JP2015501637A - 修飾されたdna結合タンパク質およびその使用 - Google Patents
修飾されたdna結合タンパク質およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015501637A JP2015501637A JP2014542510A JP2014542510A JP2015501637A JP 2015501637 A JP2015501637 A JP 2015501637A JP 2014542510 A JP2014542510 A JP 2014542510A JP 2014542510 A JP2014542510 A JP 2014542510A JP 2015501637 A JP2015501637 A JP 2015501637A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tale
- domain
- cell
- dna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/21—Endodeoxyribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.21)
- C12Y301/21004—Type II site-specific deoxyribonuclease (3.1.21.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2011年11月16日出願の米国仮出願第61/560,630号および2011年8月29日出願の同第61/694,710号の利益を主張するものであり、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
増加した活性および/または特異性を有するTALEを含む操作されたDNA結合ドメインの必要性が未だ存在する。これらのタンパク質の活性および/または特異性の増強は、様々な細胞型における内在性遺伝子を制御するように操作された転写因子、多くのモデル、診断体系、および治療体系において同様に使用され得る操作されたヌクレアーゼ、ならびにゲノム操作および編集用途のすべての様式を含む様々な用途のためにそれらの範囲および有用性を増加させる。
本出願は、TALE DNA結合ポリペプチド、これらのTALE DNA結合ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこれらの融合タンパク質を使用する方法を説明し、この方法は、これらのタンパク質の機能(例えば、DNA結合活性、ヌクレアーゼ切断活性、および/またはDNA結合特異性)のうちの1つ以上を増強することを含む。したがって、本発明は、増加した特異性で標的部位に結合し、かつ任意の有意性でゲノム中のその標的部位のみに結合するTALE融合タンパク質を提供する。これらのタンパク質は、ヌクレアーゼ切断ドメインに融合するとき、野生型TALE DNA結合ドメイン(天然に存在しない組み合わせで組織化された野生型反復単位を含む)および野生型ヌクレアーゼドメインでできたTALE融合タンパク質と比較して、増加した切断活性を呈する。
本明細書に開示の方法の実施、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、ならびに当技術分野内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987 and periodic updates、the series METHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE and FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999、およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および/またはリン酸塩部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)で修飾されるヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対合する。
LDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN(配列番号2)
キサントモナス属の植物病原菌は、重要な作物植物に病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、25を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存III型分泌(T3S)系に依存する。これらの注入されたタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター「TALE」または「TALエフェクター」)がある(Kay et al(2007)Science 318:648−651を参照のこと)。これらのタンパク質は、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたTALEのうちの1つに、斑点細菌病(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)由来のAvrBs3がある(Bonas et al(1989)Mol Gen Genet218:127−136および国際公開第WO2010079430号を参照のこと)。TALEは、DNA認識を媒介する集中型反復ドメインを含み、それぞれの反復単位は、標的塩基を特定する約33〜35個のアミノ酸を含有する。TALEは、核局在化配列およびいくつかの酸性転写活性化ドメインも含む(例えば、Schornack S,et al(2006)J Plant Physiol 163(3):256−272を参照のこと)。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、brg11およびhpx17と指定される2つの遺伝子が、青枯病菌次亜種1株GMI1000および次亜種4株RS1000中のキサントモナスのAvrBs3ファミリーと相同であることが見出されている(Heuer et al(2007)ApplおよびEnvir Micro 73(13):4379−4384を参照のこと)。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに98.9%同一であるが、hpx17の反復ドメインにおいて1,575bpの欠失分だけ異なる。しかしながら、いずれの遺伝子産物もキサントモナスのAvrBs3ファミリータンパク質と40%未満の配列同一性を有する。
本明細書に記載のDNA結合タンパク質(例えば、TALE融合タンパク質)を含む融合タンパク質および異種制御もしくは機能ドメイン(またはその機能的断片)も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子)、ヌクレアーゼドメイン、サイレンサードメイン、癌遺伝子ドメイン(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー等);DNA修復酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子;DNA転位酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子;クロマチン関連タンパク質ならびにそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ);ならびにDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)、DNA標的酵素、例えば、トランスポゾン、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、およびリゾルバーゼ、ならびにそれらの関連因子および修飾因子、核ホルモン受容体、ヌクレアーゼ(切断ドメインまたは半ドメイン)、ならびにリガンド結合ドメインが含まれる。他の融合タンパク質は、レポーターまたは選択マーカーを含み得る。レポータードメインの例として、GFP、GUS等が挙げられる。植物細胞において特定の有用性を有するレポーターは、GUSを含む。
TALE融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、融合タンパク質をコードするmRNAの注入を含む任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。Hammerschmidt et al.(1999)Methods Cell Biol.59:87−115を参照されたい。
本明細書に記載の方法および組成物は、遺伝子発現を制御し、かつ/またはゲノム修飾を介して生物を変化させることが所望される、植物、動物(例えば、マウス、ラット、霊長類、家畜、ウサギ等の哺乳動物)、および魚等の真核生物を含むが、これらに限定されない任意の生物に適用される。真核(例えば、酵母、植物、真菌、魚、ならびに哺乳類(ネコ、イヌ、マウス、ウシ、ヒツジ、およびブタ等)細胞)細胞を使用することができる。本明細書に記載の1つ以上のホモ接合KO遺伝子座または他の遺伝子修飾を含む生物由来の細胞を使用することもできる。
様々なアッセイを用いて、TALE融合タンパク質による遺伝子発現制御のレベルを決定することができる。特定のTALE融合タンパク質の活性を、様々なインビトロおよびインビボアッセイを用いて、例えば、タンパク質またはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍成長の測定によって、レポーター遺伝子の転写活性化または抑制によって、第2のメッセンジャーレベル(例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca.sup.2+)によって、サイトカインおよびホルモン産生レベルによって、ならびに例えば免疫アッセイ(例えば、抗体を用いたELISAおよび免疫組織化学的アッセイ)、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、RNase保護、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド配列研究)、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型アッセイ等を用いた新血管形成によって評価することができる。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を用いて、全生物または標的組織中の哺乳類細胞に操作されたTALEドメイン融合物をコードする核酸を導入することができる。そのような方法を用いて、TALEドメイン融合物をコードする核酸を細胞にインビトロ投与することができる。好ましくは、TALEドメイン融合物をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、DNAプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソーム等の送達ビヒクルと錯体形成された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するDNAおよびRNAウイルスを含む。遺伝子治療手順の総説については、Anderson,Science 256:808−813(1992)、Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211−217(1993)、Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162−166(1993)、Dillon,TIBTECH 11:167−175(1993)、Miller,Nature 357:455−460(1992)、Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149−1154(1988)、Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35−36(1995)、Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31−44(1995)、Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds)(1995)、およびYu et al.,Gene Therapy 1:13−26(1994)を参照されたい。
TALE融合物およびTALE融合物をコードする発現ベクターを、遺伝子発現の調節および治療的または予防的用途、例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、リウマチ性関節炎、乾癬、HIV感染、鎌状赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中、血友病、異常血色素症等のために、患者に直接投与することができる。TALE融合タンパク質遺伝子治療医によって阻害することができる微生物の例として、病原菌、例えば、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ菌、プロテウス菌、セラチア菌、シュードモナス菌、レジオネラ菌、ジフテリア、サルモネラ菌、桿菌、コレラ菌、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病原因菌;感染性真菌、例えば、アスペルギルス属、カンジダ種;胞子虫類(例えば、マラリア原虫)、根足虫(例えば、エントアメーバ属)、および鞭毛虫(トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属等)等の原虫;ウイルス疾患、例えば、肝炎(A型、B型、またはC型)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV−1、HSV−6、HSV−II、CMV、およびEBV)、HIV、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルス等が挙げられる。
TALE融合物を用いて、病害抵抗性の増加、構造および貯蔵多糖類、風味、タンパク質、および脂肪酸の修飾、果実の熟成、収率、色、栄養学的特徴、貯蔵能力の向上、渇水または冠水/浸水耐性等の植物の形質を操作することができる。具体的には、油産生の増大のための作物種の操作、例えば、油料種子において産生される脂肪酸の修飾を目的とする。例えば、米国特許第7,262,054号、ならびに米国特許公開第2008/0182332号および同第20090205083号を参照されたい。
TALE融合物は、遺伝子発現の表現型結果および機能を決定するアッセイでも使用される。分析技法における近年の進歩は、集中的な大量の配列決定の試みと相まって、以前に利用可能であった分子標的よりもはるかに多くの分子標的を特定し、かつ特徴付ける機会をもたらしている。遺伝子およびそれらの機能についてのこの新しい情報は、基本的な生物学的理解を加速させ、治療的介入のために多くの新しい標的を提示する。いくつかの場合において、分析ツールは、新しいデータの生成に追いついていない。世界的な差次的遺伝子発現の測定における近年の進歩によってある例が提供される。遺伝子発現マイクロアレイ、差次的cDNAクローニング頻度、減算的ハイブリダイゼーション、およびディファレンシャルディスプレイ法を代表とするこれらの方法は、異なる組織内で、または特定の刺激物に応答して、上方もしくは下方制御される遺伝子を非常に迅速に特定することができる。そのような方法は、形質転換、腫瘍進行、炎症応答、神経障害等の生物学的プロセスを調査するためにますます使用されている。当業者は、現在、所与の生理学的現象と相関する差次的発現遺伝子の長いリストを非常に容易に生成することができるが、個々の差次的発現遺伝子と現象との間の因果関係を実証するのは困難である。現在のところ、機能を差次的発現遺伝子に割り当てるための簡単な方法は、差次的遺伝子発現を監視する能力に追いついていない。
TALE融合技術のさらなる適用は、遺伝子発現を操作し、かつ/またはゲノムを変化させてトランスジェニック動物または植物を産生する。細胞株と同様に、内在性遺伝子の過剰発現またはトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物への異種遺伝子の導入は、極めて容易なプロセスである。同様に、トランスジェニック植物の産生が周知である。本明細書に記載のTALEドメイン融合技術を用いて、トランスジェニック動物および植物を容易に生成することができる。
開示される方法および組成物は、TALEタンパク質およびTALE融合タンパク質の特異性および/または活性を増加させる利用法を見出す。TALEタンパク質の活性の増強は、様々な環境における使用へのその適用性を増加させる。活性は、(i)切断ドメインの修飾(例えば、より速い切断速度を有するため)、(ii)結合特異性の増加(例えば、ヌクレアーゼのうちの1つ以上の標的との会合がより速く生じるか、またはより長く持続し、切断の発生により長い時間を見越すように、TALENと標的部位との間のより強力な結合)(iii)DNA結合ドメインの修飾(設計)(例えば、複数(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10個以上)の非正準もしくは非定型RVDの使用、1つ以上の反復単位の11位の変化、より強固かつ活性なR0−R1対の開発、および/またはより多くの標的と相互作用することができるR1/2反復の開発によって)によって増加し得る。TALE融合物の活性の増加がより少ないヌクレアーゼ発現ベクターしか細胞に導入しなくてもよいことを意味することは明らかであり、これは、例えば、典型的にはトランスフェクトまたは形質導入するのが困難な細胞型(初代細胞または幹細胞等)および/または細胞の大きなプールにおいて有用である。
実施例1:増強された活性を有する多量体RVDの特定
標的塩基認識のためにいくつかの操作されたTALENを正準RVDを用いて構築し、反復配列内のRVDの位置がその塩基選好性に影響を与えたことを見出した。一例として、TALEN SBS101146のSELEX分析(方法論については共同所有の米国特許公開第20110301073号を参照し、以下の表1も参照のこと)は、典型的にはGを認識するRVD「NN」が、NN含有反復単位が配列内のどこに存在するかによってGに対してより高いか、またはより低い選択性を示したことを見出した(図1)。NNの塩基選好性の数値比較は、これらの隣接塩基の影響が有意であり得ることを示した(図2)。以下の表1に示されるいくつかの操作されたTALENを用いたNNおよびNG RVDの可変挙動のさらなる例が実証された(図3)。この種のデータは、TALE反復単位がそれらの周囲環境に影響され、変異形結合挙動がその標的に対するTALENの特異性および親和性に影響を及ぼす可能性があり得ることを示した。したがって、我々は、より強固なRVDの開発に努めた。
TALE四量体ライブラリを以下のすべての可能性のある400個のRVDのサブセットを用いて構築した。標的DNAでアデニン(A)を認識するために、HI、CI、またはKI RVDを有する反復単位を選択した。Cの場合、ND、AD、KDおよびRDを有する反復単位を用い、Gの場合、KN、EN、HN、SN、AN、CN、GN、FN、AK、およびCK RVDを有する反復単位を利用した。Tを認識するために、HG、KG、MG、QG、RG、AA、QA、およびVA RVDを有する反復単位を用いた。
候補四量体がそれらの標的に結合する能力を試験するために、それらを2つのライブラリに組み立てた。ライブラリは、ATCCT標的を特定する正準(典型的な)RVD NI−NG−HD−HD−NGを有する5個の反復単位のアンカーのN末端側に結合される四量体の混合物を有するTALEを含んだ。TLライブラリにおいて、2つの組の四量体ライブラリを構築し、一方の四量体ライブラリがTCAT標的を標的とし、他方の四量体ライブラリがCTTC標的を標的とした。四量体混合物がTGAC標的を特定するアンカーTALE反復のC末端に結合されるようにTRライブラリを構築し、このアンカーは、この実施例においても同様に正準RVD(NG−NN−NI−HD)によって特定された。TRライブラリは、TALE Cキャップにおいて半反復をコードするベクター部分にコードされたさらなるアンカーRVD(NG)も含んだ。このライブラリで試験した四量体は、TCAT、CCTG、CAGC、CAGA、ATTG、およびATACに結合することを目的とした(図4A)。TL構築物およびTR構築物は両方ともに以前に説明されたTALEN骨格を用いた(N+137 Nキャップ、N+63 Cキャップ、共同所有の米国特許公開第20110301073号を参照のこと)。
上述のELISAを用いて最も活性な新規の四量体を特定した後(表1)、いくつかの四量体を選択し、これらをCCR5特異的TALENに組み立てた。これらの実験において、四量体をコンビナトリアルに組み立てて両方のCCR5 TALENパートナー内の相対位置にし、特異的標的のすべての可能性のある四量体の組み合わせの組み立てを可能にした。ELISA結果に基づいて選択し、かつコンビナトリアル組み立てに用いた四量体が以下の表3に示される。
次に、正準パートナーと組み合わせた上で特定されたCCR5 TALENを一意のTALENパートナーと組み合わせて試験する。これらの実験のために、表8に示される組を組み合わせ、Cel−I活性について試験し、結果は、これらのタンパク質が高度に活性であることを示す。
我々は、一方のパートナーがすべての正準RVD(「L」、SBS101041)を含み、他方のパートナーがすべての新規のRVD(「L*」、SBS102204)を含む上述の2つのCCR5 LパートナーをSELEXによって比較した(図7)。新規のRVDの使用は、いくつかの位置での塩基選択の特異性の改善をもたらした。同様に、一方のパートナーがすべての正準RVD(「R」、SBS101047)を使用し、他方のパートナーが新規のRVD(「R*」、SBS102109)を利用する2つのCCR5 Rパートナーを作製した。これらの対をCel Iアッセイにおいて試験し(図8)、非常に類似したレベルの切断活性を有することが見出された。
TALENとの関連でTALE DNA結合ドメインのC末端の切断がヌクレアーゼ活性を増加させることが示されている(米国特許公開第201103073号、Miller et al(同書)を参照のこと)。しかしながら、FokIタンパク質に由来するヌクレアーゼの触媒ドメインの切断は、TALENの活性を増加させることもできる。したがって、FokIタンパク質の最初の配列を試験し、2つの配列変異形を特定した(以下に示される)。これらの配列はかなり類似しているが、異なるN末端を有し、触媒ドメイン近くの領域がある程度相違する。以下に示される配列において、操作されたヌクレアーゼ融合物において用いられた触媒ヌクレアーゼドメインに対応する領域に下線が引かれている。太字の「D」は、それぞれの配列における第1の活性部位アスパラギン酸塩を表し、大文字で示される。
以前に、一方のパートナーが活性FokIドメインを有し、他方のパートナーが酵素的に不活性なFokIドメインに融合するこれらのパートナーを含むZFN対が、DSBを作成するのではなくDNAをニッキングする対をもたらしたことが観察された(共同所有の米国特許公開第20100047805号を参照のこと)。したがって、TALENニッカーゼを以下のように開発する。実施例2に記載の欠失および置換を用いて作製したTALENを101041/101070 CCR5特異的TALEN対において使用し、試験した。TALEN標的部位を含有する適切な基質をCCR5 TALEN結合領域に隣接するCCR5配列のPCR増幅によって生成して、基質を生成する。この基質をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32P末端標識し、一方のパートナーが触媒的に不活性化された点変異D450N(D450N)を含むTALENとともにインキュベートする。放射性標識基質DNAおよびTALENタンパク質の混合物を、以下に記載の修飾を伴って以前に説明されたように37℃で2時間インキュベートする(Miller et al(2007)Nat.Biotech.25:778−785)。
R−1反復単位は、R0およびR1反復を安定化する役割を果たし得、NキャップのDNA結合選好性に影響を与え得るか、または全TALE DNA結合配列の安定剤としての機能を果たし得る。増加した活性または変化した結合特異性を有するR−1変異形を特定するために、以下のように12位および13位(太字の下線で示される)等のRVDにおける置換を行い、TALE13、キサントモナス、およびラルストニア由来のR−1反復のいくつかの天然に存在する配列が参照用に示される(それぞれ、配列番号59および60)。
さらに増強されたTALE反復単位を特定するために、反復単位の11位のアミノ酸を変化させた。11位は、RVDに直ぐ隣接した位置であり、したがって、その標的ヌクレオチドへのRVDの結合に影響を与え得る。これらの実験において、小サブユニットのRVDを選択し、その後、すべての可能性のあるアミノ酸置換を生成されたこれらのRVDに隣接した11位で行った。TALE結合ドメインを構築し、その結合活性は、SELEXおよびELISAによって中央位置でのミスマッチに感受性があることが示された。このタンパク質は、配列5’−TTGACAATCCT−3’(配列番号82)に結合し、配列5’−TTGACCATCCT−3’(配列番号83)、5’−TTGACGATCCT−3’(配列番号84)、または5’−TTGACTATCCT−3’(配列番号85)に対してわずかな結合活性しか示さなかった。これらの標的は、CXA標的と称され、中央三重項核酸を示し、式中、Xは、A、C、T、またはGのいずれかである。
TALEN活性を代替のヌクレアーゼドメインを用いて増加させることもできる。BfiIは、その結合部位の下流の定位置でDNAを認識および切断するIIs型制限酵素である。消化後、1つの塩基対3’ヌクレオチド突出末端を生成する(以下の実施例を参照のこと)。
5’−ACTGGGNNNNN(配列番号87)
3’−TGACCCNNNN(配列番号88)
我々は、野生型FokIドメインまたは「eHiFi」FokIドメイン(KKR FokI変異形と対になったELD FokI変異形)のいずれかを用いて以下のTALEN対のヌクレアーゼ活性を比較した。用いたTALENはCCR5を標的とし、それらの結合部位が以下に示される(配列番号117〜119)。
上述のように、12位および13位は、TALE反復単位中のRVDを含み、反復単位がどのDNA塩基と相互作用するかを大方決定するように見える。12位のそれぞれのアミノ酸(図14A)および13位のそれぞれのアミノ酸(図14B)のDNA塩基選好性を比較する分析を行った(図14)。結果は、13位が12位よりも選択的であり、かつその同族DNA塩基へのRVDの結合の親和性および特異性により大きな役割を果たすことを示した。13位は、塩基選好性を大方決定するように見える。これは、それぞれ、T、A、C、およびG/Aを特定する残基G、I、D、およびNにおいて最も明らかである。残基HおよびKは、一般により弱い親和性を有するにもかかわらず、Gを特定する傾向もあり、いくつかのRVD含有残基AおよびPは、Tを特定することができる。対照的に、12位は、結合強度を調節する傾向があり(いくつかの場合において、50倍を超える範囲または相対的ELISAシグナルにわたって)、塩基選好性にわずかな影響または最小の影響しか及ぼさない。
ヒトCCR5に特異的なTALENを非正準RVDを含むように設計し、ヒトCD34+細胞で試験した。用いた方法は、以前に説明された方法である(Holt et al,(2010)Nat Biotech 28(8):839−847を参照のこと)。これらの実験において、CCR5特異的TALENを含有するプラスミドを、製造業者のプトロコルに従ってAmaxa 4Dヌクレオフェクションプロトコルを用いてK562細胞または胎児肝臓CD34+細胞に導入し、TALEN対のそれぞれのメンバーは、別個のプラスミド上に存在した。1μgのそれぞれのプラスミドをヌクレオフェクションに用いた。CCR5遺伝子中の選択された標的部位が以下に示され(上から下に配列番号178〜182)、使用したTALENが表16に示される。
標的部位:
Hockemeyerら((2011)Nat Biotech,29:731−734)は、インデルをヒト細胞中の内因性PITX3遺伝子に導入することができる一対のTALEN、101236および101238を説明している。TALEN対の活性および特異性を改善する我々の能力を実証するために、非正準および/または非定型RVDを101238タンパク質のいくつかの位置で置換し、その後、結果として生じたタンパク質を分析した。101236をコードする400ngのプラスミドDNAを、101238、101238a、101238b、101238c、101238d、または101238eのいずれかをコードする400ngのプラスミドDNAと合わせ、結果として生じた混合物をAmaxa Shuttle 96チャネル電気穿孔器を用いてヒトK562細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした後、細胞をDoyonら((2010)Nat Meth(7):459−460)が説明する手順と同様の「低温ショック」手順に供し、その後、ゲノムDNAを採取して、それぞれの試料のインデルの割合を上述のCel−Iアッセイを用いてアッセイした(Guschin et al.,(2010)Methods Mol Biol.649:247−56)。それぞれの試料において測定されたインデルの割合に加えて、101238、101238a、101238b、101238c、101238d、および101238eのRVDが表18に示される。101238a、101238b、101238c、および101238dは、101236と組み合わせて、最初の101238構築物よりも高い活性を有する。
Claims (23)
- 複数のTALE反復単位を含む単離された天然に存在しないTALE DNA結合ポリペプチドであって、前記TALE反復単位がそれぞれ反復可変ジ残基領域(RVD)を含み、前記TALE DNA結合ポリペプチドが少なくとも3つの非正準RVDを含む、TALE DNA結合ポリペプチド。
- 前記反復単位のうちの少なくとも1つの11位のアミノ酸が、天然に存在するTALE反復単位と比較して変化している、請求項1に記載のTALE DNA結合ポリペプチド。
- 11位のアミノ酸が、アラニン(A)、システイン(C)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、およびアルギニン(R)からなる群から選択されるアミノ酸に変化する、請求項2に記載のTALE DNA結合ポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のTALE DNA結合ポリペプチドおよび機能ドメインを含む融合タンパク質。
- 前記機能ドメインが、転写活性化因子、転写抑制因子、メチルトランスフェラーゼ、およびヌクレアーゼ切断ドメインからなる群から選択される、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のTALE DNA結合タンパク質または請求項4および5のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のTALE DNA結合タンパク質、請求項4および5のいずれかに記載の融合タンパク質、または請求項6に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項7に記載の単離された宿主細胞。
- 前記細胞が哺乳類細胞または植物細胞である、請求項8に記載の単離された宿主細胞。
- 前記哺乳類細胞が幹細胞である、請求項9に記載の単離された宿主細胞。
- 前記ヌクレアーゼ切断ドメインが活性または不活性FokI切断ドメインを含む、請求項4または請求項5に記載の融合タンパク質。
- TALE DNA結合タンパク質を作製する方法であって、
請求項1または請求項2に記載のTALE DNA結合タンパク質を作製することを含み、前記TALE DNA結合タンパク質がTALE反復単位から組み立てられ、前記TALE反復単位のうちの少なくとも3つが非正準RVDを含み、さらに前記TALE DNA結合タンパク質が、正準RVDのみを含むTALE DNA結合タンパク質と比較して、増強された特異性または活性を呈する、方法。 - 細胞における内在性遺伝子の発現を調節する方法であって、
請求項11に記載の融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記TALE DNA結合が前記内在性遺伝子中の標的部位に結合し、さらに前記内在性遺伝子の発現が前記融合タンパク質によって調節される、方法。 - 前記調節が、遺伝子活性化、遺伝子抑制、および遺伝子不活性化からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が切断ドメインまたは切断半ドメインを含み、前記内在性遺伝子が切断によって不活性化される、請求項13に記載の方法。
- 細胞のゲノム中の目的とする領域を修飾する方法であって、
請求項11に記載の少なくとも1つの融合タンパク質を前記細胞に導入することを含み、前記TALE DNA結合タンパク質が前記細胞の前記ゲノム中の標的部位に結合し、前記融合タンパク質が前記目的とする領域中の前記ゲノムを切断する、方法。 - 前記修飾は、欠失を前記目的とする領域に導入することを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記修飾が外因性核酸を前記目的とする領域に導入することを含み、前記方法が前記外因性核酸を前記細胞に導入することをさらに含み、前記外因性核酸が相同組換えによって前記目的とする領域に組み込まれる、請求項16に記載の方法。
- 前記細胞が、植物細胞、動物細胞、魚細胞、および酵母細胞からなる群から選択される真核細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして導入される、請求項16に記載の方法。
- 二本鎖DNA標的配列内に一本鎖切断を作製する方法であって、
請求項11に記載の第1および第2の融合タンパク質を含む二量体を形成することを含み、前記第1の融合タンパク質が活性FokI切断ドメインを含み、前記第2の融合タンパク質が不活性FokI切断ドメインを含む、方法。 - 二本鎖DNA標的を切断する方法であって、
第1および第2の二量体を形成することを含み、前記二量体がそれぞれ請求項11に記載の第1および第2の融合タンパク質を含み、前記第1および第2の二量体が前記二本鎖DNA標的の相補鎖上に第1および第2の一本鎖切断を作製するように、それぞれの前記二量体の前記第1の融合タンパク質が活性FokI切断ドメインを含み、前記第2の融合タンパク質が不活性FokI切断ドメインを含み、前記第1および第2の一本鎖切断が前記二本鎖DNAを2つの断片に分離し、それによって前記二本鎖DNA標的を切断する、方法。 - 請求項1または請求項2に記載のTALE DNA結合ポリペプチドを含むキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161560630P | 2011-11-16 | 2011-11-16 | |
US61/560,630 | 2011-11-16 | ||
US201261694710P | 2012-08-29 | 2012-08-29 | |
US61/694,710 | 2012-08-29 | ||
PCT/US2012/065634 WO2013074999A1 (en) | 2011-11-16 | 2012-11-16 | Modified dna-binding proteins and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015501637A true JP2015501637A (ja) | 2015-01-19 |
JP2015501637A5 JP2015501637A5 (ja) | 2015-12-24 |
JP6144691B2 JP6144691B2 (ja) | 2017-06-07 |
Family
ID=48430209
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014542510A Active JP6144691B2 (ja) | 2011-11-16 | 2012-11-16 | 修飾されたdna結合タンパク質およびその使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9458205B2 (ja) |
EP (1) | EP2780460B1 (ja) |
JP (1) | JP6144691B2 (ja) |
AU (1) | AU2012340213B2 (ja) |
CA (1) | CA2854819C (ja) |
HK (1) | HK1200871A1 (ja) |
WO (1) | WO2013074999A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015532654A (ja) * | 2012-09-04 | 2015-11-12 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 標的結合特異性を有するキメラポリペプチド |
Families Citing this family (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008027558A2 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Codon Devices, Inc. | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
CA2798988C (en) * | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
JP6118725B2 (ja) | 2010-11-12 | 2017-04-19 | ジェン9・インコーポレイテッドGen9,INC. | 核酸合成のための方法およびデバイス |
WO2012064975A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
LT3594340T (lt) | 2011-08-26 | 2021-10-25 | Gen9, Inc. | Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai |
US8450107B1 (en) | 2011-11-30 | 2013-05-28 | The Broad Institute Inc. | Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors |
US10801017B2 (en) | 2011-11-30 | 2020-10-13 | The Broad Institute, Inc. | Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors |
US11778993B2 (en) * | 2012-03-15 | 2023-10-10 | Cellectis, S.A. | Repeat variable diresidues for targeting nucleotides |
US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
CA2871505C (en) | 2012-04-24 | 2021-10-12 | Gen9, Inc. | Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning |
WO2013163628A2 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Duke University | Genetic correction of mutated genes |
US20150017136A1 (en) * | 2013-07-15 | 2015-01-15 | Cellectis | Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy |
WO2013176916A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Roman Galetto | Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells |
AU2013280661A1 (en) | 2012-06-25 | 2015-01-22 | Gen9, Inc. | Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing |
KR101844123B1 (ko) * | 2012-12-06 | 2018-04-02 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 |
US11077144B2 (en) | 2013-05-13 | 2021-08-03 | Cellectis | CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof |
US11311575B2 (en) | 2013-05-13 | 2022-04-26 | Cellectis | Methods for engineering highly active T cell for immunotherapy |
CN105934524A (zh) | 2013-11-11 | 2016-09-07 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于治疗亨廷顿氏病的方法和组合物 |
CA2930877A1 (en) * | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Crispr Therapeutics Ag | Crispr-cas system materials and methods |
WO2015164748A1 (en) * | 2014-04-24 | 2015-10-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Engineered transcription activator like effector (tale) proteins |
WO2015168158A1 (en) * | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Fredy Altpeter | Targeted genome editing to modify lignin biosynthesis and cell wall composition |
DE102014106327A1 (de) * | 2014-05-07 | 2015-11-12 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) | TAL-Effektornuklease zum gezielten Knockout des HIV-Korezeptors CCR5 |
BR112016025849A2 (pt) | 2014-05-08 | 2017-10-17 | Chdi Foundation Inc | métodos e composições para o tratamento da doença de huntington |
WO2016019144A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
US20170369848A1 (en) * | 2014-11-11 | 2017-12-28 | Q Therapeutics, Inc. | Engineering mesenchymal stem cells using homologous recombination |
WO2016153305A1 (ko) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | 한국생명공학연구원 | 표적 유전자 특이적 핵산 프로브 및 Fok Ι 제한효소 이량체를 이용하여 세포 내에서 표적 유전자를 특이적으로 편집하기 위한 조성물 및 이의 용도 |
US10179918B2 (en) | 2015-05-07 | 2019-01-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for increasing transgene activity |
WO2016183298A2 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
US9957501B2 (en) | 2015-06-18 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
US10450585B2 (en) | 2015-07-13 | 2019-10-22 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
EA037993B1 (ru) | 2015-09-23 | 2021-06-21 | Сангамо Терапьютикс, Инк. | Репрессоры htt и их применение |
EP4089175A1 (en) | 2015-10-13 | 2022-11-16 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
CA3002524A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof |
EP3380622A4 (en) | 2015-11-23 | 2019-08-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING IMMUNITY |
IL297018A (en) | 2015-12-18 | 2022-12-01 | Sangamo Therapeutics Inc | Directed cleavage of cell mhc receptor |
WO2017106528A2 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of the t cell receptor |
ES2895430T3 (es) | 2016-01-15 | 2022-02-21 | Univ Minnesota | Métodos y composiciones para el tratamiento de enfermedad neurológica |
KR20180101442A (ko) | 2016-02-02 | 2018-09-12 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | Dna-결합 도메인 및 절단 도메인을 연결시키기 위한 조성물 |
AU2017274145B2 (en) | 2016-06-02 | 2020-07-23 | Sigma-Aldrich Co Llc | Using programmable DNA binding proteins to enhance targeted genome modification |
WO2018001858A1 (en) * | 2016-06-27 | 2018-01-04 | University Of Copenhagen | Tailored assembly of a modular bud polypeptide |
SG11201901364VA (en) | 2016-08-24 | 2019-03-28 | Sangamo Therapeutics Inc | Engineered target specific nucleases |
SG10201913315SA (en) | 2016-08-24 | 2020-02-27 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulation of gene expression using engineered nucleases |
AU2017324462B2 (en) | 2016-09-07 | 2024-03-21 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modulation of liver genes |
EP3528852A4 (en) | 2016-10-20 | 2020-06-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF FABRY'S DISEASE |
WO2018081775A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
CN110214184A (zh) | 2016-12-01 | 2019-09-06 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | τ蛋白调节剂以及用于其递送的方法和组合物 |
AU2018256877B2 (en) | 2017-04-28 | 2022-06-02 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
US11512287B2 (en) | 2017-06-16 | 2022-11-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors |
SG11202004003YA (en) | 2017-11-09 | 2020-05-28 | Sangamo Therapeutics Inc | Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene |
JP7275152B2 (ja) | 2018-02-08 | 2023-05-17 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 操作された標的特異的なヌクレアーゼ |
CA3094468A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions |
JP2021520211A (ja) | 2018-04-05 | 2021-08-19 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 組換え受容体を発現するt細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法 |
US11690921B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-07-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery of target specific nucleases |
WO2020146805A1 (en) | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
US20200248156A1 (en) * | 2019-02-01 | 2020-08-06 | The General Hospital Corporation | Targetable 3`-Overhang Nuclease Fusion Proteins |
EP3826664A4 (en) | 2019-02-06 | 2022-10-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | METHOD FOR THE TREATMENT OF TYPE I MUCOPOLYSACCHARIDOSES |
CN109655614A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-04-19 | 广州维佰生物科技有限公司 | 牛布氏菌病病毒荧光微球免疫层析试纸及其制备方法与检测方法 |
KR20210146986A (ko) | 2019-04-02 | 2021-12-06 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 베타-지중해빈혈의 치료 방법 |
KR20220003561A (ko) | 2019-04-23 | 2022-01-10 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 유전자 발현의 조정제 및 그의 용도 |
KR20220016475A (ko) | 2019-05-01 | 2022-02-09 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 변형된 tgfbr2 유전자 좌에서 재조합 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오티드 및 방법 |
WO2020223571A1 (en) | 2019-05-01 | 2020-11-05 | Juno Therapeutics, Inc. | Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods |
EP3999627A2 (en) | 2019-07-18 | 2022-05-25 | University of Rochester | Cell-type selective immunoprotection of cells |
WO2021026336A2 (en) * | 2019-08-07 | 2021-02-11 | I Altius Institute For Biomedical Sciences | Compositions and methods for modulation of gene expression |
EP4041897A1 (en) * | 2019-10-11 | 2022-08-17 | Basf Plant Science Company GmbH | Increase in corn transformation efficacy by the n-terminus of a tale |
CA3159620A1 (en) | 2019-11-01 | 2021-05-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for genome engineering |
WO2021231661A2 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Juno Therapeutics, Inc. | Process for producing donor-batched cells expressing a recombinant receptor |
JP2023531531A (ja) | 2020-06-26 | 2023-07-24 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたt細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法 |
EP4182297A1 (en) | 2020-07-16 | 2023-05-24 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Cationic lipids for use in lipid nanoparticles |
WO2022046760A2 (en) | 2020-08-25 | 2022-03-03 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
CN116802203A (zh) | 2020-11-04 | 2023-09-22 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 从经修饰的恒定cd3免疫球蛋白超家族链基因座表达嵌合受体的细胞、相关多核苷酸和方法 |
WO2023010133A2 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn) |
AU2022318664A1 (en) | 2021-07-30 | 2024-02-29 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) |
WO2023039598A1 (en) | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Life Technologies Corporation | Gene editing tools |
WO2023081900A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods |
WO2023137472A2 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression |
WO2023137471A1 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation |
TW202340457A (zh) | 2022-02-28 | 2023-10-16 | 美商凱特製藥公司 | 同種異體治療細胞 |
WO2023250511A2 (en) | 2022-06-24 | 2023-12-28 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression |
WO2024015881A2 (en) | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation |
US20240067969A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-29 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression |
WO2024064642A2 (en) | 2022-09-19 | 2024-03-28 | Tune Therapeutics, Inc. | Compositions, systems, and methods for modulating t cell function |
WO2024100604A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for manufacturing engineered immune cells |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
Family Cites Families (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11030A (en) | 1854-06-06 | Water-level indicator for steam-boilers | ||
US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
US6242568B1 (en) | 1994-01-18 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
WO1995019431A1 (en) | 1994-01-18 | 1995-07-20 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
JP4118327B2 (ja) | 1994-08-20 | 2008-07-16 | ゲンダック・リミテッド | Dna認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良 |
GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
GB2338237B (en) | 1997-02-18 | 2001-02-28 | Actinova Ltd | In vitro peptide or protein expression library |
GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
ATE466952T1 (de) | 1998-03-02 | 2010-05-15 | Massachusetts Inst Technology | Poly-zinkfinger-proteine mit verbesserten linkern |
US7013219B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US7070934B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-07-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
US6794136B1 (en) | 2000-11-20 | 2004-09-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Iterative optimization in the design of binding proteins |
US7257541B1 (en) | 1999-10-08 | 2007-08-14 | I2 Technologies Us, Inc. | System and method for performing a business process in a multi-enterprise, collaborating network |
DE60023936T2 (de) | 1999-12-06 | 2006-05-24 | Sangamo Biosciences Inc., Richmond | Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen |
AU5077401A (en) | 2000-02-08 | 2001-08-20 | Sangamo Biosciences Inc | Cells for drug discovery |
US20020061512A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-05-23 | Kim Jin-Soo | Zinc finger domains and methods of identifying same |
AU2001263155A1 (en) | 2000-05-16 | 2001-11-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for interaction trap assays |
JP2002060786A (ja) | 2000-08-23 | 2002-02-26 | Kao Corp | 硬質表面用殺菌防汚剤 |
GB0108491D0 (en) | 2001-04-04 | 2001-05-23 | Gendaq Ltd | Engineering zinc fingers |
US20040224385A1 (en) | 2001-08-20 | 2004-11-11 | Barbas Carlos F | Zinc finger binding domains for cnn |
US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
CN100575485C (zh) | 2002-01-23 | 2009-12-30 | 犹他大学研究基金会 | 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变 |
EP2368982A3 (en) | 2002-03-21 | 2011-10-12 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
US9447434B2 (en) | 2002-09-05 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
JP4903689B2 (ja) | 2004-04-08 | 2012-03-28 | サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 神経障害および神経変性症状を治療するための方法と組成物 |
KR20070060115A (ko) | 2004-09-16 | 2007-06-12 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법 |
EP1913149A4 (en) | 2005-07-26 | 2009-08-05 | Sangamo Biosciences Inc | TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES |
WO2007136685A2 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase |
EP2206782A1 (en) | 2006-05-25 | 2010-07-14 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for gene inactivation |
EP2213731B1 (en) | 2006-05-25 | 2013-12-04 | Sangamo BioSciences, Inc. | Variant foki cleavage half-domains |
WO2008076290A2 (en) | 2006-12-14 | 2008-06-26 | Dow Agrosciences Llc | Optimized non-canonical zinc finger proteins |
US8790345B2 (en) | 2007-08-21 | 2014-07-29 | Zimmer, Inc. | Titanium alloy with oxidized zirconium for a prosthetic implant |
CA2700231C (en) | 2007-09-27 | 2018-09-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Rapid in vivo identification of biologically active nucleases |
DK2205749T3 (en) | 2007-09-27 | 2016-08-22 | Dow Agrosciences Llc | MODIFIED PROTEINS zinc finger, which target the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes |
JP5507555B2 (ja) | 2008-06-30 | 2014-05-28 | チョ−エー・ファーム・カンパニー・リミテッド | 豚のαS1カゼイン遺伝子、そのプロモーター、及びその用途 |
EP2313515B1 (en) | 2008-08-22 | 2015-03-04 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
EP2419511B1 (en) * | 2009-04-09 | 2018-01-17 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted integration into stem cells |
JP5798116B2 (ja) | 2009-06-30 | 2015-10-21 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 生物活性のあるヌクレアーゼの迅速なスクリーニングおよびヌクレアーゼ修飾細胞の単離 |
JP6137596B2 (ja) | 2010-02-08 | 2017-05-31 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 遺伝子操作された切断ハーフドメイン |
CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
EP3320910A1 (en) | 2011-04-05 | 2018-05-16 | Cellectis | Method for the generation of compact tale-nucleases and uses thereof |
US20130097734A1 (en) | 2011-07-12 | 2013-04-18 | Two Blades Foundation | Late blight resistance genes |
US8450107B1 (en) | 2011-11-30 | 2013-05-28 | The Broad Institute Inc. | Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors |
-
2012
- 2012-11-16 JP JP2014542510A patent/JP6144691B2/ja active Active
- 2012-11-16 AU AU2012340213A patent/AU2012340213B2/en active Active
- 2012-11-16 WO PCT/US2012/065634 patent/WO2013074999A1/en active Application Filing
- 2012-11-16 US US13/679,684 patent/US9458205B2/en active Active
- 2012-11-16 EP EP12850371.1A patent/EP2780460B1/en active Active
- 2012-11-16 CA CA2854819A patent/CA2854819C/en active Active
-
2015
- 2015-02-05 HK HK15101313.1A patent/HK1200871A1/xx unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015532654A (ja) * | 2012-09-04 | 2015-11-12 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 標的結合特異性を有するキメラポリペプチド |
KR20220016303A (ko) * | 2012-09-04 | 2022-02-08 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 표적화된 바인딩 특이도를 갖는 키메라 폴리펩타이드들 |
KR102596125B1 (ko) | 2012-09-04 | 2023-10-30 | 더 스크립스 리서치 인스티튜트 | 표적화된 바인딩 특이도를 갖는 키메라 폴리펩타이드들 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130196373A1 (en) | 2013-08-01 |
EP2780460A4 (en) | 2015-08-26 |
EP2780460B1 (en) | 2018-07-11 |
CA2854819A1 (en) | 2013-05-23 |
CA2854819C (en) | 2022-07-19 |
US9458205B2 (en) | 2016-10-04 |
JP6144691B2 (ja) | 2017-06-07 |
HK1200871A1 (en) | 2015-08-14 |
EP2780460A1 (en) | 2014-09-24 |
AU2012340213A1 (en) | 2014-05-29 |
WO2013074999A1 (en) | 2013-05-23 |
AU2012340213B2 (en) | 2017-12-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6144691B2 (ja) | 修飾されたdna結合タンパク質およびその使用 | |
US11661612B2 (en) | DNA-binding proteins and uses thereof | |
JP6812478B2 (ja) | ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151102 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151102 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160829 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161228 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170420 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170511 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6144691 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |