JP2015502199A - 注射可能なシルクフィブロイン粒子およびその使用 - Google Patents

注射可能なシルクフィブロイン粒子およびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に提供される発明は、対象の組織を修復または増強するための組成物、方法、送達デバイスおよびキットに関する。本明細書に記載される組成物は、それらを処置したい組織に最小の侵襲性の手順で（例えば、注射によって）設置でき、かつ／または任意の形状および／もしくはサイズの組織の空隙に柔軟にモールドできるように、注射可能である。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子を含み、これは暫くの間、組織内でその当初の容量を保持することができる。組成物は、例えば組織の修復および／もしくは増強のために、組織の空隙を置換するための充填材として、または組織の再生および／もしくは再建を支持するためのスキャホールドとして、使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、軟部組織の修復または増強に使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C §119(e)の下で、2011年11月9日に出願された米国仮出願第61/557,603号の恩典を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
政府による支援
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された助成金第EB002520号および米国陸軍によって授与された同第W81XWH-08-2-0032号の下で政府の支援を受けてなされたものである。
本開示の技術分野
本明細書に提供される発明は、概ね、例えば軟部組織の修復、増強および／または再建における、生物医学的適用のための、シルクフィブロインベースの材料に関する。
背景
外傷、外科的切除または先天的な欠損による軟部組織の欠損の回復は、長い時間枠の中で組織のサイズおよび形状をほぼ正常時の寸法で維持する戦略によって開始されるべきである。現在の臨床戦略は、遊離脂肪の移動および人工充填材を含む。乳房切除術を受けた乳癌患者の場合、生理食塩水またはシリコーンで満たされたシリコーンシェルが、空隙を置換するために使用される。これは、患者に不自然な見た目と印象および被膜拘縮の危険を与え、修正手術が必要になる。脂肪グラフトおよび人工充填材の選択肢は、時間と共に容量を保持できなくなるものである。したがって、脂肪グラフトおよび人工充填材の選択肢は、第2の手術部位を必要とし得、無血管性壊死を生じ得、そして通常、元の組織を再生しない。
ウシおよびヒトのコラーゲンは、軟部組織の増強および充填のための注射可能な材料として広く使用されている。動物の身体の主要な細胞外構造タンパク質であるコラーゲンは、結合組織、例えば皮膚、腱、軟骨および骨、を置換または増強するための移植材として使用されている。加えて、コラーゲンは、長年にわたり、美容目的でヒトの体内に注射または移植されている。しかし、軟部組織の増強および／または充填におけるコラーゲンの使用は費用がかかり、かつ効果が長続きぜず、例えば、その結果はしばしば約3ヶ月間しか続かない。
ヒアルロン酸（HA）は、ヒトの体内で生来的に見られる、結合、表皮および神経組織を通じて広く分布しているグリコサミノグリカンである。非架橋ヒアルロン酸の組成物は、注射後数ヶ月のうちに分解する傾向があり、したがって、それらの軟部組織増強効果の維持のためにかなり頻繁な注射が必要になる。より最近になって、架橋ヒアルロン酸の組成物が軟部組織の増強のために使用されるようになった。しかし、そのような架橋組成物は、ゲル中に懸濁された、各々およそ2mm付近の非常に大きなヒアルロン酸の粒子を含んでいる。粒子が大きければ効果がより長く持続し得るが、粒子サイズが大きければその注射はより困難になり、レシピエントに不快な体験をさせることになり得る。
要約すると、軟部組織の再生、修復および／または増強における現在の戦略の主な欠点は、大きな組織の欠損にグラフトするために多量の組織が必要になること；ドナー部位の罹患、第2の外科部位、無血管性壊死の可能性；スキャホールドの形状および／またはサイズが経時的に失われること；ネイティブ組織との物質的不適合；ならびに組織再生の不良、を含む。したがって、最小の侵襲性の手順で施行することができ、かつ身体が徐々にその部位をほぼ正常時の組織構造および機能までリモデルおよび再生させる間、少なくとも3ヶ月間またはそれ以上、例えば少なくとも6ヶ月間または少なくとも１年間、容量回復を保持し続ける戦略またはスキャホールドの開発に対する強い要望が存在する。
要旨
本明細書に記載される様々な局面の態様は、少なくとも一部、修復または増強したい組織内で一定期間その当初の容量の少なくとも一部分を保持することができる注射可能な形式のシルクフィブロインスキャホールド、例えばシルクフィブロイン粒子、の設計に基づいている。例えば、そのようなシルクフィブロイン粒子は、例えば組織の増強もしくは修復のための、空隙を置換するための充填材として、または、例えば組織の再生もしくは再建のための、スキャホールドとして、最小の侵襲性の手順（例えば、注射）によって、修復または増強したい対象の組織に設置することができる。
したがって、本明細書に提供される1つの局面は、複数のシルクフィブロイン粒子を含む、対象の組織の修復または増強に使用する注射可能な組成物であって、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、一定期間（例えば、少なくとも約6週間）、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約50％）を保持する、組成物、である。
本明細書に提供される別の局面は、対象の組織を修復または増強する方法に関する。この方法は、複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物を修復または増強したい組織に設置する工程を含み、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、一定期間（例えば、少なくとも約6週間またはそれ以上）、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約50％またはそれ以上）を保持する。1つの態様において、組成物は、注射により、修復または増強したい組織に設置される。
本明細書に提供される組成物および方法の特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、両親媒性ペプチドを含まないものであり得る。他の態様において、シルクフィブロイン粒子は、両親媒性ペプチドを含み得る。例示的な両親媒性ペプチドは、例えば、RGDモチーフを含み得る。
本明細書に提供される組成物および方法のいくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上を含む、それらの当初の容量の少なくとも約50％を保持し得る。
本明細書に提供される組成物および方法のいくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、少なくとも約6週間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上、その当初の容量の少なくとも一部分を保持し得る。
シルクフィブロイン粒子の容量保持性は、一部、シルクフィブロイン粒子の分解および／または溶解特性を調整することによって制御され得る。そのような態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、少なくとも約3ヶ月間、6ヶ月間またはそれ以上を含む、少なくとも約6週間で、例えばそれらの当初の容量の30％以下、10％以下を含む、それらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合され得る、
組織の欠損のサイズおよび／または望まれるシルクフィブロイン粒子の特性に依存して、シルクフィブロイン粒子は、任意のサイズとなるよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、組織への注射に適したサイズを有し得る。例えば、本明細書に提供されるシルクフィブロイン粒子は、約500nm〜約5000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約2000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約10μm〜約1500μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約1000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約500μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約3μm〜約425μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約500μm〜約1200μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約800μm〜約1000μmのサイズを有し得る。
シルクフィブロイン粒子は、ネイティブ組織の構造形態を模倣するようおよび／または組織の局所領域に活性剤を送達するよう適合され得る。例えば、シルクフィブロイン粒子は、多孔質であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の多孔度は、ネイティブ組織で見出される構造形態および／または細胞密度の勾配を模倣するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の多孔度は、既定の放出プロファイルで組織に活性剤を送達するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の多孔度は、一定期間、それらの当初の容量の少なくとも一部分を保持するよう適合され得る。例えば、シルクフィブロイン多孔質粒子は、例えば少なくとも約3％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上を含む、少なくとも約1％の多孔度を有し得る。そのような多孔質シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、約10nm〜約2000μm、約50nm〜約1500μm、約0.5μm〜約1500μm、約1μm〜約1000μmまたは約1μm〜約500μmの範囲であり得る。いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、約3μm〜約500μmの範囲であり得る。いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、約8μm〜約1000μmの範囲であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、多孔質である必要はない。
シルクフィブロイン粒子は、1つの態様において、固体状シルクフィブロインを粒子に細小化することによって製作され得る。例えば、固体状シルクフィブロインは、機械的手段、例えば、非限定的に、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、切断およびそれらの任意の組み合わせ、によって粒子に細小化され得る。固体状シルクフィブロインは、当技術分野で公知の任意の方法によって作製され得る。多孔質のシルクフィブロイン構造を製造するために、ポロゲン浸出（porogen-leaching）法または任意のその他の当技術分野で知られている方法が使用され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、光学特性、例えば、非限定的に、回折性、を有さないものであり得る。そのような態様において、シルクフィブロイン粒子は、任意の光学要素をインプリントまたは添加することなく、固体状シルクフィブロインから製造され得る。
シルクフィブロイン粒子を含む本明細書に記載される注射可能な組成物は、少なくとも1つの活性剤をさらに含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物のシルクフィブロイン粒子は、少なくとも1つの活性剤をさらに含み得る。活性剤の非限定的な例は、生物学的活性剤、美容活性剤、細胞接着剤、真皮充填材料およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、活性剤は治療剤であり得る。いくつかの態様において、活性剤は美容活性剤であり得る。いくつかの態様において、活性剤は真皮充填材料であり得る。
いくつかの態様において、注射可能な組成物または複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物は、少なくとも1つの細胞、例えば幹細胞、をさらに含み得る。いくつかの態様において、細胞は、生物学的流体または濃縮物、例えば吸引脂肪、吸引骨髄またはそれらの任意の組み合わせ、から取得され得る。
したがって、いくつかの態様において、注射可能な組成物または複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物は、生物学的流体または濃縮物、例えば吸引脂肪、吸引骨髄またはそれらの任意の組み合わせ、をさらに含み得る。1つの態様において、注射可能な組成物または複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物は、吸引脂肪をさらに含み得る。これらの態様において、組成物または注射可能な組成物は、約1:38〜約12:19または約1:19〜約10:19または約2:19〜約8:19の容量比で、シルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。１つの態様において、組成物または注射可能な組成物は、約3:19の容量比で、シルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。別の態様において、組成物または注射可能な組成物は、約6:19の容量比で、シルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物は、例えば別個のヒドロゲル粒子の形態のおよび／またはシルクフィブロイン粒子内に分配された、ヒドロゲルをさらに含み得る。
本明細書に記載される組成物の様々な態様は、修復または増強したい組織に、当技術分野の任意の公知の方法によって、例えば皮下、筋肉下または筋肉内に、注射され得る。組織に注射される際、組成物のいくつかの態様は、少なくとも部分的に乾燥状態であり得る。あるいは、組成物は、少なくとも部分的に水和状態であり得る、例えば、組成物は、組織に注射される際、薬学的に許容される担体、例えば緩衝溶液をさらに含み得る。いくつかの態様において、組成物中のシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に導入する前に何らかの事前圧縮を行わずに針またはカテーテルを通じて送達できる程度に十分に小さいものである。
本明細書に記載される組成物および／または方法によって修復または増強される組織は、軟部組織であり得る。軟部組織の例示的な例は、腱、靭帯、皮膚、乳房組織、繊維組織、結合組織、筋肉およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。特定の態様において、軟部組織は皮膚である。他の態様において、軟部組織は乳房組織である。
注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子の1つの態様を含む送達デバイスもまた、本明細書に提供されている。送達デバイスは、任意の従来的な注射デバイス（例えば、シリンジ）および／または最小の侵襲性の任意の投与デバイスを含み得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書の提供は、注射可能な組成物の1つの態様を含むシリンジに関する。シリンジは、針、カニューレおよび／またはカテーテルをさらに含み得る。いくつかの態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）は、注射用担体、例えば緩衝溶液、をさらに含み得る。いくつかの態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）は、局所麻酔剤をさらに含み得る。
本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、組成物および／または送達デバイスは、約0℃および約60℃、例えば約10℃〜約60℃の間または約15℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送され得る。そのような温度下で、シルクフィブロイン粒子内に埋められているまたは分配されている活性剤の生物活性は、一定期間安定化され得る。
図1は、本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を使用する例示的な方法を示している。例示的な注射可能な組成物を形成するために、（例えば、固体状多孔質シルクフィブロインを粒子またはビットに細小化することにより形成される）多孔質シルクフィブロインスキャホールドビットは、場合により脂肪由来幹細胞（ASC）を含む担体としての吸引脂肪と混合され得る。注射可能な組成物は、その後、対象、例えば動物モデルに注射され得る。 図2は、本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様の画像を示している。シルクフィブロインスキャホールド粒子は、任意のサイズ、例えばサブミクロン〜約2mmのものであり得る。左パネルは、シルクフィブロインスキャホールド粒子が約3μm〜約425μmのサイズを有し得ることを示し、右パネルは、シルクフィブロインスキャホールド粒子が約0.8mm〜約1mmのサイズを有し得ることを示している。 図3は、様々な比率の吸引脂肪と混合された注射可能なシルクフィブロイン多孔質粒子の、注射後6週間のヘマトキシリンおよびエオシン画像を示している。第1列の画像に示される（約3μm〜約500μmの孔サイズを有する）シルクフィブロイン多孔質粒子は、約300ミクロン〜約500ミクロンの孔サイズを有する多孔質シルクフィブロインスキャホールドを微粒子化することによって製造し、第2および第3列の画像に示されるもの（約8μm〜約1000μmの孔サイズを有するシルクフィブロイン粒子）は、約850ミクロン〜約1000ミクロンの孔サイズを有するシルクフィブロインスキャホールドから製造した。図3で使用される「用量」という用語は、対象、例えば動物モデルに注射されるシルクフィブロイン粒子の量を表す。いくつかの態様において、用量は、シルクフィブロイン粒子 対 吸引脂肪の最終容量比により示され得る。例えば、最終容量比は、約3:19〜約6:19の範囲であり得る。
発明の詳細な説明
本明細書には、対象の組織を修復または増強するための方法、組成物、送達デバイスおよびキットが記載されている。本明細書に記載される様々な局面の態様にしたがい、注射可能な形式のシルクフィブロインスキャホールド（例えば、シルクフィブロイン粒子）は、修復または増強したい組織に（例えば、注射によって）設置され得、そして暫くの間（例えば、少なくとも約6週間）、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の少なくとも一部分（例えば、それらの当初の容量の少なくとも約50％）を保持し得る。そのような注射可能なシルクフィブロイン粒子は、最小の侵襲性の手順で欠損部位に導入することができ、同時に、当業者は注射可能なシルクフィブロイン粒子を任意の形状および／またはサイズの欠損に調和するよう柔軟にモールドすることができる。
シルクフィブロイン粒子
本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に（例えば、注射によって）投与された際、一定期間、それらの当初の容量を保持し得る。
本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子を参照して言う「当初の容量」は、概ね、シルクフィブロイン粒子を修復または増強したい組織に設置する直前に測定されるシルクフィブロイン粒子の容量、またはシルクフィブロイン粒子を修復または増強したい組織に設置した直後に測定される対応する組織容量の増加、を意味する。例えば、シルクフィブロイン粒子の当初の容量は、例えば、シルクフィブロイン粒子を修復または増強したい組織に設置する前後の約20分以内に測定され得る。いくつかの例において、シルクフィブロイン粒子の当初の容量は、例えば、シルクフィブロイン粒子を修復または増強したい組織に設置する前後の約10秒間、約15秒間、約20秒間、約25秒間、約30秒間、約1分間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、約11分間、約12分間、約13分間、約14分間、約15分間、約16分間、約17分間、約18分間、約19分間または約20分間に測定され得る。いくつかの態様において、組織に設置する前のシルクフィブロイン粒子の容量は、乾燥状態のシルクフィブロイン粒子の容量を表し得る。代替の態様において、組織に設置する前のシルクフィブロイン粒子の容量は、水和状態のシルクフィブロイン粒子の容量を表し得る。他の態様において、組織に設置する前のシルクフィブロイン粒子の容量は、流体または担体に懸濁されたシルクフィブロイン粒子の容量を表し得る。いくつかの態様において、組織に設置する前のシルクフィブロイン粒子の容量は、シルクフィブロイン粒子を含む混合物の注射容量を表し得る。
本明細書で使用される場合、「保持」という用語は、一定期間にわたる、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分の容量（例えば、サイズおよび／または形状）の維持を表す。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間にわたり、例えばそれらの当初の容量の少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上を含む、それらの当初の容量の少なくとも約20％を保持し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間にわたり、それらの当初の容量の少なくとも約1％、少なくとも約3％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％またはそれ以上を保持し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の100％を保持し得る、例えば容量に検出可能な変化が見られない。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約1％を保持し得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約50％を保持し得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約60％を保持し得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約70％を保持し得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約80％を保持し得る。組織に設置されたシルクフィブロイン粒子の容量は、組織の特性の少なくとも1つ、例えば組織の容量、組織の弾性および／または組織の硬度、の変化によって決定され得るまたは示され得る。いくつかの態様において、組織に設置されたシルクフィブロイン粒子の容量は、外植片から、例えば重量測定および／または容量置換から決定され得る。1つの態様において、組織に設置されたシルクフィブロイン粒子の容量は、画像化によって観察および／または測定され得る。
シルクフィブロイン粒子は、任意の期間、例えば数週間、数ヶ月間または数年間、それらの当初の容量の少なくとも一部分を保持し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約6週間、少なくとも約7週間、少なくとも約8週間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約5ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約7ヶ月間、少なくとも約8ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、少なくとも約10ヶ月間、少なくとも約11ヶ月間、少なくとも約1年間、少なくとも約2年間、少なくとも3年間、少なくとも約4年間、少なくとも5年間またはそれ以上、例えばそれらの当初の容量の少なくとも約50％（例えば、それらの当初の容量の少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上を含む）を保持し得る。特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約3ヶ月間またはそれ以上、例えばそれらの当初の容量の少なくとも約70％またはそれ以上を保持し得る。他の態様においては、少なくとも約3ヶ月間またはそれ以上、修復または増強したい組織に設置された後、シルクフィブロイン粒子の容量の有意な変化を確認することができない。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上（例えば、少なくとも約9ヶ月間、少なくとも約12ヶ月間、少なくとも約18ヶ月間またはそれ以上を含む）、例えばそれらの当初の容量の少なくとも約70％またはそれ以上を保持し得る。他の態様においては、少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上、修復または増強したい組織に設置された後、シルクフィブロイン粒子の容量の有意な変化を確認することができない。特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約1年間またはそれ以上（例えば、少なくとも約2年間、少なくとも約3年間、少なくとも約4年間、少なくとも約5年間またはそれ以上を含む）、それらの当初の容量の少なくとも約20％またはそれ以上を保持し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約1年間またはそれ以上（例えば、少なくとも約2年間、少なくとも約3年間、少なくとも約4年間、少なくとも約5年間またはそれ以上を含む）、それらの当初の容量の少なくとも約50％またはそれ以上を保持し得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、少なくとも約6週間（例えば、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上を含む）、修復または増強したい組織内で、それらの当初の容量の少なくとも約1％、少なくとも約3％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％を保持し得る。
シルクフィブロイン粒子の容量保持はまた、例えば、シルクフィブロイン粒子の分解によっても特徴づけることができる。概ね、シルクフィブロイン粒子の分解が遅いほど、シルクフィブロイン粒子は組織においてより長くそれらの当初の容量を保持し得る。したがって、本明細書に提供されるいくつかの態様は、複数のシルクフィブロイン粒子を含む、対象の組織の修復または増強に使用する注射可能な組成物であって、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が一定期間をかけて修復または増強したい組織内で分解するよう適合されている、組成物、に関する。
本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子を参照して使用される場合、「分解する」または「分解」という用語は、シルクフィブロイン粒子の容量またはサイズの減少を表す。シルクフィブロイン粒子の分解は、シルクフィブロイン粒子のより小さなフラグメントへの切断および／またはシルクフィブロイン粒子もしくはそのフラグメントの溶解を通じて起こり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、例えば、それらの当初の容量の70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下またはそれ未満を含む、それらの当初の容量の80％以下を分解するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、修復または増強したい組織内で有意な分解を示し得ない（例えば、検出可能な容量の変化が見られない）。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間の間に、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合され得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間の間に、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の40％以下を分解するよう適合され得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間の間に、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合され得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間の間に、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の20％以下を分解するよう適合され得る。1つの態様において、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分は、一定期間の間に、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の10％以下を分解するよう適合され得る。
シルクフィブロイン粒子は、任意の率で分解するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、任意の期間、例えば、数週間、数ヶ月間または数年間をかけて、その当初の容量の少なくとも一部分を分解するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約6週間、少なくとも約7週間、少なくとも約8週間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約5ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約7ヶ月間、少なくとも約8ヶ月間、少なくとも約9ヶ月間、少なくとも約10ヶ月間、少なくとも約11ヶ月間、少なくとも約1年間、少なくとも約2年間、少なくとも約3年間、少なくとも約4年間、少なくとも約5年間またはそれ以上の間に、例えば、その当初の容量の50％以下（例えば、その当初の容量の40％以下、30％以下、20％以下またはそれ未満を含む）を分解するよう適合され得る。特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約3ヶ月間またはそれ以上の間に、例えばその当初の容量の30％以下またはそれ未満を分解するよう適合され得る。他の態様において、修復または増強したい組織に少なくとも約3ヶ月間またはそれ以上設置した後に、有意な分解が生じ得ない（すなわち、シルクフィブロイン粒子の容量に検出可能な変化が見られない）。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上（例えば、少なくとも約9ヶ月間、少なくとも約12ヶ月間、少なくとも約18ヶ月間またはそれ以上を含む）の間に、例えば、その当初の容量の30％以下またはそれ未満を分解するよう適合され得る。他の態様において、修復または増強したい組織に少なくとも約6ヶ月間またはそれ以上設置した後に、有意な分解が生じ得ない（すなわち、シルクフィブロイン粒子の容量に検出可能な変化が見られない）。特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約1年間またはそれ以上（例えば、少なくとも約2年間、少なくとも約3年間、少なくとも約4年間、少なくとも約5年間またはそれ以上を含む）の間に、その当初の容量の80％以下またはそれ未満を分解するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約1年間またはそれ以上の間に、その当初の容量の50％以下またはそれ未満を分解するよう適合され得る。
シルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物の同一または類似の製剤は、対象において異なる応答を示し得る。例にすぎないが、組織内でのシルクフィブロイン粒子の容量保持または分解率は、例えば、組織のミクロ環境、例えばその組織内に存在する様々なタンパク質または酵素（例えば、タンパク質分解酵素）の種類および／またはレベル、の違いにより、対象ごとに異なり得る。
いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、一定期間にわたって、一定の容量保持率および／または分解率を維持するよう適合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、時間と共に変化する容量保持率または分解率を有するよう適合され得る。例えば、シルクフィブロイン粒子は、ポリマー材料、例えば、異なる濃度のシルクフィブロインならびに／または異なる生分解性および生体適合性ポリマー、でコーティングされ得る。そのようなコーティングは、シルクフィブロイン粒子コアのそれとは異なる機能および／または異なる分解率を有し得る。例にすぎないが、シルクフィブロイン粒子のコーティングは、少なくとも1つの活性剤を含み得、シルクフィブロイン粒子コアのそれとは異なる率（例えば、より速い率）で分解するよう適合され得る。したがって、組織へのシルクフィブロイン粒子の設置の際、シルクフィブロイン粒子のコーティングは、例えば、痛みを和らげるおよび／または創傷治癒を促進するために活性剤を放出するようより速く分解し、一方シルクフィブロイン粒子コアはより長い期間それらの容量を保持し得るよう適合され得る。
シルクフィブロインは、その汎用性の高い処理、例えば完全水相系の処理（Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139 (2001); Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)）、比較的容易な機能化（Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)）および生体適合性（Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999)）ゆえに、本明細書に記載されるさまざまな態様において使用するためのバイオポリマー候補として特に魅力的である。例えば、シルクは、ヒトインプラントにおける組織工学スキャホールドとしてU.S. Food and Drug Administrationに承認されている。Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003)を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「シルクフィブロイン」という用語は、カイコフィブロインおよび昆虫またはクモシルクタンパク質を含む。例えば、Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)を参照のこと。任意のタイプのシルクフィブロインが、本明細書に記載される様々な態様において使用され得る。カイコ、例えばボンビックス・モリ（Bombyx mori）によって産生されるシルクフィブロインが最も一般的であり、地球に優しい、再生産可能な供給源と言える。例えば、シルクフィルムに使用されるシルクフィブロインは、B.モリの繭からセリシンを抽出することによって取得され得る。有機栽培したカイコ繭も市販されている。しかし、クモシルク（例えば、ネフィラ・クラビペス（Nephila clavipes）から得られるもの）、トランスジェニックシルク、遺伝子工学シルク、例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物由来のシルク（例えば、WO 97/08315；米国特許第5,245,012号を参照のこと）およびそれらの変種を含む多くの異なるシルクを使用することができる。
様々な態様において、シルクフィブロインは、様々な用途および／または所望の機械的もしくは化学的特性のために（例えば、シルクフィブロイン粒子内での活性剤の勾配の形成を促進するために）修飾され得る。当業者は、例えばシルクフィブロインの側鎖基、シルクフィブロインの所望の反応性および／またはシルクフィブロインの所望の電荷密度に依存して、シルクフィブロインを修飾するための適当な方法を選択することができる。1つの態様において、シルクフィブロインの修飾は、アミノ酸側鎖化学、例えば共有結合を通じた化学修飾または電荷・電荷相互作用を通じた修飾、を使用するものであり得る。例示的な化学修飾法は、カルボジイミドカップリング反応（例えば、米国特許出願第US 2007/0212730号を参照のこと）、ジアゾニウムカップリング反応（例えば、米国特許出願第US 2009/0232963号を参照のこと）、アビジン・ビオチン相互作用（例えば、国際出願第WO 2011/011347号を参照のこと）およびPEGポリマーの化学的に活性なまたは活性化された誘導体によるペグ化（例えば、国際出願第WO 2010/057142号を参照のこと）を含むがこれらに限定されない。シルクフィブロインはまた、シルクタンパク質の機能性を変更する遺伝子修飾を通じて修飾され得る（例えば、国際出願第WO 2011/006133号を参照のこと）。例えば、シルクフィブロインは、シルクのさらなる修飾、例えば有機・無機複合体を形成するために使用することができる繊維性タンパク質ドメインおよび鉱化ドメインを含む融合ポリペプチドの組み込み、を提供できるよう遺伝子修飾することができる。WO 2006/076711を参照のこと。加えて、シルクフィブロインマトリックスは、例えばマトリックスの柔軟性に影響する化合物、例えばグリセロールと組み合わせることができる。例えば、WO 2010/042798, Modified Silk films Containing Glycerolを参照のこと。
本明細書で使用される場合、「シルクフィブロイン粒子」というフレーズは、概ね、シルクフィブロインを含む粒子を表す。いくつかの態様において、「シルクフィブロイン粒子」というフレーズは、シルクフィブロインが全組成の少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％またはそれ以上を含む、全組成の少なくとも約30％を構成する粒子を表す。特定の態様において、シルクフィブロイン粒子は、実質的にシルクフィブロインから形成され得る。様々な態様において、シルクフィブロイン粒子は、実質的に、少なくとも1つの活性剤を含むシルクフィブロインから形成され得る。
本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、任意の形状、例えば、球形、多角形、楕円形となるよう適合され得る。シルクフィブロイン粒子を参照して使用される場合、本明細書で使用される「粒子」という用語は、例えば球形、多角形または楕円形であるがこれらに限定されない任意の形状の粒子を表す。粒子サイズは、修復もしくは増強したい組織のサイズおよび／またはシルクフィブロイン粒子の所望の特性、例えば、容量保持もしくは分解プロファイルを含むがこれらに限定されない、多くの要因と共に変更され得る。いくつかの態様において、粒子サイズは、約500nm〜約5000μm、約1μm〜約2000μm、約10μm〜約1500μm、約20μm〜約1000μm、約50μm〜約750μmまたは約100μm〜約500μmの範囲であり得る。特定の態様において、本明細書に提供されるシルクフィブロイン粒子は、約500nm〜約5000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約2000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約10μm〜約1500μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約1000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約500μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約3μm〜約425μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約500μm〜約1200μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約800μm〜約1200μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1μm〜約5μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約5μm〜約20μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約20μm〜約50μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約50μm〜約100μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約100μm〜約250μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約500μm〜約750μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約750μm〜約1000μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、約1000μm〜約1200μmのサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、1μm未満のサイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、本来的に、いかなる事前圧縮も行わずに針および／またはカテーテルを通じて送達できる程度に小さいものであり得る。そのような態様において、シルクフィブロイン粒子は針および／またはカテーテルの内径よりも小さいサイズを有し得、そのためシルクフィブロイン粒子は針および／またはカテーテルを通じた組織への注射の前に事前圧縮を必要としない。
いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、示されている「サイズ」付近の粒子サイズ分布を示し得る。そのような態様において、本明細書で使用される「粒子サイズ」という用語は、シルクフィブロイン粒子のサイズ分布の最頻値、すなわち、そのサイズ分布において最も頻出する値、を表す。粒子サイズの測定法は、当業者に公知であり、例えば動的光散乱（例えば、光子相関分光測定（photocorrelation spectroscopy）、レーザー回折、低角レーザー光散乱（LALLS）および中角レーザー光散乱（MALLS））、光遮蔽法（例えば、コールター分析法）またはその他の技術（例えば、レオロジーおよび光学または電子顕微鏡）によるものがある。
シルクフィブロイン粒子は、水ベースまたは有機溶媒ベースのシルクフィブロイン溶液から製造され得る。いくつかの態様において、有機溶媒ベースのシルクフィブロイン溶液から製造されるシルクフィブロイン粒子は、水ベースのシルクフィブロイン粒子よりも長い期間それらの当初の容量を保持し得る。本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子を作製するために使用される水または有機溶媒ベースのシルクフィブロイン溶液は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて調製され得る。軟部組織の修復または増強のために使用される溶液中のシルクフィブロインの濃度は、例えば、修復または増強したい組織に注射された際にシルクフィブロイン粒子のより長い容量保持が望まれる場合により高濃度のシルクフィブロイン溶液を使用できるときは、個々の容量保持要件に適合され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子を作製するためのシルクフィブロイン溶液は、上下限値を含めて、約4%（w/v）から約30%（w/v）まで、または上下限値を含めて、約4%（w/v）から約20%（w/v）まで様々であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン溶液は、約6%（w/v）から約20%（w/v）まで様々であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン溶液は、約6%（w/v）から約17%（w/v）まで様々であり得る。シルクフィブロイン溶液を調製する適当なプロセスは、例えば、米国特許第US 7635755号；ならびに国際出願第WO/2005/012606号および同第WO/2008/127401号に開示されている。精密ろ過工程をその中で使用することができる。例えば、調製されたシルクフィブロイン溶液を、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子になるようさらに処理する前に、例えば、遠心分離および／またはシリンジベースの精密ろ過によってさらに処理することができる。
いくつかの態様において、シルクフィブロインはまた、シルクフィブロインを含む混合ポリマー粒子を形成するよう、他の生体適合性および／または生分解性ポリマーと混合され得る。1つまたは複数の生体適合性および／または生分解性ポリマー（例えば、2つまたはそれ以上の生体適合性ポリマー）が、シルクフィブロイン溶液に添加され得る。ここで使用することができる生体適合性ポリマーは、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリエチレングリコール（PEG）、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、アルギネート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリ無水物、ポリマー、PLA-PGA、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリフマレート、コラーゲン、キトサン、アルギネート、ヒアルロン酸ならびにその他の生体適合性および／または生分解性ポリマーを含むがこれらに限定されない。例えば、国際出願第WO 04/062697号；同第WO 05/012606号を参照のこと。
いくつかの態様において、本明細書に記載される少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子となるようさらに処理する前に、シルクフィブロイン溶液に添加され得る。いくつかの態様において、活性剤は、例えば、米国特許出願第US 2007/0212730号に記載されるカルボジイミド媒介修飾法を用いて、シルクフィブロイン内に均質にまたは不均質に分散され得、勾配をつけて分散され得る。
いくつかの態様においては、シルクフィブロイン粒子を最初に形成し、次に、粒子の開放表面が少なくとも1つの活性剤でコーティングされ得るよう、少なくとも1つの活性剤に接触（例えば浸漬）させることができる。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、機械的手段によって固体状シルクフィブロインから細小化され得る。シルクフィブロイン粒子を得るための例示的な機械的手段は、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、凍結乾燥またはそれらの任意の組み合わせを含む。例えば溶媒ベースまたは水溶液ベースのシルクフィブロイン溶液を用いて、シルクフィブロイン溶液から固体状シルクフィブロインを形成する方法は、当業者に周知である。例えば、Wang Y. et al. (2008) 29 Biomaterials 3415、米国特許第US7635755号；ならびに国際特許出願第WO/2005/012606号；および同第WO/2008/127401号を参照のこと。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、例えば、ネイティブ組織の構造形態を模倣するため、シルクフィブロイン粒子の分解率／容量保持率を調整するためおよび／または、存在する場合はその中に埋め込まれた活性剤の放出プロファイルを調整するために、多孔質構造を含み得る。本明細書で使用される場合、「多孔質」および「多孔度」という用語は、概ね、その容量全体に孔または空隙部（例えば、開口、間隙またはその他のチャンネルであり得る）の連結ネットワークを有する構造を表すために使用される。「多孔度」という用語は、ある材料における空隙部の尺度であり、0〜100％の百分率（または0〜1）で表される全容量に対する空隙容量の分数である。
いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子は、望まれる特性に依存して、任意の多孔度を有するよう構成され得る。例えば、いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子は、少なくとも約1％、少なくとも約3％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上の多孔度を有し得る。いくつかの態様において、多孔度は、約50％〜約99％、約70％〜約99％または約80％〜約98％の範囲であり得る。孔サイズおよび全体多孔度の値は、当業者に公知の従来的な方法およびモデルを用いて定量され得る。例えば、孔サイズおよび多孔度は、標準化された技術、例えば水銀ポロシメトリーおよび窒素吸収を用いて測定され得る。当業者は、様々な目的に最適なシルクフィブロイン粒子の多孔度を決定することができる。例えば、シルクフィブロイン粒子の多孔度および／または孔サイズは、シルクフィブロイン粒子の所望の分解率もしくは容量保持率、シルクフィブロイン粒子からの活性剤の放出プロファイルおよび／または修復もしくは増強したい組織の構造形態に基づき最適化され得る。
孔は、任意の形状、例えば円形、楕円形または多角形、を有するよう適合され得る。多孔質シルクフィブロイン粒子は、約10nm〜約2000μm、約50nm〜約1500μm、約0.5μm〜約1500μm、約1μm〜約1500μm、約2μm〜約1500μm、約1μm〜約1000μm、約3μm〜約1000μm、約1μm〜約500μmまたは約3μm〜約500μmの孔サイズを有するよう適合され得る。いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、約3μm〜約500μmの範囲であり得る。いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、約8μm〜約1000μmの範囲であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、多孔質である必要がない。そのような態様において、シルクフィブロイン粒子の孔サイズは、10nm未満または検出不可能であり得る。本明細書で使用される「孔サイズ」という用語は、孔の寸法を表す。いくつかの態様において、孔サイズは、孔の最長寸法、例えば、円形の断面を有する孔の直径または非円形の断面を有する孔を横断して形成され得る最長の断面上の弦の長さを表し得る。他の態様において、孔サイズは、孔の最短寸法を表し得る。
シルクフィブロインマトリックス内に多孔質構造を生成する方法、例えば凍結乾燥、塩浸出および気泡法は、当技術分野で周知であり、例えば米国特許第US 7842780号；ならびに米国特許出願第US 2010/0279112号；および同第US 2010/0279112号に記載されており、これらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子は、ポロゲン浸出法（例えば、塩浸出法）によって製造され得る。例えば、US 7842780；およびUS 2010/0279112を参照のこと。いくつかの態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子は、上記のような機械的手段によって固体状多孔質シルクフィブロインから細小化され得る。例にすぎないが、シルクフィブロイン溶液は、水溶性の粒子または有機溶媒に不溶のポロゲンを含む防付着性の容器（例えば、テフロンコートされた容器）に入れられ得る。あるいは、ポロゲンは、容器に入れる前にシルクフィブロイン溶液と混合され得る。粒子（ポロゲン）の直径は、予め決定された孔サイズにしたがい異なり得る。本明細書で使用することができる水溶性ポロゲンの例は、NaCl、アルカリ金属、アルカリ土類金属のハロゲン化物、ホスフェートおよびスルフェート、氷砂糖、水溶性マイクロスフィア、多糖類およびタンパク質マイクロスフィアを含む。乾燥されたシルクフィブロインマトリックスは、その後、粒子またはポロゲンは溶解するがシルクフィブロインは溶解しない水またはその他の溶媒に浸漬され得、それによって粒子（ポロゲン）が除去され、本明細書に記載される多孔質の固体状シルクフィブロインが生成され得る。多孔質の固体状シルクフィブロインは、その後、例えば機械的手段、例えば微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、凍結乾燥およびそれらの任意の組み合わせによって、本明細書に記載される多孔質シルクフィブロイン粒子に細小化され得る。
ポロゲン浸出法（例えば、塩浸出法）を用いることで、シルクフィブロイン粒子が、例えば、非限定的に、例えば約300ミクロン〜約500ミクロンおよび／または約850ミクロン〜約1000ミクロンの範囲のポロゲンサイズに対応する孔を有する固体状シルクフィブロインを微粒子化することによって、作製され得る。いくつかの態様において、孔のサイズ範囲は、微粒子化プロセスによって影響されることを要しない。どのように固体状シルクフィブロインを切断（微粒子化）するかに依存して、得られるシルクフィブロイン粒子は、ポロゲンのサイズ範囲の任意の部分に対応する孔サイズを有し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の孔は、インタクトな孔であることを要しない（例えば、ポロゲンのサイズ範囲の一部である孔サイズを有する、例えばポロゲンのサイズ範囲の少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％またはそれ以上である）。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子の孔は、インタクトであり得る（例えば、ポロゲンのサイズと実質的に同じ孔サイズを有する）。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子のインタクトな孔は、例えば約300ミクロン〜500ミクロンの間または約850ミクロン〜約1000ミクロンの間の、使用されるポロゲンのサイズと本質的に同じサイズを維持し得る。いくつかの態様において、小さなシルクフィブロイン粒子はインタクトな孔を維持している必要がなく、したがってその孔はポロゲンのサイズよりもずっと小さなもの、例えばポロゲンのサイズ範囲の少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％またはそれ以上、であり得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、多孔質である必要がない。様々な態様において、シルクフィブロイン粒子は、インタクトな孔、部分的な孔またはそれらの組み合わせを含み得る。
代替の態様において、多孔質シルクフィブロイン粒子は、凍結乾燥法によって製造され得る。例えば、US 7842780およびUS 2010/0279112を参照のこと。そのような態様においては、防付着性の容器に入れられたシルクフィブロイン溶液が、零度以下の温度、例えば約-80℃〜約-20℃で、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間またはそれ以上凍結され、その後に凍結乾燥され得る。1つの態様において、シルクフィブロイン溶液は、一方向から凍結され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン溶液は、塩を含まないものであり得る。いくつかの態様において、アルコール、例えば15%〜25%のメタノールまたはプロパノールが、シルクフィブロイン溶液に添加され得る。多孔質の固体状シルクフィブロインは、その後、例えば機械的手段、例えば微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、凍結乾燥およびそれらの任意の組み合わせによって、本明細書に記載される多孔質シルクフィブロイン粒子に細小化され得る。いくつかの態様において、多孔質の固体状シルクフィブロインは、本明細書に記載される凍結乾燥法によって製造されない。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子または固体状シルクフィブロインは、少なくとも1つのシルクフィブロインの特性に影響し得る後処理に供され得る。例えば、シルクフィブロイン粒子または固体状シルクフィブロインの後処理は、β-シート含有量、溶解度、活性剤ロード能、分解時間、薬物透過性またはそれらの任意の組み合わせを含むシルクフィブロインの特性に影響し得る。シルクの後処理の選択肢は、制御された遅乾（Lu et al., 10 Biomacromolecules 1032 (2009)）、水中アニーリング（Jin et al., Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content, 15 Adv. Funct. Mats. 1241 (2005)）、ストレッチング（Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin. 598 (1989)）、圧縮、ならびにメタノール（Hofmann et al., 2006）、エタノール（Miyairi et al., 1978）、グルタルアルデヒド（Acharya et al., 2008）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）（Bayraktar et al., 2005）を含む溶媒浸漬を含む。
いくつかの態様において、固体状シルクフィブロインまたはシルクフィブロイン粒子の後処理、例えば水中アニーリングまたは溶媒浸漬は、シルクフィブロイン粒子からの活性剤の放出の制御を実現し得る。いくつかの態様において、固体状シルクフィブロインまたはシルクフィブロイン粒子の後処理、例えば水中アニーリングまたは溶媒浸漬は、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子の分解または溶解特性の調整を可能にし得る。いくつかの態様において、固体状シルクフィブロインまたはシルクフィブロイン粒子の後処理、例えば水中アニーリングまたは溶媒浸漬は、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子の容量保持特性の調整を可能にし得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、例えば処置したい組織に注射した際のシルクフィブロイン粒子の分解および／もしくは容量保持特性を調整するためならびに／またはシルクフィブロイン粒子から放出される活性剤の率を調整するために、本明細書に記載される生体適合性および／または生分解性ポリマーの少なくとも1つの層でコーティングされ得る。そのような態様において、生体適合性および／または生分解性ポリマーは、少なくとも1つの活性剤を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、細胞接着分子、例えば、非限定的に、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、任意の当技術分野で知られている細胞外マトリックス分子およびそれらの任意の組み合わせ、でコーティングされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、滅菌され得る。生物医学デバイスの滅菌法は当技術分野で周知であり、ガンマ線または紫外線照射、オートクレーブ（例えば、熱／蒸気）；アルコール滅菌（例えば、エタノールおよびメタノール）；ならびにガス滅菌（例えば、エチレンオキシド滅菌）を含むがこれらに限定されない。
さらに、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子は、シルクフィブロインを機能化するために開発された多くの技術（例えば、活性剤、例えば色素およびセンサー）の利点を活用することができる。例えば、米国特許第6,287,340号, Bioengineered anterior cruciate ligament; WO 2004/000915, Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof; WO 2004/001103, Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof; WO 2004/062697, Silk Fibroin Materials & Use Thereof; WO 2005/000483, Method for Forming inorganic Coatings; WO 2005/012606, Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution & Use Thereof; WO 2011/005381, Vortex-Induced Silk fibroin Gelation for Encapsulation & Delivery; WO 2005/123114, Silk-Based Drug Delivery System; WO 2006/076711, Fibrous Protein Fusions & Uses Thereof in the Formation of Advanced Organic/Inorganic Composite Materials; 米国特許出願公開第2007/0212730号, Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds; WO 2006/042287, Method for Producing Biomaterial Scaffolds; WO 2007/016524, Method for Stepwise Deposition of Silk Fibroin Coatings; WO 2008/085904, Biodegradable Electronic Devices; WO 2008/118133, Silk Microspheres for Encapsulation & Controlled Release; WO 2008/108838, Microfluidic Devices & Methods for Fabricating Same, WO 2008/127404, Nanopatterned Biopolymer Device & Method of Manufacturing Same; WO 2008/118211, Biopolymer Photonic Crystals & Method of Manufacturing Same; WO 2008/127402, Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same; WO 2008/127403, Biopolymer Optofluidic Device & Method of Manufacturing the Same; WO 2008/127401, Biopolymer Optical Wave Guide & Method of Manufacturing Same; WO 2008/140562, Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same; WO 2008/127405, Microfluidic Device with Cylindrical Microchannel & Method for Fabricating Same; WO 2008/106485, Tissue-Engineered Silk Organs; WO 2008/140562, Electroactive Biopolymer Optical & Electro-Optical Devices & Method of Manufacturing Same; WO 2008/150861, Method for Silk Fibroin Gelation Using Sonication; WO 2007/103442, Biocompatible Scaffolds & Adipose-Derived Stem Cells; WO 2009/155397, Edible Holographic Silk Products; WO 2009/100280, 3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions; WO 2009/061823, Fabrication of Silk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting; WO 2009/126689, System & Method for Making Biomaterial Structuresを参照のこと。
代替の態様において、シルクフィブロイン粒子は、光熱要素を形成するプラズモンナノ粒子を含み得る。このアプローチは、シルクフィブロインの優れたドーピング性能の利点を活用するものである。温熱療法は、様々な薬剤の経皮送達を助けることが知られている。Park et al., Effect of Heat on Skin Permeability 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008)を参照のこと。1つの態様において、非常に限られた領域での短い放熱が、周辺組織に対する有害な影響を最小化しつつ透過性を最大化するために使用され得る。したがって、プラズモン粒子をドーピングしたシルクフィブロイン粒子は、粒子を経由してのみ光を集中させ局所的に熱を発生させることによって、温熱療法に特異性を与えることができる。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、光熱剤、例えば金ナノ粒子を含み得る。
いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、両親媒性ペプチドを含み得る。他の態様において、本明細書に記載される方法において使用されるシルクフィブロイン粒子は、両親媒性ペプチドを含まないものであり得る。「両親媒性ペプチド」は、親水性および疎水性の両方の特性を有している。両親媒性分子は、通常、その親水性部分を水性環境にさらしつつその疎水性部分を脂質の膜に挿入することによって、生体膜と相互作用し得る。いくつかの態様において、両親媒性ペプチドは、RGDモチーフを含み得る。両親媒性ペプチドの例は、アミノ酸配列：
Figure 2015502199
を有する23RGDペプチドである。両親媒性ペプチドの他の例は、米国特許出願第US 2011/0008406号に開示されるものを含む。
シルクフィブロイン粒子を含む注射可能な組成物
別の局面において、本明細書には、本明細書に記載の複数のシルクフィブロイン粒子を含む、対象の組織の修復または増強に使用される注射可能な組成物であって、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部は、暫くの間（例えば、少なくとも約6週間またはそれ以上）、修復または増強したい組織内で、その当初の容量（例えば、少なくとも約50％またはそれ以上）を保持する、組成物、が提供される。
本明細書で使用される場合、「注射可能な組成物」という用語は、概ね、最小の侵襲性の手順で組織に送達または投与することができる組成物を表す。「最小の侵襲性の手順」という用語は、可能な限り最小限の損傷（例えば、小さな切開、注射）しか与えずに、皮膚を通じてまたは体腔もしくは解剖学的な開口部を通じて対象の体内に進入することによって実行される手順を表す。いくつかの態様において、注射可能な組成物は、注射によって組織に投与または送達され得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物は、皮膚上に小さな切開を形成しそこに針、カニューレおよび／または管状物、例えばカテーテルを挿入することを通じて組織に送達され得る。限定されることを望まないが、注射可能な組成物は、外科手術、例えば移植によって組織に投与または設置され得る。
いくつかの態様において、注射可能な組成物は、本明細書に記載される少なくとも1つの活性剤を含み得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物は、少なくとも1つの細胞を含み得る。本明細書で使用される「細胞」という用語は、植物、酵母、蠕虫、昆虫および哺乳動物を含む原核生物または真核生物の任意の細胞を表す。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、非限定的に、霊長類、ヒト、および、非限定的に、マウス（mouse）、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ（dog）、ネコ（cat）、家畜動物、例えばウマ、ウシ、マウス（murine）、ヒツジ、イヌ（canine）、ネコ（feline）等を含む関心対象の任意の動物由来の細胞を含む。細胞は、幅広い組織タイプ、例えば、非限定的に、造血細胞、神経細胞、間葉細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、間質細胞、筋細胞、脾細胞、細網内皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、肝細胞、腎細胞、胃腸細胞、肺細胞、T細胞等であり得る。非限定的に、造血幹細胞、神経幹細胞、間質幹細胞、筋幹細胞、心血管幹細胞、肝幹細胞、肺幹細胞および胃腸幹細胞ならびに脂肪由来幹細胞を含む、幹細胞、多能性幹細胞（iPSC）、胚性幹（ES）細胞、ES由来細胞および幹細胞前駆体も含まれる。1つの態様において、細胞は、脂肪由来幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、エクスビボまたは培養細胞、例えばインビトロ、であり得る。例えば、エクスビボ細胞の場合、細胞は、健常なおよび／または疾患に罹患した対象から取得され得る。
細胞は、非限定的な例として、生検または当業者に公知のその他の外科的手段によって取得され得る。いくつかの態様において、脂肪細胞は、従来的な脂肪吸込または吸引技術によって対象から収集され得る。そのような態様において、細胞は、吸引脂肪由来であり得る。他の態様において、細胞は、吸引骨髄由来であり得る。修復または増強したい組織のタイプに依存して、細胞は、任意の生物学的流体または濃縮物、例えば吸引脂肪または吸引骨髄由来であり得る。
したがって、いくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、生物学的流体または濃縮物、例えば吸引脂肪または吸引骨髄と共に直接送達され得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物または複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物は、生物学的流体または濃縮物、例えば吸引脂肪、吸引骨髄またはそれらの任意の組み合わせ、をさらに含み得る。1つの態様において、注射可能な組成物または複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物は、吸引脂肪をさらに含み得る。
これらの態様において、組成物または注射可能な組成物は、約1:38〜約12:19または約1:19〜約10:19または約2:19〜約8:19の容量比でシルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。1つの態様において、組成物または注射可能な組成物は、約3:19の容量比でシルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。別の態様において、組成物または注射可能な組成物は、約6:19の容量比でシルクフィブロイン粒子および生物学的流体または濃縮物（例えば、吸引脂肪または吸引骨髄）を含み得る。
細胞は、ドナー（同種）またはレシピエント（自家）から取得され得る。細胞はまた、樹立された細胞培養株、または遺伝子操作が行われた細胞でさえあり得る。加えて、細胞は、ヒト自家移植組織、トランスジェニック哺乳動物または細菌培養物（プロバイオティクス処置に使用されることが考えられる）を含むがこれらに限定されない多数の宿主から回収され得る。特定の態様において、注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、ヒト幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、多能性幹細胞（iPSC）、滑膜由来幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、臍帯血細胞、臍帯ワルトンゼリー細胞、骨細胞、繊維芽細胞、神経細胞、脂質細胞（lipocyte）、脂肪細胞（adipocyte）、骨髄細胞、仕分けされた免疫細胞、脂肪組織由来の前駆（precursor）細胞、骨髄由来前駆（progenitor）細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞および遺伝子的に形質転換された細胞もしくは上記細胞の組み合わせ；または分化した細胞、例えば、筋細胞、脂肪細胞、を含み得る。
幹細胞は、骨髄、脂肪組織または体内のその他の供給源から最小の侵襲性の手順で得ることができ、培養下で高い拡張性があり、そして十分に確立された脂肪生成を誘導する補助物質への曝露の後に脂肪組織形成細胞に分化するよう容易に誘導することができる。細胞は、本明細書に記載される注射可能な組成物および／もしくはシルクフィブロイン粒子に添加されそして身体の一領域への投与の前に一定期間インビトロで培養され得、または本明細書に記載される注射可能な組成物および／もしくはシルクフィブロイン粒子に添加されそして身体の一領域に投与され得る。細胞は、投与直前に短時間（1日未満）シルクフィブロイン粒子上に播種され得、または投与前に播種されたマトリックス内で細胞を増殖させ細胞外マトリックスを合成させるためにより長い（1日超の）期間培養され得る。
幹細胞の供給源として利用される場合、脂肪組織は、当業者に公知の任意の方法によって取得され得る。例えば、脂肪組織は、吸込支援脂肪形成外科術（suction-assisted lipoplasty）、超音波支援脂肪形成外科術および脂肪組織切除（excisional lipectomy）によって個体から取り出され得る。加えて、これらの手順は、そのような手順の組み合わせを含み得る。吸込支援脂肪形成外科術は、最小の侵襲性の組織回収方法を提供し、他の技術、例えば超音波支援脂肪形成外科術に付随し得る幹細胞の損傷の可能性が小さいために、個体から脂肪組織を取り出す上で望ましいものであり得る。脂肪組織は、細胞成分の生存性を確保し、かつ組織への潜在的感染生物、例えば細菌および／またはウイルスの混入の可能性を最小化する様式で回収されるべきである。
いくつかの態様において、細胞集団の調製は、脂肪組織の成熟脂肪を含有する脂肪細胞成分を枯渇させることを必要とし得る。これは典型的に、最初に組織をリンスして遊離脂肪（破裂した脂肪細胞から放出される）および末梢血要素（組織収集時に切断された血管から放出される）の存在を減らし、次いでこれを解体してインタクトな脂肪細胞およびその他の細胞集団を結合組織のマトリックスから分離する、一連の洗浄・解体工程によって達成される。解体は、機械力（ミンチまたは剪断力）、単一のもしくは組み合わされたタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、リベラーゼHIおよびペプシンによる酵素消化または機械的および酵素的方法の組み合わせを含む、任意の従来技術または方法を用いて達成され得る。例えば、インタクトな組織フラグメントの細胞成分は、当業者に公知のように、脂肪組織中の微小血管内皮細胞を回収する方法と同様、脂肪組織のコラゲナーゼ媒介解離を用いる方法によって解体され得る。使用することができるコラゲナーゼを用いるさらなる方法も、当業者に公知である。さらに、方法は、酵素の組み合わせ、例えば、コラゲナーゼとトリプシンの組み合わせ、または酵素、例えばトリプシンと機械的解離の組み合わせを使用し得る。
細胞集団（処理された吸引脂肪）は、その後に、成熟脂肪細胞の存在を減らすことによって、解体された組織フラグメントから取得され得る。細胞の分離は、浮遊密度沈降（buoyant density sedimentation）、遠心分離、水簸（elutriation）、固相部分への示差的な接着および固相部分からの示差的な溶出、抗体を介した選択、電荷の違い；免疫磁気ビーズ、蛍光活性化細胞選別（FACS）またはその他の手段によって達成され得る。
解体後、活性な細胞集団は、解体プロセスの添加物および／または副産物（例えば、コラゲナーゼおよび新たに放出された遊離脂肪）を除去するために洗浄／リンスされ得る。活性な細胞集団は、次いで、遠心分離によって濃縮され得る。1つの態様において、細胞集団を連続流回転膜システム等、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,034,135号；および同第5,234,608号に開示されるシステム、に通すことによって、細胞が濃縮され、コラゲナーゼが除去される。
上記に加えて、細胞集団をさらに精製するために適用され得る洗浄後方法が多く存在する。これらは、正の選択（標的細胞の選択）または負の選択（望まない細胞の選択的除去）の両方またはそれらの組み合わせを含む。別の態様において、細胞ペレットは、再懸濁され得、連続または不連続密度勾配を形成する流体材料の上に（または下に）重層され得、そして細胞密度に基づく細胞集団の分離のために遠心分離され得る。同様の態様において、連続流アプローチ、例えば、アフェレーシスおよび水簸(向流を用いるものまたは用いないもの)が使用され得る。プラスチックへの接着とその後の短期間の細胞拡張も、骨髄由来成体幹細胞集団に適用される。このアプローチは、1つの集団を優先的に拡張しつつ、他の集団を維持する（それによって成長する選択された細胞による希釈により減少させる）または必要な成長条件の非存在により消失させる培養条件を使用する。濃縮、培養および／または拡張された細胞が、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物に組み込まれ得る。
1つの態様においては、幹細胞が収集され、その収集された細胞を、脂肪細胞への分化を誘導するのに十分な時間、脂肪生成培地と接触させ、そしてその脂肪細胞が、移植される生体適合性マトリックスにロードされる。さらなる態様において、幹細胞の少なくとも一部が脂肪細胞に分化され得、それによって最初は両方の細胞型の混合物が存在するが、これが時間と共に実質的に脂肪細胞のみに変化し、幹細胞が検出不可能な少ない量になるようにされる。脂肪組織は、幹細胞によってインビボで製作されるかまたは幹細胞によってエクスビボで調製される。
修復または増強したい組織のタイプに依存して、多くの異なる細胞型またはそれらの組み合わせが注射可能な組成物で使用され得る。これらの細胞型は、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、表皮細胞、内皮細胞、尿路表皮細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ケラチン細胞、肝細胞、胆管細胞、膵島細胞、甲状腺、副甲状腺、副腎、視床下部、下垂体、卵巣、精巣、唾液腺細胞、脂肪細胞および前駆体細胞を含むがこれらに限定されない。例にすぎないが、平滑筋細胞および内皮細胞は、注射可能な組成物が筋肉および／または血管組織、例えば血管、食道、腸管、直腸または尿管組織を修復または増強するために使用される場合に使用され得；軟骨細胞は、軟骨組織のための注射可能な組成物に含められ得；繊維芽細胞は、細胞外マトリックス、例えばコラーゲンを含む任意の幅広い様々な組織型（例えば、皮膚）を置換および／または強化することが意図されている注射可能な組成物に含められ得；脂肪細胞は、任意の幅広い様々な脂肪組織を修復または増強することが意図されている注射可能な組成物に含められ得る。概ね、天然組織において見出される任意の細胞が、対応する組織に対して使用される注射可能な組成物に含められ得る。加えて、前駆体細胞、例えば筋芽細胞または幹細胞が、それらの対応する分化した細胞型を生成するために含められ得る。
いくつかの態様において、注射可能な組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、シルクフィブロイン粒子および場合により活性剤の投与のための、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを表す。薬学的に許容される担体は、シルクフィブロイン粒子および、存在する場合、活性剤の活性に対して適合性であり、かつ対象にとって生理学的に許容される、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、ならびに等張および吸収遅延剤を含む。注射に適した薬学的製剤は、滅菌水溶液または分散液を含む。担体は、例えば、水、細胞培養培地、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。いくつかの態様において、薬学的担体は、緩衝溶液（例えば、PBS）であり得る。
加えて、抗菌保存剤、抗酸化物質、キレート剤および緩衝剤を含む、注射可能な組成物の安定性、滅菌性および等張性を強化する様々な添加剤が、添加され得る。微生物の活動の抑制は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含めることが所望され得る。注射可能な組成物はまた、望まれる調製物に依存して、補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化または粘度強化添加剤、保存剤、染料等を含み得る。基本書、例えば、参照により本明細書に組み入れられる「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」、第17版、1985年は、過度の実験を行わずに適当な調製物を調製する上で参考になり得る。
注射可能な組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を用いて選択されたレベルで維持され得る。1つの態様において、容易かつ安価に入手でき取り扱いが容易であるという理由で、メチルセルロースが使用される。他の適当な増粘剤は、例えば、キサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキプロピルセルロース、カルボマー等を含む。増粘剤の好ましい濃度は、選択される薬剤および望まれる注射粘度に依存し得る。重要なことは、選択された粘度を達成し得る量の使用、例えば、注射可能な組成物のいくつかの態様へのそのような増粘剤の添加、である。
典型的に、（本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または追加の活性剤に加えて）任意の添加剤が、乾燥重量でまたは緩衝溶液中に、0.001〜50 wt%の量で存在し得る。いくつかの態様において、活性剤は、マイクログラム〜ミリグラム〜グラムのオーダー、例えば、約0.0001〜約5 wt%、約0.0001〜約1 wt%、約0.0001〜約0.05 wt%または約0.0001〜約20 wt%、約0.01〜約10 wt%、および約0.05〜約5 wt%、で存在し得る。任意の薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与する際、毒性を、例えば適当な動物モデル、例えばげっ歯類、例えばマウスまたはラットにおいて致死用量（LD）およびLD50を決定することによって；ならびに適当な応答を誘起する組成物の用量、その成分の濃度および組成物を投与するタイミングを、決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識があれば過度の実験を要するものではない。
活性剤
いくつかの態様において、本明細書に記載される注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、少なくとも1つの活性剤をさらに含み得る。活性剤は、注射可能な組成物中に混合され、分散されもしくは懸濁され得、および／またはそれはシルクフィブロイン粒子中に分配されもしくは埋め込まれ得る。いくつかの態様において、活性剤は、シルクフィブロイン粒子中に分配され、埋め込まれまたはカプセル化され得る。いくつかの態様において、活性剤は、シルクフィブロイン粒子の表面上にコーティングされ得る。いくつかの態様において、活性剤は、注射可能な組成物を形成するよう、シルクフィブロイン粒子と混合され得る。「活性剤」という用語はまた、以下に記載されるような2つまたはそれ以上の活性剤の組み合わせまたは混合物を含み得る。活性剤の例は、生物学的活性剤（例えば、治療剤）、美容活性剤（例えば、アンチエイジング剤）、細胞接着剤（例えば、インテグリン結合分子）およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「生物学的活性剤」という用語は、インビボで少なくとも1つの生物学的効果を発揮する任意の分子を表す。例えば、生物学的活性剤は、対象の疾患状態または状況を処置または予防するための治療剤であり得る。生物学的活性剤の例は、非限定的に、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、抗体またはその一部分、抗体様分子、核酸（DNA、RNA、siRNA、shRNA）、多糖類、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、成長因子、自家骨髄、抗生物質、抗菌剤、低分子および治療剤を含む。生物学的活性剤はまた、非限定的に、抗炎症剤、麻酔剤、組織形成ならびに／または天然組織の治癒および再成長を刺激する活性剤、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得る。
抗炎症剤は、ナプロキセン、スリンダク、トルメチン、ケトロラク、セレコキシブ、イブプロフェン、ジクロフェナク、アセチルサリチル酸、ナブメトン、エトドラク、インドメタシン、ピロキシカム、cox-2阻害剤、ケトプロフェン、抗血小板薬、サルサレート、バルデコキシブ、オキサプロジン、ジフルニサル、フルルビプロフェン、コルチコステロイド、MMP阻害剤およびロイコトリエン修飾剤またはそれらの組み合わせを含み得るがこれらに限定されない。
注射部位において新しい組織の形成を亢進するおよび／またはネイティブ組織の治癒もしくは再成長を刺激する薬剤は、繊維芽細胞成長因子（FGF）、形質転換成長因子ベータ（TGF-β）、血小板由来成長因子（PDGF）、表皮成長因子（EGF）、結合組織活性化ペプチド（CTAP）、骨形態形成タンパク質を含む骨形成因子、ヘパリン、アンジオテンシンII（A-II）およびそれらのフラグメント、インスリン様成長因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、神経成長因子、インターフェロン、そのような成長因子の生物学的に活性なアナログ、フラグメントおよび誘導体、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得るがこれらに限定されない。
麻酔剤は、尾骨、硬膜外、吸入、注射、球後および脊椎適用において使用されるもの、例えば、ブピバカイン、リドカイン、ベンゾカイン、セタカイン、ロピバカインおよびテトラカイン、またはそれらの組み合わせを含み得るがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、活性剤は、美容活性剤であり得る。「美容活性剤」という用語は、皮膚、毛髪または爪に対する美容または治療効果を有する化合物、例えば、アンチエイジング剤、抗フリーラジカル剤、明色化（lightening）剤、美白剤、脱色剤、暗色化（darkening）剤、例えば、セルフタンニング剤、着色剤、抗ニキビ剤、光沢調整（shine control）剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗カビ剤、抗寄生虫剤、外用鎮痛剤、日焼け止め剤、光防護剤、抗酸化物質、角質溶解剤、界面／表面活性剤、保湿剤、栄養剤、ビタミン、エネルギー補給剤、抗発汗剤、収斂剤、脱臭剤、脱毛剤、安定剤、抗硬化（anti-callous）剤、筋弛緩剤、毛髪、爪および／または皮膚のコンディショニング剤、ならびにそれらの任意の組み合わせ、を意味する。
1つの態様において、美容活性剤は、ヒドロキシ酸、過酸化ベンゾイル、硫黄レゾルシノール、アスコルビン酸、D-パンテノール、ヒドロキノン、メトキシ経皮酸オクチル、二酸化チタン、サリチル酸オクチル、ホモサラート、アボベンゾン、ポリフェノール、カロテノイド、フリーラジカルスカベンジャー、セラミド、多価不飽和脂肪酸、必須脂肪酸、酵素、酵素阻害剤、鉱物、ホルモン、例えばエストロゲン、ステロイド、例えばヒドロコルチゾン、2-ジメチルアミノエタノール、銅塩、例えば塩化銅、コエンザイムQ10、リポ酸、アミノ酸、例えばプロリンおよびチロシン、ビタミン、ラクトビオン酸、アセチルコエンザイムA、ナイアシン、リボフラビン、チアミン、リボース、電子伝達体、例えばNADHおよびFADH2、ならびにその他の植物抽出物、例えばアロエベラ、ナツシロギクおよびダイズ、ならびにそれらの誘導体および混合物からなる群より選択され得るがこれらに限定されない。ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンB（例えば、ビタミンB3、ビタミンB5およびビタミンB12）、ビタミンC、ビタミンKおよびビタミンE、ならびにそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。
1つの態様において、美容活性剤は、抗酸化物質であり得る。抗酸化物質の例は、水溶性抗酸化物質、例えばスルフヒドリル化合物およびそれらの誘導体（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびN-アセチル-システイン）、リポ酸およびジヒドロリポ酸、レスベラトロール、ラクトフェリン、アスコルビン酸およびアスコルビン酸誘導体（例えば、パルミチン酸アスコルビルおよびアスコルビルポリペプチド）を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される組成物において使用するのに適した油溶性抗酸化物質は、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール（例えば、トコフェリル酢酸）、トコトリエノールおよびユビキノンを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される注射可能な組成物において使用するのに適した抗酸化物質を含む天然抽出物は、フラボノイドおよびイソフラボノイドならびにそれらの誘導体（例えば、ゲニステインおよびダイゼイン（diadzein））を含む抽出物、ならびにレスベラトロールを含む抽出物を含むがこれらに限定されない。そのような天然抽出物の例は、ブドウ種子、緑茶、松樹皮およびプロポリスを含む。抗酸化物質の他の例は、ICI Handbookの1612〜13ページにおいて見出すことができる。
いくつかの態様において、活性剤は、細胞接着剤であり得る。細胞接着剤の例は、ヒアルロン酸、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸／コラーゲン、インテグリン結合分子、キトサン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、軟部組織の増強のための少なくとも1つの追加材料、例えば、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロスフィア、ヒドロキシルアパタイト、ポリ（L-乳酸）、コラーゲン、エラスチンおよびグリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、市販の真皮充填材製品、例えばBOTOX（登録商標）（Allergan製）、DYSPORT（登録商標）、COSMODERM（登録商標）、EVOLENCE（登録商標）、RADIESSE（登録商標）、RESTYLANE（登録商標）、JUVEDERM（登録商標）（Allergan製）、SCULPTRA（登録商標）、PERLANE（登録商標）およびCAPTIQUE（登録商標）、ならびにそれらの任意の組み合わせ、を含むがこれらに限定されない真皮充填材料をさらに含み得る。
いくつかの態様において、注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、例えば生物医学的画像化のために、金属ナノ粒子（例えば、非限定的に、金ナノ粒子）、光学分子（例えば、非限定的に、蛍光分子および／または量子ドット）ならびに任意のその他の当技術分野で知られている造影剤を含み得る。
様々な態様において、注射可能な組成物は、乾燥状態または水和状態で保管または輸送され得る。
活性剤がシルクフィブロイン粒子中に埋め込まれる場合、その活性剤の生物活性（例えば、その活性剤の生物活性の少なくとも約30％）は、特定の条件下で、一定期間（例えば、数日間、数週間または数ヶ月間）安定化され得る。そのような条件は、状態を変化させるサイクル（例えば、凍結・解凍サイクル）、温度（例えば、0℃超）、気圧、湿度および露光を含み得るがこれらに限定されない。米国特許出願第61/477,737号を参照のこと。注射可能な組成物のいくつかの態様は、約0℃〜約60℃、約10℃〜約60℃または約15℃〜約60℃の間で保管または輸送され得る。これらの態様において、注射可能な組成物は、室温で保管または輸送され得、その間、活性剤の生物活性（例えば、活性剤の生物活性の少なくとも約30％）は、一定期間、例えば少なくとも約3週間またはそれ以上、安定化され得る。
本明細書に記載される注射可能な組成物およびシルクフィブロイン粒子の適用
本明細書に記載される注射可能な組成物は、非限定的に、組織空間の充填材、組織再建または再生のテンプレート、組織工学適用における細胞のスキャホールドまたは薬物送達のビヒクル／担体を含む、様々な医学的用途で使用され得る。修復または増強したい組織に注射された複数のシルクフィブロイン粒子は、体内の細胞外マトリックス（ECM）を模倣するおよび／または組織再生を促進するためのスキャホールドとしての役割を果たし得る。スキャホールドは、細胞をその中で増殖させるための物理的な支持体および／または接着性のテンプレートの両方として機能し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、細胞を含まないものであり得る。さらに、シルクフィブロイン粒子は、細胞接着剤、例えばコラーゲン、および／または宿主の細胞をシルクフィブロイン粒子に誘引し細胞増殖を支援し得る化学誘引物質、例えば成長因子、でコーティングされ得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい標的組織に投与する前に、細胞を播種され得る。
いくつかの態様において、本明細書には、それを必要とする組織を充填、容量増加および／または再生するために使用され得る注射可能な組成物が提供される。注射可能な組成物は、概ね、対象における組織の充填または容量増加、軟部組織の増強、置換、美容強化および／または組織の修復のために使用され得る。加えて、注射可能な組成物は、自然に形成された（例えば、加齢）か、または組織（例えば、皮膚嚢胞または固形腫瘍）の除去のための外科的手順、コルチコステロイド処置、脂肪萎縮症を引き起こす免疫学的反応、激突による損傷もしくは治療的処置（例えば、放射線療法もしくは化学療法）に起因する組織損傷によって形成されたかのいずれかの任意の組織の空隙またはへこみを満たすために使用され得る。注射可能な組成物はまた、陥凹瘢痕を盛り上げるために使用され得る。
特定の態様において、注射可能な組成物は、軟部組織の増強のために使用され得る。本明細書で使用される場合、「増強する」または「増強」という用語は、組織の増大、充填、回復、強化または置換を意味する。いくつかの態様において、組織は、その弾性、硬度、形状および／または容量を喪失し得る。いくつかの態様において、組織は部分的にまたは完全に喪失（例えば、組織の除去）または損傷し得る。これらの態様において、「増強する」または「増強」という用語はまた、本明細書に記載される少なくとも1つの注射可能な組成物を組織に注射することによる、組織における少なくとも1つの症状または欠損（例えば、非限定的に、組織における弾性、硬度、形状および／または容量の喪失；組織における空隙またはへこみの存在；組織における機能の喪失）の軽減、減少または緩和も表し得る。そのような態様において、組織における少なくとも1つの症状または欠損は、処置しない場合と比較して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上、軽減、減少または緩和され得る。いくつかの態様において、組織における少なくとも1つの症状または欠損は、処置しない場合と比較して、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％またはそれ以上、軽減、減少または緩和され得る。いくつかの態様において、組織における少なくとも1つの症状または欠損は、処置しない場合と比較して、100％軽減、減少または緩和され得る（欠損がなくなるまたは欠損が当業者に検出不可能になる）。他の態様において、組織は、組織における欠損の症候、例えば組織の弾性、硬度、形状および／もしくは容量の喪失またはしわ（wrinkle）の兆候、の発生を防ぐまたは遅らせるために使用され得る。本明細書で使用される場合、「軟部組織の増強」というフレーズは、概ね、例えば軟部組織の美容的または審美的な外観を改善するための、組織の増大、充填、回復、強化または置換を含むがこれらに限定されない軟部組織の構造の変更を指すのに使用される。例えば、乳房の増強（豊胸術（breast enlargement）、乳房拡大術（mammoplasty enlargement）、乳房増大術（augmentation mammoplasty）としても公知）は、女性の美容的または審美的な外観を改善するために女性の乳房のサイズおよび形状を変更する。軟部組織の増強の例は、真皮組織の増強、特に顔および首の、線（line）、ひだ（fold）、しわ、小さな顔のくぼみおよび口唇裂の充填；手および足、指ならびにつま先のものを含む、加齢または疾患に起因する小さな変形箇所の矯正；発声のリハビリのための声帯または声門の増強；睡眠線（sleep line）および表情線（expression line）の真皮充填；加齢による真皮および皮下組織の喪失の置換；唇の増強；ウシの足および目の周りの眼窩の溝の充填；乳房の増強；顎の増強；頬および／または鼻の増強；尿道周囲の支持、例えば過度の脂肪吸込またはその他の外傷に起因する軟部組織、真皮または皮下のへこみを満たすためのバルク剤；にきびまたは外傷性瘢痕の充填；ほうれい線、鼻眉間の線（nasoglabellar line）および口腔内の線の充填を含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載される注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、顔の脂肪萎縮症を処置するために使用され得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物は、乳房の増強および／または再建のために使用され得る。
いくつかの態様において、注射可能な組成物は、軟部組織の修復のために使用され得る。組織に関して本明細書で使用される「修復」または「修復する」という用語は、組織の容量、形状および／または機能を回復する組織の任意の矯正、補強、修繕、治療、再生、充填を表す。いくつかの態様において、「修復」は、完全な修復および部分的な修復を含む。例えば、修復したい組織の容量、形状および／または機能は、処置しない場合と比較して、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上回復し得る。いくつかの態様において、修復したい組織の容量、形状および／または機能は、処置しない場合と比較して、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％またはそれ以上回復し得る。いくつかの態様において、修復したい組織の容量、形状および／または機能は、処置しない場合と比較して、100％回復し得る（欠損がなくなるまたは欠損が当業者に検出不可能になる）。様々な態様において、注射可能な組成物は、上記の任意の軟部組織、例えば乳房、皮膚および軟部組織の増強に適した任意の軟部組織を修復するために使用され得る。いくつかの態様において、「修復」または「修復する」という用語は、本明細書において、組織の処置を指して使用される「再生」または「再生する」という用語と言い換え可能に使用される。
いくつかの態様において、注射可能な組成物は、軟部組織の再建のために使用され得る。本明細書で使用される場合、「軟部組織の再建」というフレーズは、例えば大きな事故または外科的除去によって重度に損傷したまたは喪失した軟部組織の構造を再構築することを表す。例えば、乳房の再建は、通常女性における、乳房の再構築である。自然な見た目の乳房を構築する従来法は、一般に、自家組織または補綴物を使用するものである。いくつかの態様において、そのような乳房の再建は、自然な見た目の乳輪および乳頭の再形成を含み得、そのような手順はインプラントまたは患者自身の組織の移設フラップを使用するものであり得る。いくつかの態様において、再建したい軟部組織領域への注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子の投与は、一定期間、例えば少なくとも6週間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間またはそれ以上、再建された軟部組織の構造の形状および／またはサイズを維持し得る。
制約されることを望まないが、注射可能な組成物のいくつかの態様は、硬組織（筋骨格）の増強または修復、例えば骨、軟骨および靭帯の増強または修復に使用され得る。
本明細書に記載される注射可能な組成物およびシルクフィブロイン粒子はまた、補綴用インプラント、例えば、非限定的に、従来的な乳房インプラントまたは膝置換インプラント、に位置するまたはその付近の組織を満たすために使用され得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物およびシルクフィブロイン粒子は、補綴用インプラントと組織の間をつなぎ合わせるために、例えば、補綴用インプラントと組織の間の空隙を満たすためおよび／または組織が補綴用インプラントと直接接触するのを防止するために、使用され得る。例にすぎないが、本明細書に記載される注射可能な組成物は、対象に補綴用インプラント（例えば、乳房インプラント）を設置した後、インプラントと組織（例えば、乳房組織）の間の任意の空隙を満たすためおよび／またはその組織をより自然な見た目となるよう「造形する」ために、インプラントまたはその付近に導入され得る。
本明細書に記載されるいずれかの使用において、シルクフィブロイン粒子は、修復を生物学的に強化する目的で細胞と組み合わされ得る。細胞は、ヒト自家移植組織またはトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない多くの宿主から回収され得る。より詳細に、使用されるヒト細胞は、幹細胞（例えば、脂肪細胞由来幹細胞）、骨細胞、繊維芽細胞、脂質細胞、仕分けされた免疫細胞、吸引脂肪由来の細胞またはそれらの任意の組み合わせから選択される細胞を含み得る。いくつかの態様において、細胞は、シルクフィブロイン粒子自体をリンスした後に添加され得る。それらは、注射の前に、シルクフィブロイン粒子、担体溶液またはシルクフィブロイン粒子と担体溶液の混合物にブレンドされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物と共に細胞（例えば、幹細胞または吸引脂肪）を投与することにより、経時的な宿主への統合および／または組織の形成が強化または加速され得る。細胞は、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子もしくは注射可能な組成物と混合され得、またはそれらは、シルクフィブロイン粒子もしくは注射可能な組成物が標的部位に導入される前、それと同時もしくはそれ以降に投与され得る。学説による制約を望まないが、細胞は、標的部位において血管新生促進因子および／または成長因子を分泌し得る。組織が再生またはリモデルされて空隙が満たされまたは欠損が修復されるにつれ、シルクフィブ粒子はそれにしがたって分解し得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、再生された宿主組織に統合され得る。
加えて、結果を改善する目的でシルクフィブロイン粒子に添加される活性剤、例えば治療剤、医薬または特定の成長因子は、シルクフィブロイン粒子の製造プロセスの様々な時点のいずれかまたはその組み合わせにおいて導入され得る。いくつかの態様において、これらの要素は、乾燥および固化の前にシルクフィブロイン溶液または反応促進剤（accelerant）相に添加され得、それらは反応促進剤をリンスするプロセスの間にシルクフィブロインマトリックスに浸漬され得、またはそれらはリンス後にバルクシルクフィブロイン上にコーティングされ得る。活性剤を含有する固体状シルクフィブロインは、その後、本明細書に記載される方法を用いて粒子に細小化され得る。いくつかの態様において、固体状シルクフィブロインは、活性剤をシルクフィブロイン粒子に導入する前に粒子に細小化され得る。例えば、活性剤は、シルクフィブロイン粒子に浸漬され得、シルクフィブロイン粒子上にコーティングされ得、またはシルクフィブロイン粒子とのブレンドの前または後に担体流体に投入され得る。
いくつかの局面において、本明細書に記載される注射可能な組成物およびシルクフィブロイン粒子は、組織の空白部分の充填材として使用され得る。1つの態様において、組織の空白部分の充填材は、真皮充填材である。真皮充填材は、皮膚を再水和させるため、皮膚に高い弾性を提供するため、皮膚の荒れを減らすため、皮膚をより張りのある状態にするため、ストレッチ線またはストレッチマークを減らすまたはなくすため、皮膚により良い色調、光沢、明るさおよび／または輝きを与えるため、皮膚のしわを減らすまたはなくすため、皮膚に防しわ性を提供するためおよび軟部組織の喪失を置換するためを含むがこれらに限定されない、皮膚の外観または状況を改善するために使用され得る。
シルクフィブロイン粒子を含む真皮充填材は、シルクフィブロイン濃度および形成方法の変更を通じて、粒子硬度および不透明度について調整され得る。1つの態様において、真皮充填材は、約6% (w/v)〜約20% (w/v)のシルクフィブロイン溶液から固体状シルクフィブロインを形成し、その後にこの固体状シルクフィブロインを、針またはカニューレを通じて組織に注射できるようにシルクフィブロイン粒子に細小化することによって、製造され得る。針またはカニューレは、3mm以下、2mm以下、1mm以下、0.8mm以下、0.6mm以下、0.4mm以下、0.2mm以下または0.1mm以下の外径を有し得る。いくつかの態様において、針またはカニューレのゲージは、12〜34、15〜34、20〜32または25〜30の範囲であり得る。針またはカニューレのサイズは、40N（ヒトの手による名目上の送達可能な注射力）未満の適当な押出力を実現するよう決定され得る。
したがって、本明細書に記載される別の局面は、それを必要とする対象の皮膚の状況および／または外観を改善する方法を提供する。皮膚の状況および／または外観の非限定的な例は、脱水症、皮膚の弾性の欠如、荒れ、皮膚の張りの欠如、皮膚のストレッチ線および／またはストレッチマーク、皮膚の蒼白および皮膚のしわを含む。この方法は、本明細書に記載される注射可能な組成物を対象の真皮領域に注射する工程を含み、注射は皮膚の状況および／または外観を改善する。例えば、皮膚の外観を改善することは、皮膚を再水和させること、皮膚に高い弾性を提供すること、皮膚の荒れを減らすこと、皮膚をより張りのある状態にすること、ストレッチ線またはストレッチマークを減らすまたはなくすこと、皮膚の蒼白を減らすために皮膚により良い色調、光沢、明るさおよび／または輝きを与えること、皮膚のしわを減らすまたはなくすこと、および皮膚に防しわ性を提供することを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「真皮領域」という用語は、真皮表層部（乳頭領域）および真皮深部（網状領域）を含む表皮真皮境界部および真皮を含む皮膚の領域を表す。皮膚は、3つの主要な層：防水性を提供し、感染に対する障壁として機能する表皮；皮膚付随物のための場所として機能する真皮；および皮下組織（皮下脂肪層）、から構成される。表皮は血管を含まず、真皮からの拡散により栄養を得ている。表皮を形成する主要な細胞型は、ケラチン細胞、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞を含むがこれらに限定されない。
真皮は、結合組織からなる表皮下の皮膚層であり、応力およびひずみに対する身体のクッションとなる。真皮は、基底膜によって表皮に緊密に結合されている。これはまた、触感および熱の感覚を提供する多くの機械受容器／神経終末を保有している。これは毛包、汗腺、皮脂腺、アポクリン腺、リンパ管および血管を含んでいる。真皮の血管は、それ自身の細胞および表皮の基底層に対する栄養補給および老廃物除去を提供する。真皮は構造的に2つの領域：乳頭領域と呼ばれる表皮に隣接する表層領域および網状領域として公知のより深部の厚い領域に分けられる。
乳頭領域は、ゆるい疎性結合組織から構成される。その名は、表皮に向かって延びる乳頭と呼ばれるその指のような突起物に由来する。乳頭は、表皮と互いに入り組んだ「でこぼこの」表面を真皮に提供し、この2つの皮膚層の間の結合を強固にしている。網状領域は、乳頭領域の深部に位置し、通常ずっと厚みがある。これは、高密度の不規則な結合組織から構成され、それを編み上げている高濃度のコラーゲン性、弾性および網状の繊維からその名前がきている。これらのタンパク質繊維は、真皮にその強度、伸展性および弾性の特性を付与している。この網状領域には毛根、皮脂腺、汗腺、受容器、爪および血管も位置している。妊娠に起因するストレッチマークも真皮に位置する。
皮下組織は、皮膚の一部ではなく、真皮の下に存在している。その目的は皮膚をその下層にある骨および筋肉に接着させることならびにそれに血管および神経を供給することである。これは、疎性結合組織およびエラスチンからなっている。主要な細胞型は繊維芽細胞、マクロファージおよび脂肪細胞（皮下組織は、体脂肪の50％を含んでいる）である。脂肪は、身体のパッドおよび遮蔽物として機能する。
1つの態様において、本明細書には、皮膚の脱水症を処置する方法であって、皮膚の脱水症を患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む、方法、が提供される。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚を再水和させ、それによって皮膚の脱水症を処置する。
別の態様において、皮膚の弾性の欠如を処置する方法は、皮膚の弾性の欠如を患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚の弾性を増大させ、それによって皮膚の弾性の欠如を処置する。
さらに別の態様において、皮膚の荒れを処置する方法は、皮膚の荒れを患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚の荒れを減らし、それによって皮膚の荒れを処置する。
さらに別の態様において、皮膚の張りの欠如を処置する方法は、皮膚の張りの欠如を患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚をより張りのある状態にし、それによって皮膚の張りの欠如を処置する。
さらなる態様において、皮膚のストレッチ線またはストレッチマークを処置する方法は、皮膚のストレッチ線またはストレッチマークを患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚のストレッチ線またはストレッチマークを減らしまたはなくし、それによって皮膚のストレッチ線またはストレッチマークを処置する。
別の態様において、皮膚の蒼白を処置する方法は、皮膚の蒼白を患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚の色調または輝きを向上させ、それによって皮膚の蒼白を処置する。
別の態様において、皮膚のしわを処置する方法は、皮膚のしわを患った真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚のしわを減らしまたはなくし、それによって皮膚のしわを処置する。
さらに別の態様において、皮膚のしわの形成を処置する、予防するまたは遅らせる方法は、しわができやすいまたはしわの兆候を示す真皮領域に本明細書に記載される注射可能な組成物の1つまたは複数の態様を注射する工程を含む。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により生物学的流体担体（例えば、吸引脂肪）および／または活性剤を含み得、該組成物の注射が皮膚に皮膚のしわに対する耐性を与え、それによって皮膚のしわの形成を処置する、予防するまたは遅らせる。
真皮領域に注射されるシルクフィブロイン粒子の有効量および投与スケジュールは、非限定的に、皮膚状況のタイプ、皮膚状況の位置、皮膚状況の原因、皮膚状況の重篤度、望まれる救済の程度、望まれる救済の期間、使用される個々のシルクフィブロイン粒子製剤、使用される個々のシルクフィブロイン粒子製剤の分解または容量保持率、使用される個々のシルクフィブロイン粒子製剤の薬力学、使用される個々のシルクフィブロイン粒子製剤に含まれる他の化合物の性質、個人の個々の特徴、病歴および危険因子、例えば年齢、体重、全般健康およびそれらの任意の組み合わせを含む様々な要因を考慮して当業者によって決定され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、3ヶ月毎、6ヶ月毎、9ヶ月毎、毎年、2年毎またはそれ以上の間隔で真皮領域に注射され得る。
別の局面において、注射可能な組成物は、軟部組織である身体の一部分、例えば唇、乳房、乳房の一部分、例えば乳頭、筋肉または脂肪および／または結合組織が形状、遮蔽またはその他の生物学的機能を提供するために使用される任意のその他の柔らかい身体の一部分を再建または増強するための真皮の増量のための真皮充填材として使用され得る。これらの適用で使用される充填材における、シルクフィブロインの濃度および／またはシルクフィブロイン粒子混合物に添加される担体（例えば、生理食塩水）の量は、その生物学的環境の関連する制約を考慮して調節され得る。例えば、乳房の増強のためのシルクフィブロイン粒子は、シルクフィブロイン濃度および処理方法の変更を通じて粒子の硬度および容量保持性に関して適合され得る。例えば、場合により活性剤、例えば脂肪細胞、例えば脂肪由来幹細胞または吸引脂肪由来の細胞を含む、約4％（w/v）〜約8％（w/v）のシルクフィブロイン濃度が、シルクフィブロイン粒子を製造するために使用され得る。担体含有量は、生理食塩水の場合、0％〜25％（v/v）のオーダーであり得る。他の要因、例えば欠損のタイプ、欠損のサイズおよび個別の充填材の注射深度に対する要求、も考慮されるべきである。
制約されることを望まないが、注射が最小の侵襲性であるものの、他の投与方法、例えば、必要とされる場合、例えば大きな欠損領域を修復または増強するために、移植、も使用され得る。例えば、真皮への注射または唇の増強のために、26g〜30gのサイズのシリンジ針が使用され得る。多量の充填材を用いる適用、例えば乳房の再建または乳房の増強においては、より大きな粒子サイズおよびより大きな口径の針、例えば23g〜27g、またはより小さな針ゲージが、充填材を投与するために使用され得る。いくつかの態様において、外科手術、例えば移植、もまた、多量の充填材を投与するためおよび／または特定の組織深度に到達するために使用され得る。
したがって、本明細書に記載されるさらに別の局面は、軟部組織の再建、修復または増強の方法であって、1つまたは複数の態様の本明細書に記載される注射可能な組成物を、それを必要とする個体の軟部組織領域に投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、注射可能な組成物は、複数のシルクフィブロイン粒子ならびに場合により活性剤および／または担体（例えば、吸引脂肪等の生物学的流体担体）を含み得る。本明細書に記載される注射可能な組成物の投与方法は、当業者によって決定され得る。いくつかの態様において、投与方法は、注射であり得る。いくつかの態様において、投与方法は、外科手術、例えば移植、であり得る。
本明細書に記載される注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は標的領域に直接適用され得るが（例えば、注射または外科手術）、いくつかの態様において、本明細書に開示される注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子はまた、欠損領域に設置される膨張可能で移植可能な医療デバイス、例えば、膨張可能な乳房インプラントシェルを満たすために使用され得る。そのような態様において、本明細書には、軟部組織の再建、修復または増強の方法であって、移植可能な医療デバイスを個体の軟部組織の領域の所望の位置に設置する工程；ならびにデバイスを本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物で満たすことによってデバイスを膨張させる工程、を含み、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物を満たすことによる医療デバイスの膨張は、軟部組織を再建または増強し得る、方法、が提供される。
本明細書に開示されるシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物はまた、子宮筋腫の経皮処置のための子宮動脈塞栓を含む、異常な血管（動脈）（例えば、出血を止める目的で）または臓器（過剰な機能を停止させるために、例えば、脾機能亢進の場合の脾臓の塞栓）を遮断するためのインターベンショナルラジオロジー塞栓手順と組み合わせて使用され得る。シルクフィブロイン粒子の硬度および容量保持率の調整は、上記のようにシルクフィブロイン濃度および処理方法の変更を通じて行われ得る。
本明細書に開示されるシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物は、隣接する椎体間の正常な距離を維持するのを補助するために、例えば脊椎円板の髄核除去手術によって形成された、脊椎の空隙部を修復するために使用され得る。いくつかの態様において、複数のシルクフィブロイン粒子を含む椎間板充填材が、脊椎の、例えば椎体間、および／または破壊された脊椎円板に存在する空隙部を修復するために使用され得る。そのような態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子を製作するために、約4％（w/v）〜約10％（w/v）のシルクフィブロイン濃度が使用され得る。反応促進剤および／または活性剤もまた、関心対象の部位への注射前、注射時または注射後に、シルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物に混合され得る。
本明細書に開示されるシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物は、眼球の構造を支持し、網膜の位置を維持するために、硝子体腔を満たすのに使用され得る。本明細書に記載される注射可能な組成物の粘度は、当業者により、眼内の硝子体液の粘度に調節され得る。
いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、組織の再建もしくは増強、例えば軟部組織の再建もしくは増強（例えば、乳房の増強）のための、さらには小骨または軟骨の欠損、例えば骨折のためのテンプレートとして使用され得る。本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物の投与は、軟骨／骨の修復を改善するため、軟骨／骨細胞の内方成長および増殖を促進しコラーゲンマトリックスの蓄積を支持するために使用され得る。別の局面において、細胞集団を拡張し軟骨組織の発達を促進するため、投与の前に、ドナーの軟骨細胞が、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物に播種または混合される。いくつかの態様において、軟骨または骨の組織形成を支持する特定の成長因子、例えば、それぞれ、TGF-βまたは骨形態形成タンパク質（BMP）が、シルクフィブロイン粒子に添加され得る。
別の態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、顔の整形手術、例えば鼻の再建、のために使用され得る。軟骨／骨の欠損を修復するための上記の再建戦略もまた、顔の整形手術に適用可能であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、組織工学において細胞成長を支持するためのスキャホールドとして使用され得る。例えば、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、創傷の治癒または創傷の顕示を促進するために、切開または創傷部位に投与され得る。この方法は、通常、本明細書に記載される注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子を創傷または切開部位に投与する工程、およびシルクフィブロイン粒子が体内で浸食または吸収されそれが個体自身の生組織と置き換わる間に創傷または切開を治癒させる工程を含む。この方法はさらに、投与前または投与時に、その個体由来またはドナー由来のいずれかの生細胞材料をシルクフィブロイン粒子に播種するまたは注射可能な組成物と混合する工程を含み得る。
別の局面において、シルクフィブロイン粒子を含む注射可能な組成物は、対象の組織を修復、増強または再建する、例えばヒトの乳房を増強または再建する方法において、直接的または間接的に使用され得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、例えば注射によって、修復または増強したい組織（例えば、乳房組織）に直接的に設置され得る。注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、6ヶ月毎、毎年、2年毎、3年毎またはそれより長い間隔で、組織（例えば、乳房組織）に注射され得る。他の態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、例えば乳房インプラントの下側支柱位置の支持を強化することによって、従来的な組織インプラントの支持を強化するために、使用され得る。代替の態様において、この方法は、通常、組織インプラント、例えば従来的な乳房インプラントの付近または近位に注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子を投与する工程、ならびに投与前または投与時に注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子に生細胞材料を播種する工程、を含み得る。さらに別の態様において、注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、宿主の細胞との優れた境界面を提供するためにおよび位置異常または被膜拘縮の可能性を減らすために組織インプラント（例えば、乳房インプラント）を部分的または完全に覆うために使用され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、例えば顔の脂肪異栄養症を処置するために、脂質生成を促進または支持するための充填材として使用され得る。そのような態様において、注射可能な組成物および／またはシルクフィブロイン粒子は、対象の顔の脂肪異栄養症を患った標的領域への注射の前または注射と同時に、脂肪関連細胞、例えば脂肪由来幹細胞、または吸引脂肪を播種され得るまたはこれらと混合され得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン粒子は、処置を維持するために、3ヶ月毎、6ヶ月毎、9ヶ月毎、毎年、2年毎またはそれより長い間隔で注射され得る。
さらに別の態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、末梢神経の修復に有用な細胞のスキャホールドとして使用され得る。シルクフィブロイン粒子は、神経終末との接続を補助する追加のデバイスを用いてまたは用いずに、神経の欠損位置に（例えば、注射を通じて）送達され得る。そのような目的で、神経の再生を支持する特定の成長因子、例えば、神経成長因子（NGF）が、投与前または投与時に、注射可能な組成物に添加および／またはシルクフィブロイン粒子に混合され得る。そのような態様において、例えば約0.5（w/v）〜約3％（w/v）のシルクフィブロイン濃度を用いる柔らかいシルクフィブロイン粒子が使用され得る。脳のミクロ環境に依存して、より硬いシルクフィブロイン粒子も使用され得る。シルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物は、上記の方法にしたがい、適当な治療因子と共に注入または適当な治療因子を添加され得る。
本明細書に記載される任意の細胞が、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子の表面に播種され得る。例えば、シルクフィブロイン粒子は、関心対象の細胞に適した成長培地に浸漬され、次いで細胞に直接曝露され得る。細胞は、シルクフィブロイン粒子の表面および隙間で増殖する。シルクフィブロイン粒子は、その後、成長培地から取り出され、必要な場合洗浄され、そして投与される。あるいは、細胞が適当な緩衝液または液体成長培地中に入れられ、そして減圧濾過を用いることによってシルクフィブロイン粒子を通して吸い取られ得る。細胞はまた、シルクフィブロイン粒子を形成する前に、シルクフィブロイン溶液と混合され得、その細胞の少なくともいくつかがシルクフィブロイン粒子内に捕捉される得る。別の態様において、関心対象の細胞が適当な溶液（例えば、成長培地または緩衝液）に分散され、次いでシルクフィブロイン粒子に噴霧され得る。例えば、電気スプレーは、適当な粘度および濃度を有する細胞含有溶液を、細胞を含有する溶液の小さな荷電した液滴の噴霧物を得るのに十分な電場に供するものである。
いくつかの態様において、少なくとも1つの活性剤を含むシルクフィブロイン粒子または注射可能な組成物は、薬物送達のプラットフォームとして使用され得る。例えば、シルクフィブロイン粒子は、薬剤が粒子中に取り込まれているかまたは粒子に結合されているかのいずれかの状態で形成され、次いで体内に投与（例えば、注射、移植、または経口投与でもある）され得る。いくつかの態様において、活性剤がシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物と混合され、次いで体内に投与（例えば、注射、移植、または経口投与でもある）され得る。延長または持続放出の場合、シルクフィブロイン粒子は、例えば、その容量保持および／または分解率のためにそのベータシート含有量を調整するよう操作され得る。薬物放出プロファイルをさらに制御するため、薬学的に活性な薬物を含有するシルクフィブロイン粒子は、粘性誘導成分、界面活性剤および／または生理食塩水のような内部潤滑流体（included lubricant fluid）を含むまたは含まないのいずれかの、担体としての役割を果たす追加のシルクフィブロインゲル相と混合され得る。治療剤が結合されたシルクフィブロイン粒子はまた、さらに、その安定性を強化し放出期間を延長するために架橋され得る。代替のアプローチにおいて、シルクフィブロイン粒子は、特定の成長因子またはサイトカインの放出を長期化させるためおよびその機能を安定化させるために、他のポリマー、例えばヒアルロン酸、と混合され得る。さらに、シルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物はまた、例えば噴霧によって、同軸型の薬物送達システムをコーティングするために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「持続放出」という用語は、約7日間またはそれ以上の期間にわたる薬学的に活性な薬物の放出を表す。この態様の局面において、シルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物を含む薬物送達プラットフォームは、例えば、投与後少なくとも約7日間、投与後少なくとも約15日間、投与後少なくとも約30日間、投与後少なくとも約45日間、投与後少なくとも約60日間、投与後少なくとも約75日間または投与後少なくとも約90日間の期間にわたり、薬学的に活性な薬物を放出する。
本明細書で使用される場合、「延長放出」という用語は、約7日間未満の期間にわたる薬学的に活性な薬物の放出を表す。そのような態様において、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子および／または注射可能な組成物を含む薬物送達プラットフォームは、例えば、投与後約1日間、投与後約2日間、投与後約3日間、投与後約4日間、投与後約5日間または投与後約6日間の期間にわたり、薬学的に活性な薬物を放出し得る。
シルクフィブロイン粒子の製剤化および処理方法ならびに関連する適用に依存して、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、定期的に、例えば、3ヶ月毎、4ヶ月毎、5ヶ月毎、6ヶ月毎、7ヶ月毎、8ヶ月毎、9ヶ月毎、10ヶ月毎、11ヶ月毎、毎年、2年毎またはそれ以上の間隔で、（例えば、注射により）投与され得る。
本明細書に記載される任意の適用のいくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に投与される際、少なくとも部分的に乾燥した状態であり得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に投与される際、（例えば、担体の非存在下で）乾燥した状態であり得る。
本明細書に記載される任意の適用のいくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に投与される際、少なくとも部分的に水和した状態であり得る。いくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、修復または増強したい組織に投与される際、（例えば、注射用担体、例えば緩衝溶液および／または吸引脂肪の存在下で）水和した状態であり得る。
本明細書に記載される任意の適用のいくつかの態様において、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子は、皮下、筋肉下または筋肉内注射され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法および／または組成物は、真皮領域で使用され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法および／または組成物は、表皮層、真皮層、皮下組織層またはそれらの任意の組み合わせで使用され得る。
シルクフィブロイン粒子を含む送達デバイスおよびキット
本明細書に記載される注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子を含む送達デバイスもまた、本明細書に提供される。送達デバイスは、注射の目的で使用される任意の従来的な送達デバイス、例えばシリンジ、であり得る。したがって、本明細書に提供されるさらなる局面は、注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子を含むシリンジである。
いくつかの態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）はさらに針を含み得る。いくつかの態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）はさらにカテーテルまたはカニューレを含み得る。
様々な態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）は、注射用担体、例えば緩衝溶液、を含み得る。
様々な態様において、送達デバイス（例えば、シリンジ）は、麻酔剤を含み得る。
本明細書には、針またはカニューレを有するシリンジ内にパッケージ化された注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子の1つの態様を含むキットがさらに提供される。いくつかの態様において、局所麻酔剤が、シリンジ内の注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子とブレンドされ得る。代替の態様において、局所麻酔剤は、別の容器または別のシリンジにパッケージ化され得る。例えば、さらなる処置の前に、処置したい標的組織に局所麻酔剤を適用することが望まれる。例示的な麻酔剤は、リドカインを含むがこれに限定されない。適用に依存して、キットは0.5 mL〜60 mLのサイズのシリンジを含み得、より大きな容量を必要とする適用（例えば、骨充填材、円板充填材）はより大きなサイズのシリンジで提供される。加えて、針のゲージは注射部位にしたがい調節され得、10g〜30gの針が許容される範囲である。例えば、26g〜30gの針が、皮内注射のために使用され得る。
いくつかの態様において、キットはさらに、本明細書に記載される注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子を含む複数のシリンジ（各々針を有する）を含み得る。各々のシリンジは、個々にパッケージ化され得る。
いくつかの態様において、キットはさらに、緩衝溶液または注射用担体を含む容器を含み得る。
いくつかの態様において、キットはさらに、少なくとも1つの追加の空のシリンジを含み得る。いくつかの態様において、キットはさらに、少なくとも1つの追加の針を含み得る。いくつかの態様において、キットはさらに、少なくとも1つのカテーテルまたはカニューレを含み得る。
本明細書に記載される様々な局面の態様は、以下の番号が付された項目によって例示され得る。
１. 対象の組織を修復または増強する方法であって、複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物を修復または増強したい組織に注射する工程を含み、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、方法。
２. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、項目1記載の方法。
３. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、項目2記載の方法。
４. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約60％を保持する、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
５. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、項目4記載の方法。
６. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約80％を保持する、項目5記載の方法。
７. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
８. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、項目1〜7のいずれかに記載の方法。
９. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、項目8記載の方法。
１０. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、項目1〜9のいずれかに記載の方法。
１１. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の10％以下を分解するよう適合されている、項目10記載の方法。
１２. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
１３. シルクフィブロイン粒子が多孔質である、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
１４. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも10％、少なくとも約15％、または少なくとも約30％の多孔度を有する、項目13記載の方法。
１５. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約50％の多孔度を有する、項目14記載の方法。
１６. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約70％の多孔度を有する、項目15記載の方法。
１７. 孔が、約10nm〜約1000μmのサイズを有する、項目13〜16のいずれかに記載の方法。
１８. 孔が、約1μm〜約1000μmのサイズを有する、項目17記載の方法。
１９. シルクフィブロイン粒子が、約500nm〜約5000μmのサイズを有する、項目1〜18のいずれかに記載の方法。
２０. シルクフィブロイン粒子が、約1μm〜約2000μmのサイズを有する、項目19記載の方法。
２１. シルクフィブロイン粒子が、約10μm〜約1500μmのサイズを有する、項目20記載の方法。
２２. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、機械的手段によって固体状多孔質シルクフィブロインから細小化されたものである、項目1〜21のいずれかに記載の方法。
２３. 機械的手段が、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、切断、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目22記載の方法。
２４. 固体状多孔質シルクフィブロインが、ポロゲン浸出法によって形成される、項目22〜23のいずれかに記載の方法。
２５. 組成物またはシルクフィブロイン粒子が、少なくとも1つの活性剤をさらに含む、項目1〜24のいずれかに記載の方法。
２６. 少なくとも1つの活性剤が、生物学的活性剤、美容活性剤、細胞接着剤、造影剤、またはそれらの任意の組み合わせである、項目25記載の方法。
２７. 生物学的活性剤が、薬物、治療剤、麻酔剤、細胞成長因子、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体またはその一部分、抗体様分子、核酸、多糖類、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目26記載の方法。
２８. 細胞接着剤が、ヒアルロン酸、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸／コラーゲン、インテグリン結合分子、キトサン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目26記載の方法。
２９. 美容活性剤が、アンチエイジング剤、抗フリーラジカル剤、抗酸化物質、水和剤、美白剤、着色剤、脱色剤、日焼け止め剤、筋弛緩剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目26記載の方法。
３０. 組成物が細胞をさらに含む、項目1〜29のいずれかに記載の方法。
３１. 細胞が幹細胞である、項目30記載の方法。
３２. 組成物が生物学的流体または濃縮物をさらに含む、項目1〜31のいずれかに記載の方法。
３３. 生物学的流体または濃縮物が、吸引脂肪、吸引骨髄またはそれらの任意の組み合わせである、項目32記載の方法。
３４. 生物学的流体または濃縮物が吸引脂肪である、項目32記載の方法。
３５. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約1:19〜約12:19の範囲である、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
３６. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約3:19〜約6:19の範囲である、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
３７. 組成物またはシルクフィブロイン粒子がヒドロゲルをさらに含む、項目1〜36のいずれかに記載の方法。
３８. 組成物またはシルクフィブロイン粒子が真皮充填材料をさらに含む、項目1〜37のいずれかに記載の方法。
３９. 真皮充填材料が、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロスフィア、ヒドロキシルアパタイト、ポリ（L-乳酸）、ヒアルロン酸、コラーゲン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目38記載の方法。
４０. 組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、項目1〜39のいずれかに記載の方法。
４１. 注射が、皮下、筋肉下、または筋肉内に行われる、項目1〜40のいずれかに記載の方法。
４２. 注射が、約25〜26のゲージの針を用いて行われる、項目1〜41のいずれかに記載の方法。
４３. 組成物が、組織に注射される際に少なくとも部分的に乾燥状態である、項目1〜42のいずれかに記載の方法。
４４. 組成物が、組織に注射される際に少なくとも部分的に水和状態である、項目1〜43のいずれかに記載の方法。
４５. 組織が軟部組織である、項目1〜44のいずれかに記載の方法。
４６. 軟部組織が、腱、靭帯、皮膚、乳房組織、繊維組織、結合組織、筋肉、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目45記載の方法。
４７. 軟部組織が皮膚である、項目46記載の方法。
４８. 軟部組織が乳房組織である、項目46記載の方法。
４９. 対象が哺乳動物対象である、項目1〜48のいずれかに記載の方法。
５０. 哺乳動物対象がヒトである、項目49記載の方法。
５１. 組成物が乾燥状態で保管または輸送される、項目1〜50のいずれかに記載の方法。
５２. 組成物が、約0℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目51記載の方法。
５３. 組成物が、約10℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目52記載の方法。
５４. 組成物が、約15℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目53記載の方法。
５５. シルクフィブロイン粒子が両親媒性ペプチドを含まない、項目1〜54のいずれかに記載の方法。
５６. 両親媒性ペプチドがRGDモチーフを含む、項目55記載の方法。
５７. 複数のシルクフィブロイン粒子を含む、対象の組織の修復または増強に使用する注射可能な組成物であって、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、組成物。
５８. シルクフィブロイン粒子が両親媒性ペプチドを含まない、項目57記載の組成物。
５９. 両親媒性ペプチドがRGDモチーフを含む、項目58記載の組成物。
６０. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、項目57〜59のいずれかに記載の組成物。
６１. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、項目57〜60のいずれかに記載の組成物。
６２. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約60％を保持する、項目57〜61のいずれかに記載の組成物。
６３. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、項目62記載の組成物。
６４. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約80％を保持する、項目63記載の組成物。
６５. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、項目57〜64のいずれかに記載の組成物。
６６. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、項目57〜65のいずれかに記載の組成物。
６７. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、項目57〜66のいずれかに記載の組成物。
６８. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、項目57〜67のいずれかに記載の組成物。
６９. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の10％以下を分解するよう適合されている、項目57〜68のいずれかに記載の組成物。
７０. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、項目57〜69のいずれかに記載の組成物。
７１. シルクフィブロイン粒子が多孔質である、項目57〜70のいずれかに記載の組成物。
７２. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、または少なくとも約30％の多孔度を有する、項目71記載の組成物。
７３. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約50％の多孔度を有する、項目72記載の組成物。
７４. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約70％の多孔度を有する、項目73記載の組成物。
７５. 孔が、約10nm〜約1000μmのサイズを有する、項目71〜74のいずれかに記載の組成物。
７６. 孔が、約1μm〜約1000μmのサイズを有する、項目75記載の組成物。
７７. シルクフィブロイン粒子が、約500nm〜約5000μmのサイズを有する、項目57〜76のいずれかに記載の組成物。
７８. シルクフィブロイン粒子が、約1μm〜約2000μmのサイズを有する、項目77記載の組成物。
７９. シルクフィブロイン粒子が、約10μm〜約1500μmのサイズを有する、項目78記載の組成物。
８０. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、機械的手段によって固体状多孔質シルクフィブロインから細小化されたものである、項目71〜79のいずれかに記載の組成物。
８１. 機械的手段が、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、切断、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目80記載の組成物。
８２. 固体状多孔質シルクフィブロインの多孔が、ポロゲン浸出法によって形成される、項目80または81記載の組成物。
８３. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子が、少なくとも1つの活性剤をさらに含む、項目57〜82のいずれかに記載の組成物。
８４. 少なくとも1つの活性剤が、生物学的活性剤、美容活性剤、細胞接着剤、造影剤、またはそれらの任意の組み合わせである、項目83記載の組成物。
８５. 生物学的活性剤が、治療剤、麻酔剤、細胞成長因子、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体またはその一部分、抗体様分子、核酸、多糖類、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目84記載の組成物。
８６. 細胞接着剤が、ヒアルロン酸、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸／コラーゲン、インテグリン結合分子、キトサン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目84記載の組成物。
８７. 美容活性剤が、アンチエイジング剤、抗フリーラジカル剤、抗酸化物質、水和剤、美白剤、着色剤、脱色剤、日焼け止め剤、筋弛緩剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目84記載の組成物。
８８. 細胞をさらに含む、項目57〜87のいずれかに記載の組成物。
８９. 細胞が幹細胞である、項目88記載の組成物。
９０. 生物学的流体または濃縮物をさらに含む、項目57〜89のいずれかに記載の組成物。
９１. 生物学的流体または濃縮物が、吸引脂肪、吸引骨髄、またはそれらの任意の組み合わせである、項目90記載の組成物。
９２. 生物学的流体または濃縮物が吸引脂肪である、項目90記載の組成物。
９３. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約3:19〜約6:19の範囲である、項目90〜92のいずれかに記載の組成物。
９４. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子がヒドロゲルをさらに含む、項目57〜93のいずれかに記載の組成物。
９５. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子が真皮充填材料をさらに含む、項目57〜94のいずれかに記載の組成物。
９６. 真皮充填材料が、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロスフィア、ヒドロキシルアパタイト、ポリ（L-乳酸）、ヒアルロン酸、コラーゲン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目95記載の組成物。
９７. 薬学的に許容される担体をさらに含む、項目57〜96のいずれかに記載の組成物。
９８. 乾燥状態で保管または輸送される、項目57〜97のいずれかに記載の組成物。
９９. 約0℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目98記載の組成物。
１００. 約10℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目99記載の組成物。
１０１. 約15℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、項目100記載の組成物。
１０２. 項目57〜101のいずれかに記載の注射可能な組成物を含む、送達デバイス。
１０３. シリンジをさらに含む、項目102記載の送達デバイス。
１０４. シリンジが針をさらに含む、項目103記載の送達デバイス。
１０５. カテーテルをさらに含む、項目102〜104のいずれかに記載の送達デバイス。
１０６. 注射用担体をさらに含む、項目102〜105のいずれかに記載の送達デバイス。
１０７. 項目57〜101のいずれかに記載の注射可能な組成物を含む、シリンジ。
１０８. 針をさらに含む、項目107記載のシリンジ。
１０９. カテーテルをさらに含む、項目107または108記載のシリンジ。
１１０. 注射用担体をさらに含む、項目107〜109のいずれかに記載のシリンジ。
いくつかの選択された用語の定義
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯類、家畜動物または狩猟動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカク、例えばアカゲザルを含む。げっ歯類は、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚、例えばマス、ナマズおよびサケを含む。本明細書に記載される局面の特定の態様において、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。対象は、オスまたはメスであり得る。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、組織の修復、再生および／または再建の動物モデルとなる対象として使用できる利点がある。加えて、本明細書に記載される方法および組成物は、家畜化された動物および／またはペットを処置するために使用され得る。
「統計的に有意」または「有意」という用語は、統計的有意性を表し、概ね、参照レベルを2標準偏差（2SD）上回るまたは下回ることを意味する。この用語は、そこに差が存在することの統計的証拠を表す。これは、帰無仮説が実際に真であったときにその帰無仮説を却下する決定が為される確率と定義される。この決定はしばしば、p値を用いて行われる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において言い換え可能に使用され、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって別の残基に接続されたひとつながりのアミノ酸残基を表す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において言い換え可能に使用され、そのサイズまたは機能によらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化等）およびアミノ酸アナログを含むタンパク質アミノ酸のポリマーを表す。「タンパク質」は比較的大きなポリペプチドを参照するために使用されることが多く、「ペプチド」は小さなポリペプチドを参照するために使用されることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の用法は重複しかつばらつきがある。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、そうでないことが示されていない限り、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびタンパク質のフラグメントを表す。「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子産物およびそのフラグメントを参照する場合、言い換え可能に使用される。したがって、例示的なペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメントならびに上記物質のその他の等価物、変種、フラグメントおよびアナログを含む。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）および、適当な場合は、リボ核酸（RNA）、1本鎖または2本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを表す。個別に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。それ以外のことが示されていない限り、個々の核酸配列は、明示的に示されている配列と共に、暗示的に、保存的に修飾されたその変種（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985), およびRossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。「核酸」という用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから生成されるRNAまたはDNAのいずれかの誘導体、変種およびアナログ、ならびに1本鎖（センスまたはアンチセンス）および2本鎖ポリヌクレオチドを含むものと理解されたい。
「短鎖干渉RNA」（siRNA）という用語は、本明細書で「低分子干渉RNA」とも称され、標的遺伝子の発現を、例えばRNAiによって阻害するよう機能する作用物質と定義される。siRNAは、化学的に合成することができ、インビトロ転写により製造することができ、または宿主細胞中で生産することができる。siRNA分子はまた、一方の鎖が不活性化させたいメッセージと同一である2本鎖RNAの切断によっても生成することができる。「siRNA」という用語は、RNA干渉（RNAi）経路を誘導する低分子阻害性RNA2重鎖を表す。これらの分子は、様々な長さ（概ね、18〜30塩基対）であり得、そのアンチセンス鎖の中にそれらの標的mRNAに対する様々な程度の相補性を含み得る。すべてではないが一部のsiRNAは、センス60鎖および／またはアンチセンス鎖の5'または3'末端に、対を形成しないオーバーハング塩基を有する。「siRNA」という用語は、2つの別の鎖の2重鎖および2重鎖領域を含むヘアピン構造を形成することができる1本鎖を含む。
本明細書で使用される「shRNA」という用語は、短ヘアピンRNAを表し、これはRNAiおよび／またはsiRNA種として機能するが、shRNA種が安定性の高められた2本鎖ヘアピン様構造物である点で相違する。本明細書で使用される「RNAi」という用語は、干渉性RNAを表すか、またはRNA干渉分子は核酸分子もしくはそのアナログ、例えば、遺伝子発現を阻害するRNAベースの分子、である。RNAiは、選択的な転写後遺伝子サイレンシングの手段を表す。RNAiは、特定のmRNAを破壊するかまたはRNA、例えばmRNAのプロセシングもしくは翻訳を抑制することができる。
本明細書で使用される「酵素」という用語は、他の物質の化学反応を触媒するタンパク質分子であって、その反応の完了時に破壊されたり実質的に改変されたりしないものを表す。この用語は、天然に存在する酵素および生物工学的な酵素またはそれらの混合物を含み得る。酵素ファミリーの例は、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、GTPase、カルボキシルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、デカルボキシラーゼ、トランスアミナーゼ、ラセマーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼおよびα-ケトデカルボキシラーゼを含む。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することができる1本鎖、部分的に1本鎖、部分的に2本鎖または2本鎖のヌクレオチド配列を意味する。いくつかの態様において、アプタマーは、ワトソン・クリック塩基対または3重鎖形成以外のメカニズムによって非オリゴヌクレオチド分子または分子群を認識する。アプタマーは、非限定的に、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチドならびに骨格修飾、分枝点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む、定義された配列セグメントおよび配列を含み得る。分子に結合するアプタマーを選択する方法は、当技術分野で広く知られており、当業者はそれに容易にアクセスすることができる。
本明細書で使用される場合、「抗体（"antibody"または"antibodies"）」という用語は、インタクトな免疫グロブリンまたはFc（結晶化フラグメント）領域もしくはFc領域のFcRn結合フラグメントを有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合フラグメントを表す。「抗体」という用語はまた、「抗体様分子」、例えば抗体のフラグメント、例えば抗原結合フラグメントを含む。抗原結合フラグメントは、組換えDNA技術によってまたはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって製造することができる。「抗原結合フラグメント」は、特に、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAbおよび相補性決定領域（CDR）フラグメント、単鎖抗体（scFv）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディならびにそのポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドを含む。本明細書に記載される目的上、リニア抗体も含まれる。Fab、Fc、pFc'、F(ab')2およびFvという用語は、標準的な免疫学的意味で用いられる（Klein, Immunology (John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); およびRoitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)）。様々な抗原に対する特異的な抗体または抗原結合フラグメントが、R&D Systems、BD Biosciences、e-BiosciencesおよびMiltenyi等の販売元から市販されており、またはそれらは当業者に公知の方法によってこれらの細胞表面マーカーに対して産生することができる。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（CDR；すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3）という用語は、抗原への結合のために存在する必要のある抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を表す。各可変ドメインは、典型的に、CDR1、CDR2およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各々の相補性決定領域は、Kabatにより定義される「相補性決定領域」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよそ24〜34（L1）、50〜56（L2）および89〜97（L3）の残基ならびに重鎖可変ドメインのおよそ31〜35（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）の残基；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよそ26〜32（L1）、50〜52（L2）および91〜96（L3）の残基ならびに重鎖可変ドメインのおよそ26〜32（H1）、53〜55（H2）および96〜101（H3）の残基；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Kabatにしたがい定義されるCDR領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含み得る。
「リニア抗体」という表現は、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載される抗体を表す。簡潔に説明すると、これらの抗体は、一対の直列のFdセグメント（VH-CH1-VH-CH1）を含み、これが相補的な軽鎖ポリペプチドと一対の抗原結合領域を形成しているものである。リニア抗体は、2特異性または単特異性であり得る。
本明細書で使用される場合、「単鎖Fv」または「scFv」抗体フラグメントという表現は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在している抗体フラグメントを意味することが意図される。好ましくは、Fvポリペプチドはさらに、VHとVLドメインの間に、そのscFvが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを含む（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)）。
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ（diabody）」という用語は、2つの抗原結合部位を有し、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む（VH-VL）、小さな抗体フラグメントを表す。同一鎖中の2つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を形成し、2つの抗原結合部位を生成することを強いられる（EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, P0:6444-6448 (1993)）。
本明細書で使用される場合、「低分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約10,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステルおよびその他の薬学的に許容できる形態を含むがこれらに限定されない天然または合成分子を表す。
「抗生物質」という用語は、本明細書において、微生物の生存率を低下させるまたは微生物の成長もしくは複製を阻害する化合物または組成物を表すのに使用される。本開示において使用される場合、抗生物質はさらに、抗菌剤、静菌剤または殺菌剤を含むことが意図される。例示的な抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、ペネム、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、スルホンアミド、マクロライド、テトラサイクリン、リンコシド（lincoside）、キノロン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、メトロニダゾール、リファンピン、イソニアジド、スペクチノマイシン、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含むがこれらに限定されない。
「治療剤」という用語は、当技術分野で知られており、対象において局所的にまたは全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的に活性な物質である任意の化学部分を表す。「薬物」とも呼ばれる治療剤の例は、周知の参考文献、例えば、Merck Index、the Physicians Desk ReferenceおよびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsに記載されており、それらは、非限定的に、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは疾病を処置する、予防する、診断する、癒やすもしくは和らげるために使用される物質；身体の構造もしくは機能に影響する物質；または生理学的環境下に置かれた後に生物学的に活性となるもしくはより活性が高くなるプロドラッグを含む。対象に投与されたときに本発明の組成物から隣接する組織または流体中に放出され得る様々な形態の治療剤が使用され得る。その例は、ステロイドおよびステロイドのエステル（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アンドロステロン、コレステロール、ノルエチンドロン、ジゴキシゲニン、コール酸、デオキシコール酸およびケノデオキシコール酸）、含ホウ素化合物（例えば、カルボラン）、化学療法用ヌクレオチド、薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤）、エンジイン（例えば、カリケアマイシン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ネオカルチノスタチンクロモフォアおよびケダルシジンクロモフォア）、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、ホルモンアンタゴニスト（例えば、タモキシフェン）、非特異的（非抗体）タンパク質（例えば、糖オリゴマー）、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、mRNA配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、タンパク質、抗体、光動力剤（例えば、ローダミン123）、放射性核種（例えば、I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67およびCu-64）、毒素（例えば、リシン）ならびに転写ベースの医薬を含む。
本明細書で使用される場合、「ホルモン」という用語は、概ね、天然に存在するまたは天然に存在しないホルモン、そのアナログおよび模倣体を表す。特定の態様において、「ホルモン」という用語は、治療的処置、例えば成長ホルモン処置、に使用される任意のホルモンを表す。本明細書で使用される場合、「成長ホルモン」または「GH」は、ネイティブ配列または変種形態の、任意の供給源由来の、天然、合成または組換えの、成長ホルモンを表す。その例は、ヒトネイティブ配列を有する天然または組換えGHであるヒト成長ホルモン（hGH）（ソマトトロピンまたはソマトロピン）、ならびにソマトレム、ソマトトロピンおよびソマトロピンを含む、組換えDNA技術によって生成される任意のGHまたは変種を表す、組換え成長ホルモン（rGH）、を含む。1つの態様において、ホルモンは、インスリンを含む。
本明細書で使用される場合、「造影剤」は、例えば医学的走査または画像化時の、走査または画像の最も明るい部分と最も暗い部分の間の差の程度を、造影剤を使用しないで行った走査と比較して増大させるのに使用される任意の化学部分であり得る。例えば、造影剤は、放射性同位体、例えばインジウムまたはテクネチウムを含有する画像化剤；ヨウ素、ガドリニウムまたはシアニンを含有する色素；酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、GFP、アルカリホスファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼ；蛍光物質、例えばユーロピウム誘導体；発光物質、例えばN-メチルアクリジウム誘導体等を含み得る。いくつかの態様において、造影剤は、金ナノ粒子および／または量子ドットを含み得る。
本明細書で使用される場合、「実質的」という用語は、少なくとも約60%、もしくは好ましくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%もしくは少なくとも約99%もしくはそれ以上、または70%から100%の間の任意の整数、の比率を意味する。いくつかの態様において、「実質的」という用語は、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくはそれ以上、または90%から100%の間の任意の整数、の比率を意味する。いくつかの態様において、「実質的」という用語は、100%を含み得る。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、提示されている定義された要素に加えて他の要素も存在し得ることを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示している。
「からなる」という用語は、その態様の説明の中で言及されていないあらゆる要素に対して排他的である、本明細書に記載されるその構成要素を表す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の態様に必要とされるそれらの要素を表す。この用語は、本発明の態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響しない要素の存在を許容する。
実施例を実施する以外では、またはそうでないことが示されている場合以外では、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表すすべての数値は、すべての例において、「約」という用語により修飾されることが理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、±1%を意味し得る。
単数形の用語（「a」、「an」および「the」）は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。同様に、「または」という単語は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、「および」を含むことが意図されている。本開示の実施または試験には本明細書に記載されているものと類似または等価な方法および材料を使用することができるが、以下では適当な方法および材料について説明されている。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語のexempli gratiaを語源とするものであり、本明細書において非限定的な例を示すのに使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義語である。
それ以外の説明がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術・科学用語は、本開示の属する技術の分野における通常の知識を有する者に広く理解されているのと同じ意味を有する。疾患および傷害、分離および検出技術に関する一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第18版、Merck Research Laboratories発行、2006年（ISBN 0-911910-18-2）；Robert S. Porter et al.（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.発行、1994年（ISBN 0-632-02182-9）；およびRobert A. Meyers（編）、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.発行、1995年（ISBN 1-56081-569-8）で見出すことができる。
本発明は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬等に限定されず、それらは変更され得るものであることを理解されたい。本明細書で使用されている用語は、特定の態様を説明する目的しか有しておらず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書を通じて特定されているすべての特許およびその他の刊行物は、明示的に、説明および開示の目的、例えば本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載の方法論の説明および開示の目的で、参照により本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より以前の開示物として提供されるにすぎない。これに関連するいかなる事情も、本発明者らがそれが先行発明であるためまたは他の何らかの理由でそのような開示物よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認として扱われるべきではない。日付に関するすべての言及またはこれらの文献の内容に関する表示は、出願人が入手し得た情報に基づいており、それらはそれらの日付またはこれらの文献の内容の正確性に関する何らかの承認となるものではない。
本明細書に記載されるいくつかの態様はさらに、以下の実施例によって例示されるが、これらは限定をなすものではない。
本願、実施例ならびに図面および表を通じて引用されているすべての参考文献の内容は、それらの全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
実施例1. 注射可能なシルクフィブロインスキャホールド粒子と他のシルクフィブロインスキャホールドまたはヒドロゲルの比較
例示的な材料および方法
材料：それ以外のことが明記されていない限り、シルクスキャホールドの調製に関する実施例で使用したすべての化合物および溶媒は、Sigma Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。滅菌水および生理食塩水は、Invitrogen（Carlsbad, CA）から購入した。等価な材料を使用できることおよび他の商業的供給源から購入できることに留意されたい。
シルクフィブロイン溶液の調製：ボンビックス・モリのカイコ繭を、Tajimia Shoji Co.（Yokohama, Japan）から購入した。繭を小片に切断し、そして0.02M Na2CO3中で約10〜60分間、好ましくは約30分間沸騰させた。得られたシルクフィブロイン繊維を蒸留水でリンスし、そして乾燥させた。乾燥させたシルクフィブロイン繊維を、60℃の9.3M LiBr中で約1〜4時間、溶解するまで再溶解させた。このシルクフィブロイン溶液を、蒸留水に対して、3500ダルトンの分子量カットオフを用い、少なくとも6回の水の交換を行い、透析した。水性のシルクフィブロイン溶液を乾燥するまで凍結乾燥させ、次いでこれをヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）に溶解させて17% (w/v)の溶媒ベースのシルクフィブロイン溶液を得た。
シルクフィブロイン多孔質スキャホールドの調製：シルクフィブロイン多孔質スキャホールドを、水性または溶媒ベースのいずれかのシルクフィブロイン溶液（例えば、6%〜20% w/v）から形成した。100ミクロン〜1.2ミリメートルの範囲のサイズのポロゲン（例えば、塩、例えば塩化ナトリウムNaCl）を使用した。ポロゲンをテフロンコートされた容器に詰め、そしてその塩の上からシルクフィブロイン溶液を注いだ。容器に蓋をし、室温で約1〜3日間静置した。次いでこの容器を約1日間、蓋をとった状態で置いた。この容器を蒸留水の中に入れ、塩を浸出させた。あるいは、ベータシート形成をさらに誘導するために、スキャホールドを、約1時間〜約1日間、メタノール槽に入れるかまたは水中アニーリングすることができる。いくつかの態様において、シルクフィブロイン多孔質スキャホールドは、細胞接着を促進するために、細胞外マトリックス分子、例えばラミニンでさらにコーティングされ得る。いくつかの態様において、シルクフィブロイン多孔質スキャホールドは、細胞外マトリックス分子でコーティングされていないものであり得る。
注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールドの調製：水性または溶媒ベースのシルクフィブロイン多孔質スキャホールドを、手作業でまたは機械的手段によって、例えば回転ブレード、例えば従来的なフードプロセッサのそれ、を用いて切り刻んだ。所望のサイズ範囲を得るために、切り刻んだスキャホールドを、様々な目開きのふるいに通した。切り刻んだスキャホールドを乾燥させ、次いでオートクレーブにより滅菌した。乾燥させオートクレーブした切り刻んだスキャホールド（以降、「シルクフィブロインスキャホールド粒子」と称される）を、使用するまで室温で保管した。
注射可能なシルクフィブロインヒドロゲル（「シルクフィブロインボルテックスゲル」）の調製：まず、水性のシルクフィブロイン溶液（例えば、およそ4% w/v）を、0.22ミクロンフィルターユニットに通すことによって滅菌した。次に、滅菌されたシルクフィブロイン溶液を、製造元のプロトコルにしたがい遠心分離ろ過ユニット（Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Millipore, Billerica, MA）を用いて、例えばおよそ8%、およそ10%およびおよそ12% w/v溶液に濃縮した。注射可能なシルクフィブロインヒドロゲルを形成させるために、ボルテックス法を用いた（Yucel et al, 2009. Biophys J. 97: 2044）。簡潔に説明すると、水性のシルクフィブロイン溶液を、サンプル容量および濃度に依存して動力および時間を変えて、透明な溶液が濁るまでボルテックスした（Vortex-Genie 2, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）。ゲル化をさらに誘導するため、濁った溶液をおよそ37℃で約30分間置いた。30分後に、ヒドロゲルを単独でまたは吸引脂肪と混合してシリンジにロードし、そして注射した。
注射方法：シルクフィブロインスキャホールドを、様々な調製物により、異なる方法を通じて、例えば皮下、筋肉内または筋肉下に、注射した。例示的な調製物は、乾燥状態、吸引脂肪と混合された乾燥状態、水和状態（例えば、滅菌水または通常の生理食塩水中）または吸引脂肪と混合された水和状態、を含むがこれらに限定されない。
インビボ注射：メスのヌードラットモデルを、本明細書に記載されるシルクフィブロインスキャホールドおよびヒドロゲルの評価に使用した。注射可能なシルクフィブロインスキャホールドの適用および処置のためにモデル化される組織によっては、他の哺乳動物モデル（例えば、マウス、ウサギ、イヌまたはブタモデル）も使用することができる。6月齢のラットを秤量し、注射前に酸素供給下でイソフルランを用いて麻酔した。1回の注射あたり合計約1mlを使用した。簡潔に説明すると、乾燥状態のシルクフィブロインスキャホールド粒子を、シリンジへのロードの直前に生理食塩水または吸引脂肪に浸漬した。ロードされたシリンジを、内径2mm以下のカニューレに取り付けた。皮下注射は、胸筋の上で行った。筋肉内および筋肉下注射は、それぞれ、大胸筋と小胸筋の間または胸筋の下で行った。ファニング式皮下注射法（fanning subcutaneous injection method）を、ラットの背側（dorsus）において行った。例えば、図1を参照のこと。注射したサンプルを、1、2、10および30日後に外植し、重量、容量保持および組織学的結果に関して評価した。容量保持は、2つの方法、例えば、スケール測定および容量置換によって行った。いくつかの態様において、比較のために、全シルクフィブロイン多孔質スキャホールド（直径5mm x 高さ2mm）を、同じ場所に移植した。
組織学：外植片を半分に切断し、4℃で一晩、10％ホルマリン中で固定した。1つのグループをOCT凍結培地で包埋し、10ミクロン片に凍結切片処理し、そしてOil Red Oで染色した。残りの半分に対して一連の脱水工程を行い、パラフィン包埋し、そして10ミクロン片に切断した。各スライドに3つの連続する切片を置き、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）に関する標準的な組織学法にしたがい染色するかまたは免疫組織化学的に処理した。抗原回復後、切片を1次抗ラットCD31、CD68、CD80、CD163、抗ヒト核抗体と共に約1時間インキュベートした。次にこの切片を、1次抗体の種において惹起された2次ビオチニル化抗体と共に約1時間インキュベートした。Vector Labs ABC抗体検出キットをDAB基質と共に使用して、発色度を高めた。
結果
いくつかの態様において、シルクフィブロインボルテックスゲルは、単独でまたは吸引脂肪と混合された状態で、6週間研究において吸引脂肪単独よりも速く再吸収され得る。したがって、シルクフィブロインボルテックスゲルのいくつかの態様は、長期間の、例えば6週間またはそれ以上のサイズおよび／または形状の保持が要求される適用に理想的でないかもしれない。しかし、いくつかの態様において、シルクフィブロインボルテックスゲルの容量保持特性は、例えば、シルクフィブロイン濃度および／またはシルクフィブロイン溶液のボルテックスもしくはせん断速度を調整することによって、調節することができる。
移植されるシルクフィブロイン多孔質スキャホールドは、長期間にわたってそれらの形状およびサイズを保持し得る。しかし、移植されるシルクフィブロイン多孔質スキャホールドは、通常、設置のために1つまたは複数の切開を必要とする。加えて、移植されるシルクフィブロイン多孔質スキャホールドは、通常、特定の解剖学的空隙を満たすよう手術前にキャスト（cast）されるものであり、および／またはそれらは不規則形状の空隙を満たすよう手術中にモールド（mold）することができない。
シルクフィブロインボルテックスゲルまたは移植されるシルクフィブロイン多孔質スキャホールドと異なり、注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールド（例えば、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子）は、既製品（off-the-shelf product）であっても、最小の侵襲性でありかつ少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間もしくは少なくとも約1年間またはそれ以上の間、そのサイズおよび形状を持続することができる治療法として機能し得る。注射可能なシルクフィブロインスキャホールド（例えば、本明細書に記載されるシルクフィブロイン粒子）は、その投与を最小の侵襲性の手順にまで引き下げることができると同時に、それらはまた、外科医がその（例えば、粒子の形態の）注射可能なシルクフィブロインスキャホールドを任意の形状またはサイズの欠損に柔軟にモールドできるようにする。
表1に示されるように、スキャホールドのパラメータおよび／または注射方法に関連する様々なパラメータの異なる組み合わせを使用して、注射可能なシルクフィブロインスキャホールドのインビボ適用を評価した。
（表１）注射可能なスキャホールド粒子の特性および注射方法に関連する例示的なパラメータの様々な組み合わせ
Figure 2015502199
いくつかの態様において、2つの異なるシルクフィブロイン処理法を使用し、シルクフィブロインの分解率を変化させた。皮下ラットモデルにおいて、シルクフィブロイン多孔質スキャホールドインプラントは、水性の方法で調製されたときは3〜6ヶ月以内に分解するが、溶媒ベースの方法で調製されたときは少なくとも2年もの間維持されることが、以前に示されている（Wang et al. 2008. Biomaterials. 29: 3415）。したがって、望まれるスキャホールドの特性、適用および／または処置される組織に依存して、いずれかの方法を、注射可能なシルクフィブロインスキャホールドの調製に使用することができる。いくつかの態様においては、注射可能なシルクフィブロインスキャホールドを調製するために水性の方法が使用され得る。他の態様においては、注射可能なシルクフィブロインスキャホールドを調製するために溶媒ベースの方法が使用され得る。この実施例では、水性および溶媒ベースの両方の方法により調製された注射可能なシルクフィブロインスキャホールドを、そのシルクフィブロイン材料が完全に消えた後の統合性および同材料の長期的統合性の評価のために研究した。急性炎症の兆候の評価のために早期の時点（例えば、1〜2日）を使用することができ、後期の時点は、組織全体の統合性、血管形成性、容量保持性およびスキャホールド分解性に関して評価される。
別の評価すべき変数は、孔のサイズ範囲である。300〜500ミクロンのより小さな孔を、850〜1000ミクロンのより大きな孔と比較した。さらに、表1に示されるような、注射可能なシルクフィブロインスキャホールド粒子の様々な直径を評価した。いくつかの態様においては、数ミクロンより小さい注射可能なシルクフィブロインスキャホールド粒子も製造され得る。いくつかの態様においては、シルクフィブロインスキャホールド粒子が分解するため、それらはそれらのサイズに起因する有害な炎症反応を生じない。表1に示されるように、シルクフィブロインスキャホールド粒子は、乾燥状態または水和状態であり得る。乾燥状態のシルクフィブロインスキャホールド粒子を使用する利点の1つは、それらを既製品として使用できることである。乾燥状態の粒子の別の利点は、事前に水和させる必要なくスキャホールド粒子に注入されるそれらの能力である。
表1に示される異なる注射位置は、様々な適用における臨床上の注射部位の例を表すことが意図されているが、それらは限定とみなされるべきではない。例えば、皮下注射は、軟部組織欠損充填材に代表的であり得；皮下、筋肉下および筋肉内注射は、乳房再建に代表的であり得る。
いくつかの態様において、（例えば、未播種のまたは細胞が播種された）注射可能なシルクフィブロインスキャホールドはまた、処置される組織における血管形成を、未処置組織または非シルク性の注射可能な組成物で処置された組織と比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上増大させ得る。
いくつかの態様において、細胞、例えばASC、または吸引脂肪を播種された注射可能なシルクフィブロインスキャホールドはまた、宿主組織との統合性を、未播種の注射可能なシルクフィブロインスキャホールドで処置された組織と比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上増大させ得る。
いくつかの態様において、細胞、例えばASC、または吸引脂肪を播種された注射可能なシルクフィブロインスキャホールドは、脂肪組織の再生を、未播種の注射可能なシルクフィブロインスキャホールドで処置された組織と比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％またはそれ以上増大させ得る。
実施例2. 注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールドのインビボ研究
例示的な材料および方法
注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールドの調製：特定の態様において、シルクフィブロイン多孔質スキャホールドを、溶媒ベースのシルク溶液（17% w/v）から形成した。スキャホールドに孔を作製するために、ポロゲンを使用することができる。特定の態様においては、約300〜500ミクロンの範囲のサイズのNaClポロゲンを使用した。特定の態様においては、約850〜1000ミクロンの範囲のサイズのNaClポロゲンを使用した。NaClポロゲンをテフロンコートされた容器に詰め、そしてその塩の上からシルク溶液を注いだ。容器に蓋をし、室温で1〜3日間静置した。次いでこの容器を1日間、蓋をとった状態で置いた。この容器を蒸留水の中に入れ、塩を浸出させた。いくつかの態様においては、ベータシート形成をさらに誘導するために、得られたシルクスキャホールドを、1日間メタノール槽に入れた。次いで、注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールドを、実施例1に記載される方法を用いて、例えば、シルクフィブロイン多孔質スキャホールドをより小さな片に細小化することによって、製造することができる。例えば、図2を参照のこと。
加工吸引脂肪の調製：スキャホールドの注射と同日に、吸引脂肪を待機的形成外科手術により得た。吸引脂肪を、手術後直ちに室温で無菌的に輸送した。およそ30mlの吸引脂肪を50mlのコニカルチューブに入れ、そして室温、1000rpmで10分間遠心分離した。血液および遊離脂質を取り除いた。残った組織を滅菌されたペトリ皿に置いた。注射の前に、注射可能なシルクフィブロイン多孔質スキャホールドを、1時間、この加工吸引脂肪中に入れた。
注射方法：1mlの切り刻んだシルクフィブロイン多孔質スキャホールドおよび吸引脂肪を1mlシリンジに吸い上げた。吸引脂肪 対 シルクスキャホールドの最終的な容量比は、19:3（低用量）〜19:6（高用量）の範囲であり得る。いくつかの態様において、注射可能なスキャホールドおよび吸引脂肪の混合物を、24ゲージ針を通じて、吸引脂肪との水和状態で、無胸腺マウスの背側から皮下注射した。例えば、図1を参照のこと。
組織学：外植サンプルおよびコンストラクトを標準的な組織学プロトコルにしたがい処理した。ホルマリン固定されたサンプルを、自動組織プロセッサを用いて、一連の脱水溶媒に通し、そして最後にパラフィンに通した。サンプルをパラフィン包埋し、10ミクロン片に切断し、そしてガラススライドに接着させた。この切片を再水和させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして画像化した。
結果
注射後6週間で、マウスを屠殺し、注射した材料を回収した。その外植塊を、それらの重量および嵩（mass）について測定した。様々な多孔度（例えば、300〜500ミクロン孔 対 850〜1000ミクロン孔）の固体状多孔質シルクフィブロインから製造されたシルクフィブロイン粒子を用いることで、相対的な重量変化もしくは嵩変化またはそのような時点におけるシルクフィブロインスキャホールド 対 吸引脂肪の相対比（例えば、3:19 対 6:19）に差が見られなかった。
図3に示されるように、注射された吸引脂肪（実線の矢印）は、すべてのグループで検出された。注射された吸引脂肪内で、注射可能なシルクフィブロインスキャホールド片が検出された（点線の矢印）。注射されたシルクフィブロイン材料は、炎症促進反応を惹起しなかったが：注射された塊の周辺ではマクロファージが検出された。

Claims (110)

  1. 対象の組織を修復または増強する方法であって、複数のシルクフィブロイン粒子を含む組成物を修復または増強したい組織に注射する工程を含み、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、方法。
  2. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、請求項1記載の方法。
  3. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、請求項2記載の方法。
  4. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約60％を保持する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、請求項4記載の方法。
  6. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約80％を保持する、請求項5記載の方法。
  7. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、請求項8記載の方法。
  10. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の10％以下を分解するよう適合されている、請求項10記載の方法。
  12. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
  13. シルクフィブロイン粒子が多孔質である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
  14. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、または少なくとも約30％の多孔度を有する、請求項13記載の方法。
  15. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約50％の多孔度を有する、請求項14記載の方法。
  16. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約70％の多孔度を有する、請求項15記載の方法。
  17. 孔が、約10nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
  18. 孔が、約1μm〜約1000μmのサイズを有する、請求項17記載の方法。
  19. シルクフィブロイン粒子が、約500nm〜約5000μmのサイズを有する、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. シルクフィブロイン粒子が、約1μm〜約2000μmのサイズを有する、請求項19記載の方法。
  21. シルクフィブロイン粒子が、約10μm〜約1500μmのサイズを有する、請求項20記載の方法。
  22. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、機械的手段によって固体状多孔質シルクフィブロインから細小化されたものである、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
  23. 機械的手段が、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、切断、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
  24. 固体状多孔質シルクフィブロインが、ポロゲン浸出（porogen-leaching）法によって形成される、請求項22〜23のいずれか記載の方法。
  25. 組成物またはシルクフィブロイン粒子が、少なくとも1つの活性剤をさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 少なくとも1つの活性剤が、生物学的活性剤、美容活性剤、細胞接着剤、造影剤、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項25記載の方法。
  27. 生物学的活性剤が、薬物、治療剤、麻酔剤、細胞成長因子、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体またはその一部分、抗体様分子、核酸、多糖類、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
  28. 細胞接着剤が、ヒアルロン酸、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸／コラーゲン、インテグリン結合分子、キトサン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
  29. 美容活性剤が、アンチエイジング剤、抗フリーラジカル剤、抗酸化物質、水和剤、美白剤、着色剤、脱色剤、日焼け止め剤、筋弛緩剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
  30. 組成物が細胞をさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
  31. 細胞が幹細胞である、請求項30記載の方法。
  32. 組成物が生物学的流体または濃縮物をさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
  33. 生物学的流体または濃縮物が、吸引脂肪、吸引骨髄またはそれらの任意の組み合わせである、請求項32記載の方法。
  34. 生物学的流体または濃縮物が吸引脂肪である、請求項32記載の方法。
  35. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約1:19〜約12:19の範囲である、請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。
  36. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約3:19〜約6:19の範囲である、請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。
  37. 組成物またはシルクフィブロイン粒子がヒドロゲルをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
  38. 組成物またはシルクフィブロイン粒子が真皮充填材料をさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
  39. 真皮充填材料が、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロスフィア、ヒドロキシルアパタイト、ポリ（L-乳酸）、ヒアルロン酸、コラーゲンおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項38記載の方法。
  40. 組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
  41. 注射が、皮下、筋肉下、または筋肉内に行われる、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。
  42. 注射が、約25〜26のゲージの針を用いて行われる、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. 組成物が、組織に注射される際に少なくとも部分的に乾燥状態である、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. 組成物が、組織に注射される際に少なくとも部分的に水和状態である、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. 組織が軟部組織である、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。
  46. 軟部組織が、腱、靭帯、皮膚、乳房組織、繊維組織、結合組織、筋肉、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項45記載の方法。
  47. 軟部組織が皮膚である、請求項46記載の方法。
  48. 軟部組織が乳房組織である、請求項46記載の方法。
  49. 対象が哺乳動物対象である、請求項1〜48のいずれか一項記載の方法。
  50. 哺乳動物対象がヒトである、請求項49記載の方法。
  51. 組成物が乾燥状態で保管または輸送される、請求項1〜50のいずれか一項記載の方法。
  52. 組成物が、約0℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項51記載の方法。
  53. 組成物が、約10℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項52記載の方法。
  54. 組成物が、約15℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項53記載の方法。
  55. シルクフィブロイン粒子が両親媒性ペプチドを含まない、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
  56. 両親媒性ペプチドがRGDモチーフを含む、請求項55記載の方法。
  57. 複数のシルクフィブロイン粒子を含む、対象の組織の修復または増強に使用する注射可能な組成物であって、ここで、シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、修復または増強したい組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、組成物。
  58. シルクフィブロイン粒子が両親媒性ペプチドを含まない、請求項57記載の組成物。
  59. 両親媒性ペプチドがRGDモチーフを含む、請求項58記載の組成物。
  60. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、請求項57〜59のいずれか一項記載の組成物。
  61. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約50％を保持する、請求項57〜60のいずれか一項記載の組成物。
  62. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約60％を保持する、請求項57〜61のいずれか一項記載の組成物。
  63. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、請求項62記載の組成物。
  64. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約80％を保持する、請求項63記載の組成物。
  65. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも3ヶ月間、組織内でそれらの当初の容量の少なくとも約70％を保持する、請求項57〜64のいずれか一項記載の組成物。
  66. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、請求項57〜65のいずれか一項記載の組成物。
  67. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の50％以下を分解するよう適合されている、請求項57〜66のいずれか一項記載の組成物。
  68. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、請求項57〜67のいずれか一項記載の組成物。
  69. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約6週間でそれらの当初の容量の10％以下を分解するよう適合されている、請求項57〜68のいずれか一項記載の組成物。
  70. シルクフィブロイン粒子の少なくとも一部分が、少なくとも約3ヶ月間でそれらの当初の容量の30％以下を分解するよう適合されている、請求項57〜69のいずれか一項記載の組成物。
  71. シルクフィブロイン粒子が多孔質である、請求項57〜70のいずれか一項記載の組成物。
  72. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、または少なくとも約30％の多孔度を有する、請求項71記載の組成物。
  73. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約50％の多孔度を有する、請求項72記載の組成物。
  74. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、少なくとも約70％の多孔度を有する、請求項73記載の組成物。
  75. 孔が、約10nm〜約1000μmのサイズを有する、請求項71〜74のいずれか一項記載の組成物。
  76. 孔が、約1μm〜約1000μmのサイズを有する、請求項75記載の組成物。
  77. シルクフィブロイン粒子が、約500nm〜約5000μmのサイズを有する、請求項57〜76のいずれか一項記載の組成物。
  78. シルクフィブロイン粒子が、約1μm〜約2000μmのサイズを有する、請求項77記載の組成物。
  79. シルクフィブロイン粒子が、約10μm〜約1500μmのサイズを有する、請求項78記載の組成物。
  80. 多孔質シルクフィブロイン粒子が、機械的手段によって固体状多孔質シルクフィブロインから細小化されたものである、請求項71〜79のいずれか一項記載の組成物。
  81. 機械的手段が、微粒子化、摩砕、微粉砕、破砕、研削、切断、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項80記載の組成物。
  82. 固体状多孔質シルクフィブロインの多孔が、ポロゲン浸出法によって形成される、請求項80または81記載の組成物。
  83. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子が、少なくとも1つの活性剤をさらに含む、請求項57〜82のいずれか一項記載の組成物。
  84. 少なくとも1つの活性剤が、生物学的活性剤、美容活性剤、細胞接着剤、造影剤、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項83記載の組成物。
  85. 生物学的活性剤が、治療剤、麻酔剤、細胞成長因子、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体またはその一部分、抗体様分子、核酸、多糖類、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項84記載の組成物。
  86. 細胞接着剤が、ヒアルロン酸、コラーゲン、架橋ヒアルロン酸／コラーゲン、インテグリン結合分子、キトサン、エラスチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、それらの任意の誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項84記載の組成物。
  87. 美容活性剤が、アンチエイジング剤、抗フリーラジカル剤、抗酸化物質、水和剤、美白剤、着色剤、脱色剤、日焼け止め剤、筋弛緩剤、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項84記載の組成物。
  88. 細胞をさらに含む、請求項57〜87のいずれか一項記載の組成物。
  89. 細胞が幹細胞である、請求項88記載の組成物。
  90. 生物学的流体または濃縮物をさらに含む、請求項57〜89のいずれか一項記載の組成物。
  91. 生物学的流体または濃縮物が、吸引脂肪、吸引骨髄、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項90記載の組成物。
  92. 生物学的流体または濃縮物が吸引脂肪である、請求項90記載の組成物。
  93. シルクフィブロイン粒子 対 生物学的流体または濃縮物の容量比が、約3:19〜約6:19の範囲である、請求項90〜92のいずれか一項記載の組成物。
  94. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子がヒドロゲルをさらに含む、請求項57〜93のいずれか一項記載の組成物。
  95. 注射可能な組成物またはシルクフィブロイン粒子が真皮充填材料をさらに含む、請求項57〜94のいずれか一項記載の組成物。
  96. 真皮充填材料が、ポリ（メチルメタクリレート）マイクロスフィア、ヒドロキシルアパタイト、ポリ（L-乳酸）、ヒアルロン酸、コラーゲン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項95記載の組成物。
  97. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項57〜96のいずれか一項記載の組成物。
  98. 乾燥状態で保管または輸送される、請求項57〜97のいずれか一項記載の組成物。
  99. 約0℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項98記載の組成物。
  100. 約10℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項99記載の組成物。
  101. 約15℃〜約60℃の間の温度で保管または輸送される、請求項100記載の組成物。
  102. 請求項57〜101のいずれか一項記載の注射可能な組成物を含む、送達デバイス。
  103. シリンジをさらに含む、請求項102記載の送達デバイス。
  104. シリンジが針をさらに含む、請求項103記載の送達デバイス。
  105. カテーテルをさらに含む、請求項102〜104のいずれか一項記載の送達デバイス。
  106. 注射用担体をさらに含む、請求項102〜105のいずれか一項記載の送達デバイス。
  107. 請求項57〜101のいずれか一項記載の注射可能な組成物を含む、シリンジ。
  108. 針をさらに含む、請求項107記載のシリンジ。
  109. カテーテルをさらに含む、請求項107または108記載のシリンジ。
  110. 注射用担体をさらに含む、請求項107〜109のいずれか一項記載のシリンジ。
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