JP2015532654A - 標的結合特異性を有するキメラポリペプチド - Google Patents
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Abstract
キメラポリペプチド（その組成物を含む）、発現ベクター、ならびにトランスジェニック細胞、組織、植物および動物の作製のためのその使用方法を本明細書に開示する。本発明の組成物、ベクターおよび方法は遺伝子治療技術においても有用である。【選択図】なし
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年９月４日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／６９６，６８９、２０１３年１月１７日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／７５３，７６３および２０１３年５月１日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／８１８，３６４（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものである。
本出願は、２０１２年９月４日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／６９６，６８９、２０１３年１月１７日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／７５３，７６３および２０１３年５月１日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／８１８，３６４（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は全般的にはバイオテクノロジーの分野、より詳細には、特異的ＤＮＡ配列を認識するキメラリコンビナーゼに関する。
本発明は全般的にはバイオテクノロジーの分野、より詳細には、特異的ＤＮＡ配列を認識するキメラリコンビナーゼに関する。
ＤＮＡを配列依存的にタンパク質が認識しうることは生命にとって重要である。なぜなら、種々のタンパク質ドメインは、配列特異的ＤＮＡ認識をもたらすように進化してきたからである。これらのドメインの選ばれた少数のものによるＤＮＡ認識は多種多様なバイオテクノロジー用途にとっても根本的に重要である。特に、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、使用者により定められたＤＮＡ配列を認識するように操作された最初のＤＮＡ結合性タンパク質の１つであり、転写調節、ゲノム操作およびエピジェネティック修飾を含む多数の用途に使用されており、種々の度合の成功を収めている。ＺＦＰのモジュール式構築はこれらのアプローチを促進させている。しかし、ＺＦＰ技術の進歩および有望さにもかかわらず、ある配列に対する特異的高アフィニティＺＦＰの構築は依然として困難であり、限られた場合には、非専門的な研究室によっては容易には採用されない、長時間を要する労働集約的な選択系の使用を要する。
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ドメインは、ＺＦＰ技術の潜在的代替物に相当する天然に存在するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のクラスである。ＴＡＬＥは植物病原体キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）において見出され、標的ＤＮＡ配列に選択的に結合するように機能する一連の３３〜３５個のアミノ酸の反復を含有する。これらの反復は、単一ヌクレオチドへの結合をもたらすことによりＤＮＡ特異性を付与する２つの隣接反復可変性二残基（ＲＶＤ）以外は同一である。類似した塩基対番号（ｂｐ）のＤＮＡ部位に結合する３０個を超える反復の配置が記載されている。各ＲＶＤの結合においては固有の縮重が存在するが、最近の研究は、合成ＴＡＬＥタンパク質が、ヒトゲノム内の単一遺伝子座を標的化するのに十分な程度に特異的であることを示している。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のようなキメラヌクレアーゼによるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、遺伝子機能をノックアウトするために、または標的化遺伝子座における外的付加ＤＮＡ駆動カセット組込みの存在下で用いられうる。ＺＦＮは過去１０年間にわたって詳細に研究されており、幾つかの場合には、遺伝子治療のための臨床利用に近づきつつある。最近、幾つかのグループが、標的化ゲノム編集のための、ヌクレアーゼに融合したＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥＮ）の使用を検討している。実際、ＺＦＮに関する研究の多くが、ＴＡＬＥヌクレアーゼを使用して追試されている。なぜなら、ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ結合モジュール性（ｍｏｄｕｌａｒｉｔｙ）に関して、ＺＦＮに優る利点を有しうるからである。しかし、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを使用した印象的な研究にもかかわらず、それらの安全性および特異性に関する疑問が尚も残っている。特に、オフターゲット（非特異的）切断事象を検出することは依然として困難である。なぜなら、オフターゲットＤＳＢの最も考えられうる結果は小さな挿入または欠失の導入であるからである。また、ＤＳＢの修復は、細胞型によって異なる細胞装置に左右される。
標的化ゲノム修飾を達成するための代替的アプローチは部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）の使用である。チロシンリコンビナーゼＣｒｅおよびＦｌｐのようなＳＳＲは、細胞内の染色体構造を操作するために常套的に使用される貴重な分子生物学手段である。これらの酵素は、幾つかの複雑なタンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ相互作用に基づいて触媒作用を調整するため、ＳＳＲは顕著な標的部位特異性を示す。しかし、現在のところ、多くのＳＳＲの特異性の改変は困難であることが判明している。レゾルバーゼ／インベルターゼ型のセリンリコンビナーゼは、ゲノム操作のための、チロシンリコンビナーゼの多目的代替物となる。本質的に、これらの酵素は、高度にモジュール的な様態で組換えを調整するマルチドメインタンパク質複合体として機能する。しかし、組換えのためのアクセサリーファクターを要しない幾つかのセリンリコンビナーゼの突然変異体が特定されている。また、多数の研究により、セリンリコンビナーゼの天然ＤＢＤが特別設計ＺＦＰで置換され、キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）が得られる可能性があることが示されている。原理的には、増大した数の配列を認識しうるＺＦＲが得られうるが、可能なＤＮＡトリプレットの全てを認識しうるジンクフィンガードメインがないことにより、これらの酵素の潜在的モジュラー標的化能が制限される。
ＺＦＲは、ほぼ全てのＤＮＡ配列を認識するように特別に設計されうるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、セリンリコンビナーゼのレゾルバーゼ／インベルターゼファミリーに由来する活性化触媒ドメインとから構成される（図３０Ａ）。ＺＦＲは、リコンビナーゼ触媒ドメインにより認識される中央の２０ｂｐのコア配列に隣接する２つの逆転ジンクフィンガー結合部位（ＺＦＢＳ）からなる特異的ＺＦＲ標的部位の間の組換えを触媒する（図３０Ｂ）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）とは対照的に、ＺＦＲは自律的に機能し、細胞ＤＮＡ損傷応答経路を活性化することなくヒトおよびマウス細胞において導入遺伝子を切り出し、組込みうる。しかし、通常の部位特異的リコンビナーゼの場合と同様に、ＺＦＲの適用は、リコンビナーゼ触媒ドメインにより課される配列要件により制限されており、これは天然セリンレゾルバーゼ／インベルターゼ組換え部位由来の２０ｂｐのコアをＺＦＲ標的部位が含有することを必要とする。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ、ＦＬＰ−ＦＲＴおよび∧Ｃ３１−ａｔｔのような部位特異的ＤＮＡ組換え系が遺伝的操作のための強力な手段として出現している。これらのＤＮＡ再編成を促進させる部位特異的リコンビナーゼは、ＤＮＡ合成または高エネルギー補因子を要しないメカニズムにより、短い（３０〜４０ｂｐ）配列を認識し、ＤＮＡ切断、鎖交換および再連結を調整する。この単純性は、並外れた空間的および時間的感度で研究者が遺伝子機能を研究することを可能にしている。しかし、部位特異的リコンビナーゼにより課される厳格な配列要件は、それらの適用を、人工的に導入された組換え部位を含有する細胞および生物に限定している。この制限に対処するために、定向進化が用いられ、天然に存在するＤＮＡ配列に対する幾つかのリコンビナーゼの配列特異性が改変されている。進歩しているにもかかわらず、複雑な突然変異誘発および選択法の必要性、ならびに再操作リコンビナーゼ変異体が通常、弛緩基質特異性を示すという知見によって、この技術の広範な採用が妨げられている。
したがって、特に遺伝子治療のための、内因性ゲノムの、標的および部位特異的組換えを触媒する、より一般化された方法、ならびにそのような標的化および部位特異的組換えを触媒しうる酵素が必要とされている。これは遺伝子治療に特に有用であるが、分子生物学における多数の他の用途も有し、例えば、遺伝子クローニング、ならびに産業用生物ならびに農業用植物および動物の改変における使用が挙げられる
本明細書には、標的化キメラポリペプチド（その組成物を含む）、発現ベクター、ならびにトランスジェニック細胞、組織、植物および動物の作製のためのその使用方法が開示される。本発明の組成物、ベクターおよび方法は遺伝子治療技術においても有用である。
１つの態様においては、本発明はキメラポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、ａ）リコンビナーゼ、ヌクレアーゼもしくは転写因子またはそれらの断片；およびｂ）転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む。種々の実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は末端が切断されて（トランケート化されて（truncated））おり、Ｃ末端またはＮ末端切断（トランケーション）を含む。幾つかの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質はＡｃｒＸａ７、ＴａｌｌｃおよびＰｔｈＸｏｌである。幾つかの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列の全部または一部を含む。幾つかの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は配列番号２のアミノ酸残基２７と２６８との間、９２と１３４との間、１２０と１２９との間、７４と１４７との間または８７と１２０との間でトランケート化されている。幾つかの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は配列番号２の２８、７４、８７、９２、９５、１２０、１２４、１２８、１２９、１４７および１５０においてトランケート化されている。
別の態様では、本発明は、所望のヌクレオチドに特異的に結合する転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質結合ドメインの製造方法を提供する。該方法は、ａ）可変性二残基（ＲＶＤ）内の又はＲＶＤの１〜２アミノ酸残基Ｎ末端側もしくはＣ末端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインのアミノ酸配列をランダム化することと、ｂ）所望のヌクレオチドに特異的に結合する、（ａ）のランダム化ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインを選択することとを含む。
別の態様では、本発明は、キサンタモヌス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎｕｓ）由来転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該ＴＡＬＥタンパク質は、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、ＷはＲである、ＷはＧである、Ｗは欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号３（ＶＧＫＱＷＳＧＡＲＡＬ）に記載されているアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する。
別の態様では、本発明は、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該ＴＡＬＥタンパク質は、Ｒ１はＫである、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、Ｒ２はＷである、Ｒ２はＧである、Ｒ２は欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号８（ＩＶＤＩＡＲ１ＱＲ２ＳＧＤＬＡ）に記載されているアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する。
別の実施形態では、本発明は転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）の製造方法を提供する。該方法は、ａ）ＮＴＤ内の１以上のアミノ酸残基を突然変異または欠失させることにより、ＮＴＤのアミノ酸配列をランダム化することと（ここで、該アミノ酸配列は配列番号１４（ＶＧＫＸＸＸＧＡＲ）または配列番号１５（ＶＤＩＡＸＸＸＸＧＤＬＡ）である）、ｂ）所望のヌクレオチドに特異的に結合する又は活性の増強を示す、（ａ）のランダム化ＴＡＬＥタンパク質ＮＴＤを選択することとを含む。
また、セリンリコンビナーゼと１以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含むキメラタンパク質、ＺＦＲの製造方法、その組成物、発現ベクター、ならびにトランスジェニック細胞、組織、植物および動物の作製のためのその使用方法を本明細書に開示する。本発明の組成物、ベクターおよび方法は遺伝子治療技術においても有用である。
ある態様において本発明は、対応する野生型リコンビナーゼよりも大きな触媒特異性を有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）タンパク質の製造方法を提供する。該方法は、Ｇｉｎ Ｉｌｅ１２０、Ｔｈｒ１２３、Ｌｅｕ１２７、Ｉｌｅ１３６およびＧｌｙ１３７またはそれらの組合せと同等の位置においてリコンビナーゼ触媒ドメイン上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関して２および３位において該ＤＮＡを突然変異させ、該リコンビナーゼ触媒ドメインを複数のジンクフィンガー結合ドメインと融合させてＺＦＲを形成させ、対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有するＺＦＲを富化させることを含む。幾つかの実施形態においては、ＺＦＲは、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＴＴおよびＡＣから選択されるＤＮＡ標的に対する触媒活性の増強を示す。１つの実施形態においては、該リコンビナーゼ触媒ドメインはＩｌｅ１３６および／またはＧｌｙ１３７において突然変異誘発される。
種々の態様において、本明細書に記載されているキメラポリペプチドは、以下のものから誘導されるか又は本明細書に開示されているとおりにランダムに突然変異誘発されるリコンビナーゼ触媒ドメインを含む：ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；またはｂ）ａ）の突然変異タンパク質。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現カセットを提供する。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている発現カセットを含むベクターを提供する。
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されているベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。
更に別の態様では、本発明はＤＮＡ配列内への部位特異的組込みのための方法を提供する。該方法は、部位特異的組込みを触媒する本発明のキメラポリペプチドと該ＤＮＡ配列を接触させることを含む。
更に別の態様では、本発明は遺伝子治療方法を提供する。該方法は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的に除去または不活性化される。
更に別の態様では、本発明は医薬組成物を提供する。該組成物は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む。もう１つの態様においては、該組成物は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドコードする核酸分子と医薬上許容される担体とを含む。
更に別の態様では、本発明は、本発明のキメラポリペプチドにより触媒される組換えにより産生されるトランスジェニック生物を提供する。
更に別の態様では、本発明は遺伝子治療方法を提供する。該方法は、本明細書に記載されている部位特異的組込みの方法に産生されたＤＮＡ配列を有する核酸分子を含む細胞を対象に投与することを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されているキメラタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
別の態様では、本発明は部位特異的組換えのための方法を提供する。該方法は、ａ）本明細書に記載されているキメラタンパク質と特異的に相互作用するための少なくとも２つの結合部位を含むＤＮＡ配列を提供することと、ｂ）該ＤＮＡ配列を該キメラタンパク質と反応させることとを含み、ここで、該キメラタンパク質と特異的に相互作用する２つの部位の間で該ＤＮＡ配列の鎖の両方が切断される部位特異的組換え事象を該キメラタンパク質が触媒する。
発明の詳細な説明
本発明はＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）の最初の開示を提供する。漸増トランケート化ＴＡＬＥドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてＤＮＡを組換えるために使用されうる最適化ＴＡＬＥＲ構造を特定した。任意の特製ＴＡＬＥ反復アレイが、本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造内に挿入可能であり、ひいてはバイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を劇的に拡大する。
本発明はＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）の最初の開示を提供する。漸増トランケート化ＴＡＬＥドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてＤＮＡを組換えるために使用されうる最適化ＴＡＬＥＲ構造を特定した。任意の特製ＴＡＬＥ反復アレイが、本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造内に挿入可能であり、ひいてはバイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を劇的に拡大する。
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、実質的に全てのＤＮＡ配列に結合するように設計されうる。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの設計のための一般的指針は、ＴＡＬＥにより結合されるＤＮＡ配列の最も５’側の塩基（Ｎ０塩基）がチミンであるべきだと提示している。該Ｎ０要件は、この位置に各ＤＮＡ塩基を含有するＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、ＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥ−Ｒ）およびＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の活性の分析により定量された。５’Ｔの非存在下では、５’Ｔを含有する標的配列と比較して、ＴＡＬＥ−ＴＦ活性においては＞１０００倍までの、ＴＡＬＥ−Ｒ活性においては１００倍までの、そしてＴＡＬＥＮ活性においては１０倍までのＴＡＬＥ活性の低下が観察された。全ての可能なＮ０塩基を認識するＴＡＬＥ構造体を開発するために、ＴＡＬＥ−Ｒ活性選択と組合された構造誘導ライブラリー設計を用いて、任意のＮ０塩基を含有する新規ＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインを得た。Ｇ選択的ドメインおよび広範反応性ドメインを単離し、特徴づけした。ＴＡＬＥ−Ｒ形態において選択された操作されたＴＡＬＥドメインはモジュラー性を示し、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＴＡＬＥＮ構造において活性であった。得られたＮ末端ドメインは、ＴＡＬＥ結合性タンパク質およびデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）酵素としての任意のＤＮＡ配列の、有効かつ制約の無い、ＴＡＬＥに基づく標的化をもたらす。
また、配列要件制限に対処するために、セリンリコンビナーゼ触媒特異性を再操作するための、知識に基づくアプローチが記載された。特異性決定ＤＮＡ結合残基の飽和突然変異誘発に基づくこの戦略を、特異性における＞１０，０００倍の変化を示すリコンビナーゼ変異体を作製するために用いた。重要なことに、このアプローチは、リコンビナーゼ二量体境界の外部に位置するアミノ酸残基に専ら焦点を合わせている（図３５）。その結果、再操作触媒ドメインが会合してＺＦＲヘテロ二量体を形成すること、およびこれらの設計されたＺＦＲペアが、予め決定されたＤＮＡ配列を並外れた特異性で組換えること確認された。総合すると、これらの結果は、この方法により開発される特殊化触媒ドメインの拡張カタログが、特別仕様（カスタム）の特異性を有するＺＦＲを作製するために用いられうると仮定することに本発明者らを導いた。ここでは、推定４×１０８個のユニーク２０ｂｐコア配列を認識しうるＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインの多様なコレクションを開発するために、基質特異性分析と定向進化との組合せを用いる。これらの再操作触媒ドメインから構築されたＺＦＲは、使用者により定められた配列を高い特異性で組換え、ヒト細胞における標的化内因性遺伝子座内にＤＮＡを組込むことが示されている。これらの結果は、ゲノム操作および遺伝子治療を含む多種多様な用途のためのＺＦＲ技術の可能性を示している。
本組成物および方法を記載する前に、本発明は、記載されている個々の組成物、方法および実験条件に限定されず、そのような装置、方法および条件は変動しうる、と理解されるべきである。また、本明細書中で用いる用語は、個々の実施形態を説明することを目的としたものであるに過ぎず、限定的なものではないと理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみにおいて限定されるからである。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数対象物を含む。したがって、例えば、「組成物」または「方法」が示すものは、本開示などを読めば当業者に明らかとなる本明細書に記載されているタイプの、１以上の組成物および方法ならびに／または工程を含む。
特に示されていない限り、本明細書中で用いられている全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および物質が本発明の実施および試験において使用されうるが、好ましい方法および物質を以下に説明する。
「リコンビナーゼ」は、該リコンビナーゼにより認識される特異的ＤＮＡ配列の間で部位特異的組換えを引き起こす酵素のファミリーである（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｄ．およびＳｃｏｃｃａ，Ｊ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，３６０５−３６１４（１９９７）；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６，３９１−４０６（１９９８）；Ｓｔａｒｋ，Ｗ．Ｍ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８，４３２−４３９（１９９２））。
本明細書中で用いる「キメラＴＡＬＥリコンビナーゼ」なる語は、限定的なものではないが、配列特異的結合活性を有する、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質に由来するＴＡＬＥドメインまたは合成由来のＴＡＬＥタンパク質もしくはドメインを有するリコンビナーゼを含む。
本明細書中で用いる「キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ」なる語は、限定的なものではないが、配列特異的結合活性を有する、天然に存在するジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質に由来するジンクフィンガー結合ドメインまたは合成由来のジンクフィンガー結合タンパク質もしくはドメインを有するリコンビナーゼを含む。
本明細書中で用いる「ジンクフィンガー」、「ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメイン」なる語または類似の用語は、天然に存在するジンクフィンガーおよび人工的に製造されたジンクフィンガーの両方を意味する。そのようなジンクフィンガーは、Ｃ２Ｈ２、Ｃ４、Ｈ４、Ｈ３Ｃ、Ｃ３Ｘ、Ｈ３Ｘ、Ｃ２Ｘ２およびＨ２Ｘ２（ここで、Ｘは亜鉛結合アミノ酸である）（これらに限定されるものではない）のような種々のフレームワーク構造を有しうる。ジンクフィンガー構造の説明において通常用いられるとおり、これらのフレームワーク構造においては、「Ｃ」はシステイン残基を表し、「Ｈ」はヒスチジン残基を表す。フレームワークＣ２Ｈ２を有するジンクフィンガーには、例えば以下のものに記載されているジンクフィンガーが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｂａｒｂａｓら，国際公開番号ＷＯ２００８／００６０２８、Ｂａｒｂａｓ，米国特許第７，１０１，９７２号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許第７，０６７，６１７号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許第６，７９０，９４１号、Ｂａｒｂａｓ，米国特許第６，６１０，５１２号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許第６，２４２，５６８号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許第６，１４０，４６６号、Ｂａｒｂａｓ，米国特許第６，１４０，０８１号、Ｂａｒｂａｓ，米国特許出願公開第２００６０２２３７５７号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００６０２１１８４６号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００６００７８８８０号、Ｂａｒｂａｓ，米国特許出願公開第２００５０１４８０７５号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００５００８４８８５号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００４０２２４３８５号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００３００５９７６７号、Ｂａｒｂａｓら，米国特許出願公開第２００２０１６５３５６号（これらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする。他のジンクフィンガーは以下のものに記載されている：Ｒｅｂａｒら，米国特許第７，０６７，３１７号；Ｌｉｕら，米国特許第７，０３０，２１５号；Ｒｅｂａｒら，米国特許第７，０２６，４６２号；Ｃａｓｅら，米国特許第７，０１３，２１９号；Ｃｏｘ ＩＩＩら，米国特許第６，９７９，５３９号；Ｃａｓｅら，米国特許第６，９３３，１１３号；Ｃｏｘ ＩＩＩら，米国特許第６，８２４，９７８号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，米国特許第６，７９４，１３６号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，米国特許第６，７８５，６１３号；Ｃａｓｅら，米国特許第６，７７７，１８５号；Ｃｈｏｏら，米国特許第６，７０６，４７０号；Ｃｏｘ ＩＭら，米国特許第６，６０７，８８２号；Ｃａｓｅら，米国特許第６，５９９，６９２号；Ｃｏｘ ＩＩら，米国特許第６，５３４，２６１号；Ｃａｓｅら，米国特許第６，５０３，７１７号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，米国特許第６，４５３，２４２号；Ｒｅｂａｒら，米国特許出願公開第２００６／０２４６５８８号；Ｒｅｂａｒら，米国特許出願公開第２００６／０２４６５６７号；Ｃａｓｅら，米国特許出願公開第２００６／０１６６２６３号；Ｃｏｘ ＨＩら，米国特許出願公開第２００６／００７８８７８号；Ｒｅｂａｒら，米国特許出願公開第２００５／０２５７０６２号；Ｃｏｘ ＩＩＩら，米国特許出願公開第２００５／０２１５５０２号；Ｃｏｘ ＭＩら，米国特許出願公開第２００５／０１３０３０４号；Ｃａｓｅら，米国特許出願公開第２００４／０２０３０６４；Ｃａｓｅら，米国特許出願公開第２００３／０１６６１４１号；Ｃａｓｅら，米国特許出願公開第２００３／０１３４３１８号；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，米国特許出願公開第２００３／０１０５５９３号；Ｃｏｘ ＩＭら，米国特許出願公開第２００３／００８７８１７号；Ｒｅｂａｒら，米国特許出願公開第２００３／００２１７７６号；およびＣａｓｅら，米国特許出願公開第２００２／００８１６１４号（これらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする）。例えば、これらの特許および特許公開に記載されている１つの代替手段は、いわゆる「Ｄ−エイブル（ａｂｌｅ）部位」、およびそのような部位に結合するジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの使用を含む。「Ｄ−エイブル」部位は、適切に設計されたジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが標的鎖の３個の塩基ではなく４個の塩基に結合することを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは二本鎖ＤＮＡ標的セグメントの一方の鎖（標的鎖）上の３個の塩基のトリプレットおよび他方の相補鎖上の第４の塩基に結合する。４塩基標的セグメントへの単一ジンクフィンガーの結合は標的鎖の配列およびジンクフィンガーのアミノ酸配列の両方に制約を課す。
本明細書中で用いる、本明細書中に現れる種々のアミノ酸配列に存在するアミノ酸は、それらの良く知られた３文字または１文字略語に従い特定される。種々のＤＮＡセグメントに存在するヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる標準的な１文字表示で示される。
ペプチドまたはタンパク質においては、アミノ酸の適当な保存的置換が当業者に公知であり、一般に、生じる分子の生物活性を改変することなく施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に改変しないと当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，ｐ．２２４を参照されたい）。特に、そのような保存的変異体は修飾アミノ酸配列を有していて、該変化はタンパク質（保存的変異体）の構造および／または活性、例えば抗体活性、酵素活性または受容体活性を実質的に改変しない。これらは、アミノ酸配列の保存的修飾変異、すなわち、タンパク質の活性に決定的に重要ではない残基のアミノ酸置換、付加または欠失、あるいは、決定的に重要なアミノ酸の置換でさえも構造および／または活性を実質的に改変しないような、類似特性（例えば、酸性、塩基性、正または負電荷、極性または無極性など）を有する残基によるアミノ酸の置換を含む。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換の表が当技術分野でよく知られている。例えば、保存的置換を選択するための１つの典型的な指針は以下のものを含む（元の残基に続いて典型的な置換が示されている）：Ａｌａ／ＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇまたはＧｌｎまたはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕまたはＴｙｒまたはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅまたはＬｅｕ。代替的な典型的指針は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれが含む以下の６つのグループを用いる：（１）アラニン（ＡまたはＡｌａ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）；（２）アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）；（３）アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）；（４）アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）；（５）イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）；および（６）フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）；（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＳｃｈｕｌｚおよびＳｃｈｉｍｅｒ（１９７９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇも参照されたい）。前記置換は唯一の可能な保存的置換ではないと当業者は理解するであろう。例えば、幾つかの目的には、全ての荷電アミノ酸を、それらが正であるか負であるかにかかわらず、互いに保存的置換とみなしうる。また、コード化配列内の単一アミノ酸または小さな比率のアミノ酸を改変し、付加し、または欠失させる個々の置換、欠失または付加も、運ばれるタンパク質の三次元構造および機能がそのような変異により保存されている場合には、「保存的修飾変異」とみなされうる。
本明細書中で用いる「発現ベクター」なる語は、本発明で提供される発現カセットまたは本発明における融合タンパク質をコードする核酸のような異種ＤＮＡの挿入または組込みにより操作されているプラスミド、ウイルス、ファジミドまたは当技術分野で公知の他のビヒクルを意味する。そのような発現ベクターは、典型的に、細胞における挿入核酸の効率的転写のためのプロモーター配列を含有する。該発現ベクターは、典型的に、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有する。
本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語は、ベクターが増幅され、そのＤＮＡが発現される細胞を意味する。この語はまた、対象宿主細胞の任意の後代を含む。全ての後代は親細胞と同一でなくてもよいと理解される。なぜなら、複製中に突然変異が生じうるからである。「宿主細胞」なる語が用いられる場合には、そのような後代が含まれる。外来ＤＮＡが宿主内で連続的に維持される場合の安定導入の方法は当技術分野で公知である。
本明細書中で用いる遺伝子治療は、そのような治療が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの或る細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの導入を含む。異種ＤＮＡが発現され、それによりコードされる治療用産物が産生されるように、該ＤＮＡは、選択された標的細胞内に導入される。あるいは、該異種ＤＮＡは、何らかの方法で、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を引き起こし、あるいはそれは、何らかの方法で、治療用産物の発現を直接的または間接的に引き起こすペプチドまたはＲＮＡのような産物をコードしうる。遺伝子治療は、それが行われた哺乳動物または細胞により産生される遺伝子産物を補足する又は欠損遺伝子を置換する遺伝子産物をコードする核酸を運搬するためにも用いられうる。導入核酸は、哺乳動物宿主において通常は産生されない又は治療的に有効な量もしくは治療的に有効な時点で産生されない治療用化合物、例えば、その増殖因子インヒビター、または腫瘍壊死因子もしくはそのインヒビター、例えば、それに対する受容体をコードしうる。該治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、該産物またはその発現を増強または改変するために、罹患宿主の細胞内への導入の前に修飾されうる。遺伝子治療はまた、遺伝子発現のインヒビターまたはリプレッサーまたは他のモジュレーターの運搬を含みうる。
本明細書中で用いる異種ＤＮＡは、それが発現される細胞によりインビボで通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする、あるいは転写、翻訳または他の調節可能な生化学的過程に影響を及ぼすことにより内因性ＤＮＡの発現を改変するメディエーターを媒介またはコードするＤＮＡである。異種ＤＮＡは外来ＤＮＡとも称されうる。発現される細胞にとって異種または外来性であるものとして当業者が認識し又はみなす任意のＤＮＡが本発明においては異種ＤＮＡに含まれる。異種ＤＮＡの例には、薬物耐性を付与するタンパク質のような追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗癌物質、酵素およびホルモンのような治療的に有効な基質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体のような他のタイプのタンパク質をコードするＤＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は、該異種ＤＮＡが導入された細胞の表面上で分泌または発現されうる。
したがって、本発明においては、異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡには、ゲノム内で見出される対応ＤＮＡ分子としての正確な配向および位置では存在しないＤＮＡ分子が含まれる。それは別の生物または種からの（すなわち、外因性）ＤＮＡ分子をも意味しうる。
本明細書中で用いる治療的に有効な産物は、宿主内へに核酸が導入されると、遺伝的または後天的疾患の症状、徴候を改善もしくは排除する又は該疾患を治癒させる産物が発現される、異種核酸、典型的にはＤＮＡによりコードされる産物である。典型的には、所望の遺伝子産物をコードするＤＮＡをプラスミドベクター内にクローニングし、通常の方法、例えばリン酸カルシウム媒介性ＤＮＡ取り込み（（１９８１）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：６０３−６１６を参照されたい）またはプロデューサー細胞、例えばパッケージング細胞内へのマイクロインジェクションにより導入する。プロデューサー細胞内での増幅の後、異種ＤＮＡを含有するベクターを、選択された標的細胞内に導入する。
本明細書中で用いる発現ベクターまたは運搬ベクターは、適当な宿主細胞内での発現のために外来または異種ＤＮＡが挿入されうる任意のプラスミドまたはウイルスを意味する。すなわち、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドは宿主細胞の系において合成される。１以上のタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を導くベクターは本明細書においては「発現ベクター」と称される。逆転写酵素を使用して産生されるｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にするベクターも含まれる。
本明細書中で用いる遺伝子は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を意味する。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。遺伝子はコード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含みうる。
本明細書中で用いる、核酸分子またはポリペプチドまたは他の生体分子に関する「単離（された）」なる語は、該ポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝的環境から該核酸またはポリペプチドが分離されていることを意味する。それは、該生体分子が天然状態から改変されていることをも意味しうる。該用語が本明細書において用いられている場合、例えば、生きた動物において天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。したがって、組換え宿主細胞内で産生および／または含有されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されているとみなされる。また、組換え宿主細胞または天然源から部分的または実質的に精製されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドは「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」であると意図される。例えば、化合物の組換え産生形態は、Ｓｍｉｔｈら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１４０に記載されている１工程法により実質的に精製されうる。単離（された）および精製（された）なる語は互換的に用いられることがある。
したがって、「単離（された）」は、天然に存在するゲノムにおいて、関心のある核酸をコードする遺伝子に直に隣接している遺伝子のコード配列を該核酸が含有しないことを意味する。単離されたＤＮＡは一本鎖または二本鎖であることが可能であり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡまたは合成ＤＮＡでありうる。それは天然ＤＮＡ配列と同一であることが可能であり、あるいは１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換によりそのような配列とは異なっていることが可能である。
生体細胞または宿主から得られた調製物に関して用いられる「単離（された）」または「精製（された）」は、関心のあるＤＮＡまたはタンパク質の粗抽出物を含む、示されているＤＮＡまたはタンパク質を含有する任意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合、精製された調製物は、個々の技術または一連の調製用もしくは生化学的技術に従い得られることが可能であり、関心のあるＤＮＡまたはタンパク質はこれらの調製物において種々の純度で存在しうる。タンパク質の場合には特に、該方法には、例えば、硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過、イオン交換変化クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、エレクトロフォーカシング（等電点電気泳動）、クロマトフォーカシングおよび電気泳動が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「実質的に純粋な」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の調製物は、そのようなＤＮＡまたはタンパク質に天然で通常付随している天然に存在する物質を含有しない調製物を意味すると理解されるべきである。「実質的に純粋な」は、少なくとも９５％の関心のあるＤＮＡまたはタンパク質を含有する「高度に」精製された調製物を意味すると理解されるべきである。
関心のあるＤＮＡまたはタンパク質を含有する細胞抽出物は、関心のあるＤＮＡを含有する又は該タンパク質を発現する細胞から得られた均一調製物または細胞非含有調製物を意味すると理解されるべきである。「細胞抽出物」なる語は、培地、特に、該細胞が取り出された使用済み培地を含むと意図される。
本明細書中で用いる、遺伝子のプロモーター領域は、構造遺伝子の５’側に典型的に位置する調節要素を含み、介在ヌクレオチド配列により隔てられた複数の調節要素が存在しうる。遺伝子を活性化させるためには、転写因子として公知のタンパク質を該遺伝子のプロモーター領域に付着させる。この合体状態は、第２の遺伝的セグメントをＤＮＡからＲＮＡへと酵素が転写することを可能にすることにより、「スイッチの入った状態（オン・スイッチ）」に似たものとなる。ほとんどの場合、生じたＲＮＡ分子は特定のタンパク質の合成のための鋳型として働き、時には、ＲＮＡ自体が最終産物である。プロモーター領域は通常の細胞プロモーターまたは例えば腫瘍プロモーターでありうる。腫瘍プロモーターは一般にウイルス由来プロモーターである。ジンクフィンガー結合性ポリペプチドが標的化されうるウイルスプロモーターには、レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）、およびレンチウイルスプロモーター、例えば、ヒトＴ細胞リンホトリピックウイルス（ＨＴＬＶ）１および２ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２からのプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書中で用いる「トランケート化」または類似用語は、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはセリンリコンビナーゼのような天然タンパク質の不完全なアミノ酸配列を含有するポリペプチド誘導体を意味する。
本明細書中で用いるポリペプチド「変異体」または「誘導体」は、所望の活性、例えば、リガンドもしくは核酸分子に結合する又は転写をモジュレーションする能力を尚も保有する、ポリペプチドの突然変異誘発形態であるポリペプチドまたは組換えにより産生されたポリペプチドを意味する。
組成物、担体、希釈物および試薬に関して本明細書中で用いる「医薬上許容される」、「生理的に許容される」なる語およびそれらの文法的派生語は互換的に用いられ、該組成物の投与を禁止するほどの悪心、眩暈、胃の不調などのような望ましくない生理的作用をもたらすことなくヒトに又はヒトの表面上に該物質が投与可能であることを表す。
本明細書中で用いる「ベクター」なる語は、それが機能的に連結されている別の核酸を、異なる遺伝的環境間で輸送しうる核酸分子を意味する。好ましいベクターとしては、それが機能的に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の自律的な複製および発現が可能なベクターが挙げられる。したがって、ベクターは、好ましくは、既に記載されているレプリコンおよび選択マーカーを含有する。ベクターには、発現ベクターが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
ＤＮＡ断片を含む核酸分子に関して用いる「機能的に連結（されている）」なる語は、機能的に連結されている部分が意図されたとおりに機能するように、配列またはセグメントが、好ましくは通常のホスホジエステル結合により、一本鎖または二本鎖形態の１本のＤＮＡ鎖内に共有結合されていることを意味する。ここで提供される転写単位またはカセットが機能的に連結されるベクターの選択は、当技術分野でよく知られているとおり、望まれる機能特性、例えば、ベクター複製およびタンパク質発現、ならびに形質転換される宿主細胞に直接左右され、これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する技術分野に固有の制約である。
本明細書中で用いる、治療用組成物の投与はいずれかの手段により行われることが可能であり、経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入技術、腹腔内投与および非経口投与（これらに限定されるものではない）を含む。
細胞を形質転換する方法は当技術分野でよく知られている。「形質転換」は、外来ＤＮＡの取り込みにより生じる、細胞における遺伝可能な改変を意味する。適当な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の型、および形質転換が生じる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ）に左右される。これらの方法の一般的考察はＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５に見出されうる。
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」なる語は互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体の任意長のヌクレオチドの重合形態を意味する。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することが可能であり、公知または未知の任意の機能を行いうる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが含まれる。
「発現カセット」は、関心のある遺伝子／コード配列の発現を導きうる任意の核酸構築物を含む。そのようなカセットは、発現カセットを標的細胞内に導入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」または「遺伝子導入ベクター」へと構築されうる。したがって、該用語はクローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターを含む。
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術も当技術分野において公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の厳密なヌクレオチドとヌクレオチドとの又はアミノ酸とアミノ酸との一致を意味する。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）が、それらの「同一性（％）」を決定することにより比較されうる。２つの配列の同一性（％）は、核酸配列の場合でもアミノ酸配列の場合でも、２つの整列配列の間の厳密なマッチの数を、短いほうの配列の長さで割り算し、１００を掛けたものである。核酸配列のおおよそのアライメントはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）により開発されＧｒｉｂｓｋｏｖ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６））により標準化されたスコアリングマトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用されうる。配列の同一性（％）を決定するためのこのアルゴリズムの典型的な実行は「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によりもたらされる。この方法のためのデフォルトパラメータはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明の場合の同一性（％）を確定するための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有しＪｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発されＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）により頒布されたプログラムのＭＰＳＲＣＥパッケージを使用することである。このパッケージの一式から、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムが使用可能であり、ここで、スコアリング表に関するデフォルトパラメータ（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよび６のギャップ）が使用される。得られたデータから、「マッチ（Ｍａｔｃｈ）」値が「配列同一性」を表す。配列間の同一性または類似性を計算するための他の適当なプログラムは当技術分野で一般に公知であり、例えば、もう１つのアライメントプログラムとして、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴが挙げられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用されうる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝無し；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
あるいは、相同領域間で安定二本鎖を形成する条件下のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ならびにそれに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化断片のサイズ決定により、相同性が決定されうる。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列が互いに「実質的に相同」であるのは、それらの配列が、前記方法を用いて決定された場合に、該分子の一定の長さにわたって少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合である。本明細書中で用いる実質的に相同はまた、特定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列に関するものである。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その個々の系に関して定められるストリンジェントな条件下、サザンハイブリダイゼーション実験において特定されうる。適当なハイブリダイゼーション条件の決定は当技術分野の技量の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，前掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前掲を参照されたい。
したがって、本発明は、同等の生物活性を保有するポリペプチドをコードし実質的に相同である、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する。
２つの核酸断片は、本明細書に記載されているとおりに「選択的にハイブリダイズする」とみなされる。２つの核酸分子の間の配列同一性の度合はそのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全同一配列が標的分子にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に抑制するであろう。完全同一配列のハイブリダイゼーションの抑制は、当技術分野でよく知られているハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を用いて評価されうる。そのようなアッセイは、種々の度合の選択性を用いて、例えば、低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーへと変化する条件を用いて行われうる。低いストリンジェンシーの条件を用いる場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性の部分的な度合さえも欠く第２プローブ（例えば、標的分子に対して約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価されることが可能であり、この場合、非特異的結合事象の非存在下では、第２プローブは標的にハイブリダイズしない。
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を用いる場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブを選択し、ついで、適当な条件の選択により、該プローブおよび該標的配列が互いに「選択的にハイブリダイズ」または結合してハイブリッド分子を形成する。「中等度にストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズしうる核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列に対して約９０〜９５％以上の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび標的が特定の度合の配列同一性を有する場合のプローブ／標的ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知のとおりに決定されうる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関しては、例えば、以下の要因を変動させることにより、個々のストリンジェンシーを確立するために多数の同等の条件が用いられうることが当技術分野でよく知られている：プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータ、ならびに種々の洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の個々の組合せの選択は、当技術分野における標準的な方法に従い選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
第１ポリヌクレオチドが第２ポリヌクレオチド「から誘導された（に由来する）」と言えるのは、それが、第２ポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同じ又は実質的に同じ塩基対配列を有する場合、あるいはそれが前記の配列同一性を示す場合である。
第１ポリペプチドが第２ポリペプチド「から誘導された（に由来する）」と言えるのは、それが、（ｉ）第２ポリヌクレオチドから誘導された（に由来する）第１ポリヌクレオチドによりコードされている、あるいは（ｉｉ）前記のとおりの第２ポリペプチドに対する配列同一性を示す場合である。
部位特異的リコンビナーゼはゲノム操作のための強力な手段である。セリンリコンビナーゼのレゾルバーゼ／インベルターゼファミリーの超活性化変異体はアクセサリーファクターの非存在下で機能し、したがって、天然ＤＮＡ結合ドメインを操作ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）で置換することにより、関心のある配列に再標的化されうる。
本明細書に記載されているジンクフィンガーリコンビナーゼは、カスタム設計ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびレゾルバーゼ／インベルターゼファミリーのセリンリコンビナーゼに由来する活性化触媒ドメインから構成されるキメラ酵素である。操作された触媒ドメインから構築されたＺＦＲは、使用者により定められたＤＮＡ標的を、高い特異性で効率的に組換え、設計されたＺＦＲはＤＮＡをヒト細胞内の標的化内因性遺伝子座内に組込む。
１つの態様においては、本発明は、対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）タンパク質の製造方法を提供する。該方法は、野生型Ｇｉｎ触媒ドメインに関するＧｉｎ Ｉｌｅ１２０、Ｔｈｒ１２３、Ｌｅｕ１２７、Ｉｌｅ１３６およびＧｌｙ１３７またはそれらの組合せと同等な位置においてリコンビナーゼ触媒ドメイン上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関して２および３位において該ＤＮＡを突然変異させ、該リコンビナーゼ触媒ドメインを複数のジンクフィンガー結合ドメインと融合させてＺＦＲを形成させ、対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有するＺＦＲを富化させることを含む。幾つかの実施形態においては、ＺＦＲは、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＴＴおよびＡＣから選択されるＤＮＡ標的に対する触媒活性の増強を示す。１つの実施形態においては、該リコンビナーゼ触媒ドメインはＩｌｅ１３６および／またはＧｌｙ１３７において突然変異誘発される。
本明細書中で用いる野生型Ｇｉｎ触媒ドメインは、以下のとおりに配列番号５６として記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドの全部または一部を含むＧｉｎ触媒ドメインを意味する。
種々の実施形態においては、本発明のキメラポリペプチドはＧｉｎ触媒ドメイン（例えば、本発明の方法により製造されるもの）を含む。個々のＧｉｎ触媒ドメインには、表１に記載されているものが含まれる。
種々の実施形態においては、本発明の方法により製造されるＺＦＲには、複数のジンクフィンガー結合ドメインに機能的に連結されたＧｉｎ触媒ドメインが含まれる。本発明により製造される典型的なＺＦＲには、表２に記載されているものが含まれる。
実施例は、Ｇｉｎ触媒ドメインを有するＺＦＲの製造を例示しているが、該方法は多数の他のリコンビナーゼの触媒ドメインに適用されうる。そのようなリコンビナーゼは以下のものを含む：ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；ＭｕＧｉｎ；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；またはｂ）ａ）の突然変異タンパク質。
個々のドメインに対する不完全なモジュール性、全ＤＮＡトリプレットに対する高アフィニティ結合性の欠如および構築の困難さが、専門化されていない研究室におけるＺＦＰの広範な採用を妨げている。キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からの転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質における新規タイプのＤＮＡ結合ドメインの発見がＺＦＰの代替手段をもたらす。キメラＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）、すなわち、ＤＮＡインベルターゼＧｉｎからの超活性化触媒ドメインと最適化ＴＡＬＥ構造との操作融合体が本明細書に記載されている。細菌細胞においてジンクフィンガーリコンビナーゼに匹敵する効率および特異性でＤＮＡを修飾するＴＡＬＥＲ融合体を特定するために、漸増トランケート化ＴＡＬＥ変異体のライブラリーを特定した。実施例にも示されているとおり、ＴＡＬＥＲは哺乳類細胞においてＤＮＡを組換える。本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造体は特別仕様（カスタム）ＴＡＬＥドメインの挿入のためのプラットフォームとなり、したがって、操作リコンビナーゼの標的化能ならびにバイオテクノロジーおよび医学におけるそれらの潜在的用途を有意に拡大する。
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、実質的に全てのＤＮＡ配列に結合するように設計されうる。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの設計のための一般的指針は、ＴＡＬＥにより結合されるＤＮＡ配列の最も５’側の塩基（Ｎ０塩基）がチミンであるべきだと提示している。本発明者らは、この位置に各ＤＮＡ塩基を含有するＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、ＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥ−Ｒ）およびＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の活性の分析により、該Ｎ０要件を定量した。５’Ｔの非存在下では、５’Ｔを含有する標的配列と比較して、ＴＡＬＥ−ＴＦ活性においては＞１０００倍までの、ＴＡＬＥ−Ｒ活性においては１００倍までの、そしてＴＡＬＥＮ活性においては１０倍までのＴＡＬＥ活性の低下が観察された。全ての可能なＮ０塩基を認識するＴＡＬＥ構造体を開発するために、ＴＡＬＥ−Ｒ活性選択と組合された構造誘導ライブラリー設計を用いて、任意のＮ０塩基を含有する新規ＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインを得た。Ｇ選択的ドメインおよび広範反応性ドメインを単離し、特徴づけした。ＴＡＬＥ−Ｒ形態において選択された操作されたＴＡＬＥドメインはモジュラー性を示し、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＴＡＬＥＮ構造において活性であった。得られたＮ末端ドメインは、ＴＡＬＥ結合性タンパク質およびデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）酵素としての任意のＤＮＡ配列の、有効かつ制約の無い、ＴＡＬＥに基づく標的化をもたらす。
１つの態様においては、本発明は、所望のヌクレオチドに特異的に結合する転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質結合ドメインの製造方法を提供する。実施例に示されているとおり、該方法は、ａ）可変性二残基（ＲＶＤ）内の又はＲＶＤの１〜２アミノ酸残基Ｎ末端側もしくはＣ末端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインのアミノ酸配列をランダム化し、ｂ）所望のヌクレオチドに特異的に結合する、（ａ）のランダム化ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインを選択することを含む。
配列特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼおよび転写因子を本発明において提供する。該配列特異的ポリペプチドは特別仕様（カスタム）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、もう１つの態様においては、本発明はキメラポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、ａ）リコンビナーゼ、転写因子またはヌクレアーゼ、およびｂ）転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む。
ＴＡＬＥは植物病原性細菌のタンパク質であり、該病原体により植物細胞内に注入され、該植物細胞において、それは核に移行し、転写因子として機能して特異的植物遺伝子のスイッチを入れる。ＴＡＬＥの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を決定する。したがって、ＴＡＬＥの標的部位は予測可能であり、本明細書に記載されているとおり、特定のヌクレオチド配列への結合を目的としてＴＡＬＥは操作され、製造されうる。
ＴＡＬＥコード化核酸配列に融合するのは、ヌクレアーゼ、転写因子もしくはリコンビナーゼまたはそれらの一部をコードする配列である。本発明において使用されうる多数のそのようなタンパク質が当技術分野で公知である。
種々の実施形態において、該キメラポリペプチドはリコンビナーゼの触媒ドメインを含む。前記のとおり、多数のリコンビナーゼの触媒ドメインが使用されうる。そのようなリコンビナーゼには以下のものが含まれる：ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；またはｂ）ａ）の突然変異タンパク質。好ましい実施形態においては、高活性Ｇｉｎ触媒ドメインが使用される。そのようなドメインは、本明細書に記載されているとおり、本発明の方法を用いて作製されうる。
本明細書に記載されているとおり、ＴＡＬＥは、それがＤＮＡと相互作用する特異性を決定する幾つかの不完全反復を含みうる。各反復は、該反復の残基１２および１３における個々の二アミノ酸配列に応じて、単一塩基に結合する。したがって、ＴＡＬＥ内の該反復を操作することにより、特定のＤＮＡ部位が標的化されうる。そのような操作されたＴＡＬＥは、例えば、特定のＤＮＡ配列に標的化される転写因子として使用されうる。
実施例に例示されているとおり、本発明のキメラタンパク質は、表３に記載されている変異体およびその一部（例えば、ＲＶＤおよびＮＴＤ）により例示される。
種々の実施形態においては、キメラタンパク質は、Ｃ末端またはＮ末端トランケーション（トランケート化）を有するＴＡＬＥタンパク質を含む。例えば、該ＴＡＬＥタンパク質は配列番号２の全部または一部を含みうる。幾つかの実施形態においては、該ＴＡＬＥタンパク質は配列番号２のアミノ酸残基２７と２６８との間、９２と１３４との間、１２０と１２９との間、７４と１４７との間または８７と１２０との間、例えば、アミノ酸残基２８、７４、８７、９２、９５、１２０、１２４、１２８、１２９、１４７および１５０においてトランケート化されている。
もう１つの実施形態においては、本発明は、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該ＴＡＬＥタンパク質は、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、ＷはＲである、ＷはＧである、Ｗは欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号３（ＶＧＫＱＷＳＧＡＲＡＬ）に記載されているアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する。
幾つかの実施形態においては、ＮＴＤは、ＶＧＫＹＲＧＡＲＡＬ（配列番号４）、ＶＧＫＳＲＳＧＡＲＡＬ（配列番号５）、ＶＧＫＹＨＧＡＲＡＬ（配列番号６）およびＶＧＫＲＧＡＧＡＲＡＬ（配列番号７）から選択されるアミノ酸配列を含む。
もう１つの実施形態においては、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該ＴＡＬＥタンパク質は、Ｒ１はＫである、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、Ｒ２はＷである、Ｒ２はＧである、Ｒ２は欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号８（ＩＶＤＩＡＲ１ＱＲ２ＳＧＤＬＡ）に記載されているアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する。
幾つかの実施形態においては、ＮＴＤは、ＩＶＤＩＡＲＱＷＳＧＤＬＡ（配列番号９）、ＩＶＤＩＡＲＹＲＧＤＬＡ（配列番号１０）、ＩＶＤＩＡＲＳＲＳＧＤＬＡ（配列番号１１）、ＩＶＤＩＡＲＹＨＧＤＬＡ（配列番号１２）およびＩＶＤＩＡＲＲＧＡＧＤＬＡ（配列番号１３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
もう１つの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は、以下のとおりに記載されるアミノ酸配列を有する修飾されたＮ０ドメインを含む：ＬＴＰＤＱＬＶＫＩＡＫＲＧＧＴＡＭＥＡＶＨＡＳＲＮＡＬＴＧＡＰＬＮ（配列番号１０２）。種々の実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は突然変異体を含み、ここで、配列番号１０２のＫＲＧＧ（配列番号１０３）は、ＬＤＹＥ（配列番号１０４）、ＩＮＬＶ（配列番号１０５）、ＹＳＫＫ（配列番号１０６）、ＮＭＡＨ（配列番号１０７）、ＳＰＴＮ（配列番号１０８）、ＳＮＴＲ（配列番号１０９）、ＬＴＴＴ（配列番号１１０）、ＶＡＤＬ（配列番号１１１）、ＭＶＬＳ（配列番号１１２）、ＹＮＧＲ（配列番号１１３）、ＲＩＰＲ（配列番号１１４）、ＹＳＫＩ（配列番号１１５）、ＬＴＱＹ（配列番号１１６）、ＹＬＳＫ（配列番号１１７）、ＬＲＰＮ（配列番号１１８）、ＬＦＴＮ（配列番号１１９）、ＬＬＴＮ（配列番号１２０）、ＥＥＤＫ（配列番号１２１）、ＶＴＡＭ（配列番号１２２）、ＣＰＳＲ（配列番号１２３）、ＬＴＲＶ（配列番号１２４）、ＫＧＤＬ（配列番号１２５）、ＱＫＡＬ（配列番号１２６）、ＬＹＬＬ（配列番号１２７）、ＷＩＳＶ（配列番号１２８）、ＧＤＱＶ（配列番号１２９）およびＣＰＳＲ（配列番号１３０）から選択される。
もう１つの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は、以下のとおりに記載されるアミノ酸配列を有する修飾されたＮ−１ドメインを含む：ＭＲＳＰＫＫＫＲＫＶＱＶＤＬＲＴＬＧＹＳＱＱＱＱＥＫＩＫＰＫＶＲＳＴＶＡＱＨＨＥＡＬＶＧＨＧＦＴＨＡＨＩＶＡＬＳＱＨＰＡＡＬＧＴＶＡＶＴＹＱＨＩＩＴＡＬＰＥＡＴＨＥＤＩＶＧＶＧＸＸＸＸＸＡＲＡＬＥＡＬＬＴＤＡＧＥＬＲＧＰＰＬＱＬＤＴＧＱＬＶＫＩＡＫＲＧＧＶＴＡＭＥＡＶＨＡＳＲＮＡＬＴＧＡＰ（配列番号１３１）。種々の実施形態においては、配列番号１３１のＸＸＸＸＸはＫＲＰＡＧ（配列番号１３２）またはＫＲＰＳＧ（配列番号１３３）である。また、該タンパク質は、活性の増強を示すＥ４０Ｇ突然変異（配列番号１３１に関するもの）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は、以下に記載されているアミノ酸配列を有する反復ドメインを含む：ＬＴＰＤＶＶＡＩＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＧＨ（配列番号１３４）。種々の実施形態においては、ＴＡＬＥタンパク質は、配列番号１３４のＳＮＮＧ（配列番号１３５）がＲＧＧＧ（配列番号１３６）、ＲＧＧＲ（配列番号１３７）、ＲＧＶＲ（配列番号１３８）、ＫＧＧＧ（配列番号１３９）、ＳＧＧＧ（配列番号１４０）、ＧＧＲＧ（配列番号１４１）、ＬＧＧＳ（配列番号１４２）、ＭＤＮＩ（配列番号１４３）、ＲＶＭＡ（配列番号１４４）、ＬＡＳＶ（配列番号１４５）、ＶＧＴＧ（配列番号１４６）およびＱＧＧＧ（配列番号１４７）から選択される突然変異体を含む。
および
ドメインを有するＴＡＬＥ ＴＦによる、示されている５’残基を有する基質の相対ルシフェラーゼ活性化（ＮＴ−Ｔおよびそれぞれの５’Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔとの比較において、＊＝ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ＜０．０１，＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
図２１は、種々の５’塩基を有する野生型および進化ＮＴＤを有するＴＡＬＥＮペアの設計および活性の一連の図示およびグラフ表示である。Ａ）Ｈ３２突然変異の誘導のための、標的部位（配列番号４０〜４７）を強調するために拡大されたＣＣＲ５遺伝子（配列番号３８〜３９）。Ｂ）野生型（ＮＴ−Ｔ）ＴＡＬＥＮ、非Ｔ５’残基に関して最適化されたドメインを有するＴＡＬＥＮおよびｄＨａｘ３ ＮＴＤの遺伝子編集効率。Ｃ）５’Ｔ特異性を有するＴＡＬＥＮに対する、最適化ＮＴＤを有するＴＡＬＥＮペアの増強倍数。各ＴＡＬＥＮペア基質に対する各ＮＴＤの活性が示されている。
図２２は、ＮおよびＣ末端ドメイン（配列番号４８〜５３）のアライメントを示す図示である。
図２３は、ＴＡＬＥ−リコンビナーゼ選択法を例示する図示である。Ｎｏｔ１／Ｓｔｕ１制限酵素および相補的連結を用いて、ＮＴＤのライブラリーをＡｖｒ１５ ＴＡＬＥ−Ｒ内にクローニングした。活性ＴＡＬＥ−Ｒは、抗生物質（カルベネシリン）で選択され増幅されうる、より頻繁な組換え事象を引き起こす。得られたプラスミドは、消化されたＮｏｔ１／Ｘｂａ１であり、更なる選択および増幅のためにＴＡＬＥ−Ｒバックボーンベクター内に連結された。
図２４は、ライブラリー選択体（ライブラリーＸＸＸＳＧＡＲ（配列番号３９）およびライブラリーＫＸＸＧＡＲ（配列番号２９１））から見出された変異体集団の概要の図示である。
図２５は、ＮＴ−Ｇ（配列番号５４）と、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ＴＡＬＥドメインであるＮＴＤ−Ｂｒｇ１１（配列番号５５）とのアライメントを示す図示である。アライメントは、Ｂｒｇ１１が５’Ｇ塩基に対する特異性を示しうることを示している。
図２６は、ＥＬＩＳＡによりアッセイされた場合の、５’Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ Ａｖｒ１５ヘアピンオリゴヌクレオチドを標的化するＭＢＰ−ＴＡＬＥタンパク質の相対結合アフィニティの一連のグラフ表示である。タンパク質濃度は〜７５ｎＭであった。プレートを１２０分間現像した。
図２７は、ＴＡＬＥＮ編集後のＰＣＲ増幅ＣＣＲ５の細胞アッセイの一連の図示およびグラフ表示であり、％インデルおよびインデル集団が右側に示されている。
図２８は、図２７からの選択されたＴＡＬＥＮ実験のアライメントインデル配列決定を示す図示である（上から下へ配列番号２９２〜３３２）。
図２９は、５’残基においてのみ異なる同一５ｘＡｖｒＸａ７プロモーターをそれぞれが標的化する２つの別々のゴールディ（Ｇｏｌｄｙ）ＴＡＬＥ−転写因子構造の活性の比較のグラフ表示である。
図３０は、ＤＮＡに結合したジンクフィンガーリコンビナーゼ二量体の構造に関する一連の図示である。Ａ）各ジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）単量体（青色またはオレンジ色）は、特別設計されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに連結された活性化セリンリコンビナーゼ触媒ドメインからなる。γδレゾルバーゼおよびＡａｒｔジンクフィンガータンパク質の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：それぞれ１ＧＤＴおよび２Ｉ１３）からモデルを作製した。Ｂ）ＤＮＡ（配列番号３３３〜３３４）に結合したＺＦＲ二量体の図。ＺＦＲ標的部位は、ＺＦＲ触媒ドメインにより認識される中央の２０ｂｐのコア配列に隣接する２つの逆転ジンクフィンガー結合部位（ＺＦＢＳ）からなる。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、「左」または「右」半分の部位（それぞれ青色およびオレンジ色の箱）を認識するように設計されうる。略語は以下のとおりである：ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧを示し、ＲはＧまたはＡを示し、ＹはＣまたはＴを示す。
図３１はＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインの特異性の一連のグラフ表示および図示である。Ａ〜Ｄ）（Ａ，配列番号３３５）それぞれの可能な二塩基の組合せをジヌクレオチドコアに、（Ｂ，配列番号３３６）それぞれの可能な二塩基の組合せを３および２位に、（Ｃ，配列番号３３７）それぞれの可能な一塩基置換を６、５および４位に、そして（Ｄ，配列番号３３８）それぞれの可能な一塩基置換を１０、９、８および７位に含有するＤＮＡ標的上で組換えを測定した。置換塩基は各パネルの上に枠内に示されている。組換えを分割遺伝子再構築により評価し、クロラムフェニコール耐性形質転換体に対するカルベニシリン耐性形質転換体の比として測定した（「材料および方法」）。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。（Ｅ）（左）ジヌクレオチドコア、（中）６、５および４位、ならびに（右）１０、９、８および７位におけるＤＮＡとγδレゾルバーゼ二量体との相互作用（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＤＴ）。相互作用性残基は紫色の棒として示されている。塩基は以下のとおりに着色されている：Ａ，黄色；Ｔ，青色；Ｃ，褐色；およびＧ，桃色。
図３２はＧｉｎリコンビナーゼ触媒特異性の再操作の一連のグラフ表示および図示である。Ａ）Ｇｉｎ触媒ドメインにより認識されるカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）２０ｂｐコア。３および２位が枠内に示されている（配列番号３３９）。Ｂ）（上）ＤＮＡと複合体形成したγδレゾルバーゼの構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＤＴ）。突然変異誘発のために選択されたアーム領域残基が紫色の棒として示されている。（下）γδレゾルバーゼ（配列番号３４１）およびＧｉｎリコンビナーゼ（配列番号３４２）触媒ドメインの配列アライメント。保存残基が陰影付きのオレンジ色で示されている。黒色矢印は、突然変異誘発のために選択されたアーム領域位置を示す。Ｃ）分割遺伝子再構成選択系の図示。活性ＺＦＲ変異体の発現はβラクタマーゼリーディングフレームの回復およびアンピシリンに対する宿主細胞耐性を招く。実線はＺＦＲ標的部位の位置および同一性を示す。３および２位が下線で示されている（配列番号３４０）。Ｄ）３および２位にＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＴＴおよびＡＣ塩基の組合せを含有するコア部位を組換えるＧｉｎ突然変異体の選択。星印は、インキュベーション時間が１６時間から６時間へと短縮された選択工程を示す（「材料および方法」、実施例５）。Ｅ）３および２位におけるそれぞれの可能な二塩基の組合せに関する、選択された触媒ドメイン（β、γ、δ、εおよびζ、αにより示されている野生型Ｇｉｎ）の組換え特異性。意図されるＤＮＡ標的が下線で示されている。組換えは分割遺伝子再構築により決定され、３回重複して行われた。
図３３は、哺乳類細胞における使用者により定められた配列を組換えるＺＦＲの能力を例示する一連のグラフ表示および図示である。Ａ）哺乳類細胞におけるＺＦＲ活性を評価するために使用されたルシフェラーゼレポーター系の図示。ＺＦＲ標的部位は、ルシフェラーゼ発現を駆動するＳＶ４０プロモーターに隣接している。実線は、潜在的ＺＦＲ標的部位を特定するために使用された４４ｂｐのコンセンサス標的配列を示す。下線付きの塩基はジンクフィンガー標的ならびに３および２位（配列番号３４３）を示す。Ｂ）示されているＺＦＲペアおよびそれらのコグネイトレポータープラスミドでコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現の低減倍数。低減倍数を空ベクターおよびレポータープラスミドでのトランスフェクションに対して標準化した。各ＺＦＲ標的部位（配列番号３４４〜３６２：上から下）の配列同一性および染色体位置、ならびに各ＺＦＲペアの触媒ドメイン組成が示されている。下線付きの塩基は３および２位を示す。３つの独立した実験から標準誤差を計算した。ＺＦＲのアミノ酸配列が表２に示されている。Ｃ）ＺＦＲペアの特異性。各非コグネイトレポータープラスミドに関するＧｉｎＣ４およびＺＦＲペア１〜９に関するルシフェラーゼの発現の低減倍数を測定した。対応コグネイトレポータープラスミドを含有する各ＺＦＲペアの低減倍数に対して組換えを標準化した。アッセイを３回重複して行った。
図３４は、ヒトゲノム内への組込みを標的化するＺＦＲの能力を例示する一連のグラフ表示および図示である。Ａ）ドナープラスミド（上）ならびにＺＦＲ１（配列番号３６３）、２（配列番号３６４）および３（配列番号３６５）により標的化されるゲノム遺伝子座の図示。白色の箱は隣接エキソンを示す。矢印は転写方向を示す。各ＺＦＲ標的の配列および位置が示されている。下線付きの塩基はジンクフィンガー標的ならびに３および２位を示す。Ｂ）ＺＦＲ媒介性組込みの効率。ドナープラスミドのみでトランスフェクトされた細胞からのデータに対してデータを標準化した。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。Ｃ）ＺＦＲ媒介性組込みのＰＣＲ分析。ＰＣＲプライマーの組合せは、（中）フォワード配向または（下）リバース配向の組込みプラスミドまたは（上）未修飾遺伝子座を増幅した。Ｄ）ＺＦＲ１（配列番号３６６）および３（配列番号３６７）に関するＰＣＲ増幅組込みドナーの代表的クロマトグラム。矢印は配列決定プライマー配向を示す。陰影付きの箱はゲノム標的配列を示す。
図３５は、二量体境界の外に位置するリコンビナーゼＤＮＡ結合性残基の図示である。標的ＤＮＡと複合体形成したγδレゾルバーゼ。触媒ドメイン二量体はシアンブルー色に着色されている。ＤＮＡは灰色に着色されている。アーム領域残基は赤色の棒として示されている。二量体境界の残基は紫色の棒として示されている（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＤＴ）。
図３６は、選択されたリコンビナーゼの配列分析の図示である。各標的化アーム位置におけるアミノ酸置換の百分率を示す円グラフ。第４ラウンドの選択の後、２０個を超えるクローンが各ライブラリーから配列決定された。ＴＴを組換えるクローンの配列分析は別の箇所に記載されている（１）。
図３７は、単離された触媒ドメインのコア特異性を示す表である。４ラウンドの選択の後、３および２位に置換を有するコア配列を選択された触媒ドメインが組換える能力を評価した。帰属されたＤＮＡ標的が下線で示されている。リコンビナーゼ突然変異が示されている。星印は、更なる分析のために選択された触媒ドメインを示す。３および２位の野生型塩基の組合せはＣＣである。組換えは分割遺伝子再構築（２）により決定され、３回重複して行われた。ＴＴ置換を組換える触媒ドメインは別の箇所に記載されている（１）。
図３８は、選択された触媒ドメインの位置特異性の一連のグラフ表示である。α、β、γ、δおよびζ触媒ドメインならびに対称置換標的部位の間の組換えアッセイ。（Ａ（配列番号３６８））６、５および４位における４，０００個を超えるランダム強力塩基（Ｓ：ＧまたはＣ）置換ならびに（Ｂ（配列番号３６９））１０、９、８および７位における１０６個（可能な４．２９×１０９個のうち）を超えるユニーク塩基組合せ（Ｎ：Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）を含有するライブラリーＤＮＡ標的上で組換えを測定した。分割遺伝子再構築（２）（ｎ＝３）により組換えを測定した。
図３９はＺＦＲホモ二量体活性の一連のグラフ表示である。２．５ｎｇの対応ｐＧＬ３ＺＦＲレポータープラスミドを伴う１５０ｎｇのＺＦＲ−Ｒまたは１５０ｎｇのＺＦＲ−ＬでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。２．５ｎｇのｐＧＬ３ ＺＦＲレポータープラスミドを伴う１５０ｎｇのＺＦＲ−Ｒおよび１５０ｎｇのＺＦＲ−Ｌでのコトランスフェクションに対して組換えを標準化した。
図４０は、ＺＦＲ修飾細胞のクローン分析を示す一連の図示である。ＰＣＲプライマーの組合せはフォワードまたはリバース配向の組込みプラスミドまたは未修飾ゲノム標的を増幅した。
以下の実施例は、本発明の利点および特徴を更に例示するために記載されており、本発明の範囲を限定するものではない。それらは、用いられうるものの典型例であるが、それらの代わりに、当業者に公知の他の手順、方法または技術が用いられうる。
実施例１
キメラＴＡＬＥリコンビナーゼ
実験の概要
この研究はＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）の最初の例を示す。漸増トランケート化ＴＡＬＥドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてＤＮＡを組換えるために使用されうる最適化ＴＡＬＥＲ構造を特定した。任意の特製ＴＡＬＥ反復アレイが、本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造内に挿入可能であり、したがって、バイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を劇的に拡大する。
キメラＴＡＬＥリコンビナーゼ
実験の概要
この研究はＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥＲ）の最初の例を示す。漸増トランケート化ＴＡＬＥドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてＤＮＡを組換えるために使用されうる最適化ＴＡＬＥＲ構造を特定した。任意の特製ＴＡＬＥ反復アレイが、本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造内に挿入可能であり、したがって、バイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を劇的に拡大する。
以下の材料および方法をこの実施例において使用した。
試薬
全ての酵素は、特に示されていない限り、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入した。プライマー配列を表４に示す。
全ての酵素は、特に示されていない限り、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入した。プライマー配列を表４に示す。
プラスミド構築
Ｇｉｎコード配列の５’側または３’側のいずれかにＢａｍＨＩ制限部位を導入するために、それぞれプライマー５’Ｇｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍおよび３’Ｇｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍまたは５’Ｇｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍおよび３’Ｇｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍでＧｉｎ触媒ドメインをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限部位内に連結して、ｐＢ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍを得た。Ｃ末端およびＮ末端ＴＡＬＥＲ融合体を作製するために、ＡｖｒＸａ７遺伝子（Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢ．Ｙａｎｇ博士から快く提供していただいたもの）をＢａｍＨＩでｐＷＡｖｒＸａ７から遊離させ、ｐＢ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ（４１）のＢａｍＨＩ部位内に連結して、それぞれｐＢ−Ａｖｒ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−Ａｖｒを確立させた。各ＴＡＬＥＲの正しい構築を配列分析により実証した（図６〜１６）。
Ｇｉｎコード配列の５’側または３’側のいずれかにＢａｍＨＩ制限部位を導入するために、それぞれプライマー５’Ｇｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍおよび３’Ｇｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍまたは５’Ｇｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍおよび３’Ｇｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍでＧｉｎ触媒ドメインをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）のＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限部位内に連結して、ｐＢ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍを得た。Ｃ末端およびＮ末端ＴＡＬＥＲ融合体を作製するために、ＡｖｒＸａ７遺伝子（Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＢ．Ｙａｎｇ博士から快く提供していただいたもの）をＢａｍＨＩでｐＷＡｖｒＸａ７から遊離させ、ｐＢ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ（４１）のＢａｍＨＩ部位内に連結して、それぞれｐＢ−Ａｖｒ−Ｂａｍ−ＧｉｎおよびｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−Ａｖｒを確立させた。各ＴＡＬＥＲの正しい構築を配列分析により実証した（図６〜１６）。
ＡｖｒＸａ７のＮ末端トランケート化体を作製するために、５’Ａｖｒ−ｎ−（１−１０）および３’ Ａｖｒ＋２８または３’Ａｖｒ＋９５プライマーと共にＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を以下のプログラムで使用して、ＡｖｒＸａ７をＰＣＲ増幅させた：９４℃で３分間の１サイクル、９４℃で１分間、５２℃で１分間、６８℃で６分間の１６サイクル、および６８℃で１時間の最終サイクル。Ｇｉｎ触媒ドメインを、５’Ｇｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍおよび３’ＧｉｎＮＴａｌＰＣＲＦｕｓで、標準的なＰＣＲ条件下でＰＣＲ増幅させ、前記ＰＣＲ条件を用いる重複ＰＣＲによりトランケート化ＡｖｒＸａ７変異体に融合させた。精製されたＧｉｎ−Ａｖｒ ＰＣＲ産物を等モル比で混合し、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化した。
デザイナーＴＡＬＥを作製するために、ＴＡＬＥＮキット（Ａｄｄｇｅｎｅ）を、以下の修飾を加えて使用した。Δ１２０、Δ１２８または＋２８におけるトランケーションを含むようにｐＴＡＬ１を修飾した。これを達成するために、ＡｖｒＸａ７Δ１２０およびＡｖｒＸａ７Δ１２８断片を５’Ａｖｒ ｎ４またはＡｖｒ ｎ１２８および３’ＴａｌＲ Ｘｂａ＋２８でＰＣＲ増幅させ、ｐＴＡＬ１のＢａｍＨＩ制限部位内に連結して、ｐＴＡＬΔ１２０およびｐＴＡＬΔ１２８を得た。プラスミドｐＴＡＬΔ１２０およびｐＴＡＬΔ１２８はＧｏｌｄｅｎ ＧａｔｅクローニングのためのＥｓｐ３Ｉ制限部位を保有していた。ｐＴＡＬΔ１２０およびｐＴＡＬΔ１２８内にクローニングされたＴＡＬＥアレイをｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ内への連結のためにＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。
哺乳類ＴＡＬＥＲ発現ベクターを作製するために、Ｇｉｎ触媒ドメインを５’Ｎｈｅ−ＳＤ−Ｇｉｎ Ｆおよび３’ＧｉｎＧＳ ＲでｐＢ−Ｇｉｎ−ＡｖｒからＰＣＲ増幅させ、ｐｃＤＮＡ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位内に連結した。Ａｖｒ１５をｐＴＡＬΔ１２０またはｐＴＡＬΔ１２８からＢａｍＨ１およびＸｂａ１で消化し、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ内に連結して、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉｎ−Ａｖｒ発現ベクターを得た。
既に記載されているとおりにｐＢＬＡ基質プラスミドを構築した。
ｐＧＬ３レポータープラスミドを作製するために、ＳＶ４０プロモーターを組換え部位含有プライマー５’ｐＧＬ３ ＳＶ４０ ＢｇｌＩＩおよび３’ｐＧＬ３ ＳＶ４０ ＨｉｎｄＩＩＩでｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＰＣＲ増幅させ、ｐＧＬ３−プロモーターのＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位内に連結した。
細菌組換えアッセイ
既に記載されているとおりに細菌組換えアッセイを行った。
既に記載されているとおりに細菌組換えアッセイを行った。
漸増トランケーションライブラリー
既に記載されている修飾されたプロトコールを用いて、漸増（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）トランケーションライブラリーを作製した。簡潔に説明すると、Ｇｉｎコード配列をエキソヌクレアーゼ消化から保護するために、ＳｍａＩ制限部位を含有するスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片をＢａｍＨＩ内に挿入してｐＢ−Ｇｉｎ−ＳｍａＩ−Ｂａｍ−Ａｖｒを得た。このプラスミドをＮｈｅＩで線状化し、エキソヌクレアーゼＩＩＩで３７℃で２．５分間インキュベートし、ついで７５℃で２５分間にわたって熱不活性化を行った。ついでｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−Ａｖｒを、２００μＭ ｄＮＴＰおよび５μＭ ［α］−Ｓ−ｄＮＴＰの存在下、クレノウフラグメント（３’から５’エキソ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、ついで８０℃で２５分間にわたって熱不活性化を行った。トランケーションライブラリーを作製するために、ｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−ＡｖｒをエキソヌクレアーゼＩＩＩと共に３７℃で２．５分間インキュベートし、ついで熱不活性化およびそれに続くリョクトウヌクレアーゼでの平滑末端化を３０℃で１時間行った。ＳｍａＩでの消化の後、リコンビナーゼコード配列の平滑３’末端をＴＡＬＥ断片の平滑末端化ライブラリーに連結した。形質転換および精製後、該プラスミドをＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化してＧｉｎ−ΔＡｖｒを遊離させた。
既に記載されている修飾されたプロトコールを用いて、漸増（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ）トランケーションライブラリーを作製した。簡潔に説明すると、Ｇｉｎコード配列をエキソヌクレアーゼ消化から保護するために、ＳｍａＩ制限部位を含有するスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）断片をＢａｍＨＩ内に挿入してｐＢ−Ｇｉｎ−ＳｍａＩ−Ｂａｍ−Ａｖｒを得た。このプラスミドをＮｈｅＩで線状化し、エキソヌクレアーゼＩＩＩで３７℃で２．５分間インキュベートし、ついで７５℃で２５分間にわたって熱不活性化を行った。ついでｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−Ａｖｒを、２００μＭ ｄＮＴＰおよび５μＭ ［α］−Ｓ−ｄＮＴＰの存在下、クレノウフラグメント（３’から５’エキソ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、ついで８０℃で２５分間にわたって熱不活性化を行った。トランケーションライブラリーを作製するために、ｐＢ−Ｇｉｎ−Ｂａｍ−ＡｖｒをエキソヌクレアーゼＩＩＩと共に３７℃で２．５分間インキュベートし、ついで熱不活性化およびそれに続くリョクトウヌクレアーゼでの平滑末端化を３０℃で１時間行った。ＳｍａＩでの消化の後、リコンビナーゼコード配列の平滑３’末端をＴＡＬＥ断片の平滑末端化ライブラリーに連結した。形質転換および精製後、該プラスミドをＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化してＧｉｎ−ΔＡｖｒを遊離させた。
哺乳類レポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上に４×１０４細胞／ウェルの密度で播き、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させた。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの発現のために、細胞を１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ ＴＡＬＥＲ発現ベクター、２．５ｎｇのｐＧＬ３レポータープラスミドおよび１ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を受動細胞溶解（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞溶解し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を該製造業者の説明に従い使用して、ルシフェラーゼ発現を決定した。ベリタス・マイクロプレート・ルミノメータ（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して発光を測定した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート上に４×１０４細胞／ウェルの密度で播き、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させた。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの発現のために、細胞を１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ ＴＡＬＥＲ発現ベクター、２．５ｎｇのｐＧＬ３レポータープラスミドおよび１ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を受動細胞溶解（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞溶解し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を該製造業者の説明に従い使用して、ルシフェラーゼ発現を決定した。ベリタス・マイクロプレート・ルミノメータ（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して発光を測定した。
結果
ＴＡＬＥＲ構造
リコンビナーゼ活性の評価および定向進化のための定量系は記載されている。この系（図１Ａ）においては、組換え部位に隣接するＧＦＰｕｖ導入遺伝子を、ＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼをコードする遺伝子内に挿入する。この改変はβ−ラクタマーゼ発現を破壊し、このプラスミド（ｐＢＬＡ）を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞をアンピシリンに対して感受性にする。しかし、該基質含有プラスミドの活性リコンビナーゼの発現は標的部位間の組換えおよびβ−ラクタマーゼリーディングフレームの回復を招く。この修飾はアンピシリンに対する宿主細胞耐性を確立し、該基質含有プラスミドからの活性リコンビナーゼ変異体の単離を可能にする。プラスミド精製および再形質転換の後でアンピシリン耐性形質転換体の数を測定することにより、リコンビナーゼ活性を直接評価することも可能である。キメラリコンビナーゼの活性は触媒ドメインおよびＤＢＤの両方に依存的であるため、この分割遺伝子再構築選択系は、個々のＤＢＤの有効性を評価するためにも用いられうる。したがって、該系を、最適ＴＡＬＥＲ構造を決定するために適合化した。
ＴＡＬＥＲ構造
リコンビナーゼ活性の評価および定向進化のための定量系は記載されている。この系（図１Ａ）においては、組換え部位に隣接するＧＦＰｕｖ導入遺伝子を、ＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼをコードする遺伝子内に挿入する。この改変はβ−ラクタマーゼ発現を破壊し、このプラスミド（ｐＢＬＡ）を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞をアンピシリンに対して感受性にする。しかし、該基質含有プラスミドの活性リコンビナーゼの発現は標的部位間の組換えおよびβ−ラクタマーゼリーディングフレームの回復を招く。この修飾はアンピシリンに対する宿主細胞耐性を確立し、該基質含有プラスミドからの活性リコンビナーゼ変異体の単離を可能にする。プラスミド精製および再形質転換の後でアンピシリン耐性形質転換体の数を測定することにより、リコンビナーゼ活性を直接評価することも可能である。キメラリコンビナーゼの活性は触媒ドメインおよびＤＢＤの両方に依存的であるため、この分割遺伝子再構築選択系は、個々のＤＢＤの有効性を評価するためにも用いられうる。したがって、該系を、最適ＴＡＬＥＲ構造を決定するために適合化した。
重要なことに、ＤＮＡインベルターゼＧｉｎおよび関連セリンリコンビナーゼの触媒ドメインは、予め定められた触媒特異性を有するため、ＴＡＬＥＲ融合タンパク質は、ＴＡＬＥＮに関して記載されている設計を用いては構築され得ない。γδレゾルバーゼおよび設計酵素の構造および機能研究は、Ｃ末端Ｅ−ヘリックスがセリンリコンビナーゼＤＮＡ認識を媒介することを示している。ＺＦＲにおいては、このヘリックスはＣ末端からＮ末端（５’から３’）へとＤＮＡに結合する。したがって、ＴＡＬＥはＤＮＡに５’から３’への方向で結合するため、組換えは、ＴＡＬＥ結合部位が２０ｂｐのコアの反対鎖上に位置する場合にのみ生じうると予想された（図１Ｂ）。
ＡｖｒＸａ７を使用してＴＡＬＥＲを作製することを選択した。なぜなら、このＴＡＬＥタンパク質は、ＴＡＬＥヌクレアーゼおよび転写因子を作製するために既に使用されているからである。好都合なことに、ＢａｍＨＩ制限部位は、ＡｖｒＸａ７を含む多数のＴＡＬＥに隣接しており、複数のグループが、合成ＴＡＬＥ融合体を作製するために、この制限部位を用いている。注目すべきことに、このＢａｍＨＩ断片はＴＡＬＥのＮ末端を無傷なまま残すが、天然エフェクタードメインをＣ末端から除去する。この方法を採用し、ＢａｍＨ１制限消化によりＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体を作製した。
２つの隣接する２６ｂｐのＡｖｒＸａ７結合部位、およびＧｉｎ触媒ドメインにより認識される中央の２０ｂｐのコア配列から構成される組換え部位を含有するｐＢＬＡ選択ベクター内に、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７をクローニングした。予想どおり、ＡｖｒＸａ７結合部位が該２０ｂｐコアの隣に位置していた場合には、該Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体はＤＮＡを組換えることが不可能であった（図１Ｃ）。しかし、ＡｖｒＸａ７結合部位が該２０ｂｐコアの反対鎖上に位置していた場合には、組換えは明白であった（図１Ｃ）。このことは、組換え部位配向がＴＡＬＥ Ｎ末端への触媒ドメイン融合に決定的に重要な因子であることを示している。Ｎ末端融合が組換えに必要であることを更に確認するために、触媒ドメイン活性を抑制すると予想される非カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）融合配向を含むＣ末端ＡｖｒＸａ７−Ｇｉｎ変異体を構築した（図１Ｂおよび表５）。予想どおり、このＣ末端ＡｖｒＸａ７融合体は細菌細胞においてごく僅かの活性を示すことが確認された（図１Ｃ）。
設計されたトランケーション
前記のＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体は組換えを触媒したが、この変異体の活性は、操作されたＺＦＲのものより相当低かった。更に、特異性分析は、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体が、非コグネイト（非同族）ＤＢＤ部位および非天然２０ｂｐコア配列を含有する認識部位を忠実に識別できないことを示した。このことは、組換えがＧｉｎ媒介性ではない可能性があることを示している（図１Ｄ）。最近の報告は、該融合タンパク質のＴＡＬＥ部分がトランケート化されている場合、ＴＡＬＥＮ活性が増強されうることを示している。したがって、ＴＡＬＥＲ活性を改善することを試みるために、一連のＮおよびＣ末端ＡｖｒＸａ７トランケート化体を作製した（図２Ａ）。
前記のＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体は組換えを触媒したが、この変異体の活性は、操作されたＺＦＲのものより相当低かった。更に、特異性分析は、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７融合体が、非コグネイト（非同族）ＤＢＤ部位および非天然２０ｂｐコア配列を含有する認識部位を忠実に識別できないことを示した。このことは、組換えがＧｉｎ媒介性ではない可能性があることを示している（図１Ｄ）。最近の報告は、該融合タンパク質のＴＡＬＥ部分がトランケート化されている場合、ＴＡＬＥＮ活性が増強されうることを示している。したがって、ＴＡＬＥＲ活性を改善することを試みるために、一連のＮおよびＣ末端ＡｖｒＸａ７トランケート化体を作製した（図２Ａ）。
１０個のＮ末端トランケート化体を、ＡｖｒＸａ７ Ｔｈｒ２７（Δ２７）で始まりＡｖｒＸａ７ Ｇｌｙ２６８（Δ２６８）で終わるように、ほぼ等しい間隔で合体させた。ＴＡＬＥＮのＮ末端トランケート化変異体として報告されているＡｖｒＸａ７ Δ１５０も作製した。２個のＣ末端ＡｖｒＸａ７トランケート化体を２８位（＋２８）および９５位（＋９５）において作製した。＋２８および＋９５は共に、ＴＡＬＥＮにおける安定融合点として報告されている。各ＴＡＬＥトランケート化変異体をＧｉｎ触媒ドメインに融合させ、この２０メンバーＴＡＬＥＲライブラリーを、Ａｖｒ−２０Ｇ認識部位を含有するｐＢＬＡ選択ベクター内にクローニングした。細菌細胞における１ラウンドの選択の後（「材料および方法」）、個々のアンピシリン耐性クローンを配列決定したところ、全ての選択されたＴＡＬＥＲは２つのＮ末端トランケート化（Δ８７およびΔ１２０）の１つを含有することが判明した。また、それぞれの選択されたクローンはＣ末端の＋２８に存在した。融合点付近に自発的な１２アミノ酸の欠失を含有する単一のΔ１２０クローン（Δ１２０＊）以外は、これらのクローンの活性は非常に低かった（図２Ｂ）。このアッセイにおいては、Ｇｉｎに基づくＺＦＲは、通常、２０〜４０％の組換えを示すが、選択されたＴＡＬＥＲ融合体において観察された最高活性は〜７％の組換えであった（Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０＊）。ＴＡＬＥ ＤＢＤはＺＦドメイン（要求される隣接ペプチド配列を含まない）より３倍大きいため、本発明者らは、これらのＴＡＬＥＲ構築物に使用される２０ｂｐのスペーサーが組換えのための最適長ではない可能性があると推論した。
コア配列の長さ
次に、１４（Ａｖｒ−１４Ｇ）、２６（Ａｖｒ−２６Ｇ）および３２ｂｐ（Ａｖｒ−３２Ｇ）のコア部位を含有するＤＮＡ標的が、選択されたＴＡＬＥＲにより組換えられうるかどうかを評価することにより、コア配列の長さが組換えに及ぼす効果を調べた。リコンビナーゼ媒介性再構築後にβ−ラクタマーゼ遺伝子のリーディングフレームを維持するために、コアの半分の部位を±３ｂｐにより修飾した（表１）。前記の２０メンバーＴＡＬＥＲライブラリーを各標的部位変異体に対する１ラウンドの選択に付した。最短標的（Ａｖｒ−１４Ｇ）を組換えうるＴＡＬＥＲ変異体の特定は可能でなかったが（データ非表示）、Ａｖｒ−２６ＧおよびＡｖｒ−３２Ｇを組換える２個のＧｉｎ−ΔＡｖｒＸａ７変異体が（Ｎ末端ＴＡＬＥトランケート化体Δ８７およびΔ１２０ならびにＣ末端トランケート化体＋２８に基づいて）特定された。特に、クローン分析は、選択されたＴＡＬＥＲ（Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ８７およびＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０）が、最長コア（例えば、２６および３２ｂｐ）を含有するＤＮＡを、より短いコア（例えば、１４および２０ｂｐ）の場合より少なくとも１００倍高い効率で組換えることを示した（図２Ｂ）。更に、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０は、コグネイト（同族）コア配列（Ａｖｒ−２６ＧおよびＡｖｒ−３２ｇ）を含有する標的を、非コグネイトコア（Ａｖｒ−２０Ｔ、Ａｖｒ−２０ＧＧ、Ａｖｒ−３２ＴおよびＡｖｒ−３２ＧＧ）より＞１００倍高い効率で組換えたことが判明した（図２Ｃ）。興味深いことに、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０融合体は４４ｂｐコア（Ａｖｒ−４４Ｇ）に対してはそれほど活性ではなかったが（組換えはＡｖｒ−３２Ｇより〜３倍低かった）（図２Ｃ）、このことは、２６〜４４ｂｐのコア長が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０による組換えに最適であるらしいことを示している。
次に、１４（Ａｖｒ−１４Ｇ）、２６（Ａｖｒ−２６Ｇ）および３２ｂｐ（Ａｖｒ−３２Ｇ）のコア部位を含有するＤＮＡ標的が、選択されたＴＡＬＥＲにより組換えられうるかどうかを評価することにより、コア配列の長さが組換えに及ぼす効果を調べた。リコンビナーゼ媒介性再構築後にβ−ラクタマーゼ遺伝子のリーディングフレームを維持するために、コアの半分の部位を±３ｂｐにより修飾した（表１）。前記の２０メンバーＴＡＬＥＲライブラリーを各標的部位変異体に対する１ラウンドの選択に付した。最短標的（Ａｖｒ−１４Ｇ）を組換えうるＴＡＬＥＲ変異体の特定は可能でなかったが（データ非表示）、Ａｖｒ−２６ＧおよびＡｖｒ−３２Ｇを組換える２個のＧｉｎ−ΔＡｖｒＸａ７変異体が（Ｎ末端ＴＡＬＥトランケート化体Δ８７およびΔ１２０ならびにＣ末端トランケート化体＋２８に基づいて）特定された。特に、クローン分析は、選択されたＴＡＬＥＲ（Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ８７およびＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０）が、最長コア（例えば、２６および３２ｂｐ）を含有するＤＮＡを、より短いコア（例えば、１４および２０ｂｐ）の場合より少なくとも１００倍高い効率で組換えることを示した（図２Ｂ）。更に、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０は、コグネイト（同族）コア配列（Ａｖｒ−２６ＧおよびＡｖｒ−３２ｇ）を含有する標的を、非コグネイトコア（Ａｖｒ−２０Ｔ、Ａｖｒ−２０ＧＧ、Ａｖｒ−３２ＴおよびＡｖｒ−３２ＧＧ）より＞１００倍高い効率で組換えたことが判明した（図２Ｃ）。興味深いことに、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０融合体は４４ｂｐコア（Ａｖｒ−４４Ｇ）に対してはそれほど活性ではなかったが（組換えはＡｖｒ−３２Ｇより〜３倍低かった）（図２Ｃ）、このことは、２６〜４４ｂｐのコア長が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０による組換えに最適であるらしいことを示している。
漸増トランケーションライブラリー
Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０はＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７と比較して組換えの増強を示したが、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０は最適なＴＡＬＥ融合構造体ではない可能性があると疑われた。なぜなら、（ｉ）Ｇｉｎ触媒ドメインを含有するＺＦＲはＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０より＞２倍高い効率でＤＮＡを組換えた、および（ｉｉ）Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０はＴＡＬＥトランケーション変異体の包括的ライブラリーから特定されなかったからである。したがって、より良好な融合構造体を特定するために、漸増トランケート化ＴＡＬＥ ＤＢＤのライブラリーの作製に基づいて、スクリーニングを工夫した。
Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０はＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７と比較して組換えの増強を示したが、Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０は最適なＴＡＬＥ融合構造体ではない可能性があると疑われた。なぜなら、（ｉ）Ｇｉｎ触媒ドメインを含有するＺＦＲはＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０より＞２倍高い効率でＤＮＡを組換えた、および（ｉｉ）Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０はＴＡＬＥトランケーション変異体の包括的ライブラリーから特定されなかったからである。したがって、より良好な融合構造体を特定するために、漸増トランケート化ＴＡＬＥ ＤＢＤのライブラリーの作製に基づいて、スクリーニングを工夫した。
これを達成するために、トランケート化Ｃ末端断片（ＡｖｒＸａ７）（「材料および方法」）のライブラリーへの未修飾Ｎ−末端ドメイン（Ｇｉｎ）の融合体を可能にするために既に記載されているとおりにプロトコールを適合させた。ＡｖｒＸａ７ Ｎ末端（Ｍｅｔ１）と最初のＡｖｒＸａ７反復（Ｌｅｕ２９８）との間の領域にわたるＮ末端ＡｖｒＸａ７トランケーションをエキソヌクレアーゼ消化により作製し、Ｇｉｎ触媒ドメインの未修飾コピーに融合させた（タンパク質変異体の理論数：〜３００）。これまでの結果は、＋２８が最適なＣ末端トランケーションであることを示していたため、本発明者らはこの構造体をトランケーションライブラリー内に組込んだ。ＴＡＬＥＲを、Ａｖｒ−３２Ｇ標的部位を含有するｐＢＬＡ選択ベクター内にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換した（＞１×１０５個の形質転換体）。配列分析は、関心のある領域にわたるトランケーションの等しい分布を証明した（データ非表示）。
３ラウンドの選択の後、個々のアンピシリン耐性クローンを配列決定し、幾つかのユニークトランケーション変異体を特定した（図３Ａ）。最適なＮ末端ＴＡＬＥＲ融合点が８７および１２０位付近に位置するらしいことを示唆した、２０メンバーＴＡＬＥトランケーションライブラリーを使用して行った選択に合致して、全ての選択されたＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７変異体は７４位（Δ７４）と１４７位（Δ１４７）との間にトランケーションを含有することが判明した。特に、７３個中２６個（３５．６％，ｐ＜．００１）のクローンは１２４位（Δ１２４）と１２９位（Δ１２９）との間にトランケーションを含有していた。この集団からは、１２８位（Δ１２８）におけるトランケーションが最も代表的なもののうちの１つであった。
選択されたＡｖｒＸａ７ドメインがＴＡＬＥＲ活性を増強したかどうかを系統的に判定するために、本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＡｖｒ−３２Ｇ標的部位を含有するＤＮＡ基質に対する単離されたＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７変異体の性能を評価した。本発明者らの分析を、ＡｖｒＸａ７の９２位（Δ９２）と１３４位（Δ１３４）との間のＮ末端欠失を含有するクローンに集中させた。Δ９２融合体は非常に活性であったが、配列分析に合致して、Δ１２０とΔ１２９との間にＮ末端トランケーションを含有するＴＡＬＥＲは、比較的より長い又はより短いトランケーションに基づく変異体より効率的にＤＮＡを組込むことが判明した（図３Ｂ）。３個のクローンを更に特徴づけした。すなわち、Δ７４およびΔ１４５は可能な融合点の境界に相当するものであったため、それらを選択し、Δ１２８は、該選択において見出された最も有力なクローンであったため、それをアッセイした。１４〜４４ｂｐのスペーサー長を有する５個の標的を３個の陰性対照（Ａｖｒ３２Ｔ、Ａｖｒ３２ＧＧおよびＰｔｈＸｏｌ−３２Ｇ）と共にアッセイした。Ｇｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ７４およびＧｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ１４５は、２０ｂｐより長いスペーサーに対して、限られた活性を示し、一方、Ｇｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ１２８は、ＺＦＲ ＧｉｎＣ４に匹敵する効率で、ＤＮＡを組換えると判定された（図３Ｃ）。更に、特異性分析は、Ｇｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ７４、Ｇｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ１２８およびＧｉｎ−Ａｖｒ３２ＧΔ１４５は、コグネイトコアを含有する基質を、非コグネイトコアのもの（Ａｖｒ−３２Ｔ、Ａｖｒ−３２ＧＧおよびＰｔｈＸｏｌ−３２Ｇ）より＞１００倍高い効率で組換えうることを示した（図３Ｃ）。総合すると、これらの結果は、Δ１２０とΔ１２９との間のＮ末端欠失を含有するＴＡＬＥタンパク質がリコンビナーゼへの融合のための最適なトランケーションに相当することを示唆している。
合成ＴＡＬＥ反復アレイの組込み
前記研究は、天然に存在するＡｖｒＸａ７ ＴＡＬＥタンパク質の天然ＤＢＤを使用した。設計されたＴＡＬＥ反復アレイが、選択されたＧｉｎ−ΔＡｖｒＸａ７フレームワーク内に組込まれうるかどうかを決定するために、ＡｖｒＸａ７結合部位を標的化するように設計された一連の合成ＴＡＬＥタンパク質（１５〜２０反復長）を作製した（図７）。公に入手可能なＴＡＬＥＮプラスミドセット（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して、ＴＡＬＥタンパク質を構築した。該クローニングプラスミドを、＋２８ Ｃ末端トランケーションおよびΔ１２０またはΔ１２８ Ｎ末端トランケーションを含むように修飾した。設計されたＴＡＬＥをＧｉｎ触媒ドメイン（Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０およびＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２８）に融合させ、Ａｖｒ−３２ＧまたはＡｖｒ−３２Ｔ標的部位を含有するｐＢＬＡ選択ベクター内にクローニングした。
前記研究は、天然に存在するＡｖｒＸａ７ ＴＡＬＥタンパク質の天然ＤＢＤを使用した。設計されたＴＡＬＥ反復アレイが、選択されたＧｉｎ−ΔＡｖｒＸａ７フレームワーク内に組込まれうるかどうかを決定するために、ＡｖｒＸａ７結合部位を標的化するように設計された一連の合成ＴＡＬＥタンパク質（１５〜２０反復長）を作製した（図７）。公に入手可能なＴＡＬＥＮプラスミドセット（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して、ＴＡＬＥタンパク質を構築した。該クローニングプラスミドを、＋２８ Ｃ末端トランケーションおよびΔ１２０またはΔ１２８ Ｎ末端トランケーションを含むように修飾した。設計されたＴＡＬＥをＧｉｎ触媒ドメイン（Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０およびＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２８）に融合させ、Ａｖｒ−３２ＧまたはＡｖｒ−３２Ｔ標的部位を含有するｐＢＬＡ選択ベクター内にクローニングした。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における活性分析は、Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０およびＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２８の両方が、活性触媒ドメインに融合された場合に、ＤＮＡを組換えるために使用されうること、ならびに合成反復の組込みが活性の増強をもたらすことを示した（図４Ａ）。重要なことに、各ＴＡＬＥＲは厳密な選択性を示し、コグネイトコアを含有する標的部位を、非コグネイトコアの場合より＞１，０００倍高い効率で組換えた（図４Ｂ）。驚くべきことに、Δ１２０トランケーションに基づくＴＡＬＥＲは、Δ１２８構造に基づくＴＡＬＥと同等に有効にＤＮＡを組換えることも判明した（図４Ａ）。このことは、設計されたＴＡＬＥが、天然ＡｖｒＸａ７ ＤＢＤを含有するものほどはＮ末端トランケーションに対して感受性でない可能性があることを示している。
本明細書に記載されているＴＡＬＥＲ構造体が、任意のＤＮＡ配列を標的化するように再プログラム化されうることを更に実証するために、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質ＰｔｈＸｏ１により認識される配列を標的化するように設計された合成酵素（Ｇｉｎ−Ｐｔｈ１５Δ１２０）を作製した。Ｇｉｎ−Ｐｔｈ１５Δ１２０はそのコグネイト基質に対して非常に活性であること、ならびにＧｉｎ−Ｐｔｈ１５Δ１２０およびＧｉｎＡｖｒ１５Δ１２０の両方が、それらのコグネイト結合部位を有する標的に対する組換えにおける＞６００倍の増加を示すことが判明した（図４Ａ）。１５〜２０反復長のＤＢＤを含有する一連の設計されたＴＡＬＥＲの活性も評価したところ、各融合体が同様に高い効率および特異性で組換えを触媒することが判明した（図４Ｂ）。
哺乳類細胞におけるＴＡＬＥＲ活性
ＴＡＬＥＲが哺乳類細胞においてＤＮＡを修飾しうるかどうかも判定した。これを達成するために、本発明者らは、細胞培養におけるリコンビナーゼ活性の迅速な評価を可能にするエピソームレポーターアッセイを用いた。このアッセイにおいて、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、組換え部位に隣接したＳＶ４０プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド（ｐＧＬ３）およびリコンビナーゼ発現ベクターでコトランスフェクトした。適当なリコンビナーゼの一過性発現は細胞におけるＳＶ４０プロモーターの切り出し及びルシフェラーゼ発現の低下を招く。したがって、リコンビナーゼ活性はルシフェラーゼ発現の低下倍数に正比例する。
ＴＡＬＥＲが哺乳類細胞においてＤＮＡを修飾しうるかどうかも判定した。これを達成するために、本発明者らは、細胞培養におけるリコンビナーゼ活性の迅速な評価を可能にするエピソームレポーターアッセイを用いた。このアッセイにおいて、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、組換え部位に隣接したＳＶ４０プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド（ｐＧＬ３）およびリコンビナーゼ発現ベクターでコトランスフェクトした。適当なリコンビナーゼの一過性発現は細胞におけるＳＶ４０プロモーターの切り出し及びルシフェラーゼ発現の低下を招く。したがって、リコンビナーゼ活性はルシフェラーゼ発現の低下倍数に正比例する。
Ａｖｒ−４４Ｇ認識部位を含有するレポータープラスミド（ｐＧＬ３−Ａｖｒ−４４Ｇ）でのＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０のコトランスフェクションは、ｐＧＬ３−Ａｖｒ−４４Ｇのみのトランスフェクションと比較して、ルシフェラーゼ発現における〜２０倍の低下を招いた（図５Ａ）。Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＺＦＲ ＧｉｎＣ４に対して類似活性を示したにもかかわらず、本発明者らは、ＧｉｎＣ４が、そのコグネイト標的プラスミドｐＧＬ３−Ｃ４−２０Ｇでのコトランスフェクションの後、ルシフェラーゼ発現を＞８０倍低下させることを見出した（図５Ａ）。この矛盾は、ｐＧＬ３におけるリコンビナーゼ標的部位間の、ｐＢＬＡの場合より比較的短い介在ＤＮＡ配列、または哺乳類細胞におけるＴＡＬＥＲとＺＦＲとの間の差動的発現によるものかもしれない。しかし、この矛盾の根本原因は依然として不明である。最後に、３２ｂｐが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴＡＬＥＲのための最適コア配列長だと決定されたが、ｐＧＬ３−Ａｖｒ−３２ＧとＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０のコトランスフェクションはルシフェラーゼ発現における僅か６倍の低下を招いたに過ぎなかった（図５Ａ）。この矛盾の根本原因も依然として不明である。
次に、ＺＦＲ（ＧｉｎＣ４）およびＴＡＬＥＲ（Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０）が哺乳類細胞において適合性ヘテロ二量体を形成しうるかどうかを調べた。この可能性を評価するために、Ｇｉｎ触媒ドメイン（ｐＧＬ３−Ａｖｒ−Ｇ−ＺＦ）により認識されるコア配列にＡｖｒＸａ７結合部位およびＣ４ジンクフィンガー結合部位（ＧＣＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＴＧ；配列番号２７９）が隣接しているハイブリッド組換え部位を作製した（表２を参照されたい）。驚くべきことに、ＧｉｎＣ４およびＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０でのｐＧＬ３−Ａｖｒ−Ｇ−ＺＦのコトランスフェクションは、ｐＧＬ３−Ａｖｒ−Ｇ−ＺＦと比較して、ルシフェラーゼ発現における＞１４０倍の低下を招いたが（図５Ｂ）、ｐＧＬ３−Ａｖｒ−Ｇ−ＺＦとＧｉｎＣ４またはＧｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０のいずれかでのトランスフェクションはレポーター遺伝子発現における無視しうるほどの低下を招いたに過ぎなかった。これらの結果は、ＺＦ−ＴＡＬＥヘテロ二量体の作製が、キメラリコンビナーゼの標的化能を改善するための潜在的に有効なアプローチに相当することを示している。
考察
非常に最低限の融合構造を含有するＺＦＰとは異なり、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、機能するために、ＤＢＤアレイのいずれかの側に天然タンパク質フレームワークを要する。０位におけるチミジン残基の結合をもたらし、ほとんど全ての公知ＴＡＬＥ認識部位において見出されるいわゆる第０および第１反復はそのようなＮ末端フレームワークに相当する。最近の結晶構造解析は０位チミンの結合の説明を与えているが、最小ＴＡＬＥ構造を決定するには不十分なデータが依然として存在する。実際、これまでの全ての研究は、０位の結合をもたらすのに要求されるものよりかなり多くの残基を含有するＮ末端トランケーションを用いている。適切なＤＮＡ結合コンホメーションを可能にする際の該タンパク質のこの部分が果たす役割または最小ＴＡＬＥドメインを構成しうるものは依然として明らかではない。機能的ＴＡＬＥキメラを作製するための初期の試みは完全長ＴＡＬＥタンパク質への融合に基づくものであったが、より最近の研究は、Δ１５０ Ｎ末端構造のコンテキストにおけるエフェクタードメイン機能を改善するユニークＣ末端トランケーションの特定に焦点を合わせている。これまでの報告は、ＡｖｒＢｓ３ ＴＡＬＥのＮ末端残基２−１５３の欠失（Δ１５０）が、ＴＡＬＥのその天然細菌から標的植物細胞へのトランスロケーションに要求されるドメインを除去するが、転写因子の活性を損なわないことを示している。
非常に最低限の融合構造を含有するＺＦＰとは異なり、ＴＡＬＥ ＤＢＤは、機能するために、ＤＢＤアレイのいずれかの側に天然タンパク質フレームワークを要する。０位におけるチミジン残基の結合をもたらし、ほとんど全ての公知ＴＡＬＥ認識部位において見出されるいわゆる第０および第１反復はそのようなＮ末端フレームワークに相当する。最近の結晶構造解析は０位チミンの結合の説明を与えているが、最小ＴＡＬＥ構造を決定するには不十分なデータが依然として存在する。実際、これまでの全ての研究は、０位の結合をもたらすのに要求されるものよりかなり多くの残基を含有するＮ末端トランケーションを用いている。適切なＤＮＡ結合コンホメーションを可能にする際の該タンパク質のこの部分が果たす役割または最小ＴＡＬＥドメインを構成しうるものは依然として明らかではない。機能的ＴＡＬＥキメラを作製するための初期の試みは完全長ＴＡＬＥタンパク質への融合に基づくものであったが、より最近の研究は、Δ１５０ Ｎ末端構造のコンテキストにおけるエフェクタードメイン機能を改善するユニークＣ末端トランケーションの特定に焦点を合わせている。これまでの報告は、ＡｖｒＢｓ３ ＴＡＬＥのＮ末端残基２−１５３の欠失（Δ１５０）が、ＴＡＬＥのその天然細菌から標的植物細胞へのトランスロケーションに要求されるドメインを除去するが、転写因子の活性を損なわないことを示している。
しかし、活性ＴＡＬＥＲの開発はユニークＮ末端ＴＡＬＥ変異体の特定を要した。Ｃ末端トランケーション＋２８および＋９５を含有するＮ末端ＴＡＬＥの広範な系統的研究が最初に行われ、僅か２個のドメイン（＋２８を有するΔ８７および＋２８を有するΔ１２０）が更なる分析のための十分に高い活性を示すことが判明した。ＡｖＸａ７ Ｎ末端の漸増トランケーションに基づく二次的分析は、ＡｖｒＸａ７の７４位（Δ７４）〜１４５位（Δ１４５）を中心とするトランケーション変異体の広範なクラスターの特定をもたらした。この実験において回収されたクローンのうち、３８％がΔ１１９〜Δ１２８のトランケーションを含有しており、この領域に融合体を含有するＴＡＬＥＲに関して得られたデータの精査は高い活性を示した。特に、この領域からのＮ末端トランケーション（Δ１２８およびΔ１２０）に基づくＴＡＬＥＲは、細菌および哺乳類細胞においてＤＮＡを組換えるために使用されうると判定された。Δ１１９〜Δ１２８のトランケーション変異体のクラスター化はこの領域の本質的安定性も示しているかもしれない。
ＺＦＲは、典型的に、４４〜５０ｂｐの長さの標的部位の組換えを触媒する。各標的部位は、リコンビナーゼ触媒ドメインにより認識される中央の２０ｂｐのコア配列、および２個の隣接ＺＦＰ結合部位を含有する。しかし、ＴＡＬＥＲの融合配向は、ＴＡＬＥ結合部位が該中央コア配列に対して反対鎖上に存在することを要する。この特有の幾何学的配置ゆえに、本発明者らは組換えのための最小コア配列要件を調べることにした。ＴＡＬＥ ＤＢＤの長さ（ＴＡＬＥ反復はＺＦＰより３〜４倍長い）および触媒ドメインとＴＡＬＥドメインとの間で伸長するＮ末端リンカーに基づいて、本発明者らは、より長いコア配列（３２または４４ｂｐ）が組換えに必要であろうと推論した。実際、自発性欠失（Δ１２０＊）を含有するＴＡＬＥ変異体以外は、この研究において特定されたほとんどのＮ末端トランケーション変異体は３２ｂｐのコアに対して最適な特性を示した。ＺＦＮとは異なり、ＤＮＡを効率的に切断するために有意に長いスペーサー配列を要するＴＡＬＥＮ（例えば、ＴＡＬＥＮ：１７〜２０ｂｐ；ＺＦＮ：５〜６ｂｐ）に関して報告された結果に、これらの結果は合致している。これらの観察を裏付けるものとして、短いコア配列（１４ｂｐ）に対するユニークＮ末端トランケーション変異体の選択はいずれのクローンも与えないことが判明した。
Ｇｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２８は最適ＴＡＬＥ融合体として特定されたが、公に入手可能なＴＡＬＥ構築キットを使用して作製された合成ＴＡＬＥタンパク質を使用する後続の研究は、Δ１２８およびΔ１２０に基づくＴＡＬＥＲが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において類似活性を示すことを示した。これらの設計ＴＡＬＥは、密接に関連しており天然に存在するＴａｌ１ｃおよびＰｔｈＸｏ１ ＴＡＬＥタンパク質に由来するキメラタンパク質に基づくものであった。ＴＡＬＥは高い相同性を有するが、それらは同一ではない。残基１２および１３以外のＲＶＤ反復における多型はＴＡＬＥ融合体活性に全く影響を及ぼさないことが示されているが、本発明者らの知見によれば、ＤＢＤ以外のＴＡＬＥフレームワークにおける相違の系統的評価は何ら報告されていない。漸増トランケーションライブラリーの分析により示されるとおり、僅かなアミノ酸変化が個々の融合体の活性に有意に影響を及ぼしうる。したがって、本発明者らがＧｉｎ−ＡｖｒＸａ７Δ１２０と合成Ｇｉｎ−Ａｖｒ１５Δ１２０との間で観察した活性における矛盾の幾つかは、これまでに使用されたＡｖｒＸａ７フレームワークおよびＴＡＬＥフレームワーク構造の間の配列変異に起因すると考えられうる。
合成ＴＡＬＥの構築に好都合な４つのＲＶＤ（ＮＩ：Ａ，ＨＤ：Ｃ，ＮＧ：ＴおよびＮＮ：Ｇ）は自然界で最も一般的であるが、これらの反復が最も特異的なＲＶＤモジュールに相当するかどうかは依然として明らかでない。２６反復のＡｖｒＸａ７ ＴＡＬＥの場合、同じ配列を標的化する合成形態はＲＶＤ組成における１６個の変化を有するであろう（図７）。それらは自然界で最も一般的に見出されるため、合成用に選択されたそれらの４つのＲＶＤは、それらのコグネイト塩基に対して、他のＲＶＤより高いアフィニティを有しうると仮定された。これが事実であれば、該合成ＲＶＤ反復を使用して作製されたＴＡＬＥは、天然ドメインを使用した場合のＴＡＬＥより高いＤＮＡ結合アフィニティを有しうると考えるのが合理的であろう。ＲＶＤアフィニティの件は直接的には検討されなかったが、合成反復アレイを含有するＴＡＬＥＲは、天然ＡｖｒＸａ７ ＤＢＤを含有する構築物より活性であると判定された。合成ＤＢＤを含有するＴＡＬＥＲは、有意に少数のＤＢＤを含有するにもかかわらず、天然反復を含有する構築物より約２倍高い活性を示した。また、該合成アレイで観察された活性の増強はオフターゲット組換えにおけるいずれの増加とも相関しなかった。
幾つかの研究は、ＴＡＬＥがそれらの標的配列における幾つかのミスマッチを許容しうることを示している。特定の塩基に対して正の関連性を有するＲＶＤは自然界において非コグネイト塩基を許容することが示されているため、これらの知見は驚くことではない。しかし、ＴＡＬＥＲによりもたらされる協同的特異性は、潜在的制約を回避するために用いられうるであろう。触媒ドメインは組換えに対する特異性に寄与するため、高度に相同なゲノム配列を選択的に修飾しうるデザイナーＴＡＬＥＲも作製されうると予想される。実際、リコンビナーゼ触媒特異性は、非天然コア部位を標的化するように有効に再プログラム化されうることが最近示されている。
実施例２
新規第０残基特異性の選択
新規クラスの、Ｔａｌに基づくＤＮＡ結合性タンパク質を設計した。ＴＡＬ（転写アクチベーター様）エフェクターは、予測可能な特異性を有する新規クラスのＤＮＡ結合性タンパク質である。Ｔａｌエフェクターはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属のグラム陰性植物病原性細菌により利用され、それは、種々のエフェクタータンパク質の混合物をＩＩＩ型分泌経路（Ｔ３ＳＳ）を経由して植物細胞内にトランスロケーションし、該部位において、それらはビルレンス決定因子として作用する。ＴＡＬのＤＮＡ結合特異性は縦列反復の中央ドメインにより決定される。各反復はＤＮＡ内の１つの塩基対（ｂｐ）の認識をもたらす。反復モジュールの再配置は、ある重要な制約と共に所望のＤＮＡ結合特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。例えば、Ｔａｌドメインを有するＤＮＡ配列の標的化の最も制約的な特徴は、Ｔａｌ ＤＮＡ部位が塩基Ｔ、そして時にはＣから始まるという要件である。ＧまたはＡ塩基を有する結合部位の標的化は−１位においては可能ではない。突然変異を第−１および第０ ＲＶＤ領域に標的化することにより、この制約を欠くＴａｌ ＤＮＡ結合ドメインを選択するために、Ｔａｌ−リコンビナーゼ活性選択を用いた。この発見の実際の成果は莫大なものである。なぜなら、現在、各ＤＮＡ配列は、新規無制約アプローチを促進する新規Ｔａｌドメインを使用して、ＴＡＬ転写因子に標的化されて、転写をオン／アップまたはオフ／ダウンし、ＴＡＬヌクレアーゼを標的化して遺伝子機能をノックアウトし、あるいは相同組換えを導き、あるいは本発明者ら自身のＴＡＬリコンビナーゼまたは他のＴＡＬ酵素を標的化しうるからである。
新規第０残基特異性の選択
新規クラスの、Ｔａｌに基づくＤＮＡ結合性タンパク質を設計した。ＴＡＬ（転写アクチベーター様）エフェクターは、予測可能な特異性を有する新規クラスのＤＮＡ結合性タンパク質である。Ｔａｌエフェクターはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属のグラム陰性植物病原性細菌により利用され、それは、種々のエフェクタータンパク質の混合物をＩＩＩ型分泌経路（Ｔ３ＳＳ）を経由して植物細胞内にトランスロケーションし、該部位において、それらはビルレンス決定因子として作用する。ＴＡＬのＤＮＡ結合特異性は縦列反復の中央ドメインにより決定される。各反復はＤＮＡ内の１つの塩基対（ｂｐ）の認識をもたらす。反復モジュールの再配置は、ある重要な制約と共に所望のＤＮＡ結合特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。例えば、Ｔａｌドメインを有するＤＮＡ配列の標的化の最も制約的な特徴は、Ｔａｌ ＤＮＡ部位が塩基Ｔ、そして時にはＣから始まるという要件である。ＧまたはＡ塩基を有する結合部位の標的化は−１位においては可能ではない。突然変異を第−１および第０ ＲＶＤ領域に標的化することにより、この制約を欠くＴａｌ ＤＮＡ結合ドメインを選択するために、Ｔａｌ−リコンビナーゼ活性選択を用いた。この発見の実際の成果は莫大なものである。なぜなら、現在、各ＤＮＡ配列は、新規無制約アプローチを促進する新規Ｔａｌドメインを使用して、ＴＡＬ転写因子に標的化されて、転写をオン／アップまたはオフ／ダウンし、ＴＡＬヌクレアーゼを標的化して遺伝子機能をノックアウトし、あるいは相同組換えを導き、あるいは本発明者ら自身のＴＡＬリコンビナーゼまたは他のＴＡＬ酵素を標的化しうるからである。
（−１）位におけるＧ特異性に関しては、まず、ＧｉｎＡｖｒ１５Δ１２８−合成タンパク質の（−１）ドメイン内で、ＮＮＫコドン法を用いて、アミノ酸ＱＷＳＧ（配列番号２０９）をランダム化した。得られたライブラリーの３ラウンドのｔａｌリコンビナーゼ活性選択の後、標的化領域内に選択された配列ＲＳＮＧ（配列番号２１０）およびＳＲＳＧ（配列番号２１１）を有する新規ｔａｌ結合ドメインを選択した。ついで、これらは、開始クローンにより認識される親（ｐａｒｅｎｔａｌ）Ｔを越えて、標的配列の０位のＧに結合することが示された。該選択を繰返して、最初に選択されたＱＷＳＧ（配列番号２１２）と重複する以下に赤色で示されているＫＱＷ領域をランダム化した。選択されたＳＳＲ、ＳＲＡ、ＳＲＣおよびＫＲＣ配列を有するクローンが今や選択された。全ての選択されたＴａｌ結合ドメインを、Ｇ置換を含有する一定のオリゴに対する結合性研究においてアッセイしたところ、配列Ｇ−ＡＴＡＡＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号２１３）に今や優先的に結合することが示された。この同じ配列を使用してＴａｌリコンビナーゼ活性選択を行ったことに注目されたい。開始Ｔａｌ結合性タンパク質ＧｉｎＡｖｒ１５Δ１２８はＴ−ＡＴＡＡＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号２１４）に結合する。選択された突然変異を含有するＴａｌヌクレアーゼの配列試験はこれらの配列のＧ特異性を証明しており、これは、この新規クラスのＴａｌが初めて開発されることを可能にするものである。選択された配列は他の種に由来するＴａｌに移植可能（ｐｏｒｔａｂｌｅ）である。
また、Ａを標的化するためにこの同じライブラリーを使用して選択を行った。この研究においては、配列ＰＲＧ、ＰＴＲおよびＰＫＤを選択した。全ての選択されたＴａｌ結合ドメインを、Ａ置換を含有する一定のオリゴに対する結合性研究においてアッセイしたところ、配列Ａ−ＡＴＡＡＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号２２２）に今や優先的に結合することが示された。この同じ配列を使用してＴａｌリコンビナーゼ活性選択を行ったことに注目されたい。開始Ｔａｌ結合性タンパク質ＧｉｎＡｖｒ１５Δ１２８はＴ−ＡＴＡＡＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号２２３）に結合する。選択された突然変異を含有するＴａｌヌクレアーゼの配列試験はこれらの配列のＡ特異性を証明しており、これは、この新規クラスのＴａｌが初めて開発されることを可能にするものである。Ｎ末端ドメインのランダム突然変異誘発または第０ドメイン内のＫＲＧＧ（配列番号２２４）配列の標的突然変異誘発および該リコンビナーゼ系における再選択により、結合活性における後続の改良が達成されうる。
実施例３
選択
コンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）依存的ＲＶＤ選択および新規特異性を有するＲＶＤの選択のために、以下に太字で示されているＨＤ配列をランダム化するライブラリーを作製した。ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（原型ＲＶＤ配列；配列番号２２５）。
選択
コンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）依存的ＲＶＤ選択および新規特異性を有するＲＶＤの選択のために、以下に太字で示されているＨＤ配列をランダム化するライブラリーを作製した。ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（原型ＲＶＤ配列；配列番号２２５）。
Ｎ、Ｄ，Ｈ、ＫおよびＱアミノ酸に限定されたライブラリーがＨ残基の置換の成功をもたらすことが多いが、典型的には、該ライブラリーはこれらの２つの位置における全てのアミノ酸を可能にする。あるいは、ＳＨＤＧ（配列番号２２６）およびＡＳＨＤＧＧ（配列番号２２７）領域をランダム化した、より大きなライブラリーは、コンテキスト依存的特性を有するユニークＲＶＤ特異性の選択を可能にする。
したがって、Ｔａｌリコンビナーゼ活性選択は標的化ＲＶＤドメイン内の新規特異性の選択を迅速に可能にする。生じるＲＶＤは高度にモジュール性またはそれらの配列認識においてコンテキスト依存的である可能性があり、したがってＴａｌヌクレアーゼおよび転写因子を作製するために使用されうる。
この技術の有用性には、手段および治療法として用いられる、転写をオン／アップまたはオフ／ダウンし、ＴＡＬヌクレアーゼを標的化して遺伝子機能をノックアウトし、あるいは相同組換えを導き、あるいは本発明者ら自身のＴＡＬリコンビナーゼまたは他のＴＡＬ酵素を標的化するためのＴＡＬ転写因子に対する無制約アプローチが含まれる。
この発見の利点および実際の成果は莫大である。なぜなら、現在、各ＤＮＡ配列は本発明者らの新規Ｔａｌドメインを使用して標的化可能であり、それらの特異性は迅速に最適化可能だからである。
実施例４
チミン以外の５’塩基を含むＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインの定向進化
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、関心のある実質的に全てのＤＮＡ配列に結合するように設計されうる。植物非病原性遺伝子を標的化する天然ＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）のＤＮＡ結合部位は５’チミジンを有する。合成ＴＡＬＥ−ＴＦもこの要件を有する。最近の構造データは、標的配列の５’ＴとＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）との間に相互作用が存在することを示している。最近のＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の文献の精査は標的配列の最初の塩基（Ｎ０残基）の重要性に関する矛盾するデータを示した。また、ＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥ−Ｒ）の活性に対するＮ０塩基の影響に関する研究は行われていない。ここで、ＴＡＬＥ−Ｒ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、マルトース結合性タンパク質との融合体（ＭＢＰ−ＴＡＬＥ）として発現されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびＴＡＬＥＮの結合領域におけるＮ０塩基の影響を定量する。これらのＴＡＬＥプラットフォームのそれぞれは特有のＮ末端およびＣ末端構造を有するが、全ては、Ｎ０残基がチミジンである場合に最高活性を示した。これらのプラットフォームにおける有効なＴＡＬＥを構築するための規則を単純化し、いずれかの任意ＤＮＡ配列における精密ゲノム工学用途を可能にするために、本発明者らは、本発明者らが最近開発したＴＡＬＥ−Ｒ系を使用する構造誘導活性選択を案出した。５’Ｇを含有するＴＡＬＥ結合部位に対して非常に活性であり選択的なＴＡＬＥ−Ｒ活性をもたらす新規ＮＴＤ配列を特定した。そして、任意の５’Ｎ０残基の一般的標的化を可能にする追加的なドメイン配列を選択した。これらのドメインはＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ構造内に移入され、非Ｔ ５’残基を含有する標的配列に対して野生型ＮＴＤが示す活性より大きな活性を一貫して示した。該新規ＮＴＤはゴールデン・ゲイト（ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ）ＴＡＬＥＮ構築法に適合性であり、任意のＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥ転写因子、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびＤＮＡ結合性タンパク質の効率的構築が今や可能となり、ほとんどの天然ＴＡＬＥタンパク質を制限する５’ Ｔ規則を考慮することなく、ＤＮＡ上の、ＴＡＬＥに基づくタンパク質の正確かつ無制約の配置を可能にした。
チミン以外の５’塩基を含むＴＡＬＥ Ｎ末端ドメインの定向進化
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、関心のある実質的に全てのＤＮＡ配列に結合するように設計されうる。植物非病原性遺伝子を標的化する天然ＴＡＬＥ転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）のＤＮＡ結合部位は５’チミジンを有する。合成ＴＡＬＥ−ＴＦもこの要件を有する。最近の構造データは、標的配列の５’ＴとＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）との間に相互作用が存在することを示している。最近のＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の文献の精査は標的配列の最初の塩基（Ｎ０残基）の重要性に関する矛盾するデータを示した。また、ＴＡＬＥリコンビナーゼ（ＴＡＬＥ−Ｒ）の活性に対するＮ０塩基の影響に関する研究は行われていない。ここで、ＴＡＬＥ−Ｒ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、マルトース結合性タンパク質との融合体（ＭＢＰ−ＴＡＬＥ）として発現されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびＴＡＬＥＮの結合領域におけるＮ０塩基の影響を定量する。これらのＴＡＬＥプラットフォームのそれぞれは特有のＮ末端およびＣ末端構造を有するが、全ては、Ｎ０残基がチミジンである場合に最高活性を示した。これらのプラットフォームにおける有効なＴＡＬＥを構築するための規則を単純化し、いずれかの任意ＤＮＡ配列における精密ゲノム工学用途を可能にするために、本発明者らは、本発明者らが最近開発したＴＡＬＥ−Ｒ系を使用する構造誘導活性選択を案出した。５’Ｇを含有するＴＡＬＥ結合部位に対して非常に活性であり選択的なＴＡＬＥ−Ｒ活性をもたらす新規ＮＴＤ配列を特定した。そして、任意の５’Ｎ０残基の一般的標的化を可能にする追加的なドメイン配列を選択した。これらのドメインはＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ構造内に移入され、非Ｔ ５’残基を含有する標的配列に対して野生型ＮＴＤが示す活性より大きな活性を一貫して示した。該新規ＮＴＤはゴールデン・ゲイト（ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ）ＴＡＬＥＮ構築法に適合性であり、任意のＤＮＡ配列を認識するＴＡＬＥ転写因子、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびＤＮＡ結合性タンパク質の効率的構築が今や可能となり、ほとんどの天然ＴＡＬＥタンパク質を制限する５’ Ｔ規則を考慮することなく、ＤＮＡ上の、ＴＡＬＥに基づくタンパク質の正確かつ無制約の配置を可能にした。
以下の材料および方法をこの実施例において用いた。
オリゴヌクレオチド
プライマーおよび他のオリゴヌクレオチド（以下の表４）はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取り寄せた。
プライマーおよび他のオリゴヌクレオチド（以下の表４）はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取り寄せた。
ＴＡＬＥ−Ｒ ＮＴＤ進化プラスミドの作製
既に報告されているＴＡＬＥ−Ｒ系をこの研究に適合化した。簡潔に説明すると、ｐＢＣＳ（クロラムフェニコールおよびカルベニシリン耐性遺伝子を含有する）をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｐｅ１で消化した。対をなすリコンビナーゼ部位を含有するスタファー（Ａｖｒ Ｘ；ここで、ＸはＮ０塩基である）をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ１で消化し、該ベクター内に連結して、分割ベータ−ラクタマーゼ遺伝子を得た。ついでｐＢＣＳ ＡｖｒＸをＢａｍＨ１／Ｓａｃ１で消化し、Ｇｉｎ１２７−Ｎ−スタファー−Ａｖｒ１５をＢａｍＨ１／Ｓａｃ１で消化し、該ベクター内に連結して、Ｇｉｎ１２７−Ｎ−スタファー−Ａｖｒ１５−Ｘを得た。該スタファーをＮ−１ ＴＡＬＥヘアピンにおける進化のためにＮｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、Ｎ０ ＴＡＬＥヘアピンにおける進化のためにＮｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化した。
既に報告されているＴＡＬＥ−Ｒ系をこの研究に適合化した。簡潔に説明すると、ｐＢＣＳ（クロラムフェニコールおよびカルベニシリン耐性遺伝子を含有する）をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓｐｅ１で消化した。対をなすリコンビナーゼ部位を含有するスタファー（Ａｖｒ Ｘ；ここで、ＸはＮ０塩基である）をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａ１で消化し、該ベクター内に連結して、分割ベータ−ラクタマーゼ遺伝子を得た。ついでｐＢＣＳ ＡｖｒＸをＢａｍＨ１／Ｓａｃ１で消化し、Ｇｉｎ１２７−Ｎ−スタファー−Ａｖｒ１５をＢａｍＨ１／Ｓａｃ１で消化し、該ベクター内に連結して、Ｇｉｎ１２７−Ｎ−スタファー−Ａｖｒ１５−Ｘを得た。該スタファーをＮ−１ ＴＡＬＥヘアピンにおける進化のためにＮｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、Ｎ０ ＴＡＬＥヘアピンにおける進化のためにＮｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化した。
ＴＡＬＥ ＮＴＤ進化ライブラリーの作製
プライマーｐｔａｌ１２７ Ｎｏｔ１ ｆｗｄおよびリバースプライマーＫＸＸＧ ｌｉｂ ｒｅｖまたはＫＸＸＸＸ ｌｉｂ ｒｅｖを使用してＮ−１ ＴＡＬＥヘアピンにおけるＮ末端変異体を得、ついでＮｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、ついで、消化されたＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸ内に連結した。フォワードプライマーｐｔａｌ１２７ Ｎｏｔ１ ｆｗｄおよびリバースプライマーＫＲＧＧ Ｌｉｂ Ｒｅｖを使用して、Ｎ０ ＴＡＬＥヘアピンにおける突然変異を有するライブラリーをＰＣＲ増幅した。ついでこれをＮｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化し、Ｎｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化されたＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸ内に連結した。
プライマーｐｔａｌ１２７ Ｎｏｔ１ ｆｗｄおよびリバースプライマーＫＸＸＧ ｌｉｂ ｒｅｖまたはＫＸＸＸＸ ｌｉｂ ｒｅｖを使用してＮ−１ ＴＡＬＥヘアピンにおけるＮ末端変異体を得、ついでＮｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、ついで、消化されたＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸ内に連結した。フォワードプライマーｐｔａｌ１２７ Ｎｏｔ１ ｆｗｄおよびリバースプライマーＫＲＧＧ Ｌｉｂ Ｒｅｖを使用して、Ｎ０ ＴＡＬＥヘアピンにおける突然変異を有するライブラリーをＰＣＲ増幅した。ついでこれをＮｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化し、Ｎｏｔ１／Ｓｐｈ１で消化されたＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸ内に連結した。
ＴＡＬＥ−Ｒ ＮＴＤ進化アッセイ
ラウンド１の連結物をエタノール沈殿させ、エレクトロコンピテント Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞内に形質転換し、ついでＳＯＣ内に１時間回収した。該細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含有する１００ｍｌのスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ）（ＳＢ）培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によりＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡ（Ｒｄ １投入物）をエレクトロコンピテントＴｏｐ１０Ｆ’細胞内に形質転換し、細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含有する１００ｍｌのＳＢ培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によりプラスミドＤＮＡを単離した。ラウンド１産物をＮｏｔ１／Ｘｂａ１で消化し、相補的付着末端を有するＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸベクター内に連結した。コンセンサス配列が観察される場合には、このプロトコールを３〜４回繰返し、クローンを特徴づけした。
ラウンド１の連結物をエタノール沈殿させ、エレクトロコンピテント Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞内に形質転換し、ついでＳＯＣ内に１時間回収した。該細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含有する１００ｍｌのスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ）（ＳＢ）培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によりＤＮＡを単離した。得られたプラスミドＤＮＡ（Ｒｄ １投入物）をエレクトロコンピテントＴｏｐ１０Ｆ’細胞内に形質転換し、細胞を、１００ｍｇ／ｍｌ カルベニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含有する１００ｍｌのＳＢ培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によりプラスミドＤＮＡを単離した。ラウンド１産物をＮｏｔ１／Ｘｂａ１で消化し、相補的付着末端を有するＧｉｎ１２７−ＡｖｒＸベクター内に連結した。コンセンサス配列が観察される場合には、このプロトコールを３〜４回繰返し、クローンを特徴づけした。
Ｎ末端ＴＡＬＥＮ活性の測定
それぞれの可能な塩基を含有する４個のＴＡＬＥＮペアを、ゴールデン・ゲイト法を用いて作製した。融合ＡおよびＢプラスミドを第２ゴールデン・ゲイト反応によりＧｏｌｄｙ ＴＡＬＥＮ（Ｎ Δ１５２／Ｃ ＋６３）フレームワーク内に直接的に連結した。ｐＣＡＧベクターをＢｇｌＩ／Ｎｓｉ１で消化し、ＢｇｌＩＩ／Ｎｓｉ１で消化されたＰＣＲ増幅ＮＴＤに連結することにより、ＮＴＤを修飾した。ＴＡＬＥＮペア（それぞれ５０〜７５ｎｇのＴＡＬＥＮ／ウェル）を９６ウェルプレートのウェル内のＨｅＬａ細胞内に１．５×１０４細胞／ウェルの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃のインキュベーター内で２４時間配置し、ついで３０℃で２日間、ついで３７℃で２４時間配置した。公開されている方法によりゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ突然変異率をセル・サーベヤー（Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイおよび配列決定により定量した。細胞アッセイのために、まず、プライマーＣＣＲ５外側ｆｗｄ／ＣＣＲ５外側ｒｅｖを使用し、ついでＣＣＲ５内側ｆｗｄ／ＣＣＲ５内側ｒｅｖを使用するネステッドＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅した。ついで断片をＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１で消化し、相補的に消化されたｐＵＣ１９内に連結した。
それぞれの可能な塩基を含有する４個のＴＡＬＥＮペアを、ゴールデン・ゲイト法を用いて作製した。融合ＡおよびＢプラスミドを第２ゴールデン・ゲイト反応によりＧｏｌｄｙ ＴＡＬＥＮ（Ｎ Δ１５２／Ｃ ＋６３）フレームワーク内に直接的に連結した。ｐＣＡＧベクターをＢｇｌＩ／Ｎｓｉ１で消化し、ＢｇｌＩＩ／Ｎｓｉ１で消化されたＰＣＲ増幅ＮＴＤに連結することにより、ＮＴＤを修飾した。ＴＡＬＥＮペア（それぞれ５０〜７５ｎｇのＴＡＬＥＮ／ウェル）を９６ウェルプレートのウェル内のＨｅＬａ細胞内に１．５×１０４細胞／ウェルの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃のインキュベーター内で２４時間配置し、ついで３０℃で２日間、ついで３７℃で２４時間配置した。公開されている方法によりゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ突然変異率をセル・サーベヤー（Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイおよび配列決定により定量した。細胞アッセイのために、まず、プライマーＣＣＲ５外側ｆｗｄ／ＣＣＲ５外側ｒｅｖを使用し、ついでＣＣＲ５内側ｆｗｄ／ＣＣＲ５内側ｒｅｖを使用するネステッドＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅した。ついで断片をＢａｍＨ１／ＥｃｏＲ１で消化し、相補的に消化されたｐＵＣ１９内に連結した。
ＴＡＬＥ−ＴＦおよびルシフェラーゼアッセイ
該リコンビナーゼ選択からの変異体ＮＴＤをプライマーでｐｔａｌ１２７ ＳＦＩ ｆｗｄおよびＮ−Ｔｅｒｍ Ｓｐｈ１でＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物を増幅し、Ｎｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、ｐＴＡＬ１２７−ＳＦＩ Ａｖｒｌ５（これは、ｐＴＡＬ１２７−ＳＦＩ Ａｖｒ１５からｐｃＤＮＡ ３．０ ＶＰ６４内へのＮ末端修飾ＴＡＬＥの転移を促進する、対になったＳＦＩ−１消化部位を含有する）内に連結した。対応するＴＡＬＥ結合部位を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流のｐＧＬ３ベーシック（Ｂａｓｉｃ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。各アッセイのために、リポフェクチミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の仕様に従い使用して、１００ｎｇのｐｃＤＮＡを５ｎｇのｐＧＬ３ベクターおよび１ｎｇのｐＲＬ レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照ベクターで９６ウェルプレートのウェル内のＨＥＫ２９３ｔ細胞内にコトランスフェクトした。４８時間後、細胞を洗浄し、細胞溶解し、ベリタス・マイクロプレート（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で二重ルシフェラーゼレポーター系（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を評価した。トランスフェクションを３回重複して行い、結果を平均した。
該リコンビナーゼ選択からの変異体ＮＴＤをプライマーでｐｔａｌ１２７ ＳＦＩ ｆｗｄおよびＮ−Ｔｅｒｍ Ｓｐｈ１でＰＣＲ増幅した。該ＰＣＲ産物を増幅し、Ｎｏｔ１／Ｓｔｕ１で消化し、ｐＴＡＬ１２７−ＳＦＩ Ａｖｒｌ５（これは、ｐＴＡＬ１２７−ＳＦＩ Ａｖｒ１５からｐｃＤＮＡ ３．０ ＶＰ６４内へのＮ末端修飾ＴＡＬＥの転移を促進する、対になったＳＦＩ−１消化部位を含有する）内に連結した。対応するＴＡＬＥ結合部位を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流のｐＧＬ３ベーシック（Ｂａｓｉｃ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。各アッセイのために、リポフェクチミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の仕様に従い使用して、１００ｎｇのｐｃＤＮＡを５ｎｇのｐＧＬ３ベクターおよび１ｎｇのｐＲＬ レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ対照ベクターで９６ウェルプレートのウェル内のＨＥＫ２９３ｔ細胞内にコトランスフェクトした。４８時間後、細胞を洗浄し、細胞溶解し、ベリタス・マイクロプレート（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で二重ルシフェラーゼレポーター系（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性を評価した。トランスフェクションを３回重複して行い、結果を平均した。
ＭＢＰ−ＴＡＬＥアッセイ
ビオチン化オリゴヌクレオチドへのＭＢＰ−ＴＡＬＥ結合のアフィニティアッセイを、既に記載されている方法を用いて行った。簡潔に説明すると、ＡｖｒＸａ７ ＴＡＬＥドメインをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞内でｐＭＡＬ ＭＢＰ−ＡｖｒＸａ７プラスミドから発現させ、アミロース樹脂上で精製した。修飾残基を有する標的ＡｖｒＸａ７標的部位を含有するビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して、サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ形態においてＴＡＬＥ結合活性を決定した。ＭＢＰ置換基を標的化する抗体をアッセイ現像のために使用した。
ビオチン化オリゴヌクレオチドへのＭＢＰ−ＴＡＬＥ結合のアフィニティアッセイを、既に記載されている方法を用いて行った。簡潔に説明すると、ＡｖｒＸａ７ ＴＡＬＥドメインをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞内でｐＭＡＬ ＭＢＰ−ＡｖｒＸａ７プラスミドから発現させ、アミロース樹脂上で精製した。修飾残基を有する標的ＡｖｒＸａ７標的部位を含有するビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して、サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ形態においてＴＡＬＥ結合活性を決定した。ＭＢＰ置換基を標的化する抗体をアッセイ現像のために使用した。
結果
５’Ｔ規則の予備分析
ＰｔｈＸｏ７ ＤＮＡ配列に結合しているＴＡＬＥタンパク質の最近の結晶構造は、Ｎ−１ヘアピン内のＷ２３２とＤＮＡ基質の接触領域の５’末端のチミジン（Ｎ０塩基）との間の特有の相互作用を明らかにした。この研究は、ＴＡＬＥコードが最初に解読された際に報告された既に確立されている５’Ｔ規則の構造的基礎を示した（図１８ＡおよびＢ）。ＴＡＬＥＮの標的配列の第１塩基の重要性に関する矛盾するデータが存在する。標的ＤＮＡにおける５’Ｔの要件を、まず、Ｇｉｎ３２Ｇコアに隣接した全ての可能な５’残基を有する４個のＡｖｒＸａ７結合部位を含有する分割ベータラクタマーゼＴＡＬＥリコンビナーゼ選択ベクターを使用するＴＡＬＥ−Ｒのコンテキストにおいて評価した（図１８Ｃ）。ついでＴＡＬＥ−ＴＦによるＮ０残基の認識を、それぞれの可能な５’残基を含有する認識部位を有する五量体ＡｖｒＸａ７プロモーター領域を含有するルシフェラーゼレポーターベクターを使用して評価した（図１８Ｄ）。５’Ｔ以外の塩基では、５’Ｔを含有する配列と比較してＴＡＬＥ−Ｒにおいては＞１００倍までの、そしてＴＡＬＥ−ＴＦにおいては１０００倍の活性の低下を観察した（図１８ＣおよびＤ）。著しく短縮したＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の存在下では特に、５’Ｔの偏りを除去すると報告されているこれらのキメラのＣ末端構造における変異にもかかわらず、これらの低下が観察された。酵素結合イムノソルベントアッセイも、非Ｔ５’残基を有する標的オリゴヌクレオチドに対するＭＢＰ−ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性タンパク質のアフィニティの低下を示した（図１８Ｅ）。最後に、非Ｔ５’ヌクレオチドを有する標的に対する野生型ＮＴＤを有する設計されたＴＡＬＥＮの活性の検査は、５’Ｔを有するものと比較して１０倍の活性低下を示した（図１８Ｆ）。結果は、５’Ｔが、リコンビナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼおよび単純なＤＮＡ結合性タンパク質の場合における最大限に有効なＴＡＬＥドメインのための重要な設計パラメータであることを示している。
５’Ｔ規則の予備分析
ＰｔｈＸｏ７ ＤＮＡ配列に結合しているＴＡＬＥタンパク質の最近の結晶構造は、Ｎ−１ヘアピン内のＷ２３２とＤＮＡ基質の接触領域の５’末端のチミジン（Ｎ０塩基）との間の特有の相互作用を明らかにした。この研究は、ＴＡＬＥコードが最初に解読された際に報告された既に確立されている５’Ｔ規則の構造的基礎を示した（図１８ＡおよびＢ）。ＴＡＬＥＮの標的配列の第１塩基の重要性に関する矛盾するデータが存在する。標的ＤＮＡにおける５’Ｔの要件を、まず、Ｇｉｎ３２Ｇコアに隣接した全ての可能な５’残基を有する４個のＡｖｒＸａ７結合部位を含有する分割ベータラクタマーゼＴＡＬＥリコンビナーゼ選択ベクターを使用するＴＡＬＥ−Ｒのコンテキストにおいて評価した（図１８Ｃ）。ついでＴＡＬＥ−ＴＦによるＮ０残基の認識を、それぞれの可能な５’残基を含有する認識部位を有する五量体ＡｖｒＸａ７プロモーター領域を含有するルシフェラーゼレポーターベクターを使用して評価した（図１８Ｄ）。５’Ｔ以外の塩基では、５’Ｔを含有する配列と比較してＴＡＬＥ−Ｒにおいては＞１００倍までの、そしてＴＡＬＥ−ＴＦにおいては１０００倍の活性の低下を観察した（図１８ＣおよびＤ）。著しく短縮したＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の存在下では特に、５’Ｔの偏りを除去すると報告されているこれらのキメラのＣ末端構造における変異にもかかわらず、これらの低下が観察された。酵素結合イムノソルベントアッセイも、非Ｔ５’残基を有する標的オリゴヌクレオチドに対するＭＢＰ−ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性タンパク質のアフィニティの低下を示した（図１８Ｅ）。最後に、非Ｔ５’ヌクレオチドを有する標的に対する野生型ＮＴＤを有する設計されたＴＡＬＥＮの活性の検査は、５’Ｔを有するものと比較して１０倍の活性低下を示した（図１８Ｆ）。結果は、５’Ｔが、リコンビナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼおよび単純なＤＮＡ結合性タンパク質の場合における最大限に有効なＴＡＬＥドメインのための重要な設計パラメータであることを示している。
非Ｔ５’残基を含有させるためのＴＡＬＥ ＮＴＤの進化
ＤＮＡ認識のための、より柔軟な系を得るために、最近開発されたＴＡＬＥ−Ｒ選択系を使用してＴＡＬＥのＮＴＤを進化させて５’Ｔ制約を排除しうると仮定した（図２３）。ランダム化された残基Ｋ２３０〜Ｇ２３４を有するライブラリーを作製し、それぞれの可能な５’塩基に対する活性を有するＴＡＬＥ−Ｒを数ラウンドの選択の後で単離した（図１９Ａ〜Ｃ）。最も活性な選択されたクローンはＫ２３０およびＧ２３４の強力な保存性を示した。前者はＤＮＡホスファートバックボーンと接触可能であり、後者はヘアピンループ形成に影響を及ぼしうる（図２４）。ライブラリーＫ２３０〜Ｗ２３２においては、Ｋ２３０Ｓが頻繁に観察されたが、個別にアッセイされたほぼ全ての変異体においてＫ２３０ＲまたはＫ２３０変異体より遥かに低い活性を示した。Ｗ２３２〜Ｒ２３２突然変異を伴うと観察された幾つかのうちの１つのクローン（ＮＴ−Ｇ）は、５’Ｔから５’Ｇへの、選択性の有意な変化を示した。該配列は、この領域における最近記載されたラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ＴＡＬＥタンパク質のＮＴＤのものに類似している。植物転写因子レポーター遺伝子調節の場合における該ラルストニアＮＴＤはその基質において５’Ｇを好むと報告されている（タンパク質アライメントは図２５を参照されたい）。５’Ｇに対するＮＴ−Ｇのストリンジェンシー（厳密さ）により示されるとおり、残基Ｒ２３２はＧ塩基に特異的に接触しうる。５’Ｇに関するＮＴ−Ｇの優先性は５’Ｔに関する野生型ドメインの特異性と比較しうるものであった。５’Ａまたは５’Ｃに特異的なＮＴＤ変異体は誘導不可能であったが、高い活性を維持し任意の５’残基を有する基質を受容するＫ２６５−Ｇ２６８ Ｎ０ヘアピンに類似している許容性ＮＴＤであるＮＴ−αＮが得られた。この変異体は、野生型ＮＴＤと比較して増強した、ＤＮＡホスファートバックボーンとの非特異的接触をもたらして、特異的５’残基と接触することなくＴＡＬＥ−ＤＮＡ複合体の全結合を増強すると仮定された。短縮ヘアピン構造は、５’Ａまたは５’Ｃ残基に対する特異性を有する変異体の選択を可能にすると仮定された。Ｑ２３１−Ｗ２３２におけるランダム化および残基２３３の欠失を有するライブラリーを、推定ＤＮＡ結合ループを短縮するように設計した。リコンビナーゼ選択は、幾つかのクローンにおいて高い活性を示す高度に保存されたＱ２３１Ｙ突然変異を示した（図１９Ｄ）。特に、ＮＴ−βＮは、野生型ＮＴＤを有するＴＡＬＥと比較して、５’Ａ、ＣおよびＧを有する基質に対する活性の改善を示したが、５’Ｔ基質に対する活性を低減した（図１９Ｅ）。
ＤＮＡ認識のための、より柔軟な系を得るために、最近開発されたＴＡＬＥ−Ｒ選択系を使用してＴＡＬＥのＮＴＤを進化させて５’Ｔ制約を排除しうると仮定した（図２３）。ランダム化された残基Ｋ２３０〜Ｇ２３４を有するライブラリーを作製し、それぞれの可能な５’塩基に対する活性を有するＴＡＬＥ−Ｒを数ラウンドの選択の後で単離した（図１９Ａ〜Ｃ）。最も活性な選択されたクローンはＫ２３０およびＧ２３４の強力な保存性を示した。前者はＤＮＡホスファートバックボーンと接触可能であり、後者はヘアピンループ形成に影響を及ぼしうる（図２４）。ライブラリーＫ２３０〜Ｗ２３２においては、Ｋ２３０Ｓが頻繁に観察されたが、個別にアッセイされたほぼ全ての変異体においてＫ２３０ＲまたはＫ２３０変異体より遥かに低い活性を示した。Ｗ２３２〜Ｒ２３２突然変異を伴うと観察された幾つかのうちの１つのクローン（ＮＴ−Ｇ）は、５’Ｔから５’Ｇへの、選択性の有意な変化を示した。該配列は、この領域における最近記載されたラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ＴＡＬＥタンパク質のＮＴＤのものに類似している。植物転写因子レポーター遺伝子調節の場合における該ラルストニアＮＴＤはその基質において５’Ｇを好むと報告されている（タンパク質アライメントは図２５を参照されたい）。５’Ｇに対するＮＴ−Ｇのストリンジェンシー（厳密さ）により示されるとおり、残基Ｒ２３２はＧ塩基に特異的に接触しうる。５’Ｇに関するＮＴ−Ｇの優先性は５’Ｔに関する野生型ドメインの特異性と比較しうるものであった。５’Ａまたは５’Ｃに特異的なＮＴＤ変異体は誘導不可能であったが、高い活性を維持し任意の５’残基を有する基質を受容するＫ２６５−Ｇ２６８ Ｎ０ヘアピンに類似している許容性ＮＴＤであるＮＴ−αＮが得られた。この変異体は、野生型ＮＴＤと比較して増強した、ＤＮＡホスファートバックボーンとの非特異的接触をもたらして、特異的５’残基と接触することなくＴＡＬＥ−ＤＮＡ複合体の全結合を増強すると仮定された。短縮ヘアピン構造は、５’Ａまたは５’Ｃ残基に対する特異性を有する変異体の選択を可能にすると仮定された。Ｑ２３１−Ｗ２３２におけるランダム化および残基２３３の欠失を有するライブラリーを、推定ＤＮＡ結合ループを短縮するように設計した。リコンビナーゼ選択は、幾つかのクローンにおいて高い活性を示す高度に保存されたＱ２３１Ｙ突然変異を示した（図１９Ｄ）。特に、ＮＴ−βＮは、野生型ＮＴＤを有するＴＡＬＥと比較して、５’Ａ、ＣおよびＧを有する基質に対する活性の改善を示したが、５’Ｔ基質に対する活性を低減した（図１９Ｅ）。
進化ＴＡＬＥ ＮＴＤの用途
デザイナーＴＡＬＥ融合タンパク質の用途における進化ＮＴＤの移植性（ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために、最適化ＮＴＤをＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＥおよびＴＡＬＥＮ内に組込んだ。ＮＴ−Ｇ、ＮＴ−αＮおよびＮＴ−βΝドメインを含有するＴＡＬＥ−ＴＦは、ＮＴ−Ｔドメインを含有するＴＡＬＥ−ＴＦと比較して、５’Ｔ残基を有さない作用部位を含有するルシフェラーゼ標的遺伝子の転写活性化における４００〜１５００倍の増加を示した。ＮＴ−Ｇに基づくＴＦは、ＴＡＬＥ−Ｒ選択系において観察されるとおり、５’Ｇ選択性を保有していた。全ての５’ヌクレオチドに対するＮＴ−αＮおよびＮＴ−βＮに基づくＴＦの活性は、リコンビナーゼ形態において観察された相対活性の跡を追うものであった（図２０）。ＭＢＰ−ＴＡＬＥはまた、５’Ｔを有さない部位を含有する標的オリゴヌクレオチドに対して、野生型ＭＢＰ−ＴＡＬＥより大きな相対結合アフィニティを示し（図２６）、選択されたドメインが非チミジン５’塩基の認識および非チミジン５’塩基に対する許容性を増強したという更なる証拠を与えている。
デザイナーＴＡＬＥ融合タンパク質の用途における進化ＮＴＤの移植性（ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために、最適化ＮＴＤをＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＥおよびＴＡＬＥＮ内に組込んだ。ＮＴ−Ｇ、ＮＴ−αＮおよびＮＴ−βΝドメインを含有するＴＡＬＥ−ＴＦは、ＮＴ−Ｔドメインを含有するＴＡＬＥ−ＴＦと比較して、５’Ｔ残基を有さない作用部位を含有するルシフェラーゼ標的遺伝子の転写活性化における４００〜１５００倍の増加を示した。ＮＴ−Ｇに基づくＴＦは、ＴＡＬＥ−Ｒ選択系において観察されるとおり、５’Ｇ選択性を保有していた。全ての５’ヌクレオチドに対するＮＴ−αＮおよびＮＴ−βＮに基づくＴＦの活性は、リコンビナーゼ形態において観察された相対活性の跡を追うものであった（図２０）。ＭＢＰ−ＴＡＬＥはまた、５’Ｔを有さない部位を含有する標的オリゴヌクレオチドに対して、野生型ＭＢＰ−ＴＡＬＥより大きな相対結合アフィニティを示し（図２６）、選択されたドメインが非チミジン５’塩基の認識および非チミジン５’塩基に対する許容性を増強したという更なる証拠を与えている。
ついで該最適化ＮＴＤのうちの４つをＧｏｄｙ ＴＡＬＥＮフレームワーク内に移入した。これらの実験の場合、ＣＣＲ５遺伝子のΔ３２遺伝子座のコンテキストにおいて４つの基質を構築した（図２１Ａ）。各基質は異なる５’残基を含有していた。実験は、遺伝子編集活性の基準物として、５’Ｔに対する特異性を有する野生型（ＮＴ−Ｔ）およびｄＨａｘ３ ＮＴＤ［ｄＨａｘ３は、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）から単離された一般に使用されるＮＴＤ変異体である］を有するＴＡＬＥＮを含んでいた。該変異体ＮＴＤの活性増強寄与を決定するために、可能な限り高いＲＶＤ相同性（５０〜９０％）を保有するように該基質ＴＡＬＥＮペアを設計した（図２１Ａ）。
配列決定により、および細胞（Ｃｅｌｌ）アッセイを用いることにより、ＴＡＬＥＮの活性を分析した。選択されたドメインは、野生型ドメインを含有するＴＡＬＥＮの活性と比較した場合、非Ｔ５’残基に対して２〜９倍の遺伝子編集活性の増強を示した（図２１および図２７）。野生型またはｄＨａｘ３ ＮＴＤを有するＴＡＬＥＮペアＴ１／Ｔ２に対して、活性は最高であった。ＴＡＬＥＮペア基質Ｇ１／Ｇ２は、ＮＴ−αＮ、ＮＴ−βＮおよびＮＴ−Ｇを有するＴＡＬＥＮにより、ＮＴ−Ｔと比べて２．０〜３．５倍の増強を伴って最も効果的にプロセシングされた。ＮＴ−αＮは、ＴＡＬＥＮペアＡ１／Ａ２およびＣ１／Ｃ２に対して、野生型ＮＴ−Ｔよりそれぞれ９倍および２倍高い活性を示した。５’残基におけるミスマッチの影響は、ＴＡＬＥＮにおいては、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＴＡＬＥ−Ｒフレームワークの場合より限られたものであるが、該最適化ＮＴＤは、遺伝子編集実験において使用された場合にＴＡＬＥＮ活性を著しく改善した。
考察
全てではないがほとんどの過去の研究は、最適ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの設計における最も５’側の残基としてチミジンが要求されることを示唆している。本明細書に記載されている分析は、機能的ＴＡＬＥ融合タンパク質の構築にはチミジンが最適であり、幾つかの場合には決定的に重要であることを示している。したがって、この要件は、ＴＡＬＥ転写因子、ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼキメラで有効に標的化されうる配列に対して制約を課す。この要件は理論的には、遺伝子ノックアウトを誘発するためのＴＡＬＥＮの使用に小さな制約を課すものであるが、それらの広範なスペーサー領域許容性を考慮すると、任意の５’残基を含みうるＮＴＤは有効なＴＡＬＥ構築のための規則を更に単純化し、ゲノム操作およびインタロゲーションのために厳密なＴＡＬＥ配置を要求する用途［例えば、ＴＡＬＥＮを使用する一定の塩基対におけるＤＮＡの厳密な切断、ＴＡＬＥＲ−リコンビナーゼによる継ぎ目の無い遺伝子挿入および交換、特異的内因性ＤＮＡ配列から天然ＤＮＡ結合性タンパク質を置換除去して、それらの機能的役割を調べること、経路操作のための直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）転写因子の開発、転写因子配置が鍵となる天然および合成遺伝子の相乗的活性化、ならびに多数の他の用途］を著しく増大させるであろう。ＤＮＡに基づくナノテクノロジーにおける他の用途には、特異的ＤＮＡ結合性タンパク質でのＤＮＡナノ構造／折紙の装飾が含まれる。この場合、特定の部位への標的化はＤＮＡフォールディング／構造に基づいて制限され、したがって、任意の部位に結合可能であることが決定的に重要である。ＤＮＡ結合性タンパク質でのこれらの構造および装置の加工は、機能を拡張するための魅惑的なアプローチでありうるであろう。実際、全ての標的化制約が排除されれば、ＤＮＡ結合性タンパク質およびその融合体の多数の用途を想像することは困難ではない。これらの潜在的用途により鼓舞されて、本発明者らは、任意の塩基で始まる部位の標的化を可能にするＮＴＤを開発することを目標とした。
全てではないがほとんどの過去の研究は、最適ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの設計における最も５’側の残基としてチミジンが要求されることを示唆している。本明細書に記載されている分析は、機能的ＴＡＬＥ融合タンパク質の構築にはチミジンが最適であり、幾つかの場合には決定的に重要であることを示している。したがって、この要件は、ＴＡＬＥ転写因子、ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼキメラで有効に標的化されうる配列に対して制約を課す。この要件は理論的には、遺伝子ノックアウトを誘発するためのＴＡＬＥＮの使用に小さな制約を課すものであるが、それらの広範なスペーサー領域許容性を考慮すると、任意の５’残基を含みうるＮＴＤは有効なＴＡＬＥ構築のための規則を更に単純化し、ゲノム操作およびインタロゲーションのために厳密なＴＡＬＥ配置を要求する用途［例えば、ＴＡＬＥＮを使用する一定の塩基対におけるＤＮＡの厳密な切断、ＴＡＬＥＲ−リコンビナーゼによる継ぎ目の無い遺伝子挿入および交換、特異的内因性ＤＮＡ配列から天然ＤＮＡ結合性タンパク質を置換除去して、それらの機能的役割を調べること、経路操作のための直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）転写因子の開発、転写因子配置が鍵となる天然および合成遺伝子の相乗的活性化、ならびに多数の他の用途］を著しく増大させるであろう。ＤＮＡに基づくナノテクノロジーにおける他の用途には、特異的ＤＮＡ結合性タンパク質でのＤＮＡナノ構造／折紙の装飾が含まれる。この場合、特定の部位への標的化はＤＮＡフォールディング／構造に基づいて制限され、したがって、任意の部位に結合可能であることが決定的に重要である。ＤＮＡ結合性タンパク質でのこれらの構造および装置の加工は、機能を拡張するための魅惑的なアプローチでありうるであろう。実際、全ての標的化制約が排除されれば、ＤＮＡ結合性タンパク質およびその融合体の多数の用途を想像することは困難ではない。これらの潜在的用途により鼓舞されて、本発明者らは、任意の塩基で始まる部位の標的化を可能にするＮＴＤを開発することを目標とした。
５’−Ｔ制約を排除するためにＴＡＬＥのＮＴＤを進化させるために、最近開発されたＴＡＬＥ−Ｒ系を使用した。３ラウンドの選択において、５’Ｇに対する特異性を有するＮＴＤを得た。５’Ａまたは５’Ｃを認識する変異体を得るために、多数の選択を行った。Ｇ２３０−Ｋ２３４ヘアピンを逆転さえ、Ｋ２３０−Ｇ２３４／ｉｎｓ２３２ヘアピンを拡張させ、Ｋ２６５−Ｇ２６８ Ｎ０ヘアピンの修飾を試み、ランダム突然変異誘発を評価した。本発明者らは、５’Ａおよび５’Ｃ残基の両方を有する基質を許容可能なアフィニティで認識する欠失を有するＮＴＤ、ＮＴ−βＮを特定したが、これらの方法はいずれも、５’Ａまたは５’Ｃを有する標的配列に対するアフィニティを有するＮＴＤを与えなかった。ＮＴＤ ＮＴ−ＴおよびＮＴ−Ｇにより示された強力な選択優先性ならびにＮＴ−ＴにおけるＷ２３２およびＮＴ−ＧにおけるＲ２３２の重要性はＤＮＡ認識配列の５’末端残基とこれらのアミノ酸の特異的相互作用によるものであるらしい。ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＴＡＬＥのストリンジェンシーが５’Ｇを要すること、およびＮＴ−Ｇにおける２３２に類似した位置にアルギニンを含有する比較しうるＮ−１ヘアピンであると思われるものをＮＴ−Ｇとの配列アライメントが示すことが最近報告された（図２５）。ＮＴＤ Ｂｒｇｌ１およびＮＴ−Ｔ間の高い構造的相同性ゆえに、単純なアルギニンからトリプトファンへの突然変異によりチミンに対するラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）ＴＡＬＥ ＮＴＤの優先性を修飾すること、またはＮＴ−αＮもしくはＮＴ−βＮドメインをこの関連タンパク質内にグラフティングすることにより特異性を排除することが可能でありうる。アルギニン−グアニン相互作用が進化ジンクフィンガーにおいて一般的であることに注目することも興味深い。
選択された変異体ＮＴＤはＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ内に成功裏に移入され、リコンビナーゼ進化系からのデータに基づいて予想される活性および特異性を概ね付与した。最適化ＮＴＤを有するＴＡＬＥ−ＴＦは、非Ｔ５’残基を有するＡｖｒＸａ７プロモーター部位に対するＮＴ−Ｔの活性と比較して、ＴＡＬＥ活性化を４００〜１５００倍増強した。ＴＡＬＥＮ内に組込まれた場合、非Ｔ選択性を有する本発明者らのＮＴＤは、５’Ａ、ＣまたはＧを有する基質上のＮＴ−Ｔドメインのものと比較して、活性を２〜９倍増強した。ＴＡＬＥＮ遺伝子編集の増強は、一般に、ＴＡＬＥ−ＲおよびＴＡＬＥ−ＴＦ構築物において観察される活性の増強と相関する。ＴＡＬＥＮペアＡ１／Ａ２、Ｃ１／Ｃ２およびＴ１／Ｔ２でのアッセイにおいて、より低い活性により証明されるとおり、ＮＴ−Ｇの特異性および高活性は維持され、また、ＮＴ−αＮおよびＮＴ−βＮの一般に高い活性がＴＡＬＥＮ Δ１５２／＋６３構造内に付与された。
合成ＴＡＬＥ ＲＶＤドメインを有する選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）トランケート化ＴＡＬＥはＤＮＡ基質内に５’Ｔを要しないことが最近報告された。報告されたΔ１４３，＋４７トランケーションはＧｏｌｄｙ ＴＡＬＥ−ＴＦとして構築され、Δ１２７，＋９５トランケーション（これは他の研究者により最も一般的に使用されており、本発明者らの研究において用いられたトランケーションの組合せである）の場合より実質的に低い、ＡｖｒＸａ７基質に対する活性が観察された（図２９）。したがって、報告された結果における相違は、用いられたトランケート化構造によるものでありうるであろう。
要約すると、設計されたＴＡＬＥの結合および活性のためのＤＮＡ基質における５’チミジンの重要性がＴＡＬＥ−Ｒ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＭＢＰ−ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮキメラの場合に決定された。基質ＤＮＡの最も５’側の塩基としてチミン以外の塩基を認識するＴＡＬＥ ＮＴＤを操作するために、標的化突然変異誘発およびＴＡＬＥ−Ｒ選択を適用した。ここで開発された操作ＴＡＬＥドメインはモジュール性を示し、ＴＡＬＥ−ＴＦおよびＴＡＬＥＮ構造において高活性であった。結合部位に関する厳格な幾何学的要件を有し、Ｎ０塩基の種類に対して高感受性である、現在のＴＡＬＥ−Ｒにより標的化されうる部位数を、これらの新規ＮＴＤは〜１５倍増大させた。更に、正確な結合が鍵となりうる遺伝子調節、内因性ＤＮＡ結合性タンパク質の置換および合成生物学用途を促進させる、任意のＤＮＡ配列におけるＴＡＬＥ ＤＢＤおよびＴＡＬＥ−ＴＦの正確な配置を、それらは今や可能にする。天然ＮＴＤに基づくＴＡＬＥＮはＮ０塩基置換の種々の度合の許容性を示すが、該データは、ここで報告されている新規ＮＴＤが、天然のＮＴＤに基づくＴＡＬＥＮより高い効率の遺伝子編集を促進することを示している。
実施例５
キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ
以下の材料および方法を用いた。
キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ
以下の材料および方法を用いた。
分割遺伝子再構築ベクター（ｐＢＬＡ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から誘導し、クロラムフェニコール耐性遺伝子および分断ＴＥＭ−１ ｐ ラクタマーゼ遺伝子をｌａｃプロモーターの制御下で含有するように修飾した。既に記載されているとおりにＺＦＲ標的部位を導入した。簡潔に説明すると、ＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプライマーＧＦＰ−ＺＦＲ−ＸｂａＩ−ＦｗｄおよびＧＦＰ−ＺＦＲ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲｅｖでＰＣＲ増幅し、ｐＢＬＡのＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位内にクローニングしてｐＢＬＡ−ＺＦＲ基質を得た。全てのプライマー配列を表８に示す。
ルシフェラーゼレポータープラスミドを作製するために、ＳＶ４０プロモーターをプライマーＳＶ４０−ＺＦＲ−ＢｇｌＩＩＩ−ＦｗｄおよびＳＶ４０−ＺＦＲ−Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＲｅｖでｐＧＬ３−Ｐｒｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを消化し、ｐＧＬ３−Ｐｒｍの同じ制限部位内に連結してｐＧＬ３−ＺＦＲ−１、２、３．．．１８を得た。ｐＢＰＳ−ＺＦＲ供与プラスミドを、ＺＦＲ−１、２および３リコンビナーゼ部位がプライマー３’ＣＭＶ−ＰｓｔＩ−ＺＦＲ−１、２または３−Ｒｅｖによりコードされている点以外は既に記載されているとおりに構築した。各プラスミドの正しい構築が配列分析により確認された。
組換えアッセイ
既に記載されているとおりに、ＰＣＲによりＺＦＲを構築した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＢＬＡの同じ制限部位内に連結した。連結物をエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。ＳＯＣ培地内での１時間の回収の後、細胞を、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールを含有する５ｍＬ ＳＢ培地と共にインキュベートし、３７℃で培養した。１６時間の時点で、細胞を集め、プラスミドＤＮＡをミニプレップ（Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離し、２００ｎｇのｐＢＬＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＳＯＣにおける１時間の回収の後、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールまたは３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールおよび１００∧ｇｍＬ−１のカルベニシリン（アンピシリン類似体）を含有する固体ＬＢ培地上で細胞をプレーティングした。クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有するＬＢ培地上のコロニーの数を、クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地上のコロニーの数で割り算したものとして、組換えを判定した。コロニー数は、ＧｅｌＤｏｃ ＸＲイメージングシステム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する自動計数により決定した。
既に記載されているとおりに、ＰＣＲによりＺＦＲを構築した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＢＬＡの同じ制限部位内に連結した。連結物をエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。ＳＯＣ培地内での１時間の回収の後、細胞を、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールを含有する５ｍＬ ＳＢ培地と共にインキュベートし、３７℃で培養した。１６時間の時点で、細胞を集め、プラスミドＤＮＡをミニプレップ（Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離し、２００ｎｇのｐＢＬＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＳＯＣにおける１時間の回収の後、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールまたは３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールおよび１００∧ｇｍＬ−１のカルベニシリン（アンピシリン類似体）を含有する固体ＬＢ培地上で細胞をプレーティングした。クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有するＬＢ培地上のコロニーの数を、クロラムフェニコールを含有するＬＢ培地上のコロニーの数で割り算したものとして、組換えを判定した。コロニー数は、ＧｅｌＤｏｃ ＸＲイメージングシステム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する自動計数により決定した。
選択
既に記載されているとおりに、重複伸長ＰＣＲによりＺＦＲライブラリーを構築した。全２０種のアミノ酸をコードする縮重コドンＮＮＫ（Ｎ：Ａ、Ｔ、ＣまたはＧおよびＫ：ＧまたはＴ）で１２０、１２３、１２７、１３６および１３７位に突然変異を導入した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＢＬＡの同じ制限部位内に連結した。連結物をエタノール沈殿させ、それを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’内に形質転換した。ライブラリーサイズは常法により〜５×１０７と決定された。ＳＯＣ培地内での１時間の回収の後、細胞を、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールを含有する１００ｍＬ ＳＢ培地と共に３７℃でインキュベートした。１６時間の時点で、３０ｍＬの細胞を集め、プラスミドＤＮＡをミニプレップ（Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）により単離し、３∧ｇのプラスミドＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＳＯＣにおける１時間の回収の後、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールおよび１００∧ｇｍＬ−１のカルベニシリンを含有する１００ｍＬのＳＢ培地と共に３７℃で細胞をインキュベートした。１６時間の時点で、細胞を集め、プラスミドＤＮＡをＭａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離した。富化されたＺＦＲをＳａｃＩおよびＸｂａＩ消化により単離し、更なる選択のために新たなｐＢＬＡ内に連結した。４ラウンドの選択の後、個々のカルベニシリン耐性クローンに関して配列分析を行った。前記のとおりに組換えアッセイを行った。
既に記載されているとおりに、重複伸長ＰＣＲによりＺＦＲライブラリーを構築した。全２０種のアミノ酸をコードする縮重コドンＮＮＫ（Ｎ：Ａ、Ｔ、ＣまたはＧおよびＫ：ＧまたはＴ）で１２０、１２３、１２７、１３６および１３７位に突然変異を導入した。ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＢＬＡの同じ制限部位内に連結した。連結物をエタノール沈殿させ、それを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’内に形質転換した。ライブラリーサイズは常法により〜５×１０７と決定された。ＳＯＣ培地内での１時間の回収の後、細胞を、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールを含有する１００ｍＬ ＳＢ培地と共に３７℃でインキュベートした。１６時間の時点で、３０ｍＬの細胞を集め、プラスミドＤＮＡをミニプレップ（Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）により単離し、３∧ｇのプラスミドＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’を形質転換した。ＳＯＣにおける１時間の回収の後、３０∧ｇｍＬ−１のクロラムフェニコールおよび１００∧ｇｍＬ−１のカルベニシリンを含有する１００ｍＬのＳＢ培地と共に３７℃で細胞をインキュベートした。１６時間の時点で、細胞を集め、プラスミドＤＮＡをＭａｘｉ−ｐｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により単離した。富化されたＺＦＲをＳａｃＩおよびＸｂａＩ消化により単離し、更なる選択のために新たなｐＢＬＡ内に連結した。４ラウンドの選択の後、個々のカルベニシリン耐性クローンに関して配列分析を行った。前記のとおりに組換えアッセイを行った。
ＺＦＲ構築
リコンビナーゼ触媒ドメインをそれらのそれぞれのｐＢＬＡ選択ベクターからプライマー５’Ｇｉｎ−ＨＢＳ−Ｋｏｚおよび３’Ｇｉｎ−Ａｇｅｌ−ＲｅｖでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＢＨの同じ制限部位内に連結してＳｕｐｅｒＺｉＦ適合性サブクローニングプラスミド：ｐＢＨ−Ｇｉｎ−ａ、Ｐ、ｙ、５、ｓまたはＺを得た。ジンクフィンガーをＳｕｐｅｒＺｉｆにより構築し、ｐＢＨ−Ｇｉｎ−ａ、Ｐ、ｙ、５、ｓまたはＺのＡｇｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位内に連結して、ｐＢＨ−ＺＦＲ−Ｌ／Ｒ−１、２、３．１８（Ｌ：左ＺＦＲ；Ｒ：右ＺＦＲ）を得た。ＺＦＲ遺伝子をＳｆｉ消化によりｐＢＨから遊離させ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結してｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ／Ｒ−１、２、３．１８を得た。各ＺＦＲの正しい構築が配列分析により確認された（表９）。
リコンビナーゼ触媒ドメインをそれらのそれぞれのｐＢＬＡ選択ベクターからプライマー５’Ｇｉｎ−ＨＢＳ−Ｋｏｚおよび３’Ｇｉｎ−Ａｇｅｌ−ＲｅｖでＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩで消化し、ｐＢＨの同じ制限部位内に連結してＳｕｐｅｒＺｉＦ適合性サブクローニングプラスミド：ｐＢＨ−Ｇｉｎ−ａ、Ｐ、ｙ、５、ｓまたはＺを得た。ジンクフィンガーをＳｕｐｅｒＺｉｆにより構築し、ｐＢＨ−Ｇｉｎ−ａ、Ｐ、ｙ、５、ｓまたはＺのＡｇｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位内に連結して、ｐＢＨ−ＺＦＲ−Ｌ／Ｒ−１、２、３．１８（Ｌ：左ＺＦＲ；Ｒ：右ＺＦＲ）を得た。ＺＦＲ遺伝子をＳｆｉ消化によりｐＢＨから遊離させ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結してｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ／Ｒ−１、２、３．１８を得た。各ＺＦＲの正しい構築が配列分析により確認された（表９）。
ルシフェラーゼアッセイ
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３および２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳおよび１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ内で維持した。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレート上に４×１０４細胞／ウェルの密度で播き、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃で樹立させた。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ １−１８、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｒ １−１８、２．５ｎｇのｐＧＬ３−ＺＦＲ−１、２、３．または１８および１ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を受動細胞溶解（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞溶解し、ベリタス・マイクロプレート・ルミノメータ（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ発現を決定した。
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３および２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳおよび１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）抗生物質−抗真菌剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ内で維持した。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレート上に４×１０４細胞／ウェルの密度で播き、加湿５％ ＣＯ２雰囲気中で３７℃で樹立させた。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ １−１８、１５０ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｒ １−１８、２．５ｎｇのｐＧＬ３−ＺＦＲ−１、２、３．または１８および１ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を受動細胞溶解（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ）バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞溶解し、ベリタス・マイクロプレート・ルミノメータ（Ｖｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ発現を決定した。
組込みアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート上に５×１０５細胞／ウェルの密度で播き、血清含有培地内で加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で維持した。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を製造業者の説明に従い使用して、１∧ｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ−１、２または３および１∧ｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｒ−１、２または３および２００ｎｇのｐＢＰＳ−ＺＦＲ−１、２または３で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの密度で分割し、２∧ｇｍＬのピューロマイシンを含有する血清含有培地内で維持した。１００％のコンフルエンスに達したら細胞を集め、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）でゲノムＤＮＡを単離した。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、以下のプライマーの組合せを使用してＺＦＲ標的をＰＣＲ増幅した：ＺＦＲ−標的−１、２または３−ＦｗｄおよびＺＦＲ−標的−１、２または３−Ｒｅｖ（未修飾標的）；ＺＦＲ−標的−１、２または３−ＦｗｄおよびＣＭＶ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ−１（フォワード組込み）；ならびにＣＭＶ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ−１およびＺＦＲ−標的−１、２または３−Ｒｅｖ（リバース組込み）。クローン分析のために、トランスフェクションの２日後に、１×１０５細胞を１００ｍｍディッシュ上に分割し、２∧ｇｍＬ−１のピューロマイシンを含有する血清含有培地内で維持した。個々のコロニーを、無菌シリコーングリース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を伴う１０ｍｍ×１０ｍｍ開放端クローニングシリンダーを使用して単離し、培地内で増殖させた。１００％のコンフルエンスに達したら細胞を集め、ゲノムＤＮＡを単離し、前記のとおりのＰＣＲのための鋳型として使用した。コロニー計数アッセイのために、トランスフェクションの２日後、細胞を６ウェルプレート内に１×１０４細胞／ウェルの密度で分割し、２∧ｇｍＬ−１のピューロマイシンの存在下または非存在下、血清含有培地内で維持した。１６日の時点で、細胞を０．２％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ピューロマイシン含有培地内で形成されたコロニーの数を計数し、ピューロマイシンの非存在下で形成されたコロニーの数で割り算することにより組込み効率を決定した。コロニー数は、ＧｅｌＤｏｃ ＸＲイメージングシステム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する自動計数により決定した。
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート上に５×１０５細胞／ウェルの密度で播き、血清含有培地内で加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で維持した。播いた後２４時間の時点で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を製造業者の説明に従い使用して、１∧ｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｌ−１、２または３および１∧ｇのｐｃＤＮＡ−ＺＦＲ−Ｒ−１、２または３および２００ｎｇのｐＢＰＳ−ＺＦＲ−１、２または３で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を６ウェルプレート上に５×１０４細胞／ウェルの密度で分割し、２∧ｇｍＬのピューロマイシンを含有する血清含有培地内で維持した。１００％のコンフルエンスに達したら細胞を集め、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）でゲノムＤＮＡを単離した。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、以下のプライマーの組合せを使用してＺＦＲ標的をＰＣＲ増幅した：ＺＦＲ−標的−１、２または３−ＦｗｄおよびＺＦＲ−標的−１、２または３−Ｒｅｖ（未修飾標的）；ＺＦＲ−標的−１、２または３−ＦｗｄおよびＣＭＶ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ−１（フォワード組込み）；ならびにＣＭＶ−Ｍｉｄ−Ｐｒｉｍ−１およびＺＦＲ−標的−１、２または３−Ｒｅｖ（リバース組込み）。クローン分析のために、トランスフェクションの２日後に、１×１０５細胞を１００ｍｍディッシュ上に分割し、２∧ｇｍＬ−１のピューロマイシンを含有する血清含有培地内で維持した。個々のコロニーを、無菌シリコーングリース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を伴う１０ｍｍ×１０ｍｍ開放端クローニングシリンダーを使用して単離し、培地内で増殖させた。１００％のコンフルエンスに達したら細胞を集め、ゲノムＤＮＡを単離し、前記のとおりのＰＣＲのための鋳型として使用した。コロニー計数アッセイのために、トランスフェクションの２日後、細胞を６ウェルプレート内に１×１０４細胞／ウェルの密度で分割し、２∧ｇｍＬ−１のピューロマイシンの存在下または非存在下、血清含有培地内で維持した。１６日の時点で、細胞を０．２％クリスタルバイオレット溶液で染色し、ピューロマイシン含有培地内で形成されたコロニーの数を計数し、ピューロマイシンの非存在下で形成されたコロニーの数で割り算することにより組込み効率を決定した。コロニー数は、ＧｅｌＤｏｃ ＸＲイメージングシステム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する自動計数により決定した。
結果
Ｇｉｎリコンビナーゼの特異性プロファイル
セリンリコンビナーゼ触媒特異性を再操作するために、このファミリーの酵素による基質認識の根底にある要因の詳細な理解を深めた。これを達成するために、対称に置換された標的部位の包括的セットをＤＮＡインベルターゼＧｉｎの触媒ドメインの活性化突然変異体が組換える能力を評価した。Ｇｉｎ触媒ドメインは、２つの１０ｂｐの半分部位領域からなる偽対称性２０ｂｐコアを組換える。したがって、組換え部位のこの集合体は１０、９、８、７、６、５および４位にそれぞれの可能な一塩基置換を、そして３および２位ならびにジヌクレオチドコア内にそれぞれの可能な二塩基の組合せを含有していた。リコンビナーゼ活性を抗生物質耐性に関連づける既に記載されている方法である分割遺伝子再構築により組換えが決定された。
Ｇｉｎリコンビナーゼの特異性プロファイル
セリンリコンビナーゼ触媒特異性を再操作するために、このファミリーの酵素による基質認識の根底にある要因の詳細な理解を深めた。これを達成するために、対称に置換された標的部位の包括的セットをＤＮＡインベルターゼＧｉｎの触媒ドメインの活性化突然変異体が組換える能力を評価した。Ｇｉｎ触媒ドメインは、２つの１０ｂｐの半分部位領域からなる偽対称性２０ｂｐコアを組換える。したがって、組換え部位のこの集合体は１０、９、８、７、６、５および４位にそれぞれの可能な一塩基置換を、そして３および２位ならびにジヌクレオチドコア内にそれぞれの可能な二塩基の組合せを含有していた。リコンビナーゼ活性を抗生物質耐性に関連づける既に記載されている方法である分割遺伝子再構築により組換えが決定された。
一般に、Ｇｉｎは、（ｉ）該ジヌクレオチドコアにおける１６個の可能な二塩基の組合せのうちの１２個（ＡＡ，ＡＴ，ＡＣ，ＡＧ，ＴＡ，ＴＴ，ＴＣ，ＴＧ，ＣＡ，ＣＴ，ＧＡ，ＧＴ）；（ｉｉ）３および２位における１６個の可能な二塩基の組合せのうちの４個（ＣＣ，ＣＧ，ＧＧおよびＴＧ）；（ｉｉｉ）６、５または４位における単一のＡからＴへの置換；ならびに（ｉｖ）１０、９、８および７位における全１２個の可能な一塩基置換を許容することが判明した（図３１Ａ〜Ｄ）。更に、Ｇｉｎは、１０、９、８および７位における（可能な４．２９×１０９個のうちの）少なくとも１０６個のユニーク塩基の組合せを含有する標的部位ライブラリーを組換えうることが判明した（図３１Ｄ）。
これらの知見は、ｙＳレゾルバーゼの結晶構造からなされた観察に合致しており、これは、（ｉ）ジヌクレオチドコアを越えてリコンビナーゼ二量体によりなされる相互作用が非対称であり、主に非特異的であること、（ｉｉ）ＤＮＡ小溝およびリコンビナーゼアーム領域における進化的に保存されたＧｌｙ−Ａｒｇモチーフの間の相互作用が６、５および４位のアデニンまたはチミンの要件を課すこと、ならびに（ｉｉｉ）１０、９、８または７位におけるアーム領域および小溝の間の配列特異的相互作用が存在しないことを示している（図３１Ｅ）。これらの結果は、密接に関連したＨｉｎリコンビナーゼのＤＮＡ結合特性の決定に焦点を合わせた研究とも合致している。
Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒特異性の再操作
Ｇｉｎが３および２位の保存的置換（すなわち、ＣＣ、ＣＧ、ＧＧおよびＴＧ）を許容するという知見に基づいて、天然酵素によっては許容されない１２個の塩基の組合せのそれぞれを含有するコア配列（図３２Ａ）を特異的に認識するようにＧｉｎ触媒特異性が再操作されうるかどうかを調べた。ＧｉｎによるＤＮＡ認識に関与する特異的アミノ酸残基を特定するために、対応するそれぞれのＤＮＡ標的と複合体形成した２つの関連セリンリコンビナーゼ（ｙ６レゾルバーゼおよびＳｉｎリコンビナーゼ）の結晶構造を調べた。これらのモデルに基づいて、３および２位においてＤＮＡに接触する５個の残基、すなわち、Ｌｅｕ １２３、Ｔｈｒ １２６、Ａｒｇ １３０、Ｖａｌ １３９およびＰｈｅ １４０（ｙ５レゾルバーゼに基づく番号づけ）を特定した（図３２Ｂ）。Ｇｉｎ触媒ドメイン内の同等残基（Ｉｌｅ １２０、Ｔｈｒ １２３、Ｌｅｕ １２７、Ｉｌｅ １３６およびＧｌｙ １３７）において重複伸長ＰＣＲによりランダム突然変異誘発を行い、これらの触媒ドメイン変異体を「Ｈ１」ＺＦＰの未修飾コピーに融合させることによりＺＦＲ突然変異体のライブラリーを構築した。このライブラリーの理論的サイズは３．３×１０７変異体であった。
Ｇｉｎが３および２位の保存的置換（すなわち、ＣＣ、ＣＧ、ＧＧおよびＴＧ）を許容するという知見に基づいて、天然酵素によっては許容されない１２個の塩基の組合せのそれぞれを含有するコア配列（図３２Ａ）を特異的に認識するようにＧｉｎ触媒特異性が再操作されうるかどうかを調べた。ＧｉｎによるＤＮＡ認識に関与する特異的アミノ酸残基を特定するために、対応するそれぞれのＤＮＡ標的と複合体形成した２つの関連セリンリコンビナーゼ（ｙ６レゾルバーゼおよびＳｉｎリコンビナーゼ）の結晶構造を調べた。これらのモデルに基づいて、３および２位においてＤＮＡに接触する５個の残基、すなわち、Ｌｅｕ １２３、Ｔｈｒ １２６、Ａｒｇ １３０、Ｖａｌ １３９およびＰｈｅ １４０（ｙ５レゾルバーゼに基づく番号づけ）を特定した（図３２Ｂ）。Ｇｉｎ触媒ドメイン内の同等残基（Ｉｌｅ １２０、Ｔｈｒ １２３、Ｌｅｕ １２７、Ｉｌｅ １３６およびＧｌｙ １３７）において重複伸長ＰＣＲによりランダム突然変異誘発を行い、これらの触媒ドメイン変異体を「Ｈ１」ＺＦＰの未修飾コピーに融合させることによりＺＦＲ突然変異体のライブラリーを構築した。このライブラリーの理論的サイズは３．３×１０７変異体であった。
分割遺伝子再構築により活性ＺＦＲに関して富化されており天然酵素によっては許容されない５つの塩基の組合せ（ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＡＣまたはＴＴ）の１つを含有する基質プラスミド内にＺＦＲライブラリーをクローニングした（図３２Ｃ）。４ラウンドの選択の後、各ＺＦＲ集団の活性が、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡおよびＴＴ置換を含有するＤＮＡ標的に対しては＞１，０００倍、そしてＡＣ置換を含有するＤＮＡ標的に対しては＞１００倍増強することが判明した（図３２Ｄ）。
個々のリコンビナーゼ変異体を各集団から配列決定し、１２０、１２３および１２７位に高レベルのアミノ酸多様性が存在すること、および選択されたクローンの＞８０％が１３６位にＡｒｇを、そして１３７位にＴｒｐまたはＰｈｅを含有することが判明した（図３６）。これらの結果は、１３６および１３７位が非天然コア配列の認識において決定的に重要な役割を果たしていることを示唆している。それぞれの選択された酵素がその標的ＤＮＡを組換える能力を評価した。ほぼ全てのリコンビナーゼが活性（＞１０％の組換え）を示し、それらの意図されるコア配列への特異性における＞１，０００倍の移行を示すことが判明した（図３７）。親Ｇｉｎの場合と同様に、幾つかのリコンビナーゼは３および２位の保存的置換を許容することが判明した（すなわち、ＧＴおよびＣＴまたはＡＣおよびＡＧに対する交差反応性）。このことは、複数のコア部位を標的化するために単一の再操作触媒ドメインが用いられうることを示している（図３７）。
リコンビナーゼ特異性を更に調べるために、親酵素によっては許容されない１２個の可能な二塩基の組合せのうちの９個（ＧＣ、ＴＣ、ＧＴ、ＣＴ、ＧＡ、ＣＡ、ＡＧ、ＡＣおよびＴＴ）を認識することが示された５つのＧｉｎ変異体（以下、Ｇｉｎ ｐ、ｙ、６、ｅおよびＺと称する）の組換えプロファイルを決定した（表１）。Ｇｉｎ ｐ、６およびｅはそれらの意図されるコア配列を、親酵素（以下、Ｇｉｎ ａと称される）のものと比較しうる活性および特異性で組換え、そのＧｉｎ ｙおよびＺはそれらの意図されるコア配列を、Ｇｉｎ ａのものを超える特異性で組換えることが可能であった（図３２Ｅ）。各リコンビナーゼは６、５および４位のアデニンまたはチミンに対する＞１，０００倍の優先性を示し、１０、９、８および７位における塩基優先性を示さなかった（図３８）。これらの結果は、ＤＮＡ結合性アームの突然変異誘発がリコンビナーゼ特異性を損なわなかったことを示している。３および２位におけるＡＡ、ＡＴまたはＴＡ置換を許容しうるＧｉｎ変異体を選択することは可能ではなかった。この結果に関する１つの可能性は、＞４個の連続的Ａ−Ｔｂｐを含有するＤＮＡ標的が、リコンビナーゼ結合および／または触媒を妨げる屈曲したＤＮＡコンホメーションを示すというものである。
使用者により定められた配列を組換えるためのＺＦＲの操作
再操作触媒ドメインから構成されるＺＦＲが所定配列を組換えうるかどうかを調べた。この可能性を試験するために、ランダムＤＮＡの４００，０００ｂｐ当たり約１個出現すると予想される４４ｂｐのコンセンサス組換え部位を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７一次参照構築体）を潜在的ＺＦＲ標的部位に関して検索した（図４Ａ）。選択されたＧｉｎ変異体のコア配列プロファイルから導き出されたこのＺＦＲコンセンサス標的部位は、２１個の可能な触媒ドメインの組合せにより許容されると予想される（可能な１．０９５５×１０１２個のうちの）約７×１０８個のユニーク２０ｂｐコア組合せ、ならびに各ＺＦＢＳ内の５’−ＣＮＮ−３’および５’−ＴＮＮ−３’トリプレットを含まないモジュール式ジンクフィンガードメインの保存的選択を含む。選択のための一次決定因子としてＺＦＰ特異性を用いて、非タンパク質コード化遺伝子座における８個のヒト染色体（第１、２、４、６、７、１１、１３およびＸ染色体）にわたる１８個の可能なＺＦＲ標的部位を特定した。平均して、それぞれの２０ｂｐのコアは、天然Ｇｉｎ触媒ドメインにより認識されるコア配列に対して〜４６％配列同一性を示した（図３３Ｂ）。各対応ＺＦＲはモジュール式構築により構築された（「材料および方法」を参照されたい）。
再操作触媒ドメインから構成されるＺＦＲが所定配列を組換えうるかどうかを調べた。この可能性を試験するために、ランダムＤＮＡの４００，０００ｂｐ当たり約１個出現すると予想される４４ｂｐのコンセンサス組換え部位を使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７一次参照構築体）を潜在的ＺＦＲ標的部位に関して検索した（図４Ａ）。選択されたＧｉｎ変異体のコア配列プロファイルから導き出されたこのＺＦＲコンセンサス標的部位は、２１個の可能な触媒ドメインの組合せにより許容されると予想される（可能な１．０９５５×１０１２個のうちの）約７×１０８個のユニーク２０ｂｐコア組合せ、ならびに各ＺＦＢＳ内の５’−ＣＮＮ−３’および５’−ＴＮＮ−３’トリプレットを含まないモジュール式ジンクフィンガードメインの保存的選択を含む。選択のための一次決定因子としてＺＦＰ特異性を用いて、非タンパク質コード化遺伝子座における８個のヒト染色体（第１、２、４、６、７、１１、１３およびＸ染色体）にわたる１８個の可能なＺＦＲ標的部位を特定した。平均して、それぞれの２０ｂｐのコアは、天然Ｇｉｎ触媒ドメインにより認識されるコア配列に対して〜４６％配列同一性を示した（図３３Ｂ）。各対応ＺＦＲはモジュール式構築により構築された（「材料および方法」を参照されたい）。
各ＺＦＲペアがその意図されるＤＮＡ標的を組換えるかどうかを決定するために、ＺＦＲ媒介性組換えをルシフェラーゼ発現の低減と相関させる一過性レポーターアッセイを開発した（図３３Ａおよび３９）。これを達成するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０プロモーターの上流および下流にＺＦＲ標的部位を導入した。ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を各ＺＦＲペアおよびその対応レポータープラスミドのための発現ベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼ発現を測定した。分析された１８個のＺＦＲペアのうち、３８％（１８個中７個）がルシフェラーゼ発現を＞７５倍低減し、２２％（１８個中４個）がルシフェラーゼ発現を＞１４０倍低減した（図３３Ｂ）。比較として、天然Ｇｉｎ触媒ドメインにより認識されるコア配列を標的化するように設計された陽性ＺＦＲ対照であるＧｉｎＣ４はルシフェラーゼ発現を１０７倍低減した。総合すると、評価されたＺＦＲペアの５０％（１９個中９個）はルシフェラーゼ発現を少なくとも２０倍低減することが判明した。重要なことに、細菌細胞において有意な活性（＞２０％の組換え）を示した実質的に全ての触媒ドメインは、哺乳類細胞における少なくとも１つの天然に存在する配列を組換えるために成功裏に使用された。
ＺＦＲ特異性を評価するために、独立して、それぞれの非コグネイトレポータープラスミドと共に９個の最も活性なＺＦＲのための発現プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。各ＺＦＲペアはその意図されるＤＮＡ標的に対する高い特異性を示し、評価されたＺＦＲの７７％（９個中７個）は、陽性対照ＧｉｎＣ４の場合と実質的に同一である全体的な組換え特異性を示した（図４Ｃ）。ルシフェラーゼ発現の低減が、意図されたＺＦＲヘテロ二量体の成果であり、組換え適合性ＺＦＲホモ二量体の副産物ではないことを確証するために、組換えに対する各ＺＦＲ単量体の寄与を測定した。ＺＦＲ １「左」単量体のその対応レポータープラスミドとのコトランスフェクションはルシフェラーゼ発現における中程度の低減（組換えに対する全寄与：〜２２％）を招いたが、個々のＺＦＲ単量体の大多数（１８個中１６個）は組換えに有意には寄与せず（＜１０％の組換え）、多数（１８個中７個）は活性を示さなかった（図３９）。総合すると、これらの研究は、使用者により定められた配列を高い特異性で組換えるようにＺＦＲが操作されうることを示している。
操作されたＺＦＲはヒトゲノム内への標的化組込みをもたらす。
ＺＦＲがヒト細胞における内因性遺伝子座内にＤＮＡを組込みうるかどうかを次に評価した。これを達成するために、特異的ＺＦＲ標的部位およびピューロマイシン耐性遺伝子をＳＶ４０プロモーターの制御下で含有する対応ＤＮＡ供与プラスミドならびにＺＦＲ発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクトした。この分析のために、それぞれヒト染色体４、Ｘおよび４上の染色体非タンパク質コード化遺伝子座を標的化するように設計されたＺＦＲペア１、２および３を使用した（図３４Ａ）。トランスフェクションの２日後、細胞をピューロマイシン含有培地と共にインキュベートし、ピューロマイシン耐性（ｐｕｒｏＲ）コロニーの数の決定により組込み効率を測定した。（ｉ）供与プラスミドおよび対応ＺＦＲペアのコトランスフェクションは、供与プラスミドのみでのトランスフェクションと比較してｐｕｒｏＲコロニーにおける＞１２倍の増加を招くこと、ならびに（ｉｉ）両方のＺＦＲでのコトランスフェクションは、個々のＺＦＲ単量体でのトランスフェクションと比較してｐｕｒｏＲコロニーにおける６〜９倍の増加を招くことが判明した（図３４Ｂ）。ＺＦＲペアが組込みを正しく標的化したかどうかを評価するために、ゲノムＤＮＡをｐｕｒｏＲ集団から単離し、各標的化遺伝子座をＰＣＲにより増幅した。フォワードおよび／またはリバース配向における組込みに対応するＰＣＲ産物が、これらのＺＦＲペアにより標的化された各遺伝子座において観察された（図３４Ｃ）。次に、ＺＦＲ媒介性組込みの全体的特異性を決定するために、ゲノムＤＮＡをクローン細胞集団から単離し、プラスミド挿入をＰＣＲにより評価した。この分析は８．３％（１２個中１個のクローン）、１４．２％（３５個中５個のクローン）および９．１％（１１個中１個のクローン）の、それぞれＺＦＲペア１、２および３に関する標的化効率を示した（図Ｓ６）。各ＰＣＲ産物の配列分析はＺＦＲ媒介性組込みを証明した（図３４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＤＮＡを内因性遺伝子座内に正確に組込むようにＺＦＲが設計されうることを示している。
最後に、ＺＦＲ−１「左」単量体はＺＦＲ−１遺伝子座内への組込みを標的化することが判明したことが注目される（図３４Ｃ）。前記のルシフェラーゼレポーター研究に合致しているこの結果（図３９）は、組換え適合性ＺＦＲホモ二量体がオフターゲット（非特異的）組込みを媒介する能力を有することを示している。最適化ヘテロ二量体ＺＦＲ構造体の将来の開発およびオフターゲット組込みの包括的評価は、より大きな標的化効率を示すＺＦＲの設計につながるはずである。
使用者により定められた配列を高い特異性で組換えるようにＺＦＲが設計されうること、およびＺＦＲがヒト細胞における所定内因性遺伝子座内にＤＮＡを組込みうることが本明細書に示されている。基質特異性分析と定向進化とを組合せることにより、ＺＦＲ触媒ドメインにより課される実質的に全ての配列要件が排除された。４５個の予め選択されたジンクフィンガーモジュールのアーカイブを使用して、４，０００ｂｐのランダム配列当たりに約１個の潜在的ＺＦＲ標的部位に対応する＞１×１０２２個のユニーク４４ｂｐ ＤＮＡ配列を認識するようにＺＦＲが設計されうると推定される。選択による特製（カスタム化）ジンクフィンガードメインの構築は標的化を更に進展させるであろう。本明細書に記載されている再操作触媒ドメインは、最近記載されているＴＡＬエフェクターリコンビナーゼに適合するであろう。この研究は、カスタム特異性を有するＺＦＲを作製する実施可能性を実証しており、ゲノム工学、合成生物学および遺伝子治療を含む多種多様な用途に関するＺＦＲの潜在的有用性を例示している。
本発明は前記実施例に関して記載されているが、修飾および変更が本発明の精神および範囲内に含まれると理解されるであろう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲のみにより限定される。
Claims (69)
- ａ）リコンビナーゼ、転写因子またはヌクレアーゼと
ｂ）転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質とを含むキメラポリペプチド。 - 前記ＴＡＬＥタンパク質がトランケート化されている、請求項１記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質がＣ末端またはＮ末端トランケート化を含む、請求項２記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質がＣ末端トランケート化を含む、請求項３記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質が、ＡｃｒＸａ７、Ｔａｌ１ｃおよびＰｔｈＸｏｌからなる群から選択される、請求項１記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質が、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質がＣ末端トランケート化を含む、請求項６記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質がアミノ酸残基２７と２６８との間、９２と１３４との間、１２０と１２９との間、７４と１４７との間または８７と１２０との間でトランケート化されている、請求項７記載のキメラタンパク質。
- 前記ＴＡＬＥタンパク質がアミノ酸残基２８、７４、８７、９２、９５、１２０、１２４、１２８、１２９、１４７および１５０においてトランケート化されている、請求項８記載のキメラタンパク質。
- 前記リコンビナーゼが、
（ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；ならびに
ｂ）ａ）のリコンビナーゼの突然変異タンパク質
からなる群から選択される、請求項１記載のキメラタンパク質。 - 前記リコンビナーゼが、Ｇｉｎ、Ｈｉｎ、Ｔｎ３、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ．Ｍｉｎ、ＤｉｎおよびＣｉｎならびにＧｉｎの突然変異タンパク質、Ｈｉｎの突然変異タンパク質、Ｓｉｎの突然変異タンパク質、Ｂｅｔａの突然変異タンパク質、Ｐｉｎの突然変異タンパク質、Ｍｉｎの突然変異タンパク質、Ｄｉｎの突然変異タンパク質、Ｃｉｎの突然変異タンパク質、Ｔｎ３の突然変異タンパク質からなる群から選択される、請求項１０記載のキメラタンパク質。
- 前記リコンビナーゼがＧｉｎである、請求項１０記載のキメラタンパク質。
- 前記リコンビナーゼがＧｉｎであり、ＴＡＬＥタンパク質がＡｃｒＸａ７である、請求項１記載のキメラタンパク質。
- 請求項１〜１３のいずれか１項記載のキメラタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項１４記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項１５記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項１４記載の核酸分子または請求項１６記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
- 部位特異的組換えのための方法であって、
（ａ）請求項１記載のキメラタンパク質と特異的に相互作用するための少なくとも２つの結合部位を含むＤＮＡ配列を提供することと、
（ｂ）該ＤＮＡ配列を該キメラタンパク質と反応させることと
を含み、該キメラタンパク質と特異的に相互作用する２つの部位の間で該ＤＮＡ配列の鎖の両方が切断される部位特異的組換え事象を該キメラタンパク質が触媒する、方法。 - 前記部位特異的組換え事象が逆位である、請求項１８記載の方法。
- 前記部位特異的組換え事象が組込みである、請求項１８記載の方法。
- 前記部位特異的組換え事象が分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）である、請求項１８記載の方法。
- 請求項１記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む遺伝子治療方法であって、
該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的に除去または不活性化される、方法。 - 前記遺伝子の機能的置換を含む核酸分子を対象に投与することを更に含む、請求項２２記載の方法。
- ａ）請求項１記載のキメラタンパク質と、
ｂ）医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。 - ａ）請求項１記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子と、
ｂ）医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。 - 請求項１記載のキメラタンパク質により触媒される組換えの作用により生産されるトランスジェニック生物。
- 請求項１８〜２１のいずれか１項記載の方法に産生されたＤＮＡ配列を有する核酸分子を含む細胞を対象に投与することを含む、遺伝子治療方法。
- 生物のゲノムを修飾するための方法であって、
請求項１８〜２２のいずれか１項記載の方法を使用して該ゲノムの核酸分子上で部位特異的組換えを行うことにより該生物のゲノムを修飾することを含む、方法。 - 前記生物が原核生物、細菌、ウイルスまたは真核生物である、請求項２８記載の方法。
- 所望のヌクレオチドに特異的に結合する転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質結合ドメインの製造方法であって、
ａ）可変性二残基（ＲＶＤ）内の又はＲＶＤの１〜２アミノ酸残基Ｎ末端側もしくはＣ末端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインのアミノ酸配列をランダム化することと、
ｂ）所望のヌクレオチドに特異的に結合する、（ａ）のランダム化ＴＡＬＥタンパク質結合ドメインを選択することと
を含む、製造方法。 - 請求項３０記載の製造方法により製造された転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質結合ドメインを含む単離されたタンパク質。
- １〜４０個のＴＡＬＥタンパク質結合ドメインを含む、請求項３１記載の単離されたタンパク質。
- 標的ヌクレオチド配列に特異的に結合する、請求項３２記載の単離されたタンパク質。
- ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ活性を含む、請求項３３記載の単離されたタンパク質。
- 遺伝子発現を調節する、請求項３３記載の単離されたタンパク質。
- 請求項３１〜３５のいずれか１項記載のＴＡＬＥタンパク質結合ドメインを含むタンパク質をコードする単離された核酸分子。
- 請求項３６記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項３７記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項３７記載の核酸分子または請求項３８記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
- キサンタモヌス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎｕｓ）由来転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドであって、
該ＴＡＬＥタンパク質が、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、ＷはＲである、ＷはＧである、Ｗは欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号３（ＶＧＫＱＷＳＧＡＲＡＬ）に示すアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する、単離されたポリペプチド。 - 前記ＮＴＤが、ＶＧＫＹＲＧＡＲＡＬ（配列番号４）、ＶＧＫＳＲＳＧＡＲＡＬ（配列番号５）、ＶＧＫＹＨＧＡＲＡＬ（配列番号６）およびＶＧＫＲＧＡＧＡＲＡＬ（配列番号７）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４０記載のポリペプチド。
- ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）由来転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む単離されたポリペプチドであって、
該ＴＡＬＥタンパク質が、Ｒ１はＫである、ＱはＹである、ＱはＳである、ＱはＲである、Ｒ２はＷである、Ｒ２はＧである、Ｒ２は欠失している、ＳはＲである、ＳはＨである、ＳはＡである、ＳはＮである、およびＳはＴであることから選択される１以上の突然変異または欠失を有する配列番号８（ＩＶＤＩＡＲ１ＱＲ２ＳＧＤＬＡ）に示すアミノ酸配列を含むＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を有する、単離されたポリペプチド。 - 前記ＮＴＤが、ＩＶＤＩＡＲＱＷＳＧＤＬＡ（配列番号９）、ＩＶＤＩＡＲＹＲＧＤＬＡ（配列番号１０）、ＩＶＤＩＡＲＳＲＳＧＤＬＡ（配列番号１１）、ＩＶＤＩＡＲＹＨＧＤＬＡ（配列番号１２）およびＩＶＤＩＡＲＲＧＡＧＤＬＡ（配列番号１３）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４２記載のポリペプチド。
- リコンビナーゼドメインまたはヌクレアーゼドメインを更に含む、請求項４０〜４３のいずれか１項記載のポリペプチド。
- 請求項４０〜４４のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 請求項４５記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項４６記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項４５記載の核酸分子または請求項４７記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
- 転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）の製造方法であって、
ａ）ＮＴＤ内の１以上のアミノ酸残基を突然変異または欠失させることにより、ＮＴＤのアミノ酸配列をランダム化することと、
ｂ）所望のヌクレオチドに特異的に結合する又は活性の増強を示す、（ａ）のランダム化ＴＡＬＥタンパク質ＮＴＤを選択することを含み、
前記アミノ酸配列は配列番号１４（ＶＧＫＸＸＸＧＡＲ）または配列番号１５（ＶＤＩＡＸＸＸＸＧＤＬＡ）である、製造方法。 - 対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ（ＺＦＲ）タンパク質の製造方法であって、
ａ）Ｇｉｎ Ｉｌｅ１２０、Ｔｈｒ１２３、Ｌｅｕ１２７、Ｉｌｅ１３６およびＧｌｙ１３７またはそれらの組合せと同等な位置においてリコンビナーゼ触媒ドメイン上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関して２および３位において該ＤＮＡを突然変異させることと、
ｂ）ａ）のリコンビナーゼ触媒ドメインを複数のジンクフィンガー結合ドメインと融合させてＺＦＲを形成することと、
ｃ）対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有するｂ）のＺＦＲを富化させることと
を含む、製造方法。 - 前記ＺＦＲが、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＴＴおよびＡＣから選択されるＤＮＡ標的に対する触媒活性の増強を示す、請求項５０記載の製造方法。
- 前記リコンビナーゼ触媒ドメインがＩｌｅ１３６および／またはＧｌｙ１３７において突然変異誘発される、請求項５０記載の製造方法。
- 前記ＺＦＲが第１、２、４、６、７、１１、１３およびＸ染色体における標的特異性の増強を示す、請求項５０記載の製造方法。
- 前記ＺＦＲがベクター内に存在する、請求項５０記載の製造方法。
- 前記リコンビナーゼ触媒ドメインが、
ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；ならびに
ｂ）ａ）の突然変異タンパク質
からなる群から選択されるリコンビナーゼからのものである、請求項５０記載の製造方法。 - 前記リコンビナーゼ触媒ドメインがＧｉｎ、Ｈｉｎ、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、ＣｉｎまたはＴｎ３の突然変異タンパク質からのものである、請求項６記載の方法。
- 請求項５０記載の製造方法により製造されるキメラポリペプチド。
- 前記リコンビナーゼ触媒ドメインが、
ａ）Ｔｎ３（ＥｃｏＴｎ３としても公知）；Ｈｉｎ（ＳｔｙＨｉｎとしても公知）；Ｇｉｎ（ＭｕＧｉｎとしても公知）；Ｓｉｎ；Ｂｅｔａ；Ｐｉｎ；Ｍｉｎ；Ｄｉｎ；Ｃｉｎ；ＥｃｏＴｎ２１；ＳｆａＴｎ９１７；ＢｍｅＴｎ５０８３；Ｂｍｅ５３；Ｃｐｅ；ＳａｕＳＫ１；ＳａｕＳＫ４１；ＳａｕＴｎ５５２；Ｒａｎ；Ａａｃ；Ｌｌａ；ｐＭＥＲ０５；Ｍｌｏ９２；Ｍｌｏ９０；Ｒｒｈ；Ｐｊｅ；Ｒｅｑ；ＰｐｓＴｎ５５０１；Ｐａｅ；Ｘａｎ；ＩＳＸｃ５；Ｓｐｙ；ＲｈｉｚＹ４ｃＧ；ＳａｒｐＮＬ１；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ａ；ＳｓｏｌＳＣ１９０４ｂ；ＳｓｏＩＳＣ１９１３；Ａａｍ６０６；ＭｊａＭ００１４；Ｐａｂ；ＨｐｙｌＳ６０７；ＭｔｕｌＳ Ｙ３４９；ＭｔｕＲｖ２７９２ｃ；ＭｔｕＲｖ２９７９ｃ；ＭｔｕＲｖ３８２８ｃ；ＭｔｕＲｖ０９２１；ＭｃｅＲｖ０９２１；ＴｎｐＸ；ＴｎｄＸ；ＷｗＫ；ラクトコッカスファージＴＰ９０１−１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφ３７０．１セリンリコンビナーゼ；エス・ピロゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ファージφＦＣ１セリンリコンビナーゼ；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ファージＡ１１８セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ３Ｃ８．２４セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ２Ｅ１．３７セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ７８．０４ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣ８Ｆ４．１５ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＤ１２Ａ．２３セリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＨ１０．３８ｃセリンリコンビナーゼ；エス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）染色体ＳＣＣ８８．１４セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージφＣ３１セリンリコンビナーゼ；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージＲ４セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージφ１０５セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージＳＰＢｃ２セリンリコンビナーゼ；バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロファージＳＫＩＮセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＡセリンリコンビナーゼ；エス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｃｃｒＢセリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ファージＢｘｂ１セリンリコンビナーゼ；エム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）プロファージφＲＶｌセリンリコンビナーゼ；ＹＢＣＫ ＥＣＯＬＩ；Ｙ４ｂＡ；Ｂｊａ；Ｓｐｎ；Ｃａｃ １９５６；およびＣａｃ １９５４；ならびに
ｂ）ａ）の突然変異タンパク質
からなる群から選択される、請求項５７記載のキメラポリペプチド。 - 前記リコンビナーゼ触媒ドメインがＧｉｎ、Ｈｉｎ、Ｓｉｎ、Ｂｅｔａ、Ｐｉｎ、Ｍｉｎ、Ｄｉｎ、ＣｉｎまたはＴｎ３の突然変異タンパク質からのものである、請求項９記載の方法。
- 請求項５７記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 請求項６０記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項６１記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項６２記載のベクターを含有する単離された宿主細胞。
- 部位特異的組込みを触媒する請求項５７記載のキメラポリペプチドとＤＮＡ配列を接触させることを含む、ＤＮＡ配列内への部位特異的組込みのための方法。
- 請求項５７記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む遺伝子治療方法であって、
該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的に除去または不活性化される、方法。 - 該遺伝子の機能的置換を含む核酸分子を対象に投与することを更に含む、請求項６５記載の方法。
- ａ）請求項５７記載のキメラポリペプチドと、
ｂ）医薬上許容される担体と
を含む医薬組成物。 - ａ）請求項５７記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子と、
ｂ）医薬上許容される担体と
を含む医薬組成物。 - 請求項５７記載のキメラポリペプチドにより触媒される組換えにより生産されるトランスジェニック生物。
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