JP2014521312A - 長鎖核酸分子の大規模合成方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
その方法は以下のステップを含む:
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップ:効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割する。各々の一本鎖短鎖核酸分子を合成する方法は十分確立しており、コストが非常に低いからである。例えば、60bp長を有する百万個のオリゴヌクレオチドは、米国ドル単位でわずか数百ドルのコストである。即ち、各々の塩基は0.01ドル未満である。
一組のDNAオリゴヌクレオチドを水溶液に溶かし、混合し100fmol/μlの濃度に希釈した。製造要件に従い、T4キナーゼ(ポリヌクレオチドキナーゼ、NEB)を使用することにより、これらのオリゴヌクレオチドにリン酸化を施し、次いで37℃において1時間インキュベートした。リン酸化後、全てのDNAオリゴヌクレオチドを各々1fmolの濃度にさらに希釈した。一方、T1ビーズ(Dynal)は5'末端をビオチンで修飾した精製オリゴヌクレオチドと混合し、室温において15分間インキュベートし、次いでバッファーで三回洗浄した。
[実施例1]
25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)を最初に混合して、次いでリン酸化を施した。アニーリング後、完全な二本鎖をT4リガーゼの作用で形成することができる。その後、ストレプトアビジンで修飾した磁気ビーズを使用して連結産物を精製し、これによって反応基質、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を効率良く除去することができる。最後に、精製産物はPCRなどの核酸増幅法の使用によって増大することが可能であった。
最初に、磁気ビーズを精製オリゴヌクレオチドと共に15分間インキュベートし、次いでバッファーで三回洗浄する。次いでビーズを他のDNAオリゴヌクレオチドと混合し、実施例1中に記載したのと同じ、連結、精製及び増幅などの実験手順に従い処理した。
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、磁気ビーズのみをガラス粒子、ポリ(メタ)アクリルアミド、ポリ乳酸(PLA)、ポリ乳酸-グリコール酸ポリマー(PLGA)、ポリアクリル酸(PAA)、2-ヒドロキシエチル(メタ)アクリレートを含むポリメタクリル酸、ポリ-N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、酢酸ビニル又はポリプロピレン、又はポリエチレンアミンなどのポリマー粒子に変更した。
25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)を最初に混合して、次いでリン酸化を施した。アニーリング後、完全な二本鎖をT4リガーゼの作用で形成することができる。その後、産物をHPLCによって精製し、これによって反応基質、不完全に結合した産物又はミスマッチ産物を効率良く除去することができる。最後に、精製産物はPCRなどの核酸増幅法の使用によって増大することが可能であった。
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、HPLC精製のみを変更して、PAGEゲル、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動又は他の精製法を使用した。
実施例1中に記載したのと同じ実験手順に従い、25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(17)、リンカー配列(1及び2)並びに精製オリゴヌクレオチド(表1)以外に、12個の干渉オリゴヌクレオチド(表5)を加えた。精製産物にはクローニング及び配列決定を施した。大部分のクローンは正確な配列、554bpを示した。
実施例6中に記載したのと同じ実験手順に従い、ただし初期核酸分子のみが、25〜59ヌクレオチド長を有する一組の核酸分子(合計73)、リンカー配列(1及び2)、精製オリゴヌクレオチド(1)及び一組の干渉配列(合計24)(表1〜6)を含む。精製産物にはクローニング及び配列決定を施した。554bp、731bp又は1026bpを含む3個の正確な配列を得た。
長鎖核酸分子の大規模合成については、本明細書に記載の本発明の方法は、短鎖核酸分子の一群を取得するところから始まり、次いでこれらの短鎖核酸分子を長鎖核酸分子へとライゲーションさせる。長鎖核酸分子の長さは、短鎖分子の1つの少なくとも2倍の長さである。この方法は次のステップを含む。1)短鎖核酸分子を設計し合成すること。組み立てる(アセンブリすべき)長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子に分割する。長鎖ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列中の互いに少なくとも3〜9ヌクレオチドシフト(移動)している点において分割される。二本鎖短鎖核酸分子の各鎖は市販されているものを取得することができる。2)長鎖ヌクレオチド配列の1つの末端に配置される4つの核酸分子のうちの少なくとも1つを修飾すること。こうした分子を精製配列と呼び、これらは化学基または生物分子で修飾する。3)長鎖核酸分子を合成すること。バルク固体を別の種類の化学基または生物分子で処置し、これによりそれらが精製配列中の化学基または生物分子と反応して共有結合または親和性の高い物理的吸着を形成しうることを保証する。次いでステップ2に記載の末端に改変を有する短鎖分子を処置済のバルク固体とインキュベートし、これらバルク固体上に固定化する。その後、全ての短鎖核酸分子を加え、リガーゼの作用によりバルク固体上の長鎖核酸分子へとさらにアセンブリさせる。4) 精製。バルク固体を洗浄して長鎖核酸分子を精製する。5) 増幅。バルク固体上に固定化された長鎖核酸分子を増幅手法を用いて増幅する。6) カットオフ(任意的ステップ)。酵素消化によりバルク固体から長鎖核酸分子を分離する。
慣用の精製手法を用いる場合、次のステップを用いることができる。
長鎖核酸分子の大規模合成については、本明細書に記載の本発明の方法は、短鎖核酸分子の一群を取得するところから始まり、次いでこれらの短鎖核酸分子を長鎖核酸分子へとライゲーションさせる。長鎖核酸分子の長さは、短鎖分子の1つの少なくとも2倍の長さである。この方法は次のステップを含む。1)短鎖核酸分子を合成すること。アセンブルすべき(組み立てる)長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割する。長鎖ヌクレオチド配列は、二本鎖ヌクレオチド配列中の互いに少なくとも3〜9ヌクレオチドシフトしている点において分割される。二本鎖短鎖核酸分子の各鎖は市販されているものを取得することができる。2)ライゲーション。ステップ1において合成された短鎖核酸分子をアニーリングさせ、アセンブリさせ、リガーゼの作用により二本鎖核酸分子へとライゲーションさせる。3) 精製。ライゲーションさせた核酸分子をHPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動等により精製した。4)増幅。長鎖核酸分子を増幅手法により増幅する。
Claims (18)
- 短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的で低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)「精製オリゴヌクレオチド」と呼ぶ化学基で一つ又は二つの短鎖オリゴヌクレオチドを修飾するステップであって、化学基を有するこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを固体粒子に固定化するステップ、
3)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、ステップ1及びステップ2で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを溶液中で混合して粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成するステップ、
4)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ3で得た長鎖核酸分子を固体粒子とインキュベートし、次いでバッファーで洗浄するステップ、
5)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ、
6)精製又は増幅用に設計することができる組み立てた長鎖核酸分子の5'又は3'末端を必要な場合酵素の使用により除去する酵素的切断ステップ(任意選択ステップ)、
を含む方法。 - 短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)「精製オリゴヌクレオチド」と呼ぶ化学基で一つ又は二つの短鎖オリゴヌクレオチドを修飾するステップであって、化学基を有するこれらの短鎖オリゴヌクレオチドを固体粒子に固定化するステップ、
3)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ1で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを、精製オリゴヌクレオチドを固定化した固体粒子と溶液中でインキュベートして粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成することが可能であるステップ、
4)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、固体粒子が化学基で修飾されており、その結果「精製オリゴヌクレオチド」がこれらの固体粒子に固定化可能であり、ステップ3で得た長鎖核酸分子を固体粒子とインキュベートし、次いでバッファーですすぐステップ、
5)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ、
6)であって、精製又は増幅用に設計することができる組み立てた長鎖核酸分子の5'又は3'末端を必要な場合酵素の使用により除去する酵素的切断ステップ(任意選択ステップ)
を含む方法。 - 長鎖ヌクレオチド配列が、それ自体で合成されると予想されるヌクレオチド配列である、請求項1又は2に記載の方法。
- 長鎖ヌクレオチド配列が、合成されると予想されるヌクレオチド配列、並びにPCRプライマー配列及びオリゴヌクレオチドを含有する2つの隣接配列から構成される、請求項1又は2に記載の方法。
- 転写-逆転写ステップをステップ4とステップ5の間に実施することができる、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 増幅ステップ(ステップ5)後に追加的精製を実施することができる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割し、二本鎖ヌクレオチド配列中の分割地点が少なくとも3ヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも9ヌクレオチド互いにシフトした、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 固体粒子が、磁性材料、珪素、二酸化珪素、セラミックス、ポリマー、シリカ又はガラスを含むがそれだけには限られない、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 精製オリゴヌクレオチドがビオチンで修飾可能であり、固体粒子がストレプトアビジンで修飾されている、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 精製オリゴヌクレオチドがアミノ基で修飾されていてもよく固体粒子がカルボキシル基で修飾されており、又は精製オリゴヌクレオチドがアジド基で修飾されていてもよく固体粒子がアルキン基で修飾されており、逆の場合も同じである、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- リガーゼがT4DNAリガーゼ又はTaqリガーゼのいずれか、又はこれらの任意の誘導体である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも700ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が150を超えず、又は長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも1000ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が200を超えない、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 短鎖オリゴヌクレオチドの組み立てを介した長鎖核酸分子の大規模、低コスト及び効率的な合成方法であって、
1)短鎖核酸分子を設計及び合成するステップであって、効率的に低コストで各々の一本鎖短鎖核酸分子が合成可能であるように、組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割するステップ、
2)短鎖オリゴヌクレオチドを組み立てて長鎖ヌクレオチド配列にするステップであって、ステップ1で得た一本鎖短鎖オリゴヌクレオチドを溶液中で混合して粘着性ギャップを有する二本鎖核酸分子を形成し、その結果これらのギャップをリガーゼの作用で連結させて完全な二本鎖長鎖ヌクレオチド配列を形成することが可能であるステップ、
3)組み立てた長鎖ヌクレオチド配列を精製するステップであって、従来型HPLC、PAGE、キャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動法を使用することにより、組み立てた核酸分子を精製することができるステップ、
4)固体粒子に固定化した核酸分子をPCRなどの増幅法の使用によって増幅する増幅ステップ
を含む方法。 - 転写-逆転写ステップをステップ3とステップ4の間に実施することができる、請求項13に記載の方法。
- 増幅ステップ(ステップ4)後に追加的精製を実施することができる、請求項13または14に記載の方法。
- 組み立てる長鎖ヌクレオチド配列を二本鎖短鎖核酸分子の群に分割し、二本鎖ヌクレオチド配列中の分割地点が少なくとも3ヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも9ヌクレオチド互いにシフトした、請求項13から15のいずれか1項に記載の方法。
- リガーゼがT4DNAリガーゼ又はTaqリガーゼのいずれか、又はこれらの任意の誘導体である、請求項13から16のいずれか1項に記載の方法。
- 長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも700ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が150を超えず、又は長鎖ヌクレオチド配列が少なくとも1000ヌクレオチドを含み、各々の短鎖核酸分子が200を超えない、請求項13から17のいずれか1項に記載の方法。
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