JP2015167503A

JP2015167503A - フェルラ酸を製造する方法

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Publication number: JP2015167503A
Application number: JP2014043855A
Authority: JP
Inventors: 理紗浜中; Risa Hamanaka; 哲河津; Satoru Kawazu; 池水　昭一; Shoichi Ikemizu; 昭一池水
Original assignee: Oji Holdings Corp
Current assignee: Oji Holdings Corp
Priority date: 2014-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2015-09-28
Anticipated expiration: 2034-03-06
Also published as: JP6343967B2

Abstract

【課題】リグノセルロース系バイオマス原料の酵素糖化工程を含むプロセスからの廃棄物を、有用物質を生産のための原料として利用する方法を提供する。木本植物からフェルラ酸を得るための方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース系原料からの、酵素により糖化処理する工程を経た処理懸濁液を固液分離し、得られた固形分からフェルラ酸を分離する。処理懸濁液は、好ましくは酵素糖化処理の前に前処理工程を経たものであり、より好ましくは、前処理は化学的処理である。【選択図】図１

Description

本発明は、リグノセルロース系のバイオマス原料から、フェルラ酸を製造する方法に関する。

リグノセルロース原料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりガソリンの代替燃料となるアルコールや、コハク酸や乳酸などの化成品原料を製造することができることから、循環型社会の形成に有益な技術である。植物系バイオマスに含まれる多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法として酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法がある。酵素糖化法を効率よく行うための様々な技術が開発されてきている。例えば特許文献１は、微生物による発酵処理などの下流の工程に影響を与えず、簡易な方法で酵素が吸着した残渣から酵素を効率的に回収する方法を提案する。

代替燃料としてのアルコール生産を目的とした場合等においては、極めて低コストで酵素糖化処理が実施できることも重要であるが、目的物質を生産した後の廃棄物から有価物が生産できれば、プロセス全体の経済性向上に寄与できる。例えば特許文献２は、セルロース系バイオマス原料に対して水酸化カルシウムによるアルカリ処理を行った後、固形分は中和して酵素糖化処理工程に供することを提案する。その一方で、固形分から分離した液分に対して、疎水性樹脂、又は陰イオン交換樹脂による生成を行うことにより、フェルラ酸等を回収することを提案する。また、特許文献３は、木本植物の樹皮を糖化処理したものについて、糖を含む液分と固形分残渣とを分離する固液分離処理を行い、残渣から靭皮繊維を得ることを提案する。さらに特許文献４は、粗破砕および又は磨砕処理を行ったリグノセルロースを多糖分解酵素により、糖を除去する第一糖化工程から得られる残渣に、磨砕処理を行った後、多糖分解酵素により糖を除去する第二糖化工程によって得られることを特徴とするリグニンの製造方法を提案する。

他方、フェルラ酸（3-methoxy-4-hydroxycinnamic acid）は、リグニンの前駆体であり、草本植物（米糠など）に多く含まれていることが知られている。フェルラ酸にはラジカル消去作用と活性酸素消去作用があり、食品の酸化防止剤として用いられている。また、天然由来の紫外線吸収剤として化粧品用途にも利用されている。フェルラ酸については、最近では高血圧改善作用、持久力向上や抗疲労作用、エタノール性肝炎の治癒作用、アルツハイマー病の患者における症状改善作用などが報告されている。

特開２０１３−１８８２０２号公報特開２０１３−２２００６７号公報特開２０１１−４７０８３号公報特開２０１２−１６２８５号公報

本発明の課題は、リグノセルロース系バイオマス原料の酵素糖化工程を含むプロセスからの廃棄物を、有用物質の生産のための原料として利用する方法を提供することにある。
また、草本植物に比較して量的には少ないが、フェルラ酸は木本植物にも含まれており、木本植物かからフェルラ酸を得るための実用的な方法があれば、原料の確保が容易となるメリットがある。

本発明者らは、バイオエタノール生産において副生成する発酵残渣の有効利用について検討してきた。そして、ヘミセルロースを比較的多く含む前処理原料であれば、糖化発酵残渣にもリグニン由来の物質が多く含まれているのではないかと考えた。そこで前処理したリグノセルロース系原料を併行糖化発酵に供して得られた処理懸濁液を固液分離し、固形分（残渣）について詳細に検討した結果、残渣からは予想外にも多量のフェルラ酸が得られることを見出し、本発明を完成した。本発明は以下を提供する。

［１］リグノセルロース系原料からの、酵素により糖化処理する工程を経た処理懸濁液を固液分離し、得られた固形分からフェルラ酸を分離する工程を含む、フェルラ酸を製造する方法。
［２］前記固形分が、リグニンを含有することを特徴とする、［１］に記載のフェルラ酸の製造方法。
［３］処理懸濁液が、酵素糖化処理の前に前処理工程を経たものである、［１］又は［２］に記載のフェルラ酸の製造方法。

［４］前処理が、化学的処理である、［３］に記載のフェルラ酸の製造方法。
［５］処理懸濁液が、酵素糖化処理と併行して又は酵素糖化処理の後に発酵処理したものである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のフェルラ酸の製造方法。
［６］リグノセルロース系原料が、広葉樹から得られたものである、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のフェルラ酸の製造方法。

本発明により、リグノセルロース系原料の糖化処理工程を経るプロセスから、フェルラ酸を効率的に得ることができる。

図１は、本発明によるフェルラ酸の製造方法の一態様を示した図である。

Ｉ：一軸粉砕装置
ＣＯ：加熱粉砕装置
Ｒ：リファイナー
ＢＲ：併行糖化発酵槽
Ｓ：固液分離装置

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

＜リグノセルロース系原料＞
本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、次のものが挙げられる。木質系：製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等。草本系：ケナフ、稲藁、麦わら、コーンコブ、バガス等の農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えば、ＥＦＢ：ＥｍｐｔｙＦｒｕｉｔＢｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等。特にこれらに限定されない。また、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥等、食品廃棄物、等を原料として利用することができるが、特にこれらに限定されない。これらの原料は、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、原料は、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。

前記木質系のリグノセルロース系原料としては、特に限定するものではないが、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できる。ユーカリ属植物、アカシア属植物、ヤナギ属植物は、原料として大量に採取し易いためである。特に、ユーカリ属植物としては、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓｐｅｌｌｉｔａ、アカシア属としては、Ａｃａｃｉａｍａｎｇｉｕｍ、Ａｃａｃｉａａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓ、アカシアハイブリッド（ＡｃａｃｉａｍａｎｇｉｕｍとＡｃａｃｉａａｕｒｉｃｕｌｉｆｏｒｉｍｉｓの交雑種）、ヤナギ属植物としては、Ｓａｌｉｘｓｃｈｗｅｒｉｎｉｉを用いるのが好ましい。
木本性植物由来のリグノセルロース系原料の中では、林地残材（樹皮、枝葉を含む）、樹皮を用いるのが好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。
他の観点からの本発明に用いられる木質系のリグノセルロース系原料好適な例として、ユーカリ、オーク、アカシア、ビーチ、タンオーク、オルダー等の広葉樹材が挙げられる。使用する広葉樹材に多少の針葉樹材を含まれていても構わない。

＜前処理＞
本発明では、前記リグノセルロース原料に、酵素糖化のための前処理を施すことができる。本発明に適用される前処理は、後述する糖化処理を経た処理懸濁液を固液分離して得られる固形分が十分な量のリグニンまたはフェルラ酸を含有するように行うことが好ましい。強い条件で前処理をすると、リグニン等が固形分には残らないと推測されるからである。このような条件を満たす前処理であれば、フェルラ酸、リグニン等を本発明に適用し得る。

（機械的処理）
本発明では、前記リグノセルロース原料に、酵素糖化のための前処理として、機械的処理を施すことができる。機械的処理としては、破砕、裁断、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の化学的処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー等を用いることができる。

前記機械的処理の前工程又は後工程として、異物（石、ゴミ、金属、プラステック等のリグノセルロース以外の異物）を除去するための洗浄などによる異物除去工程を導入することもできる。
原料を洗浄する方法としては、例えば、原料に水を噴射して原料に混合されている異物を除く方法、あるいは、原料を水中に浸漬し異物を沈降させて取り除く方法等が挙げられる。また、メタルトラップ等の装置を用いて、異物を原料から分離する方法が挙げられる。
原料に異物が含まれていると、リファイナーのディスク（プレート）等の機械的処理で用いる装置の部品を破損させる可能性があるし、配管が詰まる等の製造工程内でトラブルを起こす等の問題が発生するため、異物除去工程を導入することが望ましい。

（化学的処理）
リグノセルロース原料は、化学的処理を施してもよい。化学的処理の例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから選ばれる１種以上のアルカリ薬品を含有する溶液に浸漬することである。化学処理の他の例は、亜硫酸ナトリウムと前記アルカリ薬品の中から選ばれる１種以上のアルカリ薬品を含有する溶液に浸漬することである。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。
化学的処理は、前記機械的処理と組み合わせて、それらの前処理の後の処理として行うことが好適である。

化学的処理で使用する薬品の添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面から、リグノセルロース系原料の絶乾１００質量部に対して７０質量部以下であることが望ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、処理時間２０〜９０分、処理温度８０〜２００℃が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は７０分以下、処理温度は１８０℃以下であることが好ましい。

化学処理として、リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して１０〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加することもできる。リグノセルロースに亜硫酸ナトリウムを前記の添加量で単独で添加して加熱処理すると、加水分解中に酢酸等の有機酸が生成するためｐＨの低下が起こり加水分解液が酸性となる。加水分解液が酸性の条件下で加水分解を継続すると加水分解で生成されたキシロースがフルフラールに変換するという問題が発生する。フルフラールは、エタノール発酵の阻害物質となるため可能な限り生成させないことが望ましい。また、発酵基質であるキシロースの収率が低下するため結果としてエタノール生産効率が低下する。リグノセルロース原料に前記の添加量で亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤としてアルカリを添加して加熱処理することにより、加水分解中のｐＨが中性〜弱アルカリ性に維持されるため、フルフラールの生成及びキシロースの収率低下を抑制することができる。また、加熱処理後（加水分解後）のリグノセルロースを含む水溶液のｐＨが４．０〜７．０（中性〜弱アルカリ性）となるため、加水分解処理後の廃液あるいは加水分解物を中和するための薬品の使用量を低減できるというメリットがある。

前記ｐＨ調整剤として用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられるが、これらの薬品に特に限定されない。

前記、リグノセルロース原料（乾燥重量）に対して１０〜７０質量％の亜硫酸ナトリウム及びｐＨ調整剤として０．１〜５質量％のアルカリを添加して加熱処理を行う場合の加熱処理温度は、８０〜２００℃が好ましく、１２０〜１８０℃がさらに好ましい。また、加熱処理時間は、１０〜３００分で行うことができるが、３０〜１２０分が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理温度は、１８０℃以下、処理時間は１２０分以下であることが好ましい。

（磨砕処理）
本発明では、前記化学処理により得られたリグノセルロース原料をレファイナーのディスク（プレート）のクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲で磨砕することが好ましく、０．１〜１．０ｍｍの範囲がさらに好ましい。使用するレファイナーとしては、シングルディスクレファイナー、ダブルディスクレファイナー等を使用することができ相対するディスクのクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲に設定できるレファイナーであれば特に制限なく使用することができる。ディスクのクリアランスが２．０ｍｍを超えると糖化又は併行糖化発酵で得られる糖収率が添加するため好ましくない。一方、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーで磨砕処理した後の加水分解物（固形分）の収率が低下するため好ましくない。また、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーの運転に要する電気消費量が増大するため好ましくない。

レファイナーのディスク（プレート）の材質、ディスクの型、ディスク面の刃の型、ディスク面に対する刃の方向等のディスクの形状については効果が得られる材質、形状であれば、特に制限なく使用することができる。

前記の磨砕処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶液と固形分に固液分離し、固形分を糖化又は併行糖化発酵の原料として用いる。固液分離する方法としては、例えば、スクリュープレス等を用いて水溶液と固形分に分離することができ、水溶液と固形分に分離することができる装置であれば制限なく使用することができる。

（殺菌処理）
前記の固形分離後の原料を用いて糖化又は併行糖化発酵を行う前には、殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化及び／又は糖化発酵工程に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで、好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。

場合により前記前処理が施されたリグノセルロース原料が、糖化工程又は併行糖化発酵工程へ供給される。以下では、前処理が施されたリグノセルロース原料を用いる態様を例に本発明を説明することがあるが、本発明はその実施態様によって限定されるものではない。

＜糖化工程＞
本発明においては、場合により前処理が施されたリグノセルロース系原料が適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、酵素糖化工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ）により糖化（セルロース→グルコース、ヘミセルロース→グルコース、キシロース）される。酵素処理は、原料を部分分解することにより、リグニン成分であるフェルラ酸の抽出に有利に働くと考えられる。

（糖化工程、及び併行糖化発酵工程）
リグノセルロース系原料の糖化工程は、併行糖化発酵工程としてもよい。本発明で糖化工程又は酵素糖化工程というときは、併行糖化発酵工程を含む。併行糖化発酵工程は、リグノセルロース系原料を適量の水と酵素と混合して原料懸濁液とし、さらに酵母等の微生物と混合することにより、実施できる。リグノセルロース系原料は酵素により糖化され、生成された糖類が発酵微生物（酵母など）によりエタノール等の生産物に変換される。

糖化工程又は併行糖化発酵工程で用いるリグノセルロース系原料の懸濁濃度は、１〜３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。

糖化工程又は併行糖化発酵で使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。
各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。

市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、例えばセルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、０．５〜１００質量部が好ましく、１〜５０質量部が特に好ましい。

糖化工程又は併行糖化発酵工程での反応液のｐＨは３．５〜１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０〜７．５の範囲に維持することがより好ましい。

糖化工程又は併行糖化発酵工程での反応液の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がさらに好ましい。反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は１０〜２４０時間、さらに好ましくは１５〜１６０時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、１０〜１５０時間、さらに好ましくは１５〜１００時間である。

併行糖化発酵工程では、糖類（六炭糖、五炭糖）が発酵できる発酵微生物を用いることが好ましい。発酵微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａｓｈｉｈａｔａｅ）、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等の酵母やザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）等の細菌が挙げられる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物（酵母、細菌等）を用いることもできる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物を特に制限なく用いることができる。

微生物は固定化しておいても良い。微生物を固定化しておくと、次工程で微生物を分離して再回収する工程を省くことができるため、少なくとも回収工程に要する負担を軽減することができ、微生物のロスが軽減できるというメリットがある。また、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。

＜固液分離工程＞
糖化工程又は併行糖化発酵工程から排出された培養液は、固液分離装置へ移送し液体分（濾液）と固形分（残渣）に分離することができる。固液分離を行う装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。
回収された固形分（残渣）は、さらに糖化工程又は併行糖化発酵工程へ移送し、糖化又は糖化発酵の原料として用いることもできる。

＜フェルラ酸を得る工程＞
本発明においては、少なくとも糖化処理工程を経たリグノセルロース系原料の処理懸濁液が固液分離され、固形分（残渣）はフェルラ酸を得るための原料となる。なお、処理懸濁液は、糖化工程又は併行糖化発酵工程から排出されたものを指す場合、培養液ということもある。またここでいう固形分（残渣）は、後述する一次残渣分離工程または二次残渣分離工程から得られたものを含んでいてもよい。なお、本発明でフェルラ酸というときは、特に記載した場合を除き、遊離のフェルラ酸のみならず、配糖体またはエステルの形態であるものも含む。

固形分からフェルラ酸を得るには、固形分をアルカリを含む水に混合し、処理すればよい。アルカリの添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、例えば、高い収率でフェルラ酸を得るためには、固形分（絶乾重量）に対して０．５質量％以上、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１．２５質量％以上用いることができる。アルカリの添加量の上限値は適宜定めることができ、例えば、固形分（絶乾重量）に対して５０質量％以下、３０質量％以下、３質量％以下とすることができる。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられるが、これらの薬品に特に限定されない。水は、固形分（絶乾重量）に対して１〜１００質量％、好ましくは５〜５０質量％用いることができる。処理の際は、イソプロピルアルコールを添加してもよい。

混合液は、６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上に加熱し、必要に応じ、攪拌しながら時間反応させることができる。高い収率でフェルラ酸を得るためには、反応は４時間以上、好ましくは６時間以上、より好ましくは８時間以上行うとよい。反応時間の上限値は適宜定めることができ、例えば、２４時間以下、１６時間以下、１２時間以下とすることができる。その後、混合液を必要に応じ冷却し、ヘキサン等の有機溶媒を添加して目的外の成分を油層に抽出除去した後、水層を得て、水層を濾過し固形分（不溶物）を除去し、ろ液を得ることができる。ろ液に酸を添加することにより、フェルラ酸を析出させることができる。得られた析出物は再結晶化等の通常の手段により、精製してもよい。

得られたフェルラ酸は、常法により、例えばＨＰＬＣ又はＵＰＬＣ（波長３２０ｎｍ）等により同定でき、また定量することができる。

本発明のフェルラ酸の製造方法を、図１に示した例により説明する。原料はＩ（一軸破砕機）により機械的処理をされた後、ＣＯ（加熱処理装置）及びＲ（レファイナー）を経て、ＢＲ（併行糖化発酵槽）へ移送される。糖化発酵処理工程を経た処理懸濁液は、Ｓ（固液分離装置）で液体分と固形分（残渣）に分離される。得られた固形分は、フェルラ酸を得るための反応工程へ移送される。

＜その他の工程＞
（発酵工程）
本発明の実施態様においては、糖化工程と発酵工程を別の反応槽で行ってもよい。前記固液分離工程で分離された液体分（濾液）は、発酵工程へ移送し発酵微生物を用いて発酵を行う。発酵微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａｓｈｉｈａｔａｅ）、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）等の酵母やザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）等の細菌、等が挙げられる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物（酵母、細菌等）を用いることもできる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物を特に制限なく用いることができる。
微生物は固定化しておいても良い。微生物を固定化しておくと、次工程で微生物を分離して再回収するという工程を省くことができるため、少なくとも回収工程に要する負担を軽減することができ、微生物をロスが軽減できるというメリットがある。また、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。

（蒸留工程）
前記発酵工程で発酵処理された処理液、又は併行糖化発酵工程で処理された処理液（固液分離工程を行った場合は、固液分離工程で分離された液体分）は、蒸留工程へ移送し減圧蒸留装置により発酵生成物（エタノール等）を蒸留分離することができる。減圧下では低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
蒸留温度は、エタノールの場合、２５〜６０℃が好ましい。２５℃未満であると、生成物の蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、６０℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪くなる。
蒸留後の蒸留残渣留分中に残る発酵生成物濃度は０．１質量％以下であることが好ましい。このような濃度にすることによって、後段の固液分離工程において固形物とともに排出される発酵生成物量を低減することができ、収率を向上させることができる。

（一次残渣分離工程）
本発明の実施態様においては、プロセス全体を前掲特許文献１のように構成してもよい。前掲特許文献１の図１及び図２に示す製造工程では、蒸留後の発酵生成物（エタノール等）を分離した後の蒸留残液は、一次残渣分離工程へ移送され、一次残渣分離装置Ｃ１で液体留分と残渣に分離される。一次残渣分離装置Ｃ１で分離された液体留分はライン７（及び培養液保管タンクＴ）を経由して一次併行糖化発酵槽ＢＲ１に循環される。また、図３に示す製造工程では、一次残渣分離工程（残渣分離装置Ｃ１）で分離された液体留分はライン３を経由して二次併行糖化発酵槽ＢＲ２（前記、一次併行糖化発酵工程とは異なる併行糖化発酵工程）へ移送される。二次併行糖化発酵工程では、新しいリグノセルロース原料を添加して糖化発酵させることもできるし、キシロース等の五炭糖の発酵を目的とした発酵を行うこともできる。

一次残渣分離工程で分離された液体留分には酵素が含まれており、糖化工程、一次併行糖化発酵工程又は二次併行糖化発酵工程へ循環し酵素含有液として再利用することができる。一次残渣分離工程で分離された残渣は、上述のフェルラ酸回収工程へ供することができる。一方、一次残渣分離工程で分離された残渣には酵素が含まれているので、酵素回収工程へ移送してもよい。

（二次残渣分離工程）
本発明の実施態様においては、プロセス全体を前掲特許文献１のように構成し、前記酵素回収工程において水溶性塩類で処理した後の残渣懸濁液を、二次残渣分離工程へ移送し、二次残渣分離装置Ｃ２により残渣と液体留分に分離してもよい。前掲特許文献１の図１及び図２に示す製造工程では、酵素を含む液体留分はライン８（及び培養液保管タンクＴ）を経由して一次併行糖化発酵槽ＢＲ１へ移送することができる。図３に示す製造工程では、二次残渣分離工程（二次残渣分離装置Ｃ２）で分離された液体留分はライン８ａを経由して二次併行糖化発酵槽ＢＲ２（前記、一次併行糖化発酵工程とは異なる併行糖化発酵工程）へ移送される。二次併行糖化発酵工程では、新しいリグノセルロース原料を添加して糖化発酵させることもできるし、キシロース等の五炭糖の発酵を目的とした発酵を行うこともできる。二次残渣分離工程で分離された残渣は、上述のフェルラ酸回収工程へ供することができる。
酵素を含む液体留分（濾液）を連続的に工程内を循環することにより工程内の酵素活性を長期にわたって高い水準に維持することができる。

一次残渣分離工程、又は二次残渣分離工程で用いる残渣分離装置（一次残渣分離装置、二次残渣分離装置）としては、遠心分離機、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス、スクリーン等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［実施例１］
チップ状のユーカリ・グロブラスの林地残材（樹皮７０％、枝葉３０％）を２０ｍｍの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機（西邦機工社製、ＳＣ−１５）で破砕し原料として用いた。
上記原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム２００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加後、水を添加し水溶液の容量を８Lに調製した。前記原料懸濁液を混合後、１７０℃で１時間加熱した。加熱処理後の原料懸濁液をレファイナー（熊谷理器工業製、ＫＲＫ高濃度ディスクレファイナー）でディスク（プレート）のクリアランスを１．０ｍｍし磨砕した。次に２０メッシュ（８４７μm）のスクリーンを用いて磨砕処理後の原料懸濁液を固液分離（脱水）することにより溶液の電気伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の固形分を原料（以下、「前処理原料」という。）として併行糖化発酵を行った。

＜併行糖化発酵＞
予め、液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（市販酵母、商品名：商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: ＭａｕｒｉＹｅａｓｔＡｕｓｔｒａｌｉａＰｔｙＬｉｍｉｔｅｄ）を、３０℃、２４時間培養した。糖化発酵槽にポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を添加後，水を添加し最終容量を０．８ｍ^３に調整した。酵母菌体を含む培養液を糖化発酵槽に添加し２４時間培養した。酵母の密度が、１ｘ１０^８／ｍｌに増殖した時点で、市販セルラーゼ溶液（マルティフェクトＣＸ１０Ｌ）５０Ｌ、及び原料１００ｋｇ（乾燥重量）を糖化発酵槽に添加した。次に、糖化発酵槽に水を添加し培養液の最終容量を１ｍ^３に調製した。培養液のｐＨを５．０に調整し３０℃で併行糖化発酵を開始した。糖化発酵槽ＢＲ内での培養液の滞留時間（原料懸濁液が糖化発酵槽を通過する時間：糖化発酵槽の容量／流速）を２０時間に設定し糖化発酵行った。すなわち、糖化発酵を開始した時点から、固形分濃度（乾燥重量当たり）が１０質量％の原料懸濁液（原料を水に懸濁）を流速５０Ｌ／ｈで糖化発酵槽の原料供給口から連続的に添加した。一方、原料供給開始と同時に糖化発酵槽の培養液排出口より原料懸濁液を５０Ｌ／ｈで排出し、固液分離工程へ移送した。また、前記セルラーゼ溶液を２．５Ｌ／ｈで糖化発酵槽に連続的に添加した。尚、連続運転中に培養液が減少した場合、自動的に培地を添加することにより培養液の最終容量を１ｍ^３に維持した。培養中の培養液のｐＨを５．０に維持した。

＜固液分離＞
前記併行糖化発酵工程から排出された原料懸濁液を、スクリュープレス（富国工業株式会社製ＳＨＸ−２００ｘ１５００Ｌ、スクリーンサイズ１．２ｍｍ）で固液分離して固形分（残渣）と液体分（濾液）を分離した。

前記固形分（残渣）を試料として用いた。三口フラスコに試料10ｇ（絶乾重量）、水酸化ナトリウム1.5ｇ（絶乾重量）、水20ml、イソプロピルアルコール20mlを添加後、90-100℃まで加熱し８時間攪拌し反応させた。その後、前記混合液を室温まで冷却した。次に、ヘキサンを混合液に添加し、攪拌後、水層とヘキサン層に分画した。水層を濾過し固形分（不溶物）を除去し、ろ液を得た。ろ液に7.5N硫酸を5ml添加し、フェルラ酸を結晶化させた。得られた結晶をろ過し、結晶を再度熱湯で溶解した後、再結晶化させ、フェルラ酸を精製した。試料から精製したフェルラ酸をHPLC（カラム/CADENZA CD-C18、カラム温度/30℃、溶離液/MeOH(10→60％)＋酢酸水溶液（90→40％）、波長320nmで測定）で分析し、試料に含まれるフェルラ酸を測定した。結果を表１に示す。

［実施例２］
実施例１において、反応に用いた試料を3ｇに変更した以外は実施例１と同様の方法で試験した。再結晶による単離はできなかったが、細かい結晶が生成した。結果を表１に示す。

［比較例１］
実施例１において、試料として残渣の代わりに糖化発酵前の前処理原料を用いた以外は実施例１と同様の方法で試験した。結晶が生成しなかった。結果を表１に示す。

［比較例２］
実施例１において、試料として残渣の代わりに固液分離後の液体分を濃縮、乾燥して得られた固形分（固形分A）を用いた以外は実施例１と同様の方法で試験した。結晶が生成しなかった。結果を表１に示す。

表１に示すように、糖化発酵後の培養液を固形分と液体分に固液分離し、得られた固形分から効率的にフェルラ酸が製造できることが判明した。

本発明により、リグノセルロース系バイオマスを原料としたエタノール等の有用物質生産において、糖化発酵後の固形分（残渣）からフェルラ酸を製造することができる。フェルラ酸は、食品、化粧品及び医療等の分野で有用である。

Claims

リグノセルロース系原料からの、酵素により糖化処理する工程を経た処理懸濁液を固液分離し、得られた固形分からフェルラ酸を分離する工程を含む、フェルラ酸を製造する方法。
前記固形分が、リグニンを含有することを特徴とする、請求項1に記載のフェルラ酸の製造方法。
処理懸濁液が、酵素糖化処理の前に前処理工程を経たものである、請求項１又は２に記載のフェルラ酸の製造方法。
前処理が、化学的処理である、請求項３に記載のフェルラ酸の製造方法。
処理懸濁液が、酵素糖化処理と併行して又は酵素糖化処理の後に発酵処理したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフェルラ酸の製造方法。
リグノセルロース系原料が、広葉樹から得られたものである、請求項1〜５のいずれか１項に記載のフェルラ酸の製造方法。