KR101464992B1

KR101464992B1 - Ｔｍｅｍ１７３ 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101464992B1
Application number: KR1020120048896A
Authority: KR
Inventors: 장용석; 김주; 최충현; 박인선; 유강열; 정창호
Original assignee: 재단법인 전주생물소재연구소
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2014-11-26
Also published as: KR20130125417A

Abstract

본 발명은 Tmem173 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 Tmem173 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 효과적인 골 관련 질환(골다공증 등)의 예방 및 치료용 소재로서 활용이 가능하며, 유용 생리활성 물질의 조절기작 연구 등 노인성 질환 발병요인 제어 기술 개발의 초석으로 기능성 바이오소재 탐색 및 선별에 활용하여 고부가가치를 지닌 기능성 식품소재 발굴 및 다양한 제품 개발에 적용 가능할 것이다.

Description

Ｔｍｅｍ１７３ 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating bone-related disease comprising Tmem173 protein as effective component}

본 발명은 Tmem173 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날 까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다. 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다. 골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다.

조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다. 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘을 혈류로 방출시켜 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다. 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸린다. 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데 특히 골다공증과 암세포의 골전이(bone metastasis)로 인한 뼈의 손상과 관련된 질환이 대표적이다. 특히, 노인들의 골질환이나, 여성들의 폐경기로 인해 발생하는 골질환은 조골세포에 의한 골형성 보다는 골을 흡수하는 파골세포 활성 증가가 주된 원인이다.

골다공증(osteoporosis)은 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조의 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하는 질환으로 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 수 있는 상태로 진행된다. 골다공증은 폐경기의 시작과 동시에 급속한 골손실(연간 2~3%)이 나타나며 척추의 압박 및 손목뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 폐경기 이후의 골다공증(Postmenopausal osteoporosis), 70세 이상의 남녀 노인에게 서서히 발생하며(연간 0.5~1%) 골반골(hip bone)과 척추뼈의 점진적인 골 손실을 가져오는 노년기의 골다공증(Senile osteoporosis), 그리고 연령에 상관없이 질병(내분비질환, 위장관질환, 악성종양)이나 약물(부신피질호르몬, 항암화학요법, 갑상선호르몬, 항경련제, 항응고제, 메토트렉사트(methotrexate), 사이클로스포린(cyclosporine), GnRH 등), 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 2차 골다공증(Secondary osteoporosis)으로 분류된다.

유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 또는 다발성 골수종(multiple myeloma) 환자들에서 거의 항상 골 전이가 일어나고, 이들 암환자들이 얼마나 오랫동안 살 수 있는지는 골 전이 여부에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 유방암 환자나 전립선암 환자의 사망률이 높아지는 이유는 암세포가 선택적으로 뼈로 전이되기 때문이다. 유방암에서 관찰되는 골 전이는 대부분 뼈를 파괴하는 골 용해성 골 전이(osteolytic metastasis)로서 유방암 세포가 뼈에 직접적인 영향을 미치는 것이 아니라 파골세포를 자극함으로써 일어나는 것으로 알려져 있다. 반면, 전립선암에서 관찰되는 골전이는 골조성 골전이(osteoblastic metastasis)이다. 골조성 골 전이 또한 골 용해와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 뼈로 전이해 온 암세포들은 뼈 주위의 미세환경에서 증식하여 파골세포나 조골세포의 활성을 자극함으로써 골용해성 골전이로 진행될지 골조성 골전이로 진행될지를 결정한다. 유방암 환자의 약 80%가 암세포의 골 전이가 발생되며, 전이된 유방암 세포는 파골세포를 활성화시킨다. 활성화된 파골세포는 뼈 주위의 미세 환경의 균형을 파괴시켜 골용해(osteolysis)를 야기시키고 이러한 현상으로 인해 병적 골절이 자주 발생할 뿐만 아니라, 백혈구 감소증(leukoerythroblastic anaemia), 뼈의 기형, 고칼슘혈증(hypercalcemia), 통증(pain), 신경압박 증후군(nervecompression syndromes) 등의 뼈와 관련된 질환이 발생된다.

이러한 골 관련 질환의 예방 및 치료를 위해 시판되고 있는 약을 복용한 경우, 뼈나 관절의 무력화 또는 근골격의 통증이 발생하는 사례가 해마다 증가되고 있다. 따라서 부작용이 적으면서 보다 효과적인 골 관련 질환의 예방 및 치료제의 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

한국공개특허 제2009-0107056호에서는 '파골세포의 분화를 통해 골량을 조절하는 ＣＤ200 및 이의 수용체 ＣＤ200Ｒ'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0909867호에서는 '골대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 Tmem173 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 새로운 파골세포의 활성조절 지표로서 면역계의 항원인식에 중요한 MHC class II와 연계되어 최근 선천성면역반응(innate immune response)에도 관여하며 면역세포의 세포사 유도인자로 알려진 Tmem173가 파골세포에서 조절기능을 수행하는지 여부와 그 연관성을 규명하고자 하였다. 이를 통해 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)로 유도된 파골세포 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)이 Tmem173에 의해 효과적으로 저해됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Tmem173 (Transmembrane protein 173) 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명을 통하여 골 관련 질환의 예방, 진단 및 치료제 개발에 효과적인 지표가 될 수 있는 새로운 단백질을 발굴할 수 있고, 이를 통해 기존의 알려진 타겟에 한정되어 진행되어 온 관련 기초 및 응용 연구를 벗어나 새로운 치료제 및 진단법 개발 등의 연구에 활용한다면 이 분야의 세계와의 경쟁에서 우위를 확보할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 Tmem173 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 효과적인 골 관련 질환(골다공증 등)의 예방 및 치료용 소재로서 활용이 가능하며, 유용 생리활성 물질의 조절기작 연구 등 노인성 질환 발병요인 제어 기술 개발의 초석으로 기능성 바이오소재 탐색 및 선별에 활용하여 고부가가치를 지닌 기능성 식품소재 발굴 및 다양한 제품 개발에 적용 가능할 것이다.

도 1은 Tmem173 유전자 확보 과정을 나타낸다. (A) Tmem173 유전자 PCR, (B) Tmem173 cloning 확인
도 2는 Tmem173 과발현 세포주 제작을 나타낸다. Tmem173 과발현 세포 주에서 Tmem173 유전자(A) 및 단백질(B, C) 과발현 확인. (A) 레인 1: RAW264.7 세포, 레인 2: 빈 벡터 세포, 레인 3: Tmem173 과발현 RAW264.7 세포, (B) SDS-PAGE 및 (C) 웨스턴 블럿, 레인 1: RAW264.7 세포 총 단백질 분해물, 레인 2: Tmem173 과발현 RAW264.7 세포 총 단백질 분해물, M: 사이즈 마커
도 3은 Tmem173 과발현에 의한 TRAP mRNA 발현 변화를 나타낸다.
도 4는 Tmem173 과발현에 의한 TRAP 활성 저해를 나타낸다.
도 5는 Tmem173 과발현에 의한 TRAP 염색 저해를 나타낸다.
도 6은 Tmem173에 의한 NO(Nitric Oxide) 생성 저해능 실험을 나타낸다. (A) RAW264.7 세포, (B) Tmem173 과발현 세포, (C) NO 생성량 측정
도 7은 Tmem173에 의한 염증성 시토카인(inflammatory cytokine)의 mRNA 발현 변화를 나타낸다. (A) RAW264.7 세포, (B) Tmem173 과발현 세포

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Tmem173 (Transmembrane protein 173) 단백질을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 골 관련 질환은 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)에 의해 발생하는 조골속도 및 파골속도의 균형이 깨질 경우 뼈에서 야기될 수 있는 질환을 일컫는 것으로, 바람직하게는 파골세포 활성 증가가 주된 원인일 수 있다. 상기 파골세포는 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)와 풍부한 칼시토닌(calcitonin, CT) 수용체를 가지는 특징이 있으며, 실제적으로 뼈의 흡수작용(bone resorption)을 할 때는 산 생성이 활발하고 액틴 링(actin ring)을 형성하여 골기질을 흡수하는 특징이 있다.

본 발명의 Tmem173 단백질은 TRAP 효소의 활성증가로 인한 파골세포의 분화 및 활성을 억제함으로써, 골 관련 질환의 예방 또는 치료를 수행할 수 있다.

발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에서, 상기 Tmem173 단백질은 마우스(Mus musculus) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 인간(Homo sapiens) 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열의 상동성은 69%이고, 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 상동성은 76%이다.

본 발명의 Tmem173은 MPYS, MITA 또는 STING로 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 Tmem173 단백질의 범위는 마우스(Mus musculus) 또는 인간(Homo sapiens)으로부터 분리된 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 골 관련 질환의 예방 또는 치료 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 Tmem173 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 Tmem173 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에서, 상기 골 관련 질환은 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast) 및 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)에 의해 발생하는 조골속도 및 파골속도의 균형이 깨질 경우 뼈에서 야기될 수 있는 질환을 포함하며, 바람직하게는 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증, 고관절증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 척추관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병성 관절염, 류마티스 관절염, 신경병관절병증, 급성 류마티스 열, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 골다공증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

뼈는 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴되는 과정이 조화롭게 이루어졌을 때 건강하게 유지된다. 하지만 뼈의 형성과 파괴의 평형이 깨지게 되면 여러 가지 뼈대사 질환에 걸리게 된다. 과도한 뼈의 파괴는 골밀도감소를 유발하여 골다공증과 같은 질환의 원인이 되고, 반대로 뼈의 파괴가 정상적으로 이루어지지 않게 되면 골밀도가 증가하고 결과적으로 골화석증과 같은 질병에 걸리게 된다.

최근 분자생물학 및 면역학의 발달에 힘입어 파골세포의 분화에 필수적인 인자들(RANKL, OPG 등)이 보고되고 있으며, 이를 기반으로 현재 골흡수와 관련된 파골세포에 대한 연구는 주로 RANK/RANKL/OPG 네트웨크를 활용하여 이루어지고 있다. OPG는 RANKL에 결합하는 유도 수용체(decoy receptor)로서 RANKL 기작을 차단하는 효과를 가지며 따라서 성숙한 파골세포로의 분화를 저해한다. 또한 파골세포의 활동성 평가 및 골흡수 지표로는 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)와 Cathepsin K가 주로 사용되고 있는데, 이와 같은 RANK/RANKL/TRAP 시스템은 파골세포 조절기전 연구 및 뼈 질환 예방 및 치료를 위한 기능성 물질을 발굴하는 데에 기본적인 패러다임으로 활용되고 있다. 현재 개발된 골흡수 저해제들은 PTH 저해제(PTHrP neutralize antibody), RANKL antagonist(OPG & RANK-Fc), Cathepsin K 저해제, Bisphosphate 제제 등으로 파괴된 뼈를 복원하기보다는 뼈의 파괴를 예방하는 것이 효율적이므로 파골세포의 활성을 저해/조절하는 접근방법으로 골다공증을 치료하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

따라서 본 발명은 Tmem173을 매개로 하여 파골세포의 분화 또는 활성을 저해할 수 있으므로, 골다공증 등과 같은 골 관련 질환의 예방 및 치료용으로 이용될 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 약학 조성물에서, 상기 Tmem173 단백질은 파골세포 분화 또는 활성을 저해할 수 있고, 바람직하게는 파골세포의 TRAP 효소 활성을 저해시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하여 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. Tmem173 과발현 세포 주 확보

파골세포의 분화 및 활성에 대한 Tmem173의 기능을 알아보기 위하여 파골 전구세포주인 RAW264.7 세포에 Tmem173을 과발현하고자 하였다.

① Tmem173 유전자 확보

RAW264.7 세포로부터 TRI 시약(TRI reagent)을 사용하여 총 RNA를 추출한 다음 cDNA를 합성하고 이를 기반으로 RT-PCR을 수행하여 Tmem173 유전자를 확보하였다.

② Tmem173 과발현 세포 주 제작

확보된 Tmem173 유전자를 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+)에 NdeI과 XbaI으로 클로닝한 후, 이 유전자 구조물을 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)을 사용하여 RAW264.7 세포에 형질전환하고 G418 (500ug/mL)을 이용하여 선별하였다. Tmem173 유전자의 형질전환을 확인하기 위하여 형질전환 세포 주로부터 플라스미드를 추출한 다음, Tmem173 유전자의 프라이머로 PCR을 진행하였다. 또 형질전환 세포 주 내에서 Tmem173 단백질이 정상적으로 발현됨을 확인하고자 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 먼저, 단백질을 추출하기 위하여 단백질 분해(lysis) 버퍼 (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2mM Na₃VO₄, 10mM NaF, 10mM 소듐 파이로포스페이트, 0.4mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 0.33% CHAPS, 100X 프로테아제 & 포스파타아제 저해 칵테일)를 각 웰에 200㎕씩 첨가하여 4℃에서 2hr 동안 반응시킨 후, 12,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리 하였다. 얻어진 단백질은 SDS-PAGE 젤에 동량 로딩하여 분리한 후, 나이트로셀룰로스 막(Whatman)에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막은 5% 스킴 밀크가 섞인 PBS로 1시간 30분 동안 블럭킹한 후, 래트 항-MPYS 폴리세라를 1시간 30분 동안 반응시킨 후, TBST로 3회 세척하고 다시 래트-항 IgG AP-접합된 2차 항체를 1시간 30분 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척 후 BCIP/NBT 용액을 이용하여 암실에서 발색시킨 뒤 막에 나타나는 밴드로 Tmem173 단백질의 발현을 확인하였다.

2. Tmem173에 의한 골흡수(골용해) 지표 변화 분석

Tmem173가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포 주에 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)를 처리하여 파골세포화(osteoclstogenesis)를 유도한 다음, 골흡수(골용해) 지표인 TRAP mRNA 발현, TRAP 활성, TRAP 염색을 분석하였다.

① TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) mRNA 발현 분석 실험

Tmem173가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포 주에서 RANKL에 의한 TRAP mRNA의 발현 변화를 분석하였다. RAW264.7 세포와 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2x10⁵(세포/웰)씩 분주하고 2시간 경과 후, sRANKL (50ng/mL)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하여 파골세포화(osteoclstogenesis)를 유도하였다. 골흡수(골용해) 지표인 TRAP의 mRNA 발현 정도를 분석하기 위하여 TRI 시약을 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, cDNA를 합성하였고, 특이 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 TRAP mRNA 발현 변화를 확인하였다. β-액틴(house keeping gene)은 내부 대조구로 사용하였다.

② TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 활성 실험

Tmem173가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포 주에서 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)에 의한 TRAP 활성을 분석하였다. RAW264.7 세포와 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포를 6웰 플레이트에 2x10⁵(세포/웰)씩 분주하고 2시간 경과 후, sRANKL (50ng/mL)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건에서 96시간 동안 배양하여 파골세포화(osteoclstogenesis)를 유도하였다. 골흡수(골용해) 지표인 TRAP 활성을 분석하기 위하여 96시간 경과 후 배양액을 제거하고 분해 버퍼(0.1% Triton X-100, 50mM Tris, pH7.4)를 500ul/웰로 처리하여 세포를 분해한 다음, 다시 4분간 음파처리(sonication)를 수행하였다. 10분 동안 원심분리 후, 상층액을 취해 96웰 플레이트에서 125mM 소듐 아세테이트(pH5.2), pNPP(p-nitrophenylphosphate) 및 타르트레이트 용액(Tartrate solution)과 37℃에서 30분간 반응한 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 또 BCA 키트를 이용하여 취한 상층액의 단백질 농도를 정량하였고, TRAP 활성은 흡광도(405nm)/단백질 농도(mg)로 계산하였다.

③ TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 실험

Tmem173가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포 주에서 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)를 처리한 후, TRAP 염색 실험을 수행하였다. RAW264.7 세포와 확보된 Tmem173 과발현 RAW264.7 세포를 3x10³(세포/웰)이 되도록 96웰 플레이트에 분주하고 2시간 후, sRANKL (100ng/mL)를 처리한 다음 96시간 경과 후 애시드 포스페이트 키트(acid phosphate kit, sigma-aldrich)를 이용하여 TRAP 염색을 수행하였다.

3. Tmem173에 의한 파골세포의 분화 및 활성 조절기작 분석

Tmem173에 의한 파골세포의 분화 및 활성 저해 메카니즘을 이해하기 위해 파골세포의 분화 및 활성 조절에 관련된 인자들의 발현 변화를 확인하였다.

① NO(Nitric Oxide) 생성 저해능 실험

RAW264.7 세포와 Tmem173(MPYS) 과발현 세포를 6웰 플레이트에 8x10⁵(세포/웰)씩 분주하여 밤새 배양하고 LPS (1ug/ml)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 2시간 배양하였다. 2시간 경과 후, TRI 시약을 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, cDNA를 합성하였고 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX-2)와 유도성 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 각각의 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 mRNA 발현을 확인하였다. β-액틴(house keeping gene)은 내부 대조구로 사용하였다. NO 생성 농도는 RAW264.7 세포와 Tmem173 과발현 세포를 24웰 플레이트에 5x10⁵(세포/웰)씩 분주하고 2시간 경과 후, LPS (1ug/mL)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 경과 후, 배양액을 100ul씩 취하여 Griess Reagent (0.1% N-1-나프틸에틸렌디아민, 1% 설파닐아미드, 5% 인산)과 1:1로 섞은 다음 상온에서 30분간 반응 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO(nitric oxid) 양은 아질산나트륨(sodium nitrite)을 표준으로 비교하였다.

② 염증성 시토카인(Pro-inflammatory cytokine) 분석 실험

RAW264.7 세포와 Tmem173 과발현 세포를 6웰 플레이트에 8x10⁵(세포/웰)씩 분주하여 밤새 배양하고 LPS (1ug/mL)를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 2시간 배양하였다. 2시간 경과 후, TRI 시약을 사용하여 총 RNA를 추출한 다음, cDNA를 합성하였고 IL-6와 IL-1β 각각의 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 mRNA 발현을 확인하였다. β-액틴(house keeping gene)은 내부 대조구로 사용하였다.

실시예 1. Tmem173 유전자 확보 및 Tmem173 과발현 세포주 제작

새로운 골대사 관련 바이오마커를 발굴하고, 이를 이용한 기능성 바이오 소재 탐색 및 효능 분석을 포함한 다양한 골대사 연구에 이용하고자 Tmem173을 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1(+)에 클로닝한 후, 파골 전구세포주인 RAW264.7 세포에 형질전환하여 Tmem173 과발현 세포주를 제작하였다(도 1). PCR과 웨스턴 블럿 분석을 통하여 정상적인 Tmem173 유전자의 형질전환 및 단백질 발현을 확인하였다(도 2).

실시예 2. Tmem173에 의한 골흡수(골용해) 지표 변화 분석 결과

Tmem173이 골흡수(골용해)에 미치는 영향을 확인하고자, Tmem173 과발현 세포주에 RANKL(receptor activator of NFκB ligand)를 처리하여 파골세포화(osteoclstogenesis)를 유도한 다음, 골흡수(골용해)의 대표적인 분화 마커인 TRAP의 mRNA 발현, TRAP 활성 및 TRAP 염색 실험을 수행하였다(도 3, 4 및 5). 그 결과, TRAP mRNA의 발현은 대조군보다 현저하게 감소하였고(도 3), TRAP 활성은 RANKL 미처리군보다 오히려 감소하였으며(도 4), 또한 TRAP 염색 결과도 대조군과 다르게 거의 염색되지 않았다(도 5). 이를 통해, Tmem173은 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 정상적인 분화 및 활성을 저해한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. Tmem173에 의한 파골세포의 분화 및 활성 조절기작 분석 결과

염증 유도 물질들이 파골세포의 분화와 골흡수(골용해)를 유도하는 것으로 알려져 있어 대표적인 염증 유도 물질인 NO(Nitric Oxide)와 IL-1β 및 IL-6 등이 Tmem173에 의해 어떤 영향을 받는지 확인하였다(도 6 및 도 7). 먼저 NO 생성 저해능 실험을 수행한 결과, Tmem173 과발현 세포주에서 LPS로 유도한 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 NO를 생성을 유도하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)와 염증 매개인자인 PGE₂(prostagland E₂)를 유도하는 COX-2(cyclooxygenase)의 mRNA 발현을 확인한 결과, 대조군인 RAW264.7 세포에서보다 Tmem173 과발현 세포에서 iNOS와 COX-2 각각의 초기 mRNA 발현 시간이 늦어짐을 확인할 수 있었다(도 6). 또한 대표적인 염증 관련 시토카인인 IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현을 확인한 결과, Tmem173 과발현 세포에서 IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현 시기가 RAW264.7 세포에서보다 지연되거나 발현 정도가 약화됨이 확인되었다(도 7). NO는 파골세포 분화 과정 중 꼭 필요한 파골 전구세포들끼리의 세포융합을 유도하여, 다핵형 파골세포 형성을 유도하는 것으로 알려져 있고, IL-1β와 IL-6는 각각의 리셉터 블록킹 실험을 통해 파골세포의 분화 및 활성에 직간접적으로 관여 한다고 알려져 있다. Tmem173은 이들의 발현 시기나 발현량에 영향을 미치는 것이 실험을 통해 확인하였다. 이를 통해 Tmem173이 골대사 관련 새로운 바이오마커로서, 그 기능을 할 수 있음이 확인되었고, 나아가 기능성 바이오 소재 스크린 및 효능 분석 등 다양한 연구에 이용될 수 있음을 확인하였다.

<110> JEONJU BIOMATERIALS INSTITUTE <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating bone-related disease comprising Tmem173 protein as effective component <130> PN12099 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 378 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Pro Tyr Ser Asn Leu His Pro Ala Ile Pro Arg Pro Arg Gly His 1 5 10 15 Arg Ser Lys Tyr Val Ala Leu Ile Phe Leu Val Ala Ser Leu Met Ile 20 25 30 Leu Trp Val Ala Lys Asp Pro Pro Asn His Thr Leu Lys Tyr Leu Ala 35 40 45 Leu His Leu Ala Ser His Glu Leu Gly Leu Leu Leu Lys Asn Leu Cys 50 55 60 Cys Leu Ala Glu Glu Leu Cys His Val Gln Ser Arg Tyr Gln Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Trp Lys Ala Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Ile His Cys Met 85 90 95 Ala Met Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Phe Tyr Phe Leu Gln Asn Thr Ala 100 105 110 Asp Ile Tyr Leu Ser Trp Met Phe Gly Leu Leu Val Leu Tyr Lys Ser 115 120 125 Leu Ser Met Leu Leu Gly Leu Gln Ser Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser 130 135 140 Ala Val Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp 145 150 155 160 Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala 165 170 175 Arg Ile Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala 180 185 190 Gly Ser Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro 195 200 205 Asp Asn Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu 210 215 220 Pro Gln Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser 225 230 235 240 Asn Ser Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys 245 250 255 Ile Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln 260 265 270 Asp Ala Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys 275 280 285 Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser 290 295 300 Arg Asn Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn 305 310 315 320 Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu 325 330 335 Lys Glu Glu Val Thr Met Asn Ala Pro Met Thr Ser Val Ala Pro Pro 340 345 350 Pro Ser Val Leu Ser Gln Glu Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Met Asp 355 360 365 Gln Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Leu Ile 370 375 <210> 2 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 20 25 30 Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 35 40 45 Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 50 55 60 Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 85 90 95 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 100 105 110 Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 130 135 140 Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 145 150 155 160 Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 165 170 175 Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 180 185 190 Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 195 200 205 Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 210 215 220 Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 225 230 235 240 Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 245 250 255 Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 260 265 270 Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 275 280 285 Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 290 295 300 Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 325 330 335 Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 340 345 350 Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 355 360 365 Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 370 375

Claims

Tmem173 (Transmembrane protein 173) 단백질을 유효성분으로 함유하는, 고관절증, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 신경병관절병증, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Tmem173 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 Tmem173 단백질은 파골세포 분화 또는 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.