JP2015118196A - 位相差観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】簡易な構成で物体の定量的な観察が可能な位相差観察装置を提供する。【解決手段】位相差観察装置は、光源からの光を被照射面に導く照明光学系と、被照射面の光学像を形成する結像光学系と、照明光学系の内部に設けられた第１の開口絞りと、結像光学系の内部に設けられた第２の開口絞りとを有し、第２の開口絞りは、第１の開口絞りを通過した直接光を通過させ、被照射面からの回折光の一部を遮光する。【選択図】図１

Description

本発明は、位相差観察装置に関する。

従来から、無染色の細胞に代表される位相物体（試料）を観察するため、位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡が用いられている。一般的な位相差顕微鏡では、照明光学系に輪帯状の開口が形成されており、試料を照明した後の直接光に対して、対物レンズ内に配置された複素振幅変調領域でλ／４の位相差を与える。これにより、直接光と回折光との干渉によるコントラストの高い像を得ることができる。特許文献１には、対物レンズ内に複素振幅変調領域を配置して構成された位相差顕微鏡が開示されている。

また従来から、照明光学系からの直接光が対物レンズに入射しないように、照明光学系の開口数を大きくし、位相物体からの回折光のみで像を取得する暗視野顕微鏡が知られている。特許文献２には、対物レンズ内に配置された遮光領域により照明光学系からの直接光を遮光するように構成された暗視野顕微鏡が開示されている。

特開２０００−１００１３号公報 特開平９−１８９５２０号公報

しかしながら、特許文献１の位相差顕微鏡では、複素振幅変調領域の位相変調量をλ／４に設定するために高度な成膜技術が必要である。また、その波長依存性により、広い波長範囲で位相変調量をλ／４に設定することは困難である。また、特許文献２の暗視野顕微鏡では、暗い背景に対して物体が存在する位置を明るくし、顆粒や粒状の物体は観察しやすいが、細胞のようなある程度大きい組織に対しては良好な観察が困難である。また、いずれの顕微鏡も、位相物体を定性的にしか観察することができない。特に暗視野顕微鏡は、高次の回折光のみで像を取得するため、ある程度大きい物体を定量的に観察することは困難である。

そこで本発明は、簡易な構成で物体の定量的な観察が可能な位相差観察装置を提供する。

本発明の一側面としての位相差観察装置は、光源からの光を被照射面に導く照明光学系と、前記被照射面の光学像を形成する結像光学系と、前記照明光学系の内部に設けられた第１の開口絞りと、前記結像光学系の内部に設けられた第２の開口絞りとを有し、前記第２の開口絞りは、前記第１の開口絞りを通過した直接光を通過させ、前記被照射面からの回折光の一部を遮光する。

本発明の他の目的及び特徴は、以下の実施例において説明される。

本発明によれば、簡易な構成で物体の定量的な観察が可能な位相差観察装置を提供することができる。

本実施形態における位相差観察装置の構成図である。 本実施形態における開口絞り（対物開口絞り、照明開口絞り）の構成図である。 本実施形態における対物開口ＯＡの大きさの説明図である。 一般的な暗視野顕微鏡のシミュレーション結果（比較例）である。 実施例１における位相差観察装置のシミュレーション結果である。 実施例２における位相差観察装置のシミュレーション結果である。 実施例３における位相差観察装置のシミュレーション結果である。 実施例４における位相差観察装置のシミュレーション結果である。

以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明する。

まず、図１を参照して、本実施形態における位相差観察装置（位相差顕微鏡）について説明する。図１は、位相差観察装置１０の構成図である。１００は、光源である。１０１は、光源１００からの光を被照射面（試料１０３）に導く照明光学系である。１０２は、照明光学系１０１の内部に設けられ、複数の照明開口ＩＡ（開口部）が形成された照明開口絞り１０２（第１の開口絞り）である。開口絞り１０２に形成された複数の照明開口ＩＡは、光源１００から出射した光を制限する。これにより、光源１００から出た光は、複数の照明開口ＩＡにより制限されて試料１０３を照明する。本実施形態において、好ましくは、照明開口絞り１０２として可変開口絞りが用いられる。可変開口絞りを用いることにより、コントラストや分解能を変更することができる。本実施形態において使用される光としては、可視光または近赤外光（例えば、波長０．４μｍ〜１．１μｍ）が用いられる。なお本実施例において、開口絞り１０２には複数の照明開口ＩＡが形成されているが、これに限定されるものではなく、単一の照明開口であってもよい。

１０４は、被照射面（試料１０３）の光を集光（光学像を形成）する対物レンズ（結像光学系）である。１０５は、対物レンズ１０４の内部に設けられた対物開口絞り（第２の開口絞り）である。対物開口絞り１０５は、照明開口絞り１０２を通過した直接光を通過させ、試料１０３（被照射面）からの回折光の一部を遮光するように構成されている。好ましくは、対物開口絞り１０５は、直接光の９０％以上を通過させ、回折光の２０％以上かつ８０％以下を遮光する。本実施形態において、対物開口絞り１０５は、複数の対物開口ＯＡ（開口部）および遮光領域ＳＨ（遮光部）を備えている。光源１００からの直接光は、対物開口ＯＡを通過し、試料１０３（被照射面）からの回折光の少なくとも一部は、遮光領域ＳＨで遮光される。

被照射面（試料１０３）からの光（光学像）は、対物レンズ１０４の内部に配置されたレンズ１０４ａおよび対物開口絞り１０５を通過して、撮像素子１０６に結像する。撮像素子１０６は、光学像を光電変換して画像信号（画像データ）を出力する。撮像素子１０６から出力された画像信号は、画像処理系１０７（画像処理手段）に出力される。画像処理系１０７は、撮像素子１０６から出力された画像信号に対して画像処理を行い、画像情報を生成する。すなわち画像処理系１０７は、後述のように、画像信号に基づいて観察対象の位相差量分布を算出する。

本実施形態において、対物開口絞り１０５の対物開口ＯＡおよび遮光領域ＳＨは、照明開口絞り１０２の照明開口ＩＡ（開口部）と共役な位置に設けられている。そして、光源１００からの直接光は、対物開口ＯＡを通過し、試料１０３（被照射面）からの回折光の少なくとも一部は、遮光領域ＳＨで遮光される。

試料１０３からの回折光の光量は、試料１０３の位相差量に応じて変化する。このため、回折光の一部を遮光することにより、試料１０３の位相差量に応じたコントラストが生じる。このように位相差観察装置１０は、試料１０３が存在位置にて発生する回折光の一部を遮光するように構成される。このため、暗視野顕微鏡とは異なり、背景が明るく物体が暗い像を得ることができる。なお本実施例において、照明開口ＩＡからの直接光の１００％が対物開口ＯＡを通過することが好ましい。ただし、誤差などを考慮して、厳密に１００％である必要はなく、例えば直接光の９０％以上が対物開口ＯＡを通過するように構成すればよい。

続いて、図２を参照して、位相差観察装置１０に用いられる照明開口絞り１０２および対物開口絞り１０５の構成について説明する。図２は、照明開口絞り１０２および対物開口絞り１０５の構成図である。図２（ａ）〜（ｃ）のそれぞれの左図は、対物レンズ１０４内に配置された対物開口絞り１０５の対物開口ＯＡおよび遮光領域ＳＨを光軸ＡＸの方向から見た図である。また、図２（ａ）〜（ｃ）のそれぞれの右図は、照明光学系１０１内に設けられた照明開口絞り１０２の照明開口ＩＡを光軸ＡＸの方向から見た図である。

図２（ａ）は放射状、図２（ｂ）は多重輪帯、図２（ｃ）はランダムドットの対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡをそれぞれ本実施形態の一例として示している。ただし本実施例は、これらに限定されるものではない。例えば、図２（ａ）〜（ｃ）に示される３つの例を組み合わせることもできる。

本実施形態の位相差観察装置１０は、照明開口ＩＡからの直接光が対物開口ＯＡを通過するように構成される必要がある。このため、図２に示されるように、瞳（瞳領域）に占める開口の割合は、照明開口ＩＡよりも対物開口ＯＡのほうが大きいか、または、同等の大きさになるように構成されている。また、対物開口ＯＡ、遮光領域ＳＨ、および、照明開口ＩＡは、金属板に穴をあけることや、透明な平行平板に遮光膜を成膜するなどして製造することができる。対物開口ＯＡは、従来の位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡とは異なり、光源１００からの直接光の振幅や位相を変調しないように構成されている。

好ましくは、アーティファクト、製造誤差、および、調整誤差の観点から、図２（ａ）に示されるように複数の対物開口ＯＡは、光軸ＡＸを中心として放射状に延び、また、光軸ＡＸを中心とした円の周方向よりも径方向において長い形状を有する。例えば図２（ｂ）のような多重輪帯の対物開口ＯＡでは、複数の輪帯のそれぞれの輪帯（対物開口ＯＡ）が等しい間隔で配置しやすい。このため、特定の周波数成分を強調するようなアーティファクトが生じやすい。また、図２（ｃ）のようなランダムドットの対物開口ＯＡでは、周期性が低いため、照明開口ＩＡからの直接光が対物開口ＯＡを通過するように製造および調整するのが困難である。一方、図２（ａ）のような放射状の対物開口ＯＡでは、上記のようなデメリットを低減することができる。ただし、観察する物体など様々な条件に応じて、対物開口ＯＡの望ましい形状は変わる。このため、目的や装置の構成に応じて最適な対物開口ＯＡを選択することが好ましい。

続いて、図３を参照して、対物開口ＯＡの望ましい大きさについて説明する。図３は、対物開口ＯＡの望ましい大きさの説明図であり、図３（ａ）は対物開口ＯＡが比較的小さい場合、図３（ｂ）は対物開口ＯＡが比較的大きい場合をそれぞれ示している。

ここで、対物開口絞り１０５の上に配置される直径Ｒの円を考える。被照射面（試料１０３）から対物開口ＯＡまでのレンズ１０４ａの合成焦点距離をｆ、光源１００から出射する光の最大波長をλ（μｍ）、対物レンズ１０４の試料１０３側の開口数をＮＡとする。また、Ｒｎ＝０．１２×λ／ＮＡと定義する。このとき、以下の式（１）で表される直径Ｒの円を対物開口ＯＡの任意の位置に配置した場合、対物開口ＯＡはこの円を内包しない大きさであることが好ましい。

Ｒｎ＝Ｒ／（ＮＡ×ｆ） … （１）
ここで、式（１）を満たす直径Ｒは、以下の式（１ａ）のように表すことができる。

Ｒ＝０．１２×ｆλ … （１ａ）
図３（ａ）は、直径Ｒの円Ｃを対物開口ＯＡの任意の位置に配置しても、円Ｃは対物開口ＯＡに内包されない場合を示している。一方、図３（ｂ）は、直径Ｒの円Ｃを対物開口ＯＡのある位置に配置すると、対物開口ＯＡに内包される場合を示している。

ここで、式（１）のＲｎは、対物レンズ１０４の瞳径（ＮＡ×ｆ）で規格化されたＲである。Ｒｎはエアリーディスクの第一暗環により決定される。本実施形態において、想定している物体直径ｄは２０μｍである。このため、照明光による物体の回折角θは、以下の式（２）ように表すことができる。

２ｓｉｎθ＝２．４４×λ／ｄ≒０．１２×λ … （２）
このとき、対物レンズ１０４の瞳面上での回折光の広がりは、２ｓｉｎθ×ｆとして表される。このため、対物レンズ１０４の瞳径ＮＡ×ｆで規格化した回折光の広がりＤは、以下の式（３）ように表される。式（３）で表されるＤは、前述のＲｎに等しい。

Ｄ＝（２ｓｉｎθ×ｆ）／（ＮＡ×ｆ）
＝０．１２×λ／ＮＡ … （３）
式（１）を満たす直径Ｒの円を対物開口ＯＡの任意の位置に配置した場合に直径Ｒの円が対物開口ＯＡに内包されないということは、物体の直径が２０μｍ程度の大きな物体から生じる低次の回折光でも遮光することができることを意味する。このため、式（１）を満たすことにより、位相差観察装置１０は定量的に像を再現することができる。本実施形態において、位相差観察装置１０は、回折光を遮光することによりコントラストを得る。定量的な像を得るには、式（１）を満たすことにより様々な周波数成分の回折光を均等に遮光することが好ましい。

更に、Ｒｎ＝０．０６×λ／ＮＡと定義することがより好ましい。

また、分解能やコントラストの高い像を得るため、対物レンズ１０４の瞳領域（瞳の面積）に対する対物開口ＯＡの割合をＡｒ（％）とするとき、以下の式（４）を満たすことが好ましい。

２０＜Ａｒ＜８０ … （４）
式（４）の下限を超えると、回折光を遮光する割合が大きくなり過ぎ、直接光と回折光とが干渉せずに分解能の高い像を得ることができない。一方、式（４）の上限を超えると、回折光を遮光する割合が小さくなり過ぎ、コントラストの高い像が得られない。

更に好ましくは、式（４）の範囲を、以下の式（４ａ）のように設定する。

４０＜Ａｒ＜６０ … （４ａ）

続いて、図４および図５を参照して、本発明の実施例１における位相差観察装置について説明する。

一般的な位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡と本実施例の位相差観察装置における主に相違点は、対物レンズ１０４内に配置された対物開口ＯＡと照明光学系１０１内に配置された照明開口ＩＡの構成である。このため、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡを変更した場合の効果について、シミュレーション結果を用いて説明する。シミュレーションは、単波長の光源１００を用いて行い、光源１００の波長λを０．５５μｍとしている。また試料１０３としては、直径２０μｍ程度の細胞を想定し、背景との位相差がλ／２となるように設定している。

図４および図５は、開口数ＮＡが０．２の場合におけるシミュレーション結果である。図４は、一般的な暗視野顕微鏡のシミュレーション結果であり、図４（ａ）の上段および下段は、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡの構成図をそれぞれ示す。図４（ｂ）は、シミュレーションの二次元画像を示す。図４（ｃ）は、図４（ｂ）の物体像（光学像）の断面図を示し、縦軸は像の強度、横軸は位置である。図４を見てわかるように、一般的な暗視野顕微鏡では、複数の対物開口ＯＡはなく、対物レンズ１０４に直接光が入射しないように大きな開口数で照明している。図４（ｃ）を見てわかるように、一般的な暗視野顕微鏡では、試料の境界だけが強調された像を形成し、定性的な観察しかできない。

図５は、本実施例における位相差観察装置１０のシミュレーション結果である。図５（ａ）の上段および下段は、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡの構成図をそれぞれ示す。図５（ｂ）は、シミュレーションの二次元画像を示す。図５（ｃ）は、図５（ｂ）の物体像（光学像）の断面図を示し、縦軸は像の強度、横軸は位置である。図５（ａ）に示されるように、対物開口ＯＡは光軸ＡＸを中心として５°の角度で放射状に延びるように、また対物レンズ１０４の瞳の面積に対する対物開口ＯＡの割合Ａｒが５０％となるように設定されている。放射状に延びた対物開口ＯＡのそれぞれの円弧の長さは０．０８７であり、式（１）の右辺は０．３４である。このため、直径Ｒの円は、対物開口ＯＡの任意の位置に配置しても対物開口ＯＡに内包されない。図５（ｃ）を見てわかるように、本実施例の位相差観察装置によれば、一般的な暗視野顕微鏡と比較して、試料中心に像の強度があり、試料の定量的な可視化が可能である。

次に、図６を参照して、本発明の実施例２における位相差観察装置について説明する。図６は、開口数ＮＡが０．２の場合における本実施例の位相差観察装置のシミュレーション結果である。なお、実施例１と同様の部分についての説明は省略する。

図６（ａ）の上段および下段は、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡのそれぞれの構成図を示す。図６（ｂ）は、シミュレーションの二次元画像を示す。図６（ｃ）は、図６（ｂ）の物体像（光学像）の断面図を示し、縦軸は像の強度、横軸は位置である。図６（ａ）に示されるように、対物開口ＯＡは多重輪帯となるように、また対物レンズ１０４の瞳の面積に対する対物開口ＯＡの割合Ａｒは３０％となるように設定されている。多重輪帯である対物開口ＯＡのそれぞれの輪帯幅は０．０５であり、式（１）の右辺は０．３４である。このため、直径Ｒの円は、対物開口ＯＡの任意の位置に配置しても対物開口ＯＡに内包されない。図６（ｃ）を見てわかるように、本実施例の位相差観察装置によれば、一般的な暗視野顕微鏡と比較して、試料の中心に像の強度があり、試料の定量的な可視化が可能である。

次に、図７を参照して、本発明の実施例３における位相差観察装置について説明する。図７は、開口数ＮＡが０．７の場合における本実施例の位相差観察装置のシミュレーション結果である。なお、実施例１と同様の部分についての説明は省略する。

図７（ａ）の上段および下段は、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡのそれぞれの構成図を示す。図７（ｂ）は、シミュレーションの二次元画像を示す。図７（ｃ）は、図７（ｂ）の物体像（光学像）の断面図であり、縦軸は像の強度、横軸は位置である。図７（ａ）に示されるように、対物開口ＯＡはランダムドットとなるように、また対物レンズ１０４の瞳の面積に対する対物開口ＯＡの割合Ａｒが６０％となるように設定されている。ランダムドットである対物開口ＯＡのそれぞれのドットの径は０．０２５であり、式（１）の右辺は０．０９４である。このため、直径Ｒの円は、対物開口ＯＡの任意の位置に配置しても対物開口ＯＡに内包されない。図７（ｃ）を見てわかるように、本実施例の位相差観察装置によれば、一般的な暗視野顕微鏡と比較して、試料中心に像の強度があり、定量的な可視化が可能である。

次に、図８を参照して、本発明の実施例４における位相差観察装置について説明する。図８は、開口数ＮＡが０．７の場合における本実施例の位相差観察装置のシミュレーション結果である。本実施例において、試料１０３は直径２０μｍ程度の細胞中に屈折率の異なる構造Ｓ＿Ａ、Ｓ＿Ｂを有する。構造Ｓ＿Ａ、Ｓ＿Ｂは、それぞれ、背景との位相差がλ／２の細胞に対して位相差量が４０％、６０％小さくなる構造である。なお、実施例１と同様の部分についての説明は省略する。

図８（ａ）の上段および下段は、対物開口ＯＡおよび照明開口ＩＡのそれぞれの構成図を示す。図８（ｂ）は、シミュレーションの二次元画像を示す。図８（ｃ）は、図８（ｂ）の物体像（光学像）の断面図を示し、縦軸は像の強度、横軸は位置である。図８（ａ）に示されるように、対物開口ＯＡは光軸ＡＸを中心として２．５°の角度で放射状に延びるように、また対物レンズ１０４の瞳の面積に対する対物開口ＯＡの割合Ａｒが５０％となるように設定されている。放射状に延びた対物開口ＯＡのそれぞれの円弧の長さは０．０４４であり、式（１）の右辺は０．０９４である。このため、直径Ｒの円は、対物開口ＯＡの任意の位置に配置しても対物開口ＯＡに内包されない。

図８（ｃ）を見てわかるように、位相差量がλ／２となる細胞に対して、位相差量が４０％小さくなる構造Ｓ＿Ａ、６０％小さくなる構造Ｓ＿Ｂの像強度の大小関係が同じで定量化されている。この点、一般的な位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡では、位相差量の大小関係と像強度の大小関係が一致しない。また、図８（ｃ）の像強度から、位相差量分布を推定することができる。位相差量分布は、例えば、位相変化量が既知の試料を用いて取得したデータから推定することができる。

各実施例によれば、簡易な構成で物体の定量的な観察が可能な位相差観察装置を提供することができる。

以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことはいうまでもなく、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。例えば、各実施例は撮像素子に結像するように構成されているが、接眼レンズを用いて目で観察可能に構成してもよい。また各実施例では、透過照明を用いているが、落射照明を用いてもよい。

１０ 位相差観察装置
１０１ 照明光学系
１０２ 開口絞り
１０４ 対物レンズ
１０５ 対物開口絞り

Claims (12)

1. 光源からの光を被照射面に導く照明光学系と、
   前記被照射面の光学像を形成する結像光学系と、
   前記照明光学系の内部に設けられた第１の開口絞りと、
   前記結像光学系の内部に設けられた第２の開口絞りと、を有し、
   前記第２の開口絞りは、前記第１の開口絞りを通過した直接光を通過させ、前記被照射面からの回折光の一部を遮光する、ことを特徴とする位相差観察装置。
2. 前記第２の開口絞りは、前記直接光の９０％以上を通過させ、前記回折光の２０％以上かつ８０％以下を遮光することを特徴とする請求項１に記載の位相差観察装置。
3. 前記第２の開口絞りは、開口部および遮光部を備え、
   前記光源からの前記直接光は、前記開口部を通過し、
   前記被照射面からの前記回折光の一部は、前記遮光部で遮光されることを特徴とする請求項１または２に記載の位相差観察装置。
4. 前記被照射面から前記第２の開口絞りの前記開口部までの合成焦点距離をｆ、前記光源から出射する光の最大波長をλ（μｍ）として、Ｒ＝０．１２×ｆλを満たす直径Ｒの円を前記第２の開口絞りの前記開口部の任意の位置に配置した場合、該開口部は該円を内包しない大きさであることを特徴とする請求項３に記載の位相差観察装置。
5. 前記結像光学系の瞳領域に対する前記第２の開口絞りの前記開口部の割合をＡｒ（％）とするとき、
   ２０＜Ａｒ＜８０
   を満たすことを特徴とする請求項３または４に記載の位相差観察装置。
6. 前記第２の開口絞りの前記開口部は、前記結像光学系の光軸を中心として放射状に延びた形状を有する複数の開口を有することを特徴とする請求項３乃至５のいずれか１項に記載の位相差観察装置。
7. 前記複数の開口のそれぞれは、前記光軸を中心とした円の周方向よりも径方向に長い形状を有することを特徴とする請求項６に記載の位相差観察装置。
8. 前記第１の開口絞りには、単一または複数の開口部が形成されていることを特徴とする請求項３乃至７のいずれか１項に記載の位相差観察装置。
9. 前記第２の開口絞りの前記開口部および前記遮光部は、前記第１の開口絞りの前記開口部と共役な位置に設けられていることを特徴とする請求項８に記載の位相差観察装置。
10. 前記第１の開口絞りは、可変開口絞りであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の位相差観察装置。
11. 前記結像光学系は、対物レンズを有することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の位相差観察装置。
12. 前記光学像を光電変換して画像信号を出力する撮像素子と、
    前記画像信号に基づいて観察対象の位相差量分布を算出する画像処理手段と、を更に有することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の位相差観察装置。