亦可形成信號序列或前導序列，其指導本發明之雙互補位奈米抗體或多肽在合成後自宿主細胞分泌(例如以提供本發明多肽之前形式、原形式或前原形式，此取決於用於表現本發明多肽之宿主細胞)。
該其他肽或多肽亦可形成允許本發明之雙互補位奈米抗體或多肽引導至及/或穿透或進入具體器官、組織、細胞或部分或細胞隔室中及/或允許本發明之雙互補位奈米抗體或多肽穿透或跨越生物障壁(例如細胞膜、諸如上皮細胞層等細胞層、包括實體瘤之腫瘤或血腦障壁)之序列或信號。該等胺基酸序列之適宜實例為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如，但不限於)WO 08/020079之第118頁所提及之彼等。對於一些應用、特定而言對於意欲殺死表現本發明雙互補位多肽所針對(例如在癌症治療中)之標靶之細胞或降低或減緩此一細胞之生長及/或增殖之彼等應用，本發明之雙互補位多肽亦可連接至(細胞)毒性蛋白質或多肽。可連接至本發明奈米抗體以提供(例如)本發明之細胞毒性多肽之該等毒性蛋白質及多肽的實例為熟習此項技術者所明 瞭，且可參見(例如)上文所引用之先前技術及/或本文中之其他闡述。一實例為WO 03/055527中所闡述之所謂ADEPTTM技術。
根據一可選但非限制性態樣，該一或多個其他肽或多肽包含至少一個其他奈米抗體，以提供包含本發明之至少三個、例如四個、五個或更多個奈米抗體之多肽，其中該等奈米抗體可視情況經由一或多個連接體序列(如本文中所定義)連接。
最後，亦屬於本發明之範圍內的是本發明雙互補位多肽可含有兩個或更多個奈米抗體及一或多個其他肽或多肽(如本文中所提及)。
對於含有兩個或更多個VHH結構域之多價且多特異性多肽及其製備，亦參見Conrath等人，J.Biol.Chem.，第276卷，10.7346-7350,2001；Muyldermans,Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001),277-302；以及(例如)WO 96/34103及WO 99/23221。一些具體的本發明多特異性及/或多價多肽之一些其他實例可參見本文中所提及之Ablynx N.V.之應用。
本發明多特異性多肽之一較佳實例包含至少一個本發明雙互補位奈米抗體及至少一個提供延長之半衰期之奈米抗體。該等奈米抗體可係(例如)針對血清蛋白質、且特定而言人類血清蛋白質(例如人類血清白蛋白、甲狀腺素結合蛋白質、(人類)轉鐵蛋白、血纖維蛋白原、免疫球蛋白(例如IgG、IgE或IgM))或針對WO 04/003019中所列示之血清蛋白質中之一者的奈米抗體。其中，可結合至血清白蛋白(且特定而言人類血清白蛋白)或IgG(且特定而言人類IgG)之奈米抗體(例如參見Muyldermans(參見上文)之綜述中所闡述之奈米抗體VH-1)尤佳(但例如，對於在小鼠或靈長類中之實驗，可使用分別針對小鼠血清白蛋白(MSA)或來自該靈長類之血清白蛋白或與其具有交叉反應性之奈米抗體。然而，對於醫藥用途，針對人類血清白蛋白或人類IgG之奈米抗體常常將較佳)。提供延長之半衰期且可用於本發明多肽之奈米抗 體包括WO 04/041865、WO 06/122787及Ablynx N.V.之其他專利申請案(例如上文所提及之彼等)中所闡述之針對血清白蛋白之奈米抗體。
例如，用於本發明之提供延長之半衰期的一些較佳奈米抗體包括可結合至(人類)血清白蛋白上在血清白蛋白結合至FcRn中未涉及之胺基酸殘基之奈米抗體(例如參見WO 06/0122787)；能夠結合至血清白蛋白上不形成血清白蛋白之結構域III之一部分之胺基酸殘基的奈米抗體(例如參見WO 06/0122787)；具有或可提供延長之半衰期之奈米抗體(例如參見本文中所提及之Ablynx N.V之WO 08/028977)；與來自至少一個哺乳動物物種、且特定而言至少一個靈長類物種(例如但不限於來自補猴屬之猴(例如且特定而言，食蟹猴(Macaca fascicularis)及/或恒河猴(Macaca mulatta))及狒狒(豚尾狒狒))之血清白蛋白具有交叉反應性且針對人類血清白蛋白之奈米抗體(例如參見Ablynx N.V之WO 08/028977)；可以pH獨立方式結合至血清白蛋白之奈米抗體(例如參見本文中所提及之Ablynx N.V.之WO2008/043821)及/或為條件結合劑之奈米抗體(例如參見Ablynx N.V.之WO 08/043822)。
提供延長之半衰期且可用於本發明多肽之一些尤佳奈米抗體包括WO 06/122787中所揭示之奈米抗體ALB-1至ALB-10(參見表II及III)，其中ALB-8(WO 06/122787中之SEQ ID NO：62)尤佳。
根據本發明之具體態樣，本發明多肽除該兩個或更多個奈米抗體以外含有至少一個針對人類血清白蛋白之奈米抗體。
可添加或附接或融合至本發明雙互補位多肽之其他額外肽或多肽之包括由脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸(PAS序列)組成之聚合物。PAS序列可由200個至600個殘基構成，並導致流體動力學體積顯著增加，從而導致血漿半衰期延長。本發明雙互補位多肽之血清半衰期亦可藉由與稱為XTEN之864個胺基酸多肽融合來延長，如Schellenbrger等人，(2009),Nature Biotechnology 27，第12期，第1186頁至第1190頁 所闡述。
通常，含有一或多個本發明雙互補位奈米抗體之具有延長之半衰期之任何本發明多肽、及本發明雙互補位奈米抗體或該等多肽之具有延長之半衰期之任何衍生物的半衰期較佳為本發明之相應奈米抗體本身之半衰期之至少1.5倍、較佳至少2倍、例如至少5倍、例如至少10倍或超過20倍。例如，與本發明之相應奈米抗體本身相比，具有延長之半衰期之此一衍生物或多肽的半衰期可延長超過1小時、較佳超過2小時、更佳超過6小時、例如超過12小時或甚至超過24小時、48小時或72小時。
在本發明之較佳但非限制性態樣中，該等衍生物或多肽在人類中可呈現至少約12小時、較佳至少24小時、更佳至少48小時、甚至更佳至少72小時或更長之血清半衰期。例如，該等衍生物或多肽之半衰期可為至少5天(例如約5至10天)、較佳至少9天(例如約9至14天)、更佳至少約10天(例如約10至15天)、或至少約11天(例如約11至16天)、更佳至少約12天(例如約12至18天或更多)、或超過14天(例如約14至19天)。
本發明多特異性多肽之另一較佳但非限制性實例包含至少一本發明個雙互補位奈米抗體及至少一個如下奈米抗體：將本發明多肽引導至具體器官、組織、細胞或部分或細胞隔室及/或允許本發明多肽穿透或進入其中、及/或允許奈米抗體穿透或跨越生物障壁(例如細胞膜、諸如上皮細胞層等細胞層、包括實體瘤之腫瘤或血腦障壁)。該等奈米抗體之實例包括導向期望器官、組織或細胞之具體細胞表面蛋白質、標記或表位(例如與腫瘤細胞結合之細胞表面標記)之奈米抗體及WO 02/057445及WO 06/040153中所闡述之單一結構域腦靶向抗體片段，其中FC44(WO 06/040153之SEQ ID NO：189)及FC5(WO 06/040154之SEQ ID NO：190)為較佳實例。
在本發明多肽中，兩個或更多個奈米抗體及一或多個多肽可直接彼此連接(如例如WO 99/23221中所闡述)及/或可經由一或多個適宜間隔基因或連接體或其任一組合彼此連接。
根據本發明之一態樣，本發明多肽係呈基本上分離形式，如本文中所定義。
本發明之胺基酸序列、雙互補位奈米抗體、多肽及核酸可以本身已知之方式來製備，如熟習此項技術者根據本文中之其他闡述所明瞭。例如，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽可以本身已知用於製備抗體且特定而言用於製備抗體片段(包括(但不限於)(單一)結構域抗體及ScFv片段)之方式來製備。一些用於製備胺基酸序列、奈米抗體、多肽及核酸之較佳但非限制性方法包括本文中所闡述之方法及技術。
如熟習此項技術者所明瞭，一用於製備本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽之尤其有用方法通常包含以下步驟：i)在適宜宿主細胞或宿主生物(在本文中亦稱為「本發明宿主」)中或在編碼該本發明雙互補位奈米抗體或多肽之核酸(在本文中亦稱為「本發明核酸」)之另一適宜表現系統中表現，視情況接著：ii)分離及/或純化本發明之由此獲得之該雙互補位奈米抗體或多肽。
特定而言，此一方法可包含以下步驟：i)在使得本發明宿主表現及/或產生至少一個本發明雙互補位奈米抗體及/或多肽之條件下培養及/或維持該本發明宿主，視情況接著：ii)分離及/或純化由此獲得之本發明雙互補位奈米抗體或多肽。
在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明多肽(或其適宜片段)之核酸分子。此一核酸在本文中亦將稱為「本發明核酸」，且可(例如)呈遺傳構築體之形式，如本文所進一步闡述。
在較佳實施例中，本發明提供編碼選自關於表9及32之具體個別奈米抗體之SEQ ID No.25至43、90及SEQ ID No.213至219所示之胺基酸序列之群之胺基酸序列之核酸分子。另一選擇為，本發明核酸分子包含編碼SEQ ID No.44至69之多價且雙互補位奈米抗體構築體之核酸分子。此外，本發明核酸分子包含具有與表18中所鑑別之奈米抗體相關之SEQ ID No.192至211之核酸序列的分子。
本發明核酸可呈單鏈或雙鏈DNA或RNA之形式，且較佳呈雙鏈DNA之形式。例如，本發明核苷酸序列可係基因組DNA、cDNA或合成DNA(例如特別適於在預期宿主細胞或宿主生物中表現之使用密碼子之DNA)。
根據本發明之一態樣，本發明核酸係呈基本上分離形式，如本文中所定義。
本發明核酸亦可呈載體(質粒、黏粒或YAC)之形式、存在於其中及/或為其一部分，該載體可再次呈基本上分離形式。
本發明核酸可以本身已知之方式並基於本文中所給關於本發明多肽之胺基酸序列之資訊來製備或獲得，及/或可自適宜天然來源分離。為提供類似物，編碼天然存在之VHH結構域之核苷酸序列可(例如)經受定點誘變，以提供本發明之編碼該類似物之核酸。而且，如熟習此項技術者所明瞭，為製備本發明核酸，若干核苷酸序列、例如至少一個編碼本發明多肽之核苷酸序列及(例如)編碼一或多個連接體之核酸亦可以適宜方式連接在一起。
生成本發明核酸之技術為熟習此項技術者所明瞭，且可包括(例如，但不限於)自動化DNA合成；定點誘變；組合兩個或更多個天然存在及/或合成序列(或其兩個或更多個部分)；引入導致截短表現產物之表現之突變；引入一或多個限制位點(例如以產生可使用適宜限制酶容易地消化及/或接合之卡匣及/或區域)；及/或藉助使用一或多種 「失配」引物並使用(例如)CXCR2之天然存在形式之序列作為模板之PCR反應引入突變。該等及其他技術為熟習此項技術者所明瞭，且再次參見標準手冊(例如本文所提及之Sambrook等人及Ausubel等人)及下文之實例。
本發明核酸亦可呈遺傳構築體之形式、存在於其中及/或為其一部分。該等遺傳構築體通常包含至少一個本發明核酸，其視情況連接至遺傳構築體中一或多個本身已知之元件、例如一或多個適宜調控元件(例如適宜啟動子、增強子、終止子等)及本文中所提及之遺傳構築體之其他元件。包含至少一個本發明核酸之該等遺傳構築體在本文中亦將稱為「本發明遺傳構築體」。
本發明遺傳構築體亦可係DNA或RNA，且較佳係雙鏈DNA。本發明遺傳構築體亦可呈適於轉化預期宿主細胞或宿主生物之形式、呈適於預期宿主細胞整合至基因組DNA中之形式或呈適於預期宿主生物之獨立複製、維持及/或遺傳之形式。例如，本發明遺傳構築體可呈載體(例如質粒、黏粒、YAC、病毒載體或轉座子)之形式。特定而言，該載體可係表現載體，即可提供活體外及/或活體內表現(例如在適宜宿主細胞、宿主生物及/或表現系統中)之載體。
在較佳但非限制性態樣中，本發明遺傳構築體包含：i)至少一個本發明核酸；可操作地結合至ii)一或多個調控元件，例如啟動子及視情況適宜終止子；且視情況亦iii)遺傳構築體中一或多個本身已知之其他元件；其中術語「可操作地結合」及「可操作地連接」具有WO 08/020079之第131頁至第134頁所給含義；且其中「調控元件」、「啟動子」、「終止子」及「其他元件」係如WO 08/020079之第131頁至第134頁所闡述；且其中該等遺傳構築體可進一步如WO 08/020079之第 131頁至第134頁所闡述。
本發明核酸及/或本發明遺傳構築體可用於轉化宿主細胞或宿主生物，即用於表現及/或產生本發明之雙互補位奈米抗體或多肽。適宜宿主或宿主細胞為熟習此項技術者所明瞭，且可為(例如)任一適宜真菌、原核或真核細胞或細胞系或任一適宜真菌、原核或真核生物，例如WO 08/020079之第134頁及第135頁所闡述之彼等；以及本身已知用於表現及產生抗體及抗體片段(包括(但不限於)(單一)結構域抗體及ScFv片段)之所有其他宿主或宿主細胞，其為熟習此項技術者所明瞭。亦參見上文所引用之一般背景技術以及(例如)WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(1998)，參見上文；Riechmann及Muyldermans(1999)，參見上文；van der Linden(2000)，參見上文；Thomassen等人(2002)，參見上文；Joosten等人(2003)，參見上文；Joosten等人(2005)，參見上文；及本文中所引用之其他參考文獻。
本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可引入多細胞生物之一或多種細胞、組織或器官中並於其中表現，例如用於預防及/或治療目的(例如作為基因治療)，如WO 08/020079之第135頁及第136頁及WO 08/020079中所引用之其他參考文獻所闡述。
對於奈米抗體於細胞中之表現，其亦可以所謂「細胞內抗體」形式表現，如例如WO 94/02610、WO 95/22618及US-A-7004940；WO 03/014960；Cattaneo,A.及Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications.Landes and Springer-Verlag；及Kontermann,Methods 34,(2004),163-170中所闡述。
本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可(例如)於轉基因哺乳動物之乳中、例如於兔、牛、山羊或綿羊之乳中(對於將轉基因引入哺乳動物中之一般技術，參見(例如)US-A-6,741,957、US-A-6,304,489及 US-A-6,849,992)、於植物或包括(但不限於)其葉、花、果實、種子、根或塊莖之植物部分中(例如於煙草、玉米、大豆或苜蓿草中)或於(例如)蠶中國種家蠶(Bombix mori)之蛹中產生。
此外，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽亦可於無細胞表現系統中表現及/或產生，且該等系統之適宜實例為熟習此項技術者所明瞭。一些較佳但非限制性實例包括於小麥胚芽系統中；於兔網狀紅血球溶解產物中；或於大腸桿菌Zubay系統中之表現。
如上文所提及，使用雙互補位多肽及奈米抗體之一優勢在於基於其之多肽可藉助於適宜細菌系統中之表現製備，且根據(例如)上文所引用之參考文獻，熟習此項技術者將明瞭適宜細菌表現系統、載體、宿主細胞、調控元件等。然而，應注意，本發明在其最廣泛意義上並不限於於細菌系統中之表現。
較佳地，在本發明中，使用提供本發明之呈適於醫藥用途之形式之多肽之(活體內或活體外)表現系統、例如細菌表現系統，且該等表現系統再次為熟習此項技術者所明瞭。如亦為熟習此項技術者所明瞭，本發明之適於醫藥用途之多肽可使用用於肽合成之技術製備。
對工業規模之生產，用於(工業)生產含有雙互補位奈米抗體或奈米抗體之蛋白治療劑之較佳異源宿主包括適於大規模表現/生產/發酵、且特定而言適於大規模醫藥(即GMP級)表現/生產/發酵之大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒酵母(S.cerevisiae)菌株。該等菌株之適宜實例為熟習此項技術者所明瞭。該等菌株及生產/表現系統亦可由諸如Biovitrum(Uppsala,Sweden)等公司提供。
另一選擇為，哺乳動物細胞系、特定而言中國倉鼠卵巢(CHO)細胞可用於大規模表現/生產/發酵、且特定而言用於大規模醫藥表現/生產/發酵。再次，該等表現/產生系統亦可由上文所提及之一些公司提供。
具體表現系統之選擇將部分地取決於某些轉譯後修飾、更具體而言糖基化之要求。期望或需要糖基化之含有奈米抗體之重組蛋白質之產生將必須使用具有使所表現蛋白質糖基化之能力的哺乳動物表現宿主。在此態樣中，熟習此項技術者將明瞭，所獲得之糖基化模式(即所附接殘基之種類、數量及位置)將取決於用於表現之細胞或細胞系。較佳地，使用人類細胞或細胞系(即導致基本上具有人類糖基化模式之蛋白質)，或使用可提供與人類糖基化基本上及/或功能上相同或至少模擬人類糖基化之糖基化模式之另一哺乳動物細胞系。通常，諸如大腸桿菌等原核宿主不具有使蛋白質糖基化之能力，且諸如酵母等低等真核生物之使用常常導致與人類糖基化不同之糖基化模式。然而，應理解，所有前述宿主細胞及表現系統可用於本發明，此取決於欲獲得之期望雙互補位奈米抗體或多肽。
因此，根據本發明之一態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係經糖基化。根據本發明之另一非限制性態樣，本發明之胺基酸序列、奈米抗體或多肽係未經糖基化。
根據本發明之一較佳但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係於細菌細胞、特定而言適於大規模醫藥生產之細菌細胞、例如上文所提及菌株之細胞中產生。
根據本發明之另一較佳但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係於酵母細胞、特定而言適於大規模醫藥生成之酵母細胞、例如上文所提及物種之細胞中產生。
根據本發明之又一較佳但非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係於哺乳動物細胞、特定而言人類細胞或人類細胞系之細胞、且更特定而言人類細胞或適於大規模醫藥生產之人類細胞系之細胞、例如上文所提及之細胞系中產生。
如WO 08/020079之第138頁及第139頁所進一步闡述，當使用於 宿主細胞中之表現產生本發明之雙互補位奈米抗體及多肽時，該等係於細胞內(例如於細胞溶質中、於胞外質中或於包涵體中)產生，且然後自宿主細胞分離，且視情況進步一純化；或可細胞外(例如於培養宿主細胞之培養基中)產生，且然後自培養基分離，且視情況進一步純化。因此，根據本發明之一非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係已於細胞內產生且已自宿主細胞、且特定而言細菌細胞或細菌細胞中之包涵體分離之胺基酸序列、奈米抗體或多肽。根據本發明之另一非限制性態樣，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽係已於細胞外產生且已自培養宿主細胞之培養基分離之奈米抗體或多肽。
用於該等宿主細胞之一些較佳但非限制性啟動子包括WO 08/020079之第139頁及第140頁所提及之彼等。
用於該等宿主細胞之一些較佳但非限制性分泌序列包括係WO 08/020079之第140頁所提及之彼等。
用於轉化本發明之宿主或宿主細胞之適宜技術為熟習此項技術者所明瞭，且可取決於預期宿主細胞/宿主生物及欲使用之遺傳構築體。再次參見上文所提及之手冊及專利申請案。
轉化後，可實施檢測及選擇已利用本發明之核苷酸序列/遺傳構築體成功轉化之彼等宿主細胞或宿主生物的步驟。此可係(例如)基於本發明遺傳構築體中所存在之可選擇標記之選擇步驟或涉及使用(例如)特異性抗體檢測本發明多肽之步驟。
經轉化之宿主細胞(其可呈穩定細胞系之形式)或宿主生物(且可呈穩定突變體系或菌株之形式)形成本發明之其他態樣。
較佳地，該等宿主細胞或宿主生物使得其表現或(至少)能夠表現(例如在適宜條件下)本發明之雙互補位奈米抗體或多肽(且在宿主生物之情形下：在其至少一個細胞、部分、組織或器官中)。本發明亦包括本發明之可(例如)藉由細胞分離或有性或無性生殖來獲得之宿主細 胞或宿主生物之其他世代、子代及/或後裔。
為產生/獲得本發明胺基酸序列之表現，轉化宿主細胞或轉化宿主生物通常可保持、維持於使得表現/產生本發明之(期望)雙互補位奈米抗體或多肽之條件下及/或於該條件下培養。適宜條件為熟習此項技術者所明瞭，且常常將取決於所用之宿主細胞/宿主生物、以及控制本發明(相關)核苷酸序列之表現之調控元件。再次，參見上文在關於本發明遺傳構築體之段落中所提及之手冊及專利申請案。
通常，適宜條件可包括適宜培養基之使用、適宜食物來源及/或適宜營養素之存在、適宜溫度之使用及視情況適宜誘導因子或化合物之存在(例如當本發明核苷酸序列係在誘導型啟動子之控制下時)；其所有均可由熟習此項技術者選擇。再次，在該等條件下，本發明多肽可以組成方式、以瞬時方式或僅當以適宜方式誘導時表現。
熟習此項技術者亦將明瞭，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽可(首先)以未成熟形式生成(如上文所提及)，然後可經受轉譯後修飾，此取決於所用之宿主細胞/宿主生物。而且，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽可經糖基化，此再次取決於所用之宿主細胞/宿主生物。
然後，本發明之雙互補位奈米抗體或多肽可使用本身已知之蛋白質分離及/或純化技術、例如(製備型)層析法及/或電泳技術、微差沈澱技術、親和力技術(例如使用與本發明之胺基酸序列、奈米抗體或多肽融合之特異性可裂解胺基酸序列)及/或製備型免疫技術(即使用針對欲分離之胺基酸序列之抗體)自宿主細胞/宿主生物及/或培養該宿主細胞或宿主生物之培養基分離。
通常，對於醫藥用途，本發明多肽可調配成包含至少一種本發明多肽及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑及視情況一或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物之醫藥製劑或組合 物。藉助非限制性實例，此一調配物可呈適於經口投與、適於非經腸投與(例如藉由靜脈內、肌內或皮下注射或靜脈內輸注)、適於局部投與、適於藉由吸入投與(例如，經由霧化器、經計量劑量吸入器(MDI)或乾粉末吸入器(DPI)或經由經鼻途徑)、藉由皮膚貼片、藉由植入物、藉由栓劑、藉由舌下途徑等之形式。該等適宜投與形式(其可為固體、半固體或液體，此取決於投與方式)以及用於其製備之方法及載劑為熟習此項技術者所明瞭，且在本文中進一步闡述。
因此，在再一態樣中，本發明係關於含有以下之醫藥組合物：至少一種本發明雙互補位多肽、較佳至少一種雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域且更佳至少一種本發明之雙互補位奈米抗體，及至少一種適宜載劑、稀釋劑或賦形劑(即適於醫藥用途)，及視情況一或多種其他活性物質。
通常，本發明雙互補位多肽可經調配並以任一本身已知之適宜方式投與，對於此參見(例如)上文所引用之一般背景技術(且特定而言參見WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867及WO 08/020079)以及標準手冊，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel編輯),Wiley,Weinheim,2007(例如參見第252頁至第255頁)。
例如，本發明之雙互補位多肽可經調配並可以本身已知用於習用抗體及抗體片段(包括ScFv及雙鏈抗體)及其他醫藥活性蛋白質之方式投與。用於製備其之該等調配物及方法為熟習此項技術者所明瞭，且包括(例如)適於非經腸投與(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、血管腔內、動脈內或鞘內投與)或適於局部(即經皮或真皮內)投與之製劑。
用於非經腸投與之製劑可係(例如)適於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液或乳液。用於該等製劑之適宜載劑或稀釋劑包括(例如，但不限於)WO 08/020079之第143頁所提及之彼等。常常，水溶液或懸浮液將較佳。
本發明之包括雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域及奈米抗體之雙互補位多肽亦可使用基因療法遞送方法投與。例如參見美國專利第5,399,346號，其以引用的方式全文併入本文中。使用遞送之基因療法，用編碼本發明雙互補位或多肽之基因轉染之原代細胞另外可用組織特異性啟動子轉染以靶向具體器官、組織、移植物、腫瘤或細胞，且另外可用信號及穩定序列轉染用於亞細胞定位表現。
因此，本發明之雙互補位多肽、免疫球蛋白單一可變結構域及奈米抗體可與醫藥上可接受之媒劑(例如惰性稀釋劑或可同化之可食用載劑)組合全身投與(例如經口)。其可包封於硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓製成錠劑，或可與患者飲食之食物直接合併。為經口治療投與，本發明之雙互補位多肽可與一或多種賦形劑組合，並以可攝取錠劑、口頰錠、片劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、薄片及諸如此類之形式使用。該等組合物及製劑應含有至少0.1%之本發明之雙互補位多肽、免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體。當然，其在該等組合物及製劑中之百分比可有所變化，且可方便地介於所給單位劑量形式之約2%至約60%之間。該等治療上有用之組合物中之本發明雙互補位多肽使得將獲得有效劑量量。
錠劑、片劑、丸劑、膠囊及諸如此類亦可含有結合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及甜味劑或矯味劑，例如WO 08/020079之第143頁至第144頁所提及之彼等。當單位劑量形式為膠囊時，除以上類型之材料以外，其可含有液體載劑，例如植物油或聚乙二醇。各種其他材料可作為包衣存在或以其他方式改進固體單位劑量形式之物理形 式。例如，錠劑、丸劑或膠囊可用明膠、蠟、蟲膠或糖及諸如此類包衣。糖漿或酏劑可含有本發明之雙互補位奈米抗體及多肽、蔗糖或果糖(作為甜味劑)、對羥基苯甲酸甲酯(作為防腐劑)、染料及矯味劑(例如，櫻桃味或橙味)。當然，在製備任一單位劑量形式中所用之任一材料應為醫藥上可接受的，且所採用之量應實質上無毒。另外，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽可納入持續釋放製劑及裝置中。
用於經口投與之製劑及調配物亦可提供有將允許構本發明築體抵抗胃環境並進入腸中之腸溶包衣。更一般而言，用於經口投與之製劑及調配物可以適宜方式經調配用於遞送至胃腸道之任一期望部分中。另外，適宜栓劑可用於遞送至胃腸道中。
本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽亦可藉由輸注或注射靜脈內或腹膜內投與，如WO 08/020079之第144頁及第145頁所進一步闡述。
對於局部投與，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽可以純形式施加，即當其為液體時。然而，通常將期望，將其以組合物或調配物形式與皮膚病學可接受之載劑組合投與至皮膚，該載劑可為固體或液體，如WO 08/020079之第145頁所進一步闡述。
通常，液體組合物(例如洗劑)中之本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽之濃度將為約0.1wt-%至25wt-%、較佳約0.5wt-%至10wt-%。於半固體或固體組合物(例如凝膠或粉末)中之濃度將為約0.1wt-%至5wt-%、較佳約0.5wt-%至2.5wt-%。
本發明之用於治療所需要之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽之量不僅將隨所選擇之特定雙互補位奈米抗體或 多肽變化而且隨投與途徑、所治療病狀之性質及患者之年齡及狀況變化，且將最終由巡診內科醫師或臨床醫師自行決定。而且，本發明之雙互補位奈米抗體及多肽之劑量視標靶細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。
期望劑量可方便地以單一劑量呈遞或以分開劑量以適當間隔投與，例如每天兩次、三次、四次或更多次分劑量。分劑量本身可進一步分成(例如)許多次離散的鬆散間隔投與；例如自吹入器多次吸入或藉由將複數滴滴劑施加至眼中。
投與方案可包括長期日治療。「長期」意指至少兩週、且較佳數週、月或年之持續時間。考慮到本文中之教示，此劑量範圍之必需修改可僅使用常規實驗即可由熟習此項技術者確定。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.編輯),Mack Publishing公司，Easton,PA。該劑量在任一併發症之情況下亦可由個別內科醫師調整。
在其態樣中之另一者中，本發明係關於藉由投與有效量之本發明多肽或醫藥組合物且較佳本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體或含有其之組合物來治療涉及CXCR2信號轉導功能異常之疾病或病狀的方法。如本文中所論述，CXCR2信號轉導介導患有導致肺薄壁組織破壞之慢性阻塞性肺病(COPD)之患者之肺中之炎症反應。患有COPD之患者之肺中以升高之量所見之白細胞之遷移係由該等細胞之表面上之結合包括IL-8、Gro-α、β、γ、EMA 78及GCP-2之若干配體之CXCR2來介導。肺中增加數量之嗜中性球與疾病嚴重性相關。此外，Gro-α濃度在COPD患者之誘導痰及枝氣管灌洗(BAL)流體中顯著升高。因此，預期CXCR2拮抗作用預防、治療或減輕此疾病之痛苦症狀。
因此，本發明係關於預防或治療COPD或COPD之惡化之方法， 該方法包含投與雙互補位多肽(例如本發明之雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體)且特定而言其醫藥組合物。本發明亦係關於該雙互補位多肽(包括雙互補位奈米抗體及含有其之組合物)用於治療COPD及COPD之惡化之用途。
熟習此項技術者將易知，本發明之雙互補位多肽、特定而言雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體及其組合物亦可用於治療涉及CXCR2信號轉導功能異常之其他疾病，例如呼吸道之其他病狀，例如囊性纖維素化、嚴重氣喘、氣喘之惡化、過敏性氣喘、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、自發性肺纖維化、氣道重塑、閉塞性小枝氣管炎症候群或肺枝氣管發育不全。
可藉由本發明雙互補位多肽、例如雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體及其醫藥組合物預防或治療之其他疾病及病狀係動脈粥樣硬化、腎小球性腎炎、炎症性腸疾病(克隆氏病)、血管生成及特徵在於新血管發育之疾病，包括黃斑退化、糖尿病性視網膜病變及糖尿病性神經病變、多發性硬化症、牛皮癬、年齡相關性黃斑退化性疾病、眼部貝賽特氏疾病、眼色素層炎、包括自發性PAH、家族性PAH及相關性PAH之肺動脈高血壓(PAH)、慢性炎症疾病、類風濕性關節炎、骨關節炎、非小細胞癌瘤、結腸癌、胰臟癌、食管癌、卵巢癌、乳癌、實體瘤及轉移、黑色素瘤、肝細胞癌瘤或缺血再灌注損傷。
可藉由本發明雙互補位多肽、例如雙互補位免疫球蛋白單一可變結構域或奈米抗體及其醫藥組合物預防或治療之其他疾病及病狀係鐮狀血球貧血症(Sickle cell disease)中之溶血性輸血誘導型血管阻塞危機、局部缺血/再灌注損傷、急性中風/心肌梗塞、顱內受傷、創傷後炎症及胰島素抵抗型糖尿病。
對於以上方法，本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一 可變結構域及/或多肽及/或包含其之組合物可以任一適宜方式投與，此取決於欲使用之具體醫藥調配物或組合物。因此，本發明之雙互補位奈米抗體及/或多肽及/或包含其之組合物可(例如)經口、經腹膜內(例如經靜脈內、經皮下、經肌內或經由避開胃腸道之任一其他投與途徑)、經鼻內、經皮、局部、藉助栓劑、藉由吸入投與，此再次取決於欲使用之具體醫藥調配物或組合物。通常對於COPD而言，吸入並非較佳途徑。臨床醫師將能夠選擇適宜投與途徑及欲於該投與中使用之適宜醫藥調配物或組合物，此取決於個別患者之需求。
根據適於預防及/或治療欲預防或治療之疾病或病症之治療方案投與本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及/或多肽及/或包含其之組合物。臨床醫師通常將能夠確定適宜治療方案，此取決於如下之因子：欲預防或治療之疾病或病症、欲治療疾病之嚴重性及/或其症狀之嚴重性、欲使用之具體的本發明雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或多肽、欲使用之具體投與途徑及醫藥調配物或組合物、患者之年齡、性別、體重、飲食、一般狀況及臨床醫師所熟知之類似因子。
通常，為預防及/或治療本文中所提及之疾病及病症、特定而言COPD，欲投與之量將取決於欲使用之具體的本發明雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域或多肽之效能、具體投與途徑及所使用之具體醫藥調配物或組合物。通常，其將以如下之量在白天期間作為單一日劑量連續(例如藉由輸注)或作為多個分開劑量投與：介於1克/kg體重/天與0.01微克/kg體重/天之間、較佳介於0.1克/kg體重/天與0.1微克/kg體重/天之間、例如約1微克/kg體重/天、10微克/kg體重/天、100微克/kg體重/天或1000微克/kg體重/天。臨床醫師通常將能夠確定適宜日劑量，此取決於本文中所提及之因子。亦將明瞭，在具體情形下，基於(例如)上文所引用之因子及其專家判斷，臨床醫師可選 擇偏離該等量。
本發明之雙互補位奈米抗體、免疫球蛋白單一可變結構域及多肽亦可與一或多種其他醫藥活性化合物或成份組合使用，即作為可或可不導致協同效應之組合治療方案。再次，基於上文所引用之因子及其專家判斷，臨床醫師將能夠選擇該等其他化合物或成份以及適宜組合治療方案。
例如，可將雙互補位多肽(例如本發明雙互補位奈米抗體)與COPD之習用治療(例如短效及長效β-腎上腺素枝氣管擴張藥、吸入抗副交感神經劑(毒蕈鹼拮抗劑)及吸入皮質類固醇)組合。
可以本身已知用於所涉及疾病或病症之方式測定及/或跟蹤根據本發明使用之治療方案之有效性，如臨床醫師所明瞭。若適當且根據具體情況，臨床醫師亦將能夠改變或修改特定治療方案，以達成期望治療效應，以避免、限制或降低不期望副作用，及/或以達成一方面達成期望治療效應與另一方面避免、限制或降低不期望副作用之間之適當平衡。
通常，將跟蹤治療方案，直至達成期望治療效應為止及/或持續維持期望治療效應之時間。再次，此可由臨床醫師來確定。
欲治療之個體可為任一溫血動物，但特定而言為哺乳動物，且更特定而言為人類。如熟習此項技術者所明瞭，特定而言，欲治療之個體將為患有本文中所提及疾病及病症或具有患該等疾病及病症之風險之人。
現將藉助以下非限制性較佳態樣、實例及圖進一步闡述本發明。
本文中所提及之所有公開案以引用的方式併入本文中。
1.人類及食蟹猴CXCR2選殖
表1
設計用於在各種哺乳動物細胞系中之高含量組成表現之pcDNA3.1(+)(Invitrogen,V790-20)。其含有人類細胞巨大病毒即早啟動子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、哺乳動物細胞之新黴素選擇標記及用於在大腸桿菌中選擇之胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因。
pVAX1(Invitrogen,V260-20)係針對DNA疫苗所設計之質粒載體。其含有人類細胞巨大病毒即早啟動子、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及用於在大腸桿菌中選擇之康黴素(kanamycin)抗性基因。
2.表現人類及食蟹猴CXCR2之CHO、CaKi、RBL及HEK293T細胞系之建立
CHO-K1△1-17人類CXCR2(N端3xHA標籤)
用質粒pcDNA3.1_3xHA-△1-17-hCXCR2並使用Amaxa電穿孔系統(於解決方案T中之程式U 23)轉染CHO-K1細胞。自轉染後第二天起將經轉染細胞庫保持於選擇壓力(1000 αg/mL G418)下。8天後，使用FMAT Blue標記之人類GRO-α鑑別人類CXCR2陽性群體。根據製造商說明書(Applied Biosystems,4328408)使用FMAT Blue多官能反應性染料套組(FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye Kit)進行人類Gro-α(Biosource,PHC1063)之FMAT Blue標記。使用FACSaria(BD Biosciences)將單一細胞分選至96孔細胞培養板中。於FACSarray(BD Biosciences)裝置上使用FMAT Blue標記之人類GRO-α測試生長中之選殖體之△1-17人類CXCR2表現。選擇具有最高表現之CHO-K1選殖體(9000之MCF值)。
HEK293T食蟹猴CXCR2
用質粒pcDNA3.1_cCXCR2並使用FuGene HD轉染試劑(Roche)轉染HEK293T細胞。轉染後兩天，於FACSarray(BD Biosciences)裝置上使用50nM FMAT Blue標記之GRO-α測試細胞之cCXCR2表現。進一步使用具有良好表現之細胞(約12000之MCF值)。
RBL-2H3食蟹猴CXCR2
根據製造商之方案，藉由電穿孔(Amaxa Biosystems)使於37℃/5% CO2下生長並以常規方式於補充有1×非必需胺基酸、0.15%碳酸氫鈉、1mM丙酮酸鈉及15%胎牛血清(Invitrogen)之MEM伊式培養基(MEM Eagle media，Invitrogen)中繼代培養之大鼠嗜鹼性白血病細胞(RBL-2H3)經受核轉染。於37℃/5% CO2下培育經轉染細胞，且轉染後24小時藉由添加遺傳黴素達1mg/mL之終濃度來起始抗生素選擇。使經轉染細胞於選擇培養基中生長並繼代培養3天至5天，然後藉由系列稀釋將其單一細胞分選至96孔板中。大約兩週後，擴增活躍生長之群落，且隨後分析食蟹猴CXCR2轉錄物表現。然後進一步擴增陽性選殖體用於分析。
CHO-Trex(HA)3-huCXCR2及(HA)3huCCR9-CXCR2雜合體
將中國倉鼠卵巢T-Rex(T-RexTM-CHO，Invitrogen，編號R718-07)於37℃下以單層培養物維持於含有2mM L-麩醯胺酸並補充有10%不含四環素之胎牛血清(FBS)(Biosera)、1%青黴素/鏈黴素及10μg/mL殺稻瘟菌素之Ham’s F12培養基中。此四環素調控表現(T-RexTM)細胞系穩定地表現四環素抑制子(TetR)。然後使用核轉染程序(細胞系核轉染套組T(Cell line Nucleofector Kit T)，Amaxa Biosystems，程式U-23)產生表現兩種CXCR2構築體之穩定細胞系。轉染後48小時，將經轉染細胞於37℃/5% CO2下培育，並用300μg/mL博來黴素(Zeocin)處理。在博來黴素存在下將細胞培養數週，以允許選擇陽性轉化體，其後使用Mo-Flo FACS分選機實施單一細胞分選。兩週後，擴增活躍生長之群落，同時將其維持於其博來黴素濃度為300μg/mL之常規培養基中。
3.人類Gro-a、食蟹猴Gro-a、人類IL-8、人類ENA-78
表4 NVTS-IL-8、ENA-78、食蟹猴Gro-α
4.肽
自Bachem記錄代表人類及食蟹猴CXCR2之不同N端及細胞外環(EL)段之肽(表5)。在表示為「環狀」之肽中，第一個及最後一個胺基酸係經半胱胺酸殘基替代，且野生型序列之天然存在之內部半胱胺酸係經白胺酸殘基替代。藉助側翼半胱胺酸殘基使該等肽環化。
5.免疫
用表現人類CXCR2之哺乳動物細胞將3只駱馬免疫7次至9次，且用表現食蟹猴CXCR2之哺乳動物細胞將1只駱馬免疫6次。在此方案之後投與四次混合於(不)完全弗式佐劑((in)complete Freund’s Adjuvant)中之肽-鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)偶聯混合物，即代表人類及食蟹猴CXCR2二者之細胞外環編號2及3之肽(參見表5)。用編碼自pVAX1表現之人類全長CXCR2或△1-17 CXCR2之DNA將8只其他駱馬4次至5次，接著投與一次表現人類全長CXCR2之哺乳動物細胞。用編碼自pVAX1表現之食蟹猴CXCR2之DNA將3只額外駱馬免疫4次，接著投與一次表現食蟹猴CXCR2之哺乳動物細胞。在投與每一抗原後4天至8天，獲取免疫血液及淋巴結樣品。
6.藏庫構築
自免疫血液及淋巴結樣品之總RNA製劑製備cDNA樣品。在一個步驟RT-PCR反應中使用引物ABL051、ABL052及ABL003自所有用人類或食蟹猴CXCR2免疫之駱馬之cDNA樣品擴增編碼奈米抗體之核苷酸序列。引物序列係顯示於表6中。將自樣品中之IgG2及IgG3 cDNA擴增之700bp擴增子自凝膠分離，且隨後在使用含有SfiI限制性酶切位點之ABL050引物以及ABL003引物之巢式PCR反應中用作模板。隨後在大腸桿菌(Escherichia coli)TG-1中電穿孔後利用SfiI及BstEII(天然存在於VHH基因之FR4中)消化PCR產物，並將其接合至噬菌粒載體pAX50之相應限制位點中，以獲得藏庫。pAX50係源自於pUC119且含有LacZ啟動子、大腸桿菌噬菌體pIII蛋白質編碼序列、胺苄青黴素或卡本西林(carbenicillin)之抗性基因、多選殖位點及gen3前導序列之表現載體。在具有奈米抗體®編碼序列之框架中，該載體編碼C端c-myc標籤及(His)6標籤。該噬菌粒載體允許產生噬菌體顆粒，將個別奈米抗體表現為與geneIII產物之融合蛋白。
7.選擇
使用呈遞CXCR2表位之肽、膜提取物及完整細胞選擇於噬菌體表面表現之上述pAX50奈米抗體藏庫。
使用肽之選擇在於在塗覆親和素(Pierce,31000)之Maxisorp微量滴定板(Nunc,430341)上所捕獲之0nM至1000nM生物素化肽(參見表5)上培育噬菌體藏庫。另一選擇為，在具有10nM生物素化肽之溶液中培育噬菌體藏庫，隨後於塗覆鏈黴抗生物素蛋白之Dynabeads(Invitrogen,112-06D)上捕獲肽-噬菌體複合物。使用補充有1%酪蛋白之PBS實施阻斷。添加自該等藏庫製備之噬菌體，並將其培育1小時(於補充有0.1%酪蛋白及0.1%吐溫(tween)20之PBS中)。洗去未經結合噬菌體(利用補充有0.05%吐溫20之PBS)；藉由添加胰蛋白酶(1mg/ml，存於PBS中)將經結合噬菌體溶析15分鐘。基本上如上文所闡述實施第二輪選擇。
藉由用自表現人類CXCR2之細胞製備之50ug/mL(總蛋白質)膜提取物(Perkin Elmer，ES-145-M400UA及6110524400UA)塗覆免疫管 (Nunc,444474)來實施使用膜提取物之選擇。製備自表現人類FPR1之CHO細胞的膜提取物(Perkin Elmer,6110527400UA)以平行方式塗覆，作為陰性對照。使用補充有4% Marvel脫脂乳粉之PBS實施阻斷。將噬菌體培育2小時(於補充有1% Marvel之PBS中)。利用PBS洗去未經結合噬菌體；藉由添加胰蛋白酶(1mg/ml，存於PBS中)將經結合噬菌體溶析15分鐘。基本上如上文所闡述實施第二輪選擇。在一些情形下，藉由於塗覆有對照膜提取物之連續管或孔上預吸收結合至不相關細胞背景表位之噬菌體來特異性耗盡該噬菌體。然後，在溶液中存在對照膜提取物之情況下，於所塗覆之人類CXCR2膜提取物上實施培育。在其他實驗中，在肽上進行一或兩輪選擇後在膜提取物上進行一輪選擇，或反之亦然。
在另一組實驗中，將1百萬個至5百萬個表現人類或食蟹猴CXCR2之哺乳動物細胞與噬菌體藏庫一起於補充有10% FBS及1% Marvel脫脂乳粉之PBS中培育。使用未經轉化細胞系作為陰性對照。利用PBS洗去未經結合噬菌體；藉由添加胰蛋白酶(1mg/ml，存於PBS中)將經結合噬菌體溶析15分鐘。基本上如上文所闡述但於與第一輪不同之細胞系背景上實施第二輪。
在其他實驗中，在溶液中存在1μM肽(參見表5)之情況下，將噬菌體與膜提取物或表現CXCR2之哺乳動物細胞一起培育，以耗盡表現結合至該等肽所代表區域之奈米抗體之噬菌體。
8.周質提取物之製備
使經溶析噬菌體感染處於指數生長期之TG-1細胞，然後將該等細胞平鋪於含有卡本西林之LB瓊脂板上。分析耐卡本西林選殖體是否存在插入物，並驗證陽性選殖體之序列。使所關注選殖體於補充有卡本西林之TB培養基中生長，並藉由添加IPTG來誘導用於表現。在37℃下繼續表現4小時，隨後使細胞短暫離心(spin down)。將來自大 腸桿菌表現培養物之經冷凍過夜細胞沈澱溶解於PBS(最初培養物體積之1/10)中，並於4℃下在溫和振盪條件下培育1小時。然後，再將細胞短暫離心一次，並儲存含有分泌至周質空間中之蛋白質之上清液。
9.篩選
於FACS上分析周質提取物(如上文所闡述)在結合至人類CXCR2方面與Gro-α之競爭。於4℃下將2×105個細胞與周質提取物之½稀釋液一起於FACS緩衝液(PBS+10%胎牛血清(Sigma,F7524))中培育30分鐘。然後添加等體積之6nM存於FACS緩衝液中之FMAT Blue標記之人類Gro-α，並在黑暗中於4℃下再繼續培育30分鐘。然後於FACS緩衝液中將細胞洗滌3次，且最後再懸浮於FACS緩衝液中。用碘化丙啶(Sigma,P4170)對死細胞進行染色。然後於FACSarray(BD Biosciences)上分析樣品。表7列示其周質提取物展示與Gro-α對人類CXCR2之競爭之奈米抗體。
在另一設定中，藉由ELISA分析周質提取物至人類1至19肽之結合。將MaxiSorb板(Nunc,430341)用親和素塗覆2個小時，接著進行1小時阻斷(PBS，1%酪蛋白)。然後將100nM生物素化人類1至19肽添加至該等板中，持續1小時(PBS，0.1%酪蛋白，0.05%吐溫20)，接著與周質提取物之10倍稀釋液一起培育1小時。洗去未經結合周質提取物(補充有0.05%吐溫20之PBS)，且使用小鼠抗myc(Roche,11667149001)、接著兔抗小鼠HRP偶聯物(Dakocytomation,P0260)檢測經結合奈米抗體。表8概述抗CXCR2奈米抗體相對於不相關對照奈米抗體之結合信號比率。
10.序列
表9-單價抗CXCR2奈米抗體之序列
單價奈米抗體之主要表徵 11.單價奈米抗體之構築
利用MfeI及BstEII消化藉由於功能性噬菌粒選殖體上利用Fwd-EVQL-MfeI及Rev-TVSS-BstEII引物進行之PCR所獲得之含有奈米抗體之DNA片段(表1)，將其接合至pAX100載體中，並轉化至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。pAX100係源自於pUC119且含有LacZ啟動子、康黴素之抗性基因、多選殖位點及OmpA前導序列之表現載體。在具有奈米抗體編碼序列之框架中，該載體編碼C端c-myc標籤及His6標籤。分析耐康黴素選殖體是否存在插入物，並驗證陽性選殖體之序列。
12.小規模表現
使含有編碼所關注奈米抗體之表現載體之TG-1細胞於含有TB培養基加100μg/ml康黴素之具擋板振盪燒瓶中生長，並藉由添加1mM IPTG來誘導用於表現。使表現於37℃下繼續4小時。收集該等細胞後，製備周質提取物，且藉由固定化金屬親和力層析法(HisTrap FF Crude,GE Healthcare)、接著脫鹽(HiPrep 26/10,GE Healthcare)或凝膠過濾層析法(Superdex 75 HR16/10,GE Healthcare)於PBS中純化His6標記之奈米抗體。
13.配體競爭分析
在關於人類及食蟹猴CXCR2之FACS配體競爭分析中針對3nM FMAT-Blue標記之Gro-α滴定經純化單價抗CXCR2奈米抗體(表10)。關於人類CXCR2，阻斷效能係在介於兩位數nM與亞nM之間之範圍內，而關於食蟹猴CXCR2，其係在介於個位數nM與兩位數nM之間之範圍 內。
NA：無活性可量測。
14.使用重組細胞系之功能性分析 (1)量測細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)
將表現人類或食蟹猴CXCR2受體之RBL細胞接種於96孔板中，並於37℃下培育過夜。在實驗當天，於37℃下向該等細胞加載Fluo-4染料，持續30分鐘，接著與經過純化單價抗CXCR2奈米抗體一起培育30分鐘。最後，使用螢光成像板讀數器(Fluorometric Imaging Plate Reader，FLIPR)添加GRO-α，接著檢測螢光信號，此與細胞內鈣之釋放相對應。使用表現人類CXCR1之L2071細胞實施選擇性分析。該分析方案與針對CXCR2所闡述者保持相同，然而使用IL-8作為激動劑。平均IC50值之概述係顯示於表11中，另外，在所測試濃度(1μM最大濃度)之CXCR1受體下，所測試奈米抗體中之任一者對細胞內鈣之激動劑誘導釋放均未顯示任何抑制。
(2)量測[ 35 S]GTPγS之激動劑刺激之累積
將經純化單價抗CXCR2奈米抗體與GRO-α、GDP、SPA珠粒及CHO-CXC2膜(自表現人類CXCR2受體之CHO細胞製備)一起於96孔板 中培育60分鐘。此接著係添加[35S]GTPγS及再培育60分鐘。最後，使該板離心，然後於Topcount上讀數。平均IC50值之概述係顯示於表11中。
*將曲線固定至100%抑制，此乃因在所測試濃度下未獲得任何平線區。NA-沒有活性可量測。ND-未測定。
15.使用原代嗜中性球之功能性分析 (1)人類嗜中性全血形狀變化分析(hWBSC)
供體為沒有全身用藥之健康正常志願者(Novartis Horsham供體組)。以1mL EDTA對9mL血液之比率收集經52mM EDTA(無菌)抗凝之全血。在室溫下收集血液，並在使用前預升溫至37℃。在室溫下將80μL全血與CXCR2奈米抗體一起預培育10分鐘(10個點/劑量反應(0.03×10-7μM至1.144×10-7μM))，然後用趨化激素刺激；除零化合物以外，將10μL rhGROα(2nM近似為EC70濃度)添加至所有孔中，向該零化合物中添加10μL形狀變化分析緩衝液。溫和振盪樣品，並在 37℃下再培育5分鐘。然後將該等管置於冰上，且添加250μL冰冷之經最佳化CellFixTM溶液，溫和振盪各管並將其再培育5分鐘，其後將1.4mL 1×氯化銨溶解溶液添加至所有管中，並再留在冰上20分鐘。在紅血球溶解後，於FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析樣品。藉由前向散射/側向散射(FSC/SSC)選通、接著使用自第一個圖選通之粒細胞之FSC/FL-2圖來鑑別細胞群。在FL-2圖上嗜中性球與嗜酸性球不同，此乃因後者具有較高自發螢光。每個樣品計數5000個事件。
(2)人類嗜中性趨化作用分析
供體為沒有全身用藥之健康正常志願者(Novartis Horsham供體組)。以1mL EDTA對9mL血液之比率收集經52mM EDTA(無菌)抗凝之全血。使用標準方案分離白細胞：將4%葡聚糖添加至20mL抗凝血液中，溫和混合，然後於冰上培育30分鐘，以允許紅血球沈澱。然後將含有外周血單核細胞(PMN)之上清液於Ficoll-Paque®密度梯度上分層，並於18℃下以300×g離心25分鐘。將富含PMN之流分再懸浮於500μL 1×PBS中，且使用低滲休克實施紅血球溶解。將20mL冰冷、無菌、不含內毒素之蒸餾水添加至沈澱中，且使溶解進行30秒至40秒，然後添加20mL 2×PBS。溫和混合樣品，並於18℃下以300×g離心10分鐘，以獲得粒細胞。將粒細胞沈澱再懸浮於500μL 1×PBS中，並用50mL×1 PBS洗滌兩次。將粒細胞沈澱再懸浮於RPMI 1640(pH 7.4)加2.5% FBS中，計數並稀釋至2e6/mL之最終濃度。使用transwell板並利用3μm來自Becton Dickinson之PET膜量測遷移。簡言之，將6nM GROα(EC80-EC100)添加至該板之底部孔中(1000μL/孔)，然後將多孔插入物降至該位置中，然後將已在室溫下與不同濃度之奈米抗體(對於單價為0.13nM至1000nM或對於雙互補位為0.6pM至30nM)一起預培育30分鐘之PMN添加至插入物中(500μL/孔)。然後於 37℃下將各板培育90分鐘，使用FACSCalibur流式細胞儀計數已遷移至底部室中之細胞。流式細胞儀經設定以計數在20秒樣品/之設定時間內FSC/FL-2圖上之R2門內之事件數。
(3)食蟹猴嗜中性全血形狀變化分析(CynoWBSC)
用3.8%檸檬酸鈉(無菌)以1mL檸檬酸鈉對9mL血液之比率使自前臂或腿獲取之靜脈血抗凝。在室溫下收集血液，並在使用前預升溫至37℃。在室溫下將80μL全血與CXCR2奈米抗體一起預培育10分鐘(10個點/劑量反應(0.03×10-7μM至1.144×10-7μM))，然後用趨化激素刺激；除零化合物以外將10μL rhGROα(30nM近似為EC70-90濃度)添加至所有孔中，向該零化合物中添加10μL形狀變化分析緩衝液。溫和振盪樣品，並在37℃下再培育5分鐘。然後將該等管置於冰上，且添加250μL冰冷之經最佳化CellFixTM溶液，溫和振盪各管並將其再培育5分鐘，其後將2mL溶解緩衝液(Sigma Aldrich，編號R7757)添加至所有管中，並再留在冰上40分鐘至60分鐘。在紅血球溶解後，於FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析樣品。藉由前向散射/側向散射(FSC/SSC)選通、接著使用自第一個圖選通之粒細胞之FSC/FL-2圖來鑑別細胞群。在FL-2圖上嗜中性球與嗜酸性球不同，此乃因後者具有較高自發螢光。每個樣品計數5000個事件。
多價奈米抗體 16.二價奈米抗體之構築
使用兩種方法構築體二價奈米抗體。
對編碼單價建構組元之質粒DNA進行PCR擴增。使用Fwd-EVQL-MfeI及編碼GlySer連接體之一部分之反向引物擴增N端建構組元，而使用編碼GlySer連接體之其餘部分之正向引物及Rev-TVSS-BstEII擴增C端建構組元(表6)。利用MfeI及BamHI消化N端片段，利用BamHI及BstII消化C端片段；然後將該等片段同時接合至pAX100載體中，並轉化至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。
另一選擇為，對編碼單價建構組元之質粒DNA進行不同PCR擴增。使用Fwd-EVQL-MfeI及Rev-TVSS-BspEI擴增N端建構組元，而使用Fwd-EVQL-BamHI及Rev-TVSS-BstEII擴增C端建構組元(表6)。利用MfeI及BamHI消化N端片段，利用BspEI及BstII消化C端片段。將N端片段接合(MfeI-BspEI)至含有GlySer連接體之編碼資訊之pAX100衍生物中，並轉化至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。自此轉化混合物製備質粒DNA，並利用BspEI及BstEII消化，且然後將C端片段接合至pAX100載體中，並轉化至大腸桿菌TG-1勝任細胞中。
分析耐康黴素選殖體是否存在插入物，並驗證陽性選殖體之序列。
17.多價抗CXCR2奈米抗體之序列
表13
18.配體競爭分析
在關於人類及食蟹猴CXCR2之FACS配體競爭分析中針對3nM FMAT-Blue標記之Gro-α滴定多價抗CXCR2奈米抗體(表14)。關於人類CXCR2，阻斷效能係在介於兩位數nM與亞nM之間之範圍內，而關於食蟹猴CXCR2，其係在介於個位數nM與兩位數nM之間之範圍內。
ND：未測定。
19.使用重組細胞系之功能性分析 (1)量測細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)
將表現人類或食蟹猴CXCR2受體之RBL細胞接種於96孔板中，並於37℃下培育過夜。在實驗當天，於37℃下向該等細胞加載Fluo-4染料，持續30分鐘，接著與經過純化多價抗CXCR2奈米抗體一起培育30分鐘。最後，使用螢光成像板讀數器(FLIPR)添加GRO-α，接著檢測螢光信號，此與細胞內鈣之釋放相對應。使用表現人類CXCR1之L2071細胞(其中IL-8作為激動劑)及內源性表現人類CXCR4之CEM細胞(其中SDF-1作為激動劑)實施選擇性分析，然而分析方案與針對CXCR2所闡述者保持相同。平均IC50值之概述係顯示於表15中，另外，在所測試濃度(1μM最大濃度)之CXCR1或CXCR4下，所測試奈 米抗體中之任一者對細胞內鈣之激動劑誘導釋放均未顯示任何抑制。
(2)量測[ 35 S]GTPγS之激動劑刺激之累積
將經純化多價抗CXCR2奈米抗體與激動劑(GRO-α、IL-8或ENA-78)GDP、SPA珠粒及CHO-CXC2膜(自表現人類CXCR2受體之CHO細胞製備)一起於96孔板中培育60分鐘。此接著係添加[35S]GTPγS及再培育60分鐘。最後，使該板離心，然後於Topcount上讀數。平均IC50值之概述係顯示於表15中。
*將曲線固定至100%抑制，此乃因在所測試濃度下未獲得任何平線區。ND-未測定。
ND-未測定
(3)確定抗CXCR2奈米抗體之作用機制之Schild分析
使用IL-8及GRO-α刺激之[35S]GTPγS累積分析實施Schild分析。此分析格式允許在添加[35S]GTPγS之前激動劑與奈米抗體達到平衡，且因此，應避免可導致曲解機制之任何半平衡贗象。為此，在遞增濃度之奈米抗體存在下測定激動劑濃度反應曲線。兩種單價奈米抗體54B12及163E3及所得多價奈米抗體之數據係作為實例給出並顯示於圖1中。該數據顯示GRO-α之濃度反應曲線，但當使用IL-8時，觀測到類似數據。
單價奈米抗體54B12及163E3均顯示異位作用機制，但對激動劑之抑制具有不同效應。54B12及其他1-19結合劑之異位機制係由在較低奈米抗體濃度下激動劑濃度反應曲線之平行右移所例示，該等平行右移在遞增濃度之奈米抗體存在下並不進一步右移(圖1(a))。此效應之飽和性質(且最大激動劑反應並不消減)指示對激動劑之親和力具有異位效應。相比之下，163E3及其他非1-19結合劑之異位機制係由在較高奈米抗體濃度下激動劑濃度反應曲線之平行右移與最大激動劑反應之降低之組合所例示(圖1(b))。此效應可為飽和的，但在所用濃度下未觀測到此，然而，關鍵觀測結果係最大激動劑反應之降低，其指示對激動劑之效力具有異位效應。最後，雙互補位奈米抗體54B12-163E3組合兩種異位機制，以對激動劑濃度反應曲線產生由在遠遠較 低奈米抗體濃度下之平行右移及最大激動劑反應之顯著消減例示之效應。(圖1(c))。亦測試雙互補位奈米抗體127D1-163E3、127D1-163D2及54B12-163D2，且顯示具有類似性質(數據未顯示)。
與圖1中所圖解說明者相同之性質亦顯示於圖2中，其顯示當針對抑制GRO-α之能力測試時，代表性結合分子127D1係強效的，但無效，而另一結合分子163E3相對於127D1具有較低效能，但更有效。當組合兩種結合分子時，顯示所得雙互補位結合分子既強效又有效。總而言之，已顯示在效力及效能方面本發明之雙互補位分子相對於單體奈米抗體具有較好性質。IC50值係示於下表中。
異位調節劑之當前定義係其於與激動劑(正構配體)結合位點不同之位點結合且正構配體及異位調節劑二者同時結合至受體。儘管本發明者當前沒有數據證實此且不希望受理論限制，但據信並非該奈米抗體結合位點不同於激動劑結合位點，而是該等結合位點重疊。亦未得到數據顯示激動劑及奈米抗體二者同時結合至受體，但Schild分析數據將表明該等奈米抗體為CXCR2之異位調節劑。
20.功能性分析-NSC
方法與部分15中所闡述者相同
表17-經純化雙互補位抗CXCR2奈米抗體在使用原代人類或食蟹猴嗜中性球之功能性分析中之IC 50 值(相對於rhGROα，平均值±SD)
領先序列(leadpanel)-CDR+FR CXCR2 Kabat
21.序列最佳化-CXCR2拮抗劑多肽
熱移位分析(TSA)：將5μl純化單價奈米抗體(80mg/ml)與5μl螢光探針Sypro Orange(Invitrogen，Carlsbad,CA，目錄編號S6551)(最終濃度10×)混合於10μl緩衝液(100mM鹽酸鹽、100mM硼酸鹽、100mM檸檬酸鹽、115mM NaCl，於3.5至9之範圍內之不同pH下緩衝)中。然後於LightCycler 480II機器(Roche,Basel,Switzerland)中以4.4℃/s將樣品自37℃加熱至90℃，其後以2.2℃/s將其冷卻至37℃。在熱誘導之解摺疊後，疏水蛋白質斑暴露於Sypro Orange所結合者，從而導致螢光強度增加。螢光強度曲線之一階導數之拐點充當熔融溫度(Tm)之量度。(Ericsson等人2006(Annals of Biochemistry,357：289-298)。
微差掃描熱量法(DSC)：於Auto-Cap VP-DSC(MicroCal-GE Healthcare)上根據製造商說明書實施實驗。在30℃至95℃之溫度範圍內以1℃/min之加熱速率實施奈米抗體(0.25mg/mL)之熔融溫度測定。在適當基線減法後獲得最終熱譜圖。Software-driven(Origin 7.0)峰檢測得到相應熔融溫度。
強制氧化：在室溫下並在黑暗中向奈米抗體樣品(1mg/mL)施加存於PBS中之10mM H2O2中並持續4小時，與此同時在不施加H2O2之情形下運行對照樣品，接著使用Zeba脫鹽離心管柱(0.5mL)(Thermo Scientific)將緩衝液切換成PBS。然後在70℃下於Zorbax 300SB-C3管柱(Agilent Technologies)上藉助系列1200機器(Agilent Technologies)上之RPC來分析應力及對照樣品。藉由測定與主要蛋白質蜂相比因氧化應力發生之峰前之峰面積%來量化奈米抗體之氧化。
2B2序列最佳化
將親代2B2之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表20，第147頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代 表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自2B2、CXCR20059及CXCR20063產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中或藉助微差掃描熱量法(DSC)測定變體之熔融溫度(表21)。CXCR20059及CXCR20063中之M93L突變廢止親代2B2對強制氧化之敏感性。
97A9序列最佳化
將親代97A9之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表22，第147頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自97A9及CXCR20061產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中測定變體之熔融溫度(表23)。
表23-單價979A9及經序列最佳化變體之功能表徵
163E3序列最佳化
將親代163E3之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表24，第147頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自163E3及CXCR20076產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中測定變體之熔融溫度(表25)。
127D1序列最佳化
將親代127D1之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表26，第147頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自127D1及CXCR20079產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及 食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中測定變體之熔融溫度(表27)。CXCR20079中之M57R突變廢止親代127D1對強制氧化之敏感性。
163D2序列最佳化
將親代163D2之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表28，第148頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自163D2及CXCR20086產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中測定變體之熔融溫度(表29)。
54B12序列最佳化
將親代54B12之蛋白質序列與人類VH3-23(DP-47)及JH5種系(表30，第148頁)比對。相對於人類種系序列之胺基酸差異係由字母代 表，相同胺基酸係由點代表。選擇加下劃線之胺基酸差異以轉換成人類對應物，而其他保持不變。
自54B12、CXCR20103及CXCR2104產生經純化單價材料，然後在FACS配體競爭分析及細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)分析中針對人類及食蟹猴CXCR2二者進行表徵。另外，在熱移位分析(TSA)中測定變體之熔融溫度(表31)。
22.表位定位
由Integral Molecular公司，3711 Market street,Suite 900,Philadelphia,PA,USA,www.integralmolecular.com使用其散彈槍(Shotgun)誘變技術實施奈米抗體之表位定位。
散彈槍誘變技術概述
散彈槍誘變使用使能夠表現及分析真核細胞內之突變標靶蛋白質之較大藏庫之專門的高通量細胞表現技術。使蛋白質中之每一殘基個別突變成(常常)多個其他胺基酸，以分析功能變化。蛋白質係在標準哺乳動物細胞系內表現，故甚至可定位需要真核轉譯或轉譯後加工之困難蛋白質。
用於表位定位之命名法係如下：RDHBC 792=CXCR20079
RDHBC 793=CXCR20061
RDHBC 792=CXCR20076
以單一胺基酸解析度使用散彈槍誘變定位抗CXCR2抗體RD-HBC792(CXCR20079)、RD-HBC793(CXCR220061)及RD-HBC794(CXCR20076)之表位，如以下。
親代構築體：將未經標記親代基因選殖至高表現載體中，測序 並藉由免疫檢測針對表現進行驗證。奈米抗體最佳化：以散彈槍誘變格式藉由分析394孔微板中之一組奈米抗體稀釋液來使奈米抗體之檢測最佳化。選擇每一奈米抗體之最優濃度用於篩選突變藏庫。完成突變藏庫，且使每一胺基酸位置突變成保守及非保守變化，包括每一殘基至Ala取代之突變。測試藏庫之表面表現，並一式三份藉由免疫檢測針對奈米抗體結合進行篩選。針對奈米抗體結合之損失實施藏庫之分析，鑑別並定位關鍵殘基。
以384孔格式藉由免疫發光及免疫螢光實施瞬時表現之野生型親代構築體之親代構築體表現免疫檢測。對於所有實驗，使用液體處置機器人實施細胞轉染及免疫染色中所涉及之液體處置步驟，以確保精確度及高實驗重現性。
表37.用於多株免疫檢測之實驗參數。
結論：使用對照MAb及多株血清檢測野生型親代構築體之穩健表面表現及總表現，故可使用野生型親代構築體用於散彈槍誘變。免疫發光分析顯示高信號：背景及低可變性，且將用於定位研究。
使用定位奈米抗體來使免疫檢測最佳化。以384孔格式使用用野生型受體或僅具載體之質粒瞬時轉染之細胞進行免疫檢測。經選擇用於其他定位研究之濃度係基於具有高信號：背景及低可變性之接近最大信號。
表38.用於以散彈槍誘變384孔格式進行之經最佳化分析檢測之實驗參數。使用本文所定義之經最佳化分析條件用於以384孔格式定位CXCR2突變藏庫。藉由瞬時轉染在細胞中表現藏庫中之每一選殖體，並在轉染後大約18小時針對奈米抗體反應性進行分析。CXCR2奈米抗體RD-HBC792、RD-HBC793及RD-HBC794缺乏Fc區域，但含有myc標籤，故使用多個步驟檢測策略，其中使用中間體小鼠抗myc抗體(9E10)，接著用抗小鼠HRP抗體進行檢測。
結論：確定用於3種CXCR2奈米抗體之免疫檢測及表位定位之最終條件。經最佳化條件在散彈槍誘變格式中導致高信號：背景及低可變性，且從而可以高信賴度用於表位定位。表位定位涉及施加本文所確定之相同分析條件，但利用受體變體之突變藏庫。
奈米抗體表位之關鍵殘基之鑑別
表39.關鍵殘基之鑑別。藉由比較選殖體之奈米抗體反應性與多株反應性(表面表現)來鑑別MAb之關鍵殘基。抗體表位中所涉及之殘基經鑑別為對於奈米抗體結合而言為陰性但對於多株結合而言為陽性之彼等，包括Ala殘基取代(即去除殘基側鏈)，且位於細胞外環中。顯示MAb結合及多株抗體結合之平均反應性及標準偏差。針對每一MAb所鑑別之關鍵殘基具有灰色陰影。亦將RD HBC792之數據與RD HBC793相比，此乃因發現RD HBC792之結合特性與商業多株血清(其係源自於人類CXCR2之N端細胞外結構域，其可解釋血清對F11、F14及W15突變之降低之反應性)類似。
表位資訊之進一步分析
藉由散彈槍誘變定位所鑑別之關鍵胺基酸界定3種CXCR2 MAb之 結合位點。MAb RD HBC792係定位至CXCR2之N端區域，且關鍵殘基之緊密靠近表明該表位實際上為線性的。MAbs RD HBC793及RD HBC794似乎結合主要由CXCR2之ECL1及ECL3形成之構形複合表位。已知形成兩個將細胞外環固持在趨化激素受體中適當位置之二硫鍵之細胞外Cys殘基之突變亦消除MAb 793及794之結合，故據信其並未在表位相互作用中直接涉及。793及794之表位顯著重疊，但兩者間之精細差異很明顯。
23.重組細胞系之CXCR2選擇性 細胞內鈣之激動劑誘導之釋放(FLIPR)
為檢查CXCR2選擇性，將不同單價抗CXCR2奈米抗體組合為單價、二價或雙互補位構築體，其中個別奈米抗體建構組元係由35GS連接體隔開。
在37℃下向表現人類CXCR2受體之RBL細胞加載Fluo-4染料並持續30分鐘，接著與經純化單價、二價或雙互補位奈米抗體一起培育30分鐘。最後，使用螢光成像板讀數器(FLIPR)添加GROα，接著檢測螢光信號，此與細胞內鈣之釋放相對應。使用表現人類CXCR1之L2071細胞實施選擇性分析。該分析方案與針對CXCR2所闡述者保持相同，然而，使用IL-8作為激動劑。代表性結果係顯示於圖3中。
24.利用抗HSA(Alb8)之半衰期延伸
嗜中性球係炎症中之一主要促炎症細胞，表現高含量之介導化學吸引之CXCR2受體。用CXCR2配體(GROα)或對照刺激物(FMLP)刺激後之嗜中性形狀變化可藉由流式細胞術來量化，並用作激活標記。
在此研究中，活體內描述抗CXCR2奈米抗體，以測定半衰期延長之奈米抗體(HLE：CXCR20076-35GS-CXCR20079-Alb8(在實例中亦稱為76-79-Alb8)與NB-NB(非HLE：CXCR20076-35GS-CXCR20079(在實例中亦稱為76-79))相比之藥物動力學特性。將單一劑量奈米抗 體以等莫耳濃度劑量靜脈內注射至食蟹猴中：未經格式化之奈米抗體(NB-NB,0.3mg/kg)或經Alb8(抗HSA)結構域延長之奈米抗體(NB-NB-Alb8,0.45mg/kg)，在投藥前及投藥後長達35天內之各時間點處收集血液。所有構築體在該第一取樣時間點處(注射後1h或3h)離體完全抑制全血嗜中性形狀變化(WBSC)。與NB-NB非HLE奈米抗體之30小時相比，對於NB-NB-Alb8融合而言在9天之較長持續時間內明顯具有較強PD抑制(WBSC)。
25.奈米抗體79-76-Alb8及79-86-Alb8完全阻斷CXCR2功能活性
奈米抗體79-76-Alb8-AA及79-86-Alb8-AA在功能上係等效的且完全阻斷CXCR2功能。因此該等抗體未因在C端添加Ala-Ala變體而改變。
26.對與健康志願者中之CXCR2奈米抗體相互作用之IgG抗體之檢測 及C端延伸之效應。
藉由在夾心式ELISA中篩選健康供體血清(44個雄性及44個雌性)來評價結合至人類血清中之CXCR20079-35GS-CXCR20076(79-76)、CXCR20079-35GS-CXCR20076-ALB8(79-76-Alb8)、CXCR20079-35GS-CXCR20086(79-86)及CXCR20079-35GS-CXCR20086-ALB8(79-86-Alb8)之IgG抗體之形成。簡言之，將奈米抗體CXCR20079-35GS-CXCR20076-ALB8直接固定於微量滴定板上。藉由固定化奈米抗體捕獲抗奈米抗體抗體，並藉由與山葵過氧化酶偶聯之抗人類IgG-(Fc特異性)抗體進行檢測。與受質TMB一起培育後，在450nm下量測酶促反應之經著色產物之光學密度(OD)。所用之陽性對照抗體為人類抗CXCR2抗體NOV0205(1M8)(藉由噬菌體展示於內部生成)，即ACE00277批次。由於分析未經驗證，因此估計初始截止點，即平均正規化OD(OD樣品/OD陰性對照)。
測試44個雄性及44個雌性健康供體血清，其中50%之雄性及61%之雌性樣品證明與親代奈米抗體之反應性高於該分析之初始篩選截止點(參見下圖)。
不欲受限於任何解釋，機制或假設、證據表明IgG與經人類化Vh結構域中之構形表位(即通常由CH1結構域遮蔽於抗體中之區域)相互作用。為阻斷此相互作用，生成各種C端延伸(A、AA、AS、AST、ASTKP、GGGS)，並測試其抗Nb IgG活性及功能活性。下圖中所顯示之數據顯示，具有AA C端延伸79-76-Alb8-AA之半衰期延長之雙互補位奈米抗體使抗Nb IgG反應性在雄性中自50%顯著降低至20%，並在雌性中自61%顯著降低至16%。另外，當與無c端延伸79-76-Alb8及79-86-Alb8之奈米抗體相比時，Ala-Ala C端變體79-76-Alb8-AA及79-86-Alb8-AA不改變功能活性，參見圖4。
27.使用雙互補位奈米抗體抑制對CXCR2之趨化作用
趨化作用係細胞沿化學濃度梯度之定向移動。在活體內，此係指吞噬細胞(例如嗜中性球)自血管經由內皮向組織之遷移。參考文獻參見Boyden S(1962)The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes.J Exp Med；115：453-466及Frevert C、Wong V、Goodman R等人1998)Rapid fluorescence-based measurement of neutrophil migration in vitro.J Immunol Methods；213(1)：41-52。
為模擬此過程，在活體外，吾人已研發transwell分析，使用來自Becton Dickinson之3μm聚酯膜。簡言之，將EC50濃度之趨化激素(2nM rhGRO-α)添加至接收板之底部孔中，然後將多孔插入物降低至該位置中。在室溫下將剛自外周血分離並用活性染料鈣黃綠素-AM標記之人類嗜中性球與不同濃度之奈米抗體(0.007nM至30nM)一起預培育30分鐘。然後將細胞添加至多孔插入物中，並在37℃下培育90分鐘，然後移除並丟棄該插入物。然後於BioTek Synergy板讀數器上在485nm激發及520nm發射下量測來自已遷移至接收板之孔中之細胞之螢光。抗CXCR2奈米抗體79-76-Alb8-AA以0.256±0.02nM(平均值±SEM，來自n=4個供體)之IC50值抑制rhGRO-α刺激之趨化作用，參見圖5。

Claims (10)

  1. 一種包含兩個免疫球蛋白抗原結合結構域之多肽，該多肽係針對或結合至趨化激素受體CXCR2，其中該第一抗原結合結構域係包含於重鏈抗體之單一重鏈之第一VHH結構域或其片段內，且該第二抗原結合結構域係包含於重鏈抗體之單一重鏈之第二VHH結構域或其片段內，且其中該多肽之C端包含該等抗原結合結構域之序列之至少一個額外胺基酸殘基之延伸；該多肽具有以下結構中之一者：●FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT●FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8--連接體-HLE-EXT●FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--HLE--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT●HLE--連接體--FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4--連接體--FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8-EXT其中若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含該第一抗原結合結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含該第二抗原結合結構域，且若FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4包含該第二抗原結合結構域，則FR5-CDR4-FR6-CDR5-FR7-CDR6-FR8包含該第一抗原結合結構域：HLE係提供延長之活體內半衰期之結合單元，且EXT係選自A、AA、AS、AST、ASTKP或GGGS之C端延伸；且其中該第一抗原結合結構域可識別CXCR2上之第一表位且能夠結合至SEQ ID No.7所示之胺基酸序列組成之線性肽，及該第二抗原結合結構域可識別CXCR2上之第二表位且該第二抗原結合結構域結合至人類CXCR2之外環(SEQ ID No.1之胺基酸殘基106-120、184-208及274-294)內之表位；其中在該第一抗原結合結構域中，CDR1包含SEQ ID No.141所示之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID No.236所示之胺基酸序列，且CDR3包含SEQ ID No.181所示之胺基酸序列；且其中在該第二抗原結合結構域中，CDR4包含SEQ ID No.146所示之胺基酸序列，CDR5包含SEQ ID No.237所示之胺基酸序列，且CDR6包含SEQ ID No.186所示之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之多肽，其中該C端延伸係由兩個丙胺酸殘基組成。
  3. 如請求項1之多肽，其中該第一抗原結合結構域包含SEQ ID No.216之胺基酸序列，且該第二抗原結合結構域包含SEQ ID No.217之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之多肽，其包含SEQ ID No.221及由兩個丙胺酸殘基組成之C端延伸。
  5. 如請求項1之多肽，其係由SEQ ID No.225之序列組成，其具有由兩個丙胺酸殘基組成之C端延伸。
  6. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至5中任一項之多肽。
  7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之多肽及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  8. 一種如請求項1至5中任一項之多肽之用途，其用於製備藥物。
  9. 一種如請求項1至5中任一項之多肽之用途，其用於製備治療慢性阻塞性肺病(COPD)及COPD惡化之藥物。
  10. 一種如請求項1至5中任一項之多肽之用途，其用於製備治療囊性纖維素化、氣喘、特定而言嚴重氣喘及氣喘之惡化、急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群、自發性肺纖維化、氣道重塑、閉塞性小枝氣管炎症候群或肺枝氣管發育不全之藥物。
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