JP6673552B2

JP6673552B2 - ラマン分光顕微鏡及びラマン散乱光観察方法

Info

Publication number: JP6673552B2
Application number: JP2016543813A
Authority: JP
Inventors: 克昌藤田; 河田　聡; 聡河田; 梢渡辺
Original assignee: Nanophoton Corp
Current assignee: Nanophoton Corp
Priority date: 2014-08-18
Filing date: 2015-08-18
Publication date: 2020-03-25
Anticipated expiration: 2035-08-18
Also published as: EP3184992A1; EP3184992A4; JPWO2016027453A1; US10352862B2; WO2016027453A1; EP3184992B1; US20170276610A1

Description

本発明は、ラマン分光顕微鏡及びラマン散乱光観察方法に関する。

観察対象物の微細構造の観察手法として、ラマン分光顕微鏡が知られている。ラマン分光顕微鏡は、分子や結晶格子の振動数を計測しながら空間分布も取得できるため、材料工学、医療診断、創薬といった幅広い分野に適用できる。こうした光学的な観察手法では、一般に、観察の空間分解能は照明光の波動性により制限される。

空間分解能を向上させる手法として、構造化照明（例えば、特許文献１）の導入が知られている。また、空間分解能を向上させる手法として、ライン照明の導入も有効であることが報告されている（例えば、非特許文献２及び３）。これらの文献では、照明光の照射位置をシフトさせた観察結果を合成することで蛍光顕微鏡の空間分解能を向上させる手法も提案されている（非特許文献１、２及び３）。

国際公開第２０１３／１０８６２６号

M. G. L. Gustafsson, "Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy", 2000, Journal of Microscopy, vol. 198, Issue 2, pp. 82-87. Taejoong Kim, et al., "Enhancement of fluorescence confocal scanning microscopy lateral resolution by use of structured illumination", 2009, Measurement Science and Technology, Volume 20, 055501. Ondrej Mandula, et al., "Line scan--structured illumination microscopy super-resolution imaging in thick fluorescent samples", 8 Oct 2012, OPTICS EXPRESS , Vol. 20, No. 22, pp. 24168-24174.

しかし、発明者らは、上述で説明した手法には以下に示す問題点が有ることを見出した。上述の手法では、ラマン分光顕微鏡における観察の空間分解能の向上については触れられていない。そのため、ラマン分光顕微鏡において、如何にして観察の空間分解能を向上させ得るかは明らかでない。

本発明は上述の事情に鑑みて成されたものであり、本発明の目的は、ラマン分光顕微鏡において光の回折限界を超える空間分解能を実現することである。

その他の課題と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。

本発明の第１の態様であるラマン分光顕微鏡は、光源と、前記光源が出力する光を回折させ、回折光を生じさせる回折素子と、入射する光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得する分光器と、前記回折素子で生じた前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光を、前記干渉光による干渉縞と直交する第１の方向を長手方向とするライン照明光として観察対象物に照射するとともに、前記ライン照明光が観察対象物に照射されて生じたラマン散乱光を前記分光器へ導く光学系と、前記ライン照明によって、観光察対象物を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査させる制御部と、を備えるものである。これにより、ライン照明光の第１の方向に＋１次回折光と−１次回折光との干渉縞を生じさせることができる。その結果、光の回折限界を超えて第１の方向に解像可能な空間周波数を大きくすることができる。

本発明の第２の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記制御部は、前記第２の方向のサンプリング間隔が前記ライン照明光の前記第１の方向の強度分布に現れる空間周波数と一致するように、前記ライン照明光に観察対象物を走査させるものである。これにより、第１及び第２の方向で空間周波数が一致した観察対象物の２次元像を取得することができる。

本発明の第３の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記分光器は、前記ラマン散乱光が入射するスリットと、前記スリットを介して入射した前記ラマン散乱光が撮像面に結像する撮像素子と、を備え、前記撮像素子が撮像を行うことにより、前記前記ラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得するものである。これにより、ライン照明部位からのラマン散乱光を同時に取得できる。

本発明の第４の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記制御部は、観察対象物に対する前記ライン照明光の照射位置を保ったまま、前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光によって生じる干渉縞の位相を多段階に変化させ、変化させた前記干渉縞の位相のそれぞれについて得られる複数の前記分光スペクトルの光強度の空間分布を合成して、当該照射位置における分光スペクトルの光強度の空間分布を生成するものである。これによれば、観察対象物の２次元像における第１の方向の空間分解能をさらに向上させることができる。

本発明の第５の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記制御部は、前記分光器が取得した前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布を取得し、前記光強度の空間分布に現れる空間周波数が均一となるように、光強度の空間分布の空間ピッチを補正するものである。これにより、分光器が取得した前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布の分光器の収差に起因する歪みを補正し、観察対象物の正確な２次元像を取得することができる。

本発明の第６の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記制御部は、前記分光器から取得した前記光強度の空間分布を複数の区間に分割し、前記複数の区間のそれぞれについて、光強度の空間分布に現れる空間周波数を取得し、前記複数の区間のそれぞれの空間周波数が所定の基準値に一致するように、前記複数の区間のそれぞれの光強度分布の空間ピッチを補正し、空間ピッチを補正した前記複数の区間の光強度の空間分布を合成して、分光スペクトルの光強度の空間分布を補正するものである。これにより、各区間の空間周波数に基づいて、各区間の空間ピッチの補正を具体的に行うことが可能である。

本発明の第７の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記光源から前記回折素子に入射する光は、平行光であるものである。これにより、ラマン分光で用いられる光源からの光強度の大きい光が回折素子で収束しないようにでき、回折素子の劣化を防止することができる。

本発明の第８の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、試料の深さ方向に対して干渉縞が生成されるように、＋１次回折光及び−１次回折光の位相に対して、前記回折素子で生じた０次回折光の位相及び強度を調整して、＋１次回折光、−１次回折光干渉及び０次回折光を干渉させるものである。これにより、試料の深さ方向にも干渉縞して、試料の深さ方向の空間分解能を向上させることができる。

本発明の第９の態様であるラマン分光顕微鏡は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記光源と前記回折素子との間又は前記光学系に設けられ、通過する光のビーム断面形状を変化させるビーム断面変換器を更に備えるものである。これにより、回折素子の刻線数が固定されている場合でも、試料に照明光を照射する対物レンズの瞳に、所望の回折光を入射させることができる。

本発明の第１０の態様であるラマン散乱光観察方法は、光源が出力する光を、回折素子により回折させ、回折光を生じさせ、前記回折素子で生じた前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光を、前記干渉光による干渉縞と直交する第１の方向を長手方向とするライン照明光として観察対象物に照射し、前記ライン照明光によって、観察対象物を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査させ、前記ライン照明光が観察対象物に照射されて生じたラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得するものである。これにより、ライン照明光の第１の方向に＋１次回折光と−１次回折光との干渉縞を生じさせることができる。その結果、光の回折限界を超えて第１の方向に解像可能な空間周波数を大きくすることができる。

本発明の第１１の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン散乱光観察方法であって、前記第２の方向のサンプリング間隔が前記ライン照明光の前記第１の方向の強度分布に現れる空間周波数と一致するように、前記ライン照明光に観察対象物を走査させるものである。これにより、第１及び第２の方向で空間周波数が一致した観察対象物の２次元像を取得することができる。

本発明の第１２の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン散乱光観察方法であって、前記ラマン散乱光をスリットに入射させ、前記スリットを介して入射した前記ラマン散乱光を撮像素子の撮像面に結像させ、前記撮像素子が撮像を行わせることで、前記前記ラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得するものである。これにより、ライン照明部位からのラマン散乱光を同時に取得できる。

本発明の第１３の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン散乱光観察方法であって、観察対象物に対する前記ライン照明光の照射位置を保ったまま、前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光によって生じる干渉縞の位相を多段階に変化させ、変化させた前記干渉縞の位相のそれぞれについて得られる複数の前記分光スペクトルの光強度の空間分布を合成して、当該照射位置における分光スペクトルの光強度の空間分布を生成するものである。これによれば、観察対象物の２次元像における第１の方向の空間分解能をさらに向上させることができる。

本発明の第１４の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン散乱光観察方法であって、前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布に現れる空間周波数が均一となるように、光強度の空間分布の空間ピッチを補正するものである。これにより、分光器が取得した前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布の分光器の収差に起因する歪みを補正し、観察対象物の正確な２次元像を取得することができる。

本発明の第１５の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン散乱光観察方法であって、前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布を複数の区間に分割し、前記複数の区間のそれぞれについて、光強度の空間分布に現れる空間周波数を取得し、前記複数の区間のそれぞれの空間周波数が所定の基準値に一致するように、前記複数の区間のそれぞれの光強度分布の空間ピッチを補正し、空間ピッチを補正した前記複数の区間の光強度の空間分布を合成して、分光スペクトルの光強度の空間分布を補正するものである。これにより、各区間の空間周波数に基づいて、各区間の空間ピッチの補正を具体的に行うことが可能である。

本発明の第１６の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記光源から前記回折素子に入射する光は、平行光であるものである。これにより、ラマン分光で用いられる光源からの光強度が大きい光が回折素子で収束しないようにでき、回折素子の劣化を防止することができる。

本発明の第１７の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン分光顕微鏡であって、試料の深さ方向に対して干渉縞が生成されるように、＋１次回折光及び−１次回折光の位相に対して、前記回折素子で生じた０次回折光の位相及び強度を調整して、＋１次回折光、−１次回折光干渉及び０次回折光を干渉させるものである。これにより、試料の深さ方向にも干渉縞して、試料の深さ方向の空間分解能を向上させることができる。

本発明の第１８の態様であるラマン散乱光観察方法は、上述のラマン分光顕微鏡であって、前記回折素子の前記光源側又は前記回折素子の前記光源とは反対側に、通過する光のビーム断面形状を変化させるビーム断面変換器が前記回折素子と離隔して設けられるものである。これにより、回折素子の刻線数が固定されている場合でも、試料に照明光を照射する対物レンズの瞳に、所望の回折光を入射させることができる。

本発明によれば、ラマン分光顕微鏡において光の回折限界を超える空間分解能を実現することができる。

実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡の基本構成を模式的に示すブロック図である。実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡の構成を模式的に示す上面図である。実施の形態１にかかる光学系の一部の構成を光源側から見た場合の斜視図である。実施の形態１にかかる光学系に含まれる照明光学系の構成を模式的に示す横面図である。観察対象物上でのライン照明光の照射位置を模式的に示す要部拡大図である。観察対象物上でのライン照明光の強度分布を模式的に示す図である。図４の対物レンズ及び観察対象物を含む領域Ａの拡大図である。対物レンズの手前での回折光の集光位置（図７のＢ−Ｂ線）における回折光を光源側から観察した例を示す図である。実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡（実施例１）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例１）での試料の観察像を示す図である。実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡（実施例２）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例２）での試料の観察像を示す図である。図１０の破線で囲んだ領域の拡大図である。図１１の線ＬＡ１２−ＬＡ１２（比較例２）及び線ＬＢ１２−ＬＢ１２（実施例２）における波数３０５５ｃｍ^−１のラマン光強度を示す図である。実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡（実施例３）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例３）での試料の観察像を示す図である。図１３の線ＬＡ１４−ＬＡ１４（比較例３）及び線ＬＢ１４−ＬＢ１４（実施例３）における波数１３０７−１３８７ｃｍ^−１（Ｄバンド）の平均ラマン光強度を示す図である。実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡（実施例４）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例４）での試料の観察像を示す図である。図１５の点ｉ及びｉｉにおけるラマン光スペクトルを示す図である。ＣＨ基（炭化水素基）の伸縮に対応するピーク（２８４８ｃｍ^−１、２８８４ｃｍ^−１及び２９３０ｃｍ^−１）における比較例４（図１５の線ＬＡ１７−ＬＡ１７）及び実施例４（図１５の線ＬＡ１７−ＬＡ１７）のラマン光強度分布を示す図である。測定された干渉縞の空間周波数のズレを示すグラフである。図１８に示す干渉縞の空間周波数のズレとそのＸ軸上の位置との関係を示した図である。実施の形態２にかかるラマン分光顕微鏡の光強度分布の歪みを補正する動作を示すフローチャートである。分割した各区間の光強度分布に現れる空間周波数をプロットした図である。図２１のプロット結果に基づいたピクセルサイズの補正を示すグラフである。実施の形態２にかかるラマン分光顕微鏡において歪みを補正した後の光強度分布を示す図である。図２３に示す補正後光強度分布から得られる光強度の２次元分布を示す図である。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。各図面においては、同一要素には同一の符号が付されており、必要に応じて重複説明は省略される。

実施の形態１
実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡について説明する。図１は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００の基本構成を模式的に示すブロック図である。図２は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００の構成を模式的に示す上面図である。図３は、実施の形態１にかかる光学系３の一部の構成を光源１側から見た場合の斜視図である。

図１〜３、以下の図および説明では、ミラーなどによる光の反射にかかわらず、照明光またはラマン散乱光の進行方向をＺ軸、Ｚ軸に垂直な方向をＸ軸、Ｚ軸とＸ軸の両方に垂直となる方向をＹ軸とする。図２では紙面に対して垂直な方向がＸ軸である。また、Ｘ軸方向を第１の方向、Ｙ軸方向を第２の方向とも称する。

光源１は、単色光源であり、例えば連続発振レーザ装置が用いられる。光源１は、レーザ光Ｌを回折格子２へ出力する。この際、レーザ光Ｌは、平行光として回折格子２に入射する。一般にラマン分光顕微鏡では、比較的高出力のレーザ光が用いられる。高出力のレーザを回折格子に収束させると、回折格子の破損、劣化が生じるおそれがある。そこで、本実施の形態では、レーザ光Ｌを平行光として回折格子２に入射させることで、回折格子の破損、劣化を防止することができる。

回折格子２は、Ｙ軸に沿った方向（水平方向）を長手方向とするスリット、もしくは屈折率分布が刻まれた構造を有する回折素子である。これにより、回折光が生じる。以下では、０次回折光、＋１次回折光、−１次回折光に着目して説明する。回折格子２からは、Ｚ軸方向に直進する０次回折光と、Ｘ−Ｚ平面内で所定角度だけ回折した＋１次回折光及び−１次回折光とが生じ、光学系３に入射する。０次回折光、＋１次回折光及び−１次回折光を含む光を、照明光Ｌｄと表記する。

光学系３は、照明光を導き、ライン照明光ＬＬとして観察対象物１０に照射する。また、光学系３は、ライン照明光ＬＬが観察対象物１０に照射されて発生するラマン散乱光Ｌｒを、分光器４に導く。すなわち、光学系３は、照明光を観察対象物に導く照明光学系としての機能と、観察対象物に照射されて発生するラマン散乱光を分光器に導く結像光学系としての機能とを併せ持つものである。

光学系３は、シリンドリカルレンズＣＬ１〜ＣＬ３、レンズＬ１〜Ｌ４、対物レンズＯＬ、遮光板３１、エッジフィルタ３２、ガルバノミラー３３、ミラー３４を有する。

図４は、実施の形態１にかかる光学系３に含まれる照明光学系の構成を模式的に示す横面図である。図２では、光学系３での光路は屈曲しているが、照明光学系の理解を容易にするため、図４では照明光学系の構成要素を直線上に並べて表示している。図４では、＋１次回折光を実線で示し、−１次回折光を短鎖線で示している。また、照明光の光軸を長鎖線で示している。また、図４では、エッジフィルタ３２、ガルバノミラー３３及びミラー３４を省略している。

まず、照明光学系に注目して、光学系３の構成を説明する。

シリンドリカルレンズＣＬ１は、曲面が回折格子２に向くように設けられ、照明光Ｌｄの光路をＸ−Ｚ平面内で屈折させる。照明光Ｌｄは、シリンドリカルレンズＣＬ１によってＹ軸に沿う方向を長手方向とする帯状の領域を照明するように成形される。

遮光板３１は、照明光Ｌｄに含まれる０次回折光及び±２次以上の高次回折光を遮光する。遮光板３１は、＋１次回折光と−１次回折光とを通過させるＹ軸方向を長手方向とするスリットを有し、＋１次回折光と−１次回折光とを含むライン照明光ＬＬを出射する。

シリンドリカルレンズＣＬ２は、曲面がシリンドリカルレンズＣＬ３に向くように設けられ、ライン照明光ＬＬの光路をＸ−Ｚ平面内で屈折させる。

シリンドリカルレンズＣＬ３は、シリンドリカルレンズＣＬ２を通過したライン照明光ＬＬの光路をＹ−Ｚ平面内で屈折させる。

レンズＬ１は、シリンドリカルレンズＣＬ３により収束され、その後拡散したライン照明光ＬＬが入射する。ライン照明光ＬＬは、レンズＬ１によりＹ−Ｚ平面上で平行光となる。

レンズＬ１を通過したライン照明光ＬＬは、エッジフィルタ３２により反射され、レンズＬ２に入射する。レンズＬ２を通過したライン照明光ＬＬは、ミラー３４で反射されて、レンズＬ３に入射する。レンズＬ３を通過したライン照明光ＬＬはＹ−Ｚ平面上で平行光となり、対物レンズＯＬに入射する。

対物レンズＯＬは、ライン照明光ＬＬを観察対象物１０上にライン状に集光させる。図５は、観察対象物１０上でのライン照明光ＬＬの照射位置を模式的に示す要部拡大図である。図５に示すように、ライン照明光ＬＬは、観察対象物１０で鉛直方向（Ｘ軸方向）を長手方向とする領域に照射される。

観察対象物１０に結像されたライン照明光ＬＬは、＋１次干渉光と−１次干渉光とが干渉することで、Ｘ軸方向で明暗が反復する干渉縞が現れる。図６は、観察対象物１０上でのライン照明光ＬＬの強度分布を模式的に示す図である。図６に示すように、ライン照明光は、鋭いピークがＸ軸方向に反復して連続する干渉縞が現れる。すなわち、ライン照明光ＬＬは、干渉縞による光強度分布を有する構造化照明光として、観察対象物１０に照射される。

回折限界に近い細かさの構造をもつ照明パターンで試料を照明することにより、結像される情報の空間周波数をシフトさせ、回折限界を超えた空間周波数を持つ像を受光面上に結像することができる。

図７は、図４の対物レンズＯＬ及び観察対象物１０を含む領域Ａの拡大図である。図８は、対物レンズＯＬの手前での回折光の集光位置（図７のＢ−Ｂ線）における回折光を光源側から観察した例を示す図である。本実施の形態では、回折光の集光位置（Ｂ−Ｂ線）における回折光（図８の符号ＤＬ１＿１及びＤＬ＿−１）による２本のラインの長さＬｙ、間隔ｄ及び収束角度θを適当な値にする必要が有る。２本のラインの長さＬｙは、構造化照明光の開口数（ＮＡ）を決定する。２本のラインの間隔ｄは、ライン照明光ＬＬに現れる干渉縞のピッチを決定する。２本のラインへの収束角度θは、ライン照明光の長さを決定する。

対物レンズＯＬの瞳にできる回折光による２本のラインの長さ、間隔及び収束角度は、回折格子２により決定することができる。しかし、一般に入手可能な回折格子の刻線数は３００、６００又は１２００など、離散的な値である。そのため、上記光学系に最適な回折格子を得るためには、使用する対物レンズにあわせて専用の回折格子を設計する必要が有る。その結果、回折格子の入手に大きなコストが必要となってしまう。

これに対し、本実施の形態では、回折格子２の後にそれぞれ焦点距離の異なる２枚のシリンドリカルレンズＣＬ１及びＣＬ２を挿入し、シリンドリカルレンズＣＬ２とシリンドリカルレンズＣＬと３を、光軸（Ｚ軸）を回転軸として相対的に９０°回転させて配置している。これにより、シリンドリカルレンズＣＬ１及びＣＬ２は、ビーム断面変換器として、通過する光のビーム断面を拡大、縮小したり、ビーム断面形状を楕円に変換することができる。その結果、回折格子２の刻線数が所定の値に固定されていても、シリンドリカルレンズＣＬ２及びＣＬ３により、対物レンズＯＬの瞳にできる回折光による２本のラインの長さ、間隔及び収束角度を最適化することができる。なお、上記では、回折格子２の後にビーム断面変換器を配置したが、ビーム断面変換器は、光源１と回折格子２との間に配置されてもよい。なお、ビーム断面変換器は、上記のシリンドリカルレンズのペア以外にも、アナモルフィックプリズムのペアで構成することもできる。

次いで、結像光学系に注目して、光学系３の構成を説明する。

観察対象物１０で生じたラマン散乱光Ｌｒは、対物レンズＯＬに入射する。ラマン散乱光Ｌｒは、ライン照明光ＬＬとは逆の経路、すなわち対物レンズＯＬ、レンズＬ３、ミラー３４、レンズＬ２、ガルバノミラー３３を経て、エッジフィルタ３２に達する。

エッジフィルタ３２は、ラマン散乱光Ｌｒを透過するように設計されている。エッジフィルタ３２を通過したラマン散乱光Ｌｒは、レンズＬ４で収束され、分光器４に入射する。

分光器４は、ラマン散乱光Ｌｒを分光分析する。分光器４は、スリット４０、凹面ミラー４１及び４２、分散素子４３、検出部４４を有する。分光器４のスリット４０に入射したラマン散乱光Ｌｒは、凹面ミラー４１で平行光に変換され、分散素子４３に入射する。

分散素子４３は、例えば回折格子やプリズムなどを用いることが可能である。分散素子４３は、ラマン散乱光Ｌｒを分光し、分光した光を凹面ミラー４２へ出射する。凹面ミラー４２は、分光された光が検出部４４で結像するように収束させる。

検出部４４は、例えば、分光されたラマン散乱光Ｌｒを検出する撮像素子（Charge Coupled Device Image sensor：ＣＣＤイメージセンサ、Complementary Metal Oxide Semiconductor Image Sensor：ＣＭＯＳイメージセンサ、など）を有する。この撮像素子上には、分光された波長の異なるラマン散乱光が空間的に隔離して結像する。よって、撮像素子で撮像を行うことで、ラマン散乱光Ｌｒの分光スペクトルを得ることができる。この際、撮像した画像のＸ軸方向がライン照明の長手方向に対応するので、観察対象物１０の鉛直方向（Ｘ軸方向）の空間情報（光強度分布）が得られる。これに対し、Ｙ軸方向にはラマン散乱光の分光スペクトルが分布することとなる。分光器４は、分光結果（分光スペクトル、各スペクトルの光強度分布）を、信号ＤＥＴとして制御部５に出力することができる。

制御部５は、ラマン分光顕微鏡１００の動作を制御する。具体的には、光学系３のガルバノミラー３３の動きを制御信号ＣＯＮにより制御することで、ライン照明光ＬＬにより観察対象物１０をＹ軸方向（図５に示す矢印）に走査することができる。

次いで、ラマン分光顕微鏡１００の動作について説明する。

ラマン分光顕微鏡１００は、観察対象物１０に対してライン照明光ＬＬを照射する。上述の通り、分光器４での分光結果から、ライン照明光ＬＬが照射される位置の観察対象物１０からのラマン散乱光ＬｒのＸ軸方向の光強度分布を得ることができる。

また、ラマン分光顕微鏡１００は、図５の矢印に示すように、観察対象物１０をＹ軸に方向にライン照明光ＬＬで走査する。これにより、観察対象物１０のＹ軸方向の光強度分布を取得することが可能である。

以上、構造化照明を導入したライン照明と走査を組み合わせることで、観察対象物のＸ−Ｙ平面におけるラマン散乱光の２次元光強度分布を取得することができる。これにより、ラマン分光顕微鏡１００は、観察対象物の２次元像を取得することができる。

ラマン分光顕微鏡１００では、観察対象物１０の２次元像において、Ｙ軸方向の分解能とＸ軸方向の分解能とが一致することが望ましい。ラマン分光顕微鏡１００では、Ｘ軸方向とＹ軸方向の分解能のトレードオフ関係が、回折格子２による入射光の回折角度によって決定する。制御部５がガルバノミラー３３の回転速度又は回転ピッチなどを制御することで、ライン照明光のＹ軸方向の走査速度又は走査ピッチを制御できる。すなわち、回折格子２の刻線数を適切に選び、制御部５は、観察対象物１０の２次元像において、Ｙ軸方向の分解能とＸ軸方向の分解能とが一致するように、走査速度又はピッチを制御することでＸ軸・Ｙ軸の分解能を一致させることが可能である。

また、ラマン分光顕微鏡１００では、回折格子２をピエゾアクチュエータなどによってＸ軸に沿って移動可能とし、制御部５によって、その位置を駆動することで、ライン照明光ＬＬの干渉縞の位相を多段階（例えば３段階）に変化させることができる。これによれば、位相変化により、干渉縞の間隔よりも小さな範囲で干渉縞を変化させることができる。そして、変化させた干渉縞の位相のそれぞれについて得られる複数の分光スペクトルの光強度の空間分布を波長毎にフーリエ変換処理し、それらを周波数空間で合成した後に逆フーリエ変換を行うことで、照射位置における分光スペクトルの光強度の空間分布を生成できる。これにより、通常のスリット共焦点型ラマン分光顕微鏡に比べ、観察対象物のＸ軸方向の空間分解能を向上させることが可能となる。

実施例１
図９は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００（実施例１）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例１）での試料の観察像を示す図である。図９は、直径５００ｎｍのポリスチレン微小球のラマン画像（１００３ｃｍ^−１）を示している。比較例では、構造化照明を用いないスリット共焦点ラマン顕微鏡を使用した。図９からわかるように、ラマン分光顕微鏡１００では、通常のスリット共焦点ラマン顕微鏡と比べて、ポリスチレン微小球の像がより高解像度で得られることが確認できる。

実施例２
図１０は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００（実施例２）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例２）での試料の観察像を示す図である。図１０は、ガラス基板上の直径５００〜８００ｎｍのポリスチレン及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）微小球混合体の波数３０５５ｃｍ^−１及び２９５７ｃｍ^−１におけるラマン画像を示している。比較例２では、構造化照明を用いないスリット共焦点ラマン顕微鏡を使用した。図１０の陰影の明るい微小球はポリスチレン微小球であり、陰影の暗い微小球はＰＭＭＡ微小球である。図１０からわかるように、ラマン分光顕微鏡１００では、通常のスリット共焦点ラマン顕微鏡と比べて、微小球の像がより高解像度で得られることが確認できる。

図１１は、図１０の破線で囲んだ領域の拡大図である。図１２は、図１１の線ＬＡ１２−ＬＡ１２（比較例２）及び線ＬＢ１２−ＬＢ１２（実施例２）における波数３０５５ｃｍ^−１のラマン光強度を示す図である。図１２では、実施例２を実線で示し、比較例２を破線で示している。２つの微小球に着目すると、図１２に示すように、比較例２では２つの微小球に対応するピークはオーバーラップしている。これに対し、実施例２においては、２つの微小球の間の間隙が明瞭に表れていることが確認できる。つまり、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００によれば、一般的なラマン分光顕微鏡と比べて微細構造の観察における空間分解能を向上できることが理解できる。

実施例３
図１３は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００（実施例３）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例３）での試料の観察像を示す図である。図１３は、単層グラフェン、２層グラフェン、グラファイト及びこれらに生じた欠陥を示している。比較例３では、構造化照明を用いないスリット共焦点ラマン顕微鏡を使用した。図１３からわかるように、ラマン分光顕微鏡１００では、通常のスリット共焦点ラマン顕微鏡と比べて、試料の微細構造がより高解像度で得られることが確認できる。なお、図１３では、ｉはグラファイト、ｉｉは欠陥、ｉｉｉは単層グラフェンの積層、ｉｖは２層グラフェン、ｖは単層グラフェンを示す。

図１４は、図１３の線ＬＡ１４−ＬＡ１４（比較例３）及び線ＬＢ１４−ＬＢ１４（実施例３）における波数１３０７−１３８７ｃｍ^−１（Ｄバンド）の平均ラマン光強度を示す図である。図１４では、実施例３を実線で示し、比較例３を破線で示している。図１４に示すように、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００は、一般的なラマン分光顕微鏡と比べて、より空間周波数が高い、すなわち、より高い空間分解能を有することが理解できる。

実施例４
図１５は、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００（実施例４）及び比較例である一般的なラマン分光顕微鏡（比較例４）での試料の観察像を示す図である。図１５は、実験用マウスの脳組織をスライスして作製した標本のラマン画像を示している。比較例４では、構造化照明を用いないスリット共焦点ラマン顕微鏡を使用した。これらの例では、タンパクのβシート及び脂質を観察するため、波数１６８２ｃｍ^−１（アミドＩバンド（Ｃ＝Ｏ伸縮）に対応、赤色）及び波数２８２８ｃｍ^−１（ＣＨ_２基の伸縮に対応、緑色）での観察像を示している。図１５からわかるように、ラマン分光顕微鏡１００では、通常のスリット共焦点ラマン顕微鏡と比べて、標本の構造の像がより高解像度で得られることが確認できる。

図１６は、図１５の点ｉ及びｉｉにおけるラマン光スペクトルを示す図である。図１６に示すように、ＣＨ基（炭化水素基）の伸縮に対応するピーク（２８４８ｃｍ^−１、２８８４ｃｍ^−１及び２９３０ｃｍ^−１）が現れていることがわかる。

図１７は、ＣＨ基（炭化水素基）の伸縮に対応するピーク（２８４８ｃｍ^−１、２８８４ｃｍ^−１及び２９３０ｃｍ^−１）における比較例４（図１５の線ＬＡ１７−ＬＡ１７）及び実施例４（図１５の線ＬＢ１７−ＬＢ１７）のラマン光強度分布を示す図である。図１７では、実施例４を実線で示し、比較例４を破線で示している。図１７に示すように、実施例４では、比較例４に比べ、標本の微細構造がより詳細に観察できることがわかる。つまり、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００は、実施例１〜３での無機物の試料のみならず、生体標本においても優れた解像度による観察を行うことが可能である。

以上の実施例により、実施の形態１にかかるラマン分光顕微鏡１００によれば、一般的なラマン分光顕微鏡と比べて微細構造の観察における空間分解能を試料形態によらず向上できることが理解できる。

実施の形態２
実施の形態２にかかるラマン分光顕微鏡２００について説明する。ラマン分光顕微鏡２００は、ラマン分光顕微鏡１００と比べて、制御部５が、分光器の収差に起因する光強度分布の歪みを補正する動作を行う点で相違する。なお、ラマン分光顕微鏡２００の構成は、ラマン分光顕微鏡１００と同様であるので説明を省略する。

一般に、分光器４には収差が存在する。そのため、スリット４０に入射したラマン散乱光Ｌｒが分光されて検出部４４に到達するまでに、収差により光強度分布に歪みが生じる。図１８は、測定された干渉縞の空間周波数のズレを示すグラフである。図１８の横軸は、ライン照明光の長手方向（Ｘ軸に沿う方向）の空間周波数を示す。図１８の縦軸は、分光されたラマン散乱光の光強度分布を示す。また、光強度分布を示す線が複数有るが、これはＸ軸方向における観察位置の相違を示す。

図１９は、図１８に示す干渉縞の空間周波数のズレとそのＸ軸上の位置との関係を示した図である。図１９では、規格化空間周波数０．５付近に存在する光強度の強い部分（明るいパターン部分）が、Ｘ軸方向の観察位置を示す値が大きくなるにしたがってマイナス側にシフトしていく様子が確認できる。なお、図１９の横軸は、規格化された空間周波数を示している。

ラマン分光顕微鏡１００では、ライン照明光に構造化照明を用いているので、図１８に示すように、ライン照明光のＸ軸方向の光強度の変動、すなわち空間周波数が光強度分布に現れていることが確認できる。ここで光強度分布に現れる空間周波数は回折格子２で生じた回折光の干渉で決まるので、原理的にはＸ軸上での位置によらず一定であると考え得る。しかし、分光器に収差が有る場合には光強度分布が歪み、光強度分布に現れる空間周波数にばらつきが生じる。その結果、図１９に示す２次元光強度分布が歪んでしまい、観察対象物の正確な像を取得することができない。

これに対し、ラマン分光顕微鏡２００では、分光器４及び光源１から分光器４に至るまでの光路で生じた収差（特に、湾曲収差）に起因する光強度分布の歪みを補正することで、観察対象物の正確な像を取得する機能を有する。ラマン分光顕微鏡では分光器は必須であるが、分光器による収差は、光源から分光器に至るまでの光路で生じる収差と比べて大きい。そのため、分光器による収差を補正できなければ観察対象物の正確な像を取得できないこととなり、以下で説明する光強度分布の歪みの補正は、ラマン分光顕微鏡にとっては特に有意義であると言える。以下、ラマン分光顕微鏡２００の補正動作について説明する。なお、以下で説明する補正動作は、制御部５が行う。図２０は、実施の形態２にかかるラマン分光顕微鏡２００光強度分布の歪みを補正する動作を示すフローチャートである。

ステップＳ１
まず、光強度分布の歪み補正を行うため、一様に発光する基準サンプルの光強度分布を測定する。一様に発光する十分に薄い基準サンプルとしては、例えば蛍光膜を用いることができ、Ｓ／Ｎ比の高い光強度分布を得ることができる。

ステップＳ２
測定した歪みを含む基準サンプルの光強度分布（以下、基準サンプル光強度分布と称する）を横軸方向で複数の区間に分割する。なお、各区間は、隣接する区間の５０％とオーバーラップするように分割される。ここでは、基準サンプル光強度分布を８分割する例について説明する。

ステップＳ３
基準サンプル光強度分布のそれぞれの区間についてフーリエ変換を行う。これにより、各区間の光強度分布に現れる空間周波数を取得する。

ステップＳ４
各区間の光強度分布に現れる空間周波数をプロットし、プロットした各点での値を内挿する。図２１は、分割した各区間の光強度分布に現れる空間周波数をプロットした図である。図２１では、プロットした点に対する多項式近似曲線を表示している。

ステップＳ５
プロット結果から、空間周波数の規格化の基準値を決定する。この例では、プロットした点が近傍に多く存在する０．２５を基準値とする。

ステップＳ６
先に決定した基準値に基づいて、光強度分布のピクセルサイズを補正する。図２２は、図２１のプロット結果に基づいたピクセルサイズの補正を示すグラフである。図２２において、破線は補正前のピクセルサイズを示し、実線は補正後のピクセルサイズを示す。

ステップＳ７
次いで、測定対象となる試料の測定を行い、試料の光強度分布（補正前光強度分布と称する）を測定する。この時点では、試料の光強度分布は、ピクセル補正はされておらず、歪みを含んでいる。

ステップＳ８
ステップＳ７で取得した補正前光強度分布に、ステップＳ６で決定した補正後のピクセルサイズを適用する。これにより、図１８に示した光強度分布（補正前光強度分布）におけるピクセルサイズ、すなわち光強度分布のＸ軸方向の空間ピッチを補正する。図２３は、実施の形態２にかかるラマン分光顕微鏡２００において歪みを補正した後の光強度分布を示す図である。これにより、分光されたラマン散乱光の光強度分布に現れる空間周波数が一定となり、光強度分布に含まれる歪みが除去される。

ここで、ピクセルサイズ（空間ピッチ）を補正した後の試料の光強度分布を補正後光強度分布と称する。図２４は、図２３に示す補正後光強度分布から得られる光強度の２次元分布を示す図である。図１９では、規格化空間周波数０．５付近に現れる光強度の強い部分が、Ｙ軸方向の位置を示す値が大きくなるにしたがってマイナス側にシフトする。これに対し、図２４では、規格化空間周波数０．５付近に現れる光強度の強い部分のマイナス側へのシフトが、図１９と比べて小さいことが確認できる。すなわち、補正前の光強度分布に基づいて取得した観察対象物の２次元像のシフト補正し、正確な２次元像が得られたことが理解できる。なお、図２４の横軸は、規格化された空間周波数を示している。

なお、収差のない分光器を用いることで、分光したラマン散乱光の光強度分布に含まれる歪みを除去ないしは軽減することも可能である。しかし、収差のない分光器を実現するには、高コストであるばかりでなく、作製技術が高度であり作製に要する時間も長くなる。これに対し、本実施の形態にかかる光強度分布の歪み補正は、制御部５により演算のみで実現することができる。よって、特別な分光器を用いることなく２次元像の歪みを補正できるので、ラマン分光顕微鏡への実装が容易であり、かつコスト抑制の観点からも有利である。

なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば、上述の光学系３及び分光器４の構成は例示に過ぎない。すなわち、光学系３及び分光器４と同様の機能を発揮し得る限り、光学系及び分光器の構成は、適宜変更することが可能である。

実施の形態２では、光強度分布を８分割する例について説明したが、分割数は２以上の任意の数とすることができる。また、各区間が隣接する区間とオーバーラップする必要はないし、オーバーラップする割合も５０％以外でもよい。また、空間周波数を求める区間を連続的に移動させて、Ｘ軸に沿った空間周波数の変化を連続的に求めてもよい。このとき、ハニング窓などの適当な窓関数を用いることができる。

上述の実施の形態では、観察平面（Ｘ−Ｙ平面）における空間分解能の向上について述べたが、０次回折光、＋１次回折光及び−１次回折光を用いて、試料の深さ方向（観察平面であるＸ−Ｙ平面に対して垂直な方向であるＺ軸方向）の空間分解能を高めることも可能である。具体的には、＋１次回折光及び−１次回折光に対して０次回折光の位相および強度を適切に調整し、干渉させることによって、試料の深さ方向にも干渉縞を形成することができる。これにより、観察平面の場合と同様の原理で、異なるＺ座標で観察した複数の像を合成することにより、試料の深さ方向の空間分解能を向上させることができる。

なお、上述の回折格子２は、着脱可能としてもよい。これにより、回折格子２を用いる場合には上述で説明した構造化照明を利用でき、構造化照明スリット共焦点顕微鏡を実現できる。また、回折格子２を用いない場合には、通常のスリット共焦点顕微鏡を実現できる。

上述の実施の形態では、１個のガルバノミラー３３を用いた構成により、Ｙ軸方向にのみライン照明光ＬＬが走査可能としているが、走査方向が直交する２個のガルバノミラーをガルバノミラー３３の位置に近接させて設置し、Ｘ方向にもライン照明光ＬＬを走査可能とすることもできる。これにより、試料のより広い領域を測定することができる。

上述では、光学系３のガルバノミラー３３によってライン照明光ＬＬを走査可能としたが、例えば、ライン照明光ＬＬの位置を不変とし、試料が載置されるステージを駆動させることで、実質的にライン照明光ＬＬに試料を走査させることができる。なお、光学系３及びステージの両方を駆動制御してライン照明光ＬＬの走査を行うことができることはいうまでもない。

上述の実施の形態ではラマン分光顕微鏡について説明したが、このラマン分光顕微鏡は、ラマン分光顕微鏡としての機能を付与するためのアタッチメントを通常の光学顕微鏡に装着することによっても実現することができる。具体的には、図２の光学系３のうち、ミラー３４、レンズＬ３及び対物レンズＯＬは通常の光学顕微鏡においても設けられているので、これらの光学部品以外の光学系３の構成部品（シリンドリカルレンズＣＬ１〜ＣＬ３、レンズＬ１、Ｌ２及びＬ４、遮光板３１、エッジフィルタ３２、及び、ガルバノミラー３３）、光源１、回折格子２、分光器４及び制御部５をラマン分光顕微鏡用アタッチメントとして通常の正立／倒立光学顕微鏡に取り付けてもよい。

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は既に述べた実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることはいうまでもない。

この出願は、２０１４年８月１８日に出願された日本出願特願２０１４−１６５７６０を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

１光源
２回折格子
３光学系
４分光器
５制御部
１０観察対象物
３１遮光板
３２エッジフィルタ
３３ガルバノミラー
３４ミラー
４０スリット
４１、４２凹面ミラー
４３分散素子
４４検出部
１００ラマン分光顕微鏡
２００ラマン分光顕微鏡
ＣＬ１〜ＣＬ３シリンドリカルレンズ
Ｌレーザ光
Ｌ１〜Ｌ４レンズ
Ｌｄ照明光
Ｌｒラマン散乱光
ＬＬライン照明光
ＯＬ対物レンズ

Claims

光源と、
前記光源が出力する光を回折させ、回折光を生じさせる回折素子と、
入射する光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得する分光器と、
前記回折素子で生じた＋１次回折光及び−１次回折光による干渉光を、前記干渉光による干渉縞と直交する第１の方向を長手方向とするライン照明光として観察対象物に照射するとともに、前記ライン照明光が観察対象物に照射されて生じたラマン散乱光を前記分光器へ導く光学系と、
前記ライン照明光によって、観察対象物を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査させる制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記分光器が取得した前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布を取得し、
前記光強度の空間分布に現れる空間周波数が均一となるように、光強度の空間分布の空間ピッチを補正する、
ラマン分光顕微鏡。
前記制御部は、
前記第２の方向のサンプリング間隔が前記ライン照明光の前記第１の方向の強度分布に現れる空間周波数と一致するように、前記ライン照明光に観察対象物を走査させる、
請求項１に記載のラマン分光顕微鏡。
前記分光器は、
前記ラマン散乱光が入射するスリットと、
前記スリットを介して入射した前記ラマン散乱光が撮像面に結像する撮像素子と、を備え、
前記撮像素子が撮像を行うことにより、前記ラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得する、
請求項１又は２に記載のラマン分光顕微鏡。
前記制御部は、
観察対象物に対する前記ライン照明光の照射位置を保ったまま、前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光によって生じる干渉縞の位相を多段階に変化させ、
変化させた前記干渉縞の位相のそれぞれについて得られる複数の前記分光スペクトルの光強度の空間分布を合成して、当該照射位置における分光スペクトルの光強度の空間分布を生成する、
請求項１乃至３のいずれか一項に記載のラマン分光顕微鏡。
前記制御部は、前記分光器から取得した前記光強度の空間分布を複数の区間に分割し、
前記分光器は、前記複数の区間のそれぞれについて、光強度の空間分布に現れる空間周波数を取得し、
前記制御部は、
前記複数の区間のそれぞれについて取得した空間周波数から基準値を決定し、
前記基準値に基づいて前記光強度の空間分布のピクセルサイズを補正することで、分光スペクトルの光強度の空間分布を補正する、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のラマン分光顕微鏡。
前記光源から前記回折素子に入射する光は、平行光である、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のラマン分光顕微鏡。
試料の深さ方向に対して干渉縞が生成されるように、＋１次回折光及び−１次回折光の位相に対して、前記回折素子で生じた０次回折光の位相及び強度を調整して、＋１次回折光、−１次回折光干渉及び０次回折光を干渉させる、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のラマン分光顕微鏡。
前記光源と前記回折素子との間又は前記光学系に設けられ、通過する光のビーム断面形状を変化させるビーム断面変換器を更に備える、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のラマン分光顕微鏡。
光源が出力する光を、回折素子により回折させ、回折光を生じさせ、
前記回折素子で生じた＋１次回折光及び−１次回折光による干渉光を、前記干渉光による干渉縞と直交する第１の方向を長手方向とするライン照明光として観察対象物に照射し、
前記ライン照明光によって、観察対象物を前記第１の方向と直交する第２の方向に走査させ、
前記ライン照明光が観察対象物に照射されて生じたラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得し、
前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布に現れる空間周波数が均一となるように、光強度の空間分布の空間ピッチを補正する、
ラマン散乱光観察方法。
前記第２の方向のサンプリング間隔が前記ライン照明光の前記第１の方向の強度分布に現れる空間周波数と一致するように、前記ライン照明光に観察対象物を走査させる、
請求項９に記載のラマン散乱光観察方法。
前記ラマン散乱光をスリットに入射させ、
前記スリットを介して入射した前記ラマン散乱光を撮像素子の撮像面に結像させ、
前記撮像素子が撮像を行わせることで、前記ラマン散乱光の分光スペクトル及び前記分光スペクトルの光強度の空間分布を取得する、
請求項９又は１０に記載のラマン散乱光観察方法。
観察対象物に対する前記ライン照明光の照射位置を保ったまま、前記＋１次回折光及び前記−１次回折光による干渉光によって生じる干渉縞の位相を多段階に変化させ、
変化させた前記干渉縞の位相のそれぞれについて得られる複数の前記分光スペクトルの光強度の空間分布を合成して、当該照射位置における分光スペクトルの光強度の空間分布を生成する、
請求項９乃至１１のいずれか一項に記載のラマン散乱光観察方法。
前記ラマン散乱光の分光スペクトルの光強度の空間分布を複数の区間に分割し、
前記複数の区間のそれぞれについて、光強度の空間分布に現れる空間周波数を取得し、
前記複数の区間のそれぞれについて取得した空間周波数から基準値を決定し、
前記基準値に基づいて前記光強度の空間分布のピクセルサイズを補正することで、分光スペクトルの光強度の空間分布を補正する、
請求項９乃至１２のいずれか一項に記載のラマン散乱光観察方法。
前記光源から前記回折素子に入射する光は、平行光である、
請求項９乃至１３のいずれか一項に記載のラマン散乱光観察方法。
試料の深さ方向に対して干渉縞が生成されるように、＋１次回折光及び−１次回折光の位相に対して、前記回折素子で生じた０次回折光の位相及び強度を調整して、＋１次回折光、−１次回折光干渉及び０次回折光を干渉させる、
請求項９乃至１４のいずれか一項に記載のラマン散乱光観察方法。
前記回折素子の前記光源側又は前記回折素子の前記光源とは反対側に、通過する光のビーム断面形状を変化させるビーム断面変換器が前記回折素子と離隔して設けられる、
請求項９乃至１５のいずれか一項に記載のラマン散乱光観察方法。