JP2014507162A - オメガ９形質を有する強化キャノーラ粕栄養価をもたらす種子の組成上の属性を示すキャノーラ生殖質 - Google Patents

Abstract

キャノーラ種子に高タンパク質含有量および低繊維含有量の形質を付与するキャノーラ生殖質であって、キャノーラ植物体が、平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を有する種子を生じる、キャノーラ生殖質。キャノーラ種子の形質は、油を含まない乾物ベースで少なくとも４５％の粗タンパク質および１８％以下の酸性デタージェント繊維含有量も含み得る。ある特定の実施形態は、減少したポリフェノール含有量および増加したリン含有量からなる群から選択される１つまたは複数の形質をさらに含む。特定の実施形態では、本発明は、そのような生殖質およびそれから生じる植物生産物（例えば、種子）を含むキャノーラ植物体に関する。本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体は、それらをキャノーラ粕の供給源として特に有益なものにする好都合な種子組成特性を示すことができる。

Description

優先権の主張
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１１年２月２２日出願の米国仮出願第６１／４４５，４２６号、「ＣＡＮＯＬＡ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＥＸＨＩＢＩＴＩＮＧ ＳＥＥＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＡＬ ＡＴＴＲＩＢＵＴＥＳ ＴＨＡＴ ＤＥＬＩＶＥＲ ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＣＡＮＯＬＡ ＭＥＡＬ ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ ＶＡＬＵＥ ＨＡＶＩＮＧ ＯＭＥＧＡ−９ ＴＲＡＩＴＳ」の利益を主張する。

本発明は、キャノーラ生殖質および栽培品種に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、種皮色に関係なく、粕組成属性が改変された（例えば、非栄養性因子のレベルが低下し、タンパク質レベルが上昇した）キャノーラ生殖質に関する。特定の実施形態は、暗い種子色を、例えば、非栄養性因子（例えば、酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）およびポリフェノール化合物）のレベルの低下およびタンパク質およびリンのレベルの上昇と組み合わせて示しているキャノーラ生殖質に関する。

「キャノーラ」とは、最大で２重量パーセント（種子の全脂肪酸含有量と比較して）のエルカ酸（Ｃ２２：１）含有量を有し、脱脂（油を含まない）粕１グラム当たり３０マイクロモル（μｍｏｌ）未満のグルコシノレートを含有する風乾粕を生じる（圧搾後）ナタネ（アブラナ属（Brassica）の種）を指す。これらの種類のナタネは、この種のより伝統的な品種と比較すると、それらの可食性によって区別される。キャノーラ油は、飽和脂肪酸のレベルが低いので、優れた食用油になると考えられる。

ナタネ粕はタンパク質が比較的多いにもかかわらず、繊維含有量が多いので、その消化率および動物用飼料としてのその価値が減少する。ダイズ粕と比較して、キャノーラ粕およびアブラナ粕は、より高い値の食物繊維およびより低い百分率のタンパク質を含有する。食物繊維が多いので、キャノーラ粕の代謝エネルギー（ＭＥ）はダイズ粕よりも約２０％少ない。結果として、特にブタおよび家禽への配給における粕の価値は、ダイズ粕などの他の油糧種子粕と比較して低いままである。Rakow（2004a）Canola meal quality improvement through the breeding of yellow-seeded varieties-an historical perspective、AAFC Sustainable Production Systems Bulletin。さらに、一部のキャノーラ粕中にグルコシノレートが存在することによっても、これらの化合物には家畜の成長および繁殖に対する有害作用があるので、その価値が減少する。

キャノーラ品種は、一部それらの種皮色によって区別される。種皮色は、一般に、２つの主要なクラス：黄色および黒色（または暗褐色）に分けられる。これらの色の種々の色合い、例えば、赤褐色および黄褐色なども観察される。より明るい種皮色を有するキャノーラ品種はより薄い外皮を有し、したがって、暗い色の種皮を有する品種よりも繊維が少なく、油およびタンパク質が多いことが広範に観察されている。Stringamら（1974）Chemical and morphological characteristics associated with seed coat color in rapeseed、Proceedings of the 4th International Rapeseed Congress、Giessen、Germany、99〜108頁；BellおよびShires（1982）Can. J. Animal Science 62:557-65；ShirzadeganおよびRobbelen（1985）Gotingen Fette Seifen Anstrichmittel 87:235-7； Simbayaら（1995）J. Agr. Food Chem. 43:2062-6；Rakow（2004b）Yellow-seeded Brassica napus canola for the Canadian canola Industry、AAFC Sustainable Production Systems Bulletin。これについての１つの可能性のある説明は、キャノーラ植物体は、種皮繊維構成成分を産生するためのエネルギーを必要としない場合、タンパク質および油の産生により多くのエネルギーを費やすことができるというものである。黄色い種子のキャノーラ系統は、黒色の種子のキャノーラ系統よりもグルコシノレート含有量が少ないことも報告されている。Rakowら（1999b）Proc. 10th Int. Rapeseed Congress、Canberra、Australia、1999年9月26〜29日、Poster #9。したがって、歴史的に、キャノーラ粕の飼料価値を高めるための潜在的なやり方として、黄色い種子のキャノーラ品種の開発が追求されてきた。Bell（1995）Meal and by-product utilization in animal nutrition, Brassica oilseeds, production and utilization. KimberおよびMcGregor編、Cab International、Wallingford、Oxon、OX108DE、UK、301〜37頁；Rakow（2004b）、上記；Rakow & Raney（2003）。

セイヨウアブラナ（B. napus）と密接に関連する黄色い種子の形態のアブラナ属（Brassica）種のいくつか（例えば、Ｂ．ラパ（B. rapa）およびカラシナ（B. juncea））は、それらの種子およびその後の粕中の繊維のレベルがより低いことが示されている。黄色い種子のセイヨウアブラナ（B. napus）生殖質の開発により、関連するアブラナ属（Brassica）種由来の、種子色素形成を制御する遺伝子を組み込むことによってセイヨウアブラナ（B. napus）中の繊維を減少させることができることが実証された。しかし、関連するアブラナ属（Brassica）種由来の、種子色素形成を制御する遺伝子を、キャノーラ品種などの有益な油糧種子アブラナ属（Brassica）品種に組み込むことは、現在入手可能な黄色い種子の系統における黄色の種皮の遺伝には多数の劣性対立遺伝子が関与するという事実によって複雑になる。さらに、「さやの湾曲」も、他のアブラナ属（Brassica）種、例えば、カラシナ（juncea）およびアビニシアガラシ（carinata）などからの黄色い種皮の組み込みにおいて一般に生じる問題である。

暗色の種子のセイヨウアブラナ（B. napus）の生殖質内の繊維にどのくらいの変動性が存在するかに関して入手可能な情報は非常に少なく、非栄養性因子（例えば、繊維およびポリフェノール化合物）のレベルが低下し、タンパク質レベルが上昇した、開発された暗色の種子のキャノーラ系統に関する報告はなされていない。

本明細書には、栄養価に影響を与えることが示されているキャノーラ粕の組成の変化の新規の組み合わせをもたらす生殖質を含むキャノーラ（セイヨウアブラナ（Brassica napus））の放任受粉した栽培品種（ＣＬ０４４８６４、ＣＬ０６５６２０）および雑種（ＣＬ１６６１０２Ｈ、ＣＬ１２１４６０ＨおよびＣＬ１２１４６６Ｈ）が記載されている。いくつかの実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体は、例えば、タンパク質レベル、繊維レベル、およびリンレベルの新規の組み合わせを有する種子を、これらの種子構成成分が種皮色とは無関係であるように、生じ得る。特定の実施形態では、そのような植物は、標準のキャノーラの種類よりもタンパク質が多く、繊維が少ないだけでなく、リンレベルが標準のキャノーラの種類のリンレベルと同様であるかそれよりも高い種子を生じ得る。本発明の生殖質を含むキャノーラの純系統および雑種は、いくつかの実施形態では、飼料成分または食物成分として直接利用された場合、および／またはタンパク質分離物およびタンパク質濃縮物を加工するための飼料ストックとして利用された場合に、栄養的に強化された粕の性質をもたらし得る。そのような種子は暗色（例えば、黒色、暗色、およびまだら）または明色であり得る。

したがって、本明細書には、種子色に関係なく、望ましい種子構成成分の形質を有するキャノーラ植物体を得るために使用することができるアブラナ属（Brassica）の生殖質が記載されている。いくつかの実施形態では、そのような生殖質を含む植物を使用して、望ましい栄養品質を有するキャノーラ粕を作出することができる。特定の実施形態では、本発明の生殖質を含む近交系のキャノーラ系統（およびその植物体）が提供される。別の実施形態では、本発明の生殖質を含む近交系のキャノーラ植物体を親として有する雑種キャノーラ系統（およびその植物体）が提供される。本発明のキャノーラ品種としては、例えば、これらに限定することなく、ＣＬ０４４８６４、ＣＬ０６５６２０、ＣＬ１６６１０２Ｈ、ＣＬ１２１４６０Ｈ、およびＣＬ１２１４６６Ｈが挙げられる。

本発明の特定の実施形態は、キャノーラ種子に高タンパク質含有量および低繊維含有量の形質を付与するキャノーラ生殖質であって、キャノーラ植物体が、平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を有する種子を生じるキャノーラ生殖質を包含する。他の実施形態では、キャノーラ植物体はキャノーラ生殖質を含む。キャノーラ植物体から生じた種子も記載されている。さらなる実施形態は、キャノーラ植物体の種子から生長した後代植物体も包含する。キャノーラ栽培品種に、種皮色に関係なく、高タンパク質含有量、低繊維含有量、少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される少なくとも１つの所望の形質を導入する方法も開示されている。

本明細書には、本発明の生殖質を含む近交系のキャノーラ植物体または雑種から得られる植物生産物も記載されている。特定の実施形態は、そのような近交系のキャノーラ植物体または雑種から得られるキャノーラ粕または種子を包含する。

キャノーラ粕の栄養価を改善するための方法も記載されている。例えば、種子色に関係なく、キャノーラ粕の組成特性の組み合わせをアブラナ属（Brassica）の生殖質に遺伝子移入するための方法が記載されている。特定の実施形態では、本発明の生殖質を、黄色の種皮を特徴とするキャノーラ生殖質と組み合わせて、生殖質のそれぞれによって与えられる所望の特性を有する強化キャノーラ粕をもたらすことができる生殖質を作出することができる。

前述および他の特徴は、付随する図を参照して進められる以下のいくつかの実施形態の詳細な説明から、より明白になる。

暗い種皮色を有するいくつかのキャノーラ品種の画像である。 特定のセイヨウアブラナ（B. napus）の純系統および雑種の種子組成分析からのデータである。種子試料は、カナダ西部全体わたる反復試験からのものであった。種子組成データはＮＩＲに基づいて予測し、その後、参照化学法を用いて検証した。

Ｉ．いくつかの実施形態の概要
キャノーラ粕は、油の抽出プロセスの後に残るキャノーラ種子の画分である。キャノーラ粕はタンパク質の供給源であり、したがって、動物用飼料の配合および高価値のタンパク質濃縮物およびタンパク質分離物の単離を含めたいくつかの適用において利用される。粕になる種皮、子葉および胚の内部の繊維により単胃動物種におけるキャノーラ粕の包含率が限定され、したがって、キャノーラ粕からは、一般には、他の供給源（例えば、ダイズ）から調製された粕と同じ栄養価はもたらされない。セイヨウアブラナ（B. napus）と密接に関連する種（例えば、Ｂ．ラパ（B. rapa）およびカラシナ（B. juncea））における黄色い種子の形態は、それらの種子およびその後の粕中の繊維のレベルがより低いことが示されている。この知見により、黄色種子色に依存して、低種子繊維形質をセイヨウアブラナ（B. napus）に導入するための試みが動機づけられた。その結果黄色い種子のセイヨウアブラナ（B. napus）生殖質が発生したことにより、この手法によってセイヨウアブラナ（B. napus）における繊維を減少させることができることが実証された。

本発明の前には、暗色の種子のキャノーラ品種が、黄色い種子の品種において観察されたものと同様の低さの種子の繊維含有量を示すとは考えられていなかった。さらに、改善されたキャノーラ粕の供給源を示す、非栄養性因子（例えば、繊維およびポリフェノール化合物）のレベルが低下し、タンパク質およびリンのレベルが上昇した暗色の種子のキャノーラ系統は記載されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキャノーラ生殖質により、種皮色に関係なく発現されるいくつかの重要な強化された粕組成属性の組み合わせがもたらされる。特定の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ種子から調製したキャノーラ粕により、例えば、ブタおよび家禽の食餌における、より高い食餌包含率を実現することができる。

本発明の生殖質を用いて（例えば、選抜育種によって）、１つまたは複数のさらなる所望の形質（例えば、改善された油組成、増加した油作出量、改変されたタンパク質組成、増加したタンパク質含有量、病害、寄生生物抵抗性、除草剤抵抗性など）を伴う所望の種子構成成分の形質を有するキャノーラを開発することができる。本発明の生殖質を、種子組成の追加的な変化を導入することができる出発生殖質として使用することができ、したがって、本明細書に記載の種類の改善が増加したキャノーラ粕をもたらすキャノーラ系統および雑種を開発することができる。

ＩＩ．略語
ＡＤＦ 酸性デタージェント繊維
ＡＤＬ 酸性デタージェントリグニン
ＡＩＤ 見かけの回腸消化率
ＡＭＥ 見かけの代謝エネルギー
ＢＳＣ 黒色の種子のキャノーラ
ＣＰ 粗タンパク質の百分率
ＤＭ 乾物濃度
ＥＣＭ 本発明の強化キャノーラ粕
ＦＡＭＥ 脂肪酸／脂肪酸メチルエステル
ＧＥ 総エネルギー
ＨＴ 「高温」加工
ＬＴ 「低温」加工
ＮＤＦ 中性デタージェント繊維
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＮＩＲ 近赤外線分光法
ＳＡＥ シナピン酸エステル
ＳＢＭ ダイズ粕
ＳＥＲ 可溶性抽出残渣
ＳＩＤ 標準化した回腸消化率
ＴＡＡＡ 真のアミノ酸利用率
ＴＤＦ 総食物繊維
ＴＭＥ 真の代謝エネルギー
ＷＦ 白色フレーク

ＩＩＩ．用語
戻し交雑：戻し交雑法を用いて、植物体に核酸配列を導入することができる。戻し交雑技法は、植物体に新しい形質を導入するために、何十年にもわたって広範に使用されてきた。Jensen, N.編 Plant Breeding Methodology、John Wiley & Sons, Inc.、1988。典型的な戻し交雑プロトコールでは、対象の元の品種（反復親）を、移入される対象の遺伝子を担持する第２の品種（一回親）と交雑する。次いで、この交雑から生じた後代を再度反復親と交雑し、一回親から移入された遺伝子に加えて、反復植物体の所望の形態学的特性および生理的特性の本質的に全てが、変換された植物体において回復している植物体が得られるまでこのプロセスを繰り返す。

キャノーラ油：キャノーラ油とは、ナタネの市販の品種から抽出された油を指す。キャノーラ油を作出するために、一般には、大穀物倉庫において種子を類別し、混和して許容できる均一な生成物を作出する。次いで、混和した種子を破砕し、油を、一般にはヘキサンを用いて抽出し、その後、不純物を取り除く。次いで、生じた油を使用するために販売することができる。油含有量は、一般には、全乾燥種子に対する百分率として測定され、特定の油含有量はキャノーラの種々の品種に特有である。油含有量は、種々の分析技法、例えば、これらに限定することなくＮＭＲ、ＮＩＲ、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出を用いて、または当業者が広範に利用可能な他の方法によって、容易にかつ常套的に決定することができる。Bailey、Industrial Oil & Fat Products（1996）、第５版、Wiley Interscience Publication、New York、New Yorkを参照されたい。全脂肪酸のパーセント組成は、一般には、種子から油の試料を抽出し、油試料中に存在する脂肪酸のメチルエステルを生成し、試料中の種々の脂肪酸の割合を、ガスクロマトグラフィーを用いて分析することによって決定される。脂肪酸組成も、特定の品種を区別する特性であり得る。

商業的に有用：本明細書で使用される場合、「商業的に有用」という用語は、十分な植物生長力および稔性を有し、したがって、植物系統または雑種の作物を、農業者が従来の農業設備を使用して生産することができる植物系統および雑種を指す。特定の実施形態では、記載の構成成分および／または品質を有する植物生産物を、商業的に有用な品種の植物体または植物性材料から抽出することができる。例えば、所望の油構成成分を含む油を、商業的に有用な植物系統または雑種の種子から、従来の圧搾および抽出用設備を利用して抽出することができる。ある特定の実施形態では、商業的に有用な植物系統は、純系統または雑種系統である。「農業優良」系統および雑種は、一般には、望ましい農業特性、例えば、これらに限定することなく、少なくとも１つの植物生産物の収量の改善、成熟、病害抵抗性、および耐倒伏性（standability）を有する。

優良系統：優れた農業生産力の育種および選抜によって生じた任意の植物系統である。優良植物体は優良系統由来の任意の植物体である。

強化キャノーラ粕： 本明細書で使用される場合、「強化キャノーラ粕」という用語は、タンパク質のレベルが上昇し、少なくとも一部の非栄養性構成成分のレベルが低下しているキャノーラ種子を加工することで得られる、強化された組成を有するキャノーラ粕を意味する。本発明の強化キャノーラ粕は、多様に、本明細書では、「ＥＣＭ」「黒色の種子のキャノーラＥＣＭ」、「ＢＳＣ ＥＣＭ」または「ＤＡＳ ＢＳＣ ＥＣＭ」と称することができる。しかし、本発明は、黒色の種子のキャノーラのＥＣＭ生殖質のみに限定されるものではない。

本質的に由来する（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ）：いくつかの実施形態では、植物体、種子、またはその一部を操作することにより、従属品種（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉｅｔｙ）を作製することができる。本明細書で使用される場合、「本質的に由来する」という用語は、植物新品種保護国際同盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）（ＵＰＯＶ）により定められた協定に従う：
品種は、以下の場合、別の品種（「原品種」）に本質的に由来するとみなされるべきである
（ｉ）原品種に主として由来する、または、それ自体が原品種に主として由来する品種に由来し、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的な特性の発現を保持する；
（ｉｉ）それが原品種と明確に区別可能である；
（ｉｉｉ）引き出す行為から生じる差異以外は、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的な特性の発現において原品種に一致する。UPOV、Sixth Meeting with International Organizations、Geneva、1992年10月30日（Office of the Unionにより作成された文書）。

植物生産物：本明細書で使用される場合、「植物生産物」という用語は、特定の植物または植物の一部（例えば、本発明の生殖質を含む植物、および本発明の生殖質を含む植物から得られた植物の一部）から生産された商品を指す。生産物は、例えば、これらに限定することなく、穀粒；粕；茎葉；タンパク質；単離されたタンパク質；穀粉；油；破砕したもしくは完全な穀粒もしくは種子；任意の粕、油、または破砕したもしくは完全な穀粒を含む任意の食品；またはサイレージであり得る。

植物系統：本明細書で使用される場合、「系統」とは、少なくとも１つの形質について、個体間で遺伝的変異をほとんど示さない（例えば、遺伝的変異がない）植物の一群を指す。純系統は、何世代か自家受粉させ、選抜することによって、あるいは、単一の親から、組織または細胞の培養技法を用いて栄養繁殖させることによって創出することができる。本明細書で使用される場合、「栽培品種」、「品種」および「種類」という用語は同義であり、これらの用語は、商業生産に使用される系統を指す。

植物性材料：本明細書で使用される場合、「植物性材料」という用語は全体的にまたは部分的に、植物体由来の任意の加工材料または非加工材料を指す。例えば、これらに限定することなく、植物性材料は、植物の一部、種子、果実、葉、根、植物組織、植物組織培養物、植物外植片、または植物細胞であってよい。

安定性：本明細書で使用される場合、「安定性」または「安定な」という用語は、遺伝性であり、多数の種子世代を通して実質的に同じレベルで維持される所与の植物の構成成分または形質を指す。例えば、安定な構成成分は、少なくとも３世代にわたって実質的に同じレベルで維持され得る。この場合、「実質的に同じ」という用語は、いくつかの実施形態では、２つの異なる世代間で２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、３％以内、２％以内、および／または１％以内に維持される構成成分、ならびに２つの異なる世代間で完全に維持される構成成分を指し得る。いくつかの実施形態では、安定な植物構成成分は、例えば、これらに限定することなく、油構成成分、タンパク質成分、繊維構成成分、色素構成成分、グルコシノレート構成成分、およびリグニン構成成分であり得る。構成成分の安定性は、１つまたは複数の環境因子の影響を受ける可能性がある。例えば、油構成成分の安定性は、例えば、これらに限定することなく、温度、所在地、ストレス、および植え付け時期の影響を受ける可能性がある。圃場条件下で安定な構成成分を有するその後の世代の植物は、例えば、上記と同様に植物構成成分を産生することが予測されよう。

形質または表現型：「形質」および「表現型」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

品種または栽培品種：「品種」または「栽培品種」という用語は、本明細書では、繁殖の際にその特性が独特であり、安定しており、均一である、商業生産のために使用される植物系統を指す。雑種品種または栽培品種の場合では、親系統の特性が独特であり、安定しており、均一である。

別段の指定のない限り、本明細書で使用される「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」という用語は、少なくとも１つを指す。

ＩＶ．種子色に関係なく、望ましい種子構成成分の形質をもたらすキャノーラ生殖質
好ましい実施形態では、本発明は、種子色に関係なく、望ましい種子構成成分の形質を有するキャノーラ植物体を得るために使用することができるアブラナ属（Brassica）の生殖質を提供する。この生殖質を含む特定の例示的なキャノーラの純系統および雑種も提供される。

キャノーラ油は、一般に、食用および飼料用のどちらとしても非常に健康によい油であると認識されている。しかし、油構成成分を抽出した後に残るキャノーラ種子の粕構成成分は、繊維含有量が多く、栄養価が減少するので、ダイズ粕よりも劣る。いくつかの実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体により、これらの欠損を減ずるまたは克服することができ、キャノーラ粕を、高度に栄養になり、経済的な動物用飼料供給源として提供することができる。キャノーラ粕は、キャノーラ油生産の副産物であり、したがって、本発明により提供されるキャノーラ粕によりこの副産物を他の粕と競合的に使用することが可能になることによって、有益な資源が守られる。

以前は、黄色のキャノーラ種子色が、油を抽出した後に得られる粕構成成分の栄養特性の改善に対応すると考えられていたので、それ自体が重要であると考えられていた。いくつかの実施形態により、初めて、優れた、高オレイン酸かつ低リノレン酸油ももたらす、暗色の種子（例えば、暗色の種子、黒色の種子、およびまだらの種子）で低繊維のキャノーラの生殖質を提供することができ、この生殖質により、栄養特性が改善された（例えば、種子構成成分が改善された）キャノーラ粕ももたらされる。いくつかの実施形態では、本発明の生殖質を含む植物は、驚いたことに、さらに、これらの形質を、他の有益な形質（例えば、これらに限定することなく、優れた収量、高タンパク質含有量、高油含有量、および高油品質）と組み合わせてもたらすことができる。特定の実施形態では、暗色の種皮は、標準の暗色の種子のキャノーラ品種から生じた種子よりも相当薄い種皮を有し得る。種皮がより薄いことにより、粕中の繊維含有量が減少し、標準の暗色の種子の品種中の油およびタンパク質のレベルと比較して、種子油およびタンパク質の含有量が増加し得る。したがって、本発明の生殖質を含む植物から生じる暗色の種子は、標準の暗色の種子のキャノーラ植物体から生じた種子において観察される油およびタンパク質の濃度よりも高い油およびタンパク質の濃度をその種子中に有し得る。

複数の実施形態では、本発明の生殖質を含む植物は、実質的な農学的限定および／または種子の限定を示さない。例えば、そのような植物体は、少なくとも、標準のキャノーラ品種によって示されるものと同等に好都合な農学的品質および／または種子の品質（例えば、発芽、早期の生長力、種子処理の効果、種子の収穫および保存性）を示し得る。特定の実施形態では、本発明の生殖質を含む植物は、既存のキャノーラの純系統によって示される１つまたは複数のさらなる好都合な形質、例えば、これらに限定することなく、好都合な脂肪酸プロファイルも含み得る。

複数の実施形態では、本発明の生殖質を含む植物は、いくつかの栄養特性のうちの少なくとも１つを含む種子を生じ得る。特定の実施形態では、そのようなキャノーラ植物体から生じた種子は、好都合な油プロファイル、高タンパク質含有量、低繊維含有量（例えば、ＡＤＦおよびＮＤＦ（低ポリフェノール含有量を含む））、（低繊維および高タンパク質がより高い代謝エネルギーを付与する）、高リン含有量、および低シナピン酸エステル（ＳＡＥ）含有量からなる群から選択される少なくとも１つの栄養特性を含み得る。ある特定の実施形態では、「高」または「低」構成成分含有量とは、本発明の生殖質を含む参照植物から生じた種子と標準のキャノーラ品種から生じた種子との比較を指す。したがって、「低」繊維含有量の種子を生じる植物体は、標準のキャノーラ品種から生じた種子において観察されるよりも繊維含有量が少ない種子を生じ得る。また、「高」タンパク質含有量の種子を生じる植物体は、標準のキャノーラ品種から生じた種子において観察されるよりもタンパク質含有量が多い種子を生じ得る。

いくつかの実施形態では、上述の群から選択される少なくとも１つの栄養特性を含むキャノーラ植物体から生じるナタネの実質的に均一な集合体を作出することができる。そのような種子を使用して、セイヨウアブラナ植物体の実質的に均一な圃場を作出することができる。特定の実施形態は、上述の特性の識別的な組み合わせを含むキャノーラ種子を提供する。例えば、種子の総計の油およびタンパク質の含有量の組み合わせが、種子の有用な尺度および独特の特性であり得る。

いくつかの実施形態は、ＮＡＴＲＥＯＮ型油プロファイルまたは「オメガ９」油プロファイルを有するキャノーラ油をもたらすことができる本発明の生殖質を含むキャノーラ（例えば、暗色の種子のキャノーラ）を提供する。「ＮＡＴＲＥＯＮ型」、「ＮＡＴＲＥＯＮ様」または「オメガ９」油プロファイルにより、例えば、６８〜８０％、７０〜７８％、７１〜７７％、および７２〜７５％の範囲のオレイン酸含有量が、例えば、３％未満のアルファリノレン酸含有量と共に示され得る。特定の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体から得られる種子により、６８％超、７０％超、７１％超、７１．５％、および／または７２％超（例えば、７２．４％または７２．７％）のオレイン酸を有し、リノレン酸含有量が３％未満、２．４％未満、２％未満、１．９％未満、および／または１．８％未満（例えば、１．７％）である油がもたらされ得る。しかし、別の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラにより、例えば、オレイン酸含有量が８０％を超える油がもたらされ得る。ある特定の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラから作出されるキャノーラ油は天然で安定である（例えば、人工的に水素化されていない）。キャノーラ油の脂肪酸含有量は、公知の方法に従って容易かつ常套的に決定することができる。

したがって、いくつかの実施形態は、油画分および粕画分を含み、油画分のα−リノレン酸含有量が、例えば、３％以下（種子の全脂肪酸含有量と比較して）であり、およびオレイン酸含有量が、例えば、６８％以上（種子の全脂肪酸含有量と比較して）であるキャノーラ種子（例えば、暗色のキャノーラ種子）を提供する。定義によれば、そのような種子のエルカ酸（Ｃ２２：１）含有量は、２重量％未満（種子の全脂肪酸含有量と比較して）であってもよい。特定の例では、キャノーラ種子の油含有量は、種子の重量の４８％〜５０％を構成し得る。

「高オレイン酸」という用語は、野生型または他の参照の品種または系統のオレイン酸含有量よりもオレイン酸含有量が多いカラシナ（Brassica juncea）または文脈により示される他のアブラナ属（Brassica）種を指すことができ、より一般的には、少なくとも６８．０重量％のオレイン酸を含む脂肪酸組成を示す。

「総飽和」とは、脂肪酸であるパルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）およびテトラコサン酸（Ｃ２４：０）の合わせた百分率を指す。本明細書で考察されている脂肪酸濃度は、当業者に周知の標準の手順に従って決定する。特定の手順は実施例において説明されている。脂肪酸濃度は全脂肪酸含有量の重量百分率として表される。

「安定性」または「安定な」という用語は、所与の遺伝的に制御された脂肪酸構成成分に関して本明細書で使用される場合、脂肪酸構成成分が、代々、少なくとも２世代、好ましくは少なくとも３世代にわたって実質的に同じレベルで、例えば、好ましくは±５％で維持されることを意味する。本発明の方法により、代々最大±５％で安定な改善された脂肪酸組成を有するカラシナ（Brassica juncea）系統を創出することができる。当業者には、上で参照した安定性は、温度、所在地、ストレスおよび植え付けの時期の影響を受ける可能性があることが理解される。したがって、キャノーラ系統間の脂肪酸プロファイルの比較は、同様の生長条件下で生じた種子を用いて行うべきである。

「アブラナ属（Brassica）植物体」という用語が本発明の文脈において使用される場合、この用語は、その群の任意の単一遺伝子変換も包含する。本明細書で使用される「単一遺伝子変換された植物体」という用語は、戻し交雑技法によって品種に移入された単一遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的特性および生理的特性の本質的に全てを回復させる、戻し交雑と称される植物の育種技法によって開発されるアブラナ属（Brassica）植物体を指す。戻し交雑法を本発明と一緒に用いて、特性を改善することまたは特性を品種に導入することができる。「戻し交雑」という用語は、本明細書で使用される場合、雑種後代をまた反復親と交雑することの繰り返し、すなわち、反復親と１回または複数回戻し交雑すること（「ＢＣ１」、「ＢＣ２」などと識別される）を指す。所望の特性の遺伝子に寄与する親のアブラナ属（Brassica）植物体は、「一回親」または「供与親」と称される。この術語は、一回親は、戻し交雑プロトコールにおいて一回使用され、したがって、反復しないという事実を指す。一回親由来の１つまたは複数の遺伝子が移入される親のアブラナ属（Brassica）植物体は、戻し交雑プロトコールにおいて何ラウンドか使用されるので、反復親として公知である（Poehiman & Sleper、1994、Fehr、1987）。典型的な戻し交雑プロトコールでは、対象の元の品種（反復親）を、移入される対象の単一遺伝子を担持する第２の品種（一回親）と交雑する。次いで、この交雑から生じた後代を再度反復親と交雑し、このプロセスを、一回親由来の単一の移入遺伝子に加えて、反復親の所望の形態学的特性および生理的特性の本質的に全てが変換された植物体において回復したことが、同じ環境条件下で生長させた場合に５％の有意水準で決定されたアブラナ属（Brassica）植物体が得られるまで繰り返す。本出願では、「アブラナ属（Brassica）」という用語は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、カラシナ（Brassica juncea）、クロガラシ（Brassica nigra）、アビシニアガラシ（Brassica carinata）、ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）およびブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）を含めたアブラナ属（Brassica）に包含される種のいずれかまたは全てを含み得る。

キャノーラカラシナ（Brassica juncea）とは、本出願において使用される場合、それぞれ「キャノーラ」油または「キャノーラ」粕としての商品名の要件を満たす油および粕の品質を有する種子を生じるカラシナ（Brassica juncea）（すなわち、種子油中２重量％未満のエルカ酸（Δ１３−２２：１）を有し、油を含まない粕１グラム当たり３０マイクロモル未満のグルコシノレートを有するカラシナ（Brassica juncea）種の植物体）を指す。

一態様では、本発明は、オレイン酸の重量百分率が高く、リノレン酸の重量百分率が低い内在性の脂肪酸含有量を有する種子を生じることができるカラシナ（Brassica juncea）植物体などのアブラナ属（Brassica）植物体を提供する。特定の実施形態では、オレイン酸は、約６８．０％超、６９．０％超、７０．０％超、７１．０％超、７２．０％超、７３．０％超、７４．０％超、７５．０％超、７６．０％超、７７．０％超、７８．０％超、７９．０％超、８０．０％超、８１．０％超、８２．０％超、８３．０％超、８４．０％超または８５．０％超を構成し得、全ての整数およびその分数、または８５％のオレイン酸を超える値を有する任意の整数を含む。特定の実施形態では、脂肪酸のリノレン酸含有量は、約５％未満、４％未満、３％未満、２．５％未満、２．０％未満、１．５％未満、１．０％未満、０．５％未満または０％未満であり得、全ての整数およびその分数を含む。例示的な一実施形態では、植物体はカラシナ（Brassica juncea）であり、その種子は、少なくとも６８重量％のオレイン酸および３重量％未満のリノレン酸を含む内在性の脂肪酸含有量を有する。追加的な実施形態では、植物体は、カラシナ（Brassica juncea）植物体であり、その種子は、少なくとも６８．０重量％のオレイン酸および約５重量％以下のリノレン酸を含む内在性の脂肪酸含有量を有する。

一態様では、本発明は、オレイン酸の重量百分率が高く、リノレン酸の重量百分率が低い内在性の脂肪酸含有量、および、それぞれ約５．５％未満の総飽和脂肪酸または＞１０％の総飽和脂肪酸を含み得る低総飽和脂肪酸または高総飽和脂肪酸を有する種子を生じることができるカラシナ（Brassica juncea）植物体などのアブラナ属（Brassica）植物体を提供する。

カラシナ（Brassica juncea）の種子由来の油の組成は、セイヨウアブラナ（Brassica napus）の種子由来の油の組成とは、脂肪酸構成成分（例えば、エルカ酸含有量がより高い）、精油（例えば、アリルイソチオシアネート）、および副次的な構成物（例えば、トコフェロール、金属、タンニン、フェノール、リン脂質、染色体（color body）など）のいずれにおいても異なることが公知である。カラシナ（Brassica juncea）由来の種子（抽出された油を含む）中の油は、カラシナ（Brassica juncea）由来の油は一般にはより高レベルのＣ１８：３を有するにもかかわらず、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来の油と比較して酸化安定性が高いことが見いだされている。（C. Wijesunderaら、「Canola Quality Indian Mustard oil（Brassica juncea）is More Stable to Oxidation than Conventional Canola oil（Brassica napus）」、J. Am. Oil Chem. Soc. (2008)85:693-699)。

代替の態様では、本発明は、アブラナ属（Brassica）植物体のオレイン酸含有量を増加させ、リノレン酸含有量を減少させるための方法を提供する。そのような方法は、（ａ）オレイン酸含有量が５５％超であり、リノレン酸含有量が１４％未満であるアブラナ属（Brassica）系統由来の少なくともいくつかの細胞において突然変異誘発を誘導するステップと、（ｂ）前記突然変異誘発された細胞の少なくとも１つから植物体を再生し、少なくとも６８％のオレイン酸（または上で詳述されているオレイン酸の代替閾値濃度）および３％未満のリノレン酸（または上で詳述されているリノレン酸の代替閾値濃度）を含む脂肪酸含有量を有する再生された植物体を選択するステップと、（ｃ）前記再生された植物体から植物体のさらなる世代を引き出すステップであって、前記植物のさらなる世代の個々の植物体が少なくとも６８％のオレイン酸（または代替閾値濃度）および３％未満のリノレン酸（または代替閾値濃度）を含む脂肪酸含有量を有するステップとを伴ってよい。いくつかの実施形態では、アブラナ属（Brassica）はカラシナ（Brassica juncea）であってよい。「高オレイン酸含有量」および「低リノレン酸含有量」という用語は、上記の可能性のある値の全域を包含する。代替の実施形態では、本発明の方法は、系統、再生された植物体および植物体のさらなる世代のうちの１つまたは複数を、リノール酸含有量の減少、例えば、上記の可能性のある値の範囲などについて選抜するステップをさらに含んでよい。別の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）の再生された植物体から種子を選抜し、生長させることを伴ってよい。別の実施形態では、本発明の方法は、所望のオレイン酸含有量、リノール酸含有量、またはその両方が実現されるまで特定のステップを繰り返すことを含んでよい。

代替の実施形態では、個々の種子を、オレイン酸含有量の増加およびリノール酸含有量の減少についてスクリーニングするための方法であって、発芽種子の一部の脂肪酸のオレイン酸含有量；またはリノール酸含有量；またはオレイン酸含有量およびリノール酸含有量のうちの１つまたは複数を決定するステップと、含有量のうちの１つまたは複数を参照値と比較するステップと、種子の、可能性のある相対的なオレイン酸、リノール酸、またはオレイン酸とリノール酸の含有量を推測するステップとを含む方法が提供される。特定の実施形態では、分析のために使用する植物体の一部は、葉、子葉、幹、葉柄、茎、または任意の他の組織の一部または全部、または組織の断片、例えば、種子の組成との信頼できる相関が実証されている組成を有する組織などであってよい。一連の実施形態では、発芽体の一部は、葉の一部であってよい。ある特定の実施形態では、種子の脂肪酸組成を推測するステップは、前記葉中の所与の酸のレベルの有意な変化が、種子中のその酸のレベルの同様の相対的変化を反映すると仮定することを含んでよい。本発明の特定の実施形態では、アブラナ属（Brassica）植物体を、少なくとも６８重量％のオレイン酸および３重量％未満のリノレン酸を含む内在性の脂肪酸含有量を有する種子を有する個々の植物系統について、葉組織を分析することによってスクリーニングするための方法。さらに、葉組織を脂肪酸組成についてガス液体クロマトグラフィーによって分析することができ、ここで脂肪酸の抽出は、バルク種子（bulk-seed）分析または半種子（half-seed）分析などの方法によって起こり得る。

代替の実施形態では、本発明は、カラシナ（Brassica juncea）系統由来の上記の対立遺伝子を含むカラシナ（Brassica juncea）植物体であってよいアブラナ属（Brassica）植物体を提供する。ある特定の実施形態では、植物体は、突然変異遺伝子によって示されるｆａｄ２−ａ遺伝子座およびｆａｄ３−ａ遺伝子座においてホモ接合性であってよい。追加的な実施形態では、カラシナ（Brassica juncea）植物体、植物細胞、またはその一部は、本明細書に開示されている上記の配列からの核酸配列を有する対立遺伝子を含有する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＨＯＬＬ、本発明のキャノーラ品質のカラシナ（Brassica juncea）（≧６８％のオレイン酸および≦５％のリノレン酸）と、低オレイン酸／高リノレン酸のカラシナ（Brassica juncea）（約４５％のオレイン酸および約１４％のリノレン酸）を、ＢＪｆａｄ２ｂ遺伝子の存在または不在を検査することによって区別することを伴ってよい（参考として、米国特許出願公開第２００３０２２１２１７号、Yaoらを参照されたい）。この区別は、当技術分野で公知の通り、ＢＪｆａｄ２ａ遺伝子が、キャノーラ品質のカラシナ（Brassica juncea）系統における唯一の機能的なオレイン酸脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子であること確認することを伴ってよい。

一実施形態では、カラシナ（Brassica juncea）系統は、国際公開第ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１号に開示されており、その図１および３に例示されている通り、ｆａｄ２遺伝子およびｆａｄ３遺伝子を含有する。ｆａｄ２遺伝子およびｆａｄ３遺伝子は、本明細書において配列番号１〜４で例示されている。生じた対立遺伝子は、デルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードし、これは、国際公開第ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１号の図２に例示されている。他の実施形態では、カラシナ（Brassica juncea）系統は、ｆａｄ２−ａ遺伝子およびｆａｄ３−ａ遺伝子の遺伝子座において突然変異を含有してよく、生じた突然変異遺伝子は、予測されるＢＪＦＡＤ２−ａタンパク質およびＢＪＦＡＤ３−ａタンパク質の配列における１つまたは複数の突然変異をコードし得る。本発明において使用するために適したｆａｄ２−ａおよびｆａｄ３−ａの突然変異した遺伝子およびタンパク質の代表的な例としては、これらに限定されないが、以下に開示されているものなども挙げられる：国際公開第ＷＯ２００６／０７９５６７Ａ２号（例えば、図１および２）、例えば、配列番号８および９など；国際公開第ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２号、例えば、配列番号１０〜２１など；米国特許第６，９６７，２４３Ｂ２号（例えば、図２および３）、例えば、配列番号２２〜２７；および欧州公開第１８６２５５１Ａ１号（例えば、図１〜１０）、例えば、配列番号２８〜３９。

選択された実施形態では、本発明は、以前に開示された突然変異体ｆａｄ２遺伝子およびｆａｄ３遺伝子の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および／または５’上流領域を含む単離されたＤＮＡ配列を提供する。したがって、本発明は、上記の突然変異遺伝子由来の突然変異を含有する予測突然変異体タンパク質のポリペプチド配列も提供する。ＦＡＤ２などの膜結合デサチュラーゼは、保存されたヒスチジンボックスを有することが公知である。これらのヒスチジンボックスの外側のアミノ酸残基の変化も、ＦＡＤ２酵素活性に影響を及ぼす（Tanhuanpaaら、Molecular Breeding 4:543-550、1998）。

本発明の一態様では、本明細書に記載の突然変異遺伝子を植物の育種において使用することができる。詳細には、本発明の対立遺伝子を、高オレイン酸のアブラナ属（Brassica）種、例えば、カラシナ（Brassica juncea）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、クロガラシ（Brassica nigra）およびアビシニアガラシ（Brassica carinata）などを育種するために使用することができる。本発明は、突然変異遺伝子を代替配列と区別するための分子マーカーを提供する。それにより、本発明は、本発明の対立遺伝子を有する植物体が関与する遺伝的交雑の分離および選別分析のための方法を提供する。それにより、本発明は、本発明の対立遺伝子を有する植物が関与する遺伝的交雑に由来する後代の分離および選抜分析のための方法を提供する。

代替の実施形態では、本発明は、望ましい脂肪酸組成または所望のゲノム特性を有するカラシナ（Brassica juncea）植物体などのアブラナ属（Brassica）植物体を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、例えば、ゲノム内の、特定のＦＡＤ２対立遺伝子および／またはＦＡＤ３対立遺伝子、例えば、本発明の対立遺伝子など、または野生型Ｊ９６Ｄ−４８３０対立遺伝子／ＢＪｆａｄ２ａ対立遺伝子の存在を決定することを伴ってよい。特定の実施形態では、該方法は、同定された対立遺伝子のうちの１つに関連づけられる核酸多型、または本発明の対立遺伝子のうちの１つに関連づけられる抗原性決定因子の存在を同定することを含んでよい。そのような決定は、例えば、さまざまな技法、例えば、関連性のあるＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅、ＤＮＡフィンガープリント法、ＲＮＡフィンガープリント法、ゲルブロッティングおよびＲＦＬＰ解析、ヌクレアーゼ保護アッセイ、関連性のある核酸断片の配列決定、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の生成、または関連性のある対立遺伝子によって産生されるタンパク質を、そのタンパク質の他の変異体または野生型形態と区別することに適合する代替の方法などを用いて実現することができる。本発明は、少なくとも６８重量％のオレイン酸を含む内在性の脂肪酸含有量を有する種子を有するカラシナ（B. juncea）植物体を、本発明の突然変異遺伝子の存在を決定することによって同定するための方法も提供する。

代替の実施形態では、本発明は、突然変異したＦＡＤ２タンパク質およびＦＡＤ３タンパク質をコードするｆａｄ２コード配列およびｆａｄ３コード配列を含むアブラナ属（Brassica）植物体を提供する。そのような突然変異したＦＡＤ２／ＦＡＤ３タンパク質は、野生型ＦＡＤ２タンパク質と比較してただ１つのアミノ酸の変化を含有してよい。代表的な実施形態では、種々のカラシナ（Brassica juncea）系統が、上記の対立遺伝子によりコードされる上記の突然変異したＦＡＤ２タンパク質を含有する。そのような対立遺伝子は、オレイン酸含有量の増加およびリノレン酸含有量の減少を本発明の植物体に付与するために有効であるように選択することができる。特定の実施形態では、育種技法によって、所望の対立遺伝子を植物体に導入することができる。代替の実施形態では、植物の形質転換を含めた分子生物学的技法によって本発明の対立遺伝子を導入することができる。そのような実施形態では、本発明の植物体は、少なくとも約６８重量％のオレイン酸および約３重量％未満のリノレン酸、または上で詳述されている任意の他のオレイン酸およびリノレン酸の含有量の閾値を含む内在性の脂肪酸含有量を有する種子を生じ得る。本発明の植物体は、約６８重量％〜約８５重量％のオレイン酸、約７０％〜約７８％のオレイン酸、および約０．１％〜約３％のリノール酸も含有し得、油組成は、親系統に遺伝的に由来する。本発明の植物体は、７．１重量％未満〜約６．２重量％未満の全脂肪酸含有量も有し得る。一実施形態では、植物体は、少なくとも約６８％のオレイン酸および３％未満のリノール酸を含む内在性の脂肪酸含有量を有する種子を生じ、油組成は親系統に遺伝的に由来する。

選択された実施形態では、本発明は、前述の実施形態のうちの１つまたは複数で詳述されている脂肪酸組成を有する内在性の油含有量を有し、内在性の油含有量の遺伝的決定因子が、本発明の突然変異遺伝子に由来するカラシナ（Brassica juncea）種子であってよいアブラナ属（Brassica）種子を提供する。そのような種子は、例えば、本発明の突然変異遺伝子系統のそれぞれを自家受粉させることによって得ることができる。あるいは、そのような種子は、例えば、突然変異遺伝子系統を第２の親と交雑し、その後選抜することによって得ることができ、第２の親は、任意の他のアブラナ属（Brassica）系統、例えば、キャノーラ品質のカラシナ（Brassica juncea）またはキャノーラ品質でないカラシナ（Brassica juncea）であるカラシナ（Brassica juncea）系統など、または任意の他のアブラナ属（Brassica）種、例えば、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、クロガラシ（Brassica nigra）、およびアビシニアガラシ（Brassica carinata）などであってよい。これらの育種技法は当業者に周知である。

代替の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の１つまたは複数に開示されている組成を有する成熟種子を発生するカラシナ（Brassica juncea）植物体などの遺伝的に安定なアブラナ属（Brassica）の植物体を提供する。そのような植物体は、本発明の突然変異遺伝子を有するカラシナ（Brassica juncea）系統から得ることができる。そのような植物の油組成は、遺伝的に親系統に由来し得る。

代替の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の１つまたは複数に関して示されている組成を含む内在性の脂肪酸含有量を有する成熟種子を生じるカラシナ（Brassica juncea）植物体などの遺伝的に安定なアブラナ属（Brassica）植物体を作出するプロセスを提供する。本発明のプロセスは、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のオメガ９遺伝子（例えば、ｆａｄ２ａおよびｆａｄ３ａ）をカラシナ（Brassica juncea）などの他のアブラナ属（Brassica）植物体と交雑して、Ｆ１後代を形成するステップを伴ってよい。Ｆ１後代は、例えば、自家受粉または倍加半数体植物の発生を含み得る手段によって繁殖させることができる。突然変異ＦＡＤ２対立遺伝子および突然変異ＦＡＤ３対立遺伝子を組み合わせることによって、二重突然変異遺伝子（ｆａｄ２およびｆａｄ３）を有する植物は、任意の単一突然変異植物体よりも優れた油の脂肪酸プロファイルを有し得る。生じた後代は、前述の実施形態の１つまたは複数に関して開示されている組成を有する種子を生成する遺伝的に安定な植物体についての選抜に供することができる。そのような種子は、例えば、抽出可能な油の総量中約７．１％〜約６．５％の総飽和含有量を含む安定化された脂肪酸プロファイルを有し得る。特定の変形では、後代は、それ自体が代替的な実施形態に関して上で詳述されている組成を有する種子または油を生じる。約６８重量％超のオレイン酸含有量および約３重量％未満のリノレン酸含有量を有する。

一態様では、本発明は、安定な、遺伝性の高オレイン酸および低リノレン酸表現型を有する植物体を提供する。例えば、本発明の突然変異遺伝子に由来する高オレイン酸および低リノレン酸表現型は、Ｍ２世代、Ｍ３世代、およびＭ４世代を通じて遺伝性である。

代替の実施形態では、本発明は、突然変異誘発実験のために使用した野生型カラシナ（B. juncea）と比較して、脂肪酸デサチュラーゼの活性が変更された、オレイン酸含有量が変更された、またはリノレン酸含有量が変更されたカラシナ（Brassica juncea）植物体を提供する。脂肪酸デサチュラーゼ（「ＦＡＤ」）とは、脂肪酸の生合成において二重結合を導入する活性を示すタンパク質を意味する。例えば、ＦＡＤ２／ＦＡＤ３酵素は、オレイン酸からのリノール酸の生合成において第２の二重結合を導入する活性によって特徴付けることができる。デサチュラーゼ活性の変更は、参照用の植物体、細胞または試料と比較してデサチュラーゼ活性が上昇していること、低下していることまたは排除されていることを含んでよい。

他の態様では、デサチュラーゼ活性の低下は、デサチュラーゼをコードする核酸配列、例えば、本発明の核酸配列などの発現の排除を含み得る。発現の排除とは、本明細書では、核酸配列によりコードされる機能的なアミノ酸配列が検出可能なレベルで産生されないことを意味する。デサチュラーゼ活性の低下は、デサチュラーゼをコードする核酸配列、例えば、ＦＡＤ２酵素またはＦＡＤ３酵素をコードする本発明の配列などの転写の排除を含み得る。転写の排除とは、本明細書では、核酸配列によりコードされるｍＲＮＡ配列が検出可能なレベルで転写されないことを意味する。デサチュラーゼ活性の低下とは、デサチュラーゼをコードする核酸配列由来の切断されたアミノ酸配列の産生も含み得る。切断されたアミノ酸配列の産生とは、本明細書では、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列が、野生型核酸配列によりコードされる機能的なアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸が欠けたものであることを意味する。さらに、デサチュラーゼ活性の低下とは、変異デサチュラーゼアミノ酸配列の産生を含み得る。変異アミノ酸配列の産生とは、本明細書では、アミノ酸配列が、野生型核酸配列によりコードされるアミノ酸配列とは異なる１つまたは複数のアミノ酸を有することを意味する。本明細書においてより詳細に考察されている通り、本発明には、本発明の突然変異系統が、野生型系統Ｊ９６Ｄ−４８３０と比較して変異アミノ酸を有するＦＡＤ２酵素およびＦＡＤ３酵素を産生することが開示されている。デサチュラーゼ活性を低下させるために、種々の種類の突然変異、例えば、フレームシフト突然変異、置換および欠失などを核酸配列に導入することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の代替的な実施形態に従って修飾することができる新しいＦＡＤ２／ＦＡＤ３ポリペプチド配列を提供する。ポリペプチドの構造に、そのペプチドの生物学的機能を実質的に変化させることなくいくつかの修飾および変化を行って、生物学的に等価なポリペプチドを得ることができることが当技術分野で周知である。本明細書で使用される場合、「保存されたアミノ酸置換」という用語は、ペプチド内の所与の場所における１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換であって、いかなる目に見える機能の損失または増大も伴わずに行って生物学的に等価なポリペプチドを得ることができる置換を指す。そのような変化を成すことにおいて、好ましいアミノ酸残基置換を、側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらのサイズ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて行うことができ、そのような置換を、それらのペプチドの機能に対する効果について、常套的な試験によってアッセイすることができる。逆に、本明細書で使用される場合、「保存されていないアミノ酸置換」という用語は、ペプチド内の所与の場所における１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換であって、目に見えるペプチドの機能の損失または増大を引き起して、生物学的に等価ではないポリペプチドが得られる置換を指す。

繊維は、植物細胞壁の構成成分であり、それらとしては、炭水化物ポリマー（例えば、セルロース（直鎖状グルコースポリマー鎖））；ヘミセルロース（例えば、フェノール分子が付着したガラクトース、キシロース、アラビノース、ラムノースのヘテロポリマーの分枝鎖）；およびペクチン（メチル化の程度が異なるガラクツロン酸、キシロース、アラビノースの水溶性ポリマー）が挙げられる。繊維は、ポリフェノールポリマー（例えば、リグニン様ポリマーおよび縮合タンニン）も包含する。理論的には、ＡＤＦ繊維はセルロースおよびリグニンからなる。縮合タンニンは、一般には、ＡＤＦ画分に含まれるが、縮合タンニン含有量はＡＤＦ無関係に変動する。対照的に、ＴＤＦとは、タンパク質、可溶物、およびデンプンが除去された粕であり、不溶性細胞壁構成成分（例えば、セルロース、ヘミセルロース、ポリフェノール、およびリグニン）で構成される。

特定の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体の種子（例えば、暗色の種子のキャノーラ植物体）は、キャノーラ品種と比較して減少したＡＤＦを有し得る。特定の例では、キャノーラ粕の繊維含有量（全種子、油除去、乾物ベースで）は、例えば、これらに限定することなく、約１８％未満のＡＤＦ（例えば、約１８％のＡＤＦ、約１７％のＡＤＦ 約１６％のＡＤＦ、約１５％のＡＤＦ、約１４％のＡＤＦ、約１３％のＡＤＦ、約１２％のＡＤＦ、約１１％のＡＤＦ、および約１０％のＡＤＦおよび／または約２２％未満のＮＤＦ（例えば、約２２．０％のＮＤＦ、約２１％のＮＤＦ、約２０％のＮＤＦ、約１９％のＮＤＦ、約１８％のＮＤＦ、および約１７％のＮＤＦ）を含み得る。

特定の実施形態では、本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体の種子は、標準の暗色の種子のキャノーラ品種と比較して増加したタンパク質含有量を有し得る。特定の例では、キャノーラ粕（全種子、油除去、乾物ベースで）のタンパク質含有量は、例えば、これらに限定することなく、約４５％超（例えば、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、および約５８％）の粗タンパク質を含み得る。異なるキャノーラ品種は、特定のタンパク質含有量によって特徴付けられる。タンパク質含有量（％窒素×６．２５）は、種々の周知かつ常套的な分析技法、例えば、ＮＩＲおよびＫｊｅｌｄａｈｌを用いて決定することができる。

いくつかの実施形態では、キャノーラ品種の種子、植物体、および系統を、リン含有量を用いて定義することもできる。そのようなキャノーラ品種からは、標準のキャノーラ品種から作出された粕と比較して増加したリン含有量を有する（全種子、油除去、乾物ベースで）キャノーラ粕が作出され得る。例えば、本発明のキャノーラ粕は、１．２％超、１．３％超、１．４％超、１．５％超、１．６％超、１．７％超、および／または１．８％超のリン含有量を含み得る。

上述の形質の種々の組み合わせは、いくつかの実施例において提供される近交系のキャノーラ系統および雑種において同定することができ、例示されている。これらの系統により、多種多様な有利なキャノーラの特性および／または形質の種々の新しい組み合わせを提供し、得るために本発明の生殖質を使用することができることが例示される。例えば、本発明の生殖質を含む近交系のキャノーラ系統を所望の特性および／または形質を含む別のキャノーラ系統と交雑して、本発明の生殖質を含む近交系のキャノーラ系統の望ましい種子構成成分の特性を導入することができる。種子構成成分（例えば、繊維含有量、グルコシノレート含有量、油含有量など）および他の植物体の形質の算出は、当技術分野で公知であり、産業において許容される技法を用いて得ることができる。親品種の所望の特性および／または形質を含む、交雑からの後代植物を選抜し、繁殖させることによって、特性および／または形質の所望の組み合わせを含む新しい品種を創出することができる。

Ｖ．改善された栄養特性を有するキャノーラ粕
いくつかの実施形態は、上記の油および粕の特性を有するキャノーラ種子を含む粕を提供する。例えば、いくつかの実施形態は、上記の特性（例えば、種子構成成分）の新規の組み合わせを含む、ヘキサン抽出し、風乾したキャノーラ粕（白色フレーク、またはＷＦ）を包含する。特定の実施形態は、本発明の生殖質を含む植物から生じたキャノーラ種子を含む粕、および本発明の生殖質を含む植物の後代の種子を含む粕を包含する。

本発明の生殖質を含むキャノーラの純系統および雑種は、いくつかの実施形態では、飼料成分または食物成分として直接利用される場合、および／またはタンパク質分離物およびタンパク質濃縮物を加工するための飼料ストックとして利用される場合に、栄養的に強化された粕の性質がもたらすことができる。例えば、そのようなキャノーラの純系統および雑種は、標準のキャノーラ粕よりも優れた動物用飼料性能をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、キャノーラ粕構成成分（およびそれらを含む動物飼料）を利用して、単胃動物（例えば、ブタおよび家禽）に優良な栄養を提供することができる。

いくつかの実施形態では、キャノーラ粕構成成分（およびそれらを含む動物飼料）をさらに利用して、反芻動物（例えば、ウシ亜科動物、ヒツジ、ヤギ、および他の反芻亜目の動物）に優良な栄養を提供することもできる。反芻動物の給餌では、特別な問題および特別な機会が示される。特別な機会は、これらの動物の第一胃中の特定の微生物により分解され得るが、一般に、ブタなどの単胃哺乳動物には消化されない不溶性のセルロース系繊維を利用する反芻動物の能力から生じる。特別な問題は、特定の飼料により第一胃における繊維の消化が阻害される傾向から、および第一胃により特定の飼料の構成成分のいくつか、例えば、脂肪およびタンパク質などの利用が限定される傾向から生じる。

油を抽出したアブラナ属（Brassica）種子は、動物用飼料に使用される高品質のタンパク質の潜在的な供給源である。油を抽出した後、商品キャノーラ粕は、約３７％のタンパク質を含み、比較して、飼料および食物目的のために現在広範に好ましいダイズ粕では約４４〜４８％である。キャノーラに含有されるタンパク質はメチオニンが豊富であり、適切な分量のリシンを含有し、そのどちらも、大部分の穀類および油糧種子のタンパク質において制限アミノ酸である。しかし、キャノーラ粕は望ましくない構成物、例えば、繊維、グルコシノレート、およびフェノールなどを含有するので、タンパク質供給源としてのその使用は特定の動物飼料ではいくらか限定されている。

キャノーラが由来するナタネの１つの栄養的側面は、硫黄に基づく化合物であるグルコシノレートのレベルが高い（３０〜５５μｍｏｌ／ｇ）ことである。キャノーラの葉または種子を破砕すると、グルコシノレートに対するミロシナーゼの作用によってイソチオシアネートエステルが生成される。これらの生成物は、甲状腺によるチロキシンの合成を阻害し、また他の抗代謝的な影響を有する。Paulら（1986）Theor. Appl. Genet. 72:706-9。したがって、ヒトの食用には、製品安全性をもたらすために、例えば、ナタネ粕由来のタンパク質のグルコシノレート含有量を減少させるまたは排除するべきである。

例えば、種子における好都合な油プロファイルおよび含有量および低グルコシノレート含有量を有する改善されたキャノーラ種子では、水素添加の必要性が有意に減少する。例えば、そのような油は、オレイン酸含有量が高く、α−リノレン酸含有量が低いことにより、酸化安定性の増加がもたらされ得、それにより、水素添加の必要およびトランス脂肪酸の生成が減少する。種子のグルコシノレートが減少することにより、油中に残留する硫黄含有量が有意に減少する。硫黄により、水素添加に一般に使用されるニッケル触媒が被毒する。Koseogluら、第8章、Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology、Shahidi編、Van Nostrand Reinhold、N.Y.、1990、123〜48頁。さらに、種子のグルコシノレートが少ないキャノーラ品種由来の油は、水素化するための費用が少なくなる。

キャノーラ粕中のフェノール化合物により、苦いフレーバーが付与され、最終的なタンパク質産物には暗色が必ず伴うと考えられている。標準のキャノーラ粕中に大量に存在する種子の外皮は、ヒトおよび他の単胃動物にとっては消化しにくく、また、見苦しい異質な製品がもたらされる。

本発明の生殖質を含むキャノーラ植物体から生じた種子の粕構成成分は、例えば、これらに限定することなく、高タンパク質、低繊維、高リン、および／または低ＳＡＥを有し得る。不溶性の繊維およびポリフェノールは非栄養性であり、タンパク質およびアミノ酸の消化を害する。したがって、減少した繊維含有量、増加したタンパク質含有量、減少したポリフェノール含有量および増加したリン含有量からなる群から選択される少なくとも１つの種子構成成分の特性を有するキャノーラ粕およびキャノーラ粕を含む動物飼料が、一部の適用において望ましい場合がある。

特定の例では、キャノーラ粕（油を含まない乾物ベース）は、少なくとも約４５％（例えば、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、および約５８％）のタンパク質含有量を含み得る。

本発明の生殖質を含むキャノーラ品種は、好収率を有し得、参照キャノーラ系統と比較してはるかに低い酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を有する種子を生じる。本発明の生殖質を含む植物品種から生じた種子の構成成分に関して決定された任意の経験的な値は、いくつかの実施形態において、植物品種の植物体、種子、および油を定義するために使用することができる。一部のそのような実施例では、決定された値のいずれかを上回る、下回るまたはその中間の範囲を定義するための評価項目として特定の数字を使用することができる。油の特性および他の種子構成成分に関する例示的な範囲は上に記載されている。系統およびその植物体の種子も、そのような範囲の組み合わせによって定義することができる。例えば、上記の油の特性を、特徴的な繊維レベル、ポリフェノールレベル、グルコシノレートレベル、タンパク質レベル、およびリンレベルと一緒に、例えば、特定の系統およびその種子を定義するために使用することができる。

上述の特性（例えば、種子構成成分の特性）の全てが、いくつかの実施形態の系統および種子を定義するために必要なわけではないが、そのような系統および種子を定義するために追加的な特性を使用することができる（例えば、これらに限定することなく、代謝エネルギー、可消化エネルギー、生物学的エネルギー、および正味エネルギー）。

ＶＩ．種子色に関係なく望ましい種子構成成分の形質を付与する生殖質を含む植物体
本発明の生殖質を含む特定のキャノーラの純系統および雑種の望ましい形質を、アブラナ属（Brassica）の他の種類、例えば、Ｂ．ラパ（B. rapa）、およびカラシナ（B. juncea）に移入し（従来の育種などを通じて）、種子色に関係なく発現される所望の特性（例えば、種子構成成分の特性）を有する種子を生じる植物体を得ることができる。したがって、本発明の生殖質を含む特定のキャノーラの純系統または雑種の１つまたは複数の望ましい形質を移入したアブラナ属（Brassica）品種は、種子が黄色または種子が暗色である所望の特性を有する種子を生じ得る。そのような新規のまたは改変されたアブラナ属（Brassica）品種の粕および種子は、種子の繊維のレベルが低下し、タンパク質のレベルが上昇し、リンのレベルが上昇し、かつ／またはポリフェノールのレベルが低下し得る。

いくつかの実施形態は、本明細書において記載され、例示されている生殖質を含むキャノーラの黄色の種子および暗色の種子だけではなく、そのような種子から生長した、または他のやり方で生じた植物体、ならびに対象のキャノーラ植物体の再生可能な細胞の組織培養物も包含する。例示されている系統および雑種は、遺伝子工学も突然変異誘発も用いずに得ており、それにより、新規の改変されたキャノーラ品種の作出における生殖質の有用性が実証される。

いくつかの特定の実施形態では、特異的な例示的なキャノーラの純系統および雑種が提供される。本開示の一部として、ＣＬ０６５６２０、ＣＬ０４４８６４、ＣＬ１２１４６０Ｈ、ＣＬ１６６１０２ＨおよびＣＬ１２１４６６Ｈのそれぞれの少なくとも２５００の種子が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．２０８５２に寄託されており、一般に公開されており、特許権に支配されているが、他の点では、制限がない（米国特許法施行規則第１．８０８条（ｂ）により明白に認められている制限以外）。寄託物は、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１６９７、ＰＴＡ−１１６９６、ＰＴＡ−１１６９８、ＰＴＡ−＿、およびＰＴＡ−１１６９９＿と称されており、寄託日は、ＰＴＡ１１６９６〜ＰＴＡ１１６９９については２０１１年２月２２日であり、ＰＴＡ_＿については２０１２年２月２１日である。寄託物は、公共の寄託所であるＡＴＣＣ寄託所において、３０年、または最新の要求から５年、または特許の有効期間のいずれか長い期間にわたって上記の通り維持され、寄託物は、その期間中に生育不能になった場合には交換される。

いくつかの実施形態は、本明細書に開示されているセイヨウアブラナ（Brassica napus）品種のいずれかの種子を包含する。いくつかの実施形態は、そのような種子から生じたセイヨウアブラナ（Brassica napus）植物体、ならびにそのような植物の再生可能な細胞の組織培養物も包含する。また、そのような組織培養物から再生されたセイヨウアブラナ（Brassica napus）植物体も包含される。特定の実施形態では、そのような植物体は、例示されている品種の全ての形態学的性質および生理的性質を発現することができ得る。特定の実施形態のセイヨウアブラナ（Brassica napus）植物体は、寄託された種子から生長させた植物体の識別的な生理的特性および／または形態学的特性を有し得る。

本発明の生殖質（例えば、本明細書において提供される例示的なキャノーラの純系統および雑種に見いだされる）を用いて、少なくとも１つの上記の種子の後代の親において交雑を行うプロセスも提供される。例えば、いくつかの実施形態は、本明細書において例示されている植物体のいずれかを一方の親または両親として持つＦ_１雑種セイヨウアブラナ（B. napus）植物体を包含する。別の実施形態は、そのようなＦ_１雑種から生じたセイヨウアブラナ（B. napus）種子を包含する。特定の実施形態では、Ｆ_１雑種セイヨウアブラナ（B. napus）種子を作出するための方法は、例示された植物体を異なる近交系の親キャノーラ植物体と交雑し、得られた雑種種子を収穫することを含む。本発明のキャノーラ植物体（例えば、親キャノーラ植物体、およびＦ_１雑種を作出するための方法によって作出されたキャノーラ植物体）は、雌株または雄株のいずれでもあり得る。

いくつかの実施形態では、キャノーラ植物体の特性（例えば、油およびタンパク質のレベルおよび／またはプロファイル）を、本発明の植物体と、改変された特性（例えば、高レベルの油およびタンパク質）を有する別の系統を交雑することによってさらに改変および／または改良することができる。同様に、親植物を慎重に考察することによって他の特性を改良することができる。本発明の生殖質を含むキャノーラ系統は、それらの望ましい種子構成成分の特性を、種子色に関係なく他のセイヨウアブラナまたはキャノーラ系統と交雑するために有益であり得る。本発明の生殖質により、これらの形質を、同じ種内の他の植物体に、他家受粉および後代の選抜を含めた従来の植物の育種技法によって移入することが可能になる。いくつかの実施形態では、花粉の移動および選抜を伴う従来の植物の育種技法を用いて、所望の形質を種間で移入することができる。例えば、Brassica crops and wild allies biology and breeding、Tsunadaら編、Japan Scientific Press、Tokyo（1980）；Physiological Potentials for Yield Improvement of Annual Oil and Protein Crops、DiepenbrockおよびBecker編、Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin、Vienna（1995）；Canola and Rapeseed、Shahidi編、Van Nostrand Reinhold、N.Y.（1990）；およびBreeding Oilseed Brassicas、Labanaら編、Narosa Publishing House、New Dehli（1993）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの望ましい種子構成成分の特性を種子色に関係なく移入するための方法は、種間交雑した後、Ｆ_１世代のメンバーを自家受粉させてＦ_２種子を作出することを含む。次いで、戻し交雑を行って、所望の種子構成成分の特性（複数可）を示す系統を得ることができる。さらに、プロトプラスト融合および核移植方法を用いて、形質を１つの種から別の種に移入することができる。例えば、Ruesink、「Fusion of Higher Plant Protoplasts」、Methods in Enzymology、LVIII巻、JakobyおよびPastan編、Academic Press, Inc.、New York、N.Y.（1979）、およびそこで引用されている参考文献；およびCarlsonら（1972）Proc. Natl. Acad Sci. USA 69:2292を参照されたい。

本発明の生殖質を含む例示的なキャノーラ系統を得、作出すると、暗い種皮色を、望ましい種子構成成分の特性と一緒に、上記の従来の植物体の育種技法によって他のアブラナ属（Brassica）種に容易に移入することができる。例えば、暗い種皮色を、望ましい種子構成成分の特性と一緒に、市販のＢ．ラパ（B. rapa）品種、例えば、これらに限定することなく、Ｔｏｂｉｎ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、およびＣｏｌｔに容易に移入することができる。暗い種子色を種子の他の特性と一緒に移入しなければならないわけではないことが理解される。

出発点として例示的な品種のうちの１つを考えると、当業者は、品種によってもたらされる特定の利益を、いくつものやり方で、本発明の範囲から逸脱することなく操作することができる。例えば、例示的な品種において存在する種子油プロファイルを他の農業的に望ましいセイヨウアブラナ（B. napus）品種に、他家受粉および後代の選抜を伴う従来の植物体の育種技法によって移入することができ、例えば、例示的な品種の生殖質が他の農業的に望ましい品種に組み込まれる。

特定の実施形態は、セイヨウアブラナ（B. napus）の例示的な品種、ならびに例示されている品種の少なくとも１つに本質的に由来する従属品種を含み得る。さらに、本発明の実施形態は、例示されている品種の少なくとも１つの植物体、そのような従属品種の植物体、および／またはセイヨウアブラナ植物体から生じた植物体または組織（花粉、種子、および細胞を含む）から再生されたセイヨウアブラナ植物体を含み得る。

再生することができる植物性材料、例えば、種子、小胞子、胚珠、花粉、栄養部位、および小胞子を選択することができる。一般に、そのような植物細胞は、所望の農業形質を有するものを含めた、アブラナ属（Brassica）の任意の品種から選択することができる。

再生技法は当技術分野で公知である。最初に、選抜された植物体または品種から、再生することができる細胞（例えば、種子、小胞子、胚珠、花粉、および栄養部位）を選択することができる。場合によって、これらの細胞を突然変異誘発に供すことができる。次いで、細胞の種類（および突然変異誘発されているかどうか）に基づいて、再生、受精、および／または生長技法を用いて、細胞から植物体を発育させることができる。植物体または種子、またはその一部を操作することにより、従属品種が創出される。

いくつかの実施形態では、所望の種子構成成分の特性および複数の望ましい形質の両方を有する植物体を作出するために、本発明の生殖質を含む植物体によって示される所望の種子構成成分の特性を、複数の追加的な望ましい形質を含む植物体に種子色に関係なく導入することができる。所望の種子構成成分の特性を、１つまたは複数の望ましい形質を含む植物体に種子色に関係なく導入するプロセスは、これらの形質の「スタッキング」と称される。いくつかの例では、複数の望ましい形質を有する所望の種子構成成分の特性のスタッキングにより、種子構成成分の特性がさらに改良され得る。いくつかの例では、複数の望ましい形質を有する所望の種子構成成分の特性のスタッキングにより、複数の望ましい形質の１つまたは複数（例えば、全て）に加えて、所望の種子構成成分の特性を有するキャノーラ植物体がもたらされ得る。

所望の種子構成成分の特性と組み合わせるために望ましい可能性がある形質の例としては、例えば、これらに限定することなく、植物病害抵抗性遺伝子（例えば、Jonesら（1994）Science 266:789（クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に抵抗するためのトマトＣｆ−９遺伝子）；Martinら（1993）Science 262:1432（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に抵抗するためのトマトＰｔｏ遺伝子）；およびMindrinosら（1994）Cell 78:1089（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に抵抗するためのＲＳＰ２遺伝子）を参照されたい；害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体、またはそれに対してモデリングされた合成ポリペプチド（例えば、Geiserら（1986）Gene 48:109（Ｂｔ δエンドトキシン遺伝子；δエンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４００９８；６７１３６；３１９９５；および３１９９８の下で購入することができる）を参照されたい）；レクチン（例えば、Van Dammeら（1994）Plant Molec. Biol. 24:25（クリビア・ミニアータ（Clivia miniata）マンノース結合性レクチン遺伝子）を参照されたい）；ビタミン結合性タンパク質、例えば、アビジン（国際ＰＣＴ公開ＵＳ９３／０６４８７（use of avidin and avidin homologues as larvicides against insect pests）を参照されたい）；酵素阻害剤；プロテアーゼ阻害剤またはプロテイナーゼ阻害剤（例えば、Abeら（1987）J. Biol. Chem. 262:16793（コメシステインプロテイナーゼ阻害剤）；Huubら（1993）Plant Molec. Biol. 21:985（タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ；および米国特許第５，４９４，８１３号）を参照されたい；アミラーゼ阻害剤（Sumitaniら（1993）Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）アルファアミラーゼ阻害剤）を参照されたい）；昆虫に特異的なホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドまたは幼若ホルモン、その変異体、それらに基づく模倣物、またはそれらのアンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、Hammockら（1990）Nature 344:458（幼若ホルモンの失活剤）を参照されたい）；影響を及ぼす害虫の生理機能を攪乱する、昆虫に特異的なペプチドまたは神経ペプチド（例えば、Regan（1994）J. Biol. Chem. 269:9（昆虫利尿ホルモン受容体）；Prattら（1989）Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243（ジプロプテラ・プンタータ（Diploptera puntata）由来のアロスタチン）；米国特許第５，２６６，３１７号（昆虫に特異的な麻痺性神経毒）を参照されたい）； ヘビ、スズメバチ、または他の生物体によって天然に産生される昆虫に特異的な毒液（例えば、Pangら（1992）Gene 116:165（サソリ昆虫毒性ペプチド）を参照されたい）；モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または別の殺虫活性を有する非タンパク質分子の高度集積に関与する酵素；生物活性のある分子の翻訳後修飾を含めた修飾に関与する酵素、例えば、解糖酵素；タンパク質分解酵素；脂肪分解酵素；ヌクレアーゼ；シクラーゼ；トランスアミナーゼ；エステラーゼ；加水分解酵素；ホスファターゼ；キナーゼ；ホスホリラーゼ；ポリメラーゼ；エラスターゼ；キチナーゼ；またはグルカナーゼ、天然、合成に関わらず（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０２１９７（カラーゼ（callase）遺伝子）；キチナーゼをコードする配列を含有するＤＮＡ分子（例えば、ＡＴＣＣから、受託番号３９６３７および６７１５２）；Kramerら（1993）Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691（タバコイモムシキチナーゼ）；およびKawalleckら（1993）Plant Molec. Biol. 21:673（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子）を参照されたい；シグナル伝達を刺激する分子（例えば、Botellaら（1994）Plant Molec. Biol. 24:757（カルモジュリン）；およびGriessら（1994）Plant Physiol. 104:1467（トウモロコシカルモジュリン）を参照されたい；疎水性モーメントペプチド（例えば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６７７６（真菌性植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体）；および国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５５（病害抵抗性を付与する合成抗菌ペプチド））を参照されたい；膜透過酵素、チャネル形成薬、またはチャネル遮断薬（例えば、Jaynesら（1993）Plant Sci 89:43（シュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対するトランスジェニック植物抵抗性を与えるセクロピンβ溶解性ペプチド類似体）を参照されたい）；ウイルスの浸潤性タンパク質またはそれに由来する複合体毒素（例えば、Beachyら（1990）Ann. rev. Phytopathol. 28:451（アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチ病ウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対するコートタンパク質媒介性抵抗性）を参照されたい）；昆虫に特異的な抗体、またはそれらに由来する免疫毒素（例えば、Taylorら、Abstract #497、Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions（Edinburgh、Scotland）（1994）（単鎖抗体断片の産生を介した酵素による不活化）を参照されたい；ウイルス特異的抗体（例えば、Tavladorakiら（1993）Nature 366:469（ウイルスによる攻撃から保護するための組換え抗体遺伝子）を参照されたい）；病原体または寄生生物によって天然に産生される発育抑止性タンパク質（developmental arrestive protein）（例えば、Lambら（1992）Bio/Technology 10:1436（真菌のエンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物の栄養分放出を容易にする；Toubartら（1992）Plant J. 2:367（エンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質）を参照されたい）；ならびに植物により天然に産生される発育抑止性タンパク質（例えば、Logemannら（1992）Bio/Technology 10:305（真菌性病害に対する抵抗性の増大をもたらすオオムギリボソーム不活性化遺伝子）を参照されたい）が挙げられる。

所望の種子構成成分の特性と組み合わせるために望ましい可能性がある形質のさらなる例としては、例えば、これらに限定することなく、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子（Leeら（1988）EMBO J. 7:1241（突然変異ＡＬＳ酵素）；Mikiら（1990）Theor. Appl. Genet. 80:449（突然変異ＡＨＡＳ酵素）；米国特許第４，９４０，８３５号および同第６，２４８，８７６号（グリホサート抵抗性をもたらす突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子）；米国特許第４，７６９，０６１号およびＡＴＣＣ受託番号３９２５６（ａｒｏＡ遺伝子）；グリホサートアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（グリホサート抵抗性）；ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリジクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含めたストレプトマイセス属（Streptomyces）種由来の他のホスホノ化合物、例えば、欧州特許出願第０２４２２４６号およびDeGreefら（1989）Bio/Technology 7:61（グリホサート抵抗性をもたらすグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）に記載のものなど；ピリジノキシプロピオン酸またはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノン（グリホサート抵抗性）；欧州特許出願第０３３３０３３号および米国特許第４，９７５，３７４号（Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性をもたらすグルタミン合成酵素遺伝子）；Marshallら（1992）Theor. Appl. Genet. 83:435（セトキシジムおよびハロキシホップなどのフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサノンに対する抵抗性をもたらすＡｃｃ１−Ｓ１遺伝子、Ａｃｃ１−Ｓ２遺伝子、およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子）；ＷＯ２００５０１２５１５（グリホサート抵抗性をもたらすＧＡＴ遺伝子）；ＷＯ２００５１０７４３７（２，４−Ｄ除草剤、ｆｏｐ除草剤およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子）；および光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンなど（ｐｓｂＡ遺伝子およびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）（例えば、Przibilaら（1991）Plant Cell 3:169（突然変異ｐｓｂＡ遺伝子）を参照されたい；ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列が米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子がＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１、および６７４４２の下で入手可能である；およびHayesら（1992）Biochem. J. 285:173（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））が挙げられる。

所望の種子構成成分の特性と組み合わせるために望ましい可能性がある形質のさらなる例としては、例えば、これらに限定することなく、付加価値形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子、例えば、脂肪酸代謝の改変（例えば、Knultzonら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624（植物のステアリン酸含有量を増加させるためのステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子）を参照されたい）；フィチン酸含有量の減少（例えば、Van Hartingsveldtら（1993）Gene 127:87（アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子がフィチン酸の分解を増強し、形質転換された植物体により多くの遊離リン酸を付加する）；およびRaboyら（1990）Maydica 35:383（低レベルのフィチン酸を有するトウモロコシ突然変異体に関与する対立遺伝子に付随するＤＮＡのクローニングおよび再導入）を参照されたい）；および、例えば、デンプンの分岐パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物体を形質転換することによって影響を受ける改変された炭水化物組成（例えば、Shirozaら（1988）J. Bacteol. 170:810（連鎖球菌属（Streptococcus）突然変異フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子）；Steinmetzら（1985）Mol. Gen. Genet. 20:220（レバンスクラーゼ遺伝子）；Penら（1992）Bio/Technology 10:292（α−アミラーゼ）；Elliotら（1993）Plant Molec. Biol. 21:515（トマトインベルターゼ遺伝子）；Sogaardら（1993）J. Biol. Chem. 268:22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；およびFisherら（1993）Plant Physiol. 102:1045（トウモロコシ内胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい）が挙げられる。

本明細書で考察されている参考文献は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全てが、発明者らが先行発明に基づいてそのような開示に先立つ権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。

以下の実施例は、特許請求された発明のある特定の特徴および／または態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載されている特定の特徴または態様に限定するものと解釈されるべきではない。

強化キャノーラ粕（ＥＣＭ）および従来のキャノーラ粕の平均栄養組成および栄養価
２００９年から２０１２年の間にいくつかの分析試験および機能試験を行って、本発明のＥＣＭ系統および雑種の栄養組成および栄養価を評価した。栄養組成および栄養価に対する可能性のある加工の影響を考慮に入れるために、加工していない種子全体、部分的に加工した粕および完全に加工した粕に対して試験を行った。イリノイ大学、ミズーリ大学、ジョージア大学およびマニトバ大学において試料を分析した。この組成の情報を用いて、強化キャノーラ粕と従来のキャノーラ粕とについて、標準の予測方程式を用いてエネルギー価を推定した。家禽のエネルギーおよびアミノ酸消化率についての試料の生物学的評価をイリノイ大学およびジョージア大学において行った。ブタのエネルギーおよびアミノ酸消化率についての試料の生物学的評価をイリノイ大学において行った。ＥＣＭ系統（範囲または平均）と従来のキャノーラ粕との間の栄養組成の差異の概要が表１に示されている。関連性のある手順および試験の詳細が次の実施例に概略されている。

ＥＣＭ系統は、栄養組成においていくつかの明確な改善を示し、これは動物の給餌における価値をもたらす。表１に例示されているように、ＥＣＭは、従来のキャノーラ粕よりもタンパク質がおよそ７％ポイント高い。さらに、必須アミノ酸の平衡（タンパク質の百分率として）が高タンパク質レベルにおいて維持される。家禽およびブタによるＥＣＭにおけるアミノ酸の消化率は、少なくとも従来のキャノーラ粕の場合と同様に優良であり、重要なアミノ酸であるリシンは、わずかに高い消化率を有すると思われる。ＥＣＭ系統は、より低いレベルの、細胞壁および外皮において見いだされる繊維構成成分、詳細には、およそ２％ポイント低いレベルのリグニン／ポリフェノール、１％ポイント低いセルロース、３％ポイント低いＡＤＦ残留物（３％ポイント）、および５％ポイント低いＡＤＦレベルを示した。

高レベルのタンパク質および低レベルの繊維構成成分は、ＥＣＭ系統における生物学的エネルギーのおよそ１０％の上昇と相関する。これらの系統は、動物飼料に添加するには費用のかかる栄養分であるリンも高レベルで示した。タンパク質（アミノ酸）、エネルギーおよびリンが多いことは、ブロイラーおよび食用ブタの成長飼料の機会価格の増加に反映される通り、ブタおよび家禽の飼料におけるキャノーラ粕についての価値（＄／ｔ）がおよそ２０〜３２％上昇することと相関する。表１。

ＰＯＳ白色フレーク（ＷＦ）、ＬＴおよびＨＴ粕の加工
ＥＣＭ種子および従来のキャノーラ種子を、カナダ、サスカトゥーンにあるＰＯＳパイロットプラントにおいて、以下の手順に従って加工した：

材料
２０１１年８月２日、ＰＯＳにおいて、およそ１．５ＭＴのＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）キャノーラ種子を受け取った。２０１１年８月３日、ＰＯＳにおいておよそ３．０ＭＴの商品対照キャノーラ種子を受け取った。主要な材料の供給源は以下の通りである。
ヘキサン／イソヘキサン：Ｕｎｉｖａｒ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＳＫ
Ｈｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｉｄ： Ｍａｎｖｉｌｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ
窒素：Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＳＫ
濾過布、モノフィラメント：Ｐｏｒｒｉｔｔｓ ａｎｄ Ｓｐｅｎｓｏｒ、Ｐｏｉｎｔｅ Ｃｌａｉｒｅ、ＰＱ
濾紙、５５ｌｂ ｔａｎ ｓｔｙｌｅ １１３８−５５：Ｐｏｒｒｉｔｔｓ ａｎｄ Ｓｐｅｎｓｏｒ、Ｐｏｉｎｔｅ Ｃｌａｉｒｅ、ＰＱ

方法−パイロットプラント加工
各キャノーラ品種の間に、「主要な」加工プラント内の全ての装置を電気掃除機で掃除した、または掃き掃除した。引火性の抽出器は試験間で活動停止させなかった。しかし、抽出器系統、Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎおよび溶媒回収系は、キャノーラ品種間で装置が空になるまで運転し続けた。真空は運転停止せず、したがって、全ての蒸気を凝縮器に抜き取り、凝縮し、溶媒加工槽に排出した。これにより、Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎ内で水が凝縮し、コンベアを塞ぐことを防いだ。キャノーラ試料を以下の順序で圧搾／抽出した。
１．対照ＨＴ
２．対照ＬＴ
３．ＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）ＬＴ

フレーク化
煮沸／予備圧搾のために、種子を、平滑なローラーの集合を通過させることによってフレーク化を行って、油細胞を破裂させ、表面積が大きい薄いフレークを調製する。フレークの厚さおよび水分を調整して、生じる微粒子の分量を最小限にする。微粒子レベルが高いことにより、溶媒浸出性が乏しい圧搾ケーキがもたらされる。

キャノーラ種子を、最小のロールギャップ設定を用いてフレーク化した。各ロットのフレークの厚さの範囲は以下の通りであった。
１．対照ＨＴ ０．２１〜０．２３ｍｍ
２．対照ＬＴ ０．１９〜０．２３ｍｍ
３．ＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）ＬＴ ０．２１〜０．２３ｍｍ

供給速度は圧搾の速度によって制御し、およそ１３３〜１５０ｋｇ／時間であった。

フレーカー：Ｌａｕｈｏｆｆ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造された直径１４”×幅２８”のＬａｕｈｏｆｆ Ｆｌａｋｍａｓｔｅｒ Ｆｌａｋｉｎｇ Ｍｉｌｌ Ｍｏｄｅｌ Ｓ−２８、製造番号７８０１。

煮沸（調節）
油細胞をさらに破裂させ、含有される油の粘度を低下させることによってフレークをしなやかにし、エキスペラーの効率を上昇させるために、煮沸を行う。煮沸は、種子中の酵素を不活化するためにも行う。クッカーを予熱してから各運転を開始した。運転している間、蒸気圧力を調整して所望のフレーク温度を維持した。

対照ＨＴロットについてのトレー内の温度は以下の通りであった。
上のトレー ６０±５℃
下のトレー ９７±３℃

対照ＬＴロットプラスＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）ＬＴロットについてのトレー内の温度は以下の通りであった。
上のトレー ６０±５℃
下のトレー ９３±２℃

クッカー：２トレー式Ｓｉｍｏｎ−Ｒｏｓｅｄｏｗｎクッカーを使用した。各区画は高さ３６ｃｍ（作用高さ２１ｃｍ）および直径９１ｃｍであり、材料を撹拌するためのスイーピングアームが備わっている。乾燥した熱のジャケットに蒸気を使用した。直接蒸気を容器の内容物に加えることもできる。直接供給のためにクッカーをスクリュープレスの上に載せた。

圧搾
圧搾により、油のおよそ２／３が取り出され、溶媒抽出のために適した圧搾ケーキが生じる。圧搾ケーキには、抽出器中で保持するための破砕抵抗性および良好な物質移動および排液のための多孔度が必要である。フレーク化し、煮沸した種子を、Ｓｉｍｏｎ−Ｒｏｓｅｄｏｗｎ予備圧搾を用いて圧搾した。

粗圧搾油を槽中に収集した。

予備圧搾：長いスクリュープレス９４ｃｍによるＳｉｍｏｎ−Ｒｏｓｅｄｏｗｎ直径９．５ｃｍ。操作スクリュースピード１７ｒｐｍを用いた。

溶媒抽出および脱溶媒（desolventization）
溶媒抽出は、圧搾ケーキをヘキサンと接触させて、ケーキ塊から油を取り出すことである。２つの機構で操作した。油を溶媒に浸出させること、および搾りかす（ヘキサン−固体）を、連続的に弱めたミセラ（ヘキサン−油）で洗浄すること。抽出は、通常は連続的な向流プロセスである。

キャノーラ対照ＨＴ圧搾ケーキを、総滞留時間およそ９０分間（ループインからループアウトまで）、溶媒固体比およそ２．５：１（ｗ：ｗ）およびミセラ温度５２±５℃を用いてイソヘキサン／ヘキサン抽出した（キャノーラ圧搾ケーキの供給速度は、９０分の保持時間でおよそ９０ｋｇ／時間であり、溶媒の流速は２２０±１０ｋｇ／時間であった）。

商品キャノーラ白色フレーク（ＷＦ）の試料を取り出した後に、脱溶媒し、風乾した。

粗油を、上昇性薄膜エバポレーターおよび蒸気ストリッパーにおいて脱溶媒（desolventize）した。
搾りかす（ヘキサン−固体）の脱溶媒を、蒸気ジャケット付きのＳｃｈｎｅｃｋｅｎスクリューおよび２トレー式脱溶媒機（desolventizer）−トースターにおいて行った。散布蒸気を上のＤＴトレーに加えた。トレー内の標的温度は以下の通りであった。
Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎの出口：＜６０℃
脱溶媒トレー：１０２±３℃
トースティングトレー：１０２±３℃

キャノーラ対照ＬＴおよびＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）ＬＴロット圧搾ケーキを、総滞留時間およそ１１０分間（ループインからループアウトまで）、溶媒固体比およそ２．５：１（ｗ：ｗ）およびミセラ温度５２±５℃を用いてイソヘキサン／ヘキサン抽出した。（キャノーラ圧搾ケーキの供給速度は１１０分の保持時間でおよそ８０ｋｇ／時間であり、溶媒の流速は２２０±１０ｋｇ／時間であった）。

ＥＣＭ試験系統白色フレーク（ＷＦ）の試料を取り出した後に脱溶媒し、風乾した。

粗油を、上昇性薄膜エバポレーターおよび蒸気ストリッパーにおいて脱溶媒した。

搾りかす（ヘキサン−固体）の脱溶媒を、蒸気ジャケット付きのＳｃｈｎｅｃｋｅｎスクリューおよび２トレー式脱溶媒機−トースターにおいて行った。散布蒸気を上のＤＴトレーに加えた。トレー内の標的温度は以下の通りであった。
Ｓｃｈｎｅｃｋｅｎの出口：＜６０℃
脱溶媒トレー：９３±２℃
トースティングトレー：９３±２℃

抽出器：全てステンレスのＣｒｏｗｎ Ｉｒｏｎ Ｗｏｒｋｓ Ｌｏｏｐ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（ＩＩ型）。抽出ベッドは長さ６８０ｃｍで幅２０．３ｃｍ×深さ１２．７ｃｍであった。さらに、このユニットは、上昇性薄膜エバポレーターおよび蒸気ストリッパーを使用したミセラの脱溶媒、および蒸気ジャケット付きのＳｃｈｎｅｃｋｅｎスクリューおよび２トレー式脱溶媒機−トースターを使用した搾りかす（固体プラス溶媒）の脱溶媒を含む。回収された溶媒を収集し、再利用した。

真空乾燥
真空乾燥を行って、脱脂ＬＴキャノーラ粕を＜１２％水分まで乾燥させた。

乾燥が必要であった唯一の脱脂キャノーラ粕ロットは対照ＬＴロットであった。およそ２２５ｋｇの脱脂粕をＬｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｄｒｙｅｒにローディングした。次いで、粕を、１０〜１５”ＨＧの真空下で７５±２℃まで加熱した。水分分析のための粕の試料採取を約６０℃から開始し、水分が＜１２％になるまで１５分ごとに行った。次いで、粕をバルク袋に放出した。上記の手順を、粕の全てが乾燥するまで繰り返した。
真空乾燥機：６００リットルのＭｏｄｅｌ ＦＫＭ６００−Ｄ（２Ｚ）Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｒｅａｃｔｏｒ、製造番号５１３２、Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｄａｙ、Ｆｌｏｒｅｎｃｅ、ＫＹ。

ハンマーミル
ハンマーミルを行って粒子サイズを均一にした。

乾燥した粕を、８／６４”ふるいを使用してハンマーミル処理した。ハンマーミルは、粕の各ロット間に電気掃除機で掃除した。粕を繊維ドラムで包装し、出荷するまで外界温度で保管した。

キャノーラ粕をハンマーミル処理した順序は以下の通りであった。
１．対照ＨＴ
２．ＥＣＭ試験系統（ＣＬ４４８６４）ＬＴ
３．対照ＬＴ
ハンマーミル：Ｐｒａｔｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｍｏｄｅｌ Ｇ５ＨＦＳＩ、製造番号５０７５、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ

インディアナポリスにおける白色フレーク加工
本発明のキャノーラ種子を、最初にBailey's Industrial Oil & Fat Products（1996）、第５版、第２章、Wiley Interscience Publication、New York、New Yorkに記載された手順を用いて加工して、キャノーラ白色フレークを作出することができる。

キャノーラ種子から油を抽出するために、最初に、キャノーラ種子をコーヒー粉砕によってフレーク化し、乾燥器中で少なくとも２０分間、８５℃±１０℃まで加熱処理する。加熱処理した後、粉砕された種子を、Ｔａｂｙ Ｐｒｅｓｓ ｔｙｐｅ−２０Ａ Ｐｒｅｓｓ（Ｔａｂｙ Ｓｋｅｐｐｓｔａ、Ｏｒｅｂｒｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて圧搾した。Ｔａｂｙ Ｐｒｅｓｓから得られた圧搾ケーキを溶媒抽出して、いかなる残留油も取り出す。

次いで、油糧種子の圧搾ステップ由来の圧搾ケーキを溶媒抽出して、いかなる残油も取り出し、収集する。圧搾ケーキを、ＬａＳａｌｌｅ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ（Ｇｕｅｌｐｈ、ＯＮ）に特別注文したＳｏｘｈｌｅｔ（商標）抽出器に入れたステンレススチールのシンブル中に入れる。抽出溶媒としてヘキサンを使用することができ、Ｓｏｘｈｌｅｔ（商標）抽出器系を９〜１０時間にわたって作動させることができる。次いで、溶媒抽出した圧搾ケーキをシンブルから取り出し、ケーキの厚さが１インチ未満になるようにトレー全体に拡散させる。溶媒抽出したケーキを、破砕する前に２４時間、空気で脱溶媒させる。次いで、脱溶媒した白色フレークを、例えば、Ｒｏｂｏｔ Ｃｏｕｐｅ Ｒ２Ｎ Ｕｌｔｒａ Ｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＭＳ）を使用して破砕する。

試料分析
ＥＣＭ試料および従来のキャノーラ試料の化学分析および栄養分析は、下に概説されている方法を用いて多様に実施することができる。キャノーラ粕試料を乾物（方法９３０．１５、ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２００７年。Official Methods. Of Analysis of AOAC Int.、第１８版、改訂第２版W. HortwitzおよびG. W. Latimer Jr.編 Assoc. Off. Anal. Chem. Int.、Gaithersburg. MD.（以下「ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．、２００７年」））、灰分（方法９４２．０５、ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．）、およびＧＥについて、ボンベ比色計（Ｍｏｄｅｌ ６３００、Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｌｉｎｅ、ＩＬ）によって分析した。AOAC International（2007）Official Methods of Analysis of AOAC Int.、第１８版、改訂第２版、HortwitzおよびLatimer編Assoc. Off. Anal. Chem. Int.、Gaithersburg. MD。酸加水分解エーテル抽出物（ＡＥＥ）を、３ＮのＨＣｌ（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ）を使用して酸加水分解し、その後、石油エーテルを用いて粗脂肪を抽出すること（方法９５４．０２、ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．）によって、Ｓｏｘｔｅｃ２０５０自動分析機器（ＦＯＳＳ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）で決定した。Sanderson（1986）、「A new method of analysis of feeding stuffs for the determination of crude oils and fats」、77〜81頁、Recent Advances in Animal Nutrition、HaresignおよびCole編、Butterworths、London、U.K。粗タンパク質を、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ｒａｐｉｄ Ｎ−ｃｕｂｅタンパク質／窒素装置（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．、Ｍｔ．Ｌａｕｒｅｌ、ＮＪ）における燃焼（方法９９０．０３、ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．）によって測定し、アミノ酸を、方法９８２．３０Ｅ（Ａ、Ｂ、およびＣ）［ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．］に従って測定し、粗繊維を、方法９７８．１０（ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．）に従って測定し、ＡＤＦおよびリグニンを方法９７３．１８（ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．）に従って測定し、ＮＤＦをＨｏｌｓｔ（Holst、D. O. 1973.Holst filtration apparatus for Van Soest detergent fiber analysis. J. AOAC. 56:1352-1356）に従って測定した。糖プロファイル（グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、マルトース）は、Ｃｈｕｒｍｓ（Churms、1982、Carbohydrates in Handbook of Chromatography. ZweigおよびSherma編 CRC Press、Boca Raton、FL.）、ならびにKakehiおよびHonda（1989. Silyl ethers of carbohydrates.、43〜85頁、Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. C. J. BiermannおよびG. D. McGinnis編 CRC Press、Boca Raton、FL）に従った。オリゴ糖（ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース）をＣｈｕｒｍｓに従って分析し、ミネラル（Ｃａ、Ｐ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｎａ、Ｋ、Ｓ、Ｍｏ、Ｚｎ、Ｓｅ、Ｃｏ、Ｃｒ）をＩｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ−Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｏｓｃｏｐｙ（ＩＣＰ−ＯＥＳ）［方法９８５．０１（Ａ、Ｂ、およびＣ）；ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．］によって分析し、フィチン酸をEllisら（1977. Quantitative determination of phytate in the presence of high inorganic phosphate. Anal.Biochem. 77:536-539.）に従って分析した。

ＥＣＭインディアナポリス白色フレーク試料および従来のキャノーラ粕についてのベースラインの分析結果
調製したトーストしたＥＣＭおよび従来のキャノーラ粕のパイロットプラントの栄養組成。
いくつかのＥＣＭ系統（４４８６４、１２１４６０、１２１４６６、および６５６２０）を、インディアナポリスにあるＤｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓの実験室において、商業的なキャノーラ粕の加工と同様であるが、種子から油を溶媒抽出した後に脱溶媒／トースティングする最後のステップを伴わないプロセスを用いて加工した。このプロセスおよびその結果得られた試料を、「インディアナポリス白色フレーク」と称する。加工パラメータは実施例３において概説されている。これらのＥＣＭインディアナポリス白色フレーク試料を、イリノイ大学およびミズーリ大学において試験し、その結果が表２ａ、２ｂ、および２ｃに示されている。キャノーラ粕対照は、商業的に調製されたキャノーラ粕であり、トーストされている。値は、乾物ベースであるが、油を含んで表されている。

イリノイ大学およびミズーリ大学からのＥＣＭインディアナポリス白色フレーク試料に関する分析結果は、マニトバ大学の全種子に関する結果と同様であった。試料４４８６４（２０１０年）では、２０１１年に生長させた４４８６４を含めた他のＥＣＭ試料よりもオリゴ糖が少なく、単糖が多かった。２０１０年の試料については、生長している植物体が、収穫時付近において一部のスクロースおよびオリゴ糖を単糖に異化したものと思われる。

インディアナポリス白色フレークプロトコールを用いて、ＥＣＭ系統において従来のキャノーラ粕と比較して高タンパク質、低ＡＤＦおよび低リグニン＆ポリフェノールが見られたことは、全種子を用いて見られた結果と同様である。商業的な粕についての３３％のＮＤＦの値は、典型的な範囲の上限にある。

全種子を用いた場合と同様に、表２ｂの結果は、アミノ酸組成（粗タンパク質に対する百分率として）がＥＣＭインディアナポリス白色フレーク試料と商業的なキャノーラ粕のどちらでも同様であることを示している。これは、ＥＣＭ系統中のタンパク質が増加すると、比例して重要なアミノ酸が増加したことを示している。

ＥＣＭインディアナポリス白色フレーク試料のミネラル含有量は、従来のキャノーラ粕と同様であるが、２つの例外、リンおよびナトリウムを伴う。マニトバ大学の全種子に対する結果の場合と同様に、ＥＣＭ系統中のリンは、従来のキャノーラ粕よりも一貫して高いと思われる。従来のキャノーラ粕中の余分のナトリウムは、おそらく従来のキャノーラ加工の間に添加されたナトリウムに起因する。

商業的な加工をシミュレートするための、カナダのサスカトゥーンにあるＰＯＳパイロットプラントにおけるＥＣＭの加工
動物飼料評価のためのＥＣＭの調製において、栄養価に対する加工の影響を考慮すると、キャノーラ粕試料を商業的な加工条件下で調製するべきであることが決定された。したがって、サスカトゥーンにあるＰＯＳパイロットプラントにおいて試料を加工した。加工条件が栄養価に対する最重要な影響を及ぼさなかったことを確実にするために、２つの加工条件を用いた：脱溶媒機／トースター内の通例の温度（ＨＴ）およびそれよりも低い温度（ＬＴ）。ＰＯＳにおいて用いた加工条件は実施例２において概説されている。

試験的に加工した粕は、全種子およびインディアナポリス白色フレーク試料と同様の組成を示し、また、ＥＣＭ試料と従来のキャノーラとの間の差異は、表２ａおよび２ｂに記載の分析と一致する。タンパク質が７％ポイント高く、ＡＤＦが５％ポイント低く、リグニン＆ポリフェノールが４％ポイント低く、リンが０．３５％ポイント高い。

加工していないＥＣＭおよび従来のキャノーラ種子の完全な分析
加工していないキャノーラ種子の栄養組成。２０１０年および２０１１年に生産されたＥＣＭ系統の全種子試料５つを、マニトバ大学において分析した。これらを、定義によれば、当該季節にカナダ西部において生長した現行の商業的なキャノーラ品種の平均品質である、２０１１年生産についてのｏｆｆｉｃｉａｌ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｇｒａｉｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＣＧＣ）複合種子試料と比較した。栄養組成の結果は、油を含まない乾物ベースで表され、表４ａおよび４ｂに示されている。

結果は、ＥＣＭと従来のキャノーラの間の最大の差異が、タンパク質含有量が多いことであることを示している。ＥＣＭは、タンパク質含有量が、油を含まない乾物ベースで７．２％ポイント高く（５１．１％対４３．９％）、３％油、８８％乾物ベースで６．１％ポイント高い（４３．５％対３７．４％）（商業的なキャノーラ粕については典型的な規格書ベース）。表４ａ、４ｂを参照されたい。タンパク質が多いことは、ＥＣＭではリグニンおよびポリフェノールが２％低いこと、およびＡＤＦ残留物（ＡＤＦ−リグニン／ポリフェノール−セルロース）が３％低いことによって説明されると思われる。ＡＤＦ残留物は、糖タンパク質とヘミセルロース構成成分の組み合わせであると思われる。繊維構成成分は、主に細胞壁および外皮に見いだされる。ＥＣＭのリン含有量は、従来のキャノーラのリン含有量よりもほぼ３０％高く、フィチン酸型と非フィチン酸型の間で一様に分布していると思われる。リンは、動物飼料における有益な栄養分であり、フィチン酸と結合したリンは家禽およびブタではよく消化されないが、動物飼料にフィターゼ酵素を一般的に使用することにより、このリンを動物が利用することが可能になる。表４ｂは全種子試料のアミノ酸組成中の同様の比較を提供する。

表４ｂの結果は、アミノ酸組成（粗タンパク質に対する百分率として）が、ＥＣＭと商業的なキャノーラ粕との間で同様であることを示している。これはＥＣＭ系統におけるタンパク質が増加するにつれ、重要なアミノ酸も増加したことを示している。

家禽のＴＭＥおよびアミノ酸消化率
真の代謝エネルギー（ＴＭＥ）および真の利用可能なアミノ酸（ＴＡＡＡ）アッセイは、それぞれ１９７６年および１９８１年に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｎａｄａ ｉｎ ＯｔｔａｗａのＤｒ．Ｉａｎ Ｓｉｂｂａｌｄによって開発された。このアッセイの性質は直接かつ非破壊的であるので、このアッセイは、米国を含めた世界の大半で、家禽飼料成分におけるエネルギーおよびアミノ酸の利用可能性を決定するために選択される方法になった。

成熟した単冠白色レグホン種（ＳＣＷＬ）の若雄鶏を、イリノイ大学およびジョージア大学において行った別々の試験において選択実験動物として用いた。鳥類は急速な消化管クリアランス時間を有することが周知である。２４時間にわたって給餌を行わないことにより、試験対象の消化管が以前に摂取した食物残留物を含まないことが確実に仮定される。

各トリ（一般に、処置当たり８個体）に、試験飼料３５グラムを、挿管を介してそ嚢に直接置くことによって精密に給餌した。繊維が多い成分は通常、３５グラムではなく、空間体積が同様の２５グラムを給餌する。挿管後、トリは水を利用できるが、追加的な飼料は４０時間にわたって利用できず、その間、排泄物を定量的に収集する。収集後、排泄物を強制風乾器中、通常８０℃で乾燥させる。その後、ＴＭＥアッセイにおいて総エネルギー（ＧＥ）を決定するために、またはアミノ酸含有量を決定するために、秤量し、粉砕する。成分のＧＥおよびアミノ酸組成を同様に決定する。秤量したら、排泄物試料を、一般に、単回のＧＥまたはアミノ酸の決定のためにプールし、ホモジナイズする。トリ当たりの排泄物の質量は、特定の排泄物のＧＥまたはアミノ酸組成よりもはるかに変動する。この知見、およびＧＥおよびアミノ酸の決定の費用および時間の遅れにより、プールすることが正当化される。

消化率を、当技術分野で周知の方法を用いて、エネルギーについて、または各アミノ酸について個別に算出する。ＧＥおよびアミノ酸の内在性の損失の推定値を使用して、実験アーチファクトに関して補正する。

ブタの可消化エネルギー（ＤＥ）、代謝エネルギー（ＭＥ）
ＤＥおよびＭＥ。成長中の去勢ブタ（最初のＢＷ、２０ｋｇ）４８匹を、イリノイ大学における完全乱塊（randomized complete block）計画試験に分配する。ブタを、６種の食餌のうちの１つに、食餌当たりブタ８匹の反復に割り当てる。ブタを、給餌器およびニップルドリンカー、完全スラット床、仕切り床、および尿トレーを備えた代謝ケージに入れる。これにより、各ブタから、尿および糞便材料の全てを別々に収集することが可能になる。

ブタ当たりに毎日提供される飼料の分量は、各反復における最小のブタについてエネルギーを維持するための推定必要量（すなわち、ｋｇ^０．７５当たりＭＥ１０６ｋｃａｌ；ＮＲＣ、１９９８年）の３倍として算出し、同等の二食に分ける。NRC 1998、Nutrient requirements of swine、改訂第１０版. National Academy Press. Washington、DC。水はいつでも利用可能にする。実験を１４日間続ける。最初の５日間は食餌への適応期間と考え、続く５日間にわたって、尿および糞便材料を、マーカー・マーカー手法（marker to marker approach）を用い、標準の手順に従って収集する（Adeola、O. 2001、Digestion and balance techniques in pigs、903〜916頁、Swine Nutrition. 第2版、A. J. LewisおよびL. L. Southern編、CRC Press、New York、NY。NRC. 1998. Nutrient Requirements of Swine. 改訂第１０版、Natl. Acad. Press、Washington DC.）。尿試料を尿バケツ中に、保存料の塩酸５０ｍＬの上に収集する。糞便試料および収集した尿の１０％を、収集後すぐに−２０℃で保管する。実験の終わりに、尿試料を解凍し、動物および食餌と合わせ、化学分析のために小口試料を取る。

糞便試料を強制風乾器内で乾燥させ、細かく粉砕した後に分析する。糞便試料、尿試料、および飼料試料を、ＤＭおよび総エネルギーについて、ボンベ熱量計（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｌｉｎｅ、ＩＬ）を使用して２連で分析する。化学分析した後、上記の手順を用いて、各食餌中のエネルギーについて全消化管の消化率の値を算出する（Widmer, M. R.、L. M. McGinnis、およびH. H. Stein. 2007。Energy, phosphorus, and amino acid digestibility of high-protein distillers dried grains and corn germ fed to growing pigs. J. Anim. Sci. 85:2994-3003.）。糞便中および尿中に失われたエネルギーの量をそれぞれ算出し、２４の食餌のそれぞれのＤＥおよびＭＥの分量を算出する（Widmerら、2007）。トウモロコシ中のＤＥおよびＭＥを、トウモロコシ食餌についてのＤＥ値およびＭＥ値をこの食餌へのトウモロコシの包含率で割ることによって算出する。次いで、これらの値を用いて、トウモロコシ−キャノーラ粕食餌およびトウモロコシ−ダイズ粕食餌におけるトウモロコシからＤＥおよびＭＥへの寄与を算出し、次いで、キャノーラ粕の各供給源中、およびダイズ粕試料中のＤＥおよびＭＥを、以前に記載されている通り、差によって算出する（Widmerら、2007）。

データを、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）のＰｒｏｃ Ｍｉｘｅｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して解析する。各食餌について、および各成分について得られたデータを、ＡＮＯＶＡを用いて比較する。分散の均一性を、Ｐｒｏｃ ＭｉｘｅｄのＵＮＩＶＡＲＩＡＴＥ手順を用いて確認する。食餌または成分が固定効果になり、ブタおよび反復実験が変量効果になる。最小二乗平均を、ＬＳＤ試験を用いて算出し、平均をＰｒｏｃ Ｍｉｘｅｄのｐｄｉｆｆ ｓｔａｔｅｍｅｎｔを用いて分離する。ブタは、全ての算出について実験単位になり、平均間の有意性を評価するためにアルファレベル０．０５を用いる。

ブタのアミノ酸消化率（ＡＩＤ＆ＳＩＤ）
イリノイ大学における試験でブタのＡＩＤおよびＳＩＤを分析した。成長している去勢ブタ１２匹（最初のＢＷ：３４．０±１．４１ｋｇ）の遠位回腸付近にＴ−カニューレを装着し、各方格に食餌６種および期間６種を用いた反復６×６ラテン方格計画に割り当てた。ブタを環境制御した部屋の中の１．２×１．５ｍの囲いに個別に収容した。囲いには頑丈な羽目板、完全なスラット床があり、囲いのそれぞれに給餌器およびニップルドリンカーを設置した。

６種の食餌を調製した。５種の食餌は、コーンスターチ、糖、およびＳＢＭまたはキャノーラ粕に基づき、ＳＢＭまたはキャノーラ粕がこれらの食餌中のＡＡの唯一の供給源であった。最後の食餌はＮを含まない食餌であり、基底の回腸のＣＰおよびＡＡの内在性の損失を推定するために使用した。全ての食餌に、ブタが成長するための現行の必要量の推定値（ＮＲＣ、１９９８）に適うまたはそれを超えるようにビタミンおよびミネラルを含めた。全ての食餌が、消化されにくいマーカーとして０．４％の酸化クロムも含有した。

各期間の開始時および終了時にブタの体重を記録し、毎日供給した飼料の量も記録した。全てのブタに毎日の維持エネルギー必要量の２．５倍のレベルを給餌し、実験全体を通して水はいつでも利用可能であった。各期間の最初の５日間は食餌への適応期間とみなした。６日目および７日目に、８時間にわたって、標準の手順を用いて回腸の消化物試料を採取した。結束バンドを用いてカニューレバレルにプラスチック袋を取り付け、袋に流れ込む消化物を採取した。袋が消化物で満たされたとき、または少なくとも３０分ごとに袋を取り出し、消化物中のアミノ酸が細菌によって消化されることを防ぐために、すぐに−２０℃で凍結させた。１回の実験期間が完了したら、動物に一晩および翌朝飼料を与えず、新しい実験食餌を提供した。

実験の終わりに、回腸試料を解凍し、動物および食餌の中にプールし、化学分析のための副試料を採取した。各食餌の試料およびキャノーラ粕およびＳＢＭ試料のそれぞれの試料を同様に採取した。消化物試料は化学分析前に凍結乾燥し、細かく粉砕した。食餌および消化物の全ての試料を、ＤＭ、クロム、粗タンパク質、およびアミノ酸について分析し、キャノーラ粕およびＳＢＭを、粗タンパク質およびアミノ酸について分析した。

各食餌中のアミノ酸の見かけの回腸消化率（ＡＩＤ）の値を、方程式［１］：
ＡＩＤ、（％）＝［１−（ＡＡｄ／ＡＡｆ）×（Ｃｒｆ／Ｃｒｄ）］×１００［１］
（式中、ＡＩＤはあるアミノ酸の見かけの回腸消化率の値（％）であり、ＡＡｄは回腸の消化物ＤＭ中のそのアミノ酸の濃度であり、ＡＡｆは飼料ＤＭ中のそのアミノ酸の濃度であり、Ｃｒｆは飼料ＤＭ中のクロムの濃度であり、Ｃｒｄは回腸の消化物ＤＭ中のクロムの濃度である）を用いて算出した。ＣＰのＡＩＤもこの方程式を用いて算出する。

各アミノ酸の遠位回腸への基底の内在性の流れを、Ｎを含まない食餌を給餌した後に得られる流れに基づいて、方程式［２］：
ＩＡＡ_ｅｎｄ＝ＡＡｄ×（Ｃｒｆ／Ｃｒｄ）［２］
（式中、ＩＡＡ_ｅｎｄはアミノ酸の基底の内在性の損失（ＤＭＩ １ｋｇ当たりのｍｇ数））を用いて決定した。同じ方程式を用いてＣＰ基底の内在性の損失を決定する。

ＡＩＤを各アミノ酸のＩＡＡ_ｅｎｄについて補正することによって、標準化された回腸のアミノ酸消化率の値を、方程式［３］：
ＳＩＤ、（％）＝ＡＩＤ＋［（ＩＡＡ_ｅｎｄ／ＡＡ_ｆ）×１００］［３］
（式中、ＳＩＤは標準化された回腸消化率の値（％）である）を用いて算出した。

データを、ＳＡＳ（ＳＡＳ ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）のＰｒｏｃ ＧＬＭ手順を使用して解析した。キャノーラ粕またはＳＢＭを含有する５種の食餌を、キャノーラ粕の供給源、ブタ、および期間を主効果として用いたＡＮＯＶＡを使用して比較した。ＬＳＤ検定を用いて、平均値を分離した。アルファレベル０．０５を使用して平均値間の有意性を評価した。全ての解析について個々のブタが実験単位であった。

牛乳のアミノ酸分解性
ＥＣＭのアミノ酸分解性を、第一胃にカニューレを挿入した乳牛などの動物においてＥＣＭ粕の試料をｉｎ−ｓｉｔｕでインキュベートすることによって評価して、可溶性の分解できるタンパク質含有量を推定し、分解できる画分の分解の速度（Ｋｄ）を決定する。

ウシに、２８．１％のトウモロコシサイレージ、１３．０％のアルファルファサイレージ、７．４％のアルファルファ乾草、２０．４％の粉砕トウモロコシ、１４．８％の乾燥させていないビール粕、５．６％の全綿実、３．７％のダイズ外皮、および７．０％の栄養補助剤（タンパク質、ミネラル、ビタミン）を含有する完全混合飼料（ＴＭＲ）として混合食餌を給餌する。ダイズ粕（ＳＢＭ）、従来のキャノーラ粕（ＣＭ）、または強化キャノーラ粕（ＥＣＭ）の乾物（ＤＭ）およそ６ｇを含有する標準のポリエステルのｉｎ ｓｉｔｕ袋（Ｒ５１０、５ｃｍ×１０ｃｍ、孔サイズ５０ミクロン）を第一胃において０時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、４０時間、４８時間、および６４時間インキュベートする。各時点で２連の袋を取り出し、流出物がきれいになるまで水道水で洗浄する。袋を５５℃で３日間乾燥させ、次いで残渣を取り出し、秤量して、乾物（ＤＭ）の消失を決定する。残渣をＮ含有量について、Ｌｅｃｏの燃焼方法を用いて分析する。ゼロ時間の試料は第一胃においてインキュベートしないが、第一胃でインキュベートした試料と同じ様に洗浄し、加工した。

ゼロ時間の残渣および第一胃で１６時間インキュベートした後に残っている残渣の試料を、一般成分（ＤＭ、粗脂肪、粗繊維、および灰分）およびアミノ酸（ＡＡ）組成（トリプトファンなし）について分析する。これらのパラメータを、乳牛の栄養必要量に関するＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（２００１）ガイドラインにおいて用いられている通り使用して、第一胃において分解できるタンパク質（ＲＤＰ）および第一胃において分解できないタンパク質（ＲＵＰ）の推定値を生成することができる。

各時点で残っている元の試料Ｎの百分率を算出し、ウシの各時点の反復値を平均することができる。ウシ３匹からの値を、OrskovおよびMcDonald（1979）に記載されている非線形方程式に当てはめる。この手法では、反芻胃のＣＰ消失は、方程式、ＣＰ消失＝Ａ＋Ｂ×（１−ｅ^-Ｋｄ×ｔ）（式中、Ａは可溶性ＣＰ画分（ＣＰに対する％）であり、Ｂは潜在的に分解できるＣＰ画分（ＣＰに対する％）であり、Ｋｄは分解速度定数（ｈ^−１）であり、ｔは反芻胃のインキュベート時間（ｈ）である）によって定義される一次カイネティクスに従うと仮定する。画分Ｃ（第一胃において分解できない）は、画分Ａ引く画分Ｂとして算出する。方程式は、ＳＡＳのＰＲＯＣ ＮＬＩＮ （バージョン９．２、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、Ｍａｒｑｕａｒｄｔ算出方法を用いて当てはめる。

ＲＤＰおよびＲＵＰの値（ＣＰに対する百分率）を計算するための方程式は、ＲＤＰ＝Ａ＋Ｂ［Ｋｄ／（Ｋｄ＋Ｋｐ）］、およびＲＵＰ＝Ｂ［Ｋｐ／（Ｋｄ＋Ｋｐ）］＋Ｃであり、Ｋｐは第一胃からの通過の速度である。通過速度は、これらのデータから直接算出することができないので（基質が第一胃に含有され、下路への通過が妨げられている）、Ｋｐ速度を仮定しなければならない。この試験では、典型的な乳汁分泌食を消費している高生産性乳牛についてのＮＲＣ（２００１）における方程式に従って算出される値と同様である、０．０７の値をＫｐとして使用する。このプロジェクトの目的は、同じ条件下でのタンパク質供給源および第一胃の分解性の推定値を比較することであるので、ＲＤＰおよびＲＵＰを決定するための通過速度の選択は任意である。

各試料についての最後の方程式を、ＮＲＣ（２００１）の推奨に従って、０時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、および４８時間インキュベートした試料を用いて作成する。この試験における追加的なインキュベート時点（すなわち、１２時間、２０時間、３２時間、４０時間、および６４時間）についてのデータを使用して、系のカイネティクスを検証することおよびＮＲＣ（２００１）仕様書における仮定に合致する改変されたキャノーラ粕を確実にすることができる。

イリノイ大学、ミズーリ大学およびマニトバ大学からの分析結果に基づいて実際のＴＭＥと予測ＴＭＥを比較することを含めた家禽のＴＭＥおよびＴＡＡＡ。
家禽の真の代謝エネルギー（ＴＭＥ）評価を、ＥＣＭ試料に対して、イリノイ大学およびジョージア大学の両方で行った。プロトコールは実施例８に記載されている。

ＰＯＳで調製したＥＣＭおよびキャノーラ粕試料の場合では、加工の影響を排除するために、２つのＬＴ粕間で比較することが適切である。結果はイリノイ大学での試験とジョージア大学での試験のどちらも同程度であった。家禽のＴＭＥは、従来のキャノーラ粕よりも（ＬＴ）ＥＣＭ（ＬＴ）について有意に高い−イリノイ大学での試験では９％高く、ジョージア大学での試験では１４％高い。これらの結果により、下の表４の予測方程式の結果が確認される。ＥＣＭおよび従来のキャノーラ粕の白色フレーク試料もＰＯＳにおいて、溶媒抽出段階のすぐ後、ＤＴ段階の前に取得した。これらのＷＦ粕についての家禽のＴＭＥを、ジョージア大学における別々の試験で比較し、ＬＴ試料を用いた場合と同様に、ＥＣＭ ＷＦは従来のキャノーラ粕ＷＦよりも有意に高いＴＭＥを有した。
表４。

４品種のＥＣＭを、インディアナポリスのＤｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて、実施例３に記載の白色フレーク加工方法を用いてそれぞれ独立に加工した。次いで、これらの試料を、２つの大学において家禽のＴＭＥ分析に供した。試験したＥＣＭ系統間でＴＭＥに有意差はなかったが、例外として、１２１４６０系統は１２１４６６系統または６５６２０系統よりも低いＴＭＥを有すると思われた。

これらの試験から観察されたＴＭＥ値は、以下の予測代謝エネルギー含有量と一致した。The National Research Council Nutrient Requirements of Poultry（NRC、1984、Nutrient requirements of poultry.、改訂第９版、National Academy Press. Washington、DC））は、キャノーラ粕（ダブルゼロナタネ粕）におけるＭＥについての予測方程式を有する。
ＭＥ ｋｃａｌ／ｋｇ＝（３２．７６×ＣＰ％）＋（６４．９６×ＥＥ％）＋（１３．２４×ＮＦＥ％）

算出により、７％高いＣＰは７％低いＮＦＥによって相殺され、したがって、ＣＰについての正味の係数は：３２．７６−１３．２４＝１９．５２であるはずである。これにより、ＥＣＭ中のＭＥがキャノーラ粕中のＭＥよりも１３７ｋｃａｌ／ｋｇ多くなる（７％×１９．５２＝１３７）。この方程式の問題は、ＮＦＥが糖およびデンプンのエネルギー価についての不十分な推定値であることである。

代替の方程式は、家禽ＭＥ（成体）についてのＥＥＣ予測方程式である（Fisher, CおよびJ.M. McNab. 1987. Techniques for determining the ME content of poultry feed.、HaresignおよびD.J.A. Cole（編）、Recent Advances in Animal Nutrition-1987. Butterworths、London. 3〜17頁）。
ＭＥ、ｋｃａｌ／ｋｇ＝（８１．９７×ＥＥ％）＋（３７．０５×ＣＰ％）＋（３９．８７×デンプン％）＋（３１．０８×糖％）

ＥＥＣ方程式は、キャノーラ粕中の消化できる栄養分、例えば、タンパク質、脂肪、デンプンおよび遊離の糖などに値を与える「正の寄与」方程式である。ＥＣＭとキャノーラ粕の間の分析的な差異はタンパク質のみであるので、係数３７．０５を使用して余分のエネルギーを算出することができる：
３７．０５×７％＝２５９ｋｃａｌ／ｋｇ。ＥＥＣ方程式は、一般にキャノーラ粕よりも消化率が高い完全な飼料について設計する。したがって、３７．０５係数は高すぎる。

代替の手法は、タンパク質のエネルギー価についての最初の原理を使用することである。大まかな推定値は、タンパク質１グラム当たり総エネルギー４カロリー×８０％のタンパク質消化率×５％の窒素排出損失＝１グラム当たりおよそ７５％の全体のカロリー（１グラム当たり代謝エネルギー３カロリーまたは３０×タンパク質％。これにより、３０×７％＝ＥＣＭ中の余分のＭＥ１ｋｇ当たり２１０ｋｃａｌの代謝エネルギーがもたらされる。

要約すると、ＥＣＭ粕は、家禽ＭＥが従来のキャノーラ粕よりも１４０〜２６０ｋｃａｌ／ｋｇ多くなることが予想される。１４０ｋｃａｌ／ｋｇの値は、かなり過小評価されている可能性があり、２６０ｋｃａｌ／ｋｇは高めであり得る。家禽ＭＥの２００〜２２０ｋｃａｌ／ｋｇの増加の可能性がある。これを「そのまま」ベースで表すと（表１）、商業的なＥＣＭの家禽ＭＥは、従来のキャノーラ粕の２０００ｋｃａｌ／ｋｇに対して、２２００ｋｃａｌ／ｋｇである可能性がある。これは、エネルギーの１０％の上昇である。

家禽の真のアミノ酸消化率（ＴＡＡＡ）も、イリノイ大学およびジョージア大学の両方で測定した。この場合、トーストしたキャノーラ粕に対して白色フレークのアミノ酸消化率がはるかに高いことは商業的に妥当でなはいと考えられたので、ＰＯＳで調製した粕試料のみを分析した。表６。

異なるキャノーラ粕試料間で家禽の真のアミノ酸利用率に統計的有意差はなかった。表６。

ブタのアミノ酸消化率（ＡＩＤおよびＳＩＤ）および予測ＮＥ
ブタの回腸アミノ酸消化率試験をイリノイ大学において行った。比較のためにＰＯＳパイロットプラントにおいて調製した粕を使用した。

ＥＣＭとキャノーラ粕試料との間で、タンパク質およびアミノ酸消化率におけるいくらかの統計的有意差が認められた。ＥＣＭでは粗タンパク質ＡＩＤがキャノーラ粕よりも高かったが、タンパク質ＳＩＤの差異は有意でなかった。ＡＩＤとＳＩＤの両方について、リシンは同じ加熱処理を受けた従来のキャノーラ粕中よりもＥＣＭ中にある方がよりよく消化可能である。表７。

ブタについて、ブタにおけるＤＥ、ＭＥ、およびＮＥを予測するために一般に認められている方程式は、EvaPig（2008、第1.0版. INRA、AFZ、Ajinomoto Eurolysine）およびNRC Nutrient Requirements of Swine（NRC、1998、Nutrient requirements of swine; 改訂第１０版; National Academy Press. Washington、DC）に概説されているＮｏｂｌｅｔの方程式である：
方程式１−４．ＤＥ、ｋｃａｌ／ｋｇ＝４１５１−（１２２×灰分％）＋（２３×ＣＰ％）＋（３８×ＥＥ％）−（６４×ＣＦ％）
方程式１−１４．ＮＥ、ｋｃａｌ／ｋｇ＝２７９０＋（４１．２２×ＥＥ％）＋（８．１×デンプン％）−（６６．５×灰分％）−（４７．２×ＡＤＦ％）

Ｎｏｂｌｅｔ方程式は正の寄与因子と負の寄与因子の両方のハイブリッドである：脂肪、タンパク質およびデンプンは正の係数を有するが、灰分、ＣＦおよびＡＤＦは負の係数を有する。この方程式では正味エネルギー（ＮＥ）についてタンパク質は使用しないが、ＥＣＭとキャノーラ粕との間の差異は、ＡＤＦの差異によって捕捉することができる。デンプンおよび灰分はＥＣＭとキャノーラ粕で同じであるので、重要な差異はＡＤＦである。ＡＤＦが５％ポイント低いことにより、ＥＣＭ中のＮＥが４７．２×５％＝２３６ｋｃａｌ／ｋｇ多くなる。この予測数は、家禽ＭＥ数と同様であり、したがって、重ねて、ＥＣＭについて、「そのまま」ベースで、ブタの正味エネルギー２００ｋｃａｌ／ｋｇの増加の可能性がある（表１）。これにより、エネルギーがおよそ１２％上昇するはずである。

追加的なＥＣＭ雑種
新規キャノーラ雑種ＣＬ１６６１０２Ｈも、強化粕（ＥＣＭ）の性質を示した。２０１１年の小規模プロット試験で収穫されたこの雑種の種子に関して測定された性能および品質形質は、油、粕タンパク質、ＡＤＦ、および総グルコシノレート（Ｔｇｌｕｃ）を含む。表８参照。

表８の結果により、この新規ＤＡＳ ＥＣＭ系統が、粕の属性に関して市販の品種よりも優れていることがはっきり示されている。

Claims (42)

1. キャノーラ種子に高タンパク質含有量および低ＡＤＦ含有量の形質を付与するキャノーラ生殖質であって、キャノーラ植物体が、少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を有する種子を生じるキャノーラ生殖質。
2. キャノーラ種子に、油を含まない乾燥質量ベースで少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量および約１８％以下の酸性デタージェント繊維のさらなる列を付与する、請求項１に記載のキャノーラ生殖質。
3. 請求項１に記載のキャノーラ生殖質を含むキャノーラ植物体。
4. 油を含まない乾燥質量ベースで決定された、平均で少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量および約１８％以下の酸性デタージェント繊維を有する種子を生じる、請求項３に記載のキャノーラ植物体。
5. 平均で２％未満のエルカ酸を有する種子を生じる、請求項３に記載のキャノーラ植物体。
6. 減少したポリフェノール含有量および増加したリン含有量からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な形質をさらに含む、請求項３に記載のキャノーラ植物体。
7. 平均で少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量をさらに含む、請求項３に記載のキャノーラ植物体。
8. 油を含まない乾燥質量ベースで決定された、平均で約１８％以下の酸性デタージェント繊維をさらに含む、請求項３に記載のキャノーラ植物体。
9. 前記種子が、油を含まない乾物ベースで決定された、１１％未満の酸性デタージェント繊維を有する、請求項３に記載の植物体。
10. 前記種子が少なくとも４３％の油を含む、請求項３に記載の植物体。
11. 前記種子が少なくとも４５％のタンパク質を含む、請求項３に記載の植物体。
12. 前記種子が、油を含まない乾物ベースで少なくとも４３％の油および少なくとも４４％のタンパク質を含む、請求項３に記載の植物体。
13. 請求項３に記載の植物体を含む圃場であって、植物体が、平均で１ヘクタール当たり少なくとも１７００キログラムの種子を生じる圃場。
14. ＣＬ０６５６２０、ＣＬ０４４８６４、ＣＬ１２１４６０Ｈ、ＣＬ１６６１０２Ｈ、およびＣＬ１２１４６６Ｈからなる群から選択される、請求項３に記載の植物体。
15. 遺伝子工学も突然変異誘発も用いずに作出された、請求項３に記載の植物体。
16. 種子の非栄養性構成成分が減少した、請求項３に記載の植物体。
17. 油を含まない乾物ベースで、１．３％超のリン含有量を含む種子を生じる、請求項３に記載の植物体。
18. 請求項３から１２および１４から１７に記載のキャノーラ植物体によって生じる種子。
19. 請求項１８に記載の種子から生長した後代植物体。
20. 平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）、および高タンパク質含有量および低ＡＤＦ含有量の形質を有する種子を生じる、請求項１９に記載の後代植物体。
21. 油を含まない乾物ベースで決定された、少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量および約１８％以下のＡＤＦを有する種子を生じる、請求項２０に記載の後代植物体。
22. 請求項１８に記載の種子の１つまたは複数から作出されたキャノーラ粕。
23. 平均の真の代謝エネルギーが少なくとも２４００ｋｃａｌ／ｋｇである、請求項２２に記載のキャノーラ粕。
24. 好都合なアミノ酸消化率プロファイルを有する、請求項２３に記載のキャノーラ粕。
25. ダイズ粕のアミノ酸消化率の少なくとも約９０％のアミノ酸消化率（１０％の含水量）を含む、請求項２２に記載のキャノーラ粕。
26. ダイズ粕の可消化エネルギー含有量または代謝エネルギー含有量の少なくとも約８０％の可消化エネルギー含有量または代謝エネルギー含有量を含む、請求項２２に記載のキャノーラ粕。
27. 高タンパク質含有量および低ＡＤＦ含有量の形質を有すること、ならびに平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を有することに関して遺伝的に安定であるキャノーラ種子。
28. 油を含まない乾物ベースで決定された、平均で少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量、および約１８％以下の酸性デタージェント繊維を有することに関して遺伝的に安定である、請求項２７に記載のキャノーラ種子。
29. 平均で少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量をさらに含む、請求項２７に記載のキャノーラ種子。
30. 平均で約１８％以下の酸性デタージェント繊維含有量をさらに含む、請求項２７に記載のキャノーラ種子。
31. 減少したポリフェノール含有量および増加したリン含有量からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な形質を含むことに関して遺伝的に安定である、請求項２７に記載のキャノーラ種子。
32. 請求項１８および２７から３１に記載の種子から作出されたキャノーラ粕。
33. キャノーラ栽培品種に、種皮色に関係なく、高タンパク質含有量、低ＡＤＦ含有量、少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）からなる群から選択される少なくとも１つの所望の形質を導入する方法であって、
    請求項２に記載の植物体と、第２の異なるキャノーラ栽培品種の植物体を交雑してＦ１後代植物を作出するステップと、
    所望の形質（複数可）を有する１つまたは複数の後代植物を選抜して、選抜された後代植物を作出するステップと、
    選抜された後代植物と、請求項２に記載の植物体を戻し交雑して、戻し交雑後代植物を作出するステップと、
    第２の異なるキャノーラ栽培品種の所望の形質（複数可）および生理的特性および形態学的特性を有する戻し交雑後代植物を選抜して、選抜された戻し交雑後代植物を作出するステップと、
    戻し交雑および選抜のステップを３回以上繰り返して、所望の形質（複数可）を含む、近交系の選抜された４代目以降の戻し交雑後代植物を作出するステップと
    を含む方法。
34. 所望の形質が、油を含まない乾物ベースで決定された、少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量および約１８％以下の酸性デタージェント繊維、ならびに平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を有する種子を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 請求項３３に記載の方法によって作出された植物体。
36. 請求項３から１２、１４から１７、または３５に記載の植物体から得た植物生産物。
37. 油を含まない乾物ベースで決定された、少なくとも約４５％の粗タンパク質含有量および約１８％以下の酸性デタージェント繊維、平均で少なくとも６８％のオレイン酸（Ｃ１８：１）および３％未満のリノレン酸（Ｃ１８：３）を含むキャノーラ種子から直接得ることができる強化キャノーラ粕。
38. 平均で少なくとも約４９％の粗タンパク質含有量をさらに含む、請求項３７に記載の強化キャノーラ粕。
39. 平均で約１８％以下の酸性デタージェント繊維含有量をさらに含む、請求項３７に記載の強化キャノーラ粕。
40. キャノーラ種子が、減少したポリフェノール含有量および増加したリン含有量からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な形質を含むことに関して遺伝的に安定である、請求項３７に記載の強化キャノーラ粕。
41. 前記キャノーラ種子が、低下したレベルの非栄養性因子をさらに含む、請求項３７に記載の強化キャノーラ粕。
42. 反芻動物、ブタ、または家禽の食餌中のタンパク質またはエネルギーの補給物として、他の異なる従来のキャノーラ粕またはダイズ粕に取って代ることができる、請求項３７に記載の強化キャノーラ粕。

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