JP2015520730A5

JP2015520730A5 -

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Publication number: JP2015520730A5
Application number: JP2015500419A
Authority: JP
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2015-09-03
Anticipated expiration: 2032-06-19

Description

本出願は、一態様において、野生型ユビキチンタンパク質に対して一以上のアミノ酸置換を含む立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質を提供する。幾つかの実施態様において、前記一又は複数のアミノ酸置換は、β１／β２ループが、プロテインデータバンクコード３ＮＨＥのＢ鎖の約１．６Å平均二乗偏差以内の領域に制限されるように、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループを安定化する。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ領域は、ＮＭＲのＲ_２分散によって測定される場合、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、より遅いコンフォーメーションダイナミックスを示す。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチン蛋白質のβ１／β２ループの周辺領域のマイクロ秒Ｒ_ｅｘ値は、ＮＭＲのＲ_２分散によって測定される場合、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、最大４０倍大きい。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、前記立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、位置がＡ１−Ａ７６（配列番号１）に関することを特徴とする、Ａ７、Ａ８、Ａ１３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ６９、及びＡ７１からなる群から選択される位置にて、一又は複数のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、（ａ）置換Ａ７（Ｃ）又は置換Ａ８（Ｃ）；及び置換Ａ６９（Ｃ）を含む。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、Ａ１３（Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、又はＰ）、Ａ３４（Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｍ、又はＴ）、Ａ３６（Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｗ、Ｉ、Ｍ又はＮ）、及びＡ７１（Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｒ又はＧ）からなる群から選択される一又は複数の置換を含む。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、Ａ７（Ｄ、Ｆ、Ｒ、又はＳ）、Ａ８（Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＹ）、Ａ１３（Ｒ、Ｙ、Ｅ、又はＰ）、Ａ３４（Ｉ、Ｌ、又はＴ）、Ａ３６（Ｌ、Ｙ、Ａ、又はＮ）、Ａ６９（Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｋ、Ｙ、又はＩ）、及びＡ７１（Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｒ、又はＧ）からなる群から選択される一又は複数の置換を含む。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、アミノ酸残基の位置が配列番号１の位置に対応する、Ａ４２、Ａ４６、Ａ４９、Ａ６２、Ａ６５、Ａ６８、又はＡ７０に位置する一又は複数のアミノ酸置換を更に含む。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、アミノ酸残基の位置が配列番号１の位置に対応する、Ａ４０、Ａ４２、Ａ４６、Ａ４７、Ａ４９、Ａ６２、Ａ６５、Ａ６８、Ａ７０、Ａ７１、Ａ７２、Ａ７３、Ａ７４、Ａ７５、又はＡ７６に位置する一又は複数のアミノ酸置換を更に含む。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）ファミリーの脱ユビキチン化酵素への結合の増加を示す。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、ナノモル領域でのＫｄで脱ユビキチン化酵素に結合する。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型タンパク質よりも少なくとも１０００倍高い親和性で脱ユビキチン化酵素に結合する。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、脱ユビキチン化酵素の活性を阻害する。上述の実施態様の何れかの幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、ユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）ファミリーの脱ユビキチン化酵素への結合の減少あるいは消失を示す。

立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質の何れかの幾つかの実施態様において、一又は複数のアミノ酸置換は、タンパク質のβ１／β２ループのコンフォーメーションダイナミクスが、野生型ユビキチンタンパク質のこの領域の運動に比べて遅くなるように、β１／β２ループを安定化する。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ領域は、野生型ユビキチンタンパク質のこの領域により示されるコンフォーメーションダイナミクスと比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％の何れかを包括し、これらの値の間の任意のパーセンテージを含む、より遅いコンフォーメーションダイナミクスを示す。幾つかの実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ領域は、プロテインデータバンクコード３ＮＨＥのＢ鎖の、約０．７から２．７Å、約１．０から２．４Å、約１．３から２．１Å、約１．６から１．８Åの平均二乗偏差の何れかを含む、約０．５から３Å以内の領域に制限される。一実施態様において、立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ領域は、プロテインデータバンクコード３ＮＨＥのＢ鎖の約１．６ÅＲＭＳＤ以内の領域に制限される。幾つかの実施態様において、本明細書に開示される任意の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ周辺領域におけるマイクロ秒Ｒｅｘ値は、野生型ユビキチンと比較して、最大で約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、又は約１０００倍の何れかを包括し、これらの値の間の任意の数を含み、大きい。特定の実施態様において、本明細書に開示される何れかの立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループ周辺領域におけるマイクロ秒Ｒｅｘ値は、野生型ユビキチンと比較して、最大で約４０倍大きい。幾つかの実施態様において、本明細書に開示されるβ１／β２ループ領域の、より遅いコンフォーメーションダイナミクスの程度は、当該分野で公知の任意の方法、特に本明細書に記載の方法によって決定される。一実施態様において、方法はＮＭＲのＲ_２分散である。

幾つかの実施態様において、ユビキチンの立体構造的に安定化された形態は、一又は複数の結合パートナーに結合するのに好適である立体構造形態である。幾つかの実施態様において、薬剤の結合は、ユビキチンの立体構造形態に結合する（例えば優先的に結合する）一又は複数の結合パートナーの結合を阻害することができる（例えば、その間の相互作用を破壊することができる）。一実施態様において、結合パートナーは、限定されないが、任意のＥ１、Ｅ２又はＥ３ユビキチンプロセシング酵素などのユビキチンプロセシング酵素、又は脱ユビキチン化酵素である。幾つかの実施態様において、結合パートナーは脱ユビキチン化酵素のＵＳＰファミリーのメンバー（限定されないが、例えば、ＵＳＰ７、ＵＳＰ５、及び／又はＵＳＰ１４）である。幾つかの実施態様において、薬剤は、結合パートナーの、ユビキチンの特定の立体構造形態（例えば、一又は複数のアミノ酸置換は、β１／β２ループが、プロテインデータバンクコード３ＮＨＥのＢ鎖の約１．６Å平均二乗偏差以内の領域に制限されるように、安定化されたユビキチンタンパク質のβ１／β２ループを安定化することを特徴とする、ユビキチンの立体構造形態）への結合を競合的に阻害するが、ユビキチンの他の立体構造形態への結合パートナーの結合には影響を与えない。更なる実施態様において、薬剤は、競合ＥＬＩＳＡアッセイの下、ＩＣ_５０が約４０ｎＭ未満（例えば、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１４ｎＭ未満、約１３ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満）で、ユビキチンの特定の立体構造形態への結合パートナーの結合と競合する。幾つかの実施態様において、ユビキチンに結合した薬剤は、一又は複数の結合パートナーの酵素活性、例えば、脱ユビキチン化酵素のＵＳＰファミリーの脱ユビキチン化酵素の酵素活性などを抑制する。

結果
全てのＤＵＢはユビキチンのβ１／β２領域に結合するが、幾つかの構造的ファミリーに分離可能であるので、一部のタイプのＤＵＢは、ユビキチンの別個の構造状態を認識し得ると仮定された。この問題に対処するために、入手可能な５６個の複合体中のユビキチンの高分解能結晶構造全てのペアワイズアラインメントを、少なくとも一方のパートナーを用いて行い、結果は、β１／β２の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）に基づいて結果をクラスター化された。クラスター解析は、β１−β２ループコンフォーメーションの明らかな「標本(smear)」を（図２Ａ）、ファミリー内に僅かな違いを有する、コンフォーメーションファミリーに分類する（図２Ｂ）。これらの原子の「スナップ写真」は、ユビキチンのβ１−β２ループは、サブ状態間の速い遷移に従って、各サブ状態間に適度なエネルギー障壁を有する、一連のサブ状態にアクセスすることを意味している^２８。最大のクラスター（クラスター１）は、β１−β２領域の「アップ」コンフォメーションを表し、ＵＣＨ型のＤＵＢとの複合体中の全てのユビキチン構造を含み、ＵＣＨは「アップ」コンフォメーションを結合することを示している（図２Ｃ−Ｄ）。これとは対照的に、クラスター２は「ダウン」β１−β２コンフォメーションを表し、これまでに結晶化した全てのＵＳＰ型ＤＵＢ−ユビキチンの複合体を含んでいる。注目すべきことに、ＵＣＨ型のＤＵＢは、典型的にはナノモル親和性でユビキチンを結合し、またＵＣＨ−結合状態はアポユビキチンとクラスター形成し、「アップ」状態が溶液中に優勢であることを示唆している。逆に、ＵＳＰ型のＤＵＢは、一般的に、ユビキチンに対するマイクロモルの高親和性を有し、ＵＳＰ−結合状態は、アポユビキチンの結晶構造中で観測されず、ナノ秒からマイクロ秒の時間スケールにわたる運動に感受性であるＮＭＲ測定によってのみ検出可能である。従って、「ダウン」状態は、溶液中で弱くにしか存在し得ない。「アップ」コンフォーメーション及び「ダウン」コンフォーメーションの比較は、ＤＵＢへの結合に影響を与え得る方法でβ１−β２からＣ末端に伝えられる長距離効果により、各状態の著しく異なるパッキングを明らかにしている。例えば、「ダウン」コンフォメーションは、Ｌｅｕ７１の方にＬｅｕ８を突きだし、ＵＳＰ型のＤＵＢの活性部位と相互作用するように配置するコンフォーメーションに向かって、レバーアームとしてＣ末端を押している（図２Ｅ）。計算ドッキングはまた、「アップ」又は「ダウン」のユビキチン立体構造異性体の何れかに対するＤＵＢの結合はが相互に排他的であることを示しており：ＵＣＨ−ファミリーの酵素は、「アップ」状態に結合するように配置され、一方ＵＳＰファミリーの脱ユビキチン化酵素は「ダウン」状態に結合する（図３０）。

Claims

野生型ユビキチンタンパク質に対して一又は複数のアミノ酸置換を含む立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
前記一又は複数のアミノ酸置換は、β１／β２ループが、プロテインデータバンクコード３ＮＨＥのＢ鎖の約１．６Å平均二乗偏差以内の領域に制限されるように、タンパク質のβ１／β２ループを安定化する、請求項１に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
タンパク質のβ１／β２ループ領域は、ＮＭＲのＲ_２分散によって測定される場合、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、より遅いコンフォーメーションダイナミックスを示す、請求項１又は２に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
β１／β２ループの周辺領域のマイクロ秒Ｒｅｘ値は、ＮＭＲのＲ_２分散によって測定される場合、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、最大４０倍大きい、請求項１から３の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
前記タンパク質は、位置がＡ１−Ａ７６（配列番号１）に対応する、Ａ７、Ａ８、Ａ１３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ６９、及びＡ７１からなる群から選択される位置にて、一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
（ａ）置換Ａ７（Ｃ）又は置換Ａ８（Ｃ）；及び（ｂ）置換Ａ６９（Ｃ）を含む、請求項５に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
Ａ１３（Ｎ、Ｒ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ａ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、又はＰ）、Ａ３４（Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｍ、又はＴ）、Ａ３６（Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｗ、Ｉ、Ｍ又はＮ）、及びＡ７１（Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｑ、Ｗ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｒ又はＧ）からなる群から選択される一又は複数の置換を更に含む、請求項６に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
Ａ７（Ｄ、Ｆ、Ｒ、又はＳ）、Ａ８（Ｙ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、又はＹ）、Ａ１３（Ｒ、Ｙ、Ｅ、又はＰ）、Ａ３４（Ｉ、Ｌ、又はＴ）、Ａ３６（Ｌ、Ｙ、Ａ、又はＮ）、Ａ６９（Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｋ、Ｙ、又はＩ）、及びＡ７１（Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｒ、又はＧ）からなる群から選択される一又は複数の置換を含む、請求項５に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
アミノ酸残基の位置が配列番号１の位置に対応する、Ａ４２、Ａ４６、Ａ４９、Ａ６２、Ａ６５、Ａ６８、又はＡ７０に位置する一又は複数のアミノ酸置換を更に含む、請求項５から８の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
アミノ酸残基の位置が配列番号１の位置に対応する、Ａ４０、Ａ４２、Ａ４６、Ａ４７、Ａ４９、Ａ６２、Ａ６５、Ａ６８、Ａ７０、Ａ７１、Ａ７２、Ａ７３、Ａ７４、Ａ７５、又はＡ７６に位置する一又は複数のアミノ酸置換を更に含む、請求項５から９の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）ファミリーの脱ユビキチン化酵素への結合の増加を示す、請求項１から１０の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、ナノモル領域でのＫｄで脱ユビキチン化酵素に結合する、請求項１から１１の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型タンパク質よりも少なくとも１０００倍高い親和性で脱ユビキチン化酵素に結合する、請求項１から１２の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、脱ユビキチン化酵素の活性を阻害する、請求項１から１３の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質は、野生型ユビキチンタンパク質と比較して、ユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）ファミリーの脱ユビキチン化酵素への結合の減少あるいは消失を示す、請求項１から１４の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質。
請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質をコードする核酸。
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
ベクターが発現ベクターである、請求項１７に記載のベクター。
請求項１６に記載の核酸分子又は請求項１７又は１８に記載のベクターを含む細胞。
細胞は、動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞。
動物細胞は、ヒト細胞又は非ヒト細胞である、請求項２０に記載の細胞。
請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質及びＵＳＰファミリーのメンバーの脱ユビキチン化酵素を含むタンパク質複合体。
脱ユビキチン化酵素がＵＳＰ７、ＵＳＰ５、又はＵＳＰ１４である、請求項２２に記載のタンパク質複合体。
脱ユビキチン化酵素がＵＳＰ７である、請求項２３に記載のタンパク質複合体。
請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質の一又は複数に共有結合で連結したタンパク質。
請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質を、表面上に固定化して含む固体支持体。
固体支持体は、表面プラズモン共鳴に適した表面である、請求項２６に記載の固体支持体。
固体支持体は、ナノ粒子、ビーズ、又はガラスである、請求項２６に記載の固体支持体。
細胞の表面上に発現された、請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質を含む細胞の集団。
請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質と脱ユビキチン化酵素を接触させることを含む、ＵＳＰファミリーの脱ユビキチン化酵素を阻害する方法。
阻害は、ヒトを除くインビボ又はインビトロである、請求項３０に記載の方法。
ａ）請求項１から１５の何れか一項に記載の立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質と薬剤を接触させること；及び
ｂ）薬剤が前記立体構造的に安定化されたユビキチンタンパク質に結合するかどうかを決定すること
を含む、ＵＳＰファミリーの脱ユビキチン化酵素への結合に好適であるユビキチンタンパク質の立体構造形態に結合する薬剤を同定する方法。
薬剤は、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３２に記載の方法。
ａ）請求項２２から２４の何れか一項に記載のタンパク質複合体と薬剤を接触させること；及び
ｂ）薬剤が前記タンパク質複合体に結合できるかどうかを決定すること
を含む、ＵＳＰファミリーの脱ユビキチン化酵素及びユビキチンを含むタンパク質複合体に結合する薬剤を同定する方法。
薬剤は、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
薬剤は脱ユビキチン化酵素とユビキチンタンパク質間の相互作用を破壊する、請求項３４に記載の方法。
請求項３２から３６の何れか一項に記載の方法により同定された薬剤。
野生型タンパク質と比較して、立体構造的に安定化された形態は、結合パートナーへの結合親和性が増加し又は結合パートナーの活性を調節する能力が増加している、タンパク質の立体構造的に安定化された形態をスクリーニングするための方法であって、
ａ）タンパク質の内部に配置される一又は複数の予め選択された位置で、立体構造的に動的タンパク質のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基と置換することによって産生された、タンパク質の変異型のライブラリーと結合パートナーとを接触させること；及び
ｂ）野生型タンパク質と比較して、結合パートナーへの結合、又は結合パートナーの活性を調整する能力の増加に基づいて、立体構造的に安定化された形態を同定することを含む方法。
予め選択された位置は、タンパク質内部又はタンパク質のある領域内のコンフォーメーションダイナミックスに対する各位置におけるアミノ酸残基の寄与に基づいて選択される、請求項３８に記載の方法。
前記ライブラリーは、タンパク質の前記変異型をコードする核酸のライブラリーである、請求項３８又は３９に記載の方法。
前記ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである、請求項４０に記載の方法。
ファージディスプレイライブラリーのためのベクターは、Ｍ１３バクテリオファージ、ｆ１ファージ、ｆｄファージ、Ｉｋｅファージ、Ｎ１ファージ、腸内細菌ファージＴ４、バクテリオファージＴ７、及び腸内細菌ファージλからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
一又は複数の表面アミノ酸残基を他のアミノ酸残基と置換することにより、同定された立体構造的に安定化されたタンパク質の表面で一又は複数のアミノ酸残基を変異させること、及び一又は複数の置換された表面アミノ酸残基を含まない立体構造的に安定化されたタンパク質と比較して、結合親和性又は調節能力が増加したタンパク質をスクリーニングすることを更に含む、請求項３８から４２の何れか一項に記載の方法。
タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、核ホルモン受容体、チロシンキナーゼ受容体、及びリガンド依存性イオンチャネルからなる群から選択される、請求項３８から４３の何れか一項に記載の方法。
タンパク質がユビキチンである、請求項３８から４４の何れか一項に記載の方法。
結合パートナーは、脱ユビキチン化酵素、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、Ｅ２ユビキチン結合酵素、Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ、及び細胞プロテアソーム複合体の一又は複数のメンバーからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
結合パートナーが脱ユビキチン化酵素である、請求項４６に記載の方法。
脱ユビキチン化酵素は脱ユビキチン化酵素のユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）ファミリーのメンバーである、請求項４７に記載の方法。
脱ユビキチン化酵素が、ＵＳＰ７、ＵＳＰ５、及びＵＳＰ１４からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
脱ユビキチン化酵素がＵＳＰ７である、請求項４９に記載の方法。