JP2015047110A

JP2015047110A - リゾチーム製剤

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Publication number: JP2015047110A
Application number: JP2013180077A
Authority: JP
Inventors: 小磯　博昭; Hiroaki Koiso; 博昭小磯; 啓治後藤; Keiji Goto
Original assignee: San Ei Gen FFI Inc
Current assignee: San Ei Gen FFI Inc
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-03-16
Anticipated expiration: 2033-08-30
Also published as: JP6211352B2

Abstract

【課題】熱に対して不安定であり、加熱により効力が大幅に低下することが知られているリゾチームの耐熱性を向上させたリゾチーム製剤を提供する。【解決手段】ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの混合物であり、混合物の１０．５％水溶液を９０℃で４０分間加熱し、室温で６時間放置後に６００ｎｍの吸光度が０．０３以下であるリゾチーム製剤。なお、ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの配合比率が１０：１〜５００：１である。【選択図】なし

Description

この発明は、熱に対して不安定であり、加熱により効力が大幅に低下することが知られているリゾチームの耐熱性を向上させたリゾチーム製剤に関するものである。

リゾチーム（Lysozyme,EC 3.2.1.17）は、１９２２年にアレクサンダー・フレミング（ペニシリンの発見でノーベル医学生理学賞を受賞した細菌学者、Alexander Fleming）によって発見され、溶菌をあらわすlysisと、酵素をあらわすenzymeからLysozymeと命名された。ヒトの場合涙や鼻汁、母乳などに含まれており、工業的には卵白から抽出したリゾチームが食品や医薬品に応用されている。

このリゾチームは、真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素であり、この作用があたかも細菌を溶かしているように見えることから溶菌酵素とも呼ばれいる。
リゾチームの真正細菌に対する作用は、グラム染色陽性の菌（以下、グラム陽性菌という）にのみ作用し、グラム染色陰性の菌（以下、グラム陰性菌という）には作用しない。これはそれぞれの菌の構造の違いによるものである。
グラム陽性菌の細胞壁はＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸とがβ−１,４結合した多糖類を主成分とするペプチドグリカン層により構成されていて、ここにリゾチームが作用する。
一方グラム陰性菌は、この細胞壁の外側にさらにリポ多糖による外膜が形成されているため、リゾチームが作用されても細胞壁成分は完全に分解されない。しかし、硬いペプチドグリカン層が分解されるため、その形状は維持できなくなり、球状を呈するようになる。
リゾチームによる溶菌作用を受けやすい菌としては枯草菌（Bacillus subtillis）、Micrococcus lysodeikticusなどが知られている。

このリゾチームは食品の日持ち向上剤としてよく利用されているが、熱に対して不安定であり加熱により効力が大幅に低下することが知られている（非特許文献１参照）
その為、リゾチームを用いた食品の日持ち向上剤としては、効力の低下を補う為に様々な物質との併用が行われている。

リゾチームとＨＬＢ値が１３以上であるショ糖脂肪酸エステルが含有されている食品等に有用な抗菌剤（特許文献１参照）や、ポリグリセリン脂肪酸エステルとリゾチームを併用する食品の保存法（特許文献２参照）や、リゾチーム、低級モノグリセライド、エタノールからなる食品保存剤（特許文献３参照）や、リゾチームと、アラニンとを含有することを特徴とする食品用保存剤（特許文献４参照）や、アジピン酸，クエン酸，酒石酸，フマル酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種の有機酸及び／又はその塩０．１〜３０％，リゾチーム０．０１〜１０％，エタノール０．１〜９０％，及び飽和脂肪酸の炭素数が８〜１２のグリセリン脂肪酸エステル０．０５〜５０％を有効成分として含有する食品用日持ち向上剤（特許文献５参照）や、リゾチーム、グリシン、酢酸ナトリウムおよび１０〜３０重量％のアジピン酸を含有することを特徴とする食品日持向上剤やリゾチーム、グリシン、酢酸ナトリウム、フマル酸および１０〜３０重量％のアジピン酸を含有することを特徴とする食品日持向上剤（特許文献６参照）や、リゾチームの濃度が０．５〜１０％であり、モノカルボン酸及びエタノールからなるリゾチーム製剤（特許文献７参照）や、グリシン及び酢酸ナトリウムと共に、リゾチーム、チアミンラウリル硫酸塩、グリセリン脂肪酸エステル及び孟宗竹抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする赤飯の保存性向上剤（特許文献８参照）や、リゾチーム、酢酸およびビタミンＢ１を含有することを特徴とする魚卵日持向上剤（特許文献９参照）や、リゾチームにアミノ酸と、トレハロース及びＤＥ２０未満のデキストリンの１種以上を含有することを特徴とする食品用日持向上剤（特許文献１０参照）等が提案されている。

また、リゾチーム自身を加工する方法として、リゾチームを加水分解して得られる卵白ペプチドを配合することを特徴とする食品用日持向上剤（特許文献１１参照）や、リゾチームを加水分解して得られた卵白ペプチド１質量部に対して、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルから成る群より選ばれた１種以上の乳化剤を合計０．０１〜４質量部含有させた日持向上剤（特許文献１２参照）等が提案されている。
さらに、リゾチームの安定化の方法として、リゾチームを置換イミダゾリウム塩を含む液体媒体に接触させることを特徴とする方法（特許文献１３参照）も提案されている。

特開２００２−２３４８０８号公報特開平１−２１８５７７号公報特公平６−６０４９号公報特開平５−３３６９４１号公報特開平５−７２号公報特許第３３２８４５７号公報特開平１０−３２７８５７号公報特開平１１−３１３６２２号公報特開２０００−３７１６１号公報特許２００８−５０６１８５号公報特開２００５−０００１３３号公報特許２００６−０５０９３１号公報特表２００５−５１８３８０号公報

「天然物による食品の保蔵技術」発行所：（有）茶水企画昭和60年 p233-248

しかしながら、これらの方法では、食品の日持向上剤として使用する場合、リゾチームの熱安定性向上効果や、効力向上効果は不十分であった。

そこで、この発明者は、ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの混合物であり、混合物の１０．５％水溶液を９０℃で４０分間加熱し、室温で６時間放置後に６００ｎｍの吸光度が０．０３以下であるリゾチーム製剤を用いることによって、リゾチームの熱安定性が有意に向上されたリゾチーム製剤を得られることを見出した。

すなわち、この発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を含有するものである。
項１．ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの混合物であり、混合物の１０．５％水溶液を９０℃で４０分間加熱し、室温で６時間放置後に６００ｎｍの吸光度が０．０３以下であることを特徴とするリゾチーム製剤。
項２.ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの配合比率が１０：１〜５００：１であることを特徴とする項１のリゾチーム製剤。
項３．請求項２のリゾチーム製剤と、アミノ酸、有機酸、乳化剤、バクテリオシンおよびポリリジンから選ばれる１種または２種以上を、別々に食品に添加することを特徴とする保存性に優れた食品の製造方法。

この発明によると、ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの混合物であり、混合物１０．５％水溶液を９０℃、４０分間加熱し６時間後に６００ｎｍの吸光度が０．０３以下であるリゾチーム製剤を用いることによって、リゾチームの熱安定性が有意に向上されたリゾチーム製剤を得ることができる。

実験例１試験液の吸光度と活性を示したグラフである

この発明で用いるリゾチームは、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン間のβ−1,4結合間を加水分解する酵素であればよく、好ましくは鶏の卵白から抽出したものが好ましい。リゾチームの形態は液状でもペースト状でも粉末状でも顆粒状でも構わない。
この発明で用いるリゾチームの配合量は、製剤中０．００１〜９％が好ましい。

この発明で用いる澱粉分解物は、澱粉を加水分解したＤＥ２５〜５０のものであればよく、酵素分解や酸分解のいずれの方法で製造したものでも構わない。澱粉分解物の形態は液状でもペースト状でも粉末状でも顆粒状でも構わない。
この発明で用いる澱粉分解物の配合量は、製剤中１０〜９９．９９％が好ましい。

この発明で用いる澱粉分解物とリゾチームの配合割合は、１０：１〜５００：１が好ましい。さらに好ましくは、１０：１〜３００：１、更に好ましくは、１０：１〜２００：１である。

この発明のリゾチーム製剤の食品への添加量は、リゾチームとして０．０００１〜１％が好ましい。更に好ましくは０．００１〜０．１％である。

この発明のリゾチーム製剤の形状は液状でもペースト状でも粉末状でも顆粒状でも構わない。

また、この発明のリゾチーム製剤を食品に添加する場合、予め水に溶解し加温したほうが効果が高くなる場合もある。

以上のようにして得られるこの発明のリゾチーム製剤と、更に、食品の保存性向上目的として通常用いられている種々の食品素材を配合することができる。例えば、グリシン、ロイシン、イソロイシン等のアミノ酸類、酢酸、乳酸、アジピン酸、フマル酸、クエン酸等の有機酸及び／その塩類、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ジグリセリン脂肪酸エステル等の乳化剤、バクテリオシン、しらこ蛋白、キトサンおよびポリリジンを挙げることができる。

また、その効果を妨げない範囲において、サイクロデキストリン等の包接剤類、乳糖、糖アルコール等の賦型剤、ショ糖、麦芽糖、アンヒドロフルクトース等の糖類や糖アルコール、オリゴ糖、塩基性塩類、金属塩類等、甘味料、着色料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防カビ剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、強化剤、製造用剤、香料等を添加することができる。

本発明のリゾチーム製剤は、各種食品の保存性向上目的として使用することができる。例えば、炭酸飲料、缶コーヒー、缶ココア、缶しるこ、コーヒー牛乳、野菜ジュース、トマトジュース、乳飲料、乳酸飲料、栄養飲料、豆乳飲料、お茶等の飲料水；ナチュラルチーズ、プロセスチーズ、ヨーグルト、バター、等の乳製品、合成酢、醤油、味噌、ソース、ケチャップ、ホワイトソース、マヨネーズ、その他のドレッシング類等の調味料；ゼリー、ムース、ババロア、杏仁豆腐、等のデザート食品、キャンディー、グミキャンディー、ガム、クッキー、大福、等の洋・和菓子類；アイスクリーム、シャーベット、ソフトクリーム等冷菓等；茶碗蒸、卵豆腐、カスタードプリン、タマゴサラダ、厚焼卵等の卵製品全般；ポテトサラダやマカロニサラダといったサラダ類、ソーセージ、ハム、焼き豚、豚カツ、とり唐揚、ミートボール、ハンバーグ、シュウマイ、ギョウザといった畜肉加工品；蒲鉾、はんぺん、竹輪といった水産練り製品；しば漬け、梅干、タクアン、浅漬け、キムチ等の漬物類；あんまん、肉まん、パン、ドーナツ、カステラ等の製菓類；イチゴジャム、マーマレード等のジャム類；塩辛、みりん干し、一夜干しなどの水産加工品、うどん、そば、ラーメン、焼きそば等の麺類；たまごサンド、ハムサンド等のサンドイッチ類；赤飯のおむすび、鮭おむすび、梅干のおむすび等のおむすび類；イカ佃煮、のり佃煮等の佃煮類、おでん、昆布煮、野菜の煮物等の煮物類、エビフライ、牡蠣フライ、エビ天ぷら、コロッケ等のフライ、揚げもの食品、豆腐、厚揚げ、いなり等の豆腐加工食品類や和え物に有効である。

以下、実施例を挙げてこの発明を説明するが、この発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に記載のない限り「％」とは、「質量％」を意味するものとする。また、文中の「＊」印は、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製であることを意味する。文中の「※」印は、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社の登録商標であることを意味する。

なお、リゾチームは三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製サンキーパー※ＮＯ．６５７、澱粉分解物は松谷化学工業株式会社製パインデックス＃６、パインデックス＃１００、マックス１０００、三和澱粉工業株式会社製サンデック＃３００、サンエイ糖化株式会社製ピュアトースＰを用いた。

実験例１加熱後の濁度とリゾチーム活性
リゾチーム活性の測定方法
Ａ）試験菌 Micrococcus luteus (NBRC13867)

Ｂ）種層寒天培地の調製
１）トリプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、塩化ナトリウム１．５ｇ、酵母エキス１．５ｇ、ショ糖１ｇ、寒天１５ｇ、水１，０００ｍｌを混和し、１２１℃１５分滅菌した。
２）滅菌後のｐＨは７．４〜７．６とし、培地と同温度の５０％ポリソルベート２０溶液を２ｍｌ添加した。
３）試験菌液を滅菌した生理食塩水で希釈した液を４８〜５１℃に保った種層用寒天培地に加え、種層寒天培地とした。
４）内径９０ｍｍ、高さ２０ｍｍのシャーレに種層寒天培地２０ｍｌを分注し固化した後、中心間の距離が３０ｍｍ以上となるように一定間隔で円筒を４個並べた。
５）種層寒天培地２０ｍｌをさらに分注し、固化した後、４℃で３０分間保持し、次に円筒を静かに抜きとり、穿孔種層寒天培地とした。

Ｃ）リゾチーム定量用標準液の調製
リゾチームを６．２５、１２．５、２５、５０ｐｐｍとなるように滅菌水に溶解した。

Ｄ）試料液の加熱処理
１）試料を１０．５％になるように滅菌水に溶解した。
２）ねじ付き試験管に入れ９０℃４０分加熱した。
３）室温で６時間放置し冷却しリゾチーム濃度が２５ｐｐｍになるよう希釈した液を試験液とした。

Ｅ）濁度及びリゾチーム活性の測定
１）試験液を６００ｎｍの吸光度を測定する。
２）別途準備した種層寒天培地に試験液及び標準液を０．２ｍｌずつ寒天培地上の穿孔に入れた。
３）３０℃で１８時間培養し、阻止円の直径をノギスを用いて０．１ｍｍ単位で測定した。
４）検量線より残存活性を求めた。
表１の配合割合でリゾチームと各種澱粉分解物を混合し、混合物１０．５％水溶液を９０℃、４０分間加熱し６時間後に６００ｎｍの吸光度とリゾチーム活性を測定した。
結果を表２及び図１に示した。

吸光度と活性に相関が見られ、吸光度が約０．０３で活性の低下を防止し、それ以下の吸光度の場合、活性の上昇が見られた。

実験例２澱粉分解物とリゾチームの比率
表３の配合割合でリゾチームと各種澱粉分解物を混合し、混合物の１０．５％水溶液を９０℃で４０分間加熱し、室温で６時間放置後リゾチーム活性を測定した。結果を表４に示した。

Ｉ〜Ｌのように、リゾチームと澱粉分解物の比率が１：１０か、または１：１０よりも澱粉分解物の比率が多い場合、活性の保持あるいは活性の上昇が見られた。

実施例１．フラワーペーストの保存試験
フラワーペースト処方
グラニュー糖３１．９質量部、全脂粉乳１１．４質量部、コーンスターチ５．３質量部、薄力粉１．４質量部、ゲルアップ※ＰＩ＊０．２７質量部、全卵４．８質量部、無塩バター６．９質量部、水にて合計１００質量部とする。

上記配合に日持向上剤として、リゾチーム０．１質量部（比較例１）、リゾチーム０．１質量部およびＤＥ４０の澱粉分解物２質量部（実施例１）を加え、フラワーペーストを調製した。
３０℃で保存し一般生菌数を測定した。結果を表５に示した。

実施例２．蒸しパンの保存試験
蒸しパン処方
薄力粉１００質量部、上白糖７０質量部、精製塩０．２質量部、サンオーバー※Ｏ−２０＊４質量部、水８０質量部、クエン酸２．５％。リゾチーム１．３％、ＤＥ４０の澱粉分解物７６．２％、ピロリン酸２水素２ナトリウム５％、酢酸ナトリウム１５％、の混合物を蒸しパン用日持向上剤として蒸しパン処方中に２．５質量部加え、蒸しパンを調製した。３０℃で保存し一般生菌数を測定した。結果を表６に示した。

実施例３．煮物調味液の抗菌活性
煮物調味液処方
薄口醤油１６質量部、上白糖１２質量部、みりん８質量部、水にて合計１００質量部とする。
上記配合に日持向上剤としてリゾチーム０．０２質量部（比較例３）、リゾチーム１％およびＤＥ４０の澱粉分解物１８％、アンヒドロフルクトース２％、水７９．１％の混合物を８５度、２０分加熱したものを液体日持向上剤として、煮物調味液処方中に２質量部加え、調味液が沸騰するまで加熱し、その後沸騰状態で１０分間加熱し、室温で冷却し、煮物用の調味液を得た。この煮物用調味液のリゾチーム抗菌活性を、実験例１の方法で測定した。結果を表７に示した。

実施例４．卵焼きの保存試験
卵焼き処方
液卵７２質量部、上白糖３．５質量部、馬鈴薯澱粉２質量部、サンライク※和風だし６４０２Ｌ＊２質量部、サンスゲン※＊０．２質量部、グリシン１．５質量部、クエン酸３ナトリウム０．０５質量部、クエン酸０．０５質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．０５質量部、水にて合計１００質量部とする。
上記配合に日持向上剤としてＤＥ４０の澱粉分解物０．８４質量部、リゾチーム０．００５質量部、ショ糖脂肪酸エステル０．００５質量部加え（実施例４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓの芽胞を１００ｃｆｕ／ｇとなるように接種し、卵焼きを焼成した。焼成した卵焼きは９０度、３０分間二次殺菌し２０度まで冷却し、３０度にて４日間保存し一般生菌数を測定した。ＤＥ４０の澱粉分解物０．８４質量部をくわえていない試験区を比較例３とし、リゾチーム０．００５質量部およびショ糖脂肪酸エステル０．００５質量部を加えていない試験区を比較例４とした。

結果
実施例４２４０ｃｆｕ／ｇ
比較例３１２００ｃｆｕ／ｇ
比較例４１００万ｃｆｕ／ｇ以上

実施例５．ハンバーグの保存試験
ハンバーグ処方
豚挽肉３９質量部、牛挽肉２８質量部、ソテーしたタマネギ１１質量部、パン粉７．２質量部、牛乳８．８質量部、卵５質量部、サンライク※スパイスミックスＢＷ−１＊０．５質量部、サンライク※ＲＸ−２２＊０．５質量部。
上記配合に日持向上剤としてＤＥ４０の澱粉分解物２質量部、リゾチーム０．００５質量部、ショ糖脂肪酸エステル０．００５質量部加え（実施例５）、オーブンにて焼成し（１７０度、中心８０度達温）、室温にて放冷後、滅菌容器に入れ２５度で２日保存し一般生菌数を測定した。

結果
実施例５１０ｃｆｕ／ｇ以下
無添加区１０００万ｃｆｕ／ｇ以上

この発明によると、ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームを組合わせることにより、その水溶液を加熱した場合、活性の低下が無いかあるいは活性が上昇し、食品に添加した場合、効果的に菌類の増殖を抑制させ、食品の味質を損なうことがない、日持ち向上剤とすること、そして日持ち向上剤を食品中に添加することで得られる日持ちの向上した食品の製造方法を提供することができる。

Claims

ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの混合物であり、混合物の１０．５％水溶液を９０℃で４０分間加熱し、室温で６時間放置後に６００ｎｍの吸光度が０．０３以下であることを特徴とするリゾチーム製剤。
ＤＥ２５〜５０の澱粉分解物とリゾチームの配合比率が１０：１〜５００：１であることを特徴とする請求項１のリゾチーム製剤。