JP7459174B2 - 標的結合特異性を有するキメラポリペプチド - Google Patents
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Description
本出願は、2012年9月4日付け出願のU.S.Serial No.61/696
,689、2013年1月17日付け出願のU.S.Serial No.61/753
,763および2013年5月1日付け出願のU.S.Serial No.61/81
8,364(それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の35
U.S.C.§119(e)に基づく優先権の利益を主張するものである。
本発明は全般的にはバイオテクノロジーの分野、より詳細には、特異的DNA配列を認
識するキメラリコンビナーゼに関する。
ら、種々のタンパク質ドメインは、配列特異的DNA認識をもたらすように進化してきた
からである。これらのドメインの選ばれた少数のものによるDNA認識は多種多様なバイ
オテクノロジー用途にとっても根本的に重要である。特に、C2H2ジンクフィンガータ
ンパク質(ZFP)は、使用者により定められたDNA配列を認識するように操作された
最初のDNA結合性タンパク質の1つであり、転写調節、ゲノム操作およびエピジェネテ
ィック修飾を含む多数の用途に使用されており、種々の度合の成功を収めている。ZFP
のモジュール式構築はこれらのアプローチを促進させている。しかし、ZFP技術の進歩
および有望さにもかかわらず、ある配列に対する特異的高アフィニティZFPの構築は依
然として困難であり、限られた場合には、非専門的な研究室によっては容易には採用され
ない、長時間を要する労働集約的な選択系の使用を要する。
物に相当する天然に存在するDNA結合ドメイン(DBD)のクラスである。TALEは
植物病原体キサントモナス(Xanthomonas)において見出され、標的DNA配
列に選択的に結合するように機能する一連の33~35個のアミノ酸の反復を含有する。
これらの反復は、単一ヌクレオチドへの結合をもたらすことによりDNA特異性を付与す
る2つの隣接反復可変性二残基(RVD)以外は同一である。類似した塩基対番号(bp
)のDNA部位に結合する30個を超える反復の配置が記載されている。各RVDの結合
においては固有の縮重が存在するが、最近の研究は、合成TALEタンパク質が、ヒトゲ
ノム内の単一遺伝子座を標的化するのに十分な程度に特異的であることを示している。
本鎖切断(DSB)の導入は、遺伝子機能をノックアウトするために、または標的化遺伝
子座における外的付加DNA駆動カセット組込みの存在下で用いられうる。ZFNは過去
10年間にわたって詳細に研究されており、幾つかの場合には、遺伝子治療のための臨床
利用に近づきつつある。最近、幾つかのグループが、標的化ゲノム編集のための、ヌクレ
アーゼに融合したTALE DNA結合ドメイン(TALEN)の使用を検討している。
実際、ZFNに関する研究の多くが、TALEヌクレアーゼを使用して追試されている。
なぜなら、TALENは、DNA結合モジュール性(modularity)に関して、
ZFNに優る利点を有しうるからである。しかし、ZFNおよびTALENを使用した印
象的な研究にもかかわらず、それらの安全性および特異性に関する疑問が尚も残っている
。特に、オフターゲット(非特異的)切断事象を検出することは依然として困難である。
なぜなら、オフターゲットDSBの最も考えられうる結果は小さな挿入または欠失の導入
であるからである。また、DSBの修復は、細胞型によって異なる細胞装置に左右される
。
SR)の使用である。チロシンリコンビナーゼCreおよびFlpのようなSSRは、細
胞内の染色体構造を操作するために常套的に使用される貴重な分子生物学手段である。こ
れらの酵素は、幾つかの複雑なタンパク質-タンパク質およびタンパク質-DNA相互作
用に基づいて触媒作用を調整するため、SSRは顕著な標的部位特異性を示す。しかし、
現在のところ、多くのSSRの特異性の改変は困難であることが判明している。レゾルバ
ーゼ/インベルターゼ型のセリンリコンビナーゼは、ゲノム操作のための、チロシンリコ
ンビナーゼの多目的代替物となる。本質的に、これらの酵素は、高度にモジュール的な様
態で組換えを調整するマルチドメインタンパク質複合体として機能する。しかし、組換え
のためのアクセサリーファクターを要しない幾つかのセリンリコンビナーゼの突然変異体
が特定されている。また、多数の研究により、セリンリコンビナーゼの天然DBDが特別
設計ZFPで置換され、キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ(ZFR)が得られる可
能性があることが示されている。原理的には、増大した数の配列を認識しうるZFRが得
られうるが、可能なDNAトリプレットの全てを認識しうるジンクフィンガードメインが
ないことにより、これらの酵素の潜在的モジュラー標的化能が制限される。
ーDNA結合ドメインと、セリンリコンビナーゼのレゾルバーゼ/インベルターゼファミ
リーに由来する活性化触媒ドメインとから構成される(図30A)。ZFRは、リコンビ
ナーゼ触媒ドメインにより認識される中央の20bpのコア配列に隣接する2つの逆転ジ
ンクフィンガー結合部位(ZFBS)からなる特異的ZFR標的部位の間の組換えを触媒
する(図30B)。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)およびTALエフェクター
ヌクレアーゼ(TALEN)とは対照的に、ZFRは自律的に機能し、細胞DNA損傷応
答経路を活性化することなくヒトおよびマウス細胞において導入遺伝子を切り出し、組込
みうる。しかし、通常の部位特異的リコンビナーゼの場合と同様に、ZFRの適用は、リ
コンビナーゼ触媒ドメインにより課される配列要件により制限されており、これは天然セ
リンレゾルバーゼ/インベルターゼ組換え部位由来の20bpのコアをZFR標的部位が
含有することを必要とする。
組換え系が遺伝的操作のための強力な手段として出現している。これらのDNA再編成を
促進させる部位特異的リコンビナーゼは、DNA合成または高エネルギー補因子を要しな
いメカニズムにより、短い(30~40bp)配列を認識し、DNA切断、鎖交換および
再連結を調整する。この単純性は、並外れた空間的および時間的感度で研究者が遺伝子機
能を研究することを可能にしている。しかし、部位特異的リコンビナーゼにより課される
厳格な配列要件は、それらの適用を、人工的に導入された組換え部位を含有する細胞およ
び生物に限定している。この制限に対処するために、定向進化が用いられ、天然に存在す
るDNA配列に対する幾つかのリコンビナーゼの配列特異性が改変されている。進歩して
いるにもかかわらず、複雑な突然変異誘発および選択法の必要性、ならびに再操作リコン
ビナーゼ変異体が通常、弛緩基質特異性を示すという知見によって、この技術の広範な採
用が妨げられている。
を触媒する、より一般化された方法、ならびにそのような標的化および部位特異的組換え
を触媒しうる酵素が必要とされている。これは遺伝子治療に特に有用であるが、分子生物
学における多数の他の用途も有し、例えば、遺伝子クローニング、ならびに産業用生物な
らびに農業用植物および動物の改変における使用が挙げられる
びにトランスジェニック細胞、組織、植物および動物の作製のためのその使用方法が開示
される。本発明の組成物、ベクターおよび方法は遺伝子治療技術においても有用である。
a)リコンビナーゼ、ヌクレアーゼもしくは転写因子またはそれらの断片;およびb)転
写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含む。種々の実施形態におい
ては、TALEタンパク質は末端が切断されて(トランケート化されて(truncated))
おり、C末端またはN末端切断(トランケーション)を含む。幾つかの実施形態において
は、TALEタンパク質はAcrXa7、TallcおよびPthXolである。幾つか
の実施形態においては、TALEタンパク質は、配列番号2に記載されているアミノ酸配
列の全部または一部を含む。幾つかの実施形態においては、TALEタンパク質は配列番
号2のアミノ酸残基27と268との間、92と134との間、120と129との間、
74と147との間または87と120との間でトランケート化されている。幾つかの実
施形態においては、TALEタンパク質は配列番号2の28、74、87、92、95、
120、124、128、129、147および150においてトランケート化されてい
る。
様エフェクター(TALE)タンパク質結合ドメインの製造方法を提供する。該方法は、
a)可変性二残基(RVD)内の又はRVDの1~2アミノ酸残基N末端側もしくはC末
端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより、TALEタンパク質結合ドメインのア
ミノ酸配列をランダム化することと、b)所望のヌクレオチドに特異的に結合する、(a
)のランダム化TALEタンパク質結合ドメインを選択することとを含む。
ベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し
、該TALEタンパク質は、QはYである、QはSである、QはRである、WはRである
、WはGである、Wは欠失している、SはRである、SはHである、SはAである、Sは
Nである、およびSはTであることから選択される1以上の突然変異または欠失を有する
配列番号3(VGKQWSGARAL)に記載されているアミノ酸配列を含むN末端ドメ
イン(NTD)を有する。
ー様エフェクター(TALE)タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該T
ALEタンパク質は、R1はKである、QはYである、QはSである、QはRである、R
2はWである、R2はGである、R2は欠失している、SはRである、SはHである、S
はAである、SはNである、およびSはTであることから選択される1以上の突然変異ま
たは欠失を有する配列番号8(IVDIAR1QR2SGDLA)に記載されているアミ
ノ酸配列を含むN末端ドメイン(NTD)を有する。
質N末端ドメイン(NTD)の製造方法を提供する。該方法は、a)NTD内の1以上の
アミノ酸残基を突然変異または欠失させることにより、NTDのアミノ酸配列をランダム
化することと(ここで、該アミノ酸配列は配列番号14(VGKXXXGAR)または配
列番号15(VDIAXXXXGDLA)である)、b)所望のヌクレオチドに特異的に
結合する又は活性の増強を示す、(a)のランダム化TALEタンパク質NTDを選択す
ることとを含む。
タンパク質、ZFRの製造方法、その組成物、発現ベクター、ならびにトランスジェニッ
ク細胞、組織、植物および動物の作製のためのその使用方法を本明細書に開示する。本発
明の組成物、ベクターおよび方法は遺伝子治療技術においても有用である。
有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ(ZFR)タンパク質の製造方法を提供す
る。該方法は、Gin Ile120、Thr123、Leu127、Ile136およ
びGly137またはそれらの組合せと同等の位置においてリコンビナーゼ触媒ドメイン
上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関して2および3位において該DNAを
突然変異させ、該リコンビナーゼ触媒ドメインを複数のジンクフィンガー結合ドメインと
融合させてZFRを形成させ、対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有する
ZFRを富化させることを含む。幾つかの実施形態においては、ZFRは、GC、GT、
CA、TTおよびACから選択されるDNA標的に対する触媒活性の増強を示す。1つの
実施形態においては、該リコンビナーゼ触媒ドメインはIle136および/またはGl
y137において突然変異誘発される。
ら誘導されるか又は本明細書に開示されているとおりにランダムに突然変異誘発されるリ
コンビナーゼ触媒ドメインを含む:a)Tn3(EcoTn3としても公知);Hin(
StyHinとしても公知);Gin(MuGinとしても公知);Sin;Beta;
Pin;Min;Din;Cin;EcoTn21;SfaTn917;BmeTn50
83;Bme53;Cpe;SauSK1;SauSK41;SauTn552;Ran
;Aac;Lla;pMER05;Mlo92;Mlo90;Rrh;Pje;Req;
PpsTn5501;Pae;Xan;ISXc5;Spy;RhizY4cG;Sar
pNL1;SsolSC1904a;SsolSC1904b;SsoISC1913;
Aam606;MjaM0014;Pab;HpylS607;MtulS Y349;
MtuRv2792c;MtuRv2979c;MtuRv3828c;MtuRv09
21;MceRv0921;TnpX;TndX;WwK;ラクトコッカスファージTP
901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージ
φ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファー
ジφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリア(Listeria)ファージA118セ
リンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC3C
8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色
体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicol
or)染色体SCD78.04cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.co
elicolor)染色体SC8F4.15cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロ
ル(S.coelicolor)染色体SCD12A.23セリンリコンビナーゼ;エス
・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCH10.38cセリンリコンビ
ナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCC88.14セリ
ンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφC31
セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージR4
セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージφ105セリンリコンビ
ナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージSPBc2セリンリコンビナーゼ;バシ
ラス(Bacillus)プロファージSKINセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウ
ス(S.aureus)ccrAセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aur
eus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tubercul
osis)ファージBxb1セリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tub
erculosis)プロファージφRVlセリンリコンビナーゼ;YBCK ECOL
I;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1956;およびCac 1954;またはb
)a)の突然変異タンパク質。
する単離された核酸分子を提供する。
する核酸分子を含む発現カセットを提供する。
を提供する。
た宿主細胞を提供する。
る。該方法は、部位特異的組込みを触媒する本発明のキメラポリペプチドと該DNA配列
を接触させることを含む。
れているキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを
含み、ここで、該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的
に除去または不活性化される。
ているキメラポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む。もう1つの態様においては
、該組成物は、本明細書に記載されているキメラポリペプチドコードする核酸分子と医薬
上許容される担体とを含む。
より産生されるトランスジェニック生物を提供する。
れている部位特異的組込みの方法に産生されたDNA配列を有する核酸分子を含む細胞を
対象に投与することを含む。
離された核酸分子を提供する。
明細書に記載されているキメラタンパク質と特異的に相互作用するための少なくとも2つ
の結合部位を含むDNA配列を提供することと、b)該DNA配列を該キメラタンパク質
と反応させることとを含み、ここで、該キメラタンパク質と特異的に相互作用する2つの
部位の間で該DNA配列の鎖の両方が切断される部位特異的組換え事象を該キメラタンパ
ク質が触媒する。
本発明はTALEリコンビナーゼ(TALER)の最初の開示を提供する。漸増トラン
ケート化TALEドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてD
NAを組換えるために使用されうる最適化TALER構造を特定した。任意の特製TAL
E反復アレイが、本明細書に記載されているTALER構造内に挿入可能であり、ひいて
はバイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を
劇的に拡大する。
配列に結合するように設計されうる。TALE DNA結合ドメインの設計のための一般
的指針は、TALEにより結合されるDNA配列の最も5’側の塩基(N0塩基)がチミ
ンであるべきだと提示している。該N0要件は、この位置に各DNA塩基を含有するTA
LE転写因子(TALE-TF)、TALEリコンビナーゼ(TALE-R)およびTA
LEヌクレアーゼ(TALEN)の活性の分析により定量された。5’Tの非存在下では
、5’Tを含有する標的配列と比較して、TALE-TF活性においては>1000倍ま
での、TALE-R活性においては100倍までの、そしてTALEN活性においては1
0倍までのTALE活性の低下が観察された。全ての可能なN0塩基を認識するTALE
構造体を開発するために、TALE-R活性選択と組合された構造誘導ライブラリー設計
を用いて、任意のN0塩基を含有する新規TALE N末端ドメインを得た。G選択的ド
メインおよび広範反応性ドメインを単離し、特徴づけした。TALE-R形態において選
択された操作されたTALEドメインはモジュラー性を示し、TALE-TFおよびTA
LEN構造において活性であった。得られたN末端ドメインは、TALE結合性タンパク
質およびデザイナー(designer)酵素としての任意のDNA配列の、有効かつ制
約の無い、TALEに基づく標的化をもたらす。
ための、知識に基づくアプローチが記載された。特異性決定DNA結合残基の飽和突然変
異誘発に基づくこの戦略を、特異性における>10,000倍の変化を示すリコンビナー
ゼ変異体を作製するために用いた。重要なことに、このアプローチは、リコンビナーゼ二
量体境界の外部に位置するアミノ酸残基に専ら焦点を合わせている(図35)。その結果
、再操作触媒ドメインが会合してZFRヘテロ二量体を形成すること、およびこれらの設
計されたZFRペアが、予め決定されたDNA配列を並外れた特異性で組換えること確認
された。総合すると、これらの結果は、この方法により開発される特殊化触媒ドメインの
拡張カタログが、特別仕様(カスタム)の特異性を有するZFRを作製するために用いら
れうると仮定することに本発明者らを導いた。ここでは、推定4×108個のユニーク2
0bpコア配列を認識しうるGinリコンビナーゼ触媒ドメインの多様なコレクションを
開発するために、基質特異性分析と定向進化との組合せを用いる。これらの再操作触媒ド
メインから構築されたZFRは、使用者により定められた配列を高い特異性で組換え、ヒ
ト細胞における標的化内因性遺伝子座内にDNAを組込むことが示されている。これらの
結果は、ゲノム操作および遺伝子治療を含む多種多様な用途のためのZFR技術の可能性
を示している。
よび実験条件に限定されず、そのような装置、方法および条件は変動しうる、と理解され
るべきである。また、本明細書中で用いる用語は、個々の実施形態を説明することを目的
としたものであるに過ぎず、限定的なものではないと理解されるべきである。なぜなら、
本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみにおいて限定されるからである。
ない限り、複数対象物を含む。したがって、例えば、「組成物」または「方法」が示すも
のは、本開示などを読めば当業者に明らかとなる本明細書に記載されているタイプの、1
以上の組成物および方法ならびに/または工程を含む。
が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に
記載されているものと類似または同等の任意の方法および物質が本発明の実施および試験
において使用されうるが、好ましい方法および物質を以下に説明する。
位特異的組換えを引き起こす酵素のファミリーである(Esposito,D.およびS
cocca,J.J.,Nucleic Acids Research 25,360
5-3614(1997);Nunes-Duby,S.E.ら,Nucleic Ac
ids Research 26,391-406(1998);Stark,W.M.
ら,Trends in Genetics 8,432-439(1992))。
いが、配列特異的結合活性を有する、天然に存在するTALEタンパク質に由来するTA
LEドメインまたは合成由来のTALEタンパク質もしくはドメインを有するリコンビナ
ーゼを含む。
のではないが、配列特異的結合活性を有する、天然に存在するジンクフィンガーDNA結
合タンパク質に由来するジンクフィンガー結合ドメインまたは合成由来のジンクフィンガ
ー結合タンパク質もしくはドメインを有するリコンビナーゼを含む。
イン」なる語または類似の用語は、天然に存在するジンクフィンガーおよび人工的に製造
されたジンクフィンガーの両方を意味する。そのようなジンクフィンガーは、C2H2、
C4、H4、H3C、C3X、H3X、C2X2およびH2X2(ここで、Xは亜鉛結合
アミノ酸である)(これらに限定されるものではない)のような種々のフレームワーク構
造を有しうる。ジンクフィンガー構造の説明において通常用いられるとおり、これらのフ
レームワーク構造においては、「C」はシステイン残基を表し、「H」はヒスチジン残基
を表す。フレームワークC2H2を有するジンクフィンガーには、例えば以下のものに記
載されているジンクフィンガーが含まれるが、それらに限定されるものではない:Bar
basら,国際公開番号WO2008/006028、Barbas,米国特許第7,1
01,972号、Barbasら,米国特許第7,067,617号、Barbasら,
米国特許第6,790,941号、Barbas,米国特許第6,610,512号、B
arbasら,米国特許第6,242,568号、Barbasら,米国特許第6,14
0,466号、Barbas,米国特許第6,140,081号、Barbas,米国特
許出願公開第20060223757号、Barbasら,米国特許出願公開第2006
0211846号、Barbasら,米国特許出願公開第20060078880号、B
arbas,米国特許出願公開第20050148075号、Barbasら,米国特許
出願公開第20050084885号、Barbasら,米国特許出願公開第20040
224385号、Barbasら,米国特許出願公開第20030059767号、Ba
rbasら,米国特許出願公開第20020165356号(これらの全てを参照により
本明細書に組み入れることとする。他のジンクフィンガーは以下のものに記載されている
:Rebarら,米国特許第7,067,317号;Liuら,米国特許第7,030,
215号;Rebarら,米国特許第7,026,462号;Caseら,米国特許第7
,013,219号;Cox IIIら,米国特許第6,979,539号;Caseら
,米国特許第6,933,113号;Cox IIIら,米国特許第6,824,978
号;Eisenbergら,米国特許第6,794,136号;Eisenbergら,
米国特許第6,785,613号;Caseら,米国特許第6,777,185号;Ch
ooら,米国特許第6,706,470号;Cox IMら,米国特許第6,607,8
82号;Caseら,米国特許第6,599,692号;Cox IIら,米国特許第6
,534,261号;Caseら,米国特許第6,503,717号;Eisenber
gら,米国特許第6,453,242号;Rebarら,米国特許出願公開第2006/
0246588号;Rebarら,米国特許出願公開第2006/0246567号;C
aseら,米国特許出願公開第2006/0166263号;Cox HIら,米国特許
出願公開第2006/0078878号;Rebarら,米国特許出願公開第2005/
0257062号;Cox IIIら,米国特許出願公開第2005/0215502号
;Cox MIら,米国特許出願公開第2005/0130304号;Caseら,米国
特許出願公開第2004/0203064;Caseら,米国特許出願公開第2003/
0166141号;Caseら,米国特許出願公開第2003/0134318号;Ei
senbergら,米国特許出願公開第2003/0105593号;Cox IMら,
米国特許出願公開第2003/0087817号;Rebarら,米国特許出願公開第2
003/0021776号;およびCaseら,米国特許出願公開第2002/0081
614号(これらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする)。例えば、これ
らの特許および特許公開に記載されている1つの代替手段は、いわゆる「D-エイブル(
able)部位」、およびそのような部位に結合するジンクフィンガーモジュールまたは
ジンクフィンガーDNA結合ドメインの使用を含む。「D-エイブル」部位は、適切に設
計されたジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーDNA結合ドメインが標的
鎖の3個の塩基ではなく4個の塩基に結合することを可能にする標的部位の領域である。
そのようなジンクフィンガーモジュールまたはジンクフィンガーDNA結合ドメインは二
本鎖DNA標的セグメントの一方の鎖(標的鎖)上の3個の塩基のトリプレットおよび他
方の相補鎖上の第4の塩基に結合する。4塩基標的セグメントへの単一ジンクフィンガー
の結合は標的鎖の配列およびジンクフィンガーのアミノ酸配列の両方に制約を課す。
それらの良く知られた3文字または1文字略語に従い特定される。種々のDNAセグメン
トに存在するヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる標準的な1文字表示で示され
る。
あり、一般に、生じる分子の生物活性を改変することなく施されうる。一般に、ポリペプ
チドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に改変しないと当業者は
認識している(例えば、Watsonら,Molecular Biology of
the Gene,4th Edition,1987,Benjamin/Cummi
ngs,p.224を参照されたい)。特に、そのような保存的変異体は修飾アミノ酸配
列を有していて、該変化はタンパク質(保存的変異体)の構造および/または活性、例え
ば抗体活性、酵素活性または受容体活性を実質的に改変しない。これらは、アミノ酸配列
の保存的修飾変異、すなわち、タンパク質の活性に決定的に重要ではない残基のアミノ酸
置換、付加または欠失、あるいは、決定的に重要なアミノ酸の置換でさえも構造および/
または活性を実質的に改変しないような、類似特性(例えば、酸性、塩基性、正または負
電荷、極性または無極性など)を有する残基によるアミノ酸の置換を含む。機能的に類似
したアミノ酸を示す保存的置換の表が当技術分野でよく知られている。例えば、保存的置
換を選択するための1つの典型的な指針は以下のものを含む(元の残基に続いて典型的な
置換が示されている):Ala/GlyまたはSer;Arg/Lys;Asn/Gln
またはHis;Asp/Glu;Cys/Ser;Gln/Asn;Gly/Asp;G
ly/AlaまたはPro;His/AsnまたはGln;Ile/LeuまたはVal
;Leu/IleまたはVal;Lys/ArgまたはGlnまたはGlu;Met/L
euまたはTyrまたはIle;Phe/MetまたはLeuまたはTyr;Ser/T
hr;Thr/Ser;Trp/Tyr;Tyr/TrpまたはPhe;Val/Ile
またはLeu。代替的な典型的指針は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれが含
む以下の6つのグループを用いる:(1)アラニン(AまたはAla)、セリン(Sまた
はSer)、トレオニン(TまたはThr);(2)アスパラギン酸(DまたはAsp)
、グルタミン酸(EまたはGlu);(3)アスパラギン(NまたはAsn)、グルタミ
ン(QまたはGln);(4)アルギニン(RまたはArg)、リシン(KまたはLys
);(5)イソロイシン(IまたはIle)、ロイシン(LまたはLeu)、メチオニン
(MまたはMet)、バリン(VまたはVal);および(6)フェニルアラニン(Fま
たはPhe)、チロシン(YまたはTyr)、トリプトファン(WまたはTrp);(例
えば、Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman a
nd Company;SchulzおよびSchimer(1979)Princip
les of Protein Structure,Springer-Verlag
も参照されたい)。前記置換は唯一の可能な保存的置換ではないと当業者は理解するであ
ろう。例えば、幾つかの目的には、全ての荷電アミノ酸を、それらが正であるか負である
かにかかわらず、互いに保存的置換とみなしうる。また、コード化配列内の単一アミノ酸
または小さな比率のアミノ酸を改変し、付加し、または欠失させる個々の置換、欠失また
は付加も、運ばれるタンパク質の三次元構造および機能がそのような変異により保存され
ている場合には、「保存的修飾変異」とみなされうる。
は本発明における融合タンパク質をコードする核酸のような異種DNAの挿入または組込
みにより操作されているプラスミド、ウイルス、ファジミドまたは当技術分野で公知の他
のビヒクルを意味する。そのような発現ベクターは、典型的に、細胞における挿入核酸の
効率的転写のためのプロモーター配列を含有する。該発現ベクターは、典型的に、複製起
点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有す
る。
れる細胞を意味する。この語はまた、対象宿主細胞の任意の後代を含む。全ての後代は親
細胞と同一でなくてもよいと理解される。なぜなら、複製中に突然変異が生じうるからで
ある。「宿主細胞」なる語が用いられる場合には、そのような後代が含まれる。外来DN
Aが宿主内で連続的に維持される場合の安定導入の方法は当技術分野で公知である。
る哺乳動物、特にヒトの或る細胞、標的細胞への異種DNAの導入を含む。異種DNAが
発現され、それによりコードされる治療用産物が産生されるように、該DNAは、選択さ
れた標的細胞内に導入される。あるいは、該異種DNAは、何らかの方法で、治療用産物
をコードするDNAの発現を引き起こし、あるいはそれは、何らかの方法で、治療用産物
の発現を直接的または間接的に引き起こすペプチドまたはRNAのような産物をコードし
うる。遺伝子治療は、それが行われた哺乳動物または細胞により産生される遺伝子産物を
補足する又は欠損遺伝子を置換する遺伝子産物をコードする核酸を運搬するためにも用い
られうる。導入核酸は、哺乳動物宿主において通常は産生されない又は治療的に有効な量
もしくは治療的に有効な時点で産生されない治療用化合物、例えば、その増殖因子インヒ
ビター、または腫瘍壊死因子もしくはそのインヒビター、例えば、それに対する受容体を
コードしうる。該治療用産物をコードする異種DNAは、該産物またはその発現を増強ま
たは改変するために、罹患宿主の細胞内への導入の前に修飾されうる。遺伝子治療はまた
、遺伝子発現のインヒビターまたはリプレッサーまたは他のモジュレーターの運搬を含み
うる。
されないRNAおよびタンパク質をコードする、あるいは転写、翻訳または他の調節可能
な生化学的過程に影響を及ぼすことにより内因性DNAの発現を改変するメディエーター
を媒介またはコードするDNAである。異種DNAは外来DNAとも称されうる。発現さ
れる細胞にとって異種または外来性であるものとして当業者が認識し又はみなす任意のD
NAが本発明においては異種DNAに含まれる。異種DNAの例には、薬物耐性を付与す
るタンパク質のような追跡可能なマーカータンパク質をコードするDNA、抗癌物質、酵
素およびホルモンのような治療的に有効な基質をコードするDNA、ならびに抗体のよう
な他のタイプのタンパク質をコードするDNAが含まれるが、これらに限定されるもので
はない。異種DNAによりコードされる抗体は、該異種DNAが導入された細胞の表面上
で分泌または発現されうる。
れる対応DNA分子としての正確な配向および位置では存在しないDNA分子が含まれる
。それは別の生物または種からの(すなわち、外因性)DNA分子をも意味しうる。
たは後天的疾患の症状、徴候を改善もしくは排除する又は該疾患を治癒させる産物が発現
される、異種核酸、典型的にはDNAによりコードされる産物である。典型的には、所望
の遺伝子産物をコードするDNAをプラスミドベクター内にクローニングし、通常の方法
、例えばリン酸カルシウム媒介性DNA取り込み((1981)Somat.Cell.
Mol.Genet.7:603-616を参照されたい)またはプロデューサー細胞、
例えばパッケージング細胞内へのマイクロインジェクションにより導入する。プロデュー
サー細胞内での増幅の後、異種DNAを含有するベクターを、選択された標的細胞内に導
入する。
ために外来または異種DNAが挿入されうる任意のプラスミドまたはウイルスを意味する
。すなわち、該DNAによりコードされるタンパク質またはポリペプチドは宿主細胞の系
において合成される。1以上のタンパク質をコードするDNAセグメント(遺伝子)の発
現を導くベクターは本明細書においては「発現ベクター」と称される。逆転写酵素を使用
して産生されるmRNAからのcDNA(相補的DNA)のクローニングを可能にするベ
クターも含まれる。
列を有する核酸分子を意味する。遺伝子はRNAまたはDNAでありうる。遺伝子はコー
ド領域の前および後の領域(リーダーおよびトレーラー)ならびに個々のコードセグメン
ト(エキソン)間の介在配列(イントロン)を含みうる。
(された)」なる語は、該ポリペプチドまたは核酸が得られた遺伝的環境から該核酸また
はポリペプチドが分離されていることを意味する。それは、該生体分子が天然状態から改
変されていることをも意味しうる。該用語が本明細書において用いられている場合、例え
ば、生きた動物において天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」
されていないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離」されている。したがって、組換え宿主細胞内で産生および/または
含有されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されているとみなされる。また、
組換え宿主細胞または天然源から部分的または実質的に精製されているポリペプチドまた
はポリヌクレオチドは「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド
」であると意図される。例えば、化合物の組換え産生形態は、Smithら(1988)
Gene 67:3140に記載されている1工程法により実質的に精製されうる。単離
(された)および精製(された)なる語は互換的に用いられることがある。
をコードする遺伝子に直に隣接している遺伝子のコード配列を該核酸が含有しないことを
意味する。単離されたDNAは一本鎖または二本鎖であることが可能であり、ゲノムDN
A、cDNA、組換えハイブリッドDNAまたは合成DNAでありうる。それは天然DN
A配列と同一であることが可能であり、あるいは1以上のヌクレオチドの欠失、付加また
は置換によりそのような配列とは異なっていることが可能である。
「精製(された)」は、関心のあるDNAまたはタンパク質の粗抽出物を含む、示されて
いるDNAまたはタンパク質を含有する任意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク
質の場合、精製された調製物は、個々の技術または一連の調製用もしくは生化学的技術に
従い得られることが可能であり、関心のあるDNAまたはタンパク質はこれらの調製物に
おいて種々の純度で存在しうる。タンパク質の場合には特に、該方法には、例えば、硫酸
アンモニウム分画、ゲル濾過、イオン交換変化クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、密度勾配遠心分離、エレクトロフォーカシング(等電点電気泳動)、クロ
マトフォーカシングおよび電気泳動が含まれるが、これらに限定されるものではない。
うなDNAまたはタンパク質に天然で通常付随している天然に存在する物質を含有しない
調製物を意味すると理解されるべきである。「実質的に純粋な」は、少なくとも95%の
関心のあるDNAまたはタンパク質を含有する「高度に」精製された調製物を意味すると
理解されるべきである。
する又は該タンパク質を発現する細胞から得られた均一調製物または細胞非含有調製物を
意味すると理解されるべきである。「細胞抽出物」なる語は、培地、特に、該細胞が取り
出された使用済み培地を含むと意図される。
置する調節要素を含み、介在ヌクレオチド配列により隔てられた複数の調節要素が存在し
うる。遺伝子を活性化させるためには、転写因子として公知のタンパク質を該遺伝子のプ
ロモーター領域に付着させる。この合体状態は、第2の遺伝的セグメントをDNAからR
NAへと酵素が転写することを可能にすることにより、「スイッチの入った状態(オン・
スイッチ)」に似たものとなる。ほとんどの場合、生じたRNA分子は特定のタンパク質
の合成のための鋳型として働き、時には、RNA自体が最終産物である。プロモーター領
域は通常の細胞プロモーターまたは例えば腫瘍プロモーターでありうる。腫瘍プロモータ
ーは一般にウイルス由来プロモーターである。ジンクフィンガー結合性ポリペプチドが標
的化されうるウイルスプロモーターには、レトロウイルス長末端反復配列(LTR)、お
よびレンチウイルスプロモーター、例えば、ヒトT細胞リンホトリピックウイルス(HT
LV)1および2ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV)1または2からのプロモータ
ーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
リンリコンビナーゼのような天然タンパク質の不完全なアミノ酸配列を含有するポリペプ
チド誘導体を意味する。
、リガンドもしくは核酸分子に結合する又は転写をモジュレーションする能力を尚も保有
する、ポリペプチドの突然変異誘発形態であるポリペプチドまたは組換えにより産生され
たポリペプチドを意味する。
「生理的に許容される」なる語およびそれらの文法的派生語は互換的に用いられ、該組成
物の投与を禁止するほどの悪心、眩暈、胃の不調などのような望ましくない生理的作用を
もたらすことなくヒトに又はヒトの表面上に該物質が投与可能であることを表す。
、異なる遺伝的環境間で輸送しうる核酸分子を意味する。好ましいベクターとしては、そ
れが機能的に連結されているDNAセグメントに存在する構造遺伝子産物の自律的な複製
および発現が可能なベクターが挙げられる。したがって、ベクターは、好ましくは、既に
記載されているレプリコンおよび選択マーカーを含有する。ベクターには、発現ベクター
が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
機能的に連結されている部分が意図されたとおりに機能するように、配列またはセグメン
トが、好ましくは通常のホスホジエステル結合により、一本鎖または二本鎖形態の1本の
DNA鎖内に共有結合されていることを意味する。ここで提供される転写単位またはカセ
ットが機能的に連結されるベクターの選択は、当技術分野でよく知られているとおり、望
まれる機能特性、例えば、ベクター複製およびタンパク質発現、ならびに形質転換される
宿主細胞に直接左右され、これらは、組換えDNA分子を構築する技術分野に固有の制約
である。
であり、経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入技術、腹腔内投与および非経口投与
(これらに限定されるものではない)を含む。
Aの取り込みにより生じる、細胞における遺伝可能な改変を意味する。適当な方法には、
ウイルス感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーシ
ョン、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションな
どが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の型、および形質転換が生じ
る状況(すなわち、インビトロ、エクスビボまたはインビボ)に左右される。これらの方
法の一般的考察はAusubelら,Short Protocols in Mole
cular Biology,3rd ed.,Wiley & Sons,1995に
見出されうる。
クレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体の任意長のヌクレオチドの重合
形態を意味する。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することが可能であり、公知
または未知の任意の機能を行いうる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺
伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファー
RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリ
ヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離DNA、任意配列の単離RNA、
核酸プローブおよびプライマーが含まれる。
物を含む。そのようなカセットは、発現カセットを標的細胞内に導入するために、「ベク
ター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」または「遺伝子導入ベクター」へと構築
されうる。したがって、該用語はクローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベク
ターを含む。
である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定し
、および/またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第2の
ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、それ
ぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の厳密なヌクレオチドとヌクレオ
チドとの又はアミノ酸とアミノ酸との一致を意味する。2以上の配列(ポリヌクレオチド
またはアミノ酸)が、それらの「同一性(%)」を決定することにより比較されうる。2
つの配列の同一性(%)は、核酸配列の場合でもアミノ酸配列の場合でも、2つの整列配
列の間の厳密なマッチの数を、短いほうの配列の長さで割り算し、100を掛けたもので
ある。核酸配列のおおよそのアライメントはSmithおよびWaterman,Adv
ances in Applied Mathematics 2:482-489(1
981)の局所相同性アルゴリズムにより得られる。このアルゴリズムは、Dayhof
f(Atlas of Protein Sequences and Structu
re,M.O.Dayhoff編,5suppl.3:353-358,Nationa
l Biomedical Research Foundation,Washing
ton,D.C.,USA)により開発されGribskov(Nucl.Acids
Res.14(6):6745-6763(1986))により標準化されたスコアリン
グマトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用されうる。配列の同一性(%
)を決定するためのこのアルゴリズムの典型的な実行は「BestFit」ユーティリテ
ィアプリケーションにおいてGenetics Computer Group(Mad
ison,Wis.)によりもたらされる。この方法のためのデフォルトパラメータはW
isconsin Sequence Analysis Package Progr
am Manual,Version 8(1995)(Genetics Compu
ter Group,Madison,Wis.から入手可能)に記載されている。本発
明の場合の同一性(%)を確定するための好ましい方法は、University of
Edinburghが著作権を有しJohn F.CollinsおよびShane
S.Sturrokにより開発されIntelliGenetics,Inc.(Mou
ntain View,Calif)により頒布されたプログラムのMPSRCEパッケ
ージを使用することである。このパッケージの一式から、スミス-ウォーターマン(Sm
ith-Waterman)アルゴリズムが使用可能であり、ここで、スコアリング表に
関するデフォルトパラメータ(例えば、12のギャップオープンペナルティ、1のギャッ
プ伸長ペナルティおよび6のギャップ)が使用される。得られたデータから、「マッチ(
Match)」値が「配列同一性」を表す。配列間の同一性または類似性を計算するため
の他の適当なプログラムは当技術分野で一般に公知であり、例えば、もう1つのアライメ
ントプログラムとして、デフォルトパラメータで使用されるBLASTが挙げられる。例
えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用さ
れうる:遺伝暗号=標準;フィルター=無し;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=1
0;マトリックス=BLOSUM62;記述=50配列;ソート=HIGH SCORE
;データベース=非冗長,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBan
k CDS翻訳+Swissタンパク質+Spupdate+PIR。
イゼーション、ならびにそれに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化断片
のサイズ決定により、相同性が決定されうる。2つのDNAまたは2つのポリペプチド配
列が互いに「実質的に相同」であるのは、それらの配列が、前記方法を用いて決定された
場合に、該分子の一定の長さにわたって少なくとも約80%~85%、好ましくは少なく
とも約85%~90%、より好ましくは少なくとも約90%~95%、最も好ましくは少
なくとも約95%~98%の配列同一性を示す場合である。本明細書中で用いる実質的に
相同はまた、特定されたDNAまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列
に関するものである。実質的に相同なDNA配列は、例えば、その個々の系に関して定め
られるストリンジェントな条件下、サザンハイブリダイゼーション実験において特定され
うる。適当なハイブリダイゼーション条件の決定は当技術分野の技量の範囲内である。例
えば、Sambrookら,前掲;DNA Cloning,前掲;Nucleic A
cid Hybridization,前掲を参照されたい。
同である、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する
。
」とみなされる。2つの核酸分子の間の配列同一性の度合はそのような分子間のハイブリ
ダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全
同一配列が標的分子にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に抑制するであろう。
完全同一配列のハイブリダイゼーションの抑制は、当技術分野でよく知られているハイブ
リダイゼーションアッセイ(例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリ
ダイゼーションなど;Sambrookら,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Second Edition,(1989)C
old Spring Harbor,N.Y.を参照されたい)を用いて評価されうる
。そのようなアッセイは、種々の度合の選択性を用いて、例えば、低いストリンジェンシ
ーから高いストリンジェンシーへと変化する条件を用いて行われうる。低いストリンジェ
ンシーの条件を用いる場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性の部分的な度合さえも
欠く第2プローブ(例えば、標的分子に対して約30%未満の配列同一性を有するプロー
ブ)を使用して評価されることが可能であり、この場合、非特異的結合事象の非存在下で
は、第2プローブは標的にハイブリダイズしない。
ローブを選択し、ついで、適当な条件の選択により、該プローブおよび該標的配列が互い
に「選択的にハイブリダイズ」または結合してハイブリッド分子を形成する。「中等度に
ストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズしうる核酸分子は、典
型的に、選択された核酸プローブの配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有す
る少なくとも約10~14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハ
イブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択
された核酸プローブの配列に対して約90~95%以上の配列同一性を有する少なくとも
約10~14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび標的が
特定の度合の配列同一性を有する場合のプローブ/標的ハイブリダイゼーションに有用な
ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で公知のとおりに決定されうる(例えば、N
ucleic Acid Hybridization:A Practical Ap
proach,B.D.HamesおよびS.J.Higgins編,(1985)Ox
ford;Washington,D.C.;IRL Pressを参照されたい)。
要因を変動させることにより、個々のストリンジェンシーを確立するために多数の同等の
条件が用いられうることが当技術分野でよく知られている:プローブおよび標的配列の長
さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の
濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤(例えば、ホルムアミド、硫酸デ
キストランおよびポリエチレングリコール)の存在または非存在、ハイブリダイゼーショ
ン反応温度および時間パラメータ、ならびに種々の洗浄条件。ハイブリダイゼーション条
件の個々の組合せの選択は、当技術分野における標準的な方法に従い選択される(例えば
、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laborator
y Manual,Second Edition,(1989)Cold Sprin
g Harbor,N.Y.を参照されたい)。
えるのは、それが、第2ポリヌクレオチド、そのcDNA、その相補体の領域と同じ又は
実質的に同じ塩基対配列を有する場合、あるいはそれが前記の配列同一性を示す場合であ
る。
、それが、(i)第2ポリヌクレオチドから誘導された(に由来する)第1ポリヌクレオ
チドによりコードされている、あるいは(ii)前記のとおりの第2ポリペプチドに対す
る配列同一性を示す場合である。
ーゼのレゾルバーゼ/インベルターゼファミリーの超活性化変異体はアクセサリーファク
ターの非存在下で機能し、したがって、天然DNA結合ドメインを操作ジンクフィンガー
タンパク質(ZFP)で置換することにより、関心のある配列に再標的化されうる。
ィンガーDNA結合ドメインおよびレゾルバーゼ/インベルターゼファミリーのセリンリ
コンビナーゼに由来する活性化触媒ドメインから構成されるキメラ酵素である。操作され
た触媒ドメインから構築されたZFRは、使用者により定められたDNA標的を、高い特
異性で効率的に組換え、設計されたZFRはDNAをヒト細胞内の標的化内因性遺伝子座
内に組込む。
有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ(ZFR)タンパク質の製造方法を提供す
る。該方法は、野生型Gin触媒ドメインに関するGin Ile120、Thr123
、Leu127、Ile136およびGly137またはそれらの組合せと同等な位置に
おいてリコンビナーゼ触媒ドメイン上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関し
て2および3位において該DNAを突然変異させ、該リコンビナーゼ触媒ドメインを複数
のジンクフィンガー結合ドメインと融合させてZFRを形成させ、対応野生型リコンビナ
ーゼより大きな触媒特異性を有するZFRを富化させることを含む。幾つかの実施形態に
おいては、ZFRは、GC、GT、CA、TTおよびACから選択されるDNA標的に対
する触媒活性の増強を示す。1つの実施形態においては、該リコンビナーゼ触媒ドメイン
はIle136および/またはGly137において突然変異誘発される。
フィンガー結合ドメインに機能的に連結されたGin触媒ドメインが含まれる。本発明に
より製造される典型的なZFRには、表2に記載されているものが含まれる。
の他のリコンビナーゼの触媒ドメインに適用されうる。そのようなリコンビナーゼは以下
のものを含む:a)Tn3(EcoTn3としても公知);Hin(StyHinとして
も公知);MuGin;Sin;Beta;Pin;Min;Din;Cin;EcoT
n21;SfaTn917;BmeTn5083;Bme53;Cpe;SauSK1;
SauSK41;SauTn552;Ran;Aac;Lla;pMER05;Mlo9
2;Mlo90;Rrh;Pje;Req;PpsTn5501;Pae;Xan;IS
Xc5;Spy;RhizY4cG;SarpNL1;SsolSC1904a;Sso
lSC1904b;SsoISC1913;Aam606;MjaM0014;Pab;
HpylS607;MtulS Y349;MtuRv2792c;MtuRv2979
c;MtuRv3828c;MtuRv0921;MceRv0921;TnpX;Tn
dX;WwK;ラクトコッカスファージTP901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピ
ロゲネス(S.pyogenes)ファージφ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・
ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリ
ア(Listeria)ファージA118セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(
S.coelicolor)染色体SC3C8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエ
リコロル(S.coelicolor)染色体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;
エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD78.04cセリンリコ
ンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC8F4.15
cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC
D12A.23セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor
)染色体SCH10.38cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coel
icolor)染色体SCC88.14セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(S
treptomyces)ファージφC31セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス
(Streptomyces)ファージR4セリンリコンビナーゼ;バシラス(Baci
llus)ファージφ105セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファ
ージSPBc2セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)プロファージSK
INセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrAセリンリコ
ンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エ
ム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)ファージBxb1セリンリコンビ
ナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)プロファージφRVl
セリンリコンビナーゼ;YBCK ECOLI;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1
956;およびCac 1954;またはb)a)の突然変異タンパク質。
ィニティ結合性の欠如および構築の困難さが、専門化されていない研究室におけるZFP
の広範な採用を妨げている。キサントモナス(Xanthomonas)からの転写アク
チベーター様エフェクター(TALE)タンパク質における新規タイプのDNA結合ドメ
インの発見がZFPの代替手段をもたらす。キメラTALEリコンビナーゼ(TALER
)、すなわち、DNAインベルターゼGinからの超活性化触媒ドメインと最適化TAL
E構造との操作融合体が本明細書に記載されている。細菌細胞においてジンクフィンガー
リコンビナーゼに匹敵する効率および特異性でDNAを修飾するTALER融合体を特定
するために、漸増トランケート化TALE変異体のライブラリーを特定した。実施例にも
示されているとおり、TALERは哺乳類細胞においてDNAを組換える。本明細書に記
載されているTALER構造体は特別仕様(カスタム)TALEドメインの挿入のための
プラットフォームとなり、したがって、操作リコンビナーゼの標的化能ならびにバイオテ
クノロジーおよび医学におけるそれらの潜在的用途を有意に拡大する。
配列に結合するように設計されうる。TALE DNA結合ドメインの設計のための一般
的指針は、TALEにより結合されるDNA配列の最も5’側の塩基(N0塩基)がチミ
ンであるべきだと提示している。本発明者らは、この位置に各DNA塩基を含有するTA
LE転写因子(TALE-TF)、TALEリコンビナーゼ(TALE-R)およびTA
LEヌクレアーゼ(TALEN)の活性の分析により、該N0要件を定量した。5’Tの
非存在下では、5’Tを含有する標的配列と比較して、TALE-TF活性においては>
1000倍までの、TALE-R活性においては100倍までの、そしてTALEN活性
においては10倍までのTALE活性の低下が観察された。全ての可能なN0塩基を認識
するTALE構造体を開発するために、TALE-R活性選択と組合された構造誘導ライ
ブラリー設計を用いて、任意のN0塩基を含有する新規TALE N末端ドメインを得た
。G選択的ドメインおよび広範反応性ドメインを単離し、特徴づけした。TALE-R形
態において選択された操作されたTALEドメインはモジュラー性を示し、TALE-T
FおよびTALEN構造において活性であった。得られたN末端ドメインは、TALE結
合性タンパク質およびデザイナー(designer)酵素としての任意のDNA配列の
、有効かつ制約の無い、TALEに基づく標的化をもたらす。
ベーター様エフェクター(TALE)タンパク質結合ドメインの製造方法を提供する。実
施例に示されているとおり、該方法は、a)可変性二残基(RVD)内の又はRVDの1
~2アミノ酸残基N末端側もしくはC末端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより
、TALEタンパク質結合ドメインのアミノ酸配列をランダム化し、b)所望のヌクレオ
チドに特異的に結合する、(a)のランダム化TALEタンパク質結合ドメインを選択す
ることを含む。
該配列特異的ポリペプチドは特別仕様(カスタム)TALエフェクターDNA結合ドメイ
ンを含む。したがって、もう1つの態様においては、本発明はキメラポリペプチドを提供
する。該ポリペプチドは、a)リコンビナーゼ、転写因子またはヌクレアーゼ、およびb
)転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含む。
、該植物細胞において、それは核に移行し、転写因子として機能して特異的植物遺伝子の
スイッチを入れる。TALEの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を
決定する。したがって、TALEの標的部位は予測可能であり、本明細書に記載されてい
るとおり、特定のヌクレオチド配列への結合を目的としてTALEは操作され、製造され
うる。
ナーゼまたはそれらの一部をコードする配列である。本発明において使用されうる多数の
そのようなタンパク質が当技術分野で公知である。
む。前記のとおり、多数のリコンビナーゼの触媒ドメインが使用されうる。そのようなリ
コンビナーゼには以下のものが含まれる:a)Tn3(EcoTn3としても公知);H
in(StyHinとしても公知);Gin(MuGinとしても公知);Sin;Be
ta;Pin;Min;Din;Cin;EcoTn21;SfaTn917;BmeT
n5083;Bme53;Cpe;SauSK1;SauSK41;SauTn552;
Ran;Aac;Lla;pMER05;Mlo92;Mlo90;Rrh;Pje;R
eq;PpsTn5501;Pae;Xan;ISXc5;Spy;RhizY4cG;
SarpNL1;SsolSC1904a;SsolSC1904b;SsoISC19
13;Aam606;MjaM0014;Pab;HpylS607;MtulS Y3
49;MtuRv2792c;MtuRv2979c;MtuRv3828c;MtuR
v0921;MceRv0921;TnpX;TndX;WwK;ラクトコッカスファー
ジTP901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)フ
ァージφ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)
ファージφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリア(Listeria)ファージA1
18セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体S
C3C8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor
)染色体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coeli
color)染色体SCD78.04cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S
.coelicolor)染色体SC8F4.15cセリンリコンビナーゼ;エス・コエ
リコロル(S.coelicolor)染色体SCD12A.23セリンリコンビナーゼ
;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCH10.38cセリンリ
コンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCC88.1
4セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφ
C31セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファー
ジR4セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージφ105セリンリ
コンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージSPBc2セリンリコンビナーゼ
;バシラス(Bacillus)プロファージSKINセリンリコンビナーゼ;エス・ア
ウレウス(S.aureus)ccrAセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.
aureus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuber
culosis)ファージBxb1セリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.
tuberculosis)プロファージφRVlセリンリコンビナーゼ;YBCK E
COLI;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1956;およびCac 1954;ま
たはb)a)の突然変異タンパク質。好ましい実施形態においては、高活性Gin触媒ド
メインが使用される。そのようなドメインは、本明細書に記載されているとおり、本発明
の方法を用いて作製されうる。
決定する幾つかの不完全反復を含みうる。各反復は、該反復の残基12および13におけ
る個々の二アミノ酸配列に応じて、単一塩基に結合する。したがって、TALE内の該反
復を操作することにより、特定のDNA部位が標的化されうる。そのような操作されたT
ALEは、例えば、特定のDNA配列に標的化される転写因子として使用されうる。
ン(トランケート化)を有するTALEタンパク質を含む。例えば、該TALEタンパク
質は配列番号2の全部または一部を含みうる。幾つかの実施形態においては、該TALE
タンパク質は配列番号2のアミノ酸残基27と268との間、92と134との間、12
0と129との間、74と147との間または87と120との間、例えば、アミノ酸残
基28、74、87、92、95、120、124、128、129、147および15
0においてトランケート化されている。
LE)タンパク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該TALEタンパク質は、Q
はYである、QはSである、QはRである、WはRである、WはGである、Wは欠失して
いる、SはRである、SはHである、SはAである、SはNである、およびSはTである
ことから選択される1以上の突然変異または欠失を有する配列番号3(VGKQWSGA
RAL)に記載されているアミノ酸配列を含むN末端ドメイン(NTD)を有する。
KSRSGARAL(配列番号5)、VGKYHGARAL(配列番号6)およびVGK
RGAGARAL(配列番号7)から選択されるアミノ酸配列を含む。
パク質を含む単離されたポリペプチドを提供し、該TALEタンパク質は、R1はKであ
る、QはYである、QはSである、QはRである、R2はWである、R2はGである、R
2は欠失している、SはRである、SはHである、SはAである、SはNである、および
SはTであることから選択される1以上の突然変異または欠失を有する配列番号8(IV
DIAR1QR2SGDLA)に記載されているアミノ酸配列を含むN末端ドメイン(N
TD)を有する。
、IVDIARYRGDLA(配列番号10)、IVDIARSRSGDLA(配列番号
11)、IVDIARYHGDLA(配列番号12)およびIVDIARRGAGDLA
(配列番号13)から選択されるアミノ酸配列を含む。
ミノ酸配列を有する修飾されたN0ドメインを含む:LTPDQLVKIAKRGGTA
MEAVHASRNALTGAPLN(配列番号102)。種々の実施形態においては、
TALEタンパク質は突然変異体を含み、ここで、配列番号102のKRGG(配列番号
103)は、LDYE(配列番号104)、INLV(配列番号105)、YSKK(配
列番号106)、NMAH(配列番号107)、SPTN(配列番号108)、SNTR
(配列番号109)、LTTT(配列番号110)、VADL(配列番号111)、MV
LS(配列番号112)、YNGR(配列番号113)、RIPR(配列番号114)、
YSKI(配列番号115)、LTQY(配列番号116)、YLSK(配列番号117
)、LRPN(配列番号118)、LFTN(配列番号119)、LLTN(配列番号1
20)、EEDK(配列番号121)、VTAM(配列番号122)、CPSR(配列番
号123)、LTRV(配列番号124)、KGDL(配列番号125)、QKAL(配
列番号126)、LYLL(配列番号127)、WISV(配列番号128)、GDQV
(配列番号129)およびCPSR(配列番号130)から選択される。
ミノ酸配列を有する修飾されたN-1ドメインを含む:MRSPKKKRKVQVDLR
TLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVAL
SQHPAALGTVAVTYQHIITALPEATHEDIVGVGXXXXXAR
ALEALLTDAGELRGPPLQLDTGQLVKIAKRGGVTAMEAVH
ASRNALTGAP(配列番号131)。種々の実施形態においては、配列番号131
のXXXXXはKRPAG(配列番号132)またはKRPSG(配列番号133)であ
る。また、該タンパク質は、活性の増強を示すE40G突然変異(配列番号131に関す
るもの)を含みうる。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目1]
a)リコンビナーゼ、転写因子またはヌクレアーゼと
b)転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質とを含むキメラポリペプチド。
[項目2]
前記TALEタンパク質がトランケート化されている、項目1記載のキメラタンパク質。
[項目3]
前記TALEタンパク質がC末端またはN末端トランケート化を含む、項目2記載のキメラタンパク質。
[項目4]
前記TALEタンパク質がC末端トランケート化を含む、項目3記載のキメラタンパク質。
[項目5]
前記TALEタンパク質が、AcrXa7、Tal1cおよびPthXolからなる群から選択される、項目1記載のキメラタンパク質。
[項目6]
前記TALEタンパク質が、配列番号2に示すアミノ酸配列を含む、項目1記載のキメラタンパク質。
[項目7]
前記TALEタンパク質がC末端トランケート化を含む、項目6記載のキメラタンパク質。
[項目8]
前記TALEタンパク質がアミノ酸残基27と268との間、92と134との間、120と129との間、74と147との間または87と120との間でトランケート化されている、項目7記載のキメラタンパク質。
[項目9]
前記TALEタンパク質がアミノ酸残基28、74、87、92、95、120、124、128、129、147および150においてトランケート化されている、項目8記載のキメラタンパク質。
[項目10]
前記リコンビナーゼが、
(a)Tn3(EcoTn3としても公知);Hin(StyHinとしても公知);Gin(MuGinとしても公知);Sin;Beta;Pin;Min;Din;Cin;EcoTn21;SfaTn917;BmeTn5083;Bme53;Cpe;SauSK1;SauSK41;SauTn552;Ran;Aac;Lla;pMER05;Mlo92;Mlo90;Rrh;Pje;Req;PpsTn5501;Pae;Xan;ISXc5;Spy;RhizY4cG;SarpNL1;SsolSC1904a;SsolSC1904b;SsoISC1913;Aam606;MjaM0014;Pab;HpylS607;MtulS Y349;MtuRv2792c;MtuRv2979c;MtuRv3828c;MtuRv0921;MceRv0921;TnpX;TndX;WwK;ラクトコッカスファージTP901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリア(Listeria)ファージA118セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC3C8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD78.04cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC8F4.15cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD12A.23セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCH10.38cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCC88.14セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφC31セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージR4セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージφ105セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージSPBc2セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)プロファージSKINセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrAセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)ファージBxb1セリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)プロファージφRVlセリンリコンビナーゼ;YBCK ECOLI;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1956;およびCac 1954;ならびに
b)a)のリコンビナーゼの突然変異タンパク質
からなる群から選択される、項目1記載のキメラタンパク質。
[項目11]
前記リコンビナーゼが、Gin、Hin、Tn3、Sin、Beta、Pin.Min、DinおよびCinならびにGinの突然変異タンパク質、Hinの突然変異タンパク質、Sinの突然変異タンパク質、Betaの突然変異タンパク質、Pinの突然変異タンパク質、Minの突然変異タンパク質、Dinの突然変異タンパク質、Cinの突然変異タンパク質、Tn3の突然変異タンパク質からなる群から選択される、項目10記載のキメラタンパク質。
[項目12]
前記リコンビナーゼがGinである、項目10記載のキメラタンパク質。
[項目13]
前記リコンビナーゼがGinであり、TALEタンパク質がAcrXa7である、項目1記載のキメラタンパク質。
[項目14]
項目1~13のいずれか1項記載のキメラタンパク質をコードする単離された核酸分子。
[項目15]
項目14記載の核酸分子を含む発現カセット。
[項目16]
項目15記載の発現カセットを含むベクター。
[項目17]
項目14記載の核酸分子または項目16記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[項目18]
部位特異的組換えのための方法であって、
(a)項目1記載のキメラタンパク質と特異的に相互作用するための少なくとも2つの結合部位を含むDNA配列を提供することと、
(b)該DNA配列を該キメラタンパク質と反応させることと
を含み、該キメラタンパク質と特異的に相互作用する2つの部位の間で該DNA配列の鎖の両方が切断される部位特異的組換え事象を該キメラタンパク質が触媒する、方法。
[項目19]
前記部位特異的組換え事象が逆位である、項目18記載の方法。
[項目20]
前記部位特異的組換え事象が組込みである、項目18記載の方法。
[項目21]
前記部位特異的組換え事象が分離(resolution)である、項目18記載の方法。
[項目22]
項目1記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む遺伝子治療方法であって、
該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的に除去または不活性化される、方法。
[項目23]
前記遺伝子の機能的置換を含む核酸分子を対象に投与することを更に含む、項目22記載の方法。
[項目24]
a)項目1記載のキメラタンパク質と、
b)医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
[項目25]
a)項目1記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子と、
b)医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
[項目26]
項目1記載のキメラタンパク質により触媒される組換えの作用により生産されるトランスジェニック生物。
[項目27]
項目18~21のいずれか1項記載の方法に産生されたDNA配列を有する核酸分子を含む細胞を対象に投与することを含む、遺伝子治療方法。
[項目28]
生物のゲノムを修飾するための方法であって、
項目18~22のいずれか1項記載の方法を使用して該ゲノムの核酸分子上で部位特異的組換えを行うことにより該生物のゲノムを修飾することを含む、方法。
[項目29]
前記生物が原核生物、細菌、ウイルスまたは真核生物である、項目28記載の方法。
[項目30]
所望のヌクレオチドに特異的に結合する転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質結合ドメインの製造方法であって、
a)可変性二残基(RVD)内の又はRVDの1~2アミノ酸残基N末端側もしくはC末端側のアミノ酸残基を突然変異させることにより、TALEタンパク質結合ドメインのアミノ酸配列をランダム化することと、
b)所望のヌクレオチドに特異的に結合する、(a)のランダム化TALEタンパク質結合ドメインを選択することとを含む、製造方法。
[項目31]
項目30記載の製造方法により製造された転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質結合ドメインを含む単離されたタンパク質。
[項目32]
1~40個のTALEタンパク質結合ドメインを含む、項目31記載の単離されたタンパク質。
[項目33]
標的ヌクレオチド配列に特異的に結合する、項目32記載の単離されたタンパク質。
[項目34]
ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ活性を含む、項目33記載の単離されたタンパク質。
[項目35]
遺伝子発現を調節する、項目33記載の単離されたタンパク質。
[項目36]
項目31~35のいずれか1項記載のTALEタンパク質結合ドメインを含むタンパク質をコードする単離された核酸分子。
[項目37]
項目36記載の核酸分子を含む発現カセット。
[項目38]
項目37記載の発現カセットを含むベクター。
[項目39]
項目37記載の核酸分子または項目38記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[項目40]
キサンタモヌス(Xanthamonus)由来転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含む単離されたポリペプチドであって、
該TALEタンパク質が、QはYである、QはSである、QはRである、WはRである、WはGである、Wは欠失している、SはRである、SはHである、SはAである、SはNである、およびSはTであることから選択される1以上の突然変異または欠失を有する配列番号3(VGKQWSGARAL)に示すアミノ酸配列を含むN末端ドメイン(NTD)を有する、単離されたポリペプチド。
[項目41]
前記NTDが、VGKYRGARAL(配列番号4)、VGKSRSGARAL(配列番号5)、VGKYHGARAL(配列番号6)およびVGKRGAGARAL(配列番号7)から選択されるアミノ酸配列を含む、項目40記載のポリペプチド。
[項目42]
ラルストニア(Ralstonia)由来転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含む単離されたポリペプチドであって、
該TALEタンパク質が、R 1 はKである、QはYである、QはSである、QはRである、R 2 はWである、R 2 はGである、R 2 は欠失している、SはRである、SはHである、SはAである、SはNである、およびSはTであることから選択される1以上の突然変異または欠失を有する配列番号8(IVDIAR 1 QR 2 SGDLA)に示すアミノ酸配列を含むN末端ドメイン(NTD)を有する、単離されたポリペプチド。
[項目43]
前記NTDが、IVDIARQWSGDLA(配列番号9)、IVDIARYRGDLA(配列番号10)、IVDIARSRSGDLA(配列番号11)、IVDIARYHGDLA(配列番号12)およびIVDIARRGAGDLA(配列番号13)から選択されるアミノ酸配列を含む、項目42記載のポリペプチド。
[項目44]
リコンビナーゼドメインまたはヌクレアーゼドメインを更に含む、項目40~43のいずれか1項記載のポリペプチド。
[項目45]
項目40~44のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
[項目46]
項目45記載の核酸分子を含む発現カセット。
[項目47]
項目46記載の発現カセットを含むベクター。
[項目48]
項目45記載の核酸分子または項目47記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[項目49]
転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質N末端ドメイン(NTD)の製造方法であって、
a)NTD内の1以上のアミノ酸残基を突然変異または欠失させることにより、NTDのアミノ酸配列をランダム化することと、
b)所望のヌクレオチドに特異的に結合する又は活性の増強を示す、(a)のランダム化TALEタンパク質NTDを選択することを含み、
前記アミノ酸配列は配列番号14(VGKXXXGAR)または配列番号15(VDIAXXXXGDLA)である、製造方法。
[項目50]
対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有する複数のジンクフィンガーリコンビナーゼ(ZFR)タンパク質の製造方法であって、
a)Gin Ile120、Thr123、Leu127、Ile136およびGly137またはそれらの組合せと同等な位置においてリコンビナーゼ触媒ドメイン上でランダム突然変異誘発を行い、各アミノ酸に関して2および3位において該DNAを突然変異させることと、
b)a)のリコンビナーゼ触媒ドメインを複数のジンクフィンガー結合ドメインと融合させてZFRを形成することと、
c)対応野生型リコンビナーゼより大きな触媒特異性を有するb)のZFRを富化させることとを含む、製造方法。
[項目51]
前記ZFRが、GC、GT、CA、TTおよびACから選択されるDNA標的に対する触媒活性の増強を示す、項目50記載の製造方法。
[項目52]
前記リコンビナーゼ触媒ドメインがIle136および/またはGly137において突然変異誘発される、項目50記載の製造方法。
[項目53]
前記ZFRが第1、2、4、6、7、11、13およびX染色体における標的特異性の増強を示す、項目50記載の製造方法。
[項目54]
前記ZFRがベクター内に存在する、項目50記載の製造方法。
[項目55]
前記リコンビナーゼ触媒ドメインが、
a)Tn3(EcoTn3としても公知);Hin(StyHinとしても公知);Gin(MuGinとしても公知);Sin;Beta;Pin;Min;Din;Cin;EcoTn21;SfaTn917;BmeTn5083;Bme53;Cpe;SauSK1;SauSK41;SauTn552;Ran;Aac;Lla;pMER05;Mlo92;Mlo90;Rrh;Pje;Req;PpsTn5501;Pae;Xan;ISXc5;Spy;RhizY4cG;SarpNL1;SsolSC1904a;SsolSC1904b;SsoISC1913;Aam606;MjaM0014;Pab;HpylS607;MtulS Y349;MtuRv2792c;MtuRv2979c;MtuRv3828c;MtuRv0921;MceRv0921;TnpX;TndX;WwK;ラクトコッカスファージTP901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリア(Listeria)ファージA118セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC3C8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD78.04cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC8F4.15cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD12A.23セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCH10.38cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCC88.14セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφC31セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージR4セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージφ105セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージSPBc2セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)プロファージSKINセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrAセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)ファージBxb1セリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)プロファージφRVlセリンリコンビナーゼ;YBCK ECOLI;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1956;およびCac 1954;ならびに
b)a)の突然変異タンパク質
からなる群から選択されるリコンビナーゼからのものである、項目50記載の製造方法。
[項目56]
前記リコンビナーゼ触媒ドメインがGin、Hin、Sin、Beta、Pin、Min、Din、CinまたはTn3の突然変異タンパク質からのものである、項目6記載の方法。
[項目57]
項目50記載の製造方法により製造されるキメラポリペプチド。
[項目58]
前記リコンビナーゼ触媒ドメインが、
a)Tn3(EcoTn3としても公知);Hin(StyHinとしても公知);Gin(MuGinとしても公知);Sin;Beta;Pin;Min;Din;Cin;EcoTn21;SfaTn917;BmeTn5083;Bme53;Cpe;SauSK1;SauSK41;SauTn552;Ran;Aac;Lla;pMER05;Mlo92;Mlo90;Rrh;Pje;Req;PpsTn5501;Pae;Xan;ISXc5;Spy;RhizY4cG;SarpNL1;SsolSC1904a;SsolSC1904b;SsoISC1913;Aam606;MjaM0014;Pab;HpylS607;MtulS Y349;MtuRv2792c;MtuRv2979c;MtuRv3828c;MtuRv0921;MceRv0921;TnpX;TndX;WwK;ラクトコッカスファージTP901-1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφ370.1セリンリコンビナーゼ;エス・ピロゲネス(S.pyogenes)ファージφFC1セリンリコンビナーゼ;リステリア(Listeria)ファージA118セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC3C8.24セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC2E1.37セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD78.04cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SC8F4.15cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCD12A.23セリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCH10.38cセリンリコンビナーゼ;エス・コエリコロル(S.coelicolor)染色体SCC88.14セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージφC31セリンリコンビナーゼ;ストレプトマイセス(Streptomyces)ファージR4セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージφ105セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)ファージSPBc2セリンリコンビナーゼ;バシラス(Bacillus)プロファージSKINセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrAセリンリコンビナーゼ;エス・アウレウス(S.aureus)ccrBセリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)ファージBxb1セリンリコンビナーゼ;エム・ツベルクロシス(M.tuberculosis)プロファージφRVlセリンリコンビナーゼ;YBCK ECOLI;Y4bA;Bja;Spn;Cac 1956;およびCac 1954;ならびに
b)a)の突然変異タンパク質
からなる群から選択される、項目57記載のキメラポリペプチド。
[項目59]
前記リコンビナーゼ触媒ドメインがGin、Hin、Sin、Beta、Pin、Min、Din、CinまたはTn3の突然変異タンパク質からのものである、項目9記載の方法。
[項目60]
項目57記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
[項目61]
項目60記載の核酸分子を含む発現カセット。
[項目62]
項目61記載の発現カセットを含むベクター。
[項目63]
項目62記載のベクターを含有する単離された宿主細胞。
[項目64]
部位特異的組込みを触媒する項目57記載のキメラポリペプチドとDNA配列を接触させることを含む、DNA配列内への部位特異的組込みのための方法。
[項目65]
項目57記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む遺伝子治療方法であって、
該核酸分子の発現に際して、該対象のゲノム内に存在する遺伝子が特異的に除去または不活性化される、方法。
[項目66]
該遺伝子の機能的置換を含む核酸分子を対象に投与することを更に含む、項目65記載の方法。
[項目67]
a)項目57記載のキメラポリペプチドと、
b)医薬上許容される担体と
を含む医薬組成物。
[項目68]
a)項目57記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子と、
b)医薬上許容される担体と
を含む医薬組成物。
[項目69]
項目57記載のキメラポリペプチドにより触媒される組換えにより生産されるトランスジェニック生物。
シフェラーゼ活性化(NT-Tおよびそれぞれの5’A/G/C/Tとの比較において、
*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001)。
明の範囲を限定するものではない。それらは、用いられうるものの典型例であるが、それ
らの代わりに、当業者に公知の他の手順、方法または技術が用いられうる。
キメラTALEリコンビナーゼ
実験の概要
この研究はTALEリコンビナーゼ(TALER)の最初の例を示す。漸増トランケー
ト化TALEドメインのライブラリーを使用して、細菌および哺乳類細胞においてDNA
を組換えるために使用されうる最適化TALER構造を特定した。任意の特製TALE反
復アレイが、本明細書に記載されているTALER構造内に挿入可能であり、したがって
、バイオテクノロジーおよび医学における用途のための操作リコンビナーゼの標的化能を
劇的に拡大する。
Ginコード配列の5’側または3’側のいずれかにBamHI制限部位を導入するた
めに、それぞれプライマー5’Gin N-termおよび3’Gin N-termま
たは5’Gin C-termおよび3’Gin C-termでGin触媒ドメインを
PCR増幅した。PCR産物をpBluescriptII(Fermentas)のS
acIおよびXbaI制限部位内に連結して、pB-Bam-GinおよびpB-Gin
-Bamを得た。C末端およびN末端TALER融合体を作製するために、AvrXa7
遺伝子(Iowa State UniversityのB.Yang博士から快く提供
していただいたもの)をBamHIでpWAvrXa7から遊離させ、pB-Bam-G
inおよびpB-Gin-Bam(41)のBamHI部位内に連結して、それぞれpB
-Avr-Bam-GinおよびpB-Gin-Bam-Avrを確立させた。各TAL
ERの正しい構築を配列分析により実証した(図6~16)。
0)および3’ Avr+28または3’Avr+95プライマーと共にExpand
High Fidelity PCR System(Roche)を以下のプログラム
で使用して、AvrXa7をPCR増幅させた:94℃で3分間の1サイクル、94℃で
1分間、52℃で1分間、68℃で6分間の16サイクル、および68℃で1時間の最終
サイクル。Gin触媒ドメインを、5’Gin C-termおよび3’GinNTal
PCRFusで、標準的なPCR条件下でPCR増幅させ、前記PCR条件を用いる重複
PCRによりトランケート化AvrXa7変異体に融合させた。精製されたGin-Av
r PCR産物を等モル比で混合し、SacIおよびXbaIで消化した。
の修飾を加えて使用した。Δ120、Δ128または+28におけるトランケーションを
含むようにpTAL1を修飾した。これを達成するために、AvrXa7Δ120および
AvrXa7Δ128断片を5’Avr n4またはAvr n128および3’Tal
R Xba+28でPCR増幅させ、pTAL1のBamHI制限部位内に連結して、p
TALΔ120およびpTALΔ128を得た。プラスミドpTALΔ120およびpT
ALΔ128はGolden GateクローニングのためのEsp3I制限部位を保有
していた。pTALΔ120およびpTALΔ128内にクローニングされたTALEア
レイをpB-Gin-Bam内への連結のためにBamHIおよびXbaIで消化した。
SD-Gin Fおよび3’GinGS RでpB-Gin-AvrからPCR増幅させ
、pcDNA 3.1(Invitrogen)のNheIおよびBamHI制限部位内
に連結した。Avr15をpTALΔ120またはpTALΔ128からBamH1およ
びXba1で消化し、pcDNA-Gin-Bam内に連結して、pcDNA-Gin-
Avr発現ベクターを得た。
含有プライマー5’pGL3 SV40 BglIIおよび3’pGL3 SV40 H
indIIIでpGL3-プロモーター(Promega)からPCR増幅させ、pGL
3-プロモーターのBglIIおよびHindIII制限部位内に連結した。
既に記載されているとおりに細菌組換えアッセイを行った。
既に記載されている修飾されたプロトコールを用いて、漸増(incremental
)トランケーションライブラリーを作製した。簡潔に説明すると、Ginコード配列をエ
キソヌクレアーゼ消化から保護するために、SmaI制限部位を含有するスタファー(s
tuffer)断片をBamHI内に挿入してpB-Gin-SmaI-Bam-Avr
を得た。このプラスミドをNheIで線状化し、エキソヌクレアーゼIIIで37℃で2
.5分間インキュベートし、ついで75℃で25分間にわたって熱不活性化を行った。つ
いでpB-Gin-Bam-Avrを、200μM dNTPおよび5μM [α]-S
-dNTPの存在下、クレノウフラグメント(3’から5’エキソ)と共に37℃で30
分間インキュベートし、ついで80℃で25分間にわたって熱不活性化を行った。トラン
ケーションライブラリーを作製するために、pB-Gin-Bam-Avrをエキソヌク
レアーゼIIIと共に37℃で2.5分間インキュベートし、ついで熱不活性化およびそ
れに続くリョクトウヌクレアーゼでの平滑末端化を30℃で1時間行った。SmaIでの
消化の後、リコンビナーゼコード配列の平滑3’末端をTALE断片の平滑末端化ライブ
ラリーに連結した。形質転換および精製後、該プラスミドをSacIおよびXbaIで消
化してGin-ΔAvrを遊離させた。
HEK293T細胞を96ウェルプレート上に4×104細胞/ウェルの密度で播き、
加湿5% CO2雰囲気中で37℃で増殖させた。播いた後24時間の時点で、リポフェ
クタミン(Lipofectamine)2000(Invitrogen)を該製造業
者の説明に従い使用して、レニラ(Renilla)ルシフェラーゼの発現のために、細
胞を150ngのpcDNA TALER発現ベクター、2.5ngのpGL3レポータ
ープラスミドおよび1ngのpRL-CMVでトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンの48時間後、細胞を受動細胞溶解(Passive Lysis)バッファー(P
romega)で細胞溶解し、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系(Dual-L
uciferase Reporter Assay System)(Promega
)を該製造業者の説明に従い使用して、ルシフェラーゼ発現を決定した。ベリタス・マイ
クロプレート・ルミノメータ(Veritas Microplate Luminom
eter)(Turner Biosystems)を使用して発光を測定した。
TALER構造
リコンビナーゼ活性の評価および定向進化のための定量系は記載されている。この系(
図1A)においては、組換え部位に隣接するGFPuv導入遺伝子を、TEM-1 β-
ラクタマーゼをコードする遺伝子内に挿入する。この改変はβ-ラクタマーゼ発現を破壊
し、このプラスミド(pBLA)を含有する大腸菌(Escherichia coli
)細胞をアンピシリンに対して感受性にする。しかし、該基質含有プラスミドの活性リコ
ンビナーゼの発現は標的部位間の組換えおよびβ-ラクタマーゼリーディングフレームの
回復を招く。この修飾はアンピシリンに対する宿主細胞耐性を確立し、該基質含有プラス
ミドからの活性リコンビナーゼ変異体の単離を可能にする。プラスミド精製および再形質
転換の後でアンピシリン耐性形質転換体の数を測定することにより、リコンビナーゼ活性
を直接評価することも可能である。キメラリコンビナーゼの活性は触媒ドメインおよびD
BDの両方に依存的であるため、この分割遺伝子再構築選択系は、個々のDBDの有効性
を評価するためにも用いられうる。したがって、該系を、最適TALER構造を決定する
ために適合化した。
メインは、予め定められた触媒特異性を有するため、TALER融合タンパク質は、TA
LENに関して記載されている設計を用いては構築され得ない。γδレゾルバーゼおよび
設計酵素の構造および機能研究は、C末端E-ヘリックスがセリンリコンビナーゼDNA
認識を媒介することを示している。ZFRにおいては、このヘリックスはC末端からN末
端(5’から3’)へとDNAに結合する。したがって、TALEはDNAに5’から3
’への方向で結合するため、組換えは、TALE結合部位が20bpのコアの反対鎖上に
位置する場合にのみ生じうると予想された(図1B)。
Eタンパク質は、TALEヌクレアーゼおよび転写因子を作製するために既に使用されて
いるからである。好都合なことに、BamHI制限部位は、AvrXa7を含む多数のT
ALEに隣接しており、複数のグループが、合成TALE融合体を作製するために、この
制限部位を用いている。注目すべきことに、このBamHI断片はTALEのN末端を無
傷なまま残すが、天然エフェクタードメインをC末端から除去する。この方法を採用し、
BamH1制限消化によりGin-AvrXa7融合体を作製した。
識される中央の20bpのコア配列から構成される組換え部位を含有するpBLA選択ベ
クター内に、Gin-AvrXa7をクローニングした。予想どおり、AvrXa7結合
部位が該20bpコアの隣に位置していた場合には、該Gin-AvrXa7融合体はD
NAを組換えることが不可能であった(図1C)。しかし、AvrXa7結合部位が該2
0bpコアの反対鎖上に位置していた場合には、組換えは明白であった(図1C)。この
ことは、組換え部位配向がTALE N末端への触媒ドメイン融合に決定的に重要な因子
であることを示している。N末端融合が組換えに必要であることを更に確認するために、
触媒ドメイン活性を抑制すると予想される非カノニカル(canonical)融合配向
を含むC末端AvrXa7-Gin変異体を構築した(図1Bおよび表5)。予想どおり
、このC末端AvrXa7融合体は細菌細胞においてごく僅かの活性を示すことが確認さ
れた(図1C)。
前記のGin-AvrXa7融合体は組換えを触媒したが、この変異体の活性は、操作
されたZFRのものより相当低かった。更に、特異性分析は、Gin-AvrXa7融合
体が、非コグネイト(非同族)DBD部位および非天然20bpコア配列を含有する認識
部位を忠実に識別できないことを示した。このことは、組換えがGin媒介性ではない可
能性があることを示している(図1D)。最近の報告は、該融合タンパク質のTALE部
分がトランケート化されている場合、TALEN活性が増強されうることを示している。
したがって、TALER活性を改善することを試みるために、一連のNおよびC末端Av
rXa7トランケート化体を作製した(図2A)。
vrXa7 Gly268(Δ268)で終わるように、ほぼ等しい間隔で合体させた。
TALENのN末端トランケート化変異体として報告されているAvrXa7 Δ150
も作製した。2個のC末端AvrXa7トランケート化体を28位(+28)および95
位(+95)において作製した。+28および+95は共に、TALENにおける安定融
合点として報告されている。各TALEトランケート化変異体をGin触媒ドメインに融
合させ、この20メンバーTALERライブラリーを、Avr-20G認識部位を含有す
るpBLA選択ベクター内にクローニングした。細菌細胞における1ラウンドの選択の後
(「材料および方法」)、個々のアンピシリン耐性クローンを配列決定したところ、全て
の選択されたTALERは2つのN末端トランケート化(Δ87およびΔ120)の1つ
を含有することが判明した。また、それぞれの選択されたクローンはC末端の+28に存
在した。融合点付近に自発的な12アミノ酸の欠失を含有する単一のΔ120クローン(
Δ120*)以外は、これらのクローンの活性は非常に低かった(図2B)。このアッセ
イにおいては、Ginに基づくZFRは、通常、20~40%の組換えを示すが、選択さ
れたTALER融合体において観察された最高活性は~7%の組換えであった(Gin-
AvrXa7Δ120*)。TALE DBDはZFドメイン(要求される隣接ペプチド
配列を含まない)より3倍大きいため、本発明者らは、これらのTALER構築物に使用
される20bpのスペーサーが組換えのための最適長ではない可能性があると推論した。
次に、14(Avr-14G)、26(Avr-26G)および32bp(Avr-3
2G)のコア部位を含有するDNA標的が、選択されたTALERにより組換えられうる
かどうかを評価することにより、コア配列の長さが組換えに及ぼす効果を調べた。リコン
ビナーゼ媒介性再構築後にβ-ラクタマーゼ遺伝子のリーディングフレームを維持するた
めに、コアの半分の部位を±3bpにより修飾した(表1)。前記の20メンバーTAL
ERライブラリーを各標的部位変異体に対する1ラウンドの選択に付した。最短標的(A
vr-14G)を組換えうるTALER変異体の特定は可能でなかったが(データ非表示
)、Avr-26GおよびAvr-32Gを組換える2個のGin-ΔAvrXa7変異
体が(N末端TALEトランケート化体Δ87およびΔ120ならびにC末端トランケー
ト化体+28に基づいて)特定された。特に、クローン分析は、選択されたTALER(
Gin-AvrXa7Δ87およびGin-AvrXa7Δ120)が、最長コア(例え
ば、26および32bp)を含有するDNAを、より短いコア(例えば、14および20
bp)の場合より少なくとも100倍高い効率で組換えることを示した(図2B)。更に
、Gin-AvrXa7Δ120は、コグネイト(同族)コア配列(Avr-26Gおよ
びAvr-32g)を含有する標的を、非コグネイトコア(Avr-20T、Avr-2
0GG、Avr-32TおよびAvr-32GG)より>100倍高い効率で組換えたこ
とが判明した(図2C)。興味深いことに、Gin-AvrXa7Δ120融合体は44
bpコア(Avr-44G)に対してはそれほど活性ではなかったが(組換えはAvr-
32Gより~3倍低かった)(図2C)、このことは、26~44bpのコア長が大腸菌
(E.coli)におけるGin-AvrXa7Δ120による組換えに最適であるらし
いことを示している。
Gin-AvrXa7Δ120はGin-AvrXa7と比較して組換えの増強を示し
たが、Gin-AvrXa7Δ120は最適なTALE融合構造体ではない可能性がある
と疑われた。なぜなら、(i)Gin触媒ドメインを含有するZFRはGin-AvrX
a7Δ120より>2倍高い効率でDNAを組換えた、および(ii)Gin-AvrX
a7Δ120はTALEトランケーション変異体の包括的ライブラリーから特定されなか
ったからである。したがって、より良好な融合構造体を特定するために、漸増トランケー
ト化TALE DBDのライブラリーの作製に基づいて、スクリーニングを工夫した。
法」)のライブラリーへの未修飾N-末端ドメイン(Gin)の融合体を可能にするため
に既に記載されているとおりにプロトコールを適合させた。AvrXa7 N末端(Me
t1)と最初のAvrXa7反復(Leu298)との間の領域にわたるN末端AvrX
a7トランケーションをエキソヌクレアーゼ消化により作製し、Gin触媒ドメインの未
修飾コピーに融合させた(タンパク質変異体の理論数:~300)。これまでの結果は、
+28が最適なC末端トランケーションであることを示していたため、本発明者らはこの
構造体をトランケーションライブラリー内に組込んだ。TALERを、Avr-32G標
的部位を含有するpBLA選択ベクター内にクローニングし、大腸菌(E.coli)内
に形質転換した(>1×105個の形質転換体)。配列分析は、関心のある領域にわたる
トランケーションの等しい分布を証明した(データ非表示)。
ークトランケーション変異体を特定した(図3A)。最適なN末端TALER融合点が8
7および120位付近に位置するらしいことを示唆した、20メンバーTALEトランケ
ーションライブラリーを使用して行った選択に合致して、全ての選択されたGin-Av
rXa7変異体は74位(Δ74)と147位(Δ147)との間にトランケーションを
含有することが判明した。特に、73個中26個(35.6%,p<.001)のクロー
ンは124位(Δ124)と129位(Δ129)との間にトランケーションを含有して
いた。この集団からは、128位(Δ128)におけるトランケーションが最も代表的な
もののうちの1つであった。
するために、本発明者らは、大腸菌(E.coli)においてAvr-32G標的部位を
含有するDNA基質に対する単離されたGin-AvrXa7変異体の性能を評価した。
本発明者らの分析を、AvrXa7の92位(Δ92)と134位(Δ134)との間の
N末端欠失を含有するクローンに集中させた。Δ92融合体は非常に活性であったが、配
列分析に合致して、Δ120とΔ129との間にN末端トランケーションを含有するTA
LERは、比較的より長い又はより短いトランケーションに基づく変異体より効率的にD
NAを組込むことが判明した(図3B)。3個のクローンを更に特徴づけした。すなわち
、Δ74およびΔ145は可能な融合点の境界に相当するものであったため、それらを選
択し、Δ128は、該選択において見出された最も有力なクローンであったため、それを
アッセイした。14~44bpのスペーサー長を有する5個の標的を3個の陰性対照(A
vr32T、Avr32GGおよびPthXol-32G)と共にアッセイした。Gin
-Avr32GΔ74およびGin-Avr32GΔ145は、20bpより長いスペー
サーに対して、限られた活性を示し、一方、Gin-Avr32GΔ128は、ZFR
GinC4に匹敵する効率で、DNAを組換えると判定された(図3C)。更に、特異性
分析は、Gin-Avr32GΔ74、Gin-Avr32GΔ128およびGin-A
vr32GΔ145は、コグネイトコアを含有する基質を、非コグネイトコアのもの(A
vr-32T、Avr-32GGおよびPthXol-32G)より>100倍高い効率
で組換えうることを示した(図3C)。総合すると、これらの結果は、Δ120とΔ12
9との間のN末端欠失を含有するTALEタンパク質がリコンビナーゼへの融合のための
最適なトランケーションに相当することを示唆している。
前記研究は、天然に存在するAvrXa7 TALEタンパク質の天然DBDを使用し
た。設計されたTALE反復アレイが、選択されたGin-ΔAvrXa7フレームワー
ク内に組込まれうるかどうかを決定するために、AvrXa7結合部位を標的化するよう
に設計された一連の合成TALEタンパク質(15~20反復長)を作製した(図7)。
公に入手可能なTALENプラスミドセット(Addgene)を使用して、TALEタ
ンパク質を構築した。該クローニングプラスミドを、+28 C末端トランケーションお
よびΔ120またはΔ128 N末端トランケーションを含むように修飾した。設計され
たTALEをGin触媒ドメイン(Gin-Avr15Δ120およびGin-Avr1
5Δ128)に融合させ、Avr-32GまたはAvr-32T標的部位を含有するpB
LA選択ベクター内にクローニングした。
n-Avr15Δ128の両方が、活性触媒ドメインに融合された場合に、DNAを組換
えるために使用されうること、ならびに合成反復の組込みが活性の増強をもたらすことを
示した(図4A)。重要なことに、各TALERは厳密な選択性を示し、コグネイトコア
を含有する標的部位を、非コグネイトコアの場合より>1,000倍高い効率で組換えた
(図4B)。驚くべきことに、Δ120トランケーションに基づくTALERは、Δ12
8構造に基づくTALEと同等に有効にDNAを組換えることも判明した(図4A)。こ
のことは、設計されたTALEが、天然AvrXa7 DBDを含有するものほどはN末
端トランケーションに対して感受性でない可能性があることを示している。
再プログラム化されうることを更に実証するために、天然に存在するTALEタンパク質
PthXo1により認識される配列を標的化するように設計された合成酵素(Gin-P
th15Δ120)を作製した。Gin-Pth15Δ120はそのコグネイト基質に対
して非常に活性であること、ならびにGin-Pth15Δ120およびGinAvr1
5Δ120の両方が、それらのコグネイト結合部位を有する標的に対する組換えにおける
>600倍の増加を示すことが判明した(図4A)。15~20反復長のDBDを含有す
る一連の設計されたTALERの活性も評価したところ、各融合体が同様に高い効率およ
び特異性で組換えを触媒することが判明した(図4B)。
TALERが哺乳類細胞においてDNAを修飾しうるかどうかも判定した。これを達成
するために、本発明者らは、細胞培養におけるリコンビナーゼ活性の迅速な評価を可能に
するエピソームレポーターアッセイを用いた。このアッセイにおいて、ヒト胎児腎(HE
K)293T細胞を、組換え部位に隣接したSV40プロモーターの制御下でルシフェラ
ーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド(pGL3)およびリコンビナーゼ発現ベク
ターでコトランスフェクトした。適当なリコンビナーゼの一過性発現は細胞におけるSV
40プロモーターの切り出し及びルシフェラーゼ発現の低下を招く。したがって、リコン
ビナーゼ活性はルシフェラーゼ発現の低下倍数に正比例する。
)でのGin-Avr15Δ120のコトランスフェクションは、pGL3-Avr-4
4Gのみのトランスフェクションと比較して、ルシフェラーゼ発現における~20倍の低
下を招いた(図5A)。Gin-Avr15Δ120が大腸菌(E.coli)において
ZFR GinC4に対して類似活性を示したにもかかわらず、本発明者らは、GinC
4が、そのコグネイト標的プラスミドpGL3-C4-20Gでのコトランスフェクショ
ンの後、ルシフェラーゼ発現を>80倍低下させることを見出した(図5A)。この矛盾
は、pGL3におけるリコンビナーゼ標的部位間の、pBLAの場合より比較的短い介在
DNA配列、または哺乳類細胞におけるTALERとZFRとの間の差動的発現によるも
のかもしれない。しかし、この矛盾の根本原因は依然として不明である。最後に、32b
pが大腸菌(E.coli)におけるTALERのための最適コア配列長だと決定された
が、pGL3-Avr-32GとGin-Avr15Δ120のコトランスフェクション
はルシフェラーゼ発現における僅か6倍の低下を招いたに過ぎなかった(図5A)。この
矛盾の根本原因も依然として不明である。
類細胞において適合性ヘテロ二量体を形成しうるかどうかを調べた。この可能性を評価す
るために、Gin触媒ドメイン(pGL3-Avr-G-ZF)により認識されるコア配
列にAvrXa7結合部位およびC4ジンクフィンガー結合部位(GCG GGA GG
C GTG;配列番号279)が隣接しているハイブリッド組換え部位を作製した(表2
を参照されたい)。驚くべきことに、GinC4およびGin-Avr15Δ120での
pGL3-Avr-G-ZFのコトランスフェクションは、pGL3-Avr-G-ZF
と比較して、ルシフェラーゼ発現における>140倍の低下を招いたが(図5B)、pG
L3-Avr-G-ZFとGinC4またはGin-Avr15Δ120のいずれかでの
トランスフェクションはレポーター遺伝子発現における無視しうるほどの低下を招いたに
過ぎなかった。これらの結果は、ZF-TALEヘテロ二量体の作製が、キメラリコンビ
ナーゼの標的化能を改善するための潜在的に有効なアプローチに相当することを示してい
る。
非常に最低限の融合構造を含有するZFPとは異なり、TALE DBDは、機能する
ために、DBDアレイのいずれかの側に天然タンパク質フレームワークを要する。0位に
おけるチミジン残基の結合をもたらし、ほとんど全ての公知TALE認識部位において見
出されるいわゆる第0および第1反復はそのようなN末端フレームワークに相当する。最
近の結晶構造解析は0位チミンの結合の説明を与えているが、最小TALE構造を決定す
るには不十分なデータが依然として存在する。実際、これまでの全ての研究は、0位の結
合をもたらすのに要求されるものよりかなり多くの残基を含有するN末端トランケーショ
ンを用いている。適切なDNA結合コンホメーションを可能にする際の該タンパク質のこ
の部分が果たす役割または最小TALEドメインを構成しうるものは依然として明らかで
はない。機能的TALEキメラを作製するための初期の試みは完全長TALEタンパク質
への融合に基づくものであったが、より最近の研究は、Δ150 N末端構造のコンテキ
ストにおけるエフェクタードメイン機能を改善するユニークC末端トランケーションの特
定に焦点を合わせている。これまでの報告は、AvrBs3 TALEのN末端残基2-
153の欠失(Δ150)が、TALEのその天然細菌から標的植物細胞へのトランスロ
ケーションに要求されるドメインを除去するが、転写因子の活性を損なわないことを示し
ている。
端トランケーション+28および+95を含有するN末端TALEの広範な系統的研究が
最初に行われ、僅か2個のドメイン(+28を有するΔ87および+28を有するΔ12
0)が更なる分析のための十分に高い活性を示すことが判明した。AvXa7 N末端の
漸増トランケーションに基づく二次的分析は、AvrXa7の74位(Δ74)~145
位(Δ145)を中心とするトランケーション変異体の広範なクラスターの特定をもたら
した。この実験において回収されたクローンのうち、38%がΔ119~Δ128のトラ
ンケーションを含有しており、この領域に融合体を含有するTALERに関して得られた
データの精査は高い活性を示した。特に、この領域からのN末端トランケーション(Δ1
28およびΔ120)に基づくTALERは、細菌および哺乳類細胞においてDNAを組
換えるために使用されうると判定された。Δ119~Δ128のトランケーション変異体
のクラスター化はこの領域の本質的安定性も示しているかもしれない。
位は、リコンビナーゼ触媒ドメインにより認識される中央の20bpのコア配列、および
2個の隣接ZFP結合部位を含有する。しかし、TALERの融合配向は、TALE結合
部位が該中央コア配列に対して反対鎖上に存在することを要する。この特有の幾何学的配
置ゆえに、本発明者らは組換えのための最小コア配列要件を調べることにした。TALE
DBDの長さ(TALE反復はZFPより3~4倍長い)および触媒ドメインとTAL
Eドメインとの間で伸長するN末端リンカーに基づいて、本発明者らは、より長いコア配
列(32または44bp)が組換えに必要であろうと推論した。実際、自発性欠失(Δ1
20*)を含有するTALE変異体以外は、この研究において特定されたほとんどのN末
端トランケーション変異体は32bpのコアに対して最適な特性を示した。ZFNとは異
なり、DNAを効率的に切断するために有意に長いスペーサー配列を要するTALEN(
例えば、TALEN:17~20bp;ZFN:5~6bp)に関して報告された結果に
、これらの結果は合致している。これらの観察を裏付けるものとして、短いコア配列(1
4bp)に対するユニークN末端トランケーション変異体の選択はいずれのクローンも与
えないことが判明した。
能なTALE構築キットを使用して作製された合成TALEタンパク質を使用する後続の
研究は、Δ128およびΔ120に基づくTALERが大腸菌(E.coli)において
類似活性を示すことを示した。これらの設計TALEは、密接に関連しており天然に存在
するTal1cおよびPthXo1 TALEタンパク質に由来するキメラタンパク質に
基づくものであった。TALEは高い相同性を有するが、それらは同一ではない。残基1
2および13以外のRVD反復における多型はTALE融合体活性に全く影響を及ぼさな
いことが示されているが、本発明者らの知見によれば、DBD以外のTALEフレームワ
ークにおける相違の系統的評価は何ら報告されていない。漸増トランケーションライブラ
リーの分析により示されるとおり、僅かなアミノ酸変化が個々の融合体の活性に有意に影
響を及ぼしうる。したがって、本発明者らがGin-AvrXa7Δ120と合成Gin
-Avr15Δ120との間で観察した活性における矛盾の幾つかは、これまでに使用さ
れたAvrXa7フレームワークおよびTALEフレームワーク構造の間の配列変異に起
因すると考えられうる。
N:G)は自然界で最も一般的であるが、これらの反復が最も特異的なRVDモジュール
に相当するかどうかは依然として明らかでない。26反復のAvrXa7 TALEの場
合、同じ配列を標的化する合成形態はRVD組成における16個の変化を有するであろう
(図7)。それらは自然界で最も一般的に見出されるため、合成用に選択されたそれらの
4つのRVDは、それらのコグネイト塩基に対して、他のRVDより高いアフィニティを
有しうると仮定された。これが事実であれば、該合成RVD反復を使用して作製されたT
ALEは、天然ドメインを使用した場合のTALEより高いDNA結合アフィニティを有
しうると考えるのが合理的であろう。RVDアフィニティの件は直接的には検討されなか
ったが、合成反復アレイを含有するTALERは、天然AvrXa7 DBDを含有する
構築物より活性であると判定された。合成DBDを含有するTALERは、有意に少数の
DBDを含有するにもかかわらず、天然反復を含有する構築物より約2倍高い活性を示し
た。また、該合成アレイで観察された活性の増強はオフターゲット組換えにおけるいずれ
の増加とも相関しなかった。
ることを示している。特定の塩基に対して正の関連性を有するRVDは自然界において非
コグネイト塩基を許容することが示されているため、これらの知見は驚くことではない。
しかし、TALERによりもたらされる協同的特異性は、潜在的制約を回避するために用
いられうるであろう。触媒ドメインは組換えに対する特異性に寄与するため、高度に相同
なゲノム配列を選択的に修飾しうるデザイナーTALERも作製されうると予想される。
実際、リコンビナーゼ触媒特異性は、非天然コア部位を標的化するように有効に再プログ
ラム化されうることが最近示されている。
新規第0残基特異性の選択
新規クラスの、Talに基づくDNA結合性タンパク質を設計した。TAL(転写アク
チベーター様)エフェクターは、予測可能な特異性を有する新規クラスのDNA結合性タ
ンパク質である。Talエフェクターはキサントモナス(Xanthomonas)属の
グラム陰性植物病原性細菌により利用され、それは、種々のエフェクタータンパク質の混
合物をIII型分泌経路(T3SS)を経由して植物細胞内にトランスロケーションし、
該部位において、それらはビルレンス決定因子として作用する。TALのDNA結合特異
性は縦列反復の中央ドメインにより決定される。各反復はDNA内の1つの塩基対(bp
)の認識をもたらす。反復モジュールの再配置は、ある重要な制約と共に所望のDNA結
合特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。例えば、Talドメインを有するDN
A配列の標的化の最も制約的な特徴は、Tal DNA部位が塩基T、そして時にはCか
ら始まるという要件である。GまたはA塩基を有する結合部位の標的化は-1位において
は可能ではない。突然変異を第-1および第0 RVD領域に標的化することにより、こ
の制約を欠くTal DNA結合ドメインを選択するために、Tal-リコンビナーゼ活
性選択を用いた。この発見の実際の成果は莫大なものである。なぜなら、現在、各DNA
配列は、新規無制約アプローチを促進する新規Talドメインを使用して、TAL転写因
子に標的化されて、転写をオン/アップまたはオフ/ダウンし、TALヌクレアーゼを標
的化して遺伝子機能をノックアウトし、あるいは相同組換えを導き、あるいは本発明者ら
自身のTALリコンビナーゼまたは他のTAL酵素を標的化しうるからである。
パク質の(-1)ドメイン内で、NNKコドン法を用いて、アミノ酸QWSG(配列番号
209)をランダム化した。得られたライブラリーの3ラウンドのtalリコンビナーゼ
活性選択の後、標的化領域内に選択された配列RSNG(配列番号210)およびSRS
G(配列番号211)を有する新規tal結合ドメインを選択した。ついで、これらは、
開始クローンにより認識される親(parental)Tを越えて、標的配列の0位のG
に結合することが示された。該選択を繰返して、最初に選択されたQWSG(配列番号2
12)と重複する以下に赤色で示されているKQW領域をランダム化した。選択されたS
SR、SRA、SRCおよびKRC配列を有するクローンが今や選択された。全ての選択
されたTal結合ドメインを、G置換を含有する一定のオリゴに対する結合性研究におい
てアッセイしたところ、配列G-ATAAACCCCCTCCAA(配列番号213)に
今や優先的に結合することが示された。この同じ配列を使用してTalリコンビナーゼ活
性選択を行ったことに注目されたい。開始Tal結合性タンパク質GinAvr15Δ1
28はT-ATAAACCCCCTCCAA(配列番号214)に結合する。選択された
突然変異を含有するTalヌクレアーゼの配列試験はこれらの配列のG特異性を証明して
おり、これは、この新規クラスのTalが初めて開発されることを可能にするものである
。選択された配列は他の種に由来するTalに移植可能(portable)である。
においては、配列PRG、PTRおよびPKDを選択した。全ての選択されたTal結合
ドメインを、A置換を含有する一定のオリゴに対する結合性研究においてアッセイしたと
ころ、配列A-ATAAACCCCCTCCAA(配列番号222)に今や優先的に結合
することが示された。この同じ配列を使用してTalリコンビナーゼ活性選択を行ったこ
とに注目されたい。開始Tal結合性タンパク質GinAvr15Δ128はT-ATA
AACCCCCTCCAA(配列番号223)に結合する。選択された突然変異を含有す
るTalヌクレアーゼの配列試験はこれらの配列のA特異性を証明しており、これは、こ
の新規クラスのTalが初めて開発されることを可能にするものである。N末端ドメイン
のランダム突然変異誘発または第0ドメイン内のKRGG(配列番号224)配列の標的
突然変異誘発および該リコンビナーゼ系における再選択により、結合活性における後続の
改良が達成されうる。
選択
コンテキスト(context)依存的RVD選択および新規特異性を有するRVDの
選択のために、以下に太字で示されているHD配列をランダム化するライブラリーを作製
した。LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG(原型
RVD配列;配列番号225)。
たらすことが多いが、典型的には、該ライブラリーはこれらの2つの位置における全ての
アミノ酸を可能にする。あるいは、SHDG(配列番号226)およびASHDGG(配
列番号227)領域をランダム化した、より大きなライブラリーは、コンテキスト依存的
特性を有するユニークRVD特異性の選択を可能にする。
選択を迅速に可能にする。生じるRVDは高度にモジュール性またはそれらの配列認識に
おいてコンテキスト依存的である可能性があり、したがってTalヌクレアーゼおよび転
写因子を作製するために使用されうる。
はオフ/ダウンし、TALヌクレアーゼを標的化して遺伝子機能をノックアウトし、ある
いは相同組換えを導き、あるいは本発明者ら自身のTALリコンビナーゼまたは他のTA
L酵素を標的化するためのTAL転写因子に対する無制約アプローチが含まれる。
明者らの新規Talドメインを使用して標的化可能であり、それらの特異性は迅速に最適
化可能だからである。
チミン以外の5’塩基を含むTALE N末端ドメインの定向進化
転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質は、関心のある実質的に全
てのDNA配列に結合するように設計されうる。植物非病原性遺伝子を標的化する天然T
ALE転写因子(TALE-TF)のDNA結合部位は5’チミジンを有する。合成TA
LE-TFもこの要件を有する。最近の構造データは、標的配列の5’TとN末端ドメイ
ン(NTD)との間に相互作用が存在することを示している。最近のTALEヌクレアー
ゼ(TALEN)の文献の精査は標的配列の最初の塩基(N0残基)の重要性に関する矛
盾するデータを示した。また、TALEリコンビナーゼ(TALE-R)の活性に対する
N0塩基の影響に関する研究は行われていない。ここで、TALE-R、TALE-TF
、マルトース結合性タンパク質との融合体(MBP-TALE)として発現されるTAL
E DNA結合ドメインおよびTALENの結合領域におけるN0塩基の影響を定量する
。これらのTALEプラットフォームのそれぞれは特有のN末端およびC末端構造を有す
るが、全ては、N0残基がチミジンである場合に最高活性を示した。これらのプラットフ
ォームにおける有効なTALEを構築するための規則を単純化し、いずれかの任意DNA
配列における精密ゲノム工学用途を可能にするために、本発明者らは、本発明者らが最近
開発したTALE-R系を使用する構造誘導活性選択を案出した。5’Gを含有するTA
LE結合部位に対して非常に活性であり選択的なTALE-R活性をもたらす新規NTD
配列を特定した。そして、任意の5’N0残基の一般的標的化を可能にする追加的なドメ
イン配列を選択した。これらのドメインはTALE-TF、MBP-TALEおよびTA
LEN構造内に移入され、非T 5’残基を含有する標的配列に対して野生型NTDが示
す活性より大きな活性を一貫して示した。該新規NTDはゴールデン・ゲイト(gold
en gate)TALEN構築法に適合性であり、任意のDNA配列を認識するTAL
E転写因子、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびDNA結合性タンパク質の効率的構築
が今や可能となり、ほとんどの天然TALEタンパク質を制限する5’ T規則を考慮す
ることなく、DNA上の、TALEに基づくタンパク質の正確かつ無制約の配置を可能に
した。
既に報告されているTALE-R系をこの研究に適合化した。簡潔に説明すると、pB
CS(クロラムフェニコールおよびカルベニシリン耐性遺伝子を含有する)をHindI
II/Spe1で消化した。対をなすリコンビナーゼ部位を含有するスタファー(Avr
X;ここで、XはN0塩基である)をHindIII/Xba1で消化し、該ベクター
内に連結して、分割ベータ-ラクタマーゼ遺伝子を得た。ついでpBCS AvrXをB
amH1/Sac1で消化し、Gin127-N-スタファー-Avr15をBamH1
/Sac1で消化し、該ベクター内に連結して、Gin127-N-スタファー-Avr
15-Xを得た。該スタファーをN-1 TALEヘアピンにおける進化のためにNot
1/Stu1で消化し、N0 TALEヘアピンにおける進化のためにNot1/Sph
1で消化した。
プライマーptal127 Not1 fwdおよびリバースプライマーKXXG l
ib revまたはKXXXX lib revを使用してN-1 TALEヘアピンに
おけるN末端変異体を得、ついでNot1/Stu1で消化し、ついで、消化されたGi
n127-AvrX内に連結した。フォワードプライマーptal127 Not1 f
wdおよびリバースプライマーKRGG Lib Revを使用して、N0 TALEヘ
アピンにおける突然変異を有するライブラリーをPCR増幅した。ついでこれをNot1
/Sph1で消化し、Not1/Sph1で消化されたGin127-AvrX内に連結
した。
ラウンド1の連結物をエタノール沈殿させ、エレクトロコンピテント Top10F’
細胞内に形質転換し、ついでSOC内に1時間回収した。該細胞を、100mg/ml
クロラムフェニコールを含有する100mlのスーパーブロス(Super Broth
)(SB)培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によりDNAを単離した。得られたプ
ラスミドDNA(Rd 1投入物)をエレクトロコンピテントTop10F’細胞内に形
質転換し、細胞を、100mg/ml カルベニシリンおよび100mg/ml クロラ
ムフェニコールを含有する100mlのSB培地内で一晩増殖させた。標準的な方法によ
りプラスミドDNAを単離した。ラウンド1産物をNot1/Xba1で消化し、相補的
付着末端を有するGin127-AvrXベクター内に連結した。コンセンサス配列が観
察される場合には、このプロトコールを3~4回繰返し、クローンを特徴づけした。
それぞれの可能な塩基を含有する4個のTALENペアを、ゴールデン・ゲイト法を用
いて作製した。融合AおよびBプラスミドを第2ゴールデン・ゲイト反応によりGold
y TALEN(N Δ152/C +63)フレームワーク内に直接的に連結した。p
CAGベクターをBglI/Nsi1で消化し、BglII/Nsi1で消化されたPC
R増幅NTDに連結することにより、NTDを修飾した。TALENペア(それぞれ50
~75ngのTALEN/ウェル)を96ウェルプレートのウェル内のHeLa細胞内に
1.5×104細胞/ウェルの密度でトランスフェクトした。トランスフェクション後、
細胞を37℃のインキュベーター内で24時間配置し、ついで30℃で2日間、ついで3
7℃で24時間配置した。公開されている方法によりゲノムDNAを単離し、DNA突然
変異率をセル・サーベヤー(Cell Surveyor)アッセイおよび配列決定によ
り定量した。細胞アッセイのために、まず、プライマーCCR5外側fwd/CCR5外
側revを使用し、ついでCCR5内側fwd/CCR5内側revを使用するネステッ
ドPCRによりゲノムDNAを増幅した。ついで断片をBamH1/EcoR1で消化し
、相補的に消化されたpUC19内に連結した。
該リコンビナーゼ選択からの変異体NTDをプライマーでptal127 SFI f
wdおよびN-Term Sph1でPCR増幅した。該PCR産物を増幅し、Not1
/Stu1で消化し、pTAL127-SFI Avrl5(これは、pTAL127-
SFI Avr15からpcDNA 3.0 VP64内へのN末端修飾TALEの転移
を促進する、対になったSFI-1消化部位を含有する)内に連結した。対応するTAL
E結合部位を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流のpGL3ベーシック(Basic)ベクタ
ー(Promega)内にクローニングした。各アッセイのために、リポフェクチミン(
Lipofectimine)2000(Life Technology)を製造業者
の仕様に従い使用して、100ngのpcDNAを5ngのpGL3ベクターおよび1n
gのpRL レニラ(Renilla)ルシフェラーゼ対照ベクターで96ウェルプレー
トのウェル内のHEK293t細胞内にコトランスフェクトした。48時間後、細胞を洗
浄し、細胞溶解し、ベリタス・マイクロプレート(Veritas Microplat
e)ルミノメーター(Turner Biosystems)で二重ルシフェラーゼレポ
ーター系(Promega)でルシフェラーゼ活性を評価した。トランスフェクションを
3回重複して行い、結果を平均した。
ビオチン化オリゴヌクレオチドへのMBP-TALE結合のアフィニティアッセイを、
既に記載されている方法を用いて行った。簡潔に説明すると、AvrXa7 TALEド
メインをXL1-Blue細胞内でpMAL MBP-AvrXa7プラスミドから発現
させ、アミロース樹脂上で精製した。修飾残基を有する標的AvrXa7標的部位を含有
するビオチン化オリゴヌクレオチドを使用して、サンドイッチ酵素結合イムノソルベント
アッセイ形態においてTALE結合活性を決定した。MBP置換基を標的化する抗体をア
ッセイ現像のために使用した。
5’T規則の予備分析
PthXo7 DNA配列に結合しているTALEタンパク質の最近の結晶構造は、N
-1ヘアピン内のW232とDNA基質の接触領域の5’末端のチミジン(N0塩基)と
の間の特有の相互作用を明らかにした。この研究は、TALEコードが最初に解読された
際に報告された既に確立されている5’T規則の構造的基礎を示した(図18AおよびB
)。TALENの標的配列の第1塩基の重要性に関する矛盾するデータが存在する。標的
DNAにおける5’Tの要件を、まず、Gin32Gコアに隣接した全ての可能な5’残
基を有する4個のAvrXa7結合部位を含有する分割ベータラクタマーゼTALEリコ
ンビナーゼ選択ベクターを使用するTALE-Rのコンテキストにおいて評価した(図1
8C)。ついでTALE-TFによるN0残基の認識を、それぞれの可能な5’残基を含
有する認識部位を有する五量体AvrXa7プロモーター領域を含有するルシフェラーゼ
レポーターベクターを使用して評価した(図18D)。5’T以外の塩基では、5’Tを
含有する配列と比較してTALE-Rにおいては>100倍までの、そしてTALE-T
Fにおいては1000倍の活性の低下を観察した(図18CおよびD)。著しく短縮した
C末端ドメイン(CTD)の存在下では特に、5’Tの偏りを除去すると報告されている
これらのキメラのC末端構造における変異にもかかわらず、これらの低下が観察された。
酵素結合イムノソルベントアッセイも、非T5’残基を有する標的オリゴヌクレオチドに
対するMBP-TALE DNA結合性タンパク質のアフィニティの低下を示した(図1
8E)。最後に、非T5’ヌクレオチドを有する標的に対する野生型NTDを有する設計
されたTALENの活性の検査は、5’Tを有するものと比較して10倍の活性低下を示
した(図18F)。結果は、5’Tが、リコンビナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼおよび
単純なDNA結合性タンパク質の場合における最大限に有効なTALEドメインのための
重要な設計パラメータであることを示している。
DNA認識のための、より柔軟な系を得るために、最近開発されたTALE-R選択系
を使用してTALEのNTDを進化させて5’T制約を排除しうると仮定した(図23)
。ランダム化された残基K230~G234を有するライブラリーを作製し、それぞれの
可能な5’塩基に対する活性を有するTALE-Rを数ラウンドの選択の後で単離した(
図19A~C)。最も活性な選択されたクローンはK230およびG234の強力な保存
性を示した。前者はDNAホスファートバックボーンと接触可能であり、後者はヘアピン
ループ形成に影響を及ぼしうる(図24)。ライブラリーK230~W232においては
、K230Sが頻繁に観察されたが、個別にアッセイされたほぼ全ての変異体においてK
230RまたはK230変異体より遥かに低い活性を示した。W232~R232突然変
異を伴うと観察された幾つかのうちの1つのクローン(NT-G)は、5’Tから5’G
への、選択性の有意な変化を示した。該配列は、この領域における最近記載されたラルス
トニア(Ralstonia)TALEタンパク質のNTDのものに類似している。植物
転写因子レポーター遺伝子調節の場合における該ラルストニアNTDはその基質において
5’Gを好むと報告されている(タンパク質アライメントは図25を参照されたい)。5
’Gに対するNT-Gのストリンジェンシー(厳密さ)により示されるとおり、残基R2
32はG塩基に特異的に接触しうる。5’Gに関するNT-Gの優先性は5’Tに関する
野生型ドメインの特異性と比較しうるものであった。5’Aまたは5’Cに特異的なNT
D変異体は誘導不可能であったが、高い活性を維持し任意の5’残基を有する基質を受容
するK265-G268 N0ヘアピンに類似している許容性NTDであるNT-αNが
得られた。この変異体は、野生型NTDと比較して増強した、DNAホスファートバック
ボーンとの非特異的接触をもたらして、特異的5’残基と接触することなくTALE-D
NA複合体の全結合を増強すると仮定された。短縮ヘアピン構造は、5’Aまたは5’C
残基に対する特異性を有する変異体の選択を可能にすると仮定された。Q231-W23
2におけるランダム化および残基233の欠失を有するライブラリーを、推定DNA結合
ループを短縮するように設計した。リコンビナーゼ選択は、幾つかのクローンにおいて高
い活性を示す高度に保存されたQ231Y突然変異を示した(図19D)。特に、NT-
βNは、野生型NTDを有するTALEと比較して、5’A、CおよびGを有する基質に
対する活性の改善を示したが、5’T基質に対する活性を低減した(図19E)。
デザイナーTALE融合タンパク質の用途における進化NTDの移植性(portab
ility)を評価するために、最適化NTDをTALE-TF、MBP-TAEおよび
TALEN内に組込んだ。NT-G、NT-αNおよびNT-βΝドメインを含有するT
ALE-TFは、NT-Tドメインを含有するTALE-TFと比較して、5’T残基を
有さない作用部位を含有するルシフェラーゼ標的遺伝子の転写活性化における400~1
500倍の増加を示した。NT-Gに基づくTFは、TALE-R選択系において観察さ
れるとおり、5’G選択性を保有していた。全ての5’ヌクレオチドに対するNT-αN
およびNT-βNに基づくTFの活性は、リコンビナーゼ形態において観察された相対活
性の跡を追うものであった(図20)。MBP-TALEはまた、5’Tを有さない部位
を含有する標的オリゴヌクレオチドに対して、野生型MBP-TALEより大きな相対結
合アフィニティを示し(図26)、選択されたドメインが非チミジン5’塩基の認識およ
び非チミジン5’塩基に対する許容性を増強したという更なる証拠を与えている。
た。これらの実験の場合、CCR5遺伝子のΔ32遺伝子座のコンテキストにおいて4つ
の基質を構築した(図21A)。各基質は異なる5’残基を含有していた。実験は、遺伝
子編集活性の基準物として、5’Tに対する特異性を有する野生型(NT-T)およびd
Hax3 NTD[dHax3は、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomo
nas campestris)から単離された一般に使用されるNTD変異体である]
を有するTALENを含んでいた。該変異体NTDの活性増強寄与を決定するために、可
能な限り高いRVD相同性(50~90%)を保有するように該基質TALENペアを設
計した(図21A)。
活性を分析した。選択されたドメインは、野生型ドメインを含有するTALENの活性と
比較した場合、非T5’残基に対して2~9倍の遺伝子編集活性の増強を示した(図21
および図27)。野生型またはdHax3 NTDを有するTALENペアT1/T2に
対して、活性は最高であった。TALENペア基質G1/G2は、NT-αN、NT-β
NおよびNT-Gを有するTALENにより、NT-Tと比べて2.0~3.5倍の増強
を伴って最も効果的にプロセシングされた。NT-αNは、TALENペアA1/A2お
よびC1/C2に対して、野生型NT-Tよりそれぞれ9倍および2倍高い活性を示した
。5’残基におけるミスマッチの影響は、TALENにおいては、TALE-TFおよび
TALE-Rフレームワークの場合より限られたものであるが、該最適化NTDは、遺伝
子編集実験において使用された場合にTALEN活性を著しく改善した。
全てではないがほとんどの過去の研究は、最適TALE DNA結合ドメインの設計に
おける最も5’側の残基としてチミジンが要求されることを示唆している。本明細書に記
載されている分析は、機能的TALE融合タンパク質の構築にはチミジンが最適であり、
幾つかの場合には決定的に重要であることを示している。したがって、この要件は、TA
LE転写因子、ヌクレアーゼおよびリコンビナーゼキメラで有効に標的化されうる配列に
対して制約を課す。この要件は理論的には、遺伝子ノックアウトを誘発するためのTAL
ENの使用に小さな制約を課すものであるが、それらの広範なスペーサー領域許容性を考
慮すると、任意の5’残基を含みうるNTDは有効なTALE構築のための規則を更に単
純化し、ゲノム操作およびインタロゲーションのために厳密なTALE配置を要求する用
途[例えば、TALENを使用する一定の塩基対におけるDNAの厳密な切断、TALE
R-リコンビナーゼによる継ぎ目の無い遺伝子挿入および交換、特異的内因性DNA配列
から天然DNA結合性タンパク質を置換除去して、それらの機能的役割を調べること、経
路操作のための直交性(orthogonal)転写因子の開発、転写因子配置が鍵とな
る天然および合成遺伝子の相乗的活性化、ならびに多数の他の用途]を著しく増大させる
であろう。DNAに基づくナノテクノロジーにおける他の用途には、特異的DNA結合性
タンパク質でのDNAナノ構造/折紙の装飾が含まれる。この場合、特定の部位への標的
化はDNAフォールディング/構造に基づいて制限され、したがって、任意の部位に結合
可能であることが決定的に重要である。DNA結合性タンパク質でのこれらの構造および
装置の加工は、機能を拡張するための魅惑的なアプローチでありうるであろう。実際、全
ての標的化制約が排除されれば、DNA結合性タンパク質およびその融合体の多数の用途
を想像することは困難ではない。これらの潜在的用途により鼓舞されて、本発明者らは、
任意の塩基で始まる部位の標的化を可能にするNTDを開発することを目標とした。
TALE-R系を使用した。3ラウンドの選択において、5’Gに対する特異性を有する
NTDを得た。5’Aまたは5’Cを認識する変異体を得るために、多数の選択を行った
。G230-K234ヘアピンを逆転さえ、K230-G234/ins232ヘアピン
を拡張させ、K265-G268 N0ヘアピンの修飾を試み、ランダム突然変異誘発を
評価した。本発明者らは、5’Aおよび5’C残基の両方を有する基質を許容可能なアフ
ィニティで認識する欠失を有するNTD、NT-βNを特定したが、これらの方法はいず
れも、5’Aまたは5’Cを有する標的配列に対するアフィニティを有するNTDを与え
なかった。NTD NT-TおよびNT-Gにより示された強力な選択優先性ならびにN
T-TにおけるW232およびNT-GにおけるR232の重要性はDNA認識配列の5
’末端残基とこれらのアミノ酸の特異的相互作用によるものであるらしい。ラルストニア
・ソラナセアルム(Ralstonia solanacearum)TALEのストリ
ンジェンシーが5’Gを要すること、およびNT-Gにおける232に類似した位置にア
ルギニンを含有する比較しうるN-1ヘアピンであると思われるものをNT-Gとの配列
アライメントが示すことが最近報告された(図25)。NTD Brgl1およびNT-
T間の高い構造的相同性ゆえに、単純なアルギニンからトリプトファンへの突然変異によ
りチミンに対するラルストニア(Ralstonia)TALE NTDの優先性を修飾
すること、またはNT-αNもしくはNT-βNドメインをこの関連タンパク質内にグラ
フティングすることにより特異性を排除することが可能でありうる。アルギニン-グアニ
ン相互作用が進化ジンクフィンガーにおいて一般的であることに注目することも興味深い
。
功裏に移入され、リコンビナーゼ進化系からのデータに基づいて予想される活性および特
異性を概ね付与した。最適化NTDを有するTALE-TFは、非T5’残基を有するA
vrXa7プロモーター部位に対するNT-Tの活性と比較して、TALE活性化を40
0~1500倍増強した。TALEN内に組込まれた場合、非T選択性を有する本発明者
らのNTDは、5’A、CまたはGを有する基質上のNT-Tドメインのものと比較して
、活性を2~9倍増強した。TALEN遺伝子編集の増強は、一般に、TALE-Rおよ
びTALE-TF構築物において観察される活性の増強と相関する。TALENペアA1
/A2、C1/C2およびT1/T2でのアッセイにおいて、より低い活性により証明さ
れるとおり、NT-Gの特異性および高活性は維持され、また、NT-αNおよびNT-
βNの一般に高い活性がTALEN Δ152/+63構造内に付与された。
ケート化TALEはDNA基質内に5’Tを要しないことが最近報告された。報告された
Δ143,+47トランケーションはGoldy TALE-TFとして構築され、Δ1
27,+95トランケーション(これは他の研究者により最も一般的に使用されており、
本発明者らの研究において用いられたトランケーションの組合せである)の場合より実質
的に低い、AvrXa7基質に対する活性が観察された(図29)。したがって、報告さ
れた結果における相違は、用いられたトランケート化構造によるものでありうるであろう
。
ミジンの重要性がTALE-R、TALE-TF、MBP-TALEおよびTALENキ
メラの場合に決定された。基質DNAの最も5’側の塩基としてチミン以外の塩基を認識
するTALE NTDを操作するために、標的化突然変異誘発およびTALE-R選択を
適用した。ここで開発された操作TALEドメインはモジュール性を示し、TALE-T
FおよびTALEN構造において高活性であった。結合部位に関する厳格な幾何学的要件
を有し、N0塩基の種類に対して高感受性である、現在のTALE-Rにより標的化され
うる部位数を、これらの新規NTDは~15倍増大させた。更に、正確な結合が鍵となり
うる遺伝子調節、内因性DNA結合性タンパク質の置換および合成生物学用途を促進させ
る、任意のDNA配列におけるTALE DBDおよびTALE-TFの正確な配置を、
それらは今や可能にする。天然NTDに基づくTALENはN0塩基置換の種々の度合の
許容性を示すが、該データは、ここで報告されている新規NTDが、天然のNTDに基づ
くTALENより高い効率の遺伝子編集を促進することを示している。
キメラジンクフィンガーリコンビナーゼ
以下の材料および方法を用いた。
Stratagene)から誘導し、クロラムフェニコール耐性遺伝子および分断TEM
-1 p ラクタマーゼ遺伝子をlacプロモーターの制御下で含有するように修飾した
。既に記載されているとおりにZFR標的部位を導入した。簡潔に説明すると、GFPu
v(Clontech)をプライマーGFP-ZFR-XbaI-FwdおよびGFP-
ZFR-HindIII-RevでPCR増幅し、pBLAのSpeIおよびHindI
II制限部位内にクローニングしてpBLA-ZFR基質を得た。全てのプライマー配列
を表8に示す。
イマーSV40-ZFR-BglIII-FwdおよびSV40-ZFR-Hindll
l-RevでpGL3-Prm(Promega)からPCR増幅した。PCR産物をB
glIIおよびHindIIIを消化し、pGL3-Prmの同じ制限部位内に連結して
pGL3-ZFR-1、2、3...18を得た。pBPS-ZFR供与プラスミドを、
ZFR-1、2および3リコンビナーゼ部位がプライマー3’CMV-PstI-ZFR
-1、2または3-Revによりコードされている点以外は既に記載されているとおりに
構築した。各プラスミドの正しい構築が配列分析により確認された。
既に記載されているとおりに、PCRによりZFRを構築した。PCR産物をSacI
およびXbaIで消化し、pBLAの同じ制限部位内に連結した。連結物をエレクトロポ
レーションにより大腸菌(Escherichia coli)TOP10F’(Inv
itrogen)内に形質転換した。SOC培地内での1時間の回収の後、細胞を、30
∧gmL-1のクロラムフェニコールを含有する5mL SB培地と共にインキュベート
し、37℃で培養した。16時間の時点で、細胞を集め、プラスミドDNAをミニプレッ
プ(Mini-prep)(Invitrogen)により単離し、200ngのpBL
Aを使用して大腸菌(E.coli)TOP10F’を形質転換した。SOCにおける1
時間の回収の後、30∧gmL-1のクロラムフェニコールまたは30∧gmL-1のク
ロラムフェニコールおよび100∧gmL-1のカルベニシリン(アンピシリン類似体)
を含有する固体LB培地上で細胞をプレーティングした。クロラムフェニコールおよびカ
ルベニシリンを含有するLB培地上のコロニーの数を、クロラムフェニコールを含有する
LB培地上のコロニーの数で割り算したものとして、組換えを判定した。コロニー数は、
GelDoc XRイメージングシステム(Imaging System)(Bio-
Rad)を使用する自動計数により決定した。
既に記載されているとおりに、重複伸長PCRによりZFRライブラリーを構築した。
全20種のアミノ酸をコードする縮重コドンNNK(N:A、T、CまたはGおよびK:
GまたはT)で120、123、127、136および137位に突然変異を導入した。
PCR産物をSacIおよびXbaIで消化し、pBLAの同じ制限部位内に連結した。
連結物をエタノール沈殿させ、それを使用して大腸菌(E.coli)TOP10F’内
に形質転換した。ライブラリーサイズは常法により~5×107と決定された。SOC培
地内での1時間の回収の後、細胞を、30∧gmL-1のクロラムフェニコールを含有す
る100mL SB培地と共に37℃でインキュベートした。16時間の時点で、30m
Lの細胞を集め、プラスミドDNAをミニプレップ(Mini-prep)により単離し
、3∧gのプラスミドDNAを使用して大腸菌(E.coli)TOP10F’を形質転
換した。SOCにおける1時間の回収の後、30∧gmL-1のクロラムフェニコールお
よび100∧gmL-1のカルベニシリンを含有する100mLのSB培地と共に37℃
で細胞をインキュベートした。16時間の時点で、細胞を集め、プラスミドDNAをMa
xi-prep(Invitrogen)により単離した。富化されたZFRをSacI
およびXbaI消化により単離し、更なる選択のために新たなpBLA内に連結した。4
ラウンドの選択の後、個々のカルベニシリン耐性クローンに関して配列分析を行った。前
記のとおりに組換えアッセイを行った。
リコンビナーゼ触媒ドメインをそれらのそれぞれのpBLA選択ベクターからプライマ
ー5’Gin-HBS-Kozおよび3’Gin-Agel-RevでPCR増幅した。
PCR産物をHindIIIおよびAgeIで消化し、pBHの同じ制限部位内に連結し
てSuperZiF適合性サブクローニングプラスミド:pBH-Gin-a、P、y、
5、sまたはZを得た。ジンクフィンガーをSuperZifにより構築し、pBH-G
in-a、P、y、5、sまたはZのAgeIおよびSpeI制限部位内に連結して、p
BH-ZFR-L/R-1、2、3.18(L:左ZFR;R:右ZFR)を得た。ZF
R遺伝子をSfi消化によりpBHから遊離させ、pcDNA3.1(Invitrog
en)内に連結してpcDNA-ZFR-L/R-1、2、3.18を得た。各ZFRの
正しい構築が配列分析により確認された(表9)。
ヒト胎児腎(HEK)293および293T細胞(ATCC)を、10%(vol/v
ol)FBSおよび1%(vol/vol)抗生物質-抗真菌剤(Anti-Anti;
Gibco)を含有するDMEM内で維持した。HEK293細胞を96ウェルプレート
上に4×104細胞/ウェルの密度で播き、加湿5% CO2雰囲気中で37℃で樹立さ
せた。播いた後24時間の時点で、リポフェクタミン(Lipofectamine)2
000(Invitrogen)を該製造業者の説明に従い使用して、150ngのpc
DNA-ZFR-L 1-18、150ngのpcDNA-ZFR-R 1-18、2.
5ngのpGL3-ZFR-1、2、3.または18および1ngのpRL-CMVで細
胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を受動細胞溶解(
Passive Lysis)バッファー(Promega)で細胞溶解し、ベリタス・
マイクロプレート・ルミノメータ(Veritas Microplate Lumin
ometer)(Turner Biosystems)を使用して二重ルシフェラーゼ
レポーターアッセイ系(Dual-Luciferase Reporter Assa
y System)(Promega)でルシフェラーゼ発現を決定した。
HEK293細胞を6ウェルプレート上に5×105細胞/ウェルの密度で播き、血清
含有培地内で加湿5%CO2雰囲気中で37℃で維持した。播いた後24時間の時点で、
リポフェクタミン(Lipofectamine)2000を製造業者の説明に従い使用
して、1∧gのpcDNA-ZFR-L-1、2または3および1∧gのpcDNA-Z
FR-R-1、2または3および200ngのpBPS-ZFR-1、2または3で細胞
をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を6ウェルプレート
上に5×104細胞/ウェルの密度で分割し、2∧gmLのピューロマイシンを含有する
血清含有培地内で維持した。100%のコンフルエンスに達したら細胞を集め、Quic
k Extract DNA抽出溶液(Extraction Solution)(E
picentre)でゲノムDNAを単離した。Expand High Fideli
ty Taq System(Roche)を使用し、以下のプライマーの組合せを使用
してZFR標的をPCR増幅した:ZFR-標的-1、2または3-FwdおよびZFR
-標的-1、2または3-Rev(未修飾標的);ZFR-標的-1、2または3-Fw
dおよびCMV-Mid-Prim-1(フォワード組込み);ならびにCMV-Mid
-Prim-1およびZFR-標的-1、2または3-Rev(リバース組込み)。クロ
ーン分析のために、トランスフェクションの2日後に、1×105細胞を100mmディ
ッシュ上に分割し、2∧gmL-1のピューロマイシンを含有する血清含有培地内で維持
した。個々のコロニーを、無菌シリコーングリース(Millipore)を伴う10m
m×10mm開放端クローニングシリンダーを使用して単離し、培地内で増殖させた。1
00%のコンフルエンスに達したら細胞を集め、ゲノムDNAを単離し、前記のとおりの
PCRのための鋳型として使用した。コロニー計数アッセイのために、トランスフェクシ
ョンの2日後、細胞を6ウェルプレート内に1×104細胞/ウェルの密度で分割し、2
∧gmL-1のピューロマイシンの存在下または非存在下、血清含有培地内で維持した。
16日の時点で、細胞を0.2%クリスタルバイオレット溶液で染色し、ピューロマイシ
ン含有培地内で形成されたコロニーの数を計数し、ピューロマイシンの非存在下で形成さ
れたコロニーの数で割り算することにより組込み効率を決定した。コロニー数は、Gel
Doc XRイメージングシステム(Imaging System)(Bio-Rad
)を使用する自動計数により決定した。
Ginリコンビナーゼの特異性プロファイル
セリンリコンビナーゼ触媒特異性を再操作するために、このファミリーの酵素による基
質認識の根底にある要因の詳細な理解を深めた。これを達成するために、対称に置換され
た標的部位の包括的セットをDNAインベルターゼGinの触媒ドメインの活性化突然変
異体が組換える能力を評価した。Gin触媒ドメインは、2つの10bpの半分部位領域
からなる偽対称性20bpコアを組換える。したがって、組換え部位のこの集合体は10
、9、8、7、6、5および4位にそれぞれの可能な一塩基置換を、そして3および2位
ならびにジヌクレオチドコア内にそれぞれの可能な二塩基の組合せを含有していた。リコ
ンビナーゼ活性を抗生物質耐性に関連づける既に記載されている方法である分割遺伝子再
構築により組換えが決定された。
せのうちの12個(AA,AT,AC,AG,TA,TT,TC,TG,CA,CT,G
A,GT);(ii)3および2位における16個の可能な二塩基の組合せのうちの4個
(CC,CG,GGおよびTG);(iii)6、5または4位における単一のAからT
への置換;ならびに(iv)10、9、8および7位における全12個の可能な一塩基置
換を許容することが判明した(図31A~D)。更に、Ginは、10、9、8および7
位における(可能な4.29×109個のうちの)少なくとも106個のユニーク塩基の
組合せを含有する標的部位ライブラリーを組換えうることが判明した(図31D)。
は、(i)ジヌクレオチドコアを越えてリコンビナーゼ二量体によりなされる相互作用が
非対称であり、主に非特異的であること、(ii)DNA小溝およびリコンビナーゼアー
ム領域における進化的に保存されたGly-Argモチーフの間の相互作用が6、5およ
び4位のアデニンまたはチミンの要件を課すこと、ならびに(iii)10、9、8また
は7位におけるアーム領域および小溝の間の配列特異的相互作用が存在しないことを示し
ている(図31E)。これらの結果は、密接に関連したHinリコンビナーゼのDNA結
合特性の決定に焦点を合わせた研究とも合致している。
Ginが3および2位の保存的置換(すなわち、CC、CG、GGおよびTG)を許容
するという知見に基づいて、天然酵素によっては許容されない12個の塩基の組合せのそ
れぞれを含有するコア配列(図32A)を特異的に認識するようにGin触媒特異性が再
操作されうるかどうかを調べた。GinによるDNA認識に関与する特異的アミノ酸残基
を特定するために、対応するそれぞれのDNA標的と複合体形成した2つの関連セリンリ
コンビナーゼ(y6レゾルバーゼおよびSinリコンビナーゼ)の結晶構造を調べた。こ
れらのモデルに基づいて、3および2位においてDNAに接触する5個の残基、すなわち
、Leu 123、Thr 126、Arg 130、Val 139およびPhe 1
40(y5レゾルバーゼに基づく番号づけ)を特定した(図32B)。Gin触媒ドメイ
ン内の同等残基(Ile 120、Thr 123、Leu 127、Ile 136お
よびGly 137)において重複伸長PCRによりランダム突然変異誘発を行い、これ
らの触媒ドメイン変異体を「H1」ZFPの未修飾コピーに融合させることによりZFR
突然変異体のライブラリーを構築した。このライブラリーの理論的サイズは3.3×10
7変異体であった。
れない5つの塩基の組合せ(GC、GT、CA、ACまたはTT)の1つを含有する基質
プラスミド内にZFRライブラリーをクローニングした(図32C)。4ラウンドの選択
の後、各ZFR集団の活性が、GC、GT、CAおよびTT置換を含有するDNA標的に
対しては>1,000倍、そしてAC置換を含有するDNA標的に対しては>100倍増
強することが判明した(図32D)。
に高レベルのアミノ酸多様性が存在すること、および選択されたクローンの>80%が1
36位にArgを、そして137位にTrpまたはPheを含有することが判明した(図
36)。これらの結果は、136および137位が非天然コア配列の認識において決定的
に重要な役割を果たしていることを示唆している。それぞれの選択された酵素がその標的
DNAを組換える能力を評価した。ほぼ全てのリコンビナーゼが活性(>10%の組換え
)を示し、それらの意図されるコア配列への特異性における>1,000倍の移行を示す
ことが判明した(図37)。親Ginの場合と同様に、幾つかのリコンビナーゼは3およ
び2位の保存的置換を許容することが判明した(すなわち、GTおよびCTまたはACお
よびAGに対する交差反応性)。このことは、複数のコア部位を標的化するために単一の
再操作触媒ドメインが用いられうることを示している(図37)。
能な二塩基の組合せのうちの9個(GC、TC、GT、CT、GA、CA、AG、ACお
よびTT)を認識することが示された5つのGin変異体(以下、Gin p、y、6、
eおよびZと称する)の組換えプロファイルを決定した(表1)。Gin p、6および
eはそれらの意図されるコア配列を、親酵素(以下、Gin aと称される)のものと比
較しうる活性および特異性で組換え、そのGin yおよびZはそれらの意図されるコア
配列を、Gin aのものを超える特異性で組換えることが可能であった(図32E)。
各リコンビナーゼは6、5および4位のアデニンまたはチミンに対する>1,000倍の
優先性を示し、10、9、8および7位における塩基優先性を示さなかった(図38)。
これらの結果は、DNA結合性アームの突然変異誘発がリコンビナーゼ特異性を損なわな
かったことを示している。3および2位におけるAA、ATまたはTA置換を許容しうる
Gin変異体を選択することは可能ではなかった。この結果に関する1つの可能性は、>
4個の連続的A-Tbpを含有するDNA標的が、リコンビナーゼ結合および/または触
媒を妨げる屈曲したDNAコンホメーションを示すというものである。
再操作触媒ドメインから構成されるZFRが所定配列を組換えうるかどうかを調べた。
この可能性を試験するために、ランダムDNAの400,000bp当たり約1個出現す
ると予想される44bpのコンセンサス組換え部位を使用して、ヒトゲノム(GRCh3
7一次参照構築体)を潜在的ZFR標的部位に関して検索した(図4A)。選択されたG
in変異体のコア配列プロファイルから導き出されたこのZFRコンセンサス標的部位は
、21個の可能な触媒ドメインの組合せにより許容されると予想される(可能な1.09
55×1012個のうちの)約7×108個のユニーク20bpコア組合せ、ならびに各
ZFBS内の5’-CNN-3’および5’-TNN-3’トリプレットを含まないモジ
ュール式ジンクフィンガードメインの保存的選択を含む。選択のための一次決定因子とし
てZFP特異性を用いて、非タンパク質コード化遺伝子座における8個のヒト染色体(第
1、2、4、6、7、11、13およびX染色体)にわたる18個の可能なZFR標的部
位を特定した。平均して、それぞれの20bpのコアは、天然Gin触媒ドメインにより
認識されるコア配列に対して~46%配列同一性を示した(図33B)。各対応ZFRは
モジュール式構築により構築された(「材料および方法」を参照されたい)。
R媒介性組換えをルシフェラーゼ発現の低減と相関させる一過性レポーターアッセイを開
発した(図33Aおよび39)。これを達成するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝
子の発現を駆動するSV40プロモーターの上流および下流にZFR標的部位を導入した
。ヒト胎児腎(HEK)293T細胞を各ZFRペアおよびその対応レポータープラスミ
ドのための発現ベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後
、ルシフェラーゼ発現を測定した。分析された18個のZFRペアのうち、38%(18
個中7個)がルシフェラーゼ発現を>75倍低減し、22%(18個中4個)がルシフェ
ラーゼ発現を>140倍低減した(図33B)。比較として、天然Gin触媒ドメインに
より認識されるコア配列を標的化するように設計された陽性ZFR対照であるGinC4
はルシフェラーゼ発現を107倍低減した。総合すると、評価されたZFRペアの50%
(19個中9個)はルシフェラーゼ発現を少なくとも20倍低減することが判明した。重
要なことに、細菌細胞において有意な活性(>20%の組換え)を示した実質的に全ての
触媒ドメインは、哺乳類細胞における少なくとも1つの天然に存在する配列を組換えるた
めに成功裏に使用された。
ミドと共に9個の最も活性なZFRのための発現プラスミドでHEK293T細胞をコト
ランスフェクトした。各ZFRペアはその意図されるDNA標的に対する高い特異性を示
し、評価されたZFRの77%(9個中7個)は、陽性対照GinC4の場合と実質的に
同一である全体的な組換え特異性を示した(図4C)。ルシフェラーゼ発現の低減が、意
図されたZFRヘテロ二量体の成果であり、組換え適合性ZFRホモ二量体の副産物では
ないことを確証するために、組換えに対する各ZFR単量体の寄与を測定した。ZFR
1「左」単量体のその対応レポータープラスミドとのコトランスフェクションはルシフェ
ラーゼ発現における中程度の低減(組換えに対する全寄与:~22%)を招いたが、個々
のZFR単量体の大多数(18個中16個)は組換えに有意には寄与せず(<10%の組
換え)、多数(18個中7個)は活性を示さなかった(図39)。総合すると、これらの
研究は、使用者により定められた配列を高い特異性で組換えるようにZFRが操作されう
ることを示している。
した。これを達成するために、特異的ZFR標的部位およびピューロマイシン耐性遺伝子
をSV40プロモーターの制御下で含有する対応DNA供与プラスミドならびにZFR発
現ベクターでHEK293細胞をコトランスフェクトした。この分析のために、それぞれ
ヒト染色体4、Xおよび4上の染色体非タンパク質コード化遺伝子座を標的化するように
設計されたZFRペア1、2および3を使用した(図34A)。トランスフェクションの
2日後、細胞をピューロマイシン含有培地と共にインキュベートし、ピューロマイシン耐
性(puroR)コロニーの数の決定により組込み効率を測定した。(i)供与プラスミ
ドおよび対応ZFRペアのコトランスフェクションは、供与プラスミドのみでのトランス
フェクションと比較してpuroRコロニーにおける>12倍の増加を招くこと、ならび
に(ii)両方のZFRでのコトランスフェクションは、個々のZFR単量体でのトラン
スフェクションと比較してpuroRコロニーにおける6~9倍の増加を招くことが判明
した(図34B)。ZFRペアが組込みを正しく標的化したかどうかを評価するために、
ゲノムDNAをpuroR集団から単離し、各標的化遺伝子座をPCRにより増幅した。
フォワードおよび/またはリバース配向における組込みに対応するPCR産物が、これら
のZFRペアにより標的化された各遺伝子座において観察された(図34C)。次に、Z
FR媒介性組込みの全体的特異性を決定するために、ゲノムDNAをクローン細胞集団か
ら単離し、プラスミド挿入をPCRにより評価した。この分析は8.3%(12個中1個
のクローン)、14.2%(35個中5個のクローン)および9.1%(11個中1個の
クローン)の、それぞれZFRペア1、2および3に関する標的化効率を示した(図S6
)。各PCR産物の配列分析はZFR媒介性組込みを証明した(図34D)。総合すると
、これらの結果は、DNAを内因性遺伝子座内に正確に組込むようにZFRが設計されう
ることを示している。
が判明したことが注目される(図34C)。前記のルシフェラーゼレポーター研究に合致
しているこの結果(図39)は、組換え適合性ZFRホモ二量体がオフターゲット(非特
異的)組込みを媒介する能力を有することを示している。最適化ヘテロ二量体ZFR構造
体の将来の開発およびオフターゲット組込みの包括的評価は、より大きな標的化効率を示
すZFRの設計につながるはずである。
、およびZFRがヒト細胞における所定内因性遺伝子座内にDNAを組込みうることが本
明細書に示されている。基質特異性分析と定向進化とを組合せることにより、ZFR触媒
ドメインにより課される実質的に全ての配列要件が排除された。45個の予め選択された
ジンクフィンガーモジュールのアーカイブを使用して、4,000bpのランダム配列当
たりに約1個の潜在的ZFR標的部位に対応する>1×1022個のユニーク44bp
DNA配列を認識するようにZFRが設計されうると推定される。選択による特製(カス
タム化)ジンクフィンガードメインの構築は標的化を更に進展させるであろう。本明細書
に記載されている再操作触媒ドメインは、最近記載されているTALエフェクターリコン
ビナーゼに適合するであろう。この研究は、カスタム特異性を有するZFRを作製する実
施可能性を実証しており、ゲノム工学、合成生物学および遺伝子治療を含む多種多様な用
途に関するZFRの潜在的有用性を例示している。
範囲内に含まれると理解されるであろう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲の
みにより限定される。
Claims (9)
- 核酸分子を用いて細胞を形質転換する方法であって、
前記核酸分子が細胞内に取り込まれる条件の下で、前記核酸分子を接触させることを含み、
前記核酸分子が、QはYである、QはSである、QはRである、WはGである、Wは欠失している、SはRである、SはHである、SはAである、SはNである、およびSはTであることから選択される1以上の突然変異を有する配列番号3(VGKQWSGARAL)で表されるアミノ酸配列をN-1ヘアピンに含むN末端ドメイン(NTD)を有する、キサントモナス(Xanthomonas)由来の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸分子である、前記方法(ただし、前記細胞がヒトの生体内の細胞である方法を除く)。 - 前記核酸分子を用いた細胞の形質転換が、ウイルス感染、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって媒介される、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子がリボ核酸分子である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが転写アクチベーター様エフェクター(TALE)タンパク質結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが1~40個のTALEタンパク質結合ドメインを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ活性を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TALEタンパク質がトランケート化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記TALEタンパク質がC末端またはN末端トランケート化を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記TALEタンパク質がC末端トランケート化を含む、請求項7に記載の方法。
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