JP2015213514A - 自然免疫応答の調節因子sting(インターフェロン遺伝子の刺激因子) - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年8月4日に出願された米国仮特許出願第61/129,975号の優先権を主張し、引用により全体として本明細書に取り込まれる。
本概要は、本発明の性質及び実体を簡潔に表すための本発明の概要を示すために提供される。本概要は、特許請求の範囲、すなわち、意味を解釈するか、あるいは限定するためには用いられないであろうとの理解のもとに提示される。
本発明は添付図面に関して説明され、参照番号が類似又は均等の要素を指定するために図面を通して用いられる。前記図面は一定の縮尺で描写されておらず、それらは本発明を例示するためのみに提供される。本発明の多くの局面が、例示のための応用例に関して以下に説明される。多数の具体的な詳細、相互関係及び方法が、本発明の完全な理解を提供するために列挙されると理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明が、1つ又は2つ以上の具体的な詳細なしにか、あるいは別の方法とともに実施される場合があると容易に認識するであろう。本発明は、いくつかの作業が、異なる順番で、及び/又は、別の作業又は事象と同時に起こる場合があるように、作業又は事象の図示された順番によって限定されない。さらに、図示された作業又は事象の全てが、本発明に応じる方法を実行するために必要とされるわけではない。
本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様をただ説明するだけの目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で用いられるところの単数形の「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「前記又は該(the)」は、状況が別に明示される場合を除いて、複数形も含むことが意図される。さらに、詳細な説明及び/又は特許請求の範囲のいずれかで用いられる「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」又はそれらの変形(variants)の用語である限り、かかる用語は前記用語の「含む」と類似するやり方で含むことが意図される。
本発明の実施態様は、本明細書でSTINGと名付けられた分子の核酸配列及びそれらのエンコードされた産物に関する。新規のSTINGの核酸、そのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、変異体、バリアント及び活性型断片は、被験者の自然及び獲得免疫を変調するため、及び/又は、免疫を変調することによって感染を治療及び予防することを含む免疫関連疾患の治療のために用いられる場合がある。また、前記ペプチドと反応する薬剤と、前記ペプチド、単離された核酸分子を含む医薬品組成物と、前記ペプチドをエンコードする単離された核酸分子と、前記核酸分子を含む組み換え核酸コンストラクトと、該組み換え核酸コンストラクトを含む少なくとも1つの細胞と、宿主細胞を用いて前記ペプチドを産生する方法とを提供する。さらに本発明は、被験者に本発明の前記ペプチドを投与し、それによって前記被験者の自然免疫を変調するステップによって前記被験者における感染を治療及び/又は予防するための方法を提供する。さらに、本発明は候補治療剤を同定するための方法を提供する。
2本鎖DNAに対する抗体が、全身性エリテマトーデスの患者のおよそ半分に存在し、SLEの診断に非常に特異的である(Simon JAら、Rheumatology (Oxford). 2004 Feb;43(2):220−4)。さらに、前記抗体は、顕著な予後指標の重要性を有する抗dsDNA抗体の有するSEL患者は、ループス腎炎及び脈管炎を含む狼瘡の重篤な所見を発症する可能性がとても高く、予後が実質的に長期間不良である。狼瘡に対するdsDNA抗体の重要性が長く認識されているにもかかわらず、前記抗体と疾患の発症との関連性は謎のままである。標的組織抗原と直接的に相互作用する、単離された抗dsDNA抗体の特異性(dsDNA specificities)は一部の患者では知られてきたが、この種の同定された交差反応性を有しない患者でも肝臓がしばしば標的にされ、同様に予後が不良である。狼瘡の患者又は動物モデルのdsDNA抗原へのB及びT細胞の寛容プロトコルは、成功しなかった(Renaudineau Yら、Arthritis Rheum. 2006 Aug;54(8):2523−32; Cardiel MHら、Arthritis Rheum. 2008 Aug;58(8):2470−80; Kang HKら、J Immunol. 2007 Jun 15;178(12):7849−58.)。しかし、ヌクレオソームのDNAと、自然免疫の誘導、特に重篤なdsDNA関連瘢痕との関係性の興味が存在し続けており、免疫反応性を誘導する自己DNAに対する非TLR9の自然免疫認識経路が同定されている。STINGが、(ヌクレオソーム又は細胞内RNAのような)細胞破片の成分を潜在的に含む産物に対する自然免疫応答を誘導/増幅する役割を果たす場合がある可能性がある役割を与えられるとき、STINGは、自己免疫及び自己炎症性の症状の広範なアレイの発現で役割を果たす場合もある。したがって、前記STING遺伝子が、ヒトの5q31.2、すなわち、クローン病、関節リウマチ、1型糖尿病及びセリアック病を含む疾患リスク及び/又はより重篤な疾患の過程に結び付けられるIBD5遺伝子座のすぐそばに配置されることは注目すべきことである(7−10)。また少なくとも1つの報告が、この領域と、狼瘡のリスクとの連鎖を観察した(De Jager PLら、Genes Immun. 2006 Jun;7(4):327−34)。理論に拘束されないが、STING関連経路の誘導を増大することが、プロ免疫(pro−immune)シグナル伝達を増大して、抗dsDNA関連狼瘡の主要器官を標的にし、不良な結果をもたらす傾向を含む、自己免疫疾患の可能性及び重篤性を増大すると仮説が立てられる。前記STING経路によって調節されるその他の疾患は多発性硬化症を含み、この原因は、DNAを利用したレトロエレメントを含む場合がある(Dolei A、Perron H、JNeurovirol. 2009 Jan;15(l):4−13; Christensen T.、Rev Med Virol. 2005 May−Jun;15(3):179−211)。
STINGは、未だに知られていない分子及び経路を含むさまざまなものと相互作用又は会合する。
もう1つの好ましい実施態様では、ベクターは、配列番号1、2に列挙されるポリヌクレオチド、それらのバリアント、変異体又は活性型断片を含む。
STINGは自然免疫応答を活性化する。したがって、疾患特異的抗原に結合して、免疫応答を変調し、広範な疾患療法で適用可能なアジュバントのようなワクチンで用いられる場合があることを期待される。
STINGペプチドをエンコードする核酸が配列番号1及び2に列挙される。前記「STING」という用語は、核酸及びペプチドの両方を指すであろう。本発明はこれら2種類に限られず、アレルバリアント、種バリアント、スプライスバリアント、変異体、断片等を含むが、これらに限定されない。これら2つの配列は、明細書を通して例示の目的にのみ用いられるであろうが、限定するようには構成されていない。
好ましい実施態様では、1種類又は2種類以上のSTING核酸、タンパク質又はペプチドは、他の原子団に連結又は融合される場合がある。例えば、アプタマー、抗体の配列のような標的化配列と、例えば、サイトカインと、抗生物質と、毒物と、放射性標識のような治療上のエフェクター分子と、シグナル誘導ペプチドと、細胞内標的化原子団等。前記STING分子はリンカー分子を介して遺伝的に融合又は結合される場合がある。
さらにもう1つの局面では、本発明はトランスジェニック非ヒト動物、たとえばSTINGを欠如するトランスジェニックマウスを提供する。詳細は以下の実施例で提供される。
もう1つの好ましい実施態様では、細胞又は患者におけるSTINGの機能及び/又は発現がターゲッティングSTING分子によって変調されている。STINGアンチセンス又はsiRNAオリゴヌクレオチドの例は、配列番号3ないし5を含む。
抗体及びアプタマー
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてSTING遺伝子及び遺伝子発現を検出することに加えて、免疫アッセイは、本発明のSTINGタンパク質を検出するために用いられる場合もある。かかるアッセイは、STINGの変調因子をスクリーニングと、治療上及び診断上の用途とのために有用である。免疫アッセイは、定性的又は定量的にSTINGタンパク質を解析するために用いられる場合がある。適用可能な技術の一般的な概要は、Harlow及びLane、Antibodies: A Laboratory Manual(1988)で見出される場合がある。
ハイスループットの機能的ゲノムアッセイが、STINGの機能及び/又は発現の変調因子を同定するために用いられる場合がある。例えば、STINGで仲介されるインターフェロン誘導のようなSTINGの機能を測定する詳細な方法は、以下の実施例で提供される。細胞は、(核酸によってエンコードされる)cDNA又はランダムペプチドライブラリーと接触されるのが典型である。前記cDNAライブラリーは、センス、アンチセンス、完全長及び欠損型のcDNAを含む場合がある。前記ペプチドライブラリーは核酸によってエンコードされる。その後、STINGの前記cDNA又はペプチドライブラリーの影響が監視される。cDNA又はペプチドの影響が確認され、例えば、テトラサイクリンプロモーターからの発現のような核酸の調節可能な発現を用いて体細胞突然変異を鑑別される場合がある。ペプチドをエンコードするcDNA及び核酸は、例えば、配列タグを用いて、当業者に知られる手法を用いて回復される場合がある。
ユニークな核酸それぞれは、アレイを形成するために定義された部位で配置されるため、STINGに結合可能な核酸配列の同定は、基質表面上に核酸のライブラリーを不動化することによって達成される場合がある。詳細は以下の実施例の段落で提供される。一般的に、核酸の不動化されたライブラリーは、前記核酸に生体分子を結合する好ましい条件下で前記生体分子又は候補薬剤に曝露される。非特異的に結合する生体分子は、所望の結合特異性レベルに依存して穏やかな緩衝条件からストリンジェントな緩衝条件までを用いて洗い流される場合がある。その後、前記核酸アレイは、核酸配列が前記生体分子に結合したものを決定するために解析されるであろう。前記生体分子は、結合した核酸の局在の検出で使用するための蛍光タグを輸送するであろうことが好ましい。
コンビナトリアルケミストリーの開発は、数百個ないし数千個の個々の化合物の速く、経済的な合成を可能にする。これらの化合物は、有効性のスクリーニングのために設計された低分子の中規模のライブラリーで配置されることが典型的である。コンビナトリアル法は、新規化合物を同定するために適切な偏りのないライブラリーを作成するために用いられる場合がある。さらに、作成される場合がある低分子の多様性のないライブラリーは、以前に決定された生物学的活性を有する片親の化合物に由来する。いずれかの場合には、重要な酵素の阻害剤のようなコンビナトリアルケミストリーによって作成される、治療上の適切な生体分子を特異的に標的化するための有効なスクリーニングシステムを欠くことが、それらの資源を最適に使用することを妨げる。
アッセイで用いられる特定の標識又は検出可能な原子団又はタグが、それらのリガンドへのORFファージの特異的な結合を顕著に妨害しない限り、本発明の重大な局面ではない。検出可能なグループは、検出可能な物理的又は化学的な性質を有する物質のいずれかの場合がある。かかる検出可能な標識は、免疫アッセイの分野で十分に開発され、一般的に、かかる方法で有用な多くの標識が本発明に適用される場合がある。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的な手段によって検出可能な組成物のいずれかである。本発明の有用な標識は、磁性ビーズ(例えば、ダイナビーズ(商標))と、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等)と、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C又は32P)と、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISAで一般的に用いられるその他のもの)と、コロイド金又は着色ガラス又はプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等)のような比色標識とを含む。
組成物は、STINGが関係する疾患のin vivoの治療又は予防に有用である。これらは、ウイルス疾患、細菌感染、原生動物の寄生感染、癌、自己免疫疾患、炎症、移植、神経疾患又は障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、アルツハイマー病、肝疾患又は障害、胃腸疾患又は障害、糖尿病、癌、自己免疫、免疫関連疾患又は障害、神経疾患又は障害、神経変性疾患又は障害、神経の修復及び麻痺、神経内分泌分化、炎症性疾患、筋疾患又は障害、感染性生物に関係する疾患又は障害等を含む。
本発明に応じるキットは、STING分子、抗体等のうちの少なくとも1つを含む。また、前記キットは、(液体又は凍結の形状の)緩衝剤及び/又は賦形剤の溶液か、水で再構築されるべき緩衝剤及び/又は賦形剤の粉末調製物かを含む。したがって、STINGのペプチドを含むキットは、熱か、水か、前記キットで提供される溶液かの所定量を添加することが、疾患の治療における治療効果について化合物のいずれかを効率的にアッセイするための十分な濃度及びpHの剤形を生じるであろう濃度で、凍結されるか、凍結乾燥されるか、事前希釈されるか、あるいは事前混合されることが好ましい。また、かかるキットは、前記アッセイの成分を再構築し、使用するための説明書を含むであろうことが好ましい。前記キットは、再構築された活性組成物のための2種類又は3種類以上の構成部分を含む場合もある。例えば、第2の構成部分は、ユーロピウムクリプテート(Europium cryptate)及びアロフィコシアニンで標識された抗タグ抗体の場合がある。上記の緩衝剤、賦形剤その他の構成部分は、キットと個別又は一緒に販売される場合がある。
病原体の侵入への細胞性宿主防御応答は、ウイルスの核酸か、リポ多糖又は鞭毛タンパク質を含む微生物の細胞壁成分かのような病原体関連分子パターン(PAMPs)を抗病原体遺伝子の誘導をもたらすように検出することを主に含む。例えば、ウイルスのRNAは、小胞体(ER)及び/又はエンドソームに存在する膜結合型トル様受容体(TLR’s)(例えば、TLR3及び7/8)か、レチノイン酸誘導性遺伝子1(RIG−I)と呼ばれるTLR非依存性細胞内DExD/HボックスRNAヘリカーゼ又はメラノーマ分化関連抗原5(MDA5、IFIH1及びヘリカードとも呼ばれる)かによって検出される。これらの事象は、多くが知られないままの下流のシグナル事象を活性化し、I型IFNを含む、NF−κB及びIRF3/7に依存性の遺伝子の転写をもたらす。
細胞、ウイルス及び試薬
293T及びHEK293の細胞がATCCから入手され、10% FBSを補充したDMEM培地で維持された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)がLonza(スイス、バーゼル)から入手され、内皮増殖培地(EGM−2)(Lonza)で維持された。FADD+/+、FADD−/−、TBK−1+/+及びTBK−1−/− MEF(Balachandran, S., E.ら、Nature、2004. 432(7015):401−5頁)。VSV−GFPが感染に用いられ、以前に説明されたようにタイターが測定された(Balachandran, S., E.ら、2004)。VSV−ΔMが以前に説明されたように構築された(Faria, P. A.ら、Mol Cell, 2005. 17(1):93−102頁)。マウスIFN−β ELISAキットがPBL(ニュージャージー州ピスカタウェイ)から入手された。EMCVがATCCから購入された。
ヒトSTING(hSTING)、マウスSTING(mSTING)、hSTING−N(1−230番目のアミノ酸)及びhSTING−C(173−379番目のアミノ酸)の配列がPCRによって増幅され、C末端にHAでタグ化された発現コンストラクトを生成するためにpcDNA3プラスミドにクローニングされた。Flagでタグ化されたRIG−I、ΔRIG−I(1−284番目のアミノ酸)、IPS−1及びTBK−1をエンコードする発現プラスミドが、以前に説明された(Balachandran, S.ら、J Immunol, 2007. 178(4):2429−39頁)。GFPでタグ化されたRIG−I及びTBK−1は、pAcGFP1−C1(クロンテック、カリフォルニア州)にクローニングすることによって生成された。その他のプラスミドが、p110−Luc及びPRD−III−I−Luc(T. Maniatis)、IFNβ−Luc及びISRE−Luc(J. Hiscott)、NFKB−LUC(ストラタジーン、カリフォルニア州)、ER−dsRED及びゴルジ−dsRED(クロンテック、カリフォルニア州)から入手された。
ヒトSTINGの324−340番目の残基と一致する合成ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体が、エボクエスト顧客抗体サービス(EvoQuest Custom Antibody Services)(インビトロジェン、カリフォルニア州)から入手された。その他の抗体は、SEC61β(アップステート、ニューヨーク州)、β−アクチン、HA、FLAG(シグマ、ミズーリ州)、IRF3及びRIG−I(アビーム、マサチューセッツ州)の供給源から入手された。
ヒトの多数の組織RNAブロット(クロンテック、カリフォルニア州)が、32Pで標識化された完全長ヒトSTINGプローブでハイブリダイゼーションされた。
総RNAがRNeasy RNA抽出キット(キアゲン、カリフォルニア州バレンシア)を用いて細胞から単離され、cDNA合成が1μgの総RNAを用いて実施された(ロシュ、インディアナ州インディアナポリス)。蛍光リアルタイムPCR解析が、LightCycler 2.0機器(ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス)及びTaqMan遺伝子発現アッセイ(アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州)を用いて実施された。mRNAの相対量が、各試料の18SリボソームRNAレベルで標準化された。
総RNAが、STING発現ベクターをトランスフェクションされた293T細胞から抽出された。cDNAの調製及びマイクロアレイ解析が、イエール大学のW.M. Keck財団バイオテクノロジー研究所のDNAマイクロアレイ施設(コネチカット州ニューヘイブン)で実施された。ヒトゲノムU133プラス2.0アッセイ(アフィメトリクス、カリフォルニア州)が用いられた。データ解析が、ジーンスプリングソフトフェア(シリコンジェネティクス、カリフォルニア州)で実施された。
ER−DsRED及びゴルジ−DsRED(クロンテック、カリフォルニア州)が、ER及びゴルジのマーカーそれぞれに用いられた。ミトコンドリアの染色のために、生細胞が、300nMのミトトラッカーレッド(インビトロジェン、カリフォルニア州)を用いて37°Cで45分間インキュベーションされた。
ミトコンドリア及びER膜は、以前に説明されたように不連続ショ糖勾配で精製された(Bozidis, P., CD.ら、Curr Protoc Cell Biol、2007.第3章:単元3 27頁)。簡潔には、MTE緩衝液(0.27M マンニトール、10mM Tris−HCl、0.1mM EDTA、pH 7.4)中のHUVEC細胞が超音波によって溶解された。溶解された細胞が、核及び細胞破片を除去するために700xgで10分間遠心分離された。ミトコンドリアは15,000xgで10分間遠心分離することによって得られ、ポストミトコンドリア上清(post mitochondrial supernatant)がER画分の精製に用いられた。ミトコンドリア沈殿はMTE緩衝液に再懸濁され、1.0M及び1.7Mのショ糖からなる不連続ショ糖勾配で層状にされ、40,000xgで22分間遠心分離することによってバンド形成された。ミトコンドリア画分が15,000xgで10分間遠心分離することによって採取され、沈殿化された。精製されたミトコンドリアがPBS中に再懸濁され、ウエスタンブロット解析に用いられた。ER画分を単離するために、上記のポストミトコンドリア上清が、1.3M、1.5M及び2.0Mのショ糖からなる不連続ショ糖勾配で層状にされ、100,000xgで70分間遠心分離することによってバンド形成された。100,000xgで45分間遠心分離することによって、上清と1.3Mのショ糖との接合面の前記ER画分が採取され、沈殿化された。前記ER膜はPBS中に再懸濁され、ウエスタンブロット解析に用いられた。
化学合成されたヌクレオチド21個のsiRNA2本鎖が、ダーマコン(Dharmacon)社(コロラド州ラファイエット)から入手された。ヒト及びマウスのSTINGに用いられたRNAオリゴヌクレオチドは、hSTING(a)、GCAUCAAGGAUCGGGUUU(配列番号3)、hSTING(b)、GGUCAUAUUACAUCGGAU(配列番号3)、mSTING、CCAACAGCGUCUACGAGA(配列番号5)である。293T細胞が、ウェル1つあたり5x104細胞個で24ウェルプレートに播種され、リポフェクタミンRNAiMAX(インビトロジェン、カリフォルニア州)を用いて10pmolのsiRNA2本鎖をトランスフェクションされた。MEFは、製造者の推奨に従ってアマクサヌクレオフェクター装置(Amaxa nucleofector apparatus)(プログラムA−023)及びアマクサMEFヌクレオフェクターキット1を用いることによってトランスフェクションされた。トランスフェクション後72時間に、細胞はさらに実験に用いられた。
293T細胞が、ディッシュ1枚あたり1x106細胞個で100mmディッシュ上に播種された。細胞が、リポフェクタミン2000を用いて総量10μgの空プラスミドか、さまざまな発現プラスミドかでトランスフェクションされた。トランスフェクション後36時間に、細胞は、タンパク質分解酵素阻害剤(ロシュ、インディアナ州)を含む、M−PER緩衝液中(ピアス、イリノイ州)か、1% ジギトニン(カルビオケム、カリフォルニア州)緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、1% ジギトニン)中かで溶解された。溶解物は、HAアフィニティーマトリクス(コバンス、ウィスコンシン州)か、FLAGアフィニティービーズ(シグマ)かと1晩インキュベーションされた。前記ビーズは、0.05% ツイーン−20を含むTBSによって3回洗浄され、免疫沈降物は、非還元試料緩衝液で5分間煮沸することによって溶出された。内在性STINGの免疫沈降のために、HUVECが1%ジギトニン溶解液で溶解された。浄化された上清は、10μgの抗STING抗体とともにインキュベーションされ後、不動化されたプロテインG(ピアス)でインキュベーションされた。前記ビーズは1% ジギトニン溶解液によって4回洗浄され、免疫沈降物がSDS試料緩衝液で5分間煮沸することによって溶出された。非変性PAGE及び免疫ブロットが以前に説明されたように実施された(Balachandran, S.ら、J Immunol, 2007. 178(4):2429−39頁)。
直鎖状のターゲッティングベクターは、129SvEv系統由来のE14.1のES細胞に電気穿孔法で導入された後、G418で選択された。ターゲッティングされたクローンがPCRによってスクリーニングされた。クローン90個から陽性クローン1個が同定された。このESクローンが、宿主としてC57BL/6Jの胚盤胞を用いて、注入によってキメラマウスの作成に供された。その結果生じるオスのキメラが、生殖細胞系列伝達(germline transmission)のためにC57BL/6Jのメスのマウスとさらに交配された。ヘテロ接合体のマウス(F1マウス)が、野生型、ヘテロ接合体及びホモ接合体の同腹子(F2)を得るために異種交配された。前記マウスの遺伝子型がPCRによって決定された。動物はマイアミ大学の医学トランスジェニック基盤施設で作成された。マウスは、食物及び水に自由に入手でき、12時間の明/暗周期で、23°Cの雰囲気温度で飼育された。動物の世話及び取扱は、IACUCの指針とおり実施された。
骨髄由来マクロファージ(BMDM)及び樹状細胞(GM−DCs)が、野生型及びノックアウトマウス由来の大腿骨及び脛骨から調製された。(マウス1匹あたりの)単細胞懸濁液が調製され、赤血球細胞が溶解された。GM−DCsについて、細胞は、10% FCS、50M 2−メルカプトエタノール、100U/mL ペニシリン、100g/mL ストレプトマイシン及びGM−CSF (20ng/mL)を補充されたDMEMで培養された。BMDMについて、細胞が、10% FBS、抗生物質及びNIH3T3細胞由来の20%条件培地を補充されたRPMI1649で培養され、培地が2日毎に置換された。8日後、細胞が実験に用いられた。
STINGの興味あるパートナーをスクリーニングするために、我々は、酵母ツーハイブリッドアプローチを用いた。ヒト細胞由来の新規のIFNで誘導されたcDNAライブラリーが調製された。このライブラリーを構築するために、テロメラーゼで不死化されたヒト線維芽細胞が、インターフェロン依存性遺伝子を誘導するためにヒトIFN−アルファ及びβそれぞれ1000単位で1晩処理された。ポリ(A)+RNAが沈殿された細胞から抽出され、高品質であることが確かめられた。確認後、cDNA合成が「BDパワースクリプト(商標)」RT(クロンテック)を用いて実施された。この手順は、結果として生じる1本鎖の部位それぞれに、直接クローニング用の個別のSfiI部位(A及びB)を含むアダプターを付けることができる。またこれは、cDNAの集団が完全長のクローンを豊富に含むことを同時に保証する。その後、前記cDNAはPCRによって増幅され、SfiIで消化され、酵母のプレイ(prey)ベクターpGADT7−RecABに連結される。連結された混合物が、E.coli株のDH10Bにトランスフォーメーションされた。増幅されていないライブラリー中の独立クローンの数が、3.2x106個であると推定され、平均サイズが1.52kbであり、インサートが0.8kbから3.0kbまでのサイズの範囲である。独立のクローン15個が単離され、DNAがPCRによってサイズを調べるために抽出された。
hSTING−C(173−379番目のアミノ酸)配列がPCRによって増幅され、バイト(bait)プラスミドpGBK−T7−hSTING−Cを作成するためにpGBK−T7(クロンテック)にクローニングされた。IFNで誘導されたライブラリーのプラスミドDNA100μgが、酵母Y187株のライブラリースケールトランスフォーメーション(library−scale transformation)を実施するために用いられた。酵母ライブラリースクリーニングが酵母の接合によって実施された。簡潔には、pGBK−T7−hSTING−Cが酵母AH109株にトランスフォーメーションされ、トリプトファンを欠く50mLの最小培地で1晩増殖された。Y187のプレトランスフォーメーションライブラリーの1mL分取量が上記のものと混合され、酵母の接合が、播種される前に1晩続けられる。高いストリンジェンシーのプレート由来の陽性コロニーが単離され、プラスミドDNAが「ガラス−ビーズ」プロトコルによって抽出される。簡潔には、酵母コロニーは、ロイシンを欠く最小培地で1晩増殖される。培養液1.5mLは遠心沈殿され、沈殿は、300μLの酵母破砕緩衝液(2% トリトンX−100、1% SDS、100mM NaCl、10mM Tris 8.0、1mM EDTA)と、酸で洗浄された等量のガラスビーズ(シグマ、カタログ番号G−8772)とともに再懸濁される。300μLのフェノール:クロロホルム(1:1、pH 8.0)が添加され、試験管が少なくとも15分間攪拌混合(vortexed)される。試料は遠心分離され、水相が新しい試験管に移され、DNAが2倍量のエタノールで沈殿された。回収された沈殿は70%エタノールで洗浄され、乾燥され、50μLのミリQ水に溶解された。2−5μLが細菌のコンピテント細胞をトランスフォーメーションするために用いられ、LB−アンピシリンプレート上に播種された。個別のコロニーが増殖され、プラスミドDNAが抽出された。抽出されたDNAが、酵母を再度トランスフォーメーションし、相互作用を再確認し、自動活性化している偽陽性を除去するために用いられる。陽性コロニーが同定のために塩基配列を決定された。
自然免疫シグナル伝達機構をさらに決定するために、発現スクリーニングシステムが供され、約5,500個のヒト完全長cDNA及び9,000個のマウス完全長cDNAが、それぞれ、IFNβのプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子(IFNβ−Luc)を有する293T細胞にトランスフェクションされた。過剰発現が、対照ベクターでは誘導されないが、IFNβ−Lucの約250倍の誘導をもたらす遺伝子5個は、IPS−1(VISA/CARDIF/MAVSとも呼ばれる。)と、CARDを含むミトコンドリアの仮想タンパク質と、RIG−I/MDA5経路を促進する役割を果たすI型IFNの既知の誘導因子とであることがわかった。しかし、以前に特徴付けられていない分子(gi:38093659/NP_938023/2610307O08RIK)が、(インターフェロン遺伝子の刺激因子の)STINGとして本明細書に言及される本方法によって単離され、該STINGは、(ヒトでは)5個の仮想TMモチーフを有し、ヒト細胞では379個のアミノ酸のタンパク質及びマウス細胞では378個のアミノ酸のタンパク質として存在する(図1A)。仮想シグナル開裂モチーフが1−35番目の部位に存在することが発見され、富ロイシン領域がアミノ酸21−139番目の間に見られた(図1A、1B)。ヒトSTING(hSTING)の仮想分子量は、STINGペプチドに対して産生されるウサギ抗血清を用いる免疫ブロット解析の後、ヒト293細胞で観察された分子量におおよそ一致する42,192Daだった。RNAi研究が、前記の観察された42kDaのバンドは実際にSTINGだったことを確かめた(図1D)。STINGは、ノーザン解析によって決定されるとき、さまざまな組織で遍在的に発現することが発見され、共焦点顕微鏡及び分画解析によって決定されるとき、細胞のER領域に主にあることが発見された(図1E、1F)。
マウス、細胞及び試薬
129SvEvとC57BL/6JのバックグラウンドのSTING欠損変異体マウスは、以前に説明されている(Ishikawa, H.及びBarber, G.N. Nature 455、674−678(2008))。MEF、骨髄由来マクロファージ及びGM−CSFで誘導された樹状細胞(GM−DCs)は、以前に説明されたように調製された(Ishikawa, H.及びBarber, G.N. Nature 455、674−678(2008))。FLT3リガンドで誘導されたDCs(FLT3−DCs)を調製するために、骨髄細胞が、10% FBS、50μM 2−メルカプトエタノール、10mM HEPES(pH7.4)及び100ng/mLのヒトFLT3リガンド(ぺプロテック)を補充したRPMI 1640培地で8日間培養された。293T細胞はATCCから入手され、10%FBSを補充したDMEM培地で維持された。VSV(インディアナ株)及びEMCVが以前に説明された(Ishikawaら、2008))。HSV−1(KOS株)及びListeria monocytogenes(血清型10403)はATCCから入手された。ゲノムDNAは以下の供給源から得られた。HSV−I、HSV−2、アデノウイルス5型(ATCC)、E.coli、ウシ胸腺(シグマ)、ポリ(dA:dT)及びポリ(LC)がアマシャムバイオサイエンスから入手された。ポリ(dG:dC)及びポリ(dA)はシグマから入手された。CpG ODN(ODN 1585)はインビトロジェンから入手された。細胞を刺激するために、ゲノムDNA、ポリデオキシヌクレオチド又はポリ(LC)が、1:1(vol/wt)の割合でリポフェクタミン2000とともに混合され、その後、最終濃度1μg/mLで細胞に添加された。
黄熱ウイルスNS4Bの配列が、鋳型として完全なYFV−17D配列をエンコードするpYFM5.2を用いてPCRによって増幅され、C末端にHAでタグ化された発現コンストラクトを作成するためにpcDNA3(インビトロジェン)プラスミドにクローニングされた。ニワトリオボアルブミン(OVA)のcDNAを含む前記発現プラスミドが、PCRで増幅されたOVAのcDNAをpCDNA3にクローニングによって構築された。HAでタグ化されたマウスSTING(mSTING−HA)、FLAGでタグ化されたΔRIG−I(1−284個のアミノ酸)及びΔMDA5(1−284個のアミノ酸)をエンコードする発現プラスミドが以前に説明された(Ishikawaら、2008))。p110−Luc(IFNβ−Luc)がT. Maniatisから得られた。pUNO−hsaIRF3(IRF3SA)及びpUNO−hsaIRF7Δ(IRF7SA)がインビトロジェンから得られた。マウスDAIを含むpCMV−SPORT6がオープンバイオシステムズから入手された。
STINGに対するウサギポリクローナル抗体が以前に説明された(Ishikawaら、2008))。その他の抗体は、カルレティキュリン(abl4234、アビーム)、シグマ1受容体([SigmalR]ab53852、アビーム)、TBK1(EP611Y、アビーム)、COX IV(ab16056、アビーム)、ウサギポリクローナルHA(ab9110、アビーム)、トランスフェリン受容体([TfR]H68.4、インビトロジェン)、マウスモノクローナルHA(シグマ)、FLAG(M2、シグマ)、IRF3(ZM3、ザイメッド)、TGN46(abl6059、アビーム)、ジアンチン(ab24586、アビーム)、EEA1(#2441、セルシグナリング)、LAMP1(NB120、ノバスバイオロジカルズ)、SEC61β(アップステート)の供給源から入手された。ELISAキットは、マウスIFN−β及びIFN−α(PBL)、マウスIL−6(R&Dシステムズ又はクアンシスバイオサイエンス)、マウスIFN−γ(R&Dシステムズ)、マウスRANTES(クアンシスバイオサイエンス)の供給源から入手された。
蛍光リアルタイムPCR解析が、LightCycler 2.0機器(ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス)と、IFNβ(Mm00439546_s1)、IFNα2(Mm00833961_s1)及びTRAPβ(Mm00481383_m1)のTaqMan遺伝子発現アッセイ(アプライドバイオシステムズ)とを用いて実施された。mRNAの相対量は、各試料の18SリボソームRNAレベルで標準化された。
24ウェルプレート上に播種された293T細胞は、総量600ngのさまざまな発現プラスミド又は対照空プラスミドとともに50ngのルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて一過的にトランスフェクションされた。内部対照として、10ngのpRL−TKが同時にトランスフェクションされた。その後、24時間後、総細胞溶解物における前記ルシフェラーゼ活性が測定された。
マウスは、筋肉内(i.m.)への電気穿孔によってOVAをエンコードするプラスミド(マウス1匹あたり100μg)を用いて免疫された。追加免疫が、第1回目の免疫後2又は4週間までに施された。
脾臓は第2回目の免疫後2週間目に抽出され、5x105個の脾臓細胞が96ウェルプレート上に播種され、その後、10μg/mLのOVAの合成ペプチド(H−2Kb、SIINFEKL、プロイムノ)で刺激された。3日後、前記細胞の培養上清が採取され、ELISA(R&Dシステムズ)によってIFN−γのタイターが解析された。細胞内IFN−γの染色のために、刺激された脾臓細胞が、FITCで標識された抗CD8抗体(BD)を用いて染色された。洗浄後、細胞は固定され、透過処理された。その後、細胞は、PEで標識された抗IFN−γ抗体(BD)を用いて染色された。フローサイトメトリー解析がFACScaliber機器(BD)で行われた。血清抗OVA抗体のタイターがELISAによって測定された。簡潔には、96ウェルプレートが1μg/mLのOVAタンパク質でコーティングされ、その後、5%脱脂乳を含むPBSでブロッキングされた。プレートは洗浄され、系列希釈された血清で室温で1時間覆われた。洗浄後、抗体は、西洋ワサビぺルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスIgG(ジャクソンイムノリサーチ)を用いて検出された。追加の洗浄後、前記プレートは、基質としてテトラメチルベンジジン(TMB、シグマ)を用いて染色された。反応が1M H2SO4で止められ、吸光度が測定された。抗体のタイターは、バックグラウンド減算後に希釈限界法の逆数として表された。
MAM、ミトコンドリア及びミクロソームが、mSTING−HAプラスミドを安定的にトランスフェクションされたSting MEFから単離された。簡潔には、細胞が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄され、1,000xgで10分間遠心分離することによって沈殿された。沈殿はショ糖均質化緩衝液(0.25M ショ糖、10mM Hepes[pH 7.4])に再懸濁され、細胞がダウンスホモジナイザーを用いることによって溶解された。溶解された細胞は500gで10分間遠心分離され、上清が採取された。その後、上清は、未精製のミトコンドリア画分(MAM及びミトコンドリア)から未精製のミクロソーム画分(ミクロソーム及び細胞質)を分離するために10,300gで10分間遠心分離され、前記未精製のミクロソーム画分(上清)は100,000gで60分間超遠心分離された。前記未精製のミトコンドリア画分(沈殿)が、氷冷されたマンニトール緩衝液A(0.25M マンニトール、5mM Hepes、0.5mM EDTA)に再懸濁され、30% パーコール(Percoll)のマンニトール緩衝液B(0.225M マンニトール、25mM Hepes、1mM EDTA)上に層状にされた。ミトコンドリア及びMAM画分は、95,000gで65分間超遠心分離することによって分離された。単離された画分の両方はマンニトール緩衝液Bで希釈され、6,300gで10分間遠心分離された。MAMの遠心分離の上清は100,000gで60分間遠心分離することによってさらに分離され、沈殿はMAM画分として用いられた一方、前記ミトコンドリアの遠心分離の沈殿はミトコンドリア画分として用いられた。前記画分全ては、マンニトール緩衝液Bに再懸濁された。
Sec5及びLAMP1の局在化のために、カバーガラス上で増殖された細胞は、80%/20% マンニトール/アセトンで−20°Cで5分間固定された。EEA1の染色のために、細胞は、4%パラホルムアルデヒドPBSで37°Cで15分間固定され、0.2% トリトン−X100で透過処理された。その他のタンパク質を染色するために、細胞は、4%ホルムアルデヒドDMEMによって37°Cで15分間固定され、0.2% トリトン−X100によって透過処理された。ミトコンドリア染色のために、生細胞が、300nMのミトトラッカーレッド(インビトロジェン)で37°Cで45分間インキュベーションされた。固定され、透過処理された細胞が0.1% BSAのPBSでプレインキュベーションされ、1次抗体でインキュベーションされた。その後細胞が、FITC、Cy3又はCy5(シグマ)を結合した2次抗体でインキュベーションされた。
化学的に合成されたヌクレオチド21個のsiRNA2本鎖が、ダーマコン社(コロラド州ラファイエット)から入手された。この研究で用いられた各siRNAオリゴヌクレオチドの配列は、マウスTRAPβのsiRNA、5’−UGAAAGAGAGGACGGGUUAUU−3’(配列番号6)、マウスSec5のsiRNA、5’−AGAAGUAUUAGGUCGGAAA−3’(配列番号7)、5’−UCAACGUACUUCAGCGAUU−3’(配列番号8)、5’−CAGCAGAGAUUACACGUCA−3’(配列番号10)、5’−GUGAGUGGCUUGCGCAGUA−3’(配列番号11)である。MEFは、製造者の推奨に従ってアマクサヌクレオフェクター装置(プログラムA−023)及びアマクサMEFヌクレオフェクターキット1を用いることによってトランスフェクションされた。トランスフェクション後72時間に、細胞はさらに実験に用いられた。
スチューデントt検定がデータを解析するために用いられた。
Claims (1)
- 配列番号1又は2に列挙される配列か、それらの活性型断片又はバリアントかを含む、免疫応答を変調するタンパク質又はペプチドをエンコードすることを特徴とする、単離された核酸配列。
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