JP2015107117A - サルサブファミリーＢアデノウイルスＳＡｄＶ−２８、−２７、−２９、−３２、−３３および−３５ならびにそれらの用途 - Google Patents

サルサブファミリーＢアデノウイルスＳＡｄＶ−２８、−２７、−２９、−３２、−３３および−３５ならびにそれらの用途 Download PDF

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Abstract

【課題】標的に分子を効果的に送達しかつ集団における選択されたアデノウイルス血清型に対する既存の免疫の効果を最小化する組換えアデノウイルスベクターの提供。
【解決手段】制御配列の制御下にサルアデノウイルス２８（ＳＡｄＶ−２８）、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３及び／若しくはＳＡｄＶ−３５の各々の特定の配列並びに異種遺伝子を含んでなる組換えベクター、１種若しくはそれ以上のＳＡｄＶ−２８、−２７、−３２、−３３若しくは−３５遺伝子を発現する細胞株、前記ベクター及び前記細胞株の使用方法。複製及び被包化に必要な５’及び３’アデノウイルスシスエレメントを更に含み、複製欠損若しくはハイブリッドキャプシドを有するアデノウイルス。
【選択図】なし

Description

コンパクトディスクで提出される資料の引用による組み込み。
発明者は、これとともに提供されるコンパクトディスク上の配列表資料を引用によりここに組み込む。これらのコンパクトディスクは複製で供給され、そしてコンピュータで読み込み可能な形態の「配列表」のみを含有する。これらのディスクはそれぞれ「コピー１」および「コピー２」と表示される。これらのディスク上のファイルは「ＵＰＮ−Ｕ４６１１ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と表示されている。
アデノウイルスは約３６キロ塩基（ｋｂ）のゲノムサイズをもつ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、多様な標的組織での高度に効率的な遺伝子移入を達成するその能力および大きな導入遺伝子容量により遺伝子移入の応用に広範に使用されている。慣習的には、アデノウイルスのＥ１遺伝子が欠失され、そして選択すべきプロモーター、目的の遺伝子のｃＤＮＡ配列およびポリＡシグナルよりなる導入遺伝子カセットで置き換えられて、複製欠損組換えウイルスをもたらす。
アデノウイルスは、多数の他の少量のタンパク質すなわちＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２と一緒に３種の主要なタンパク質すなわちヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）およびノブ（ｋｎｏｂ）ファイバー（ＩＶ）よりなる正二十面体キャプシドをもつ特徴的形態を有する（非特許文献１）。該ウイルスゲノムは、末端逆位配列（ＩＴＲ）を有する５’末端に末端タンパク質が共有結合されている直鎖状二本鎖ＤＮＡである。該ウイルスＤＮＡは高度に塩基性のタンパク質ＶＩＩおよび小ペプチドｐＸ（以前はμと称される）と緊密に会合している。別のタンパク質ＶはこのＤＮＡ−タンパク質複合体でパッケージングされ、そしてタンパク質ＶＩを介するキャプシドへの構造的結合を提供する。該ウイルスは、成熟感染性ウイルスを生じるのに構造的タンパク質のいくつかのプロセシングが必要である、ウイルスにコードされるプロテアーゼもまた含有する。
ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌおよびオポッサムのアデノウイルスを包含するマストアデノウイルスファミリーの分類スキームが作成されている。この分類スキームは赤血球を凝集させる該ファミリー中のアデノウイルス配列の異なる能力に基づいて作成された。該結果は、サブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦと現在称される６サブグループであった。非特許文献２を参照されたい。
宿主細胞への異種分子の送達のための組換えアデノウイルスが記述されている。２種のチンパンジーアデノウイルスのゲノムを記述する特許文献１を参照されたい。サルアデノウイルスＣ５、Ｃ６およびＣ７はワクチンベクターとして有用であるとして特許文献２に記述されている。他のチンパンジーアデノウイルスがアデノウイルスワクチン担体を作成するのに有用であるとして特許文献３に記述されている。
当該技術分野で必要とされるものは、標的に分子を効果的に送達しかつ集団における選択されたアデノウイルス血清型に対する既存の免疫の効果を最小化するベクターである。
米国特許第６，０８３，７１６号明細書 米国特許第７，２４７，４７２号明細書 第ＷＯ ２００５／１０７１０９３号明細書
Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、８１：２５７３−２６０４（Ｎｏｖ ２０００） Ｔ．Ｓｈｅｎｋら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ"、第６７章、ＦＩＥＬＤ’Ｓ ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第６版、Ｂ．Ｎ Ｆｉｅｌｄｓらにより編中、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、フィラデルフィア、１９９６）、ｐ．１１１−２１１２
［発明の要約］
サルアデノウイルス２８（ＳＡｄＶ−２８）、サルアデノウイルス２７（ＳＡｄＶ−２７）、サルアデノウイルス２９（ＳＡｄＶ−２９）、サルアデノウイルス３２（ＳＡｄＶ−３２）、サルアデノウイルス３３（ＳＡｄＶ−３３）およびサルアデノウイルス（ＳＡｄＶ−３５）の単離された核酸配列およびアミノ酸配列、ならびにこれらの配列を含有するベクターを本明細書に提供する。本発明のベクターおよび細胞の多数の使用方法もまた提供される。
本明細書に記述される方法は、本発明のベクターを投与することにより１種若しくはそれ以上の選択された異種遺伝子を哺乳動物患者に送達することを必要とする。ワクチン接種のための本明細書に記述される組成物の使用は、保護免疫応答の誘発のための選択された抗原の提示を可能にする。ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５に基づくベクターは異種遺伝子産物をｉｎ ｖｉｔｒｏで製造するのにもまた使用しうる。こうした遺伝子産物は本明細書に記述されるような多様な目的上それら自身有用である。
本発明のこれらおよび他の態様および利点を下により詳細に記述する。
［発明の詳細な記述］
サルアデノウイルス２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５からの新規核酸およびアミノ酸配列（それらのそれぞれはチンパンジー糞便から単離された）が提供される。組換えタンパク質若しくはフラグメントまたは他の試薬のｉｎ ｖｉｔｒｏ製造での使用のための新規アデノウイルスベクターおよびそれらのベクターを製造するためのパッケージング細胞株もまた提供される。治療若しくはワクチンの目的上の異種分子の送達における使用のための組成物がさらに提供される。こうした治療若しくはワクチン組成物は挿入された異種分子を保有するアデノウイルスベクターを含有する。加えて、該新規ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造に必要とされる不可欠のヘルパー機能の提供において有用である。従って、こうした製造法でこれらの配列を使用するヘルパー構築物、方法および細胞株が提供される。
核酸若しくはそのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」若しくは「実質的類似性」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入若しくは欠失を伴い別の核酸（若しくはその相補鎖）と最適に整列される場合に、整列された配列の最低約９５ないし９９％のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
アミノ酸若しくはそれらのフラグメントを指す場合の「実質的相同性」若しくは「実質的類似性」という用語は、適切なアミノ酸の挿入若しくは欠失を伴い別のアミノ酸（若しくはその相補鎖）と最適に整列される場合に、整列された配列の最低約９５ないし９９％のアミノ酸配列同一性が存在することを示す。好ましくは、相同性は、完全長配列若しくはそのタンパク質、または長さ最低８アミノ酸若しくはより望ましくは最低１５アミノ酸であるそのフラグメントにわたる。適するフラグメントの例を本明細書に記述する。
核酸配列の文脈の「同一性パーセント」若しくは「同一の」という用語は、最大の対応のため整列される場合に同一である該２配列中の残基を指す。一配列を別のものと整列するためにギャップが必要とされる場合、ギャップに対するペナルティを伴わないより長い配列に関してスコアリングの程度が計算される。ポリヌクレオチド若しくはそれによりコードされるポリペプチドの機能性を保存する配列はより緊密に同一である。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長（例えば約３６ｋｂｐ）、遺伝子のオープンリーディングフレーム、タンパク質、サブユニット若しくは酵素の完全長（例えば、アデノウイルスコーディング領域を提供する表を参照されたい）にわたることができるか、または、最低約５００ないし５０００ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしながら、例えば最低約９ヌクレオチド、通常は最低約２０ないし２４ヌクレオチド、最低約２８ないし３２ヌクレオチド、最低約３６若しくはそれ以上のヌクレオチドのより小さいフラグメントの間の同一性もまた望ましいことができる。同様に、「配列同一性パーセント」はタンパク質の完全長若しくはそのフラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定しうる。適しては、フラグメントは長さ最低約８アミノ酸でありかつ約７００アミノ酸まででありうる。適するフラグメントの例を本明細書に記述する。
同一性は、本明細書で定義されるようなアルゴリズムおよびコンピュータプログラムをデフォルトの設定で使用して容易に決定される。好ましくは、こうした同一性は、タンパク質、酵素、サブユニットの完全長にわたるか、若しくは長さ最低約８アミノ酸のフラグメントにわたる。しかしながら、同一遺伝子産物が使用されている使用に適する場合、同一性はより短い領域に基づいてもよい。
本明細書に記述されるところのアライメントは、インターネットのウェブサーバーを通じてアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」のような多様な公的に若しくは商業的に入手可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを使用して実施する。あるいはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ(R)ユーティリティ［ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ］もまた使用される。上述され
たプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列同一性を評価するのに使用し得る当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１中のプログラムＦａｓｔａを使用して比較し得る。Ｆａｓｔａは、クエリおよび検索配列の間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）およびスコアリングマトリックスのＮＯＰＡＭファクター）でＦａｓｔａを使用して決定し得る。同様に、アミノ酸アライメントを実施するためのプログラムが利用可能である。一般に、これらのプログラムはデフォルト設定で使用するとは言え、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変更し得る。あるいは、当業者は、少なくとも参照されるアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性のレベル若しくはアライメントを提供する別のアルゴリズム若しくはコンピュータプログラムを利用し得る。
ポリヌクレオチドに適用されるところの「組換え」は、該ポリヌクレオチドが、クロー
ニング、制限若しくはライゲーション段階、および天然に見出されるポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の手順の多様な組合せの産物であることを意味している。組換えウイルスは組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語は、それぞれ元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を包含する。
「異種」は、それが比較されている実体の残部のものと遺伝子型が異なる実体由来を意味している。例えば、遺伝子工学技術により異なる種由来のプラスミド若しくはベクターに導入されるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その本来のコーディング配列から取り出されかつそれが連結されて天然に見出されないコーディング配列に効果的に連結されているプロモーターは異種プロモーターである。ウイルスのゲノム、若しくは該ウイルスのゲノムがそれを天然に含有しないウイルスベクターにクローン化されている部位特異的組換え部位は異種組換え部位である。組換え酵素のコーディング配列をもつポリヌクレオチドを使用して、通常は組換え酵素を発現しない細胞を遺伝子的に変える場合、該ポリヌクレオチドおよび該組換え酵素の双方が該細胞に対し異種である。
本明細および請求の範囲を通じて使用されるところの「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、および他の変形のなかでも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなること」を包含するその変形は、他の成分、要素、整数、段階などに包括的なものである。「よりなる」若しくは「よりなること」という用語は他の成分、要素、整数、段階などを除外する。
Ｉ．サルアデノウイルス配列
本発明は、サルＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５の核酸配列およびアミノ酸配列を提供し、それらのそれぞれはそれらが天然に会合している他物質から単離されている。これらのアデノウイルスのそれぞれはヒトサブグループＢと同一サブグループにあることが決定されている。
Ａ．核酸配列
本明細書に提供されるＳＡｄＶ−２８核酸配列は配列番号１のヌクレオチド１ないし３５６１０を包含する。本明細書に提供されるＳＡｄＶ−２７核酸配列は配列番号３９のヌクレオチド１ないし３５５９２を包含する。本明細書に提供されるＳＡｄＶ−２９核酸配列は配列番号７１のヌクレオチド１ないし３５６４６を包含する。本明細書に提供されるＳＡｄＶ−３２核酸配列は配列番号１０３のヌクレオチド１ないし３５５８８を包含する。本明細書に提供されるＳＡｄＶ−３３核酸配列は配列番号１３４のヌクレオチド１ないし３５６９４を包含する。本明細書に提供されるＳＡｄＶ−３５核酸配列は配列１６６のヌクレオチド１ないし３５６０６を包含する。
本明細書に引用することにより組み込まれる配列表を参照されたい。一態様において、本発明の核酸配列は、配列番号１、２９、７１、１０３、１３４および１６６の配列に相補的である鎖、ならびに以下の配列およびそれらの相補鎖の配列に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列をさらに包含する。別の態様において、該核酸配列は、配列表に９８．５％以上同一、および好ましくは約９９％以上同一である配列をさらに包含する。一態様において、配列番号１、２９、７１、１０３、１３４および１６６に提供される配列ならびにそれらの相補鎖の天然のバリアントおよび工作された改変もまた包含する。こうした改変は、例えば、当該技術分野で既知である標識、メチル化、および天然に存在するヌクレオチドの１個若しくはそれ以上の縮重ヌクレオチドでの置換を包含する。
Figure 2015107117
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一態様において、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５の配列、ならびにそれらの相補鎖、それらに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡのフラグメントが提供される。適するフラグメントは長さ最低
１５ヌクレオチドであり、そして機能的フラグメントすなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。例えば、機能的フラグメントは、所望のアデノウイルス産物を発現し得るか、若しくは組換えウイルスベクターの製造で有用でありうる。こうしたフラグメントは本明細書の表に列挙される遺伝子配列およびフラグメントを包含する。該表は、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列中の転写領域およびオープンリーディングフレームを提供する。ある種の遺伝子について、転写物およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は配列番号１、２９、７１、１０３、１３４および１６６に提示されるものに相補的な鎖上に位置する。例えばＥ２ｂ、Ｅ４およびＥ２ａを参照されたい。コードされるタンパク質の計算された分子量もまた示される。ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５のＥ１ａオープンリーディングフレームならびにＥ２ｂのオープンリーディングフレームは内部スプライス部位を含有することに注意されたい。これらのスプライス部位は上の表中に示される。
ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５アデノウイルス核酸配列は、治療薬としてならびに多様なベクター系および宿主細胞の構築で有用である。本明細書で使用されるところのベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、コスミド若しくはエピソームを包含するいかなる適する核酸分子も包含する。これらの配列および産物は、単独で、または他のアデノウイルス配列若しくはフラグメントと組合せ、あるいは他のアデノウイルス若しくはアデノウイルス以外の配列からのエレメントと組合せで使用しうる。ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５配列は、アンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクター若しくはワクチンベクターとしてもまた有用である。従って、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５配列を含有する核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび宿主細胞がさらに提供される。
例えば、本発明は本発明のサルＡｄ ＩＴＲ配列を含有する核酸分子を包含する。別の例において、本発明は所望のＡｄ遺伝子産物をコードする本発明のサルＡｄ配列を含有する核酸分子を提供する。本発明の配列を使用して構築されるなお他の核酸分子は、本明細書に提供される情報を鑑みれば当業者に容易に明らかであろう。
一態様において、本明細書で同定されるサルＡｄ遺伝子領域を異種分子の細胞への送達のための多様なベクターで使用しうる。例えば、パッケージング宿主細胞中でウイルスベクターを生成させる目的上、アデノウイルスキャプシドタンパク質（若しくはそのフラグメント）の発現のためのベクターを生成する。こうしたベクターはトランスでの発現のため設計しうる。あるいは、こうしたベクターは、所望のアデノウイルス機能、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、末端反復配列、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、Ｅ４ＯＲＦ６領域の１種若しくはそれ以上を発現する配列を安定に含有する細胞を提供するよう設計する。
加えて、該アデノウイルス遺伝子配列およびそれらのフラグメントは、ヘルパー依存ウイルス（例えば必須機能を欠失されたアデノウイルスベクター、若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））の製造に必要なヘルパー機能を提供するのに有用である。こうした製造方法のため、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列を、ヒトＡｄについて記述されたものに類似の様式でこうした方法で利用し得る。しかしながら、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列とヒトＡｄのものの間の配列の差違により、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列の使用は、ｒＡＡＶ産生の間に感染性アデノウイルス汚染物質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）を産生しうるヒトＡｄ Ｅ１機能を
保有する宿主細胞、例えば２９３細胞中でのヘルパー機能との相同的組換えの可能性を大きく最小化するか若しくは排除する。
アデノウイルスヘルパー機能を使用するｒＡＡＶの製造方法はヒトアデノウイルス血清型とともに文献に詳細に記述されている。例えば米国特許第６，２５８，５９５号明細書およびその中に引用される参考文献を参照されたい。米国特許第５，８７１，９８２号明細書；第ＷＯ ９９／１４３５４号明細書；第ＷＯ ９９／１５６８５号明細書；第ＷＯ
９９／４７６９１号明細書もまた参照されたい。これらの方法はヒト以外の霊長類のＡＡＶ血清型を包含するヒト以外の血清型のＡＡＶの製造でもまた使用しうる。必要なヘルパー機能（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ ＯＲＦ６）を提供するＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５配列は、ヒト起源に典型的であるｒＡＡＶパッケージング細胞中に存在するいずれかの他のアデノウイルスとの組換えの可能性を最小化若しくは排除する一方での必要なアデノウイルス機能の提供においてとりわけ有用であり得る。従って、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５の選択された遺伝子若しくはオープンリーディングフレームをこれらのｒＡＡＶ製造方法で利用しうる。
あるいは、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５の配列に基づく組換えベクターをこれらの方法で利用しうる。こうした組換えアデノウイルスサルベクターは、例えば、チンパンジーＡｄ配列が例えばＡＡＶ ３’および／若しくは５’ＩＴＲならびにその発現を制御する制御配列の制御下の導入遺伝子から構成されるｒＡＡＶ発現カセットに隣接しているハイブリッドチンパンジーＡｄ／ＡＡＶを包含しうる。当業者は、なお他のサルアデノウイルスベクターならびに／またはＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５遺伝子配列が、ｒＡＡＶ、およびアデノウイルスヘルパーに依存する他のウイルスの製造に有用であることができることを認識するであろう。
なお別の態様において、核酸分子は、所望の生理学的効果を達成するための宿主細胞中の選択されたアデノウイルス遺伝子産物の送達および発現のため設計する。例えば、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ Ｅ１ａタンパク質をコードする配列を含有する核酸分子を癌治療薬としての使用のため被験体に送達しうる。場合によっては、こうした分子を脂質に基づく担体中で処方しかつ癌細胞を優先的に標的とする。こうした製剤を他の癌治療薬（例えばシスプラチン、タキソールなど）と組合せうる。本明細書に提供されるアデノウイルス配列のなお他の用途は当業者に容易に明らかであろう。
加えて、当業者は、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５配列を、治療および免疫原性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏ送達のための多様なウイルスおよびウイルス以外のベクター系のための使用に容易に適合させ得ることを容易に理解するであろう。例えば、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５サルＡｄ配列を多様なｒＡｄおよびｒＡｄ以外のベクター系で利用し得る。こうしたベクター系は、とりわけ、例えばプラスミド、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ随伴ウイルス系を包含しうる。これらのベクター系の選択は本発明の制限でない。
本発明は、本発明のサルおよびサル由来タンパク質の製造に有用な分子をさらに提供する。本発明のサルＡｄ ＤＮＡ配列を包含するポリヌクレオチドを保有するこうした分子
は、裸のＤＮＡ、プラスミド、ウイルス若しくはいずれかの他の遺伝因子の形態にあり得る。
Ｂ．ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５アデノウイルスタンパク質
本明細書に記述されるアデノウイルス核酸によりコードされるタンパク質、酵素およびそれらのフラグメントのようなＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５アデノウイルスの遺伝子産物が提供される。他の方法により生成されるこれらの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５のタンパク質、酵素およびそれらのフラグメントがさらに包含される。こうしたタンパク質は、上の表で同定されるオープンリーディングフレームによりコードされるもの、表２中のタンパク質（配列表にもまた示される）ならびに該タンパク質およびポリペプチドのそれらのフラグメントを包含する。
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従って、一局面において、実質的に純粋である、すなわち他のウイルスおよびタンパク質性タンパク質を含まない独特のＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５タンパク質が提供される。好ましくは、これらのタンパク質は最低１０％同種、より好ましくは６０％同種、および最も好ましくは９５％同種である。
一態様において、独特なサル由来キャプシドタンパク質が提供される。本明細書で使用
されるところのサル由来キャプシドタンパク質は、これらのタンパク質の生成手段に対する制限を伴わず、キメラキャプシドタンパク質、融合タンパク質、人工キャプシドタンパク質、合成キャプシドタンパク質および組換えキャプシドタンパク質を制限なしに包含する、上で定義されたところのＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５キャプシドタンパク質またはそれらのフラグメントを含有するいかなるアデノウイルスキャプシドタンパク質も包含する。
適しては、これらのサル由来キャプシドタンパク質は、本明細書に記述されるところの多様なアデノウイルス血清型のキャプシド領域若しくはそれらのフラグメントまたは改変されたサルキャプシドタンパク質若しくはフラグメントと組合せの１種若しくはそれ以上のＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５領域またはそれらのフラグメント（例えばヘキソン、ペントン、ファイバー若しくはそれらのフラグメント）を含有する。本明細書で使用されるところの「変えられた向性を伴うキャプシドタンパク質の改変」は、変えられたキャプシドタンパク質、すなわちペントン、ヘキソン若しくはファイバータンパク質領域、またはファイバー領域のノブドメインのようなそれらのフラグメント、あるいは特異性が変えられているようなものをコードするポリヌクレオチドを包含する。サル由来キャプシドは、本発明のサルＡｄの１種若しくはそれ以上、またはヒト若しくはヒト以外の起源のものでありうる別のＡｄ血清型を用いて構築しうる。こうしたＡｄは、ＡＴＣＣ、商業的および学術的供給源を包含する多様な供給源から得ることができるか、またはＡｄの配列はＧｅｎＢａｎｋ若しくは他の適する供給源から得ることができる。
ＳＡｄＶ−２８（配列番号６）、ＳＡｄＶ−２７（配列番号４４）、ＳＡｄＶ−２９（配列番号７６）、ＳＡｄＶ−３２（配列番号１０８）、ＳＡｄＶ−３３（配列番号１３９）およびＳＡｄＶ−３５（配列番号１７１）のペントンタンパク質のアミノ酸配列が提供される。適しては、これらのペントンタンパク質若しくはそれらの独特のフラグメントを多様な目的上利用しうる。適するフラグメントの例は、それぞれ上ならびに配列番号６、４４、７６、１０８、１３９および１７１で提供されるアミノ酸番号付けに基づき約５０、１００、１５０若しくは２００アミノ酸のＮ末端および／若しくはＣ末端切断を有するペントンを包含する。他の適するフラグメントはより短い内部、Ｃ末端若しくはＮ末端フラグメントを包含する。さらに、ペントンタンパク質は当業者に既知の多様な目的上改変しうる。
ＳＡｄＶ−２８（配列番号１１）、ＳＡｄＶ−２７（配列番号４９）、ＳＡｄＶ−２９（配列番号８１）、ＳＡｄＶ−３２（配列番号１１３）、ＳＡｄＶ−３３（配列番号１４４）およびＳＡｄＶ−３５（配列番号１７６）のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列もまた提供される。適しては、これらのヘキソンタンパク質若しくはそれらの独特のフラグメントを多様な目的上利用しうる。適するフラグメントの例は、それぞれ上および配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６に提供されるアミノ酸番号付けに基づき約５０、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００アミノ酸のＮ末端および／若しくはＣ末端切断を有するヘキソンを包含する。他の適するフラグメントはより短い内部、Ｃ末端若しくはＮ末端フラグメントを包含する。例えば、１種の適するフラグメントはＤＥ１およびＦＧ１と呼称されるヘキソンタンパク質のループ領域（ドメイン）若しくはその超可変領域である。こうしたフラグメントは、それぞれ配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６を参照して、サルヘキソンタンパク質のアミノ酸残基約１２５ないし４４３；約１３８ないし４４１にわたる領域、若しくは、約残基１３８ないし残基１６３；約１７０ないし約１７６；約１９５ないし約２０３；約２３３ないし約２４６；約２５３ないし約２６４；約２８７ないし約２９７；および約４０４ないし約４３０にわたるもののようなより小さいフラグメントを包含する。他の適するフラグメントは当業者により容易に同定されうる。さらに、ヘキソンタンパク質は当業者に既知の
多様な目的上改変しうる。ヘキソンタンパク質はアデノウイルスの血清型の決定子であるため、こうした人工ヘキソンタンパク質は人工血清型を有するアデノウイルスをもたらすとみられる。他の人工キャプシドタンパク質を、チンパンジーＡｄペントン配列および／若しくは本発明のファイバー配列ならびに／またはそれらのフラグメントを使用してもまた構築し得る。
一態様において、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ヘキソンタンパク質の配列を利用する変えられたヘキソンタンパク質を有するアデノウイルスを生成しうる。ヘキソンタンパク質を変えるための適する一方法は米国特許第５，９２２，３１５号明細書（引用することにより組み込まれる）に記述されている。この方法では、アデノウイルスヘキソンの最低１個のループ領域が別のアデノウイルス血清型の最低１個のループ領域で変えられる。従って、こうした変えられたアデノウイルスヘキソンタンパク質の最低１個のループ領域は、ＳＡｄＶ−２８（または、あるいはＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５）のサルＡｄヘキソンループ領域である。一態様において、ＳＡｄＶ−２８（または、あるいはＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５）ヘキソンタンパク質の１個のループ領域が別のアデノウイルス血清型からの１個のループ領域により置き換えられる。別の態様において、ＳＡｄＶ−２８（または、あるいはＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５）ヘキソンのループ領域を使用して別のアデノウイルス血清型からのループ領域を置き換える。適するアデノウイルス血清型は、本明細書に記述されるところのヒトおよびヒト以外の血清型のなかから容易に選択しうる。適する血清型の選択は本発明の制限でない。ＳＡｄＶ−２８（または、あるいはＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５）ヘキソンタンパク質配列のなお他の用途は当業者に容易に明らかであろう。
ＳＡｄＶ−２８（配列番号２１）、ＳＡｄＶ−２７（配列番号５９）、ＳＡｄＶ−２９（配列番号９１）、ＳＡｄＶ−３２（配列番号１２３）、ＳＡｄＶ−３３（配列番号１５４）若しくはＳＡｄＶ−３５（配列番号１８５）のファイバータンパク質のアミノ酸配列。適しては、このファイバータンパク質若しくはそれらの独特のフラグメントを多様な目的上利用しうる。１種の適するフラグメントは配列番号２１、５９、９１、１２３、１５４若しくは１８５内に位置するファイバーノブである。他の適するフラグメントの例は、配列番号２１、５９、９１、１２３、１５４若しくは１８５に提供されるアミノ酸番号付けに基づき約５０、１００、１５０若しくは２００アミノ酸のＮ末端および／若しくはＣ末端切断を有するファイバーを包含する。なお他の適するフラグメントは内部フラグメントを包含する。さらに、ファイバータンパク質は当業者に既知の多様な技術を使用して改変しうる。
ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５のタンパク質の独特のフラグメントは長さ最低８アミノ酸である。しかしながら他の所望の長さのフラグメントを容易に利用し得る。加えて、ＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５遺伝子産物の収量および／若しくは発現を高めるために導入されうるところの改変、例えばＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５遺伝子産物の全部若しくは１フラグメントが高めるための融合パートナーと（直接若しくはリンカーを介してのいずれかで）融合される融合分子の構築が、本明細書で提供される。他の適する改変は、通常切断されるプレ若しくはプロタンパク質を除外しかつ成熟タンパク質若しくは酵素を提供するためのコーディング領域（例えばタンパク質若しくは酵素）の切断、および／または分泌可能な遺伝子産物を提供するためのコーディング領域の突然変異を制限なしに包含する。
なお他の改変は当業者に容易に明らかであろう。本明細書に提供されるＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５タンパク質に対する最低約９９％の同一性を有するタンパク質がさらに包含される。
本明細書に記述されるところの、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５のアデノウイルスキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のＡｄ血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの有効性を低下させる応用での使用にとりわけ良好に適する。ｒＡｄベクターは、反復遺伝子治療若しくは免疫応答（ワクチン力価）を高めるための再投与でとりわけ有利である。
ある状況下では、ＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５遺伝子産物の１種若しくはそれ以上（例えばキャプシドタンパク質若しくはそのフラグメント）を使用して抗体を生成することが望ましいことがある。本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、あるエピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、例えば高親和性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体、組換え抗体およびヒト化抗体を包含する多様な形態で存在しうる。こうした抗体は免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥから発する。
こうした抗体は当該技術分野で既知の多数の方法のいずれを使用しても生成しうる。適する抗体は、公知の慣習的技術、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎおよびその多くの既知の変法により生成しうる。同様に、所望の高力価抗体は、これらの抗原に対し発生されたモノクローナル若しくはポリクローナル抗体に既知の組換え技術を適用することにより生成する（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号明細書；英国特許出願公開第ＧＢ２１８８６３８Ａ号明細書；Ａｍｉｔら、１９８６ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７−７５３；Ｑｕｅｅｎら、１９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３；ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＷＯ９００７８６１号明細書；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｈｕｓｅら、１９８８ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５−１２８１を参照されたい）。あるいは、抗体は本発明の抗原に対する動物若しくはヒト抗体の相補性決定領域を操作することにより製造し得る。例えば、Ｅ．ＭａｒｋとＰａｄｌｉｎ、“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、第４章、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１１３、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｊｕｎｅ、１９９４）；Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；およびＢｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６を参照されたい。抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）および抗抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）が本発明によりさらに提供される。例えば、Ｍ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆら、“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ Ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ．ＣｅｒｎｙとＪ．Ｈｉｅｒｎａｕｘにより編中、１９９０ Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ワシントンＤＣ：ｐｐ．２０３−２２９を参照されたい）。これらの抗イディオタイプおよび抗抗イディオタイプ抗体
は当業者に公知の技術を使用して製造する。これらの抗体は、診断および臨床的な方法およびキットを包含する多様な目的上使用しうる。
ある状況下で、ＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５遺伝子産物、抗体、若しくは本発明の他の構築物に検出可能な標識（ｌａｂｅｌ）若しくは標識（ｔａｇ）を導入することが望ましいかもしれない。本明細書で使用されるところの検出可能な標識（ｌａｂｅｌ）は、単独で若しくは別の分子との相互作用に際して検出可能なシグナルを提供することが可能である分子である。最も望ましくは、標識は免疫組織化学的分析若しくは免疫蛍光顕微鏡検査での即座の使用のために例えば蛍光により視覚的に検出可能である。例えば、適する標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（ＣＰＯ）若しくはタンデム色素、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）およびＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）を包含する。これらの蛍光色素の全部は商業的に入手可能であり、また、それらの用途は当該技術分野に既知である。他の有用な標識はコロイド状金標識を包含する。なお他の有用な標識は放射活性化合物若しくは元素を包含する。加えて、標識は、アッセイで比色シグナルを表すよう機能する多様な酵素系を包含し、例えばグルコース酸化酵素（グルコースを基質として使用する）は生成物として過酸化物を放出し、過酸化物は過酸化酵素、およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のような水素供与体の存在下で青色として見られる酸化型ＴＭＢを産生する。他の例は、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ならびに、ＡＴＰ、グルコースおよびＮＡＤ＋と反応してとりわけ３４０ｎｍの波長で増大された吸光度として検出されるＮＡＤＨを生じるグルコース−６−リン酸脱水素酵素を伴うヘキソキナーゼを包含する。
本明細書に記述される方法で利用される他の標識系は他の手段により検出可能であり、例えば、色素が埋め込まれている着色ラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インジアナ州）を、標的配列と複合体を形成して適用されるアッセイで生じる複合体の存在を示す視覚的シグナルを提供する酵素の代わりに使用する。
所望の分子と標識の結合若しくは会合方法は同様に慣習的でありかつ当業者に既知である。既知の標識結合方法が記述されている（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン、１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード、１９９４／１９９５を参照されたい）。従って標識および結合方法の選択は本発明を制限しない。
ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え製造、化学合成若しくは他の合成手段を包含するいずれかの適する手段により製造しうる。適する製造技術は当業者に公知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）を参照されたい。あるいは、ペプチドは公知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）；ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、１９６９）ｐｐ．２７−６２）によってもまた合成し得る。これらおよび他の適する製造方法は当業者の知識内にあり、そして本発明の制限でない。
加えて、当業者は、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５配列が治療および免疫原性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏ送達のための多様なウイルスおよびウイルス以外のベクター系のための使用に容易に適合され得ることを容易に理解するであろう。例えば、一態様において、本明細書に記述されるサルＡｄキャプシドタンパク質および他のサルアデノウイルスタンパク質は、遺伝子、タンパク質、ならびに他の所望の診断、治療および免疫原性分子のウイルス以外のタンパク質に基づく送達に使用される。こうした一態様において、本発明のタンパク質は、アデノウイルスの受容体をもつ細胞へのターゲッティングのためのある分子に直接若しくは間接的に結合される。好ましくは、ヘキソン、ペントン、ファイバーのようなキャプシドタンパク質若しくは細胞表面受容体のリガンドを有するそれらのフラグメントをこうしたターゲッティングに選択する。送達に適する分子は、本明細書に記述される治療分子およびそれらの遺伝子産物のなかから選択される。脂質、ポリＬｙｓなどを包含する多様なリンカーをリンカーとして利用しうる。例えば、サルペントンタンパク質は、Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ ＬＫら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２００１ Ｍａｙ；８（１０）：７９５−８０３およびＭｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ ＬＫら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１ Ｄｅｃ；８（２３）：１７５３−１７６１に記述されるものに類似の様式でサルペントン配列を使用する融合タンパク質の製造によりこうした目的上容易に利用しうる。あるいは、サルＡｄタンパク質ＩＸのアミノ酸配列を、米国特許出願第２００１００４７０８１号明細書に記述されるとおり細胞表面受容体にベクターの標的を定めるのに利用しうる。適するリガンドはＣＤ４０抗原、ＲＧＤ含有若しくはポリリシン含有配列などを包含する。例えばヘキソンタンパク質および／若しくはファイバータンパク質を包含するなお他のサルＡｄタンパク質をこれらおよび類似の目的上使用されるため使用しうる。
なお他のＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５アデノウイルスタンパク質を、当業者に容易に明らかであろう多様な目的上、単独として若しくは他のアデノウイルスタンパク質と組合せで使用しうる。加えて、ＳＡｄＶ−２８アデノウイルスタンパク質のなお他の用途が当業者に容易に明らかであろう。
ＩＩ．組換えアデノウイルスベクター
本明細書に記述される組成物は、治療若しくはワクチンいずれかの目的上細胞に異種分子を送達するベクターを包含する。本明細書で使用されるところのベクターは、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド若しくはウイルスを制限なしに包含するいかなる遺伝因子も包含しうる。こうしたベクターはＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５のサルアデノウイルスＤＮＡならびにミニ遺伝子を含有する。「ミニ遺伝子」若しくは「発現カセット」により、選択された異種遺伝子、ならびに宿主細胞中での該遺伝子産物の翻訳、転写および／若しくは発現を駆動するのに必要な他の調節エレメントの組合せを意味している。
典型的には、選択されたアデノウイルス遺伝子に固有の領域中の他のアデノウイルス配列を含有する核酸分子中にミニ遺伝子が配置されるようなＳＡｄＶ由来アデノウイルスベクターを設計する。該ミニ遺伝子は、所望の場合はその領域の機能を破壊するように既存の遺伝子領域に挿入しうる。あるいは、該ミニ遺伝子は部分的に若しくは完全に欠失されたアデノウイルス遺伝子の部位に挿入しうる。例えば、該ミニ遺伝子は、選択されうるもののなかで、機能的Ｅ１欠失若しくは機能的Ｅ３欠失の部位などの部位に配置しうる。「機能的に欠失された」若しくは「機能的欠失」という用語は、該遺伝子領域が遺伝子発現の機能的産物を産生することがもはや可能でないように十分な量の遺伝子領域が除去また
は別の方法で例えば突然変異若しくは改変により損傷されることを意味している。所望の場合は遺伝子領域全体を除去しうる。遺伝子破壊若しくは欠失の他の適する部位は本出願の別の場所で論考する。
例えば、組換えウイルスの生成に有用な生産ベクターについて、該ベクターは、ミニ遺伝子、ならびにアデノウイルスゲノムの５’端若しくはアデノウイルスゲノムの３’端のいずれかまたはアデノウイルスゲノムの５’および３’端の双方を含有しうる。アデノウイルスゲノムの５’端は、パッケージングおよび複製に必要な５’シスエレメント、すなわち５’末端逆位配列（ＩＴＲ）（複製起点として機能する）ならびに天然の５’パッケージングエンハンサードメイン（直鎖状Ａｄゲノムをパッケージングするのに必要な配列およびＥ１プロモーターのエンハンサーエレメントを含有する）を含有する。アデノウイルスゲノムの３’端はパッケージングおよび被包化に必要な３’シスエレメント（ＩＴＲを包含する）を包含する。適しては、組換えアデノウイルスは５’および３’双方のアデノウイルスシスエレメントを含有し、また、ミニ遺伝子は該５’および３’アデノウイルス配列の間に配置される。ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５に基づくアデノウイルスベクターは付加的なアデノウイルス配列もまた含有しうる。
適しては、これらのＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５に基づくアデノウイルスベクターは、本発明のアデノウイルスゲノム由来の１個若しくはそれ以上のアデノウイルスエレメントを含有する。一態様において、該ベクターはＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−からのアデノウイルスＩＴＲならびに同一アデノウイルス血清型からの付加的なアデノウイルス配列を含有する。別の態様において、該ベクターはＩＴＲを提供するものと異なるアデノウイルス血清型由来であるアデノウイルス配列を含有する。
本明細書で定義されるところのシュードタイピングされた（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）アデノウイルスは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質がＩＴＲを提供するアデノウイルスと異なるアデノウイルスからであるアデノウイルスを指す。
さらに、キメラ若しくはハイブリッドアデノウイルスを、当業者に既知の技術を使用して、本明細書に記述されるアデノウイルスを使用して構築しうる。例えば米国特許第７，２９１，４９８号明細書を参照されたい。
ＩＴＲのアデノウイルス供給源およびベクター中に存在するいかなる他のアデノウイルス配列の供給源の選択も本態様の制限でない。多様なアデノウイルス株がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサスから入手可能であるか、若しくは多様な商業的および組織的供給源から求めにより入手可能である。さらに、多くのこうした株の配列は例えばＰｕｂＭｅｄおよびＧｅｎＢａｎｋを包含する多様なデータベースから入手可能である。他のサル若しくはヒトアデノウイルスから製造された相同なアデノウイルスベクターが公表された文献に記述されている（例えば米国特許第５，２４０，８４６号明細書を参照されたい）。Ａｄ５型（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７３２６０）を包含する多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。アデノウイルス配列は、血清型２、３、４、７、１２および４０のような、ならびに現在同定されているヒト型のいずれもさらに包含するいずれの既知のアデノウイルス血清型からも得ることができる。同様に、ヒト以外の動物（例えばサル）を感染されることが既知のアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物で使用しうる。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照されたい。
本明細書に記述されるベクターの構築で使用されるウイルス配列、ヘルパーウイルス（必要な場合）、および組換えウイルス粒子ならびに他のベクター成分および配列は上述されたとおり得られる。本発明のＳＡｄＶ２８サルアデノウイルス配列のＤＮＡ配列を、ベクターおよびこうしたベクターの製造で有用な細胞株を構築するのに使用する。
配列の欠失、挿入および他の突然変異を包含する本発明のベクターを形成する核酸配列の改変は、標準的な分子生物学技術を使用して生成することができ、そして本態様の範囲内にある。
Ａ．「ミニ遺伝子」
導入遺伝子の選択、「ミニ遺伝子」のクローニングおよび構築ならびにウイルスベクターへのその挿入に使用される方法は、本明細書に提供される教示を考えれば当該技術分野の熟練内にある。
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質若しくは他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に異種の核酸配列である。核酸コーディング配列は、宿主細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で調節成分に効果的に連結されている。
導入遺伝子配列の組成は生じるベクターが利用されるであろう使用に依存することができる。例えば、１種の導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を包含する。こうしたレポーター配列は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を包含する膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、およびそれに向けられた高親和性抗体が存在するか若しくは慣習的手段により製造され得る当該技術分野で公知の他者、ならびにとりわけヘマグルチニン若しくはＭｙｃからの抗原標識ドメインに適切に融合された膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を制限なしに包含する。これらのコーディング配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントと会合される場合に、酵素的、Ｘ線撮影、比色、蛍光、若しくは他の分光学的アッセイ、蛍光標示式細胞分取アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を包含する免疫学的アッセイを包含する慣習的手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを保有するベクターの存在はβ−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイにより検出する。導入遺伝子がＧＦＰ若しくはルシフェラーゼである場合、該シグナルを保有するベクターはルミノメーターで色若しくは光産生により視覚的に測定しうる。
一態様において、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素若しくは触媒的ＲＮＡのような生物学および医学で有用である産物をコードするマーカー以外の配列である。望ましいＲＮＡ分子はｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒的ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを包含する。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置された動物中での標的にされた核酸配列の発現を識別する配列である。
導入遺伝子は、例えば遺伝子欠損の処置に、癌治療薬若しくはワクチンとして、免疫応答の誘導のため、および／または予防ワクチンの目的上使用しうる。本明細書で使用されるところの免疫応答の誘導は、ある分子（例えば遺伝子産物）に対するＴ細胞および／若しくは体液性免疫を誘導する該分子の能力を指す。本発明は、例えば多サブユニットタンパク質により引き起こされる状態を是正若しくは改善するため複数の導入遺伝子を使用す
ることをさらに包含する。ある状況において、異なる導入遺伝子を、タンパク質の各サブユニットをコードする、または異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするのに使用しうる。これは、該タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡの大きさが大きい場合、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子若しくはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を産生するために、細胞を多様なサブユニットのそれぞれを含有する組換えウイルスに感染させる。あるいは、１タンパク質の多様なサブユニットを同一導入遺伝子によりコードしうる。この場合、単一導入遺伝子がサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを包含し、各サブユニットのＤＮＡは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えばサブユニットをコードするＤＮＡおよびＩＲＥＳの全体の大きさが５キロ塩基未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する一代替として、該ＤＮＡは翻訳後事象で自己切断する２Ａペプチドをコードする配列により分離されうる。例えばＭ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７８（Ｐｔ １）：１３−２１（Ｊａｎ １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２ＡペプチドはＩＲＥＳよりかなり小さく、空間が制限因子である場合にそれを使用に十分に適するようにする。しかしながら、選択された導入遺伝子はいかなる生物学的に活性の産物若しくは他の産物、例えば研究に所望の産物をコードしてもよい。
適する導入遺伝子は当業者により容易に選択されうる。導入遺伝子の選択は本態様の制限であるとみなされない。
２．調節エレメント
ミニ遺伝子について上で同定された主要エレメントに加え、該ベクターは、本発明により製造されるプラスミドベクターでトランスフェクトされた若しくはウイルスに感染した細胞中でのその転写、翻訳および／若しくは発現を可能にする様式で導入遺伝子に作動可能に連結されている必要な慣習的調節領域もまた包含する。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列、およびトランスで若しくは少し離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の双方を包含する。
発現制御配列は、適切な転写開始、終始、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を包含する。
天然の、構成的、誘導可能および／若しくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が、当該技術分野で既知でありかつ利用されうる。構成的プロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によってはＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によってはＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えばＢｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を制限なしに包含する。
誘導可能なプロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外的に供給される化合物、温度のような環境因子、若しくは特定の生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の
分化段階の存在により、または複製細胞中でのみ調節され得る。誘導可能なプロモーターおよび誘導可能な系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを制限なしに包含する多様な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記述されておりかつ当業者により容易に選択され得る。例えば、誘導可能なプロモーターは、亜鉛で誘導可能なヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーターおよびデキサメサゾン（Ｄｅｘ）で誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを包含する。他の誘導可能な系は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（第ＷＯ ９８／１００８８号明細書）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６））、テトラサイクリンで抑制可能な系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２））、テトラサイクリンで誘導可能な系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２−５１８（１９９８）もまた参照されたい）を包含する。他の系は、ＦＫ５０６二量体、カストラジオール（ｃａｓｔｒａｄｉｏｌ）を使用するＶＰ１６若しくはｐ６５、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、ＲＵ４８６で誘導可能な系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２−４４１（１９９７））ならびにラパマイシンで誘導可能な系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５−２８７２（１９９７））を包含する。いくつかの誘導可能なプロモーターの有効性は時間とともに増大する。こうした場合には、複数のリプレッサーをタンデムに挿入することにより（例えばＩＲＥＳによりＴｅｔＲに結合したＴｅｔＲ）こうしたシステムの有効性を高め得る。あるいは、所望の機能についてスクリーニングする前に最低３日待機し得る。この系の有効性を高めるための既知手段により所望のタンパク質の発現を高め得る。（例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用して）
別の態様において、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用することができる。該天然のプロモーターは、該導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣すべきであることが望ましい場合に好ましいことがある。該天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的に若しくは発達的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に使用しうる。さらなる一態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位若しくはコザックコンセンサス配列のような他の天然の発現調節領域もまた天然の発現を模倣するのに使用しうる。
導入遺伝子の別の態様は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている導入遺伝子を包含する。例えば、骨格筋での発現が望ましい場合は筋で活性のプロモーターを使用すべきである。これらは、骨格筋β−アクチン，ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターより高い活性をもつ合成筋プロモーター（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：２４１−２４５（１９９９）を参照されたい）を包含する。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４−３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２−９（１９９６）；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、７：１５０３−１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、２４：１８５−９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１１：６５４−６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１０６３−８（１９９８）；免疫グロブリンＨ鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３−１５（１９９３
））、神経フィラメントＬ鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１−５（１９９１））、および神経特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３−８４（１９９５））のような神経の（ｎｅｕｒｏｎａｌ）について既知である。
場合によっては、治療上有用な若しくは免疫原性の産物をコードする導入遺伝子を保有するベクターは、とりわけ、選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子もまた包含しうるはジェネチシン、ハイグロマイシン若しくはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含しうる。アンピシリン耐性のような、こうした選択可能なレポーター若しくはマーカー遺伝子（好ましくはウイルス粒子中にパッケージングされるべきウイルスゲノムの外側に配置される）を、細菌細胞中の該プラスミドの存在を知らせるのに使用し得る。ベクターの他成分は複製起点を包含しうる。これらおよび他のプロモーターならびにベクターエレメントの選択は慣習的であり、そして多くのこうした配列が入手可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、およびその中に引用される参考文献を参照されたい）。
これらのベクターは、当業者に既知の技術とともに本明細書に提供される技術および配列を使用して生成する。こうした技術は、教科書（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）に記述されるもののようなｃＤＮＡの慣習的クローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの適する方法を包含する。
ＩＩＩ．ウイルスベクターの製造
一態様において、サルアデノウイルスプラスミド（若しくは他のベクター）を使用してアデノウイルスベクターを製造する。一態様においてアデノウイルスベクターは複製欠損であるアデノウイルス粒子である。一態様において、アデノウイルス粒子はＥ１ａおよび／若しくはＥ１ｂ遺伝子中の欠失により複製欠損にされている。あるいは、アデノウイルスは、場合によってはＥ１ａおよび／若しくはＥ１ｂ遺伝子を保持しつつ別の手段により複製欠損にされている。該アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムに対する他の突然変異、例えば他の遺伝子中の温度感受性突然変異若しくは欠失もまた含有し得る。他の態様において、アデノウイルスベクター中に無傷のＥ１ａおよび／若しくはＥ１ｂ領域を保持することが望ましい。こうした無傷のＥ１領域は、アデノウイルスゲノム中のその天然の場所に配置しうるか、若しくは天然のアデノウイルスゲノム中の欠失の部位（例えばＥ３領域中）に置くことができる。
ヒト（若しくは他の哺乳動物）細胞への遺伝子の送達のための有用なサルアデノウイルスベクターの構築において、ある範囲のアデノウイルス核酸配列を該ベクター中で使用し得る。例えば、アデノウイルス後初期遺伝子（ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）Ｅ３の全部若しくは一部分を、組換えウイルスの一部を形成するサルアデノウイルス配列から除外しうる。サルＥ３の機能は組換えウイルス粒子の機能および産生に無関係であると考えられている。Ｅ４遺伝子の少なくともＯＲＦ６領域、およびより望ましくはこの領域の機能の冗長性によりＥ４領域全体の欠失を有するサルアデノウイルスベクターもまた構築しうる。本発明のなお別のベクターは後初期遺伝子Ｅ２ａ中に欠失を含有する。欠失はサルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子Ｌ１からＬ５のいずれで行ってもまたよい。同様に中間遺伝子（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｇｅｎｅ）ＩＸおよびＩＶａ2中の欠失がいくつかの目的上有用でありうる。他の欠失を他の構造的若しくは非構造的アデノウイルス遺伝子中で行いうる。上で論考される欠失は個別に使用しうる。すなわち、本明細書に記述されるところの使用のためのアデノウイルス配列は単一領域のみに欠失を含有しうる
。あるいは、遺伝子全体、若しくはそれらの生物学的活性を破壊するのに効果的なそれらの部分の欠失をいかなる組合せで使用してもよい。例えば、一例示的ベクター中で、アデノウイルス配列は、Ｅ３の欠失を伴う若しくは伴わない、Ｅ１遺伝子およびＥ４遺伝子、若しくはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ３遺伝子、若しくはＥ１およびＥ３遺伝子、若しくはＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４遺伝子などの欠失を有しうる。上で論考されたとおり、こうした欠失を温度感受性突然変異のような他の突然変異とともに使用して所望の結果を達成しうる。
いずれかの必須アデノウイルス配列（例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルスの感染性およびアデノウイルス粒子の増殖に必要とされる該欠けているアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養しうる。これらのヘルパー機能は、１種若しくはそれ以上のヘルパー構築物（例えばプラスミド若しくはウイルス）またはパッケージング宿主細胞の存在下で該アデノウイルスベクターを培養することにより提供しうる。例えば、１９９６年５月９日に公開されかつ引用することにより本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ９６／１３５９７号明細書中に「最小」ヒトＡｄベクターの製造について記述される技術を参照されたい。
１．ヘルパーウイルス
従って、ミニ遺伝子を保有するため使用されるウイルスベクターのサルアデノウイルス遺伝子含量に依存して、ヘルパーアデノウイルス若しくは非複製ウイルスフラグメントが、該ミニ遺伝子を含有する感染性組換えウイルス粒子を製造するのに必要な十分なサルアデノウイルス遺伝子配列を提供するのに必要でありうる。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物に存在せずかつ／若しくは該ベクターがトランスフェクトされるパッケージング細胞株により発現されない、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一態様において、該ヘルパーウイルスは複製欠損でありかつ上述された配列に加えて多様なアデノウイルス遺伝子を含有する。こうしたヘルパーウイルスは、望ましくはＥ１発現細胞株とともに使用する。
ヘルパーウイルスは、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．ＦｉｓｈｅｒとＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９９：４９（Ａｐｒｉｌ １、１９９４）に記述されるところのポリカチオン複合物中にもまた形成しうる。ヘルパーウイルスは場合によっては第二のレポーターミニ遺伝子を含有しうる。多数のこうしたレポーター遺伝子が当該技術分野に既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子と異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在が、Ａｄベクターおよびヘルパーウイルスの双方が独立にモニターされることを可能にする。本第二のレポーターは、精製に際して、生じる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能にするのに使用する。
２．補完細胞株
上述された遺伝子のいずれかで欠失された組換えサルアデノウイルス（Ａｄ）を生成するためには、欠失された遺伝子領域の機能を、該ウイルスの複製および感染性に不可欠である場合はヘルパーウイルス若しくは細胞株、すなわち補完若しくはパッケージング細胞株により該組換えウイルスに供給しなければならない。多くの状況で、ヒトＥ１を発現する細胞株を使用してチンパンジーＡｄベクターをトランス補完し（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）得る。これは、本発明のチンパンジーＡｄ配列と現在入手可能なパッケージング細胞で見出されるヒトＡｄＥ１配列の間の多様性により、現在のヒトＥ１含有細胞の使用が複製および製造過程の間の複製能力のあるアデノウイルスの生成を予防するため、とりわけ有利である。しかしながら、ある状況では、Ｅ１遺伝子産物を発現しかつＥ１欠失サルアデノウイルスの製造に利用し得る細胞株を利用することが望ましいであろう。こうした細胞株は記述されている。例えば米国特許第６，０８３，７１６号明細書を参照さ
れたい。
所望の場合は、本明細書に提供される配列を利用して、選択された親細胞株中での発現のためのプロモーターの転写制御下にＳＡｄＶ２８からの少なくともアデノウイルスＥ１遺伝子を発現するパッケージング細胞若しくは細胞株を生成しうる。誘導可能な若しくは構成的プロモーターを本目的上使用しうる。こうしたプロモーターの例は本明細の別の場所に詳述されている。親細胞をいずれかの所望のＳＡｄＶ２８遺伝子を発現する新規細胞株の生成のため選択する。制限なしに、こうした親細胞株は、とりわけＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ ２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ １８５）、ＨＥＫ ２９３、ＫＢ（ＣＣＬ １７）、Ｄｅｔｒｏｉｔ（例えばＤｅｔｒｏｉｔ ５１０、ＣＣＬ ７２）およびＷＩ−３８（ＣＣＬ ７５）細胞でありうる。これらの細胞株は全部Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９から入手可能である。他の適する親細胞株は他の供給源から得ることができる。
こうしたＥ１発現細胞株は組換えサルアデノウイルスＥ１欠失ベクターの生成で有用である。加えて、若しくは、あるいは、１種若しくはそれ以上のサルアデノウイルス遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／若しくはＥ４ ＯＲＦ６を発現する細胞株を、組換えサルウイルスベクターの生成で使用されると本質的に同一の手順を使用して構築し得る。こうした細胞株を、それらの産物をコードする必須遺伝子が欠失されたアデノウイルスベクターをトランス補完する、若しくはヘルパー依存ウイルス（例えばアデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能を提供するのに利用し得る。宿主細胞の製造は選択されたＤＮＡ配列の集成のような技術を必要とする。この集成は慣習的技術を利用して成し遂げうる。こうした技術は、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法、および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの他の適する方法と組み合わせた、公知でありかつ上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋらに記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用を包含する。
なお別の代替において、必須アデノウイルス遺伝子産物はアデノウイルスベクターおよび／若しくはヘルパーウイルスによりトランスに提供される。こうした場合に、適する宿主細胞は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を包含する真核生物細胞を包含するいかなる生物有機体からも選択し得る。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＨＥＫ ２９３細胞若しくはＰＥＲＣ６（その双方は機能的アデノウイルスＥ１を発現する）（Ｆａｌｌａｕｘ，ＦＪら、（１９９８）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、９：１９０９−１９１７）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を制限なしに包含するいかなる哺乳動物種のなかからも選択される。該細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制限でなく、哺乳動物細胞すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などの型もそうでない。
３．ウイルス粒子の集成および細胞株のトランスフェクション
一般に、ミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する場合、該ベクターは、約１×１０4細胞ないし約１×１０13細胞、および好ましくは約１０5細胞に対し約５μｇから約１００μｇまでのＤＮＡ、および好ましくは約１０ないし約５０μｇのＤＮＡの量で送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されるベクター、送達方法および選択される宿主細胞のような因子を考慮に入れて調節してよい。
該ベクターは、裸のＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、ウイルスなどを包含する当該技術分野で既知の若しくは上で開示されたいずれのベクターでもよい。ベクターの宿主細胞への導入は、トランスフェクションおよび感染を包含する当該技術分野で既知の若しくは上で開示されたところのいずれの手段によっても達成しうる。アデノウイルス遺伝子の１種若しくはそれ以上が、宿主細胞のゲノム中に安定に組込まれうるか、エピソームとして安定に発現されうるか、若しくは一過性に発現されうる。遺伝子産物は全部、エピソーム上で一過性に発現されうるか若しくは安定に組込まれうるか、または、遺伝子産物のいくつかが安定に発現されうる一方で他者は一過性に発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター若しくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立に選択しうる。プロモーターは、例えば生物体若しくは細胞の特定の生理学的状態により（すなわち分化状態により、または複製中の若しくは静止状態の細胞中で）、あるいは外的に添加される因子により調節しうる。
宿主細胞中への（プラスミド若しくはウイルスのような）分子の導入は、当業者に既知のおよび本明細を通じて論考されるところの技術を使用してもまた達成しうる。好ましい態様において、標準的トランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ4トランスフェクション若しくは電気穿孔法を使用する。
アデノウイルスの選択されたＤＮＡ配列（ならびに導入遺伝子および他のベクターエレメントの多様な中間プラスミドへの集成、ならびに組換えウイルス粒子を製造するためのプラスミドおよびベクターの使用は全部慣習的技術を使用して達成される。こうした技術は、教科書（上で引用されたＳａｍｂｒｏｏｋら）に記述されるもののようなｃＤＮＡの慣習的クローニング技術、アデノウイルスゲノムのオーバーラップオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの適する方法を包含する。標準的トランスフェクションおよびコトランスフェクション技術、例えばＣａＰＯ4沈殿技術を使用する。使用される他の慣習的方法は、ウイルスゲノムの相同的組換え、アガーオーバーレイ中のウイルスのプラーク形成（ｐｌａｑｕｉｎｇ）、シグナル生成の測定方法などを包含する。
例えば、所望のミニ遺伝子含有ウイルスベクターの構築および集成後に、該ベクターをヘルパーウイルスの存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージング細胞株にトランスフェクトする。相同的組換えがヘルパーおよびベクター配列間で起こり、それは該ベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製されかつビリオンキャプシドにパッケージングされることを可能にし、組換えウイルスベクター粒子をもたらす。こうしたウイルス粒子の現在の製造方法はトランスフェクションに基づく。しかしながら本発明はこうした方法に制限されない。
生じる組換えサルアデノウイルスは選択された細胞への選択された導入遺伝子の移入において有用である。パッケージング細胞株中で増殖される組換えウイルスを用いるｉｎ ｖｉｖｏ実験において、本発明のＥ１欠失組換えサルアデノウイルスベクターは、サル以外の、好ましくはヒトの細胞への導入遺伝子の移入における有用性を示す。
ＩＶ．組換えアデノウイルスベクターの使用
組換えＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５に基づくベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでヒト若しくはサル以外の家畜患者への遺伝子移入に有用である。
本明細書に記述される組換えアデノウイルスベクターを、異種遺伝子によりコードされ
る産物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの製造のための発現ベクターとして使用し得る。例えば、Ｅ１欠失の場所に挿入された遺伝子を含有する組換えアデノウイルスを、上述されたところのＥ１発現細胞株にトランスフェクトしうる。あるいは、複製能力のあるアデノウイルスを別の選択された細胞株で使用しうる。該トランスフェクトした細胞をその後慣習的様式で培養して、組換えアデノウイルスにプロモーターから遺伝子産物を発現させる。該遺伝子産物をその後、既知の慣習的なタンパク質単離および培養物からの回収方法により培養物から回収しうる。
ＳＡｄＶ２８ ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５由来組換えサルアデノウイルスベクターは、生物体が１種若しくはそれ以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有する場合であっても、選択された宿主細胞に選択された導入遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで送達し得る効率的遺伝子移入媒体を提供する。一態様において、ｒＡＡＶおよび細胞をｅｘ ｖｉｖｏで混合し；慣習的方法論を使用して感染細胞を培養し；そしてトランスフェクトした細胞を患者に再注入する。これらの組成物は、治療目的上、および保護免疫を誘導することを包含する免疫化のための遺伝子送達にとりわけ良好に適する。
より一般的には、ＳＡｄＶ２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５組換えアデノウイルスベクターは、下述されるとおり治療若しくは免疫原性分子の送達に利用することができる。本発明の組換えアデノウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターの反復送達を必要とするレジメンでの使用にとりわけ良好に適することが双方の応用について容易に理解されるであろう。こうしたレジメンは、典型的に、ウイルスキャプシドが変えられている一連のウイルスベクターの送達を必要とする。ウイルスキャプシドは、各その後の投与について、または予め選択された数の特定の一血清型キャプシドの投与（例えば１、２、３、４回若しくはそれ以上）の後に変えることができる。従って、あるレジメンは、第一のサルキャプシドをもつｒＡｄの送達、第二のサルキャプシドをもつｒＡｄを用いる送達、および第三のサルキャプシドを用いる送達を必要としうる。単独で、相互と組合せで、若しくは他のアデノウイルス（好ましくは免疫学的に交差反応性でない）と組合せで本発明のＡｄキャプシドを使用する多様な他のレジメンが当業者に容易に明らかであろう。場合によっては、こうしたレジメンは、本明細書に記述されるような他のヒト以外の霊長類のアデノウイルス、ヒトアデノウイルス若しくは人工配列のキャプシドをもつｒＡｄの投与を必要としうる。レジメンの各相は、単一Ａｄキャプシドを用いる一連の注入（若しくは他の送達経路）の投与、次いで異なるＡｄ供給源からの別のキャプシドを伴うシリーズを必要としうる。あるいは、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターを、他のウイルス系、ウイルス以外の送達系、タンパク質、ペプチドおよび他の生物学的に活性の分子を包含する他のアデノウイルスに媒介されない送達系を必要とするレジメンで利用しうる。
以下のセクションは、本発明のアデノウイルスベクターを介して送達しうる例示的分子に焦点を当てることができる。
Ａ．治療分子のＡｄ媒介性送達
一態様において、上述された組換えベクターを公表された遺伝子治療方法に従ってヒトに投与する。選択された導入遺伝子を持つサルウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合性の溶液若しくは製薬学的に許容できる送達ベヒクルに懸濁して患者に投与しうる。適するベヒクルは滅菌生理学的食塩水を包含する。製薬学的に許容できる担体であることが既知かつ当業者に公知の他の水性および非水性の等張の滅菌注入溶液ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液を本目的上使用しうる。
該サルアデノウイルスベクターは、医学の技術分野の当業者により決定され得る、標的細胞を形質導入し、ならびに不要な有害作用を伴わず若しくは医学上許容できる生理学的効果を伴い治療上の利益を提供するのに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与する。慣習的かつ製薬学的に許容できる投与経路は、限定されるものでないが、網膜への直接送達および他の眼内送達法、肝への直接送達、吸入、鼻内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、直腸、経口および他の非経口投与経路を挙げることができる。投与経路は、所望の場合は組合せうるか、または導入遺伝子若しくは状態に依存して調節しうる。投与経路は主として処置されている状態の性質に依存することができる。
ウイルスベクターの投与量は、主として、処置されている状態、患者の齢、重量および健康状態のような因子に依存することができ、そして従って患者間で異なりうる。例えば、ウイルスベクターの治療上有効な成体のヒト若しくは家畜の投与量は、一般に約１×１０6から約１×１０15粒子まで、約１×１０11ないし１×１０13粒子、若しくは約１×１０9ないし１×１０12粒子のウイルスの濃度を含有する約１００μＬから約１００ｍＬまでの担体の範囲にある。投与量は動物の大きさおよび投与経路に依存して変動することができる。例えば、筋肉内注入に適するヒト若しくは家畜の投与量（約８０ｋｇの動物について）は、単一部位について１ｍＬあたり約１×１０9ないし約５×１０12粒子の範囲にある。場合によっては複数の投与部位が送達されうる。別の例において、適するヒト若しくは家畜の投与量は、経口製剤について約１×１０11ないし約１×１０15粒子の範囲にありうる。当業者は、投与経路および該組換えベクターを使用する治療若しくはワクチンの応用に依存してこれらの用量を調節しうる。導入遺伝子の発現のレベル、若しくは免疫原については循環抗体のレベルをモニターして投与量の投与頻度を決定し得る。投与の頻度のタイミングのなお他の決定方法は当業者に容易に明らかであろう。
任意の方法の一段階は、適する量の短時間作用型免疫調節物質のウイルスベクターの投与と同時、またはその前若しくは後のいずれかの患者への共投与を必要とする。選択される免疫調節物質は、本発明の組換えベクターに向けられる中和抗体の形成を阻害することが可能な、若しくは該ベクターの細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）排除を阻害することが可能な剤と本明細書で定義する。免疫調節物質は、Ｔヘルパーサブセット（ＴH1若しくはＴH2）とＢ細胞の間の相互作用を妨害して中和抗体形成を阻害しうる。あるいは、免疫調節物質は、ＴH1細胞とＣＴＬの間の相互作用を阻害して該ベクターのＣＴＬ排除の発生を低下させうる。多様な有用な免疫調節物質およびそれらの使用のための投与量が、例えばＹａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０（９）（Ｓｅｐｔ．、１９９６）；１９９６年５月２日公開の国際特許出願第ＷＯ９６／１２４０６号明細書；および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３０３５号明細書（全部は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。
１．治療的導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療的産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦ、アクチビン、インヒビンを包含するトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのいずれか１種、若しくは骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１〜１５のいずれか、ヘレグルイン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／増殖因子のｎｅｕ
分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１種、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ−４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１種、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシン水酸化酵素を制限なしに包含するホルモンならびに増殖および分化因子を包含する。
他の有用な導入遺伝子産物は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−１からＩＬ−２５（例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８を包含する）、単球化学誘因物質タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインおよびリンホカイン、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子、ならびにインターフェロン、および幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンドを制限なしに包含する免疫系を調節するタンパク質を包含する。免疫系により産生される遺伝子産物もまた本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに工作された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子を制限なしに包含する。有用な遺伝子産物は、補体調節タンパク質、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９のような補体調節タンパク質もまた包含する。
なお他の有用な導入遺伝子産物は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の受容体のいずれか１種を包含する。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容およびスカベンジャー受容体を包含するコレステロール調節のための受容体を包含する。本発明は、グルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体を包含するステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤ受容体ならびに他の核受容体のような遺伝子産物もまた包含する。加えて、有用な遺伝子産物は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ−１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニン、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ−４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質例えばＧＡＴＡ−３、およびウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
他の有用な遺伝子産物は、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸脱離酵素、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α−１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβ合成酵素、分枝状鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソバレリルｃｏＡ脱水素酵素、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）配列およびジストロフィンのｃＤＮＡ配列を包含する。
他の有用な遺伝子産物は、挿入、欠失若しくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を有するキメラ若しくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在し
ないポリペプチドを包含する。例えば、一本鎖の工作された免疫グロブリンはある種の免疫無防備状態の患者で有用であり得る。他の型の天然に存在しない遺伝子配列は、標的の過剰発現を低下させるのに使用し得るアンチセンス分子およびリボザイムのような触媒核酸を包含する。
遺伝子の発現の低下および／若しくは調節は、癌および乾癬がそうであるように過剰増殖細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置にとりわけ望ましい。標的ポリペプチドは、過剰増殖細胞中で独占的に若しくは正常細胞と比較してより高レベルで産生されるポリペプチドを包含する。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるポリペプチドを包含する。標的抗原としての癌遺伝子産物に加え、抗癌処置および保護レジメンのための標的ポリペプチドは、いくつかの態様において自己免疫疾患の標的抗原としてもまた使用される、Ｂ細胞リンパ腫により作成される抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を包含する。モノクローナル抗体１７−１Ａおよび葉酸結合ポリペプチドにより認識されるポリペプチドを包含する、腫瘍細胞中でより高レベルで見出されるポリペプチドのような他の腫瘍関連ポリペプチドを、標的ポリペプチドとして使用し得る。
他の適する治療的ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞受容体を包含する自己免疫と関連する標的および自己に向けられた抗体を産生する細胞に対する広範な保護免疫応答を賦与することにより自己免疫疾患および障害に苦しめられている個体を処置するのに有用でありうるものを包含する。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮病、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する。これらの疾患のそれぞれは、内在性抗原に結合しかつ自己免疫疾患と関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
本発明のサルアデノウイルスベクターは、導入遺伝子の複数のアデノウイルス媒介性送達が望ましい治療レジメンに、例えば同一導入遺伝子の再送達を必要とするレジメン、若しくは他の導入遺伝子の送達を必要とする併用レジメンでとりわけ良好に適する。こうしたレジメンは、ＳＡｄＶ２８サルアデノウイルスベクターの投与、次いで同一血清型アデノウイルスからのベクターを用いる再投与を必要としうる。とりわけ望ましいレジメンは、第一の投与で送達されるベクターのアデノウイルスキャプシド配列の供給源がその後の投与の１回若しくはそれ以上で利用されるウイルスベクターのアデノウイルスキャプシド配列の供給源と異なるＳＡｄＶ２８サルアデノウイルスベクターの投与を必要とする。例えば、治療レジメンは、ＳＡｄＶ２８ベクターの投与、および同一若しくは異なる血清型の１種若しくはそれ以上のアデノウイルスベクターを用いる反復投与を必要とする。別の例において、治療レジメンは、アデノウイルスベクターの投与、次いで第一の送達されるアデノウイルスベクター中のキャプシドの供給源と異なるキャプシドを有するＳＡｄＶ２８ベクターを用いる反復投与、および、場合によっては前の投与段階でのベクターのアデノウイルスキャプシドの供給源と同一であるか若しくは好ましくは異なる別のベクターを用いるさらなる投与を必要とする。これらのレジメンはＳＡｄＶ２８サル配列を使用して構築されるアデノウイルスベクターの送達に制限されない。むしろ、これらのレジメンは、ＳＡｄＶ２８ベクターの１種若しくはそれ以上と組合せの、他のサルアデノウイルス配列（例えばＰａｎ９若しくはＣ６８、Ｃ１など）、他のヒト以外の霊長類のアデノウイルス配列またはヒトアデノウイルス配列を制限なしに包含する他のアデノウイルス配列を容易に使用し得る。こうしたサル、他のヒト以外の霊長類およびヒトのアデノウイルス血清型の例は本文書の別の場所で論考する。さらに、これらの治療レジメンは、アデノウイルス以外のベクター、ウイルス以外のベクター、および／または多様な他の治療上有用な化
合物若しくは分子と組合せのＳＡｄＶ２８アデノウイルスベクターの同時若しくは連続いずれかの送達を必要としうる。本発明はこれらの治療レジメンに制限されず、多様なそれらが当業者に容易に明らかであろう。
Ｂ．免疫原性導入遺伝子のＡｄ媒介性送達
該組換えＳＡｄＶ−２８ベクターは免疫原性組成物としてもまた使用しうる。本明細書で使用されるところの免疫原性組成物は、それに対する体液性（例えば抗体）若しくは細胞性（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）応答が、哺乳動物、および好ましくは霊長類への送達後に該免疫原性組成物により送達される導入遺伝子産物に対し開始される組成物である。組換えサルＡｄは所望の免疫原をコードする遺伝子をそのアデノウイルス配列欠失のいずれかに含有し得る。該サルアデノウイルスは、ヒト起源のアデノウイルスに比較して多様な動物種で生組換えウイルスワクチンとしての使用により良好に適することがありそうであるが、しかしこうした使用に制限されない。該組換えアデノウイルスは、免疫応答の誘導にきわめて重要でありかつ病原体の伝播を制限することが可能な抗原（１種若しくは複数）が同定されておりかつｃＤＮＡが利用可能であるいかなる病原体に対する予防的若しくは治療的ワクチンとしても使用し得る。
こうしたワクチン（若しくは他の免疫原性）組成物は上述されたとおり適する送達ベヒクル中で処方する。一般に免疫原性組成物の用量は治療的組成物について上で定義された範囲にある。選択された遺伝子の免疫のレベルをモニターしてブースターの必要性（あれば）を決定し得る。血清中の抗体力価の評価後に、任意のブースター免疫化が望ましいかもしれない。
場合によっては、本発明のワクチン組成物は例えばアジュバント、安定剤、ｐＨ調節剤、保存剤などを包含する他の成分を含有するように処方しうる。こうした成分はワクチンの技術分野の当業者に公知である。適するアジュバントの例は、リポソーム、アルム、モノホスホリルリピドＡ、およびサイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、リガンドのようないずれかの生物学的に活性の因子、ならびに最適にはそれらの組合せを制限なしに包含する。これらの生物学的に活性の因子のあるものは例えばプラスミド若しくはウイルスベクターを介してｉｎ ｖｉｖｏで発現させ得る。例えば、こうしたアジュバントは、抗原のみをコードするＤＮＡワクチンでのプライミングに際して生成される免疫応答と比較して抗原特異的免疫応答を高めるように、抗原をコードするプライミングＤＮＡワクチンとともに投与し得る。
組換えアデノウイルスは「免疫原性量」、すなわち所望の細胞をトランスフェクトしかつ免疫応答を誘導するために十分なレベルの選択された遺伝子の発現を提供するためにある投与経路で効果的である組換えアデノウイルスの量で投与する。保護免疫が提供される場合、該組換えアデノウイルスは、感染および／若しくは再発性疾患の予防において有用なワクチン組成物であると考えられる。
あるいは、若しくは加えて、本発明のベクターは、選択された免疫原に対する免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする導入遺伝子を含有しうる。組換えＳＡｄＶ−２８、ＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターは、細胞溶解性Ｔ細胞および該ベクターにより発現される挿入された異種抗原タンパク質に対する抗体の誘導で高度に有効であると期待される。
例えば、免疫原は多様なウイルス科から選択しうる。それに対する免疫応答が望ましいとみられるウイルス科の例は、感冒の症例の約５０％の原因であるライノウイルス属を包含するピコルナウイルス科；ポリオウイルス、コックサッキーウイルス、エコーウイルス
およびＡ型肝炎ウイルスのようなヒトエンテロウイルスを包含するエンテロウイルス属；ならびに主にヒト以外の動物における口蹄疫の原因であるアプトウイルス属を包含する。ウイルスのピコルナウイルス科内の標的抗原はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＧを包含する。別のウイルス科は、流行性胃腸炎の重要な原因病原体であるノーウォーク群のウイルスを包含するカルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）科を包含する。ヒトおよびヒト以外の動物で免疫応答を誘導するための抗原の標的指向化における使用に望ましいなお別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、ならびにベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎を包含するアルファウイルス属、ならびに風疹ウイルスを包含するルビウイルスを包含するトガウイルス科である。フラビウイルス科は、デング熱、黄熱病、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを包含する。他の標的抗原は、Ｃ型肝炎、あるいは伝染性気管支炎ウイルス（家禽）、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、ネコ腸内コロナウイルス（ネコ）、イヌコロナウイルス（イヌ）のような多数のヒト以外のウイルスおよび感冒を引き起こしうるヒト呼吸器コロナウイルスならびに／または非Ａ、非Ｂ若しくは非Ｃ型肝炎を包含するコロナウイルス科から生成しうる。コロナウイルス科内の標的抗原は、Ｅ１（Ｍ若しくはマトリックスタンパク質ともまた呼ばれる）、Ｅ２（Ｓ若しくはスパイクタンパク質ともまた呼ばれるＳ）、Ｅ３（ＨＥ若しくはヘマグルチン−エルテロース（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ−ｅｌｔｅｒｏｓｅ）ともまた呼ばれる）糖タンパク質（全コロナウイルスに存在するわけではない）またはＮ（ヌクレオキャプシド）を包含する。なお他の抗原は、ベシクロウイルス属（例えば水疱性口内炎ウイルス）およびリッサウイルス属（例えば狂犬病）を包含するラブドウイルス科に対し標的とされうる。
ラブドウイルス科内の適する抗原はＧタンパク質若しくはＮタンパク質に由来しうる。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血熱ウイルスを包含するフィロウイルス科は抗原の適する供給源となりうる。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（流行性耳下腺炎ウイルス）、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、麻疹およびイヌジステンパーを包含するモルビリウイルス、ならびにＲＳウイルスを包含するニューモウイルスを包含する。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科内に分類され、そして抗原の適する供給源である（例えばＨＡタンパク質、Ｎ１タンパク質）。ブニヤウイルス科は、ブニヤウイルス属（カリフォルニア脳炎、ラクロス）、フレボウイルス（リフトバレー熱）、ハンタウイルス（プレマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ）はヘマハギン（ｈｅｍａｈａｇｉｎ）熱ウイルスである）、ナイロウイルス（ナイロビ羊病）および多様な割り当てられていないブンガウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓ）を包含する。アレナウイルス科はＬＣＭおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス、ロタウイルス（小児で急性胃腸炎を引き起こす）、オルビウイルスおよびクルチウイルス（ｃｕｌｔｉｖｉｒｕｓ）（コロラドダニ熱、レボンボ（ヒト）、ウマ脳症、ブルータング）属を包含する。
レトロウイルス科は、ネコ白血病ウイルス、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩ、レンチビリナル（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｌ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびスプマビリナル（ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｌ）を包含する）のようなヒトおよび家畜の疾患を包含するオンコリビリナル（ｏｎｃｏｒｉｖｉｒｉｎａｌ）亜科を包含する。レンチウイルスのなかで多くの適する抗原が記述されそして容易に選択し得る。適するＨＩＶおよびＳＩＶ抗原の例は、ｇａｇ、ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｘ、ＶＰＲ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、ＮｅｆおよびＲｅｖタンパク質、ならびにそれらの多様なフラグメントを制限なしに包含する。例えば、Ｅｎｖタンパク質の適するフラグメントは、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ
４１のようなそのサブユニット、若しくは例えば長さ最低約８アミノ酸のそれらのより小さいフラグメントのいずれも包含しうる。同様にｔａｔタンパク質のフラグメントも選択しうる。（米国特許第５，８９１，９９４号明細書および米国特許第６，１９３，９８１号明細書を参照されたい。）Ｄ．Ｈ．Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５（５）：２４６２−２４６７（Ｍａｒｃｈ ２００１）およびＲ．Ｒ．Ａｍａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）に記述されるＨＩＶおよびＳＩＶタンパク質もまた参照されたい。別の例において、ＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶの免疫原性タンパク質若しくはペプチドを使用して融合タンパク質若しくは他の免疫原性分子を形成しうる。例えば、２００１年８月２日公開の第ＷＯ ０１／５４７１９号明細書および１９９９年４月８日公開の第ＷＯ ９９／１６８８４号明細書に記述されるＨＩＶ−１ Ｔａｔおよび／若しくはＮｅｆ融合タンパク質ならびに免疫化レジメンを参照されたい。本発明は本明細書に記述されるＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶ免疫原性タンパク質若しくはペプチドに制限されない。加えて、これらのタンパク質に対する多様な改変が記述されているか、若しくは当業者により容易に作成され得る。例えば米国特許第５，９７２，５９６号明細書に記述される改変ｇａｇタンパク質を参照されたい。さらに、いかなる所望のＨＩＶおよび／若しくはＳＩＶ免疫原も単独若しくは組合せで送達しうる。こうした組合せは単一ベクター若しくは複数のベクターからの発現を包含しうる。場合によっては、別の組合せは、タンパク質の形態の免疫原の１種若しくはそれ以上の送達を伴う１種若しくはそれ以上の発現された免疫原の送達を必要としうる。こうした組合せを下により詳細に論考する。
パボーバウイルス科は、ポリオーマウイルス亜科（ＢＫＵおよびＪＣＵウイルス）ならびにパピローマウイルス亜科（癌若しくは乳頭腫の悪性の進行と関連する）を包含する。アデノウイルス科は呼吸器疾患および／若しくは腸炎を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を包含する。パルボウイルス科ネコパルボウイルス（ネコ腸炎）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科は、シンプレックスウイルス（ＨＳＶＩ、ＨＳＶＩＩ）属、バリセロウイルス（偽性狂犬病、帯状疱疹）を包含するアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属（ＨＣＭＶ、ムロメガロウイルス）を包含するベータヘルペスウイルス亜科、ならびに、リンホクリプトウイルス属、ＥＢＶ（バーキットリンパ腫）、伝染性鼻気管炎、マレック病ウイルスならびにラジノウイルス属を包含するガンマヘルペスウイルス亜科を包含する。ポックスウイルス科は、オルトポックスウイルス属（大疱瘡（天然痘）およびワクシニア（牛痘））、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含するチョルドポックスウイルス亜科、ならびにエントモポックスウイルス亜科を包含する。ヘパドナウイルス科はＢ型肝炎ウイルスを包含する。抗原の適する供給源となりうる１種の分類されないウイルスはＤ型肝炎ウイルスである。なお他のウイルス供給源は、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを包含しうる。アルファウイルス科はウマ動脈炎ウイルスおよび多様な脳炎ウイルスを包含する。
他の病原体に対しヒト若しくはヒト以外の動物を免疫するのに有用である免疫原は、例えば、ヒトおよびヒト以外の脊椎動物を感染させる細菌、真菌、寄生性微生物若しくは多細胞寄生動物、または癌細胞若しくは腫瘍細胞からを包含する。細菌性病原体の例は、病原性グラム陽性球菌を包含するは肺炎球菌；ブドウ球菌；および連鎖球菌を包含する。病原性グラム陰性球菌は髄膜炎菌；淋菌を包含する。病原性腸グラム陰性桿菌は、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；シュードモナス、アシネトバクテリア（ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびエイケネラ（ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）；類鼻疽；サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；シゲラ（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；ヘモフィルス（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）；モラクセラ（ｍｏｒａｘｅｌｌａ）；軟性下疳菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）（軟性下疳を引き起こす）；ブルセラ（ｂｒｕｃｅｌｌａ）；野兎病菌（Ｆｒ
ａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病を引き起こす）；エルジニア（ｙｅｒｓｉｎｉａ）（パスツレラ）；ストレプトバシラス モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）およびスピリルムを包含し；グラム陽性桿菌は、リステリア モノシトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；エリジペロスリックス ルシオパチエ（ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ジフテリア）；コレラ；炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）；ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）；およびバルトネラ症を包含する。病原性嫌気性細菌により引き起こされる疾患は破傷風；ボツリヌス中毒；他のクロストリジア（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）；結核；らい；および他のミコバクテリアを包含する。病原性スピロヘータ疾患は梅毒；トレポネーマ症；イチゴ腫、ピンタおよび風土病性梅毒；ならびにレプトスピラ症を包含する。より高病原性の細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染症は、放線菌症；ノカルジア症；クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症およびコクシジオイデス真菌症；カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症；スポロトリクス症；パラコクシジオイデス真菌症、ペトリエリジオーシス（ｐｅｔｒｉｅｌｌｉｄｉｏｓｉｓ）、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコーシス；ならびに皮膚糸状菌症を包含する。リケッチア感染症は、発疹チフス、ロッキー山熱、Ｑ熱およびリケッチア痘を包含する。マイコプラスマおよびクラミジア感染症の例は：マイコプラスマ肺炎；性病性リンパ肉芽腫；オウム病；および周産期クラミジア感染症を包含する。病原性真核生物は病原性原生動物および蠕虫を包含し、また、それらにより生じられる感染症は：アメーバ症；マラリア；リーシュマニア；トリパノソーマ症；トキソプラスマ症；ニューモシスチス カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）；Ｔｒｉｃｈａｎｓ；トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；バベシア症；ジアルジア症；旋毛虫症；フィラリア症；住血吸虫症；線虫；吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）すなわち吸虫（ｆｌｕｋｅｓ）；および条虫（ｃｅｓｔｏｄｅ）（条虫（ｔａｐｅｗｏｒｍ））感染症を包含する。
これらの生物体および／若しくはそれらにより産生されるトキシンの多くは、生物学的攻撃での使用のための潜在性を有する剤として疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（（ＣＤＣ）、米国保健省の部門）により特定されている。例えば、これらの生物学的剤のいくつかは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびそのトキシン（ボツリヌス中毒）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、大疱瘡（天然痘）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（野兎病）、ならびにウイルス性出血熱（フィロウイルス（例えばエボラ、マールブルグ）ならびにアレナウイルス（例えばラッサ、マチュポ））（それらの全部は現在カテゴリーＡの剤に分類されている）；コクシエラ ブルネティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）（Ｑ熱）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）スピーシーズ（ブルセラ症）、バークホルデリア マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）（鼻疽）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（メロイドーシス（ｍｅｌｏｉｄｏｓｉｓ））、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）およびそのトキシン（リシントキシン）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）およびそのトキシン（εトキシン）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズおよびそれらのトキシン（エンテロトキシンＢ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病）、水の安全性に対する脅威（例えばコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｌｅｒａｅ）、クリトスポリジウム パルブム（Ｃｒｙｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｈｅｔｔｓｉａ ｐｏｗａｚｅｋｋｉ））、ならびにウイルス性脳炎（アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎；東部ウマ脳炎；西部ウマ脳炎）；（それらの全部は現在カテゴリーＢの剤として分類されている）；ならびにニパンウイルスおよびハン
タウイルス（現在カテゴリーＣの剤として分類されている）を包含する。加えて、そのように分類されるか若しくは異なって分類される他の生物体が将来同定かつ／若しくはこうした目的上使用されうる。本明細書に記述されるウイルスベクターおよび他の構築物が、これらの生物学的剤への感染症若しくはそれらとの他の有害反応を予防かつ／若しくは処置することができる、これらの生物体、ウイルス、それらのトキシン若しくは他の副生成物からの抗原を送達するのに有用であることが容易に理解されるであろう。
Ｔ細胞の可変領域に対する免疫原を送達するためのＳＡｄＶ−２８ベクターの投与はそれらのＴ細胞を排除するためのＣＴＬを包含する免疫応答を導き出すことが予期される。ＲＡにおいて、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−３、Ｖ−１４、Ｖ−１７およびＶα−１７を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達はＲＡに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。ＭＳにおいて、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−７およびＶα−１０を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする核酸配列の送達はＭＳに関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲの数個の特定の可変領域が特徴づけられている。これらのＴＣＲはＶ−６、Ｖ−８、Ｖ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８ならびにＶα−１２を包含する。従って、これらのポリペプチドの最低１種をコードする組換えサルアデノウイルスの送達は強皮症に関与するＴ細胞を標的とすることができる免疫応答を導き出すことができる。
Ｃ．Ａｄ媒介性送達方法
選択された遺伝子の治療レベル若しくは免疫のレベルをモニターしてブースターの必要性（あれば）を決定し得る。ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答若しくは場合によっては血清中の抗体力価の評価後に任意のブースター免疫化が望ましいかもしれない。場合によっては、組換えＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターを、単回投与で、あるいは多様な組合せレジメンで、例えば他の有効成分を必要とする処置のレジメン若しくはクールと組合せで、またはプライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）レジメンで送達しうる。多様なこうしたレジメンが当該技術分野で記述されており、そして容易に選択されうる。
例えば、プライム−ブーストレジメンは、タンパク質、若しくはこうした抗原をコードする配列を保有する組換えウイルスのような、伝統的な抗原を用いる第二のブースター投与に対し免疫系をプライミングするためのＤＮＡ（例えばプラスミド）に基づくベクターの投与を必要としうる。例えば２０００年３月２日公開の第ＷＯ ００／１１１４０号明細書（引用することにより組み込まれる）を参照されたい。あるいは、免疫化レジメンは、抗原を保有するベクター（ウイルス若しくはＤＮＡに基づくのいずれか）またはタンパク質に対する免疫応答を増強するための組換えＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターの投与を必要としうる。なお別の代替において、免疫化レジメンは、タンパク質、次いで抗原をコードするベクターを含むブースターの投与を必要とする。
一態様において、選択された抗原を保有するプラスミドＤＮＡベクターを送達すること、次いで組換えＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターを用いて増強することによる、前記抗原に対する免疫応答のプライミングおよび増強方法が記述される。一態様において、プライム−ブーストレジメンはプライムおよび／若しくはブースト媒体からの多タンパク質の発現を必要とする。例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶに対する免疫応答を生成させるのに
有用なタンパク質サブユニットの発現のための多タンパク質レジメンを記述するＲ．Ｒ．Ａｍａｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４（６ Ａｐｒｉｌ ２００１）を参照されたい。例えば、ＤＮＡプライムは、単一転写物からのＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、ＶＰＸおよびＶｐｒならびにＥｎｖ、ＴａｔおよびＲｅｖを送達しうる。あるいは、ＳＩＶ Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＨＩＶ−１ Ｅｎｖを組換えＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５アデノウイルス構築物中で送達する。なお他のレジメンは第ＷＯ ９９／１６８８４号明細書および第ＷＯ ０１／５４７１９号明細書に記述されている。
しかしながら、該プライム−ブーストレジメンはＨＩＶについての免疫化若しくはこれらの抗原の送達に制限されない。例えば、プライミングは、第一のＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターを用いて送達すること、次いで第二のＡｄベクター、若しくはタンパク質の形態の抗原それ自体を含有する組成物を用いて増強することを必要としうる。一例において、該プライム−ブーストレジメンは、抗原が由来するウイルス、細菌若しくは他の生物体に対する保護免疫応答を提供し得る。別の態様において、該プライム−ブーストレジメンは、治療が投与されている状態の存在の検出のための慣例アッセイを使用して測定し得る治療効果を提供する。
プライミング組成物は、所望の免疫応答が標的にされている抗原に依存する用量依存性の様式で体内の多様な部位に投与しうる。量若しくは注入（１個若しくは複数）の場所または製薬学的担体は制限でない。むしろ、該レジメンは、そのそれぞれが毎時、毎日、毎週若しくは毎月または毎年投与される単一用量若しくは投与量を包含しうるプライミングおよび／若しくは増強段階を必要としうる。一例として、哺乳動物は、担体中に約１０μｇないし約５０μｇの間のプラスミドを含有する１若しくは２用量を受領しうる。ＤＮＡ組成物の所望の量は約１μｇないし約１０，０００μｇの間のＤＮＡベクターの範囲にわたる。投与量は被験体体重約１ｋｇあたり約１μｇから１０００μｇのＤＮＡまで変動しうる。送達の量若しくは部位は、望ましくは哺乳動物の正体および状態に基づいて選択する。
哺乳動物への抗原の送達に適するベクターの投与量単位を本明細書に記述する。該ベクターは、等張の塩水；こうした投与の当業者に明らかであろう等張塩溶液若しくは他の製剤のような製薬学的若しくは生理学的に許容できる担体中に懸濁若しくは溶解されることにより投与のために調製される。適切な担体は当業者に明らかであることができ、そして投与経路に大きな部分依存することができる。本明細書に記述される組成物は、生物分解性の生物適合性ポリマーを使用する徐放製剤で、若しくはミセル、ゲルおよびリポソームを使用するオンサイト（ｏｎ−ｓｉｔｅ）送達により、上述された経路により哺乳動物に投与しうる。場合によっては、プライミング段階は、本明細書に定義されるようなアジュバントの適する量をプライミング組成物とともに投与することもまた包含する。
好ましくは、増強組成物は、哺乳動物被験体にプライミング組成物を投与した約２ないし約２７週後に投与する。増強組成物の投与は、プライミングＤＮＡワクチンにより投与されると同一の抗原を含有する若しくは送達することが可能な有効量の増強組成物を使用して成し遂げる。該増強組成物は、同一ウイルス供給源（例えば本発明のアデノウイルス配列）若しくは別の供給源由来の組換えウイルスベクターから構成しうる。あるいは、「増強組成物」は、プライミングＤＮＡワクチンにコードされると同一の抗原をしかしタンパク質若しくはペプチドの形態で含有する組成物であり得、この組成物が宿主中で免疫応答を誘導する。別の態様において、増強組成物は、哺乳動物細胞中でのその発現を指図する制御配列の制御下に抗原をコードするＤＮＡ配列、例えば公知の細菌若しくはウイルスベクターのようなベクターを含有する。増強組成物の主要件は、該組成物の抗原がプライ
ミング組成物によりコードされるものと同一の抗原若しくは交差反応性抗原であることである。
別の態様において、ＳＡｄＶ−２８ベクターは多様な他の免疫化および治療レジメンでの使用にもまた良好に適する。こうしたレジメンは、異なる血清型キャプシドのＡｄベクターと同時若しくは連続してのＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターの送達、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターをＡｄ以外のベクターと同時若しくは連続送達するレジメン、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５ベクターをタンパク質、ペプチドおよび／または他の生物学的に有用な治療若しくは免疫原性化合物と同時若しくは連続送達するレジメンを必要としうる。こうした用途は当業者に容易に明らかであろう。
以下の実施例は、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３および／若しくはＳＡｄＶ−３５のクローニングおよび例示的組換えＳＡｄＶ−２８ベクターの構築を具体的に説明する。これらの実施例は具体的説明のみであり、そして本発明の範囲を制限しない。
サルアデノウイルスの単離。
糞便サンプルは、ルイジアナ大学ニューイベリア研究センター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）、４４０１ Ｗ．Ａｄｍｉｒａｌ Ｄｏｙｌｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｉｂｅｒｉａ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，ＵＳＡのチンパンジーのコロニー、およびテキサス大学Ｍ．Ｄ．アンダーソンがんセンターマイケル・Ｅ．キーリング比較医学研究センター（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅ．Ｋｅｅｌｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｂａｓｔｒｏｐ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡのチンパンジーのコロニーから得た。ハンクス緩衝塩類溶液の懸濁液中のチンパンジー糞便サンプルからの上清を０．２ミクロンシリンジフィルターを通して除菌した。各濾過したサンプル１００μｌをヒト細胞株Ａ５４９培養物に接種した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むハムＦ１２中で増殖させた。培養約１ないし２週後に数回の接種を伴う細胞培養物で視覚的細胞変性効果（ＣＰＥ）が明らかであった。該アデノウイルスを、アデノウイルス精製のための標準的な公表された塩化セシウム勾配技術を使用して、Ａ５４９細胞中の培養物から精製した。精製したアデノウイルスからのＤＮＡを単離し、そしてＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｒｖｉｃｅｓ、独国ヒルデンにより完全に配列決定された。
ウイルスＤＮＡ配列の系統発生分析に基づき、サルアデノウイルス２７（ＳＡｄＶ−２７）、サルアデノウイルス２８（ＳＡｄＶ−２８）、サルアデノウイルス２９（ＳＡｄＶ−２９）、サルアデノウイルス３２（ＳＡｄＶ−３２）、サルアデノウイルス３３（ＳＡｄＶ−３３）およびサルアデノウイルス３５（ＳＡｄＶ−３５）と呼称されるアデノウイルスが、ヒトサブグループＢと同一のサブグループにあることを決定した。
該ベクターを創製するのに使用した方法論は、全Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの細菌プラスミド分子クローンを最初に創製すること、次いで該ウイルスベクターをレスキューするためのＥ１補完細胞株ＨＥＫ ２９３への該プラスミドＤＮＡのトランスフェクションであった。
Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの分子クローンを創製するために、まれに切断する（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ）制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位がＥ１欠失の代わりに挿入されているＥ１欠失アデノウイルスのプラスミド分子クローンを最初に創製した。Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩにより隣接されかつこれらの制限酵素を使用して切り出される発現カセットを、該Ｅ１欠失アデノウイルスプラスミドクローンに連結した。Ｅ１欠失の代わりに所望の発現カセットを持つプラスミドアデノウイルス分子クローンを、該組換えアデノウイルスベクターをレスキューするためにＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後のレスキューは、制限酵素消化によるプラスミドからの直鎖状アデノウイルスゲノムを最初に放出することにより促進されることが見出された。
Ｅ１欠失組換えアデノウイルスベクターの誘導を促進するためのサルサブグループＢアデノウイルス２７、−２８、−２９、−３２、−３３および−３５に基づくＥ１欠失プラスミド分子クローンの構築。
公表された報告ならびにＡｄＣ１（ＳＡｄＶ−２１）での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、種ＢアデノウイルスＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２およびＳＡｄＶ−３５に基づくベクターを、ＡｄＣ１を使用してハイブリッドアデノウイルスベクターを構築するという以前に記述された戦略（Ｒｏｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１；Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき構築した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
サブグループＢアデノウイルスベクターの構築のための出発プラスミドは、ＡｄＣ１キメラベクターの構築で中間体として構築されたもの、すなわち２００５年１月６日公開の第ＷＯ ２００５／００１１０３ Ａ３号明細書に記述されるところのｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩであった。プラスミドｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩは、ＥｃｏＲＩ制限部位間で内的に欠失されたＥ１欠失キメラＰａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）およびＡｄ Ｃ１（ＳＡｄＶ−２１）アデノウイルスゲノムを持つ。加えて、まれに切断する制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位が、導入遺伝子カセットの容易な挿入を促進するためにＥ１欠失の代わりに存在する。
Ａ．標準的分子生物学技術を使用するＳＡｄＶ−２７に基づくＥ１欠失プラスミド分子クローンの構築
公表された報告およびＡｄＣ１での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、ハイブリッドアデノウイルスを、ＡｄＣ１を使用する戦略（Ｒｏｙら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１； Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき生成した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
１．リンカーの挿入
ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩからのＡｄ Ｃ１セグメント（ＣｌａＩとＥｃｏＲＩの間）を、オリゴマーＳＡＤ２７ ｔｏｐおよびＳＡＤ２７ ｂｏｔをアニーリングすることにより創製されるＤＮＡリンカーで置き換えた。配列番号１９８：ＳＡＤ２７ ｔｏｐ−ＣＧＣＧＣＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＣＧＴＡ−ＣＣＣＡＣＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧおよび配列番号１９９：ＳＡＤ２７ ｂｏｔ−ＡＡＴＴＣＡＡＡ
ＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＧＴＡＣＧＴＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＧＧ。このプラスミドがｐＣ５ｅｎｄｓＳＡＤ２７ ｏｌｉｇｏである。
２．ＰＣＲ
プラスミドｐＣ５ｅｎｄｓＳＡＤ２７ ｏｌｉｇｏをＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＰＣＲ生成した３８７３ｂｐフラグメント（またＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化した）をクローン化してｐＣ５ｅｎｄｓＳＡＤ２７ＰＣＲを創製した。該ＰＣＲフラグメントは、鋳型としてＳＡｄＶ−２７ウイルスＤＮＡを使用し、製造元の説明書に従ってＮＥＢ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲキットを使用してプライマーＳＡＤ２７ ＡｓｃおよびＳＡＤ２７ ＲＩを使用して生成した。該ＰＣＲプライマーはそれぞれＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有した。
配列番号２００：ＳＡＤ２７ Ａｓｃ-ＴＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧ
配列番号２０１：ＳＡＤ２７ ＲＩ−ＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＴＧ
３．ＳＡｄＶ−２７からのＡｓｃＩ（７９５１−１７４５８）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＣ５ｅｎｄｓＳＡＤ２７ＰＣＲをＡｓｃＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２７ウイルスＤＮＡ ＡｓｃＩ（７９５１−１７４５８）フラグメントの９５０７ｂｐフラグメントをクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５ＳＡＤ２７ ＰＣＲ Ａｓｃと呼んだ。
４．ＰａｃＩ（１８４０９−２９０１９）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＣ５ＳＡＤ２７ ＰＣＲ ＡｓｃをＰａｃＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２７ウイルスＤＮＡ ＰａｃＩ（１８４０９−２９０１９）の１０６１０ｂｐフラグメントをクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５Ｃ２７ｄｅｌＡｓｃ−Ｐａｃと呼んだ。
５．ＭｌｕＩ（１６０２６）−ＳｂｆＩ（２３００７）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＣ５Ｃ２７ｄｅｌＡｓｃ−ＰａｃをＭｌｕＩ＋ＳｂｆＩで消化し、そして
ＳＡｄＶ−２７ウイルスＤＮＡ ＭｌｕＩ（１６０２６）−ＳｂｆＩ（２３００７）の６９８１ｂｐフラグメントをクローン化してｐＣ５／Ｃ２７ ＩＰを創製した。
プラスミドｐＣ５／Ｃ２７ ＩＰは、内的な２５６０３ｂｐセグメント（ｂｐ＃７９５５−ｂｐ＃３３５５７）がＳＡｄＶ−２７からの機能的に類似の２４７５３ｂｐ（ｂｐ＃７９５１−ｂｐ＃３２，７０３）セグメントにより置き換えられているＥ１欠失Ａｄ Ｐａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）ウイルスＤＮＡを持つ。すなわち、これは、プレ末端タンパク質（ｐｒｅ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、５２／５５Ｋタンパク質、ペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｍｕ、ヘキソン、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、１００Ｋ足場タンパク質、３３Ｋタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｅ３領域およびファイバーのＳＡｄＶ−２２遺伝子のＳＡｄＶ−２７からのものでの置換をもたらす。ＳＡｄＶ−２７フラグメントの左端のＡｓｃＩ部位はＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームの最初（１１９２残基タンパク質の残基２３６）にあり、そしてキメラタンパク質をもたらす。ＳＡｄＶ−２７フラグメントの右端を構成するＥｃｏＲＩ部位はＥ４ ｏｒｆ ６／７のオープンリーディングフレーム内にある。該右端を、再生されるＥ４ ｏｒｆ ６／７翻訳産物がＡｄ Ｐａｎ ５とＳＡｄＶ−２７の間のキメラであるようなＡｄ Ｐａｎ ５からのＰＣＲ生成した右端フラグメントに連結した。
Ｂ．標準的分子生物学技術を使用するＳＡｄＶ−２８に基づくＥ１欠失プラスミド分子クローンの構築
公表された報告およびＡｄＣ１での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、ハイブリッドアデノウイルスを、ＡｄＣ１を使用する戦略（Ｒｏｙら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１；Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき生成した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
出発プラスミドは、ＡｄＣ１キメラベクターの構築で中間体として構築されたもの、すなわち２００５年１月６日公開の第ＷＯ ２００５／００１１０３ Ａ３号明細書に記述されるところのｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩであった。
１．ＰＣＲ
ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩからのＡｄ Ｃ１セグメント（ＣｌａＩとＥｃｏＲＩの間）を、ＳＡｄＶ−２８ウイルスＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ生成したフラグメントで置き換えた。ＰＣＲプライマーはそれぞれＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有する。プライマーＣＣＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣ（配列番号３３（Ｗ３３ ｆｗｄ、Ｔｍ −６４．５°））およびＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧ（配列番号３４）を使用した。プライマー「Ｗ３３ ｆｗｄ」はＣｌａＩ部位（下線を付けられる）を含有する。ＣｌａＩ部位の後の２塩基は野生型配列でＣＡであるが、しかし該プライマー中でＣｌａＩ部位を細菌中でメチル化されないものに転化するようにＧＣに変化されている。この変化は、１０６アミノ酸のＥ３タンパク質中で１アミノ酸を変え（Ｓ９４Ｃ）、これはＡｄ４の推定の１１Ｋタンパク質ＣＲ１δに相同である）。プライマー「Ｗ３３ ｒｅｖ」はＥｃｏＲＩ部位（下線を付けられる）を含有する。対応する野生型Ａｄ配列はＧＡＡＴＣＣである。該変化された塩基は、この変化により変えられないイソロイシン（Ｅ４ ｏｒｆ ６／７タンパク質の残基１２３）のコドンである。ＣｌａＩ部位はＳＡｄＶ−２８の３０２７３のものと同一であり；Ａｄ Ｐａｎ
５からのＥ４領域にそれをスプライシングすることがキメラＥ４ ｏｒｆ ６／７を創製する（ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中のＥｃｏＲＩ部位がＡｄ Ｐａｎ ５ Ｅ４ ｏｒｆ ６／７タンパク質のオープンリーディングフレーム内にある）ように、ＥｃｏＲＩ部位を該プライマー中で創製した。
ＰＣＲはＮＥＢ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよび製造元により供給される緩衝液を使用して実施した。
２４７４ｂｐの産物をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋中に同一の２部位間にクローン化してｐＢＳ Ｗ３３ ＰＣＲを生じた。プラスミドｐＢＳ Ｗ３３ ＰＣＲをＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして２４５３ｂｐのＰＣＲ由来（元は）フラグメントをｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中に同一の２部位間にクローン化してｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲ１−Ｗ３３ ＰＣＲを生じた。
２．ＡｓｃＩ（１１０６５）ないしＣｌａＩ（１８５７７）フラグメントの挿入（ｐｏｌ遺伝子中に存在するＡｓｃＩ部位と唯一のＣｌａＩ部位の間）。
プラスミドｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲ１−Ｗ３３ ＰＣＲをＡｓｃＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２８ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（１１０６５）ないしＣｌａＩ（１８５７７）フラグメント（ｐｏｌ遺伝子中に存在するＡｓｃＩ部位と唯一のＣｌａＩ部位の間）をクローン化してｐＰａｎ５−Ｗ３３ ｄｅｌＡｓｃ ｄｅｌＣｌａを生じた。
３．ＡｓｃＩ（７９４１）ないしＡｓｃＩ（１１０６５）フラグメントの挿入（キメラポリメラーゼ遺伝子を創製するため）。
プラスミドｐＰａｎ５−Ｗ３３ ｄｅｌＡｓｃ ｄｅｌＣｌａをＡｓｃＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２８ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（７９４１）ないしＡｓｃＩ（１１０６５）フラグメントをクローン化した（キメラポリメラーゼ遺伝子を創製する）。正しい向きをもつクローンをｐＰａｎ５−Ｗ３３ ｄｅｌ Ｃｌａと呼んだ。
４．ＣｌａＩ（１８５７７）ないしＣｌａＩ（３０２７３）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＰａｎ５−Ｗ３３ ｄｅｌ ＣｌａをＣｌａＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２８ウイルスＤＮＡのＣｌａＩ（１８５７７）ないしＣｌａＩ（３０２７３）フラグメントをクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５／Ｃ２８ ＩＰと呼んだ。
プラスミドｐＣ５／Ｃ２８ ＩＰは、内的な２５６０３ｂｐセグメント（ｂｐ＃７９５５−ｂｐ＃３３５５７）がＳＡｄＶ−２８からの機能的に類似の２４７７９ｂｐ（ｂｐ＃７９４６−ｂｐ＃３２６５７）セグメントにより置き換えられているＥ１欠失Ａｄ Ｐａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）ウイルスＤＮＡを持つ。すなわち、これは、プレ末端タンパク質、５２／５５Ｋタンパク質、ペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｍｕ、ヘキソン、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、１００Ｋ足場タンパク質、３３Ｋタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｅ３領域およびファイバーのＳＡｄＶ−２２遺伝子のＳＡｄＶ−２８からのものでの置換をもたらす。ＳＡｄＶ−２８フラグメントの左端のＡｓｃＩ部位は、ＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームの最初（１１９２残基タンパク質の残基２３６）にあり、そしてキメラタンパク質をもたらす。ＳＡｄＶ−２８フラグメントの右端を構成するＥｃｏＲＩ部位は４ ｏｒｆ ６／７のオープンリーディングフレーム内にある。該右端を、再生されるＥ４ ｏｒｆ ６／７翻訳産物がＡｄ Ｐａｎ ５とＳＡｄＶ−２８の間のキメラであるようなＡｄ Ｐａｎ ５からのＰＣＲ生成した右端フラグメントに連結した。
Ｃ．標準的分子生物学技術を使用するＳＡｄＶ−２９に基づくプラスミド分子クローンの構築
公表された報告およびＡｄＣ１での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、ハイブリッドアデノウイルスを、ＡｄＣ１を使用する戦略（Ｒｏｙら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１；Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき生成した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
出発プラスミドは、ＡｄＣ１キメラベクターの構築で中間体として構築されたもの、すなわち２００５年１月６日公開の第ＷＯ ２００５／００１１０３ Ａ３号明細書に記述されるところのｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩであった。
１．ＰＣＲ
ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩからのＡｄ Ｃ１セグメント（ＣｌａＩとＥｃｏＲＩの間）を、ＳＡｄＶ−２９ウイルスＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ生成したフラグメントで置き換えた。ＰＣＲプライマーはそれぞれＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有する。プライマーＣＣＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣ（配列番号３３）およびＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧ（配列番号３４）を使用した。プライマー「Ｗ３３ ｆｗｄ」はＣｌａＩ部位（下線を付けられる）を含有する。ＣｌａＩ部位の後の２塩基は野生型配列でＣＡであるが、しかし該プライマー中で細菌中でＣｌａＩ部位をメチル化されないものに転化するようにＧＣに変化されている。この変化は、１０６アミノ酸のＥ３タンパク質中で１アミノ酸（Ｓ９４Ｃ）を変え、これはＡｄ４の推定の１１Ｋタンパク質ＣＲ１δに相同である）。プライマー「Ｗ３３ ｒｅｖ」は
ＥｃｏＲＩ部位（下線を付けられる）を含有する。対応する野生型Ａｄ配列はＧＡＡＴＣＣである。変化された塩基は、この変化により変えられないイソロイシン（Ｅ４ ｏｒｆ
６／７タンパク質の残基１２３）のコドンである。
ＣｌａＩ部位はＳＡｄＶ−２９の３０３０３のものと同一であり；Ａｄ Ｐａｎ ５からのＥ４領域にそれをスプライシングすることがキメラＥ４ ｏｒｆ ６／７を創製する（ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中のＥｃｏＲＩ部位がＡｄ Ｐａｎ ５ Ｅ４ ｏｒｆ ６／７タンパク質のオープンリーディングフレーム内にある）ように、ＥｃｏＲＩ部位を該プライマー中で創製した。
ＰＣＲはＮＥＢ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよび製造元により供給される緩衝液を使用して実施した。
２４８０ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中に同一の２部位間にクローン化してｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲ１−Ｃ２９ ＰＣＲを生じた。
２．ＡｓｃＩ（１１０９４）ないしＣｌａＩ（１８５８３）フラグメントの挿入（ｐｏｌ遺伝子中に存在するＡｓｃＩ部位と唯一のＣｌａＩ部位の間）。
プラスミドｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲ１−Ｃ２９ ＰＣＲをＡｓｃＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２９ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（１１０９４）ないしＣｌａＩ（１８５８３）フラグメント（ｐｏｌ遺伝子中に存在するＡｓｃＩ部位と唯一のＣｌａＩ部位の間）をクローン化してｐＰａｎ５−Ｃ２９ ｄｅｌＡｓｃ ｄｅｌＣｌａを生じた。
３．ＡｓｃＩ（７９４５）ないしＡｓｃＩ（１１０９４）フラグメントの挿入（キメラポリメラーゼ遺伝子を創製するため）。
プラスミドｐＰａｎ５−Ｃ２９ ｄｅｌＡｓｃ ｄｅｌＣｌａをＡｓｃＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２９ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（７９４５）ないしＡｓｃＩ（１１０９４）フラグメントをクローン化した（キメラポリメラーゼ遺伝子を創製する）。正しい向きをもつクローンをｐＰａｎ５−Ｃ２９ ｄｅｌ Ｃｌａと呼んだ。
４．ＣｌａＩ（１８５８３）ないしＣｌａＩ（３０３０３）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＰａｎ５−Ｃ２９ ｄｅｌ ＣｌａをＣｌａＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−２９ウイルスＤＮＡのＣｌａＩ（１８５８３）ないしＣｌａＩ（３０３０３）フラグメントをクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５／Ｃ２９ ＩＰと呼んだ。プラスミドｐＣ５／Ｃ２９ ＩＰは、内的な２５６０３ｂｐセグメント（ｂｐ＃７９５５−ｂｐ＃３３５５７）がＳＡｄＶ−２９からの機能的に類似の２４８１７ｂｐ（ｂｐ＃７９４５−ｂｐ＃３２７６１）セグメントにより置き換えられているＥ１欠失Ａｄ Ｐａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）ウイルスＤＮＡを持つ。すなわち、これは、プレ末端タンパク質、５２／５５Ｋタンパク質、ペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｍｕ、ヘキソン、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、１００Ｋ足場タンパク質、３３Ｋタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｅ３領域およびファイバーのＳＡｄＶ−２２遺伝子のＳＡｄＶ−２９からのものでの置換をもたらす。ＳＡｄＶ−２９フラグメントの左端のＡｓｃＩ部位はＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームの最初（１１９２残基タンパク質の残基２３６）にあり、そしてキメラタンパク質をもたらす。ＳＡｄＶ−２９フラグメントの右端を構成するＥｃｏＲＩ部位はＥ４ ｏｒｆ ６／７のオープンリーディングフレーム内にある。該右端を、再生されるＥ４ ｏｒｆ ６／７翻訳産物がＡｄ Ｐａｎ ５とＳＡｄＶ−２９の間のキメラであるようなＡｄ Ｐａｎ ５からのＰＣＲ生成した右端フラグメントに連結した。
Ｄ．標準的分子生物学技術を使用するＳＡｄＶ−３２に基づくプラスミド分子クローンの構築
公表された報告およびＡｄＣ１での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、ハイブリッドアデノウイルスを、ＡｄＣ１を使用する戦略（Ｒｏｙら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１；Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき生成した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
出発プラスミドは、ＡｄＣ１キメラベクターの構築で中間体として構築されたもの、すなわち２００５年１月６日公開の第ＷＯ ２００５／００１１０３ Ａ３号明細書に記述されるところのｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩであった。
１．ＰＣＲ
ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩからのＡｄ Ｃ１セグメント（ＣｌａＩとＥｃｏＲＩの間）を、鋳型としてＳＡｄＶ−３２ウイルスＤＮＡを使用してＰＣＲ生成したフラグメントで置き換えた。
プライマー、配列番号２０２：ＴＴＧＴＡＧＣＡＴＡＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧ（Ｃ３２ ｆｗｄ）および配列番号ＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＧ（配列番号３４（Ｗ３３ ｒｅｖ））を使用した。プライマー「Ｗ３３ ｒｅｖ」はＥｃｏＲＩ部位（下線を付けられる）を含有する。対応する野生型Ａｄ配列はＧＡＡＴＣＣである。変えられた塩基は、この変化により変えられないＥ４ ｏｒｆ ６／７タンパク質のイソロイシンのコドン中にある。Ａｄ Ｐａｎ５からＥ４領域にそれをスプライシングすることがキメラＥ４ ｏｒｆ ６／７を創製するように該プライマー中でＥｃｏＲＩ部位を創製した（ｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中のＥｃｏＲＩ部位はＡｄ Ｐａｎ ５ Ｅ４ ｏｒｆ ６／７タンパク質のオープンリーディングフレーム内にある）。
ＰＣＲはＮＥＢ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼおよび製造元により供給される緩衝液を使用して実施した。
２２５９ｂｐの産物をＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩ中に同一の２部位間にクローン化してｐＰａｎ５Ｃ１ Ｃ３２ ＰＣＲを生じた。
２．ＳＡｄＶ−３２のＡｓｃＩ（７９４５）ないしＭｌｕＩ（１６０５８）フラグメントの挿入（ｐｏｌ遺伝子中に存在するＡｓｃＩ部位と唯一のＭｌｕＩ部位の間）。
プラスミドｐＰａｎ５Ｃ１ Ｃ３２ ＰＣＲをＡｓｃＩおよびＭｌｕＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−３２ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（７９４５）ないし ＭｌｕＩ（１６０５８）フラグメントをクローン化してＰａｎ５／Ｃ３２ ｄｅｌ Ｍｌｕを生じた。
３．ＭｌｕＩ（１６０５８ないし３０５１０）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＰａｎ５／Ｃ３２ ｄｅｌ ＭｌｕをＭｌｕＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−３２ウイルスＤＮＡのＭｌｕＩ（１６０５８ないし３０５１０）フラグメントをクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５／Ｃ３２ ＩＰと呼んだ。
プラスミドｐＣ５／Ｃ３２ ＩＰは、内的な２５６０３ｂｐセグメント（ｂｐ＃７９５５−ｂｐ＃３３５５７）がＳＡｄＶ−３２からの機能的に類似の２４８１７ｂｐ（ｂｐ＃７９４５−ｂｐ＃３２７６１）セグメントにより置き換えられているＥ１欠失Ａｄ Ｐａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）ウイルスＤＮＡを持つ。すなわち、これは、プレ末端タンパク
質、５２／５５Ｋタンパク質、ペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｍｕ、ヘキソン、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、１００Ｋ足場タンパク質、３３Ｋタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｅ３領域およびファイバーのＳＡｄＶ−２２遺伝子のＳＡｄＶ−３２からのものでの置換をもたらす。ＳＡｄＶ−３２フラグメントの左端のＡｓｃＩ部位はＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームの最初（１１９２残基タンパク質の残基２３６）にあり、そしてキメラタンパク質をもたらす。ＳＡｄＶ−３２フラグメントの右端を構成するＥｃｏＲＩ部位はＥ４ ｏｒｆ ６／７のオープンリーディングフレーム内にある。該右端を、再生されるＥ４ ｏｒｆ ６／７翻訳産物がＡｄ Ｐａｎ ５とＳＡｄＶ−３２の間のキメラであるようなＡｄ Ｐａｎ ５からのＰＣＲ生成した右端フラグメントに連結した。
Ｅ．標準的分子生物学技術を使用するＳＡｄＶ−３５に基づくＥ１欠失プラスミド分子クローンの構築
公表された報告およびＡｄＣ１での発明者の経験の双方が、サブグループＢアデノウイルス中のＥ１欠失がＨＥＫ ２９３細胞中でＡｄ５ Ｅ１遺伝子により補完されないことを示したため、ハイブリッドアデノウイルスを、ＡｄＣ１を使用する戦略（Ｒｏｙら、Ｊ
Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）１４１、１４−２１；Ｒｏｙら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（２００６）８７、２４７７−２４８５）に基づき生成した。ここでキメラ構築物の左および右端はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ ５（サルアデノウイルス２２として知られる）由来である。
出発プラスミドは、ＡｄＣ１キメラベクターの構築で中間体として構築されたもの、すなわち２００５年１月６日公開の第ＷＯ ２００５／００１１０３ Ａ３号明細書に記述されるところのｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩであった。
１．ＳＡｄＶ−３５のＡｓｃＩ（１１０５８）ないしＥｃｏＲＩ（２２１９８）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＰａｎ５Ｃ１ｄｅｌＲＩをＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−３５ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩ（１１０５８）ないしＥｃｏＲＩ（２２１９８）フラグメントをクローン化してｐＰａｎ５ＣＩ Ｃ３５ Ａｓｃ−ＲＩを生じた。
２．ＡｓｃＩ（７９２８ないし１１０５８）フラグメントの挿入。
プラスミドｐＰａｎ５ＣＩ Ｃ３５ Ａｓｃ−ＲＩをＡｓｃＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−３５ウイルスＤＮＡのＡｓｃＩフラグメント（７９２８ないし１１０５８）をクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＰａｎ５ＣＩ Ｃ３５ Ａｓｃ−ＲＩ＋Ａｓｃと呼んだ。
３．ＥｃｏＲＩ（２２１９８ないし３２７３８）フラグメントの挿入。
プラスミド ｐＰａｎ５ＣＩ Ｃ３５ Ａｓｃ−ＲＩ＋ＡｓｃをＥｃｏＲＩで消化し、そしてＳＡｄＶ−３５ウイルスＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメント（２２１９８ないし３２７３８）をクローン化した。正しい向きをもつクローンをｐＣ５／Ｃ３５ ＩＰと呼んだ。
プラスミドｐＣ５／Ｃ３５ ＩＰは、内的な２５６０３ｂｐセグメント（ｂｐ＃７９５５−ｂｐ＃３３５５７）がＳＡｄＶ−３５からの機能的に類似の２４８１７ｂｐ（ｂｐ＃７９４５−ｂｐ＃３２７６１）セグメントにより置き換えられているＥ１欠失Ａｄ Ｐａｎ ５（ＳＡｄＶ−２２）ウイルスＤＮＡを持つ。すなわち、これは、プレ末端タンパク質、５２／５５Ｋタンパク質、ペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｍｕ、ヘキソン、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、１００Ｋ足場タンパク質、３３Ｋタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｅ３領域およびファイバーのＳＡｄＶ−２２遺伝子のＳＡｄＶ−３５からのもので
の置換をもたらす。ＳＡｄＶ−３５フラグメントの左端のＡｓｃＩ部位はＤＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレームの最初（１１９２残基タンパク質の残基２３６）にあり、そしてキメラタンパク質をもたらす。ＳＡｄＶ−３５フラグメントの右端を構成するＥｃｏＲＩ部位はＥ４ ｏｒｆ ６／７のオープンリーディングフレーム内にある。該右端を、再生されるＥ４ ｏｒｆ ６／７翻訳産物がＡｄ Ｐａｎ ５とＳＡｄＶ−３５の間のキメラであるようなＡｄ Ｐａｎ ５からのＰＣＲ生成した右端フラグメントに連結した。
Ｆ．Ｅ１欠失アデノウイルスベクター
インフルエンザウイルス核タンパク質を発現するＥ１欠失アデノウイルスベクターを構築するため、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３８９１１９．１）をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化しかつ完全合成した（Ｃｅｌｔｅｋ Ｇｅｎｅｓ、テネシー州ナッシュビル）。ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター、合成イントロン（プラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソンから得た）、コドン最適化したＡ型インフルエンザＮＰコーディング配列およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルから構成される発現カセットを構築した。該プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ ＣＭＶ ＰＩ ＦｌｕＡ ＮＰは、それがそれぞれまれに切断する制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の認識部位により隣接されている上述された発現カセットを持つ。Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの分子クローンを創製するため、まれに切断する制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位がＥ１欠失の代わりに挿入されているＥ１欠失アデノウイルスのプラスミド分子クローンを最初に創製した。該Ｅ１欠失アデノウイルスプラスミドをその後Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、そして発現カセット（同一酵素により消化した）を連結した。生じるアデノウイルスプラスミド分子クローンを、組換えアデノウイルスベクターをレスキューするためＨＥＫ ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後のレスキューが、制限酵素消化により該プラスミドから直鎖状アデノウイルスゲノムを最初に放出することにより促進されることが見出された。
交差中和評価
野生型ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２およびＳＡｄＶ−３５を、直接免疫蛍光によりモニターされる感染阻害中和抗体アッセイを使用して、ヒトアデノウイルス５（亜種Ｃ）およびチンパンジーアデノウイルス７（ＳＡｄＶ−２４）ならびにヒトプールＩｇＧと比較して交差中和活性について評価した。ヒトプールＩｇＧ（Ｈｕ Ｐｏｏｌｅｄ ＩｇＧ）は商業的に購入され、そして一般ヒト集団が曝露される多数の抗原に対する抗体をそれが含有するために、免疫無防備状態の患者での投与に承認されている。ヒトプールＩｇＧについてのサルアデノウイルスに対する中和抗体の存在若しくは非存在は、一般集団におけるこれらのアデノウイルスに対する抗体の頻度の反映である。
該アッセイは後に続くとおり実施した。ＨＡｄＶ−５若しくはＳＡｄＶ−２４を注入したウサギからの血清サンプルを５６℃で３５分間熱不活性化した。野生型アデノウイルス（１０8粒子／ウェル）を無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈し、そしてＤＭＥＭ中の熱不活性化血清サンプルの２倍連続希釈と３７℃で１時間インキュベートした。その後、血清とアデノウイルスの混合物を１０5単層Ａ５４９細胞を含むウェル中でスライドガラスに添加した。１時間後に各ウェル中の細胞に１００μｌの２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭを補充しかつ５％ＣＯ2中３７℃で２２時間培養した。次に、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、そしてパラホルムアルデヒド中の固定（４％、３０分）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ中の透過処理（４℃、２０分）後に、ＤＡＰＩ、およびＨＡ
ｄＶ−５に対し生じさせたヤギＦＩＴＣ標識した広範に交差反応性の抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ）で染色した。感染のレベルはＦＩＴＣ陽性細胞の数を顕微鏡下に計数することにより決定した。ＮＡＢ力価はアデノウイルス感染をナイーブ血清対照と比較して５０％若しくはそれ以上阻害する最高血清希釈として報告する。
＜１／２０という力価値が示される場合、中和抗体濃度は検出限界すなわち１／２０より下であった。
Figure 2015107117
これらのデータは、一般集団にＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９およびＳＡｄＶ−３２に対する検出可能な既存の免疫が存在しないこと；ならびにＳＡｄＶ−２８およびＳＡｄＶ−３５に対する最低限度の免疫反応性が存在することを示す。これらのデータは、さらに、ＨＡｄＶ−５およびＳＡｄＶ−２４と交差反応しない先行する表中のサルアデノウイルスが、アデノウイルスの連続送達を必要とするレジメン、例えばプライム−ブースト若しくは癌治療でに有用であり得ることを示す。
サイトカイン誘導
形質細胞様樹状細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、そして９６ウェルプレート中の培地中で培養しそしてアデノウイルスに感染させた。４８時間後に細胞を遠心沈殿しかつ上清を収集し、そしてインターフェロンαの存在について分析した。
より具体的には、ＰＢＭＣをペンシルベニア大学のＡＩＤＳ研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＣＦＡＲ）免疫学コア（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｃｏｒｅ）から得た。これらの細胞三百万をその後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからの「ヒト形質細胞様樹状細胞単離キット」を、該キットと一緒に提供される説明書に従って使用して形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を単離するのに使用した。このキットを使用する単離は、ＰＢＭＣからｐＤＣを除く全部の他の細胞型を除去することに基づいた。
最終細胞数は通常ドナーごとに変動するがしかし０．４〜０．７百万細胞からの範囲にある。従って、生成されたデータ（下で論考する）は複数ドナーからの細胞の分析に由来
する。とは言え、驚くべきことに、インターフェロン若しくは他のサイトカイン放出に基づくサブグループの分離は、複数ドナーからの細胞を分析する場合でさえ維持される。
細胞を、Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン−Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから）ならびにヒトインターロイキン３（２０ｎｇ／ｍＬ−Ｒ＆Ｄ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で培養した。野生型アデノウイルスを１０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）（１０6細胞／ｍｌの濃度で細胞あたり１０，０００ウイルス粒子）で細胞に直接添加した。４８時間後に細胞を遠心沈殿しそして上清をインターフェロンの存在についてアッセイした。ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、製造元からの推奨されるプロトコルを使用してサイトカインを測定した。
該研究は、サブグループＣアデノウイルスが検出可能な量のＩＦＮαを産生しなかったことを示した（該アッセイは１２５０ｐｇ／ｍＬの検出限界を有する）。対照的に、サブグループＥアデノウイルスの全部の試験したメンバーはＩＦＮαを産生し、そして、全般としてサブグループＢアデノウイルスに比較して有意により多いＩＦＮαを産生した。
多様な他のサイトカインもまたアデノウイルスのスクリーニングで検出された。しかしながら、一般に、サブグループＥアデノウイルスは、サブグループＣアデノウイルスより有意に高レベルのＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８およびＩＰ−１０を産生した。サブグループＢアデノウイルスもまたＩＦＮα、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ１αの誘導においてサブグループＣアデノウイルスを凌いだ。
本研究で有意の細胞溶解が観察されなかったため、これは、感染に関係なく、また、いずれかの有意の量のウイルス複製の非存在下で細胞をサブグループＥアデノウイルスと接触させることにより該サイトカインが産生されることを示唆する。
別の研究（示されない）において、細胞を空のＣ７キャプシドタンパク質（ＡｄサブグループＥ）若しくはＵＶ不活性化アデノウイルスＣ７ウイルスベクター（ＵＶ不活性化は架橋を引き起こしてアデノウイルス遺伝子発現を排除する）いずれかと上述されたとおりインキュベートした。これらの研究で、無傷のＣ７と比較して同一若しくはより高レベルのＩＦＮαが空のキャプシドおよび不活性化ウイルスベクター双方について観察された。
上で列挙される全部の文書は引用することにより本明細書に組み込まれる。多数の改変および変形が上で同定された明細の範囲に包含され、そして当業者に明らかであることが期待される。多様なミニ遺伝子の選択またはベクター若しくは免疫調節物質の選択若しくは投与量のような、組成物および方法に対するこうした改変および変化は、これに付随される請求の範囲の範囲内にあると考えられる。

Claims (21)

  1. （ａ）ＳＡｄＶ−２８のヘキソンタンパク質、配列番号１１のアミノ酸１ないし９４４；ＳＡｄＶ−２７のヘキソンタンパク質、配列番号４９のアミノ酸１ないし９５６；ＳＡｄＶ−２９のヘキソンタンパク質、配列番号８１のアミノ酸１ないし９５４；ＳＡｄＶ−３２のヘキソンタンパク質、配列番号１１３のアミノ酸１ないし９５５；ＳＡｄＶ−３３のヘキソンタンパク質、配列番号１４４のアミノ酸１ないし９５１；ＳＡｄＶ−３５のヘキソンタンパク質、配列番号１７６のアミノ酸１ないし９５６；
    （ｂ）ＳＡｄＶ−２８のペントンタンパク質、配列番号６のアミノ酸１ないし５８２；ＳＡｄＶ−２７のペントンタンパク質、配列番号４４のアミノ酸１ないし５６２；ＳＡｄＶ−２９のペントンタンパク質、配列番号７６のアミノ酸１ないし５７６；ＳＡｄＶ−３２のペントンタンパク質、配列番号１０８のアミノ酸１ないし５８５；ＳＡｄＶ−３３のペントンタンパク質、配列番号１３９のアミノ酸１ないし５７１；ＳＡｄＶ−３５のペントンタンパク質、配列番号１７１のアミノ酸１ないし５６３；および
    （ｃ）ＳＡｄＶ−２８のファイバータンパク質、配列番号２１のアミノ酸１ないし３２３、ＳＡｄＶ−２７のファイバータンパク質、配列番号５９のアミノ酸１ないし３２５；ＳＡｄＶ−２９のファイバータンパク質、配列番号９１のアミノ酸１ないし３２４；ＳＡｄＶ−３２のファイバータンパク質、配列番号１２３のアミノ酸１ないし３１９；ＳＡｄＶ−３３のファイバータンパク質、配列番号１５４のアミノ酸１ないし３２５；ＳＡｄＶ−３５のファイバータンパク質、配列番号１８５のアミノ酸１ないし３５３
    よりなる群から選択されるキャプシドタンパク質を含んでなるキャプシドを有するアデノウイルスであって、
    前記キャプシドが、宿主細胞中でのその転写、翻訳および／若しくは発現を指図する発現制御配列に作動可能に連結されている遺伝子を保有する異種分子を被包化する、上記アデノウイルス。
  2. 複製および被包化に必要な５’および３’アデノウイルスシスエレメントをさらに含んでなる、請求項１に記載のアデノウイルス。
  3. 前記アデノウイルスがＥ１遺伝子の全部若しくは一部を欠く、請求項１に記載のアデノウイルス。
  4. 前記アデノウイルスが複製欠損である、請求項３に記載のアデノウイルス。
  5. 前記ウイルスがハイブリッドキャプシドを有する、請求項５に記載のアデノウイルス。
  6. 前記ベクターが、ＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３およびＳＡｄＶ−３５から選択される１種以上のキャプシドタンパク質を含んでなる、請求項５に記載のアデノウイルス。
  7. ＳＡｄＶヘキソンタンパク質のフラグメントが、長さ約５０アミノ酸のＮ末端若しくはＣ末端切断を伴う配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６のＳＡｄＶヘキソンタンパク質であるか、または：
    配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６のアミノ酸残基１２５ないし４４３；
    配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６のアミノ酸残基１３８ないし４４１；
    配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６のアミノ酸残基１３８ないし１６３；
    配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６のアミノ酸残基１７０ないし
    １７６；および
    配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６に対するのアミノ酸残基４０４ないし４３０
    よりなる群から選択される、サルアデノウイルスヘキソンタンパク質のフラグメントおよびＳＡｄＶに対し異種の核酸配列を含有するヘキソンを含んでなるキャプシドを有する組換えアデノウイルス。
  8. キャプシドがＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５ファイバータンパク質をさらに含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  9. キャプシドがＳＡｄＶ−２８、ＳＡｄＶ−２７、ＳＡｄＶ−２９、ＳＡｄＶ−３２、ＳＡｄＶ−３３若しくはＳＡｄＶ−３５ペントンタンパク質をさらに含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  10. 前記アデノウイルスが、複製および被包化に必要な５’および３’アデノウイルスシスエレメントを含んでなるシュードタイピングされたアデノウイルスであり、前記シスエレメントがアデノウイルス５’末端逆位配列およびアデノウイルス３’末端逆位配列を含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  11. アデノウイルスが、宿主細胞中での産物の発現を指図する配列に作動可能に連結されている前記産物をコードする核酸配列を含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  12. 組換えアデノウイルスが１種若しくはそれ以上のアデノウイルス遺伝子を含んでなる、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  13. 組換えアデノウイルスが複製欠損である、請求項７に記載の組換えアデノウイルス。
  14. 組換えアデノウイルスがアデノウイルスＥ１中で欠失されている、請求項１３に記載の組換えアデノウイルス。
  15. 製薬学的に許容できる担体中の請求項１ないし１４のいずれかに記載のウイルスを含んでなる組成物。
  16. 請求項１ないし１４のいずれかに記載のウイルスを被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法。
  17. 配列番号１のサルアデノウイルス２８核酸１ないし３５６１０およびその相補物；
    配列番号７１のサルアデノウイルス２９核酸１ないし３５６４６およびその相補物；
    配列番号１０３のサルアデノウイルス３２核酸１ないし３５５８８およびその相補物；
    配列番号１３４のサルアデノウイルス３３核酸１ないし３５６９４およびその相補物；ならびに
    配列番号１６６のサルアデノウイルス３５核酸１ないし３５６０６およびその相補物
    よりなる群から選択される、単離されたサルアデノウイルスアデノウイルス核酸。
  18. （ａ）５’末端逆位配列（ＩＴＲ）；
    （ｂ）アデノウイルスＥ１ａ領域；
    （ｃ）アデノウイルスＥ１ｂ領域、若しくはスモールＴ、ラージＴおよびＩＸ領域のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそれらのフラグメント；
    （ｄ）Ｅ２ｂ領域、若しくはｐＴＰ、ポリメラーゼおよびＩＶａ２のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；
    （ｅ）Ｌ１領域、若しくは２８．１ｋＤタンパク質、５２／５５ｋＤタンパク質およびＩＩＩａタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群のなかから選択されるそれらのフラグメント；
    （ｆ）Ｌ２領域、若しくはペントン、ＶＩＩ、ＶＩおよびｐＸ／Ｍｕタンパク質のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；
    （ｇ）Ｌ３領域、またはＶＩ、ヘキソン若しくはエンドプロテアーゼのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；
    （ｈ）Ｅ２ａタンパク質、若しくはＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）のオープンリーディングフレーム；
    （ｉ）Ｌ４領域、若しくは１００ｋＤタンパク質、３３ｋＤホモログおよびＶＩＩＩのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；
    （ｊ）Ｅ３領域、若しくは１２．５Ｋタンパク質、ＣＲ１−α、ｇｐ１９Ｋ；ＣＲ１−β；ＣＲ１−γ；ＲＩＤ−α；ＲＩＤ−β；および１４．７Ｋのオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；
    （ｋ）Ｌ５領域、若しくはファイバータンパク質のオープンリーディングフレームから選択されるそのフラグメント；
    （ｌ）Ｅ４領域、若しくはＥ４ ＯＲＦ６／７、Ｅ４ ＯＲＦ６、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４
    ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ２およびＥ４ ＯＲＦ１のオープンリーディングフレームよりなる群から選択されるそれらのフラグメント；ならびに
    （ｍ）ＳＡｄＶ−２８、配列番号１、ＳＡｄＶ−２７、配列番号３９、ＳＡｄＶ−２９、配列番号７１、ＳＡｄＶ−３２、配列番号１０３、ＳＡｄＶ−３３、配列番号１３４若しくはＳＡｄＶ−３５、配列番号１６６の３’ＩＴＲ
    よりなる群の１種若しくはそれ以上から選択されるサルアデノウイルス核酸配列を含んでなるベクター。
  19. 請求項１８に記載の核酸配列によりコードされるサルアデノウイルスタンパク質。
  20. Ｅ１ａ、配列番号３０、６８、９５、１３１、１６３若しくは１９５；
    Ｅ１ｂ、スモールＴ／１９Ｋ、配列番号２３、６１、９３、１２５、１５６若しくは１８７；
    Ｅ１ｂ、ラージＴ／５５Ｋ、配列番号２、４０、７３、１０４、１３５若しくは１６７；ＩＸ、配列番号３、４１、７３、１０５、１３６若しくは１６８；
    ５２／５５Ｄ、配列番号４、４２、７４、１０６、１３７若しくは１６９；
    ＩＩＩａ、配列番号５、４３、７５、１０７、１３８若しくは１７０；
    ペントン、配列番号６、４４、７６、１０８、１３９若しくは１７１；
    ＶＩＩ、配列番号７、４５、７７、１０９、１４０および１７２；
    Ｖ、配列番号８、４６、７８、１１０、１４１若しくは１７３；
    ｐＸ、配列番号９、４７、７９、１１１、１４２若しくは１７４；
    ＶＩ、配列番号１０、４８、８０、１１２、１４３若しくは１７５；
    ヘキソン、配列番号１１、４９、８１、１１３、１４４若しくは１７６；
    エンドプロテアーゼ、配列番号１２、５０、８２、１１４、１４５若しくは１８９；
    １００ｋＤ、配列番号１３、５１、８３、１１５、１４６若しくは１７７；
    ３３ｋＤ、配列番号３２、７０、９７、１３３、１６５若しくは１９７；
    ２２ｋＤ、配列番号２５、６３、９９、１２７、１５８若しくは１９０；
    ＶＩＩＩ、配列番号１４、５２、８４、１１６、１４７若しくは１７８；
    Ｅ３／１２．５Ｋ、配列番号１５、５３、１００、１１７、１４８若しくは１７９；
    ＣＲ１−α、配列番号２６、６４、８５、１２８、１５９若しくは１９１；
    ｇｐ１９Ｋ、配列番号１６、５４、１０１、１１８、１４９若しくは１８０；
    ＣＲ１−β、配列番号２７、５５、８６、１１９、１６０若しくは１９２；
    ＣＲ１−γ、配列番号１７、５６、８７、１２０、１５０若しくは１８１；
    ＣＲ１−δ、配列番号１８、５７、８８、１５１若しくは１８２；
    ＲＩＤ−α、配列番号１９、６５、８９、１２１、１５２若しくは１８３；
    ＲＩＤ−β、配列番号２８、５８、１０２、１２９、１６１若しくは１９３；
    Ｅ３／１４．７Ｋ、配列番号２０、６６、９０、１２２、１５３若しくは１８４；ならびに
    ファイバー、配列番号２１、５９、９１、１２３、１５４若しくは１８５
    よりなる群から選択される１種若しくはそれ以上のサルアデノウイルスタンパク質を含んでなる組成物。
  21. 請求項２０に記載の組成物を被験体に送達することを含んでなる、アデノウイルス受容体を有する細胞の標的指向化方法であって、ヘキソン、ペントンおよびファイバーから選択される前記組成物１種若しくはそれ以上のサルアデノウイルスＳＡｄＶ−２８、２７、−２９、−３２、−３２および−３５タンパク質。
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