JP2015515280A - ブドウ球菌コアグラーゼ抗原およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は広くは、免疫学、微生物学、および病理学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細菌に対する免疫反応を引き出すために使用できる細菌コアグラーゼ変種が関与する方法および組成物に関する。
市中獲得型および病院獲得型の両感染の数は、血管内装置の使用増加とともにここ数年増えている。病院獲得型の(院内)感染は罹病率および死亡率の主な原因であり、より具体的には、米国では、病院獲得型の感染は毎年2百万人超の患者に影響を与えている。最も頻度が高い感染は、尿管感染(感染の33%)であり、次いで肺炎(15.5%)、外科手術部位感染(14.8%)および主要血流感染(13%)が続く(Emorl and Gaynes, 1993)。
(iv) (i)〜(iii)の任意のものと共に本明細書において記述される細菌タンパク質を任意の組み合わせまたは順列で投与する段階を含む、ブドウ球菌に対する防御的または治療的免疫反応を対象において刺激するための方法が含まれる。好ましい態様において、組成物はブドウ球菌ではない。ある特定の局面において、対象はヒトまたはウシである。さらなる局面において、組成物は薬学的に許容される処方物に処方される。ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌であることができる。
黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚および鼻孔にコロニー形成するグラム陽性微生物であり、皮膚および軟組織感染、菌血症、敗血症ならびに心内膜炎などの侵襲性疾患を引き起こす(Lowy 1998)。市中獲得型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(CA-MRSA)または院内獲得型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(HA-MRSA)と呼ばれる、抗生物質耐性株の出現は、手強い治療上の課題を提示する(Klevens 2008)。複数のワクチン開発の努力が開始されているが、FDA認可済みの黄色ブドウ球菌ワクチンは未だ利用可能にはなっていない (DeDent 2012)。
A. ブドウ球菌コアグラーゼ
コアグラーゼはブドウ球菌によって産生される酵素であり、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。CoaおよびvWhは、タンパク質分解なしでプロトロンビンを活性化する(Friedrich et al., 2003)。コアグラーゼ・プロトロンビン複合体はフィブリノゲンを特異的基質として認識し、フィブリノゲンを直接的にフィブリンへ変換する。活性複合体の結晶構造によって、D1およびD2ドメインのプロトロンビンとの結合ならびにそのIle1-Val2 N末端のIle16ポケットへの挿入、その結果、立体構造変化を通じた酵素前駆体における機能的な活性部位の誘導が明らかとなった(Friedrich et al., 2003)。α-トロンビンのエキソサイトI、フィブリノゲン認識部位、およびプロトロンビン上のプロエキソサイトIはCoaのD2によって遮断される(Friedrich et al., 2003)。それにもかかわらず、四量体(Coa・プロトロンビン)2複合体の結合により、高い親和性で新しい部位にてフィブリノゲンを結合する(Panizzi et al., 2006)。このモデルから、コアグラーゼによる凝固性および効率的なフィブリノゲン変換が説明される(Panizzi et al., 2006)。
黄色ブドウ球菌株はどれも、プロテインA、つまり細胞壁固定表面タンパク質産物(SpA)がE、D、A、BおよびCと命名された5つの高度に相同的な免疫グロブリン結合ドメインを包含するよく特徴付けられた病毒性因子に対する構造遺伝子(spa) (Jensen, 1958; Said-Salim et al., 2003)を発現する(Sjodahl, 1977)。これらのドメインはアミノ酸のレベルでおよそ80%の同一性を示し、長さが56〜61残基であり、縦列反復配列として組織化される(Uhlen et al., 1984)。SpAは、N末端YSIRK/GSシグナルペプチドおよびC末端LPXTGモチーフ選別シグナルを有する前駆体タンパク質として合成される(DeDent et al., 2008; Schneewind et al., 1992)。細胞壁固定プロテインAは、ブドウ球菌表面に非常に豊富に提示される(DeDent et al., 2007; Sjoquist et al., 1972)。その免疫グロブリン結合ドメインの各々が、3ヘリックスバンドルへ集合しかつ免疫グロブリンG (IgG)のFcドメインを結合する逆平行α-ヘリックス(Deisenhofer, 1981; Deisenhofer et al., 1978)、IgMのVH3重鎖(Fab) (すなわち、B細胞受容体) (Graille et al., 2000)、そのA1ドメインのフォンウィルブランド因子[vWF AIは血小板に対するリガンドである] (O'Seaghdha et al., 2006)、および気道上皮の表面に提示される(Gomez et al., 2004; Gomez et al., 2007)腫瘍壊死因子α (TNF-α)受容体I (TNFRI) (Gomez et al., 2006)から構成される。
プロテインAは、細菌細胞質中で前駆体として合成され、そのYSIRKシグナルペプチドを介して隔壁、すなわち、ブドウ球菌の細胞分裂隔壁の位置で分泌される (DeDent et al., 2007; DeDent et al., 2008)。C末端LPXTG選別シグナルの切断の後、プロテインAはソルターゼAによって細菌ペプチドグリカン架橋に固定される(Mazmanian et al., 1999; Schneewind et al., 1995; Mazmanian et al., 2000)。プロテインAは最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質である。この分子はほぼ全ての黄色ブドウ球菌株によって発現される(Cespedes et al., 2005; Kennedy et al., 2008; Said-Salim et al., 2003)。ブドウ球菌は分裂周期1回につきその細胞壁の15〜20%を代謝する(Navarre and Schneewind 1999)。ネズミヒドロラーゼはペプチドグリカンのグリカン鎖および壁ペプチドを切断し、それにより、付着されたC末端細胞壁二糖類テトラペプチドを有するプロテインAを細胞外培地へ放出する(Ton-That et al., 1999)。このように、生理学的デザインによって、プロテインAは細胞壁に固定もされ、細菌表面に提示もされるが、宿主感染の間に周辺組織中に放出もされる(Marraffini et al., 2006)。
過去数十年の間にわたる研究から、重要な病毒性因子として黄色ブドウ球菌外毒素、表面タンパク質および調節分子が特定された(Foster, 2005; Mazmanian et al., 2001; Novick, 2003)。これらの遺伝子の調節に関して相当な進歩が達成された。例えば、ブドウ球菌は、同族受容体に閾値濃度で結合し、それによってリン酸リレイ反応の活性化および外毒素遺伝子の多くの転写活性化を行う自己誘導性ペプチドの分泌を介して細菌個体数の調査を行う(Novick, 2003)。ブドウ球菌感染の発病はこれらの病毒性因子(分泌された外毒素、エキソ多糖類および表面付着因子)に依る。ブドウ球菌ワクチンの開発は、ブドウ球菌浸潤機構の多面性によって妨げられる。弱毒化生微生物は極めて効果的なワクチンであることが十分に確立されている。このようなワクチンによって誘発される免疫反応は多くの場合、複製しない免疫原によってもたらされる免疫反応よりも大きなものであり、長い作用時間のものである。これに対する一つの説明は、弱毒化生菌株が宿主において限定的な感染を樹立し、自然感染の初期段階を模倣するということでありうる。本発明の態様では、変種コアグラーゼポリペプチドおよびペプチド、特に1つまたは複数のコアグラーゼドメイン1〜2、ならびに感染に対しての軽減または免疫で用いるグラム陽性細菌の他の免疫原性細胞外タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド(分泌タンパク質またはペプチドも細胞表面タンパク質またはペプチドもともに含む)を含む、組成物および方法に関する。特定の態様において、細菌はブドウ球菌細菌である。細胞外タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドには、標的細菌の分泌タンパク質および細胞表面タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。
本発明は、本発明のさまざまな態様で用いるためのポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片について記述する。例えば、特定のポリペプチドを、免疫反応を誘発するかアッセイし、または免疫反応を誘発するために用いる。特定の態様において、本発明のタンパク質の全てまたは一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、Stewart and Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
ある特定の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドに関する。コアグラーゼ、コアグラーゼドメイン1〜2、SpA、および他の細菌タンパク質に対する核酸配列が含まれ、これらの全てが参照により組み入れられ、これらを用いてペプチドまたはポリペプチドを調製することができる。
本発明のポリペプチドは、ベクター中に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。「ベクター」という用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は「異種」であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞または核酸中の配列と同種であるが、しかし通常は見られない、宿主細胞または核酸内の位置にある配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス)、ならびに人工染色体(例えば、YAC)が含まれる。当業者は、標準的な組み換え技術(例えば、ともに参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 2001; Ausubel et al., 1996)を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っているであろう。1つもしくは複数のコアグラーゼドメイン1〜2またはそれらの変種をコードすることに加えて、ベクターは一つまたは複数の他の細菌ペプチド、タグまたは免疫原性増強ペプチドのような他のポリペプチド配列をコードしてもよい。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター(Inouye et al., 1985)、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断に向けたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質の作製で用いるpGEXベクターが含まれる。
「プロモーター」は制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいう「エンハンサー」とともに用いられても用いられなくてもよい。
特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。
本発明のある特定の態様において、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代の、その子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されよう。異種核酸配列を発現するという文脈において、「宿主細胞」とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができ、使用されている。宿主細胞は「形質移入」または「形質転換」されてもよく、それらは組み換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。
先に論じた組成物の少なくとも一部または全てを含む多数の発現系が存在する。原核生物および/または真核生物に基づく系を本発明で用いるために利用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くの系が市販されており、広く利用可能である。
本発明の免疫原性組成物は、PIA (PNAGとしても公知)の一つもしくは複数を含む莢膜多糖類、ならびに/または黄色ブドウ球菌V型および/もしくはVIII型莢膜多糖類、ならびに/または表皮ブドウ球菌I型および/もしくはII型および/もしくはIII型莢膜多糖類をさらに含むことができる。
現在では、PS/A、PIAおよびSAAとして同定されたブドウ球菌表面多糖類の各種形態は同じ化学的実体、つまりPNAGであることが明らかである(Maira-Litran et al., 2004)。それゆえ、PIAまたはPNAGという用語は、これらの全ての多糖類またはそれらに由来するオリゴ糖を包含する。
ヒトでの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌の大部分の菌株が5型または8型多糖類のいずれかを含む。およそ60%のヒト菌株が8型であり、およそ30%が5型である。5型および8型莢膜多糖類抗原の構造はMoreauら(1990)およびFournierら(1984)に記述されている。どちらもその反復単位の中にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに使用できるManNAcAとを有する。それらの構造は:
5型
→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
であり、最近(Jones, 2005)では、NMR分光法によってそれらの構造は、
5型
→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→
8型
→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→
に訂正されている。
一つの態様において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第6,294,177号に記述されている黄色ブドウ球菌336抗原を含む。336抗原は、β結合ヘキソサミンを含み、O-アセチル基を含まず、ATCC 55804の下で寄託された黄色ブドウ球菌336型に対する抗体と特異的に結合する。一つの態様において、336抗原は多糖類であり、これは天然のサイズのものであり、あるいは、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的処理によってサイジングされてもよい。本発明はまた、336抗原に由来するオリゴ糖を網羅する。336抗原は担体タンパク質に結合されなくてもまたは結合されてもよい。
ワクチン接種に多糖類を用いることに付随する問題の中には、多糖類それ自体が不十分な免疫原であるという事実がある。本発明において利用される多糖類を、傍観T細胞の助けをもたらすタンパク質担体に連結させて、免疫原性を改善することが好ましい。多糖類免疫原と結合されうるそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれDT、DT CRM 197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ならびにツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)、緑膿菌エキソプロテインA (rEPA)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のプロテインD、肺炎球菌溶血素またはこれらのうちのいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片には、Tヘルパーエピトープを包含する断片が含まれる。特に、インフルエンザ菌由来のプロテインD断片は、そのタンパク質のN末端側の3分の1を含むことが好ましいであろう。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり(EP 0 594 610 B1)、潜在的な免疫原である。さらに、ブドウ球菌タンパク質を本発明の多糖類結合体における担体タンパク質として用いることができる。
上記のように、本発明は、対象においてコアグラーゼまたは1つもしくは複数のコアグラーゼドメイン1〜2あるいはそれらの変種に対する免疫反応を惹起または誘導することに関係する。一つの態様において、免疫反応は、感染または関連する疾患、とりわけブドウ球菌に関連する疾患を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある対象を防御または処置することができる。本発明の免疫原性組成物の使い方の一つは、病院または感染のリスク増大を伴う他の環境において医療手当を受ける前に対象を予防接種することによって院内感染を予防することである。
本発明は、本発明の組成物により免疫反応が誘導または惹起されるかどうか、およびどの程度まで誘導または惹起されるかを評価するための血清学的アッセイ法の実施を含む。実施されうる多くのタイプの免疫アッセイ法が存在する。本発明により包含される免疫アッセイ法には、米国特許第4,367,110号に記述されているもの(二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ法)および米国特許第4,452,901号に記述されているもの(ウエスタンブロット)が含まれるが、これらに限定されることはない。他のアッセイ法には、インビトロおよびインビボの両方での、標識リガンドの免疫沈降および免疫細胞化学が含まれる。
上記の感染を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチド、ならびにこれらのポリペプチド、タンパク質および/またはペプチドに結合する抗体の使用に加え、本発明は、患者内であれ医療機器上であれ、同様に感染しうる感染症を診断するためのブドウ球菌の存在の検出を含む、種々の様式でのこれらのポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体の使用を企図する。本発明によれば、感染の存在を検出する好ましい方法は、個体から、例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から採取されたサンプルのような、一種または複数種のブドウ球菌種または菌株に感染していることが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルの単離に続き、本発明のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよび/または抗体を利用する診断アッセイ法を行ってブドウ球菌の存在を検出することができ、サンプル中でのそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技術は当業者に周知であり、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などの方法を含む。概して、本発明によれば、ブドウ球菌に感染していることが疑われるサンプルを本発明によるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗体またはモノクローナル抗体に加え、サンプル中の、ポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドに結合する抗体、または抗体に結合するポリペプチド、タンパク質および/もしくはペプチドによってブドウ球菌が示される、感染を診断する方法が企図される。
本発明のいくつかの態様において、タンパク質性組成物は対象に防御免疫を付与する。防御免疫とは、免疫反応が起こる作用因子を伴った特定の疾患または状態を対象が発症することを防ぐ特異的な免疫反応を開始する身体の能力をいう。免疫原性上有効な量は、対象に防御免疫を付与することができる。
本発明の方法は、ブドウ球菌病原菌によって引き起こされる疾患または状態の処置を含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブドウ球菌に罹患している者またはブドウ球菌に曝されていると疑われる者において免疫反応を誘導するために与えることができる。ブドウ球菌への曝露で陽性と判定された個体、または曝露の可能性に基づいて感染のリスクがあると思われる個体について、それらの方法を利用することができる。
A. ワクチン
本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、能動免疫と受動免疫の両方の態様で用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、免疫原性コアグラーゼ、もしくはその断片、またはそれらの変種、例えば1つまたは複数のコアグラーゼドメイン1〜2から調製することができる。他の態様において、コアグラーゼ、その断片、またはそれらの変種を他の分泌病毒性タンパク質、表面タンパク質またはその免疫原性断片と組み合わせて用いることができる。ある特定の局面において、抗原材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析され、および/または所望の媒体へのより容易な処方のために凍結乾燥される。
所与の組成物はその免疫原性が異なる場合がある。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することが必要になることが多く、これはペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングさせることにより達成することもできる。例示的なかつ好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA)である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として用いることもできる。ポリペプチドを担体タンパク質に抱合させるための手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル(maleimidobencoyl)-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化(bis-biazotized)ベンジジンを含む。
ポリペプチドまたはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫反応の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適当なアジュバントはサイトカイン、毒素または合成組成物などの、許容される全ての免疫刺激性化合物を含む。コアグラーゼおよび/もしくはその変種、例えば1つもしくは複数のコアグラーゼドメイン1〜2、または本明細書において企図されるその他任意の細菌タンパク質もしくは組み合わせに対する抗体反応を増強するために、いくつかのアジュバントを用いることができる。アジュバントは、(1) 抗原を体内に捕捉して持続放出を引き起こすこと; (2) 免疫反応に関わる細胞を投与部位に引き付けること; (3) 免疫系細胞の増殖もしくは活性化を誘導すること; または(4) 対象の体全体に抗原を広げるのを改善することができる。
ある特定の態様において、本発明は、核酸またはポリペプチド/ペプチドと結び付いた一つまたは複数の脂質を含む組成物に関する。脂質は水に不溶な、かつ有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書において具体的に記述するもの以外の化合物は、当業者により脂質と理解され、本発明の組成物および方法によって包含される。脂質成分および非脂質は、共有結合的または非共有結合的に、互いに付着されてもよい。
本発明の組成物および関連する方法、特に、コアグラーゼドメイン1〜2もしくはそれらの変種を含む、分泌病毒性因子もしくは表面タンパク質、および/または他の細菌ペプチドもしくはタンパク質の患者/対象への投与を従来の治療の施行と併せて用いることもできる。これらには、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、または抗生物質の各種組み合わせなどの抗生物質の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、薬学的組成物が対象に投与される。本発明の種々の局面では、対象に組成物の有効量を投与することを伴う。本発明のいくつかの態様において、ブドウ球菌抗原、Ess経路の成員、例えばEsaもしくはEsxクラスのポリペプチドもしくはペプチドなど、および/またはソルターゼ基質の成員を患者に投与して、一種または複数種のブドウ球菌病原菌を防御することができる。あるいは、一つまたは複数のそのようなポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターを、予防的処置として患者に与えることもできる。さらに、そのような化合物を抗生物質または抗菌薬と併せて投与することもできる。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水媒体中に溶解または分散される。
本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養細胞を含むが、これに限定されない、対象から取り出されたまたは対象の体外の細胞に対して行われる操作をいう。エクスビボ投与という用語は、インビトロにおいて操作されており、その後で、対象に投与される細胞をいう。インビボ投与という用語は、対象の体内で行われる全ての操作を含む。
本発明の別の局面は、レシピエントまたはドナーを本発明のワクチンで免疫する段階およびレシピエントまたはドナーから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法である。この方法によって調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる局面である。本発明の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、ブドウ球菌疾患の処置または予防のための薬物の製造において使用できる本発明のさらなる局面である。本発明の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含むブドウ球菌感染の処置または予防のための方法は、本発明のさらなる局面である。
黄色ブドウ球菌に対する防御免疫反応の決定基としてのコアグラーゼ
A. 結果
コアグラーゼドメインに対する抗体
黄色ブドウ球菌Newmanのコアグラーゼ遺伝子に由来するアフィニティ精製したHisタグ付Coa(CoaNM)でウサギを免疫した。ELISAにより抗血清を試験し、抗原に対する血清IgG抗体反応を明らかにした(図1A〜1B)。特定のサブドメインに対する抗体反応を分析するために、アフィニティ精製した組換えタンパク質(D1Coa、D2Coa、D12Coa、LCoaおよびCTCoa)をELISAに供した(図1B)。免疫血清は、試験したドメインそれぞれに対する抗体を持っていた(図1B)。注目すべきことに、LCoaに対する抗体は、反復ドメイン(CTCoa)を認識する抗体より豊富であった(LCoa vs. CTCoa、P<0.05)。D12Coaに対する抗体は、反復ドメインを認識する抗体より豊富であったが、この差異は統計学的に有意なものではなかった(D12Coa vs. CTCoa、P=0.066)。抗血清における抗体の生物学的機能を探るために、発明者らは、さまざまな量のアフィニティ精製したCoaNM抗体を用いて、D12Coaのヒトプロトロンビンとの結合またはCTCoaのフィブリノゲンとの結合を撹乱した(図1C)。発明者らは、120 nMのα-Coa IgGがプロトロンビンへのD12Coa結合をブロックするのに対し、1.7μMのα-Coa IgGがCTCoaのフィブリノゲンとの結合をブロックすることを算出した(図1C)。
ヒト感染者から単離した他の株の凝固をブロックするα-CoaNMの能力を調べるために、未処置マウスからのクエン酸処理したサンプルに抗原特異的IgGを添加し、続いて、黄色ブドウ球菌85/2082(CC8)、MW2(CC1)、MSSA476(CC1)、N315(CC5)、Mu50(CC5)、MRSA252(CC30)、CowanI(CC30)、WIS(CC45)およびSUA600(CC45)を接種した(表4)。CoaNM特異的IgGは、黄色ブドウ球菌Newman(CC8)、85/2082(CC8)およびMW2(CC1)の凝固を遅延させたが、MSSA476(CC1)、N315(CC5)、Mu50(CC1)、MRSA252(CC30)、Cowan(CC3)、WIS(CC45)およびUSA600(CC45)の凝固は遅延させなかった(表4)。これらの結果は、CoaNMに対する抗体は同じCC型(またはCoa型)由来の黄色ブドウ球菌株の凝固を妨げるだけでなく、他の型由来の株(MW2およびMSSA476)の凝固も妨げうることを示唆した。同じMLST(またはCoa型)の株がCoaNMに対する抗体による凝固について影響されなかったことから、観察された交差防御のパターンは普遍的なものではない。型特異的かつ交差防御的な阻害の一般性を調べるために、Coa85/2082、CoaMW2、CoaN315、CoaMRSA252およびCoaWISを精製し、ウサギ抗血清を作製した(表4)。Coa85/2082特異的IgGは黄色ブドウ球菌Newman(CC8)および85/2082(CC8)の凝固を阻害し、それより低い程度で、N315(CC5)およびMu50(CC5)の凝固を阻害した。CoaN315に対する抗体は、黄色ブドウ球菌N315(CC5)、Mu50(CC5)、Newman(CC8)および85/2802(CC8)ならびにMRSA252(CC30)の凝固を阻害したが、これらの抗体は、黄色ブドウ球菌CowanI(もう一方のCC30分離株)またはCC1株およびCC45株の凝固には影響を与えなかった。CoaMRSA252に対する抗体は、黄色ブドウ球菌CC1株およびCC5株の凝固を阻害したが、CC30またはCC45分離株の凝固には影響を与えなかった。CC45分離株(WIS)に対する抗体は、黄色ブドウ球菌CC1株の凝固を阻害したが、CC1、CC5、CC30またはCC45株の凝固に影響を与えなかった。まとめると、黄色ブドウ球菌株によるマウス血液の凝固は、対応するCoa(CC8、CC5、CC1およびCC30 分離株)に対して産生された抗体により常に阻害された。凝固の交差中和は、CC8株由来の2つのコアグラーゼに対する抗体、およびCC1株およびCC5株のコアグラーゼのうちそれぞれ1つで観察される。最後にCC1、CC5、CC8、CC30およびCC45株由来のCoaに対する抗体は、黄色ブドウ球菌CC45株またはCowanI(CC30)の凝固を中和しなかった。発明者らは、これらの分離株における血液凝固は別の因子、例えばvWbpに依存している可能性があると推定する(下記参照)。
精製したCoaNM、D12CoaまたはCTCoaを乳化し、プライムブースターレジメンに従ってBALB/cマウス(n=10)に注入した。モック(PBS)またはCoaNM、D12CoaおよびCTCoaで免疫した動物の血清を、抗原に対するIgG反応についてELISAにより調べ、対照マウス以外のワクチン接種した動物における特異的免疫反応を明らかにした(図2A〜2B)。注目すべきことに、CoaNMによるマウスの免疫はD12Coaに対する抗体を主に産生し、それより少ない程度で、CTCoaに対する抗体を産生した(図2A)。D12Coa免疫は、全長CoaNMと反応する高力価の抗体を産生した(図26A)。これに対し、CTCoa免疫は弱い抗体反応を生じた(図2A)。黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内注入によりマウスを攻撃し、10日間の観察期間を使って、致死的敗血症に対する防御を評価した(図2B)。モック免疫した動物と比較して、CoaNM、D12CoaまたはCTCoaによるワクチン接種は、死亡までの時間を増大させた(CoaNM vs. PBS、P<0.001;D12Coa vs. PBS、P<0.01;CTCoa vs. PBS、P<0.05)。CoaNMに対する免疫反応は、黄色ブドウ球菌の致死的攻撃に対して防御を生じさせるという点ではD12CoaまたはCTCoaのいずれかによるワクチン接種より有意に優れてはいなかった(CoaNM vs. CTCoa、P>0.05;D12Coa vs. CTCoa、P>0.05)。
黄色ブドウ球菌Newmanのvwb遺伝子に由来するアフィニティ精製したHisタグ付vWbp(vWbpNM)でラットを免疫した。抗血清をELISAにより調べ、抗原に対する血清IgG抗体反応を明らかにした(図3A〜3B)。特定のサブドメインに対する抗体反応を分析するために、アフィニティ精製したD1vWbp、D2vWbp、D12vWbp、LvWbpおよびCTvWbpをELISAに供した(図3B)。抗血清は試験したサブドメインそれぞれに対する抗体を持っていた(図3B)。注目すべきことに、D1vWbpに対する抗体およびD2vWbpに対する抗体は、これら2つのドメインを一緒に認識する抗体(D12vWbp)よりも量が少なかった。D12vWbpに対する免疫反応と比較すると、CTvWbpに対する抗体は30%少なかった(D12vWbp vs. CTvWbp、P>0.05)。抗血清中の抗体の生物学的機能を探るために、発明者らは、さまざまな量のvWbpNM特異的IgGを用いて、D12vWbpのヒトプロトロンビンとの結合およびCTvWbpのフィブリノゲンとの結合を撹乱した(図3C〜3D)。発明者らは、1.3μMのα-vWbp IgGがプロトロンビンへのD12vWbpの結合をブロックし、これに対し、1.3μMのα-vWbp IgGがCTvWbpのフィブリノゲンとの結合をブロックすることを算出した(図3D)。
精製したvWbpNM、D12vWbpまたはCTvWbpを乳化し、プライムブースターレジメンに従ってBALB/cマウス(n=10)に注入した。モック(PBS)またはvWbpNM、D12vWbpおよびCTvWbpで免疫した動物の血清を、抗原に対するIgG反応についてELISAにより調べ、対照マウス以外のワクチン接種した動物における特異的免疫反応を明らかにした(図4A〜4B)。注目すべきことに、vWbpNMによるマウスの免疫はD12vWbpに対する抗体を主に産生し、それより少ない程度で、CTvWbpに対する抗体を産生した(図4A)。D12vWbp免疫は、全長vWbpNMと反応する高力価の抗体を産生した(図4A)。これに対し、CTvWbp免疫は弱い抗体反応を生じた(図28A)。黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内注入によりマウスを攻撃し、10日間の観察期間を使って、致死的敗血症に対する防御を評価した(図4B)。モック免疫した動物と比較して、vWbpNM、D12vWbpまたはCTvWbpによるワクチン接種は、死亡までの時間を増大させた(vWbpNM vs. PBS、P<0.01;D12vWbp vs. PBS、P<0.05;CTvWbp vs. PBS、P<0.05)。vWbpNMに対する免疫反応は、黄色ブドウ球菌の致死的攻撃に対して防御を生じさせるという点ではD12vWbpによるワクチン接種より有意に優れていたが、CTvWbpによるワクチン接種よりは有意に優れてはいなかった(vWbpNM vs. D12vWbp、P<0.05;vWbpNM vs. CTvWbp、P>0.05)(図4B)。
精製した組換えCoaNMおよびvWbpNMを乳化し、プライムブースター免疫レジメンに従ってBALB/cマウス(n=10)に注入した。モック(PBS)およびCoaNM/vWbpNMで免疫した動物の血清を、CoaNMならびにvWbpNMに対するIgG反応についてELISAにより調べ、対照マウス以外のワクチン接種したマウスにおける抗原特異的免疫反応を明らかにした (図5A)。黄色ブドウ球菌によるマウスの静脈内注入および10日間の観察期間を使って、さまざまな株による致死的攻撃に対するワクチン防御を評価した(図5)。対照として、CoaNM/vWbpNM免疫は黄色ブドウ球菌Newman(CC8) (Cheng 2010)(データは示さず)およびUSA300(CC8)に対して防御を生じたが、MW2(CC1)またはN315(CC5)に対しては生じなかった(図5B〜5D)。それにもかかわらず、CoaNM/vWbpNM免疫は、黄色ブドウ球菌CowanI(CC30)およびWIS(CC45)による攻撃に対して防御を生じた。総合するとこれらのデータは、CoaNM/vWbpNMワクチンが、全てではないがいくつかのコアグラーゼ型の菌株に対して型特異的免疫ならびに交差防御をもたらしたことを示す(図5E〜5F)。
設計したポリペプチドCoa4は、N末端His6タグおよびC末端STREPタグに加えて、CoaMRSA252、CoaMW2、CoaN315のD12ドメインおよび全長CoaUSA300を持つ(図6A)。StrepTactin-セファロースによるアフィニティクロマトグラフィにより、Coa4を精製した(図6B)。アフィニティ精製したCoa4は、クマシー染色したSDS-PAGEにより分析したところ、190kDaのポリペプチドであることが明らかになった(図30B)。Coa4は、北米の患者に由来する最も頻度の高いコアグラーゼ型黄色ブドウ球菌分離株(CC1、CC5、CC8、CC30、CC45)由来のD12ドメインを包含する(DeLeo 2010)。vWbp2ポリペプチドは、N末端His6タグおよびC末端STREPタグに加えて、vWbpN315のD12ドメインおよび全長vWbpUSA300を包含する(図6A)。アフィニティクロマトグラフィによりvWbp2を精製し、クマシー染色SDS-PAGE上で85 kDaの予想質量に泳動するポリペプチドを得た(図6B)。マウス(n=5)をCoaNM/vWbpNMまたはCoa4/vWbp2のプライムブースターレジメンにより免疫し、さまざまなコアグラーゼおよびフォンウィルブランド因子結合タンパク質型に対する免疫反応をELISAにより調べた(図6C〜6D)。CoaNM/vWbpNMワクチンはマウスにおいて、CC8株由来のコアグラーゼに結合する抗体を産生させたが、CoaN315、CoaMRSA252、CoaMW2またはCoaWISに対する公差反応はほとんど示さなかった。これに対して、Coa4免疫は、CC8型コアグラーゼのみならず、CC1、CC5、CC30およびCC45株由来のコアグラーゼに対しても高い力価を有する抗体を産生させた。vWbpNMと比較して、vWbp2はCC5およびCC8型のvWbpに対して高い力価を有する抗体を産生させた(図6D)。
精製した組換えCoa4/vWbp2を乳化し、プライムブースター免疫レジメンを用いてBALB/cマウス(n=10)に注入した。モック(PBS)およびCoa4/vWbp2で免疫した動物の血清を、Coa4ならびにvWbp2に対するIgG反応についてELISAにより調べ、対照マウス以外のワクチン接種したマウスにおける抗原特異的免疫反応を明らかにした (図7A)。黄色ブドウ球菌によるマウスの静脈内注入および10日間の観察期間を使って、さまざまな株による致死的攻撃に対するワクチン防御を評価した(図7)。予想されたように、Coa4/vWbp2免疫は黄色ブドウ球菌CC8株USA300に対して防御を生じた(Cheng 2010)。CoaNM/vWbpNM免疫と同様に、Coa4/vWbp2ワクチンは、黄色ブドウ球菌CowanI(CC30)およびWIS(CC45)の攻撃に対しても防御を生じた。CoaNM/vWbpNMとは異なり、Coa4/vWbp2は、黄色ブドウ球菌N315(CC5) またはMW2(CC1) のいずれかによる致死的攻撃に対してマウスを保護した(図7B〜7D)。総合するとこれらのデータは、CoaNM/vWbpNMワクチンが、全てではないがいくつかのコアグラーゼ型の菌株に対して型特異的免疫ならびに交差防御をもたらしたことを示す(図7E〜7F)。さらに、Coa4/vWbp2ワクチンは、ブドウ球菌疾患を有する北米の患者から単離された関連する黄色ブドウ球菌CC型による攻撃に対して動物を保護した。
細菌の菌株および培養物の増殖
黄色ブドウ球菌株を37℃でトリプトソイ寒天上またはブロスにて培養した。大腸菌株DH5αおよびBL21 (DE3) を37℃でLuria Bertani寒天上またはブロスにて培養した。pET15bおよびpGEX2tkの選択のために、アンピシリン(100μg/ml)を用いた。ブドウ球菌DNA増幅に用いたプライマーは表6に見られる。
ハイブリッドタンパク質を作製するために、USA300株由来のcoaおよびvwbをPCR増幅した。5'プライマーに、ベクター(pET15b)上に挿入するための制限部位(NcoI)ならびにあとで使用するためのさらなる制限酵素(AvrII)を含めた。3'プライマーにベクター挿入のための制限部位(BamHI)を含めた。挿入断片は大腸菌DH5α株にクローニングされた。後続のクローニング回それぞれにおいて、次の対立遺伝子のD12をベクターの前回の挿入断片の5'に追加した。それぞれの場合において、5'プライマーに、ベクター部位(NcoI)および後で使用するためのさらなる制限酵素部位を含めた。各後続の挿入用の3'プライマーに、前回の挿入用の5'プライマー中に含まれる制限部位(N315のAvrII)を含めた。プロモーター領域およびHisタグは、後続のクローニング回において回復され、C末端STREPタブは別のクローニング回で付加された。ベクター全体を配列決定して、DNA配列の質を検証した。最後に、タンパク質の発現および精製のために、各ベクターを大腸菌BL21株に形質転換した。
黄色ブドウ球菌Newman由来のcoa;黄色ブドウ球菌株Newman、USA3000およびN315由来のvwb;またはcoaおよびvwbのサブドメインを含有する発現ベクター;ならびにハイブリッドタンパク質Coa4およびvWbp2用の遺伝子配列を含有する発現ベクターを持つ大腸菌BL21(DE3)を37℃で増殖させ、室温で一晩100 mM IPTGで誘導した。Coaの精製時に分解するために、大腸菌DH5α中のpGEX2tk発現ベクターを用いて、GSTタグ付構築物としてUSA300、N315、MW2、MRSA252、85/2082およびWIS由来のcoaを発現させた。誘導の3時間後、細胞を7,000×gで遠心し、1×カラム緩衝液(0.1 M Tris-HCl、pH 7.5、0.5 M NaCl)に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機(French pressure cell)で14,000 lb/in2で溶解した。溶解物を40,000×gで30分間超遠心に供した。pET15b構築物の上清をNi-NTAクロマトグラフィに供し、カラム緩衝液および10 mMイミダゾールで洗い、500 mMイミダゾールで溶出した。strepタグ付タンパク質に関して、溶解物上清をStrepTactinセファロース(GE Healthcare)で覆ったクロマトグラフィに供し、1×strep洗浄緩衝液(0.1 M Tris-HCl、pH 8、0.150 M NaCl、0.1 M EDTA)で洗い、2.5 mMのデスチオビオチンを含有する1×strep洗浄緩衝液で溶出した。GSTタグ付タンパク質に関して、除去処理した溶解物の上清をグルタチオン-セファロースクロマトグラフィに供した。GSTタグを除去するために、カラム緩衝液による洗浄後、カラム緩衝液を10 mM DTTを含有するPreScissionプロテアーゼ切断緩衝液に切り替え、カラムをPreScissionプロテアーゼ(GE Healthcare)と共にGEにより提供されたユニット定義で一晩インキュベートした。次いで、GSTタグを欠く遊離タンパク質をさらなるプロテアーゼ切断緩衝液により回収した。溶出液をPBSに対して透析した。内毒素を除去するために、1:100 Triton-X114を添加し、溶液を10分間冷却し、37℃で10分間インキュベートし、13,000×gで遠心した。これを2回繰り返した。上清をHiTrap脱塩カラム上にロードし、Triton-X114のレムナントを除去した。
BCAキット(Pierce)を用いてタンパク質濃度を決定した。SDS-PAGE解析およびクマシーブリリアントブルー染色により純度を検証した。6ヶ月齢New-Zealandホワイト雌のウサギを、初回免疫用にCFA(Difco)中で、あるいは24日目および48日目の追加免疫用にIFA中で乳化した500μgタンパク質で免疫した。60日目に、ウサギを失血させ、免疫ブロッティング実験または受動伝達実験用に血清を回収した。抗体精製のために、組換えHis6-Coa、His6-vWbpまたはHis6-C1fA(5 mg)をHiTrap NHS活性化HPカラム(GE Healthcare)に共有結合した。次いで、10〜20 mLのウサギ血清のアフィニティクロマトグラフィのために、この抗原マトリクスを4℃で用いた。チャージしたマトリクスを50カラム量のPBSで洗い、抗体を溶出緩衝液(1 Mグリシン pH2.5、0.5 M NaCl)で溶出し、直ぐに1 M Tris-HCl(pH8.5)で中和した。精製した抗体をPBS、0.5 M NaClに対して4℃で一晩透析した。
ブドウ球菌株の終夜培養の培養物を新鮮TSB中に1:100希釈し、37℃でOD600 0.4に到達するまで増殖させた。1 mLの培養物を遠心し、ブドウ球菌を洗浄し、1 mLの滅菌PBS中に懸濁し、1×108 CFU/mLの懸濁物を作製した。未処置のBALB/cマウスの全血を集め、最終濃度1%(w/v)までクエン酸ナトリウムを加えた。抗体存在下での細菌の血液凝固活性を評価するために、10μLの保存細菌培養物を、30μMの抗Coaおよび抗vWbp混合物を含有する10μLのPBSと滅菌プラスティック試験管(BD Falcon)内で混合し、15分間インキュベートした。各試験管に、1×107 CFU/mLの最終濃度を達成するように80μLの抗凝固マウス血液を滅菌プラスティック試験管(BD falcon)中に。試験管を37℃でインキュベートし、指定時間間隔で45°の角度に試験管を傾けることにより、血液凝固を検証した。ヒト血液実験に関して、同意を得た個体から10 mLの血液を失血させ、1%(w/v)の最終濃度にクエン酸ナトリウムで処理した。次いで、血液を上記のように試験した。全ての実験は少なくとも2回の独立した実験において繰り返された。
3週齢BALB/cマウス(n=10)に、60μL不完全フロイントアジュバント、および40μLの完全フロイントアジュバント中で乳化した50μgタンパク質を注入した。ワクチン接種後11日目に、それぞれ100μL不完全フロイントアジュバント中で乳化した50μgタンパク質でこれらのマウスを追加免疫した。21日目に、最大半量の力価を決定するために、マウスをケタミン/キシラジンにより麻酔し、マイクロヘマトクリット毛細管(Fisher)を用いる後眼窩出血により、Zゲルマイクロ管(Sarstedt)中に血液を集めた。管を10,000×gで3分間遠心し、血清を集めた。最大半量の抗体力価を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により測定した。
注入の6時間前に、6週齢BALB/cマウス(n=10)に、CoaもしくはvWbpの全長またはサブドメイン構築物に対するアフィニティ精製した抗体またはV10のものに対するアフィニティ精製した抗体(LcrVペスト抗原に特異的な対照IgG)を5 mg/kg体重の用量で腹腔内注入した。
ブドウ球菌株の終夜培養の培養物を新鮮なTSBに1:100希釈し、0.4のOD600に到達するまで増殖させた。細菌を7,000×gで遠心し、洗浄し、10分の1量のPBS中に懸濁した。6週齢雌のBALB/cマウス(n=15) (Charles River)に、100μLのPBS中の 1×108 CFU(黄色ブドウ球菌Newman、N315、CowanIおよびWIS)、5×107 CFU(黄色ブドウ球菌USA300)、または2×108 CFU(黄色ブドウ球菌MW2)懸濁液を後眼窩注入した。10日間にわたって、マウスを生存についてモニターした。
黄色ブドウ球菌株を、洗浄後に敗血症と比べて対数が1少ないCFUとなるような量で細菌ペレット再懸濁した以外は敗血症について記載したのと同様に、調製した。感染後5日目の腎組織におけるブドウ球菌負荷を数え上げるために、CO2窒息によりマウスを安楽死させ、剖検時に腎臓を取り出した。マウス1匹につき1個の腎臓をPBS、1%Triton X-100中でホモジナイズした。ホモジネートの連続希釈物をTSA上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートした。組織中の細菌負荷を、独立両側スチューデントt検定を用いた野生株と変異株間の対比較で解析した。組織病理について、もう一方の腎臓を室温で24時間10%ホルマリン中に固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡により検査して器官毎の病変部を数え上げた。独立両側スチューデントt検定を用いた野生株と変異株間の対比較でデータを解析した。
5×10-8 Mプロトロンビン(Innovative Research)を等モル量の機能的Coaと共に室温で10分間プレインキュベートし、続いて、100μL PBSの総反応緩衝液において1 mMの最終濃度までS-2238(発色基質)を添加した。吸光度の変化を分光光度計で450 nmにて10分間測定し、時間に応じてプロットし、線形曲線に適合させた。曲線の傾き(dA/dt)を、S-2238加水分解の速度であり、よって酵素機能を反映するものであると解釈した。5×10-9 Mで添加したポリクローナル抗体の存在下でアッセイを繰り返し、データを阻害無しの平均活性に基準化した。全ての実験を3回繰り返して行った。
精製した組換えCoaまたはvWbp(100 nM)を1%クエン酸ナトリウム/PBS中でヒトプロトロンビン(Innovative Research)と混合した。初回読み取り後に、フィブリノゲン(3μM) (Sigma)を添加し、フィブリノゲンのフィブリンへの変換をプレートリーダー(BioTek)における450 nmでの濁度の増加として2.5分間隔で測定した。対照として、ヒトα-トロンビン(Innovative Research)またはプロトロンビン単独での酵素活性を測定した。
MRSA252株由来のCoaのD1〜2ドメイン:
MW2株由来のCoaのD1〜2ドメイン:
WIS株由来のCoaのD1〜2ドメイン:
N315株由来のCoaのD1〜2ドメイン:
USA300株由来のCoaのD1〜2ドメイン:
Claims (37)
- 少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含む免疫原性組成物であって、該ドメイン1〜2が、配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)または配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)のドメイン1〜2に対して80%の配列同一性を有し、かつ少なくとも1つのドメイン1〜2が、全長より短いコアグラーゼタンパク質に含まれる、前記免疫原性組成物。
- 前記全長より短いコアグラーゼタンパク質が、LまたはRドメインセグメントの全てまたは一部を欠いている、請求項1記載の組成物。
- 前記全長より短いコアグラーゼタンパク質が、LまたはFドメインセグメントの全てまたは一部を欠いている、請求項1記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つが、黄色ブドウ球菌Newman、85/2082、MW2、MSSA476、N315、Mu50、MRSA252、CowanI、WISまたはUSA300菌株に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つが、配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)で特定されるSEQ ID NOに対して少なくとも80%の配列同一性を有するCoaドメイン1〜2である、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つが、配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)で特定されるSEQ ID NOに対して少なくとも80%の配列同一性を有するvWbpドメイン1〜2である、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2が、配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)または配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%または95%の同一性を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つが、黄色ブドウ球菌N315またはUSA300由来のvWbpドメイン1〜2である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つがCoaドメイン1〜2であり、かつブドウ球菌Coaタンパク質由来のLまたはRドメインを含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 前記ドメイン1〜2の1つがvWbpドメイン1〜2であり、かつブドウ球菌vWbpタンパク質由来のLまたはFgbドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
- 少なくとも3つ、4つまたは5つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
- 少なくとも4つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含み、該異なるドメイン1〜2が菌株MRSA252、MW2、N315およびUSA300に由来するブドウ球菌Coaドメイン1〜2である、請求項11記載の組成物。
- 前記少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2が融合タンパク質に含まれる、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
- 1つまたは複数の追加のブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の組成物。
- 前記追加のブドウ球菌抗原が、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfB、SasFおよび/または 毒素非産生性SpAである、請求項14記載の組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の組成物。
- 少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含む組換えポリペプチドであって、該ドメイン1〜2の配列が、配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)または配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)のSEQ ID NOに対して少なくとも80%の配列同一性を有する、前記組換えポリペプチド。
- 請求項17記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
- 発現制御配列に機能的に連結された請求項17記載の組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
- 請求項19記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物、請求項17記載の組換えポリペプチドまたは請求項19記載の発現ベクターの有効量を投与する段階を含む、対象においてブドウ球菌感染を処置または予防するための方法。
- 前記対象がヒトである、請求項21記載の方法。
- 前記対象が、ブドウ球菌感染に関する検査に基づいて処置される、請求項21または22記載の方法。
- 前記組成物または前記ポリペプチドが複数回投与される、請求項21〜23のいずれか一項記載の方法。
- 前記組成物または前記ポリペプチドが、静脈内に、筋肉内に、血管内に、気管内に、髄腔内に、眼内に、腹腔内に、局所的に、経口的に、注射により、注入により、またはボーラスにより投与される、請求項21〜24のいずれか一項記載の方法。
- 前記組成物または前記ポリペプチドが、液体中に、固体として、ゲルとして、錠剤として、丸剤として、半固体として、クリームとして、軟膏として、膣座剤として、座剤として投与される、請求項21〜25のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の抗生物質を対象に投与する段階をさらに含む、請求項21〜26のいずれか一項記載の方法。
- 前記感染が薬剤耐性感染である、請求項21〜27のいずれか一項記載の方法。
- 前記薬剤耐性感染がメチシリン耐性である、請求項28記載の方法。
- ブドウ球菌感染を有していると前記対象を同定する段階をさらに含む、請求項21〜29のいずれか一項記載の方法。
- 患者が、ブドウ球菌感染を有していると判定されてから1週間以内に前記組成物または前記ポリペプチドを投与される、請求項21〜30のいずれか一項記載の方法。
- 前記対象が、免疫欠損であるか、免疫不全であるか、入院しているか、侵襲的な医療手技を受けているか、呼吸器感染を有しているか、インフルエンザウイルスに感染しているか、または人工呼吸器を付けている、請求項21〜31のいずれか一項記載の方法。
- 前記組成物または前記ポリペプチドに対する反応について前記対象を検査する段階をさらに含む、請求項21〜32のいずれか一項記載の方法。
- 対象が皮膚膿瘍、おでき、またはせつを呈する、請求項21〜32のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を混合する段階を含む、免疫原性組成物を製造する方法であって、該ドメイン1〜2の配列が、配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)または配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)のドメイン1〜2の配列に対して80%の同一性を有し、かつ少なくとも1つのドメイン1〜2が、全長より短いコアグラーゼタンパク質に含まれる、前記方法。
- 配列一覧1(SEQ ID NO: 33〜37)または配列一覧2(SEQ ID NO: 38〜41)のSEQ ID NOに対して少なくとも80%の配列同一性を有する少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含む、ブドウ球菌感染を処置または予防するのに使用するための組成物であって、少なくとも1つのドメイン1〜2が全長より短いコアグラーゼタンパク質に含まれる、前記組成物。
- ブドウ球菌Coaタンパク質またはvWbpタンパク質由来の少なくとも2つの異なるブドウ球菌コアグラーゼドメイン1〜2を含む免疫原性組成物であって、少なくとも1つのドメイン1〜2が全長より短いコアグラーゼタンパク質に含まれる、前記免疫原性組成物。
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