JP2015131766A - 還元型補酵素ｑ１０の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】還元型補酵素Ｑ１０の結晶多形を制御し、所望の結晶形を確実かつ効率よく生産することが可能な、還元型補酵素Ｑ１０の製造方法を提供すること。
【解決手段】還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で少なくとも６０分間保持する工程と、その後結晶化する工程を有する、実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない還元型補酵素Ｑ１０の製造方法。還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で保持する間の温度変化は、３℃／ｈ未満であるのが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、還元型補酵素Ｑ１０の製造方法に関する。還元型補酵素Ｑ１０は、酸化型補酵素Ｑ１０に比べて高い経口吸収性を示し、優れた食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬、ペットフード等として有用な化合物である。

補酵素Ｑは、細菌から哺乳動物まで広く生体に分布する必須成分であり、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として知られている。補酵素Ｑは、ミトコンドリア内で酸化と還元を繰り返すことで、電子伝達系における伝達成分としての機能を担っているほか、還元型補酵素Ｑは抗酸化作用を持つことが知られている。ヒトでは補酵素Ｑの側鎖が、繰り返し構造を１０個持つ補酵素Ｑ１０が主成分であり、生体内においては、通常、４０〜９０％程度が還元型として存在している。補酵素Ｑの生理的作用としては、ミトコンドリア賦活作用によるエネルギー生産の活性化、心機能の活性化、細胞膜の安定化効果、抗酸化作用による細胞の保護効果等が挙げられている。

現在製造・販売されている補酵素Ｑ１０の多くは酸化型であるが、近年では、酸化型補酵素Ｑ１０に比べて高い経口吸収性を示す還元型補酵素Ｑ１０も市場に登場し、用いられるようになってきている。

還元型補酵素Ｑ１０を得る一般的な方法は特許文献１に開示されている。さらに、還元型補酵素Ｑ１０を結晶として得る方法についても、いくつかの方法が知られている。例えば、特許文献２では、還元型補酵素Ｑ１０を、アルコール溶液及び／又はケトン溶液中において晶出させ、結晶を製造している。特許文献３では、還元型補酵素Ｑ１０の高濃度液相を貧溶媒中に添加することで結晶化を行っている。

また、特許文献４には、還元型補酵素Ｑ１０を油脂に溶解させた後、冷却することにより、通常の還元型補酵素Ｑ１０結晶とはエックス線回折パターンを異にし、安定性に優れた結晶を取得できることが開示されている。

一般に、有機化合物、無機化合物を問わず、多くの化合物において結晶構造を異にする複数の結晶形が存在することが報告されており、これを結晶多形という。結晶多形において存在する複数の結晶形は、エックス線回折や赤外分光分析などの分析においてそれぞれ異なるパターンを示すだけでなく、融点や溶解度等の物性もそれぞれ異なっている。また、その物質が医薬品や機能性食品などの生理活性をもつ物質である場合には、バイオアベイラビリティーの違いを生じたりするために、結晶多形は厳密に制御されるべきものであることが知られている。

一方で、結晶多形という現象は十分に解明されていないこともまた事実である。ある日突然新たな結晶形が出現し、一方でこれまで存在していた結晶形が全く取得できなくなったために、すでに上市されていた医薬品の剤形を変更する必要が生じたり、開発中の医薬品において開発方針の変更あるいは中止を余儀なくされるといったような深刻な現象も報告されているが、このような現象がなぜ起こるかについて、いまだによくわかっていない（非特許文献１、２）。

特開平１０−１０９９３３号公報 特開２００３−００６４０９号公報 特開２００３−０８９６６９号公報 ＷＯ２００５−０３３０５４号公報

松岡正邦著「分かり易い結晶多形」（分離技術会）Ｐ．４ Ｊ．Ｄ．Ｄｕｎｉｔｚ ａｎｄ Ｊ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，"Ｄｉｓａｐｐｅａｒｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｓ"Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８，１９３−２００（１９９５）

今まで、補酵素Ｑ１０については、酸化型還元型ともに結晶多形の明確な報告はなく、結晶多形は存在しないものと考えられてきたが、驚くべきことに、ごく最近になって、還元型補酵素Ｑ１０に結晶多形現象が見られることが本発明者らによって判明した。新たに出現した結晶形は従来の還元型補酵素Ｑ１０結晶より溶解度が低く、融点が高いことが確認された。従って、新たに見出された結晶形（以下、この結晶をＦｏｒｍＩＩと呼称する）は安定形であり、従来の還元型補酵素Ｑ１０結晶（以下、この結晶をＦｏｒｍＩと呼称する）は、新たに見出された結晶形に比べて相対的に不安定な準安定形であるということになる。

還元型補酵素Ｑ１０のＦｏｒｍＩＩ結晶が見出されて以降、還元型補酵素Ｑ１０の製造において、突然これまでになかった問題が発生した。すなわち、従来と同様の製法で還元型補酵素Ｑ１０結晶を取得しているにもかかわらず、その結晶中に、従来は存在しなかったＦｏｒｍＩＩ結晶が時折見られるようになったのである。本発明者らはＦｏｒｍＩＩ結晶を検出するための分析法を新たに開発してその様子を観察した結果、結晶中に見られるＦｏｒｍＩＩ結晶の量は、従来のＦｏｒｍＩ結晶にわずかに混入している程度のこともあれば、取得された結晶のほとんどがＦｏｒｍＩＩ結晶である場合もあることがわかった。製造した還元型補酵素Ｑ１０結晶中にＦｏｒｍＩＩ結晶が混合している場合、再度結晶を溶解し、晶析をやり直すことによってＦｏｒｍＩ結晶を取得できることもあるが、その場合でも確実にＦｏｒｍＩ結晶のみが得られるというわけではなく、効率的な方法とはいえない。上述した通り、医薬品や機能性食品などにおいて、結晶多形は厳密に制御されるべきであり、還元型補酵素Ｑ１０についても、結晶多形を完全に制御する方法が望まれる。

本発明者らは、上記のように、還元型補酵素Ｑ１０の結晶多形の制御といった従来存在しなかった新たな課題を解決するために鋭意検討した結果、還元型補酵素Ｑ１０の製造において、ＦｏｒｍＩ結晶のみを確実に取得する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で少なくとも６０分間保持する工程と、その後結晶化する工程を有する、実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない還元型補酵素Ｑ１０の製造方法である。

本発明によれば、還元型補酵素Ｑ１０の結晶多形を確実に制御し、実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない還元型補酵素Ｑ１０の効率的な製造が可能となる。

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書における「還元型補酵素Ｑ１０」とは、還元型補酵素Ｑ１０を主成分とする限り、その一部に酸化型補酵素Ｑ１０を含んでいてもよい。なお、ここで主成分とは、例えば５０重量％以上、通常６０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上、さらに好ましくは９０重量％以上、特に好ましくは９５重量％以上、とりわけ９８重量％以上含まれていることを意味する。

また、本明細書における「結晶性固体」とは、結晶構造を有する部分とともに、結晶構造を有さない非晶質成分をその中に含んだ固体を意味する。

本発明の還元型補酵素Ｑ１０の製造方法は、（１）還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で少なくとも６０分間保持する工程と、（２）その後結晶化する工程を有することを特徴とする。

まず、（１）の還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で少なくとも６０分間保持する工程（以下、「保持工程」という）について説明する。保持工程における温度条件は、４７℃を超える温度であれば特に限定されないが、５０℃以上が好ましく、５５℃以上がより好ましく、６０℃以上が特に好ましい。また、保持時間については、６０分以上であれば特に限定されないが、９０分以上が好ましく、１２０分以上がさらに好ましい。本発明における温度の保持とは、４７℃を超える所定の温度で一定時間保持することだけでなく、４７℃を超える範囲であれば温度の上昇あるいは下降を伴ってもよい。温度の上昇あるいは下降を伴う場合、温度の変動幅はある程度制御されるのが好ましく、例えば一定の温度幅の範囲内で保持するのも本発明の好ましい態様の一つである。この場合の温度幅としては、実際の製造において制御しうる幅であれば特に限定されないが、例えば所定温度を含む範囲として約１０℃、好ましくは約８℃、より好ましくは約６℃、更に好ましくは約４℃、特に好ましくは約２℃である。一方、保持工程において温度の上昇あるいは下降を伴う場合の温度変化としては特に限定されないが、温度変化は緩慢な方が好ましく、具体的には温度変化における平均値として３℃／ｈ未満が好ましく、２．５℃／ｈ以下がより好ましく、２℃／ｈ以下がさらに好ましく、１℃／ｈ以下が特に好ましい。ここでいう温度変化の平均値とは、４７℃を超える温度で一定時間（少なくとも６０分間）保持される間の「温度変化（℃）／保持時間（ｈ）」として算出される。本発明の製造方法における保持工程においては、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を越える所定の温度で一定時間保持するのが好ましい。

保持工程において、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を、４７℃を超える温度で一定時間保持する方法としては特に限定されず、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える所定温度まで加温した後に、温度制御や保温などを行って、少なくとも６０分間、４７℃を超える温度が維持されるようにすればよい。保持工程において還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液は、撹拌や液の循環等により混合された状態にあっても静置状態にあってもよいが、混合された状態であるのが好ましい。

保持工程に供される還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液は、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液であれば特に限定されず、還元型補酵素Ｑ１０が溶解した均一な溶液状態でも、一部溶解されず残っているスラリー状態であっても良いが、均一な溶液状態であるのが好ましい。さらには、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、ケトン類、窒素化合物類、硫黄化合物類及び水からなる群より選択される少なくとも一つの溶媒に、還元型補酵素Ｑ１０が溶解した溶液を還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液として使用するのが好ましい。なおここで溶解される還元型補酵素Ｑ１０としては、結晶、非晶状態を問わず、またその結晶多形も問わない。また、後述する結晶化工程においてその純度を高めることが可能なため、不純物を有するものや、未精製・粗精製の還元型補酵素Ｑ１０であってもよい。さらに、従来公知の方法によって得られた還元型補酵素Ｑ１０の抽出液や、公知の還元方法で酸化型補酵素Ｑ１０から得られた還元型補酵素Ｑ１０を含有する反応液を、そのまま、あるいは必要に応じて精製及び／又は溶媒置換したものを、還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液として使用することもできる。

上記炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、また、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキセン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカン、ドデカン等を挙げることができる。芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。

ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、また、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、非環状のものが好ましく用いられる。塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素がより好ましく、塩素化炭化水素がさらに好ましい。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。

上記脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。酢酸エステル、ギ酸エステルが好ましく、酢酸エステルがより好ましい。エステル基としては、特に制限されないが、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数１〜８のアラルキルエステル等が挙げられ、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルである。プロピオン酸エステルとしては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。

上記エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。

上記アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。例えば、１価アルコールとしては炭素数１〜２０のものが挙げられ、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜５、特に好ましくは炭素数１〜４、とりわけ好ましくは炭素数１〜３のものである。最も好ましくは炭素数２〜３の１価アルコールである。また、炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の２価アルコール、炭素数３の３価アルコール等も好適に用いられる。上記のうち、炭素数１〜５の１価アルコールは、水と相溶性の高いアルコールであり、水との混合溶媒として使用する場合に好適に用いられる。１価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等を挙げることができる。２価アルコールとしては、例えば、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることができる。３価アルコールとしては、例えばグリセリン等を挙げることができる。

上記ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。

上記窒素化合物類としては、例えばニトリル類が使用できる。当該ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。 具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。上記ニトリル類以外の窒素化合物類としては、例えば、ニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等を挙げることができる。

上記硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。

上記溶媒のうち、炭化水素類、ニトリル類、アルコール類、ケトン類が好ましく、アルコール類またはケトン類がさらに好ましく、アルコール類が特に好ましい。

本発明において、還元型補酵素Ｑ１０を溶解させるための溶媒としては、上記例示したものを単独で用いても良く、還元型補酵素Ｑ１０の溶解度、晶析濃度、収率、スラリー性状、結晶性状等の晶析条件を左右する条件を改善するために、それぞれの溶媒の特性に従って、２種以上を好ましい割合で混合して用いることもできる。

保持工程及びその後の結晶化工程に供する還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液中の還元型補酵素Ｑ１０の濃度は、保持する温度において還元型補酵素Ｑ１０が完全に溶解した状態となるように調整されることが好ましい。その具体的な濃度は、用いる溶媒の保持温度における溶解度を超えない範囲で、その上限として、５０重量％以下が好ましく、４０重量％以下がさらに好ましく、３０重量％以下が特に好ましい。また、生産効率の面からは、溶液中の還元型補酵素Ｑ１０の濃度はできるだけ高い濃度に調整されることが好ましく、例えば、１重量％以上が好ましく、３重量％以上がさらに好ましく、５重量％以上が特に好ましい。

本発明の製造方法においては、（１）の保持工程を行ったあとに（２）の還元型補酵素Ｑ１０を結晶化する工程（以下、「結晶化工程」という）を実施する。ここで、結晶化工程は保持工程に引き続き行われてもよいし、保持工程のあと何らかの工程、例えば、精製、溶媒置換などを行った後に、結晶化工程を行っても良く、また、保持工程のあと結晶化工程を行うまでの熱履歴も特に限定されないが、（２）の結晶化工程は（１）の保持工程に引き続いて実施されるのが好ましい。

以下、（２）の結晶化工程について説明する。本発明において結晶化工程で実施される還元型補酵素Ｑ１０の結晶化の方法は、特に限定されないが、冷却晶析、貧溶媒晶析、または、冷却晶析と他の晶析方法を組み合わせた方法であることが好ましい。冷却晶析とは、溶液を冷却することで溶解度を下げ、溶質を結晶化させる方法であり、貧溶媒晶析とは、溶液と貧溶媒を混合することで溶解度を下げ、溶質を結晶化させる方法である。ここで、貧溶媒とは、還元型補酵素Ｑ１０をほとんど溶解しないか、あるいは全く溶解しない溶媒をいう。貧溶媒は還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液と相互に溶解することが好ましい。貧溶媒と混合する方法としては、溶液中に貧溶媒を添加してもよく、貧溶媒中に溶液を添加してもよい。冷却晶析と組み合わせる他の晶析方法には、上述の貧溶媒晶析のほか、例えば溶液を濃縮することにより結晶を析出させる濃縮晶析などがあげられる。

本発明の製造方法において、好ましい結晶化の方法は、冷却晶析あるいは貧溶媒晶析であり、特に好ましい結晶化の方法は、冷却晶析である。

結晶化に際しては、スムースに核化・結晶成長を行うために、種晶を添加することも好ましく行われる。添加する種晶として好ましいのは、還元型補酵素Ｑ１０のＦｏｒｍＩ結晶あるいはＦｏｒｍＩ結晶を含有する結晶性固体である。種晶の添加量としては、溶液中に溶解している還元型補酵素Ｑ１０の量に対して０．００１〜１０重量％が好ましく、０．００３〜５重量％がさらに好ましく、０．００５〜１重量％が特に好ましい。

結晶化工程における還元型補酵素Ｑ１０の結晶の析出は、２５℃未満の温度で行うことが好ましい。なおこの場合、２５℃未満の一定温度で結晶化を行っても良く、あるいは、特に冷却晶析においては、冷却工程の終期に２５℃未満となることでも良い。２５℃以上の温度で結晶を析出させる場合は、結晶の収率が低下したり、目的の収率に達成するために長時間を要することがある。また、生産性の観点から、特に工業的規模で実施する場合には、結晶化の操作に要する時間は２４時間未満であることが好ましい。

結晶化は、局所的な高過飽和状態の形成を抑制し、スムースに核化・結晶成長を行うために、あるいは高品質化の観点から、強制流動下に実施するのが好ましい。強制流動は、混合時間（θ）が、５分以下となるように行うことが好ましい。ここで混合時間（θ）とは、２つ以上の状態の物質が空間的に均一に混ざり合うまでに要する時間のことで、系中の混合状態の良し悪しを評価する指標として用いられるものである。混合時間（θ）は、撹拌翼の大きさや形状、バッフルの有無などの装置特性に加えて、混合する液の物性や撹拌回転数などとも関係し、これらは混合時間（θ）とレイノルズ数（Ｒｅ）との相関曲線で表される。混合時間（θ）とレイノルズ数（Ｒｅ）との相関曲線は、例えば色素や電解質の溶液などを撹拌装置内の還元型補酵素Ｑ１０溶液やそれに代わるモデル溶液に添加し、分光計や濁度計、電導度計で数値が安定するまでの時間を測定したり、チオ硫酸ナトリウムによるヨウ素の脱色反応を利用して色が消失するまでの時間を測定したりすることにより把握することが可能である。また、流動解析を行うことで、シミュレーションにより求めることも可能である。

上記強制流動は、例えば撹拌翼の回転やポンプ等を用いた液の循環、あるいはガスの吹き込みによる方法などにより行うことができるが、撹拌翼の回転による方法が好ましい。強制流動に用いる撹拌翼には、撹拌翼径と槽径（撹拌槽の内径）の比（ｄ／Ｄ）が０．８５以上の撹拌翼を用いるか、あるいはバッフルとともに用いられる撹拌翼が好ましい。撹拌翼の形状については、従来公知のものを特に制約なく用いることができる。例えば、アンカー翼、広幅パドル翼、大型格子翼、三方後退翼などの撹拌翼のうち、ｄ／Ｄが０．８５以上の撹拌翼を選択して使用するか、平板パドル翼、傾斜パドル翼、タービン翼、プロペラ翼などの撹拌翼をバッフルとともに用いるか、あるいはこれらを組合せて使用することができる。

本発明の製造方法によれば、（１）の保持工程および（２）の結晶化工程を工業的規模で実施することにも適している。実験室規模の小スケールの場合には、溶液全体の温度にムラがあることはほとんどないが、工業的規模で還元型補酵素Ｑ１０を製造する場合には、装置に取り付けた温度計が所望の温度を指示していたとしても装置内の溶液全体の温度が所望の温度に到達するのに比較的長時間を要することがある。本発明の製造方法は、所定温度で６０分以上保持するといった、工業的規模でも制御が容易な工程を特徴部分とするため、その実施規模に関係なく、実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない還元型補酵素Ｑ１０を確実に製造することが可能である。なお、ここでいう工業的規模とは、例えば２４時間当たり５ｋｇ以上の還元型補酵素Ｑ１０を製造する場合、好ましくは２４時間当たり１０ｋｇ以上の還元型補酵素Ｑ１０を製造する場合、より好ましくは２４時間当たり２０ｋｇ以上の還元型補酵素Ｑ１０を製造する場合をいう。この場合、上記生産性を満たす限り、バッチ生産でも連続生産でもかまわない。

還元型補酵素Ｑ１０の結晶あるいは結晶性固体中に、ＦｏｒｍＩＩ結晶が含有されているかどうかやその含有割合は、例えば示差走査型熱量計（ＤＳＣ）で測定することにより判別が可能である。ＦｏｒｍＩＩ結晶は、ＤＳＣにより昇温速度１℃／分において測定を行った場合、５２±２℃付近に吸熱ピークを示し、従来のＦｏｒｍＩ結晶あるいはその結晶性固体と混合された状態であっても、前記ピークの有無によりＦｏｒｍＩＩ結晶の存在の有無は明らかに判別される。本発明の方法によれば、ＤＳＣで前記の条件で測定した場合にＦｏｒｍＩＩ結晶の存在が検出されない、すなわち実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない、還元型補酵素Ｑ１０の結晶あるいは結晶性固体を確実に得ることができる。

上記方法によって得られた本発明の還元型補酵素Ｑ１０結晶及び結晶性固体は、例えば、特許文献２や３に記載されたような従来公知の方法により固液分離・乾燥の工程を経て回収される。例えば固液分離には加圧ろ過、遠心ろ過などが使用できる。また、乾燥後の結晶性固体を必要に応じて粉砕、分級（ふるい分け）して回収することもできる。

なお、上記保持工程、結晶化工程、その他後処理工程などは、脱酸素雰囲気下にて実施するのが好ましい。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例および比較例中のＤＳＣ測定条件は下記の通りである。
（ＤＳＣ測定条件）
装置 : ＳＩＩナノテクノロジー製 ＤＳＣ６２２０
サンプル容器 : アルミ製パン＆カバー（ＳＳＣ０００Ｃ００８）
昇温速度 : １℃／分
サンプル量 : ５±２ｍｇ

容積２Ｌのセパラブルフラスコ（硼珪酸ガラス製）の内部を窒素置換した後、還元型補酵素Ｑ１０を１００ｇとエタノール１２００ｇを入れ、撹拌翼により撹拌しながら６０℃まで加温して均一な溶液とした。この溶液を引き続き６０℃で２時間保持したあと、３５℃まで１時間、３５℃から２５℃まで１時間、さらに２５℃から１０℃まで１時間かけて冷却し、還元型補酵素Ｑ１０の結晶を得た。なお、別途、チオ硫酸ナトリウムによるヨウ素の脱色反応を利用して測定した同装置でのレイノルズ数（Ｒｅ）と混合時間（θ）の相関曲線より求められる、上記加温、保持、冷却工程における混合時間θは、１０秒であった。

同じ実験を１０回繰り返し、得られた結晶をそれぞれＤＳＣにより分析して還元型補酵素Ｑ１０結晶中のＦｏｒｍＩとＦｏｒｍＩＩの存在比を調べた。結果を表１に示す。
（比較例１）

実施例１と同じ装置の内部を窒素置換した後、還元型補酵素Ｑ１０を１００ｇとエタノール１２００ｇを入れ、撹拌翼により実施例１と同じ条件で撹拌しながら５０℃まで加温して均一な溶液とした。この溶液を、５０℃まで加温後直ちに３５℃まで１時間かけて冷却し、引き続き３５℃から２５℃まで１時間、さらに２５℃から１０℃まで１時間かけて冷却し、還元型補酵素Ｑ１０の結晶を得た。

同じ実験を１０回繰り返し、得られた還元型補酵素Ｑ１０結晶をそれぞれＤＳＣにより分析して結晶中のＦｏｒｍＩとＦｏｒｍＩＩの存在比を調べた。結果を表１に示す。

容積２０００Ｌの晶析槽（ＳＵＳ３０４製）の内部を窒素置換した後、還元型補酵素Ｑ１０を１００ｋｇとエタノール１２００ｋｇを入れ、ｄ／Ｄ＝０．９の撹拌翼を使用して撹拌しながら６０℃まで加温して均一な溶液とした。この溶液を引き続き６０℃±２℃で２時間保持したあと、３５℃まで１時間、３５℃から２５℃まで１時間、さらに２５℃から１０℃まで１時間かけて冷却し、還元型補酵素Ｑ１０の結晶を得た。なお、別途、水中に電解質水溶液（塩化ナトリウム水溶液）を添加し、槽の上部と下部に取り付けた電気伝導度計の値が安定するまでの時間を測定することによって予め作成したレイノルズ数（Ｒｅ）と混合時間（θ）の相関曲線より求められる、上記加温、保持、冷却工程における混合時間θは、２分であった。

同じ条件での製造を１０回実施し、得られた還元型補酵素Ｑ１０結晶をそれぞれＤＳＣにより分析した結果、いずれもＦｏｒｍＩＩ結晶の存在は確認されず、実質的にＦｏｒｍＩ結晶１００％であることが確認された。

Claims (12)

1. 還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で少なくとも６０分間保持する工程と、その後結晶化する工程を有する、実質的にＦｏｒｍＩＩ結晶を含有しない還元型補酵素Ｑ１０の製造方法。
2. 還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液が、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、ケトン類、窒素化合物類、硫黄化合物類及び水からなる群より選択される少なくとも１つの溶媒に、還元型補酵素Ｑ１０が溶解した溶液である、請求項１記載の製造方法。
3. 結晶化の方法が、冷却晶析、貧溶媒晶析、または、冷却晶析と他の晶析方法を組み合わせた方法である、請求項１または２記載の製造方法。
4. 結晶化の際に、還元型補酵素Ｑ１０のＦｏｒｍＩ結晶あるいはそ
   の結晶性固体を添加することを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の製造方法。
5. 結晶化の際に添加するＦｏｒｍＩ結晶あるいはその結晶性固体の
   量が、溶液中に溶解している還元型補酵素Ｑ１０の量に対して０．００１〜１０重量％である、請求項４記載の製造方法。
6. 還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液を４７℃を超える温度で保持する間の温度変化の平均値が、３℃／ｈ未満である、請求項１〜５いずれか１項に記載の製造方法。
7. 還元型補酵素Ｑ１０の結晶化が２５℃未満で実施されることを特徴とする、請求項１〜６いずれか１項に記載の製造方法。
8. 結晶化の工程に要する時間が２４時間未満である、請求項１〜７いずれか１項に記載の製造方法。
9. 結晶化の操作を、混合時間（θ）が５分以下となる強制流動下でおこなう、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 強制流動が、撹拌翼の回転によるものである、請求項９記載の製造方法。
11. 強制流動が、撹拌翼径と槽径の比（ｄ／Ｄ）が０．８５以上の撹拌翼、あるいはバッフルとともに用いられる撹拌翼の回転によるものである、請求項９または１０記載の製造方法。
12. 還元型補酵素Ｑ１０を含有する溶液の４７℃を超える温度での保持工程および結晶化の工程を、工業的規模で実施することを特徴とする、請求項１〜１１いずれか１項に記載の製造方法。