KR20210000752A - 오메가-9 특성을 갖는 향상된 캐놀라박 영양가를 전달하는 종자 조성을 나타내는 캐놀라 생식질 - Google Patents

Abstract

캐놀라 생식질은 높은 단백질 함량 및 낮은 섬유 함량의 특성을 캐놀라 종자에 부여하고, 상기 캐놀라 식물은 평균 68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 갖는 종자를 생산한다. 상기 캐놀라 종자 특성에는 또한 오일-무함유 건조 질량 기준으로 45％ 이상의 조 단백질 및 18％ 이하의 산성 세제 불용성 섬유 함량이 포함될 수 있다. 특정 실시양태는 감소된 폴리페놀 함량 및 증가된 인 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 이러한 생식질을 포함하는 캐놀라 식물, 및 그로부터 생산된 식물 생산품 (예를 들어, 종자)에 관한 것이다. 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물은 캐놀라박에 대한 공급원으로서 특히 가치있게 만드는 유리한 종자 조성 성질을 나타낼 수 있다.

Description

오메가-9 특성을 갖는 향상된 캐놀라박 영양가를 전달하는 종자 조성을 나타내는 캐놀라 생식질{CANOLA GERMPLASM EXHIBITING SEED COMPOSITIONAL ATTRIBUTES THAT DELIVER ENHANCED CANOLA MEAL NUTRITIONAL VALUE HAVING OMEGA-9 TRAITS}

우선권

본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2011년 2월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/445,426호 ("오메가-9 특성을 갖는 향상된 캐놀라박 영양가를 전달하는 종자 조성을 나타내는 캐놀라 생식질")를 우선권으로 주장한다.

기술분야

본 발명은 캐놀라 생식질 및 재배종에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종피 색과는 독립적으로 변형된 박 조성 (예를 들어, 감소된 수준의 반영양소 인자 및 증가된 수준의 단백질)을 갖는 캐놀라 생식질에 관한 것이다. 특정 실시양태는 예를 들어 감소된 수준의 반영양소 인자 (예를 들어, 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 및 폴리페놀 화합물) 및 증가된 단백질 및 인 수준과 함께 어두운 종자 색을 나타내는 캐놀라 생식질에 관한 것이다.

배경기술

"캐놀라"는 최대 2 중량％의 에루스산 (C22:1) 함량 (종자의 총 지방산 함량 대비)을 갖고, (분쇄 후) 탈지박 (오일-무함유) 그램당 30 마이크로몰 (μmol) 미만의 글루코시놀레이트를 함유하는 공기-건조된 박을 제공하는 평지씨 (브라시카 종(Brassica spp.))이다. 이들 유형의 평지씨는 더욱 통상적인 다양한 종들에 비해 그들의 식용성으로 구별된다. 캐놀라유는 그의 낮은 수준의 포화 지방산으로 인해 우수한 식용 오일로 고려된다.

평지씨박은 비교적 단백질이 많지만, 그의 고 섬유 함량은 그의 소화율 및 동물 사료로서의 그의 가치를 감소시킨다. 대두박에 비해, 캐놀라 및 오일 종자 평지박은 보다 많은 양의 식이 섬유 및 적은 백분율의 단백질을 함유한다. 그의 높은 식이 섬유로 인해, 캐놀라박은 대두박에 비해 약 20％ 적은 대사 에너지 (ME)를 갖는다. 그 결과, 캐놀라박의 가치는 특히 돼지 및 가금류와 관련하여 대두박과 같은 다른 오일 종자박에 비해 낮게 머무르고 있다(문헌[Rakow (2004a) Canola meal quality improvement through the breeding of yellow-seeded varieties - an historical perspective, in AAFC Sustainable Production Systems Bulletin]). 추가로, 일부 캐놀라박에서 글루코시놀레이트의 존재는 또한 가축의 성장 및 번식에 대해 이들 화합물이 갖는 유해한 효과로 인해 그의 가치가 저하된다.

캐놀라 품종은 그들의 종피 색에 의해 부분적으로 구별된다. 종피 색은 일반적으로 황색 및 흑색 (또는 흑갈색)의 두 가지 주요 부류로 나누어진다. 이들 색의 다양한 색조, 예컨대 붉은빛 갈색 및 황색빛 갈색 또한 관찰된다. 밝은 종피 색을 갖는 캐놀라 품종은 얇은 외피를 가지며, 따라서 어두운 색의 종피를 갖는 품종에 비해 섬유는 더 적고 오일과 단백질은 더 많은 것으로 널리 관찰되었다(문헌[Stringam et al. (1974) Chemical and morphological characteristics associated with seed coat color in rapeseed, in Proceedings of the 4th International Rapeseed Congress, Giessen, Germany, pp. 99-108]; [Bell and Shires (1982) Can. J. Animal Science 62:557-65]; [Shirzadegan and Robbelen (1985) Gotingen Fette Seifen Anstrichmittel 87:235-7]; [Simbaya et al. (1995) J. Agr. Food Chem. 43:2062-6; Rakow (2004b) Yellow-seeded Brassica napus canola for the Canadian canola Industry, in AAFC Sustainable Production Systems Bulletin]). 이에 대한 한 가지 가능한 설명은, 캐놀라 식물이 종피 섬유 성분의 생산을 위해 에너지를 필요로 하지 않는 경우, 캐놀라 식물이 단백질 및 오일의 생산에 더 많은 에너지를 소모할 수 있다는 것이다. 황색 종자 캐놀라 계통은 또한 흑색 종자 캐놀라 계통에 비해 보다 낮은 글루코시놀레이트 함량을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Rakow et al. (1999b) Proc. 10th Int. Rapeseed Congress, Canberra, Australia, Sep. 26-29, 1999, Poster #9]). 따라서, 역사적으로 황색 종자 캐놀라 품종의 개발은 캐놀라박의 사료 가치를 증가시킬 수 있는 방법으로서 추구되었다(문헌[Bell (1995) Meal and by-product utilization in animal nutrition, in Brassica oilseeds, production and utilization. Eds. Kimber and McGregor, Cab International, Wallingford, Oxon, OX108DE, UK, pp. 301-37]; [Rakow (2004b), supra]; [Rakow ＆ Raney (2003)]).

비. 나푸스(B. napus) (예를 들어, 비. 라파(B. rapa) 및 비. 준세아(B. juncea))와 밀접한 관련이 있는 브라시카 종의 일부 황색 종자 형태는 그들의 종자 및 후속적인 박에서 보다 낮은 수준의 섬유를 갖는 것으로 확인되었다. 황색 종자 비. 나푸스 생식질의 개발은, 관련 브라시카 종으로부터 종자 색소를 조절하는 유전자의 통합을 통해 비. 나푸스에서 섬유가 감소될 수 있음을 증명하였다. 그러나, 관련 브라시카 종으로부터 오일 종자 브라시카 품종, 예컨대 캐놀라 품종으로의 종자 색소를 조절하는 유전자의 통합은, 다중 열성 대립 형질이 현재 유용한 황색 종자 계통에서 황색 종피의 유전과 관련이 있다는 사실 때문에 복잡하다. 더욱이, "포드 컬링(pod curling)" 또한 다른 브라시카 종, 예컨대 준세아 및 카리나타(carinata)로부터 황색 종피 색의 통합 동안에 흔히 직면하게 되는 문제이다.

어두운 색 종자 비. 나푸스 생식질 내부의 섬유에 대해 얼마나 많은 변이성이 있는지에 대한 정보는 거의 없으며, 감소된 수준의 반영양소 인자 (예를 들어 섬유 및 폴리페놀 성분) 및 증가된 수준의 단백질을 함유하도록 개발된 어두운 색 종자 캐놀라 계통에 대해 보고된 적은 없다.

발명의 개시내용

본원에는 영양가에 영향을 미치는 것으로 확인된 캐놀라박 조성 변화의 신규한 조합을 제공하는 생식질을 포함하는 캐놀라 (브라시카 나푸스) 방임 수분 재배종 (CL044864, CL065620) 및 잡종 (CL166102H, CL121460H 및 CL121466H)이 기재된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물은 예를 들어 종자 성분이 종피 색과는 독립적이도록 단백질, 섬유 및 인 수준의 신규한 조합을 갖는 종자를 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 식물은 표준 캐놀라 유형에 비해 높은 단백질 및 낮은 섬유, 뿐만 아니라 표준 캐놀라 유형에서의 인 수준과 유사하거나 그보다 높은 인 수준을 생산할 수 있다. 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 근교 계통 및 잡종은 일부 실시양태에서 사료 또는 식품 성분으로서 직접 사용될 때 및/또는 단백질 단리물 및 농축물의 가공을 위한 사료 스톡으로서 사용될 때 영양적으로 향상된 박 특성을 전달할 수 있다. 이러한 종자는 어두운 색 (예를 들어, 흑색, 암색 및 반점형) 또는 밝은 색일 수 있다.

따라서, 본원은 종자 색-독립적인 방식으로 목적하는 종자 성분 특성을 갖는 캐놀라 식물을 수득하기 위해 사용될 수 있는 브라시카 생식질을 기재한다. 일부 실시양태에서, 이러한 생식질을 포함하는 식물은 목적하는 영양 특성을 갖는 캐놀라박을 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 근교 캐놀라 계통 (및 그의 식물)이 제공된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 근교 캐놀라 식물을 갖는 잡종 캐놀라 계통 (및 그의 식물)이 제공된다. 본 발명의 캐놀라 품종에는 예를 들어 비제한적으로 CL044864; CL065620; CL166102H; CL121460H; 및 CL121466H가 포함된다.

본 발명의 특정 실시양태는 고 단백질 함량 및 저 섬유 함량의 특성을 캐놀라 종자에 부여하는 캐놀라 생식질을 포함하며, 여기서 상기 캐놀라 식물은 평균 68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 갖는 종자를 생산한다. 다른 실시양태에서, 캐놀라 식물은 캐놀라 생식질을 포함한다. 캐놀라 식물에 의해 생산되는 종자 또한 기재된다. 추가의 실시양태는 캐놀라 식물의 종자로부터 성장한 후대 식물을 포함한다. 종피 색-독립적인 방식으로 고 단백질 함량, 저 섬유 함량, 68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 목적하는 특성을 캐놀라 재배종에 도입하는 방법이 개시된다.

또한, 본원은 본 발명의 생식질을 포함하는 근교 캐놀라 식물 또는 잡종으로부터 수득된 식물 생산품을 기재한다. 특정 실시양태는 이러한 근교 캐놀라 식물 또는 잡종으로부터 수득된 캐놀라박 또는 종자를 포함한다.

또한, 캐놀라박의 영양가를 개선시키는 방법이 기재된다. 예를 들어, 종자 색-독립적인 방식으로 캐놀라박 조성 성질들의 조합을 브라시카 생식질에 이입시키는 방법이 기재된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질은 각각의 생식질에 의해 부여된 목적하는 성질을 가진 향상된 캐놀라박을 전달할 수 있는 황색 종피를 특징으로 하는 캐놀라 생식질과 조합될 수 있다.

상기 및 다른 특성은 첨부된 도면을 참고하여 하기 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 어두운 종피 색을 갖는 몇몇 캐놀라 품종의 사진을 포함한다.
도 2는 비. 나푸스 근교 계통 및 잡종의 종자 조성 분석으로부터의 데이터를 포함한다. 종자 샘플은 웨스턴 캐나다에서 복제 실험으로부터 얻은 것이었다. 종자 조성 데이터는 NIR에 기초하여 예측하였고, 후속적으로 참고 화학 방법을 이용하여 입증하였다.

발명의 실시 방식(들)

I. 몇몇 실시양태의 개요

캐놀라박은 오일 추출 공정 후에 남은 캐놀라 종자의 분획이다. 캐놀라박은 단백질의 공급원이며, 따라서 몇몇 적용, 예컨대 동물 사료 제형 및 고 가치 단백질 농축물 및 단리물의 단리에 이용된다. 상기 캐놀라박에 남게 되는 종피, 자엽 및 배아 내의 섬유는 단위 동물 종에서 캐놀라박의 함유율(inclusion rate)을 제한하며, 따라서 캐놀라박은 전형적으로 다른 공급원 (예를 들어, 대두)으로부터 제조되는 박과 동일한 영양가를 제공하지 않는다. 비. 나푸스 (예를 들어, 비. 라파 및 비. 준세아)와 밀접한 관련이 있는 종의 일부 황색 종자 형태는 그들의 종자 및 후속적인 박에서 보다 낮은 수준의 섬유를 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 관찰은 황색 종자-의존적인 방식으로 비. 나푸스에 저 종자 섬유 특성을 도입하려는 시도에 동기를 부여하였다. 생성된 황색 종자 비. 나푸스 생식질의 개발은 이 접근법을 통해 비. 나푸스에서 섬유가 감소될 수 있음을 증명하였다.

본 발명 이전에는, 어두운 색 종자 캐놀라 품종이 황색 종자 품종에서 관찰된 것만큼 낮은 종자 섬유 함량을 나타낼 것으로 생각되지 않았다. 또한, 향상된 캐놀라박 공급원을 제시하게 될, 감소된 수준의 반영양소 인자 (예를 들어, 섬유 및 폴리페놀 화합물) 및 증가된 수준의 단백질 및 인을 함유하는 어두운 색 종자 캐놀라 계통은 기재된 적이 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 캐놀라 생식질은 종피 색과는 독립적으로 발현되는 몇몇 주요 향상된 박 조성을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 종자로부터 제조된 캐놀라박은 예를 들어 돼지 및 가금류 먹이에서 보다 높은 먹이 함유율을 달성할 수 있다.

본 발명의 생식질을 이용하여 (예를 들어, 선택적 교배를 통해) 하나 이상의 추가의 원하는 특성 (예를 들어, 개선된 오일 조성, 증가된 오일 생산, 변형된 단백질 조성, 증가된 단백질 함량, 질환, 기생충 내성, 제초제 내성 등)이 있는 원하는 종자 성분 특성을 갖는 캐놀라를 개발할 수 있다. 본 발명의 생식질은 본원에 기재된 유형의 증가된 개선점을 갖는 캐놀라박을 제공하는 캐놀라 계통 및 잡종이 개발될 수 있도록, 종자 조성에서의 추가의 변화가 도입될 수 있는 출발 생식질로서 사용될 수 있다.

II. 약어

ADF 산성 세제 불용성 섬유

ADL 산성 세제 리그닌

AID 외관상 회장 소화율

AME 외관상 대사 에너지

BSC 흑색 종자 캐놀라

CP 조 단백질 백분율

DM 건조 물질 농도

ECM 본 발명의 향상된 캐놀라박

FAME 지방산/지방산 메틸 에스테르

GE 총 에너지

HT "고온" 가공

LT "저온" 가공

NDF 중성 세제 불용성 섬유

NMR 핵 자기 공명

NIR 근적외선 분광법

SAE 시냅산 에스테르

SBM 대두박

SER 가용성 추출된 잔류물

SID 표준화된 회장 소화율

TAAA 진정 아미노산 이용률

TDF 총 식이 섬유

TME 진정 대사 에너지

WF 백색 박편

III. 용어

역교배: 역교배 방법을 사용하여 핵산 서열을 식물에 도입할 수 있다. 역교배 기술은 신규 특성을 식물에 도입하기 위해 수십년 동안 널리 사용되어 왔다(문헌[Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1988]). 전형적인 역교배 프로토콜에서, 원래의 관심 품종 (반복친)을 이동할 관심 유전자를 보유하는 제2 품종 (일회친)에 교배한다. 이어서, 상기 교배로부터 생성된 자손을 반복친에 다시 교배하고, 일회친으로부터의 이동된 유전자 이외에, 반복 식물의 원하는 형태학적 및 생리학적 특성의 본질적으로 전부가 전환된 식물에 회복된 식물을 수득할 때까지, 상기 방법을 반복한다.

캐놀라유: 캐놀라유는 평지씨의 상업적 품종으로부터 추출된 오일을 의미한다. 캐놀라유를 생산하기 위하여, 종자를 전형적으로 분류하고 곡물 창고에서 블렌딩하여 허용가능하게 균일한 생성물을 생산한다. 이어서, 블렌딩된 종자를 파쇄하고, 오일을 헥산으로 전형적으로 추출한 후, 정제(refine)한다. 이어서, 생성된 오일을 사용을 위해 판매할 수 있다. 오일 함량은 전형적으로 전체 건조 종자 중의 백분율로서 측정되며, 특정 오일 함량은 서로 다른 캐놀라 품종들의 특징이다. 오일 함량은 다양한 분석 기술, 예를 들면 (이에 제한되지 않음) NMR; NIR; 속실렛(Soxhlet) 추출법을 이용하거나, 당업자에게 널리 이용가능한 다른 방법으로 쉽고 일상적으로 결정할 수 있다(문헌[Bailey, Industrial Oil ＆ Fat Products (1996), 5th Ed. Wiley Interscience Publication, New York, New York] 참조). 총 지방산 중의 조성 백분율은 종자로부터 오일의 샘플을 추출하고, 오일 샘플에 존재하는 지방산의 메틸 에스테르를 생성하고, 기체 크로마토그래피를 이용하여 샘플 내 다양한 지방산의 비율을 분석함으로써 전형적으로 결정한다. 지방산 조성은 또한 특정 품종의 구별되는 특징일 수 있다.

상업적으로 유용한: 본원에 사용된 용어 "상업적으로 유용한"은 식물 계통 또는 잡종의 작물이 통상적인 농업 장비를 이용하여 농부에 의해 생산될 수 있도록 충분한 식물 활력 및 생식력을 갖는 식물 계통 및 잡종을 의미한다. 특정 실시양태에서, 기재된 성분 및/또는 성질을 갖는 식물 생산품은 상업적으로 유용한 품종의 식물 또는 식물 물질로부터 추출될 수 있다. 예를 들면, 원하는 오일 성분을 포함하는 오일은 통상적인 파쇄 및 추출 장비를 이용하여 상업적으로 유용한 식물 계통 또는 잡종의 종자로부터 추출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상업적으로 유용한 식물 계통은 근교 계통 또는 잡종 계통이다. "작물학적으로 엘리트" 계통 및 잡종은 전형적으로 바람직한 작물 특성, 예를 들면 (이에 제한되지 않음) 하나 이상의 식물 생산품의 개선된 수율; 성숙; 질환 내성; 및 지탱능력(standability)을 갖는다.

엘리트 계통: 우수한 작물 성능을 위한 번식 및 선택으로부터 수득된 임의의 식물 계통. 엘리트 식물은 엘리트 계통로부터 얻은 임의의 식물이다.

향상된 캐놀라박: 본원에 사용된 용어 "향상된 캐놀라박"는 증가된 수준의 단백질 및 감소된 수준의 하나 이상의 몇몇 반영양소 성분을 갖는 캐놀라 종자의 가공으로부터 유도된 향상된 조성을 갖는 캐놀라박을 의미한다. 본 발명의 향상된 캐놀라박은 본원에서 "ECM", "흑색 종자 캐놀라 ECM", "BSC ECM", 또는 "DAS BSC ECM"으로 다양하게 언급될 수 있다. 그러나, 본 발명은 흑색 종자 캐놀라의 ECM 생식질에만 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

본질적으로 유도된: 몇몇 실시양태에서, 식물, 종자, 또는 그의 일부의 조작은 본질적으로 유도된 품종의 생성을 유도할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "본질적으로 유도된"은 식물의 신규 품종의 보호에 관한 국제 연합 (UPOV)에 의해 발표된 관례를 따른다:

[A] 품종은 아래와 같은 경우에 다른 품종 ("최초 품종")으로부터 본질적으로 유도된 것으로 간주될 것이다.

(i) 최초 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 유발된 본질적인 특성의 발현을 유지하면서, 최초 품종으로부터, 또는 최초 품종으로부터 스스로 우세하게 유도된 품종으로부터 우세하게 유도된 경우;

(ii) 최초 품종으로부터 명확하게 구별가능한 경우; 및

(iii) 유도의 행위로부터 유발된 차이를 제외하고, 최초 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 유발된 본질적인 특성의 발현 면에서 최초 품종에 합치하는 경우.

UPOV, 1992년 10월 30일 제네바 국제 기구와의 6차 미팅 (상기 연합의 사무소에 의해 작성된 문서).

식물 생산품: 본원에 사용된 용어 "식물 생산품"은 특정 식물 또는 식물 부분 (예를 들어, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물, 및 본 발명의 생식질을 포함하는 식물로부터 수득된 식물 부분)으로부터 생산된 상품을 의미한다. 물품은 예를 들면 (이에 제한되지 않음) 곡물; 박; 여물; 단백질; 단리된 단백질; 가루; 오일; 파쇄된 또는 통 곡물 또는 종자; 임의의 박, 오일, 또는 파쇄된 또는 통 곡물을 포함하는 임의의 음식물; 또는 사일리지(silage)일 수 있다.

식물 계통: 본원에 사용된 "계통"은 하나 이상의 특성에 대해 개체 사이에서 유전자 변이를 거의 나타내지 않는 (예를 들어, 유전자 변이 없는) 식물 군을 의미한다. 근교 계통은 수 세대의 자가-수분 및 선택 또는, 다르게는 조직 또는 세포 배양 기술을 이용한 단일 부모로부터의 영양 번식에 의해 생성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재배종", "품종", 및 "유형"은 동의어이며, 이들 용어는 상업적 생산을 위해 사용되는 계통을 의미한다.

식물 물질: 본원에 사용된 용어 "식물 물질"은 식물로부터 전부 또는 부분적으로 유도된 임의의 가공된 또는 비가공된 물질을 의미한다. 예를 들면, 식물 물질은 식물 일부, 종자, 과실, 잎, 뿌리, 식물 조직, 식물 조직 배양물, 식물 이식편, 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

안정성: 본원에 사용된 용어 "안정성", 또는 "안정한"은 유전가능하고 다수의 종자 세대를 통해 실질적으로 동일한 수준으로 유지되는 주어진 식물 성분 또는 특성을 의미한다. 예를 들면, 안정한 성분은 적어도 3개 세대 동안 실질적으로 동일한 수준으로 유지될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "실질적으로 동일한"은 몇몇 실시양태에서, 2개의 상이한 세대 사이에서 완벽하게 유지되는 성분 뿐만 아니라 2개의 상이한 세대 사이에서 25％ 이내; 20％ 이내; 15％ 이내; 10％ 이내; 5％ 이내; 3％ 이내; 2％ 이내; 및/또는 1％ 이내로 유지되는 성분을 의미할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 안정한 식물 성분은 예를 들면 오일 성분; 단백질 성분; 섬유 성분; 안료 성분; 글루코시놀레이트 성분; 및 리그닌 성분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 성분의 안정성은 하나 이상의 환경 요소에 의해 영향받을 수 있다. 예를 들면, 오일 성분의 안정성은 예를 들면 (이에 제한되지 않음) 온도; 장소; 스트레스; 및 식수(planting) 시기에 의해 영향받을 수 있다. 필드 조건 하에서 안정한 성분을 갖는 식물의 후속 세대는 예를 들면, 상기 기재한 바와 같은 유사한 방식으로 식물 성분을 생산할 것으로 기대될 것이다.

특성 또는 표현형: 용어 "특성" 및 "표현형"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

품종 또는 재배종: 용어 "품종" 또는 "재배종"은 본원에서, 번식시 그의 특성 면에서 분명하고 안정하고 균일한 상업적 생산에 사용되는 식물 계통을 의미한다. 잡종 품종 또는 재배종의 경우에, 양친 계통은 그의 특성 면에서 분명하고 안정하고 균일하다.

달리 언급하지 않는 한, 부정관사("a" 및 "an") 용어는 본원에서 하나 이상을 의미한다.

IV. 종자 색-독립적 방식으로 바람직한 종자 성분 특성을 제공하는 캐놀라 생식질

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 종자 색-독립적 방식으로 바람직한 종자 성분 특성을 갖는 캐놀라 식물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 브라시카(Brassica) 생식질을 제공한다. 상기 생식질을 포함하는 특정 예시적인 캐놀라 근교 계통 및 잡종 또한 제공된다.

캐놀라유는 일반적으로 인간 및 동물 소비 둘다를 위한 매우 건강에 좋은 오일로서 인식되어 왔다. 그러나, 오일 성분의 추출 후 남아 있는 캐놀라 종자의 박 성분은 그의 높은 섬유 함량 및 감소된 영양학적 가치 때문에 대두박보다 열등하다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물은 이러한 결점을 완화 또는 극복할 수 있고, 동물 먹이의 고도로 영양가 있고 경제적인 공급원으로서 캐놀라박을 제공할 수 있다. 캐놀라박은 캐놀라유 생산의 부산물이며, 따라서 본 발명에 의해 제공된 캐놀라박은 상기 부산물이 다른 박와 경쟁적으로 사용되게 함으로써 유용한 자원을 아낀다.

황색 캐놀라 종자 색은 그것이 오일 추출 후 얻어지는 박 성분의 개선된 영양학적 특성에 상응한다고 여겨졌기 때문에, 그 자체로 유의하다고 이전에 생각되었다. 몇몇 실시양태는 처음으로, 우수한 고 올레산 및 저 리놀렌산 오일을 또한 제공하는 어두운 색 종자 (예를 들어, 어두운 색, 흑색, 및 얼룩덜룩한 색 종자)의 저-섬유 캐놀라를 위한 생식질을 제공할 수 있고, 이 생식질은 또한 캐놀라박에 개선된 영양 특성 (예를 들어, 개선된 종자 성분)을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물은 놀랍게도 이들 특성을 다른 유용한 특성 (예를 들면 (이에 제한되지 않음) 우수한 수율, 높은 단백질 함량, 높은 오일 함량 및 높은 오일 품질)과 함께 추가로 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 어두운 색 코팅된 종자는 표준 어두운 색 종자의 캐놀라 품종에 의해 생산된 종자보다 상당히 더 얇은 종피를 가질 수 있다. 보다 얇은 종피는 표준 어두운 색 종자 품종에서의 오일 및 단백질의 수준에 비해, 박에서의 감소된 섬유 함량, 및 종자 오일 및 단백질 함량의 증가를 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물에 의해 생산된 어두운 색 종자는 표준 어두운 색 종자의 캐놀라 식물에 의해 생산된 종자에서 관찰되는 것보다 그의 종자에서의 보다 높은 오일 및 단백질 농도를 가질 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물은 실질적인 작물학적 및/또는 종자 제한을 나타내지 않는다. 예를 들면, 이러한 식물은 적어도 표준 캐놀라 품종에 의해 나타나는 것만큼 호의적인 작물 및/또는 종자 품질 (예를 들어, 발아; 초기 활력; 종자 처리의 효과; 종자 수확 및 저장성)을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물은 또한 기존의 캐놀라 근교 계통에 의해 발휘되는 하나 이상의 추가의 호의적인 특성, 예를 들면 (이에 제한되지 않음) 호의적인 지방산 프로파일을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물은 수개의 영양학적 특성 중 하나 이상을 포함하는 종자를 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 캐놀라 식물에 의해 생산되는 종자는 호의적인 오일 프로파일; 높은 단백질 함량; 낮은 섬유 함량 (예를 들어, ADF 및 NDF (낮은 폴리페놀 함량을 포함함)); (낮은 섬유 및 높은 단백질은 보다 높은 대사 에너지를 부여함); 높은 인 함량; 및 낮은 시냅산 에스테르 (SAE) 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 영양 특성을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, "높은" 또는 "낮은" 성분 함량은 본 발명의 생식질을 포함하는 참조 식물에 의해 생산된 종자와 표준 캐놀라 품종에 의해 생산된 종자 사이의 비교를 의미한다. 따라서, "낮은" 섬유 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물은 표준 캐놀라 품종에 의해 생산되는 종자에서 발견되는 것보다 더 낮은 섬유 함량을 갖는 종자를 생산할 수 있다. 그리고, "높은" 단백질 함량을 갖는 종자를 생산하는 식물은 표준 캐놀라 품종에 의해 생산되는 종자에서 발견되는 것보다 더 높은 단백질 함량을 갖는 종자를 생산할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 언급된 군으로부터 선택된 하나 이상의 영양 특성을 포함하는 캐놀라 식물에 의해 생산된 평지씨의 실질적으로 균일한 집합이 생산될 수 있다. 이러한 종자를 사용하여 실질적으로 균일한 평지 식물 필드를 생산할 수 있다. 특정 실시양태는 상기 언급된 특성의 조합을 확인하는 것을 포함하는 캐놀라 종자를 제공한다. 예를 들면, 종자의 조합된 총 오일 및 단백질 함량은 종자의 유용한 척도 및 독특한 특징일 수 있다.

몇몇 실시양태는 나트레온(NATREON)-형 오일 프로파일 또는 "오메가-9" 오일 프로파일을 갖는 캐놀라유를 수득할 수 있는 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 (예를 들어, 어두운 색 종자의 캐놀라)를 제공한다. "나트레온-형", "나트레온-유사", 또는 "오메가-9" 오일 프로파일은 예를 들면 3％ 미만의 알파 리놀렌산 함량과 함께, 예를 들면, 68-80％; 70-78％; 71-77％; 및 72-75％ 범위의 올레산 함량을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물로부터 수득한 종자는 3％ 미만, 2.4％ 미만, 2％ 미만, 1.9％ 미만, 및/또는 1.8％ 미만 (예를 들어, 1.7％)의 리놀렌산 함량을 가지면서, 68％ 초과, 70％ 초과, 71％ 초과, 71.5％ 초과, 및/또는 72％ 초과 (예를 들어, 72.4％ 또는 72.7％)의 올레산을 갖는 오일을 수득할 수 있다. 그러나, 추가의 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라는 예를 들면, 80％ 초과의 올레산 함량을 갖는 오일을 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라로부터 생산된 캐놀라유는 천연적으로 안정할 (예를 들어, 인공적으로 수소화되지 않을) 수 있다. 캐놀라유의 지방산 함량은 공지된 방법에 따라 쉽게 그리고 일상적으로 결정할 수 있다.

따라서, 몇몇 실시양태는 오일 분획 및 박 분획을 포함하는 캐놀라 종자 (예를 들어, 어두운 색 캐놀라 종자)를 제공하며, 여기서 오일 분획은 예를 들면, 3％ 이하 (종자의 총 지방산 함량에 대해)의 α-리놀렌산 함량 및 예를 들면, 68％ 이상 (종자의 총 지방산 함량에 대해)의 올레산 함량을 가질 수 있다. 정의상, 이러한 종자의 에루스산 (C22:1) 함량은 또한 2 중량％ (종자의 총 지방산 함량에 대해) 미만일 수 있다. 특정 실시예에서, 캐놀라 종자의 오일 함량은 종자 중량의 48％ 내지 50％를 구성할 수 있다.

용어 "높은 올레산"은 문맥이 좌우할 수 있지만, 야생형 또는 다른 참조 품종 또는 계통의 것보다 더 높은 올레산 함량을 갖는 브라시카 준세아(Brassica juncea) 또는 다른 브라시카 종을 의미하며, 보다 일반적으로 이는 68.0 중량％ 이상의 올레산을 포함하는 지방산 조성을 나타낸다.

"총 포화"는 팔미트산 (C16:0), 스테아르산 (C18:0), 아라키드산 (C20:0), 베헨산 (C22:0) 및 테트라코사노산 (C24:0) 지방산의 합한 백분율을 의미한다. 본원에서 논의된 지방산 농도는 당업자에게 익히 공지된 표준 절차에 따라 결정된다. 구체적인 절차는 실시예에 설명된다. 지방산 농도는 총 지방산 함량의 중량에 대한 백분율로서 표현된다.

주어진 유전자 조절된 지방산 성분과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "안정성" 또는 "안정한"은 지방산 성분이 세대에서 세대까지 적어도 두 세대 동안, 바람직하게는 적어도 세 세대 동안 실질적으로 동일한 수준으로, 예를 들어, 바람직하게는 ±5％로 유지됨을 의미한다. 본 발명의 방법은 세대에서 세대까지 ±5％ 이내로 안정한 개선된 지방산 조성을 갖는 브라시카 준세아 계통을 생성할 수 있다. 당업자는 상기 언급된 안정성이 온도, 장소, 스트레스 및 식수 시기에 의해 영향받을 수 있음을 이해한다. 따라서, 캐놀라 계통 사이의 지방산 프로파일의 비교는 유사한 성장 조건하에서 생산된 종자를 이용하여 이루어져야 한다.

용어 "브라시카 식물"이 본 발명의 문맥에서 사용된 경우, 이는 상기 군의 임의의 단일 유전자 전환도 포함한다. 본원에 사용된 용어 "단일 유전자 전환된 식물"은 역교배라고 불리우는 식물 번식 기술에 의해 개발되며, 역교배 기술을 통해 품종으로 전달된 단일 유전자 이외에 품종의 원하는 형태학적 및 생리학적 특성의 본질적으로 전부가 회복되는 브라시카 식물을 의미한다. 역교배 방법을 본 발명과 함께 사용하여 특성을 품종으로 도입하거나 개선할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "역교배"는 잡종 자손을 반복친으로 역으로 반복적으로 교배하는 것, 즉, 반복친으로 1회 이상 역교배하는 것 ("BC1", "BC2" 등으로 확인됨)을 의미한다. 원하는 특성을 위해 유전자를 기증하는 양친 브라시카 식물은 "일회친" 또는 "공여친"이라고 명명된다. 상기 용어는 일회친이 역교배 프로토콜에 1회 사용되고 따라서 반복되지 않는다는 사실을 의미한다. 일회친으로부터의 유전자(들)이 전달되는 양친 브라시카 식물은 역교배 프로토콜에서 수회 사용되기 때문에 반복친으로 공지되어 있다 (Poehiman ＆ Sleper, 1994; Fehr, 1987). 전형적인 역교배 프로토콜에서, 관심 오리지널 품종 (반복친)은 전달될 관심 단일 유전자를 보유하는 제2 품종 (일회친)에 교배된다. 이어서, 상기 교배로부터 생성된 자손은 반복친에 다시 교배되고, 상기 과정은 동일한 환경 조건하에서 성장시 5％ 유의성 수준으로 결정되는 바와 같은, 일회친으로부터의 단일 전달된 유전자 이외에 반복친의 원하는 형태학적 및 생리학적 특성의 본질적으로 전부가 전환된 식물에서 회복된 브라시카 식물이 수득될 때까지 반복된다. 본 출원에서, 용어 "브라시카"는 브라시카 나푸스(Brassica napus), 브라시카 준세아, 브라시카 니그라(Brassica nigra), 브라시카 카리나타(Brassica carinata), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) 및 브라시카 라파(Brassica rapa)를 포함하여, 브라시카 속에 포함된 임의의 모든 종을 포함할 수 있다.

본 출원에서 사용된 캐놀라 브라시카 준세아는 각각 "캐놀라" 오일 또는 박와 같은 상업적 지명을 위한 요건을 만족시키는 오일 및 박 품질을 갖는 종자를 생산하는 브라시카 준세아를 의미한다 (즉, 종자 오일 중에 2 중량％ 미만의 에루스산 (Δ13 22:1)을 갖고 무오일 박의 그램당 글루코시놀레이트 30 마이크로몰 미만을 갖는 브라시카 준세아 속의 식물).

한 측면에서, 본 발명은 중량으로 높은 백분율의 올레산 및 낮은 백분율의 리놀렌산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 종자를 생산할 수 있는 브라시카 식물, 예를 들어 브라시카 준세아 식물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 올레산은 약 68.0％, 69.0％, 70.0％, 71.0％, 72.0％, 73.0％, 74.0％, 75.0％, 76.0％, 77.0％, 78.0％, 79.0％, 80.0％, 81.0％, 82.0％, 83.0％, 84.0％ 또는 85.0％ 초과 (이의 모든 정수 및 분수 또는 올레산 85％ 초과의 값을 갖는 임의의 정수를 포함함)를 구성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 지방산의 리놀렌산 함량은 약 5％, 4％, 3％, 2.5％, 2.0％, 1.5％, 1.0％, 0.5％ 미만 (이의 모든 정수 및 분수를 포함함) 또는 0％일 수 있다. 한 예시적인 실시양태에서, 식물은 종자가 68 중량％ 이상의 올레산 및 3 중량％ 미만의 리놀렌산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 브라시카 준세아이다. 추가의 실시양태에서, 식물은 종자가 68 중량％ 이상의 올레산 및 약 5 중량％ 이하의 리놀렌산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 브라시카 준세아이다.

한 측면에서, 본 발명은 중량으로 높은 백분율의 올레산 및 낮은 백분율의 리놀렌산 및 약 5.5％ 미만의 총 포화 지방산을 포함할 수 있는 낮은 총 포화 지방산 또는 10％ 초과의 총 포화 지방산을 포함할 수 있는 높은 총 포화 지방산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 종자를 생산할 수 있는 브라시카 식물, 예를 들어 브라시카 준세아 식물을 제공한다.

브라시카 준세아의 종자로부터 얻은 오일의 조성은 두 지방산 성분 모두 (예를 들어, 보다 높은 에루스산 함량), 정유 (예를 들어, 알릴 이소티오시아네이트), 및 소수 성분 (예를 들어, 토코페롤, 금속, 탄닌, 페놀류, 인지질, 색소 등)에서 브라시카 나푸스의 것과는 상이하다고 알려져 있다. 브라시카 준세아에서 얻은 오일이 전형적으로 보다 높은 수준의 C18:3을 가짐에도 불구하고, 브라시카 준세아에서 얻은 종자 중의 오일 (추출된 오일을 포함)은 브라시카 나푸스에서 얻은 오일에 비해 산화 안정성 면에서 보다 높음이 발견되었다(문헌[C. Wijesundera et al., "Canola Quality Indian Mustard oil (Brassica juncea) is More Stable to Oxidation than Conventional Canola oil (Brassica napus)," J. Am. Oil Chem. Soc. (2008) 85:693-699]).

다른 측면에서, 본 발명은 브라시카 식물의 올레산 함량을 증가시키고 리놀렌산 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 올레산 함량이 55％ 초과이고 리놀렌산 함량이 14％ 미만인 브라시카 계통으로부터의 적어도 몇개의 세포에서 돌연변이유발을 유도하는 것; (b) 상기 돌연변이유발된 세포 중 하나 이상으로부터의 식물을 재생시키고, 68％ 이상의 올레산 (또는 상기 기재한 바와 같은 올레산의 다른 역치 농도) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (또는 상기 기재한 바와 같은 리놀렌산의 다른 역치 농도)을 포함하는 지방산 함량을 갖는 재생된 식물을 선택하는 것; 및 (c) 상기 재생된 식물로부터 식물의 추가 세대를 유도하는 것 (여기서 식물의 상기 추가 세대의 개별 식물은 68％ 이상의 올레산 (또는 다른 역치 농도) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (또는 다른 역치 농도)을 포함하는 지방산 함량을 가짐)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 브라시카는 브라시카 준세아일 수 있다. 용어 "높은 올레산 함량" 및 "낮은 리놀렌산 함량"은 상기 기재된 가능한 값의 전체 범위를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 감소된 리놀레산 함량, 예를 들어 상기 기재된 가능한 값의 범위를 위해 상기 계통, 재생된 식물 및 식물의 추가 세대 중 하나 이상을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 단계 (c)는 단계 (b)의 재생된 식물로부터 종자를 선택 및 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 원하는 올레산 함량, 리놀레산 함량, 또는 둘 다가 달성될 때까지 상기 단계의 반복을 포함할 수 있다.

다른 실시양태에서, 종자 발아 부위의 일부의 지방산의 올레산 함량 또는 리놀레산 함량 또는 올레산 함량 및 리놀레산 함량 중 하나 이상을 결정하는 것; 하나 이상의 함량을 참조 값과 비교하는 것; 및 종자의 관련 있을 것 같은 올레산, 리놀레산, 또는 올레산 및 리놀레산 함량을 추론하는 것을 포함하는, 증가된 올레산 함량 및 감소된 리놀레산 함량에 대하여 개별 종자를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 분석에 사용되는 식물의 일부는 잎, 떡잎, 줄기, 잎자루, 대 또는 임의의 다른 조직 또는 조직의 단편의 일부 또는 전부, 예를 들어 종자의 조성과의 믿을 만한 상관성을 증명하는 조성을 갖는 조직일 수 있다. 한 일련의 실시양태에서, 발아 부분은 잎의 일부일 수 있다. 특정 실시양태에서, 종자의 지방산 조성을 추론하는 단계는 상기 잎에서의 주어진 산의 유의하게 변화된 수준이 종자에서의 상기 산의 수준의 유사한 상대적 변화를 반영한다고 가정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 잎 조직을 분석함으로써 종자가 68 중량％ 이상의 올레산 및 3 중량％ 미만의 리놀렌산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 개별 식물 계통에 대해 브라시카 식물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 또한, 잎 조직은 기체 액체 크로마토그래피에 의해 지방산 조성에 대해 분석될 수 있고, 여기서 지방산의 추출은 벌크 종자 분석 또는 절반 종자 분석과 같은 방법으로 이루어질 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 브라시카 준세아 계통으로부터의 상기 기재된 대립 유전자를 포함하는, 브라시카 준세아 식물일 수 있는 브라시카 식물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 식물은 돌연변이 대립 유전자에 의해 표현되는 fad2-a 및 fad3-a 유전자좌에서 동형접합일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 브라시카 준세아 식물, 식물 세포, 또는 그의 일부는 본원에 개시된 상기 기재된 서열로부터의 핵산 서열을 갖는 대립 유전자를 함유한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 BJfad2b 유전자의 존재 또는 부재를 조사함으로써, 본 발명의 캐놀라 품질 브라시카 준세아 (≥68％ 올레산 및 ≤5％ 리놀렌산)인 HOLL을 낮은 올레산/높은 리놀렌산 브라시카 준세아 (약 45％ 올레산 및 약 14％ 리놀렌산)와 구별하는 것을 포함할 수 있다 (야오(Yao) 등의 미국 특허 공개 제20030221217호 참조). 상기 구별은 당업계에 공지된 바와 같이, BJfad2a 유전자가 캐놀라 품질 브라시카 준세아 계통에서의 유일한 기능적 올레에이트 지방산 데사투라제 유전자임을 확인하는 것을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 브라시카 준세아 계통은 국제 공보 제US 2006/0248611 A1호에 개시된 바와 같은, 상기 공보의 도 1 및 3에 예시된 fad2 및 fad3 유전자를 함유한다. fad2 및 fad3 유전자는 본원에서 서열 1 내지 4에 의해 예시된다. 생성된 대립 유전자는 국제 공보 제US 2006/0248611 A1호의 도 2에 예시된 델타-12 지방산 데사투라제 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 브라시카 준세아 계통은 fad2-a 및 fad3-a 유전자 유전자좌에 돌연변이를 함유할 수 있고, 생성된 돌연변이 대립 유전자는 예측된 BJFAD2-a 및 BJFAD3-a 단백질의 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 코딩할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 fad2-a 및 fad3-a 돌연변이된 유전자 및 단백질의 대표적인 예는 국제 공보 제WO 2006/079567 A2호 (예를 들어, 도 1 및 2)에 개시된 것, 예를 들어 서열 8 및 9; 국제 공보 제WO 2007/107590 A2호에 개시된 것, 예를 들어 서열 10-21; 미국 특허 제6,967,243 B2호 (예를 들어, 도 2 및 3)에 개시된 것, 예를 들어 서열 22-27; 및 유럽 공보 제1 862 551 A1호 (예를 들어, 도 1 내지 10)에 개시된 것, 예를 들어 서열 28-39을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

선택된 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 돌연변이 fad2 및 fad3 유전자의 완전한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및/또는 5' 업스트림 구역을 포함하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 돌연변이 대립 유전자로부터의 돌연변이를 함유하는, 예상되는 돌연변이 단백질의 폴리펩티드 서열을 제공한다. 막 결합 데사투라제, 예를 들어 FAD2는 보존된 히스티딘 박스를 갖는다고 공지되어 있다. 상기 히스티딘 박스 밖의 아미노산 잔기에서의 변화는 또한 FAD2 효소 활성에 영향을 줄 수 있다(문헌[Tanhuanpaa et al., Molecular Breeding 4:543-550, 1998)].

본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 돌연변이 대립 유전자는 식물 번식에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 대립 유전자는 고 올레산 브라시카 종, 예를 들어 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 니그라, 브라시카 카리나타를 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 돌연변이 대립 유전자를 다른 서열과 구별하기 위한 분자 마커를 제공한다. 이로써, 본 발명은 본 발명의 대립 유전자를 갖는 식물과 관련된 유전자 교배의 분리 및 선택 분석을 위한 방법을 제공한다. 이로써, 본 발명은 본 발명의 대립 유전자를 갖는 식물과 관련된 유전자 교배로부터 유도된 자손의 분리 및 선택 분석을 위한 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 바람직한 지방산 조성 또는 원하는 게놈 특성을 갖는 브라시카 식물, 예를 들어 브라시카 준세아 식물을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 예를 들면 게놈에서 특정 FAD2 및/또는 FAD3 대립 유전자, 예를 들어 본 발명의 대립 유전자 또는 야생형 J96D 4830/BJfad2a 대립 유전자의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 확인된 대립 유전자 중 하나와 관련된 핵산 다형성 또는 본 발명의 대립 유전자 중 하나와 관련된 항원 결정기의 존재를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 결정은 예를 들면 일정 범위의 기술, 예를 들어 관련 DNA 단편의 PCR 증폭, DNA 핑거프린팅, RNA 핑거프린팅, 겔 블로팅 및 RFLP 분석, 뉴클레아제 보호 검정, 관련 핵산 단편의 서열분석, 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)의 생성, 또는 상기 단백질의 다른 변이체 또는 다른 아생형으로부터의 관련 대립 유전자에 의해 생산된 단백질을 구별하기 위하여 채용되는 다른 방법으로 달성할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이 대립 유전자의 존재를 결정함으로써, 종자가 68 중량％ 이상의 올레산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 비. 준세아 식물을 확인하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이된 FAD2 및 FAD3 단백질을 코딩하는 fad2 및 fad3 코딩 서열을 포함하는 브라시카 식물을 제공한다. 이러한 돌연변이된 FAD2/FAD3 단백질은 야생형 FAD2 단백질에 비해 오직 하나의 아미노산 변화만을 함유할 수 있다. 대표적인 실시양태에서, 다양한 브라시카 준세아 계통은 상기 기재된 대립 유전자에 의해 코딩된 상기 기재된 돌연변이된 FAD2 단백질을 함유한다. 이러한 대립 유전자는 본 발명의 식물에 증가된 올레산 함량 및 감소된 리놀렌산 함량을 부여하는 데에 효과적이도록 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 원하는 대립 유전자는 번식 기술에 의해 식물에 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 대립 유전자는 식물 변형을 비롯한 분자 생물학 기술에 의해 도입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 식물은 약 68 중량％ 이상의 올레산 및 약 3 중량％ 미만의 리놀렌산 또는 상기 기재된 바와 같은 임의의 다른 올레산 및 리놀렌산 함량 역치를 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 종자를 생산할 수 있다. 본 발명의 식물은 또한 약 68％ 내지 약 85 중량％ 올레산, 약 70％ 내지 약 78％ 올레산, 및 약 0.1％ 내지 약 3％ 리놀레산을 함유할 수 있으며, 여기서 오일 조성은 양친 계통으로부터 유전적으로 유도된다. 본 발명의 식물은 또한 7.1％ 미만 내지 약 6.2 중량％ 미만의 총 지방산 함량을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 식물은 약 68％ 이상의 올레산 및 3％ 미만의 리놀레산을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 종자를 생산하며, 여기서 오일 조성은 양친 계통으로부터 유전적으로 유도된다.

선택된 실시양태에서, 본 발명은 상기 실시양태의 하나 이상에 대해 기재된 지방산 조성을 갖는 내인성 오일 함량을 가지며, 내인성 오일 함량의 유전적 결정이 본 발명의 돌연변이 대립 유전자로부터 유도되는, 브라시카 준세아 종자일 수 있는 브라시카 종자를 제공한다. 이러한 종자는 예를 들면 본 발명의 돌연변이 대립 유전자 계통 각각을 자가 수분함으로써 수득될 수 있다. 다르게는, 이러한 종자는 예를 들면 돌연변이 대립 유전자 계통을 제2 양친과 교배한 후 선택함으로써 수득될 수 있고, 여기서 제2 양친은 임의의 다른 브라시카 계통, 예를 들어 캐놀라 품질 브라시카 준세아 또는 비-캐놀라 품질 브라시카 준세아인 브라시카 준세아 계통 또는 임의의 다른 브라시카 종, 예를 들어 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 니그라, 및 브라시카 카리나타일 수 있다. 상기 번식 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 실시양태의 하나 이상에 개시된 조성을 갖는 성숙한 종자를 발달시키는 브라시카 속의 유전적으로 안정한 식물, 예를 들어 브라시카 준세아 식물을 제공한다. 이러한 식물은 본 발명의 돌연변이 대립 유전자를 갖는 브라시카 준세아 계통으로부터 유도될 수 있다. 이러한 식물의 오일 조성은 양친 계통으로부터 유전적으로 유도될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 실시양태 중 하나 이상에 대해 특정된 조성을 포함하는 내인성 지방산 함량을 갖는 성숙한 종자를 생산하는 유전적으로 안정한 브라시카 식물, 예를 들어 브라시카 준세아 식물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 브라시카 나푸스로부터의 오메가-9 유전자 (예를 들어, fad2a 및 fad3a)를 다른 브라시카 식물, 예를 들어 브라시카 준세아와 교배하여 F1 자손을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. F1 자손은 예를 들면 두 배가 된 반수체 식물의 자가 수분 또는 발달을 포함할 수 있는 수단에 의해 번식될 수 있다. 돌연변이 FAD2 대립 유전자 및 돌연변이 FAD3 대립 유전자를 조합함으로써, 두 배의 돌연변이 유전자 대립 유전자 (fad2 및 fad3)를 갖는 식물은 임의의 단일 돌연변이 식물보다 우수한 오일 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 생성된 자손은 상기 실시양태 중 하나 이상에 대해 개시된 조성을 갖는 종자를 생성하는 유전적으로 안정한 식물에 대해 선택될 수 있다. 이러한 종자는 예를 들면 총 추출가능한 오일 중 약 7.1％ 내지 약 6.5％의 총 포화 함량을 포함하는 안정화된 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 특정 변이체에서, 자손은 다른 실시양태에 대해 상기 기재한 바와 같은 조성을 갖는 종자 또는 오일을 그들 스스로 생산할 수 있다. 약 68 중량％ 초과의 올레산 함량 및 약 3 중량％ 미만의 리놀렌산 함량을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 안정하고 유전될 수 있는 고 올레산 및 저 리놀렌산 표현형을 갖는 식물을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 돌연변이 대립 유전자로부터 수득된 고 올레산 및 저 리놀렌산 표현형은 M2, M3, 및 M4 세대를 통해 유전적으로 상속가능하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이유발 실험을 위해 사용된 야생형 비. 준세아에 비해 지방산 데사투라제의 활성이 변화되거나, 올레산 함량이 변화되거나, 리놀렌산 함량이 변화된 브라시카 준세아 식물을 제공한다. 지방산 데사투라제 ("FAD")란 단백질이 지방산의 생합성에 이중 결합을 도입시키는 활성을 발휘함을 의미한다. 예를 들면, FAD2/FAD3 효소는 올레산으로부터의 리놀레산의 생합성에 제2 이중 결합을 도입하는 활성을 특징으로 할 수 있다. 변화된 데사투라제 활성은 참조 식물, 세포 또는 샘플과 대비하여 데사투라제 활성의 증가, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 데사투라제 활성의 감소는 데사투라제를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어 본 발명의 핵산 서열의 발현의 제거를 포함할 수 있다. 본원에서 발현의 제거란 핵산 서열에 의해 코딩되는 기능적 아미노산 서열이 검출가능한 수준으로 생산되지 않음을 의미한다. 데사투라제 활성의 감소는 데사투라제를 코딩하는 핵산 서열, 예를 들어 FAD2 효소 또는 FAD3 효소를 코딩하는 본 발명의 서열의 전사의 제거를 포함할 수 있다. 본원에서 전사의 제거란 핵산 서열에 의해 코딩되는 mRNA 서열이 검출가능한 수준으로 전사되지 않음을 의미한다. 데사투라제 활성의 감소는 또한 데사투라제를 코딩하는 핵산 서열로부터의 잘린(truncated) 아미노산 서열의 생산을 포함할 수 있다. 본원에서 잘린 아미노산 서열의 생산이란 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 야생형 핵산 서열에 의해 코딩되는 기능적 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산을 분실함을 의미한다. 또한, 데사투라제 활성의 감소는 변이체 데사투라제 아미노산 서열의 생산을 포함할 수 있다. 본원에서 변이체 아미노산 서열의 생산이란 아미노산 서열이 야생형 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산을 가짐을 의미한다. 본원에 더욱 자세히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 계통이 야생형 계통 J96D 4830에 비해 변이체 아미노산을 갖는 FAD2 및 FAD3 효소를 생산함을 개시한다. 돌연변이 유형의 품종은 프레임 이동 돌연변이, 치환 및 결실과 같이 데사투라제 활성의 감소의 목적으로 핵산 서열에 도입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 다른 실시양태에 따라 변형될 수 있는 신규 FAD2/FAD3 폴리펩티드 서열을 제공한다. 펩티드의 생물학적 기능의 실질적 변경 없이 폴리펩티드의 구조에 일부 변형 및 변화를 주어 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 얻을 수 있다는 것은 익히 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "보존된 아미노산 치환"은 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 얻기 위해 기능의 임의의 상당한 손실 또는 획득 없이 수행될 수 있는, 펩티드 내의 주어진 위치에서의 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 이러한 변화의 수행에서, 유사 아미노산 잔기의 치환은 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 그의 크기, 전하, 소수성, 친수성 등에 기초하여 수행될 수 있고, 이러한 치환은 통상적인 시험에 의해 펩티드 기능에 대한 그의 효과에 대해 검정될 수 있다. 역으로, 본원에서 사용되는 용어 "비-보존된 아미노산 치환"은 생물학적으로 동등하지 않은 폴리펩티드를 얻기 위해 펩티드의 기능의 상당한 손실 또는 획득을 야기하는, 펩티드 내의 주어진 위치에서의 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 치환을 지칭한다.

섬유는 식물 세포벽의 성분이고, 탄수화물 중합체 (예를 들어, 셀룰로스 (선형 글루코스 중합체 쇄)); 헤미셀룰로스 (예를 들어, 페놀성 분자가 부착된, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 람노스의 헤테로중합체의 분지쇄); 및 펙틴 (상이한 정도의 메틸화를 갖는, 갈락투론산, 자일로스, 아라비노스의 수용성 중합체)를 포함한다. 섬유는 또한 폴리페놀성 중합체 (예를 들어, 리그닌-유사 중합체 및 농축 탄닌)를 포함한다. 이론상으로는, ADF 섬유는 셀룰로스 및 리그닌으로 이루어진다. 농축 탄닌은 전형적으로 ADF 분획에 포함되어 있으나, 농축 탄닌 함량은 ADF와 관계 없이 다양하다. 대조적으로, TDF는 단백질, 가용성 물질 및 전분이 제거된 박(meal)이며, 불용성 세포벽 성분 (예를 들어, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 폴리페놀 및 리그닌)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물 (예를 들어, 어두운 색 종자 캐놀라 식물)의 종자는 캐놀라 품종과 비교하여 감소된 ADF를 가질 수 있다. 특정 예에서, 캐놀라박 (건조 물질 기준으로 오일 제거된 전체 종자)의 섬유 함량은 예를 들어 및 제한 없이 약 18％ 미만의 ADF (예를 들어, 약 18％ ADF, 약 17％ ADF, 약 16％ ADF, 약 15％ ADF, 약 14％ ADF, 약 13％ ADF, 약 12％ ADF, 약 11％ ADF 및 약 10％ ADF, 및/또는 약 22％ 미만의 NDF (예를 들어, 약 22.0％ NDF, 약 21％ NDF, 약 20％ NDF, 약 19％ NDF, 약 18％ NDF 및 약 17％ NDF)를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물의 종자는 표준 어두운 색 종자 캐놀라 품종과 비교하여 증가된 단백질 함량을 가질 수 있다. 특정 예에서, 캐놀라박 (건조 물질 기준으로 오일 제거된 전체 종자)의 단백질 함량은 예를 들어 및 제한 없이 약 45％ 초과 (예를 들어, 약 45％, 약 46％, 약 47％, 약 48％, 약 49％, 약 50％, 약 51％, 약 52％, 약 53％, 약 54％, 약 55％, 약 56％, 약 57％ 및 약 58％)의 조 단백질을 포함할 수 있다. 상이한 캐놀라 품종은 특정 단백질 함량을 특징으로 한다. 단백질 함량 (질소％ x 6.25)은 다양한 익히 공지되고 통상적인 분석 기술, 예를 들어, NIR 및 켈달법(Kjeldahl)을 이용하여 결정될 수 있다.

인 함량은 또한 일부 실시양태에서 캐놀라 품종의 종자, 식물 및 계통을 정의하는데 이용될 수 있다. 이러한 캐놀라 품종은 표준 캐놀라 품종으로부터 생산된 박과 비교하여 증가된 인 함량을 갖는 캐놀라박 (건조 물질 기준으로 오일 제거된 전체 종자)을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 캐놀라박은 1.2％ 초과, 1.3％ 초과, 1.4％ 초과, 1.5％ 초과, 1.6％ 초과, 1.7％ 초과 및/또는 1.8％ 초과의 인 함량을 포함할 수 있다.

상기 언급된 특성의 다양한 조합이 또한 확인될 수 있으며, 여러 실시예에 제공된 근교 캐놀라 계통 및 잡종으로 예시된다. 이들 계통은 광범위한 이로운 캐놀라 특징 및/또는 특성의 다양한 신규 조합을 제공하고 얻기 위해 본 발명의 생식질이 사용될 수 있다는 것을 예시한다. 예를 들어, 본 발명의 생식질을 포함하는 근교 캐놀라 계통은 본 발명의 생식질을 포함하는 근교 캐놀라 계통의 바람직한 종자 성분 특징을 도입하기 위해 원하는 특징 및/또는 특성을 포함하는 또 다른 캐놀라 계통과 교배될 수 있다. 종자 성분 (예를 들어, 섬유 함량, 글루코시놀레이트 함량, 오일 함량 등) 및 다른 식물 특성의 계산은 당업계에 공지되고 해당 산업에서 용인되는 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 친품종의 원하는 특징 및/또는 특성을 포함하는 교배로부터 자손 식물을 선택하고 전파시킴으로써, 특징 및/또는 특성의 원하는 조합을 포함하는 신규 품종을 생산할 수 있다.

V. 개선된 영양 특징을 갖는 캐놀라박

일부 실시양태는 상기 논의된 바와 같은 오일 및 박 특징을 갖는 캐놀라 종자를 포함하는 박을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태는 상기 논의된 바와 같은 특징 (예를 들어, 종자 성분)의 신규 조합을 포함하는 헥산-추출 공기-건조 캐놀라박 (백색 박편 또는 WF)을 포함한다. 특정 실시양태는 본 발명의 생식질을 포함하는 식물로부터 생산된 캐놀라 종자를 포함하는 박, 및 본 발명의 생식질을 포함하는 식물의 자손의 종자를 포함하는 박을 포함한다.

본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 근교 계통 및 잡종은 일부 실시양태에서 사료 또는 식품 성분으로서 직접 사용시 및/또는 단백질 단리물 및 농축물을 처리하기 위한 사료 스톡으로서 사용시 영양이 향상된 박 특성을 전달할 수 있다. 예를 들어, 이러한 캐놀라 근교 계통 및 잡종은 표준 캐놀라박보다 우수한 동물 사료 성능을 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐놀라박 성분 (및 이를 포함하는 동물 사료)는 단위 동물 (예를 들어, 돼지 및 가금류)에 양호한 영양을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 캐놀라박 성분 (및 이를 포함하는 동물 사료)가 반추 동물 (예를 들어, 소과 동물, 양, 염소, 및 반추류 아목의 다른 동물)에 양호한 영양을 제공하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 반추동물의 사료 공급은 특별한 문제 및 특별한 기회를 제공한다. 특별한 기회는 이들 동물의 반추위에서 특정 미생물에 의해 부서질 수 있으나 일반적으로 단위 포유동물, 예컨대 돼지에 의해 소화가능하지 않은, 불용성 셀룰로스성 섬유를 사용하는 반추동물의 능력으로부터 기인된다. 특별한 문제는 반추위에서 섬유의 소화를 억제하는 특정 사료의 성향으로부터, 그리고 특정 사료의 성분, 예컨대 지방 및 단백질 중 일부의 사용을 제한하는 반추위의 성향으로부터 유발된다.

오일-추출 브라시카 종자는 동물 사료에서 사용되는 고품질 단백질의 잠재적 공급원이다. 대두박 중 약 44 내지 48％와 비교하여, 오일 추출 후, 일용품 캐놀라박은 약 37％ 단백질을 포함하며, 이는 현재 광범위하게 사료 및 식품 목적에 바람직하다. 캐놀라에 함유된 단백질에는 메티오닌이 풍부하고 적절한 양의 라이신을 함유하며, 이들 둘 모두 대부분의 곡물 및 오일 종자 단백질 중 제한 아미노산이다. 그러나, 캐놀라박은 원치않는 구성성분, 예컨대 섬유, 글루코시놀레이트 및 페놀을 함유하기 때문에 특정 동물 사료에서 단백질 공급원으로서의 사용이 어느 정도 제한되어 왔다.

캐놀라가 유래된 평지씨의 한 영양적 측면은 글루코시놀레이트, 황-기재 화합물의 높은(30-55 μmol/g) 수준이다. 캐놀라 잎 또는 종자가 으스러지면, 글루코시놀레이트에 대한 미로시나제의 작용에 의해 이소티오시아네이트 에스테르가 생성된다. 이들 생성물은 티로이드에 의한 티록신의 합성을 억제하고, 다른 항대사 효과를 갖는다(문헌[Paul et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 72:706-9]). 따라서, 인간 식품 사용을 위해, 예를 들어, 평지씨박으로부터 유래된 단백질의 글루코시놀레이트 함량은 생성물 안전성을 제공하기 위해 감소되거나 제거되어야 한다.

예를 들어 유리한 오일 프로파일 및 함량 및 낮은 글루코시놀레이트 함량을 갖는 개선된 캐놀라 종자는 수소화에 대한 필요성을 유의하게 감소시킬 것이다. 예를 들어, 이러한 오일의 더 높은 올레산 및 더 낮은 α-리놀렌산 함량은 증가된 산화 안정성을 부여하여, 이에 의해 수소화에 대한 필요성 및 트랜스 지방산의 생성을 감소시킬 수 있다. 종자 글루코시놀레이트의 감소는 오일 중 잔류 황 함량을 유의하게 감소시킬 것이다. 황은 수소화를 위해 흔히 사용되는 니켈 촉매를 중독시킨다(문헌[Koseoglu et al., Chapter 8, in Canola and Rapeseed: Production, Chemistry, Nutrition, and Processing Technology, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y., 1990, pp. 123-48]). 또한, 낮은 종자 글루코시놀레이트를 갖는 캐놀라 품종으로부터의 오일은 수소화되는데 비용이 덜 들 것이다.

캐놀라박 중 페놀성 화합물은 쓴 향미를 주며, 이는 최종 단백질 생성물 중 어두운 색과 필연적으로 관련되어 있다고 여겨진다. 표준 캐놀라박에 다량 존재하는 종자 껍질은 인간 및 다른 단위 동물에서 소화불가능하고, 또한 보기 흉하게 불균일한 제품을 제공한다.

본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 식물에 의해 생산된 종자의 박 성분은 예를 들어 및 제한 없이 높은 단백질; 낮은 섬유; 더 높은 인; 및/또는 낮은 SAE를 가질 수 있다. 불용성 섬유 및 폴리페놀은 반영양소이고, 단백질 및 아미노산 소화를 손상시킨다. 따라서, 감소된 섬유 함량, 증가된 단백질 함량, 감소된 폴리페놀 함량 및 증가된 인 함량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종자 성분 특징을 갖는, 캐놀라박 및 캐놀라박을 포함하는 동물 사료가 일부 용도에서 바람직할 수 있다.

특정 예에서, 캐놀라박 (오일-무함유, 건조 물질 기준)은 약 45％ 이상 (예를 들어, 약 45％, 약 46％, 약 47％, 약 48％, 약 49％, 약 50％, 약 51％, 약 52％, 약 53％, 약 54％, 약 55％, 약 56％, 약 57％ 및 약 58％)의 단백질 함량을 포함할 수 있다.

본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 품종은 양호한 수율을 갖고, 참조 캐놀라 계통과 비교하여 훨씬 더 낮은 산성 세제 불용성 섬유 (ADF)를 갖는 종자를 생성할 수 있다. 본 발명의 생식질을 포함하는 식물 품종에 의해 생산된 종자의 성분에 대해 결정된 임의의 경험적 값이 일부 실시양태에서 식물 품종의 식물, 종자 및 오일을 정의하는데 사용될 수 있다. 일부 이러한 예에서, 결정된 값 중 임의의 값 초과, 미만 또는 그 사이의 범위를 정의하는데 종점으로서 특정 숫자가 사용될 수 있다. 오일 특징 및 다른 종자 성분에 대한 예시적 범위는 상기 기재되어 있다. 그의 식물의 계통 및 종자는 또한 이러한 범위들의 조합에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 특징적 섬유 수준, 폴리페놀 수준, 글루코시놀레이트 수준, 단백질 수준 및 인 수준과 함께 상기 논의된 오일 특징이 예를 들어 그의 특정 계통 및 종자를 정의하는데 사용될 수 있다.

상기 언급된 특징 (예를 들어, 종자 성분 특징) 모두가 일부 실시양태의 계통 및 종자를 정의하는데 필요하지는 않으나, 이러한 계통 및 종자 (예를 들어 및 제한 없이, 대사 에너지, 소화 에너지, 생물학적 에너지 및 순 에너지)를 정의하는데 추가 특징이 사용될 수 있다.

VI. 종자 색-독립적 방식으로 바람직한 종자 성분 특성을 부여하는 생식질을 포함하는 식물

본 발명의 생식질을 포함하는 특정 캐놀라 근교 계통 및 잡종의 바람직한 특성은 다른 유형의 브라시카 (종래의 육종 등을 통해), 예를 들어, 브라시카 라파(B. rapa) 및 브라시카 준세아(B. juncea)로 전이될 수 있으며, 생성된 식물은 종자 색과 관계 없이 발현되는 원하는 특징 (예를 들어, 종자 성분 특징)을 갖는 종자를 생산한다. 따라서, 본 발명의 생식질을 포함하는 특정 캐놀라 근교 계통 또는 잡종의 하나 이상의 바람직한 특성이 전이된 브라시카 품종은 황색 종자 또는 어두운 색 종자인 원하는 특징을 갖는 종자를 생산할 수 있다. 이러한 신규 또는 변형된 브라시카 품종의 박 및 종자는 감소된 수준의 종자 섬유, 증가된 단백질 수준, 증가된 수준의 인 및/또는 감소된 수준의 폴리페놀을 가질 수 있다.

일부 실시양태는 본원에 기재되고 예시된 바와 같은 생식질을 포함하는 캐놀라의 황색 및 어두운 색 종자뿐만 아니라, 이러한 종자로부터 성장된 또는 이와 달리 생산된 식물, 및 본 캐놀라 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 예시된 계통 및 잡종이 유전자 조작 없이 및 돌연변이유발 없이 얻어졌고, 이에 의해 신규 및 변형된 캐놀라 품종의 생산에서의 생식질의 유용성을 입증한다.

일부 특정 실시양태에서, 특정 예시적 캐놀라 근교 계통 및 잡종이 제공된다. 이러한 개시물의 일부로서, CL065620, CL044864, CL121460H, CL166102H 및 CL121466H 각각의 2500개 이상의 종자가 기탁되었고, 특허권을 조건으로, 그러나 그 외에는 제한 없이 (37 C.F.R. § 1.808(b)에 의해 분명히 허용된 제한을 제외함) 미국 20852 메릴랜드주 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로 대중에게 입수가능하게 되었다. 기탁물은 ATCC 기탁 번호 PTA-11697, PTA-11696, PTA-11698, PTA-12570 및 PTA-11699로 각각 지정되었으며, 기탁일은 PTA11696 내지 PTA11699의 경우 2011년 2월 22일 및 PTA-12570의 경우 2012년 2월 21일이다. 기탁물은 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 상기 기재된 바와 같이 30년 또는 가장 최근 요청 후 5년의 기간 동안, 또는 특허의 존속기간 동안, 이중에서 더 긴 기간 동안 유지될 것이고, 기탁물은 상기 기간 동안 생존불가능하게 되면 대체될 것이다.

일부 실시양태는 본원에 개시된 브라시카 나푸스 품종 중 임의의 것의 종자를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 이러한 종자에 의해 생산된 브라시카 나푸스 식물, 및 또한 이러한 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 이러한 조직 배양물로부터 재생된 브라시카 나푸스 식물이 또한 포함된다. 특정 실시양태에서, 이러한 식물은 예시된 품종의 형태학적 및 생리학적 특성 모두를 발현할 수 있다. 특정 실시양태의 브라시카 나푸스 식물은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 식별가능한 생리학적 및/또는 형태학적 특징을 가질 수 있다.

상기 기재된 종자의 자손의 하나 이상의 양친에서 본 발명의 생식질 (예를 들어, 본원에 제공된 예시적 캐놀라 근교 계통 및 잡종에서 발견되는 바와 같음)을 이용하여 교배하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태는 양친의 하나 또는 둘 모두로서 본원에 예시된 식물 중 임의의 것을 갖는 F₁ 잡종 브라시카 나푸스 식물을 포함한다. 추가 실시양태는 이러한 F₁ 잡종에 의해 생산되는 브라시카 나푸스 종자를 포함한다. 특정 실시양태에서, F₁ 잡종 브라시카 나푸스 종자를 생산하는 방법은 예시된 식물을 상이한 근교 양친 캐놀라 식물과 교배하고, 얻어진 잡종 종자를 수확하는 것을 포함한다. 본 발명의 캐놀라 식물 (예를 들어, 양친 캐놀라 식물, 및 F₁ 잡종을 생산하기 위한 이러한 방법에 의해 생산된 캐놀라 식물)은 자성 또는 웅성 식물일 수 있다.

일부 실시양태에서 캐놀라 식물의 특징 (예를 들어, 오일 및 단백질 수준 및/또는 프로파일)은 본 발명의 식물을 변형된 특징 (예를 들어, 높은 오일 및 단백질 수준)을 갖는 또 다른 계통과 교배함으로써 추가로 변형 및/또는 개선될 수 있다. 마찬가지로, 양친 식물을 주의 깊게 고려하여 다른 특징을 개선할 수 있다. 본 발명의 생식질을 포함하는 캐놀라 계통은 그의 바람직한 종자 성분 특징을 다른 평지 또는 캐놀라 계통으로 종자 색-독립적 방식으로 교배하는데 이로울 수 있다. 본 발명의 생식질은 타가수분 및 자손의 선택을 포함하는 종래의 식물 육종 기술에 의해 이들 특성이 동일한 종 내의 다른 식물로 전이되도록 한다. 일부 실시양태에서, 원하는 특성은 화분 전이 및 선택을 수반하는 종래의 식물 육종 기술을 이용하여 종 간에 전이될 수 있다(예를 들어, 문헌[Brassica crops and wild allies biology and breeding, Eds. Tsunada et al., Japan Scientific Press, Tokyo (1980)]; [Physiological Potentials for Yield Improvement of Annual Oil and Protein Crops, Eds. Diepenbrock and Becker, Blackwell Wissenschafts-Verlag Berlin, Vienna (1995)]; [Canola and Rapeseed, Ed. Shahidi, Van Nostrand Reinhold, N.Y. (1990)]; 및 [Breeding Oilseed Brassicas, Eds. Labana et al., Narosa Publishing House, New Dehli (1993)] 참조).

일부 실시양태에서, 종자 색-독립적 방식으로 하나 이상의 바람직한 종자 성분 특징을 전이하는 방법은 종간 교배 후 F₁ 세대의 구성원을 자가수분하여 F₂ 종자를 생산하는 것을 포함한다. 그 후, 역교배를 수행하여 원하는 종자 성분 특징(들)을 나타내는 계통을 얻을 수 있다. 또한, 원형질체 융합 및 핵 이식 방법이 한 종으로부터 또 다른 종으로 특성을 전이시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ruesink, "Fusion of Higher Plant Protoplasts," Methods in Enzymology, Vol. LVIII, Eds. Jakoby and Pastan, Academic Press, Inc., New York, N.Y. (1979)] 및 그 문헌에 인용된 참고자료; 및 문헌[Carlson et al. (1972) Proc. Natl. Acad Sci. USA 69:2292] 참조).

본 발명의 생식질을 포함하는 예시적 캐놀라 계통을 수득하고 생산하면, 어두운 색 종피는 상기 기재된 바와 같이 종래의 식물 육종 기술에 의해 바람직한 종자 성분 특징과 함께 다른 브라시카 종으로 용이하게 전이될 수 있다. 예를 들어, 어두운 색 종피는 본 발명에 이르러 바람직한 종자 성분 특징과 함께 상업적으로 입수가능한 브라시카 라파 품종, 예를 들어 및 제한 없이 토빈(Tobin), 호리즌(Horizon) 및 콜트(Colt)로 용이하게 전이될 수 있다. 어두운 종자 색이 종자의 다른 특징과 함께 전이되어야 하는 것은 아니라고 이해된다.

예시적 품종 중 하나를 출발점으로서 고려해 볼 때, 품종에 의해 제공되는 특정 유익은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 수많은 방법으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 품종에 존재하는 종자 오일 프로파일은 타가수분 및 자손의 선택을 수반하는 종래의 식물 육종 기술에 의해 다른 작물학상 바람직한 브라시카 나푸스 품종에 전이될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 예시적 품종의 생식질은 다른 작물학상 바람직한 품종에 혼입된다.

특정 실시양태는 브라시카 나푸스의 예시적 품종뿐만 아니라, 본질적으로 예시된 품종 중 하나 이상의 품종으로부터 유도된 본질적 유도 품종을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시양태는 하나 이상의 예시된 품종, 이러한 필수적 유래 품종의 식물, 및/또는 이로부터 생산된 식물 또는 조직 (화분, 종자 및 세포를 포함함)으로부터 재생된 평지 식물을 포함할 수 있다.

재생할 수 있는 식물 물질, 예를 들어, 종자, 소포자, 밑씨, 화분, 식물생장 부분 및 소포자가 선택될 수 있다. 일반적으로, 이러한 식물 세포는 원하는 작물학적 특성을 갖는 품종을 포함하는 브라시카의 임의의 품종으로부터 선택될 수 있다.

재생 기술은 당업계에 공지되어 있다. 선택된 식물 또는 품종으로부터 재생할 수 있는 세포 (예를 들어, 종자, 소포자, 밑씨, 화분 및 식물생장 부분)를 초기에 선택할 수 있다. 이들 세포는 임의로 돌연변이유발로 처리될 수 있다. 그 후, 식물은 세포의 유형 (및 돌연변이 유발 여부)에 기초하여 재생, 수정 및/또는 성장 기술을 이용하여 세포로부터 발달될 수 있다. 식물 또는 종자, 또는 그의 부분의 조작은 본질적 유도 품종의 생성에 이르게 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 생식질을 포함하는 식물에 의해 나타나는 원하는 종자 성분 특징은 원하는 종자 성분 특징 및 다수의 바람직한 특성 둘 모두를 갖는 식물을 생산하기 위해 종자 색-독립적 방식으로 다수의 추가 바람직한 특성을 포함하는 식물에 도입될 수 있다. 원하는 종자 성분 특징을 종자 색-독립적 방식으로 하나 이상의 바람직한 특성을 포함하는 식물에 도입하는 방법은 이들 특성의 "스태킹(stacking)"이라고 지칭된다. 일부 예에서, 다수의 바람직한 특성과 원하는 종자 성분 특징의 스태킹은 종자 성분 특징의 추가 개선에 이르게 할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 바람직한 특성과 원하는 종자 성분 특징의 스태킹은 하나 이상 (예를 들어, 전부)의 다수의 바람직한 특성 이외에 원하는 종자 성분 특징을 갖는 캐놀라 식물에 이르게 할 수 있다.

원하는 종자 성분 특징과의 조합에 바람직할 수 있는 특성의 예는 예를 들어 및 제한 없이 다음을 포함한다: 식물 질환 내성 유전자 (예를 들어, 문헌[Jones et al. (1994) Science 266:789] (클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 내성을 위한 토마토 Cf-9 유전자); [Martin et al. (1993) Science 262:1432] (슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae)에 대한 내성을 위한 토마토 Pto 유전자); 및 [Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089] (슈도모나스 시린가에에 대한 내성을 위한 RSP2 유전자) 참조); 해충에 대해 내성을 부여하는 유전자; 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체 또는 그 위에 모델링된 합성 폴리펩티드 (예를 들어, 문헌[Geiser et al. (1986) Gene 48:109] (Bt δ-내독소 유전자; δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터, 예를 들어 ATCC 접속 번호 40098; 67136; 31995; 31998 하에 구매할 수 있음) 참조); 렉틴 (예를 들어, 문헌[Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25] (클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자) 참조); 비타민-결합 단백질, 예를 들어, 아비딘 (국제 PCT 공개 제US93/06487호 (곤충 해충에 대한 유충살충제로서 아비딘 및 아비딘 유사체의 용도) 참조); 효소 억제제; 프로테아제 또는 프로테이나제 억제제 (예를 들어, 문헌[Abe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16793] (쌀 시스테인 프로테이나제 억제제); [Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985] (담배 프로테이나제 억제제 I; 및 미국 특허 제5,494,813호); 아밀라제 억제제 (문헌[Sumitani et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243] (스트렙토미세스 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) 알파-아밀라제 억제제) 참조); 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예를 들어, 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 그의 변이체, 이를 기초로 하는 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제(agonist) (예를 들어, 문헌[Hammock et al. (1990) Nature 344:458] (유충 호르몬의 불활성화물질) 참조); 영향받은 해충의 생리를 방해하는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 (예를 들어, 문헌[Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9] (곤충 이뇨제 호르몬 수용체); [Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243] (디플롭테라 푼타타(Diploptera puntata)로부터의 알로스타틴); 미국 특허 제5,266,317호 (곤충-특이적 마비성 신경독소) 참조); 천연에서 뱀, 말벌 또는 다른 생물체에 의해 생성되는 곤충-특이적 독 (예를 들어, 문헌[Pang et al. (1992) Gene 116:165] (전갈 곤충독성 펩티드) 참조); 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과다축적의 원인인 효소; 생물학적으로 활성인 분자의 번역후 변형을 포함하는 변형에 관여된 효소, 예를 들어, 당분해 효소; 단백질분해 효소; 지질분해 효소; 뉴클레아제; 시클라제; 트랜스아미나제; 에스테라제; 히드롤라제; 포스파타제; 키나제; 포스포릴라제; 폴리머라제; 엘라스타제; 키티나제; 또는 글루카나제 (천연 또는 합성) (국제 PCT 공개 제WO 93/02197호 (칼라제 유전자) 참조); 키티나제-코팅 서열을 함유하는 DNA 분자 (예를 들어, ATCC로부터 접속 번호 39637 및 67152 하에); 문헌[Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691] (담배 박각시 키티나제); 및 [Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673] (파르슬리 유비4-2 폴리유비퀴틴 유전자); 신호 도입을 자극하는 분자 (예를 들어, 문헌[Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757] (칼모듈린); 및 [Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467] (옥수수 칼모듈린) 참조); 소수성 모멘트 펩티드 (예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO 95/16776호 (진균 식물 병원체를 억제하는 타키플레신의 펩티드 유도체); 및 국제 PCT 공개 제WO 95/18855호 (질환 내성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드) 참조); 막 투과효소, 채널 형성제 또는 채널 차단제 (예를 들어, 문헌[Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43] (트랜스제닉 식물에 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 내성을 부여하는 세크로핀-β 용해성 펩티드 유사체) 참조); 바이러스-침윤성 단백질 또는 이로부터 유래된 복합 독소 (예를 들어, 문헌[Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451] (알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대한 코트 단백질-매개 내성) 참조); 곤충-특이적 항체 또는 이로부터 유래된 면역독소 (예를 들어, 문헌[Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)] (단일쇄 항체 절편의 생성을 통한 효소적 불활성) 참조); 바이러스-특이적 항체 (예를 들어, 문헌[Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469] (바이러스 공격으로부터의 보호를 위한 재조합 항체 유전자) 참조); 천연에서 병원체 또는 기생충에 의해 생성되는 발달-저지 단백질 (예를 들어, 문헌[Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436] (식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균 군체형성 및 식물 영양소 방출을 촉진하는 진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락투로나제); [Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367] (엔도폴리갈락투로나제-억제성 단백질) 참조); 및 천연에서 식물에 의해 생성되는 발달-저지 단백질 (예를 들어, 문헌[Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305] (진균성 질환에 대해 증가된 내성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자) 참조).

원하는 종자 성분 특징과 조합하여 바람직할 수 있는 특성의 추가 예는 예를 들어 및 제한 없이 다음을 포함한다: 제초제에 대해 내성을 부여하는 유전자 (문헌[Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241] (돌연변이체 ALS 효소); 문헌[Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449] (돌연변이체 AHAS 효소); 미국 특허 제4,940,835호 및 제6,248,876호 (글리포세이트 내성을 제공하는 돌연변이체 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 유전자); 미국 특허 제4,769,061호 및 ATCC 접속 번호 39256 (aroA 유전자); 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(글리포세이트 내성); 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함하는 스트렙토미세스(Streptomyces) 종으로부터의 다른 포스포노 화합물, 예컨대, 유럽 출원 제0 242 246호 및 문헌[DeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61] (글리포세이트 내성을 제공하는 글루포시네이트 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자)에 기재된 것); 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (글리포세이트 내성); 유럽 특허 출원 제0 333 033호 및 미국 특허 제4,975,374호 (제초제, 예컨대 L-포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 글루타민 신테타제 유전자); 문헌[Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435] (페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 내성을 제공하는 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자); 제WO 2005012515호 (글리포세이트 내성을 제공하는 GAT 유전자); 제WO 2005107437호 (2,4-D, 포프 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자); 및 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자) (예를 들어, 문헌[Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169] (돌연변이체 psbA 유전자); 미국 특허 제4,810,648호에 개시된 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열, 및 ATCC 접속 번호 53435, 67441 및 67442 하에 입수가능한 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자; 및 문헌[Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173] (글루타티온 S-트랜스퍼라제) 참조).

원하는 종자 성분 특징과의 조합에 바람직할 수 있는 특성의 추가 예는 예를 들어 및 제한 없이, 값-추가된 특성, 예를 들어, 변형된 지방산 대사를 부여하거나 이에 기여하는 유전자 (예를 들어, 문헌[Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624] (식물의 스테아르산 함량을 증가시키는 스테아릴-ACP 데사투라제의 안티센스 유전자) 참조); 감소된 피테이트 함량 (예를 들어, 문헌[Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87] (아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자는 형질전환된 식물에 더 많은 유리 포스페이트를 첨가하는 피테이트의 붕괴를 향상시킴); 및 [Raboy et al. (1990) Maydica 35:383] (낮은 수준의 피트산을 갖는 옥수수 돌연변이체의 원인인 대립 유전자와 관련된 DNA의 클로닝 및 재도입) 참조); 및 예를 들어, 전분의 분지 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 식물을 형질전환시킴으로써 수행된 변형된 탄수화물 조성물 (예를 들어, 문헌[Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810] (스트렙토코쿠스(Streptococcus) 돌연변이체 프룩토실트랜스퍼라제 유전자); [Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220] (레반수크라제 유전자); [Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292] (α-아밀라제); [Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515] (토마토 인버타제 유전자); [Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480] (보리 α-아밀라제 유전자); 및 [Fisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045] (옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II) 참조)를 포함한다.

본원에서 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 이전 그의 개시에 대해서만 제공된다. 본 발명자들이 이전 발명 때문에 이러한 개시를 선행할 자격이 부여되지 않는다는 허락으로서 본원에서 해석되지 않는다.

이하 실시예는 청구된 발명의 특정한 특징 및/또는 측면을 제공하기 위한 것이다. 이들 실시예가 본 개시물을 기술된 특정한 특징 또는 측면으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 향상된 캐놀라박(ECM) 및 기존의 캐놀라박의 평균 영양 조성 및 영양가

본 발명의 ECM 계통 및 잡종의 영양 조성 및 영양가를 평가하기 위한 여러 분석 연구 및 관능 연구가 2009년에서 2012년 사이에 수행되었다. 영양 조성 및 영양가에 대해 가능한 가공의 효과를 알아보기 위해 가공되지 않은 종자, 부분적으로 가공된 박 및 완전히 가공된 박에 대해 시험을 수행하였다. 일리노이 대학, 미주리 대학, 조지아 대학 및 매니토바(Manitoba) 대학에서 샘플을 분석하였다. 조성 정보를 사용하여 표준 예측 공식으로 기존의 캐놀라박 대비 향상된 캐놀라박의 에너지 값을 추정하였다. 가금류 에너지 및 아미노산 소화율에 대한 샘플의 생물학적 평가를 일리노이 대학 및 조지아 대학에서 행하였다. 돼지 에너지 및 아미노산 소화율에 대한 샘플의 생물학적 평가를 일리노이 대학에서 행하였다. ECM 계통(범위 또는 평균)과 기존의 캐놀라박 간의 영양소 조성 차이의 요약이 표 1에 나타나 있다. 관련된 절차 및 연구에 대한 자세한 사항은 이어지는 실시예에서 약술된다.

<표 1>

ECM 계통은 동물 사료 공급에 가치가 있는, 영양소 조성에서의 여러 뚜렷한 개선을 나타낸다. 표 1에서 예시한 바와 같이, ECM은 기존의 캐놀라박보다 단백질이 대략 7％ 더 높다. 또한, 더 높은 수준에서 필수 아미노산들의 균형(단백질의 백분율로서)이 유지된다. ECM의 아미노산의 가금류 및 돼지에 의한 소화율은 적어도 기존의 캐놀라박만큼 우수하고, 중요한 아미노산인 라이신은 약간 더 높은 소화율을 가지는 것으로 나타난다. ECM 계통은 세포벽 및 외피에서 발견되는 섬유 성분이 더 낮은 수준이고, 구체적으로 리그닌/폴리페놀은 대략 2％ 더 낮은 수준으로, 셀룰로스는 1％ 더 낮고, ADF 잔여물(3％)은 3％ 더 낮고 ADF 수준은 5％ 더 낮게 나타났다.

더 높은 수준의 단백질과 더 낮은 수준의 섬유 성분은 ECM 계통의 대략 10％ 증가된 생물학적 에너지와 상관관계가 있다. 이들 계통은 또한 동물 사료에 첨가하기에는 비싼 인을 더 높은 수준으로 나타내었다. 더 높은 수준의 단백질(아미노산), 에너지 및 인은 육계(broiler) 및 돼지(hog) 사료에서 증가된 기회 비용으로 반영된 바와 같이, 돼지 및 가금류 사료에서의 캐놀라박에 대해 대략 20-32％ 증가값($/t)과 연관되었다(표 1).

실시예 2: POS 백색 박편(WF), LT 및 HT박 공정

ECM 종자 및 기존의 캐놀라 종자를 다음 과정에 따라 캘리포니아 새스커툰(Saskatoon)에 있는 POS 파일럿 공장에서 가공하였다.

재료

대략 1.5 MT의 ECM 시험 계통(CL44864) 캐놀라 종자를 2011년 8월 2일에 POS에서 얻었다. 대략 3.0 MT의 상품 등급 캐놀라 종자를 2011년 8월 3일에 POS에서 얻었다. 주요 재료에 대한 공급원은 다음과 같다.

헥산/이소-헥산: 유니바(Univar), 캐나다 서스캐처원주 새스커툰.

하이플로 슈퍼-셀(Hyflo Super-cel) 여과 조제: 맨빌 프로덕츠 코포레이션(Manville Products Corp.), 미국 콜로라도주 덴버.

질소: 에어 리퀴드(Air Liquide), 캐나다 서스캐처원주 새스커툰.

여과포, 모노필라멘트: 포리츠 앤 스펜서(Porritts and Spensor), 캐나다 퀘벡주 포인트 클레어.

여과지, 55 lb 황갈색 형(tan style) 1138-55: 포리츠 앤 스펜서, 포인트 클레어, 퀘백 주(PQ).

방법 - 파일럿 공장 가공

각 캐놀라 품종 간에, "초기" 가공 공장의 모든 설비를 진공청소 또는 쓸어서 청소하였다. 가연성, 추출기는 시험 사이에 중단하지 않았다. 그러나, 캐놀라 품종 사이에 설비를 비우기 위해 추출기 체인, 슈넥켄(Schnecken) 및 용매 회수 시스템은 계속 구동시켰다. 진공을 중단하지 않아서, 모든 증기가 응축기에 보내지고, 응축되어 용매 작업 탱크 내로 배출되었다. 이는 물이 슈넥켄 내에서 응축되고 컨베이어를 막는 것을 방지하였다. 캐놀라 샘플을 다음의 순서로 압착하고/추출하였다.

1. 대조군 HT

2. 대조군 LT

3. ECM 시험 계통 (CL44864) LT

박편화

종자를 일련의 매끄러운 롤러를 통과시켜 유세포를 파열시키고, 증해(cooking)/선압착을 위한 넓은 표면적을 가진 얇은 박편을 제조하기 위해 박편화를 수행한다. 생산되는 미세분의 수량을 최소화하도록 박편 두께와 수분이 조절된다. 높은 미세분 수준은 열악한 용매 침투 특성을 가진 압착-케이크를 생성한다.

캐놀라 종자는 최소의 롤 간격 세팅을 사용하여 박편화된다. 각 로트의 박편 두께 범위는 다음과 같다.

1. 대조군 HT 0.21 - 0.23 mm

2. 대조군 LT 0.19 - 0.23 mm

3. ECM 시험 계통 (CL44864) LT 0.21 - 0.23 mm

공급 속도는 압착 속도에 의해 조절되었고 대략 133-150 kg/hr이었다.

박편기: 라우호프 코포레이션(Lauhoff Corporation)에 의해 제작된 14" 직경 x 28" 폭 라우호프 플레이크마스터 플레이킹 밀(Flakmaster Flaking Mill) 모델 S-28, 일련번호 7801.

증해 (컨디셔닝)

유세포를 더 파열시키고, 박편을 유연하게 만들고, 함유된 오일의 점도를 낮춤으로써 배출기의 효율을 증가시키기 위해 증해를 한다. 또한 종자 내의 효소를 비활성화하기 위해 증해를 한다. 각 구동의 시작 전에 증해기를 예열한다. 소기의 박편 온도를 유지하기 위해 구동하면서 증기압을 조절하였다.

대조군 HT 로트의 트레이의 온도는 다음과 같았다.

상단 트레이 60±5℃

하단 트레이 97±3℃

대조군 LT 로트와 ECM 시험 계통(CL44864)에 대한 트레이 온도는 다음과 같았다.

상단 트레이 60±5℃

하단 트레이 93±2℃

증해기: 2 트레이 사이먼-로즈다운(Simon-Rosedown) 증해기를 사용하였다. 각 구획은 높이 36 cm (사용 높이 21 cm) 및 직경 91 cm이었고, 재료 교반을 위한 교반 암(sweeping arm)을 가진다. 건조 가열을 위해 자킷에 증기를 사용하였고; 또한 용기 내용물에 직접 증기가 첨가될 수도 있다. 직접 공급을 위해 증해기를 나사 압착기 상에 올려두었다.

압착

압착은 대략 2/3의 오일을 제거하고, 용매 추출에 적합한 압착케이크를 생성한다. 압착케이크는 추출기 내에서 견디기 위한 분쇄 저항성 및 우수한 물질 전달 및 배출을 위한 다공성을 필요로 한다. 박편화되고 증해된 종자를 사이먼-로즈다운 선-압착기를 사용하여 압착하였다.

조 압착 오일을 탱크 내에 수집하였다.

선-압착기: 사이먼-로즈다운 직경 9.5 cm, 길이 94 cm 나사 압착기. 작동 나사 속도 17 rpm이 사용되었다.

용매 추출 및 탈용매화

용매 추출은 압착 케이크를 헥산과 접촉시켜서 압착 케이크로부터 오일을 제거하는 것이다. 오일을 용매 내로 걸러내는 것과 찌꺼기(헥산-고체)를 점진적으로 더 약한 혼합물(헥산-오일)로 세정하는 두 개의 메커니즘을 사용하였다. 추출은 보통 지속적인 반대-흐름 과정이다.

총 체류 시간 대략 90 분(루프 유입에서 루프 유출까지), 용매 대 고체 비율 대략 2.5:1 (w:w) 및 혼합물 온도 52 ± 5℃를 사용하여 캐놀라 대조군 HT 압착 케이크를 이소-헥산/헥산 추출하였다(캐놀라 압착 케이크 공급 속도는 90 분 체류 시간에서 대략 90 kg/hr이었고, 용매 유속은 220 ± 10 kg/hr이었다).

상품용 캐놀라 백색 박편(WF) 샘플을 회수한 후 탈용매화 및 통풍 건조하였다.

조 오일을 상승 박막식 증발기 및 증기 스트리퍼(stripper)에서 탈용매화하였다.

찌꺼기(헥산-고체)의 탈용매화를 증기-재킷형 슈넥켄 스크류 및 2-트레이 탈용매기-토스터(toaster)에서 행하였다. 살포 증기를 상단 DT 트레이에 첨가하였다. 트레이 내의 목표 온도는 다음과 같았다.

슈넥켄 출구: <60℃

탈용매화된 트레이: 102±3℃

토스팅 트레이: 102±3℃

총 체류 시간 대략 110 분(루프 유입에서 루프 유출까지), 용매 대 고체 비율 대략 2.5:1 (w:w) 및 혼합물 온도 52 ± 5℃를 사용하여 캐놀라 대조군 LT 및 ECM 시험 계통(CL44864) LT 로트 압착 케이크를 이소-헥산/헥산 추출하였다(캐놀라 압착 케이크 공급 속도는 110 분 체류 시간에서 대략 80 kg/hr이었고, 용매 유속은 220 ± 10 kg/hr이었다).

ECM 시험 계통 백색 박편(WF) 샘플을 회수한 후 탈용매화 및 통풍 건조하였다.

조 오일을 상승 박막식 증발기 및 증기 스트리퍼에서 탈용매화하였다.

찌꺼기(헥산-고체)의 탈용매화를 증기-재킷형 슈넥켄 스크류 및 2 트레이 탈용매기-토스터에서 행하였다. 살포 증기를 상단 DT 트레이에 첨가하였다. 트레이 내의 목표 온도는 다음과 같았다.

슈넥켄 출구: <60℃

탈용매화된 트레이: 93±2℃

토스팅 트레이: 93±2℃

추출기: 전부 스테인레스 크라운 아이런 웍스 루프 추출기(Crown Iron Works Loop Extractor) (유형 II). 추출층은 폭 20.3 cm x 12.7 cm 깊이 x 길이 680 cm이었다. 또한, 공정은 상승 박막식 증발기 및 증기 스트리퍼를 사용하는 혼합물 탈용매화 및 증기 재킷형 슈넥켄 스크류 및 2 트레이 탈용매기-토스터를 사용하는 찌꺼기(고체와 용매) 탈용매화를 포함한다. 회수된 용매를 수집하고 재순환하였다.

진공 건조

탈지된 LT 캐놀라박을 진공 건조하여 <12％ 수분으로 건조시켰다.

건조가 필요한 유일한 탈지된 캐놀라박 로트는 대조군 LT 로트이었다. 탈지된 박 대략 225 kg을 리틀포드 반응기 건조기(Littleford Reactor Dryer)에 적재하였다. 이어서 박을 10-15" HG의 진공 하에서 75 ± 2℃로 가열하였다. 수분 분석을 위한 박의 샘플 채취를 ~60℃에서 시작하여 수분이 <12％일 때까지 매 15 분마다 하였다. 이어서 박을 벌크 색(bulk sack)으로 배출시켰다. 상기 과정을 모든 박이 건조될 때까지 반복하였다.

진공 건조기: 600 리터 모델 FKM600-D (2Z) 리틀포드 반응기, 일련번호 5132, 리틀포드 데이(Littleford Day), 플로렌스(Florence), 켄터키(KY).

해머 분쇄

해머 분쇄를 수행하여 균일한 입자 크기를 만들었다.

건조된 박을 8/64" 스크린을 사용하여 해머-분쇄하였다. 각 박의 로트 사이에 해머 분쇄기를 진공-청소하였다. 박을 화이버 드럼 내에 패키징하고, 선적 전까지 상온에서 보관하였다.

캐놀라박을 해머 분쇄하는 순서는 다음과 같았다.

1. 대조군 HT

2. ECM 시험 계통 (CL44864) LT

3. 대조군 LT

해머 분쇄기: 프라터 인더스트리즈(Prater Industries), 모델 G5HFSI, 일련번호 5075, 시카고, 일리노이

실시예 3: 인디애나폴리스 백색 박편 공정

문헌[Bailey's Industrial Oil ＆ Fat Products (1996), 5th Ed., Chapter 2, Wiley Interscience Publication, New York, New York]에 최초 기재된 과정을 사용하여 본 발명의 캐놀라 종자를 가공하여 캐놀라 백색 박편을 생산할 수 있다.

캐놀라 종자로부터 오일을 추출하기 위해, 캐놀라 종자를 커피 분쇄로 먼저 박편화하고 20 분 이상 동안 85℃± 10℃로 오븐에서 열처리하였다. 열 처리 후에, 분쇄된 종자를 타비 압착기(Taby Press) 유형-20A 압착기(타비 스켑스타(Taeby Skeppsta), 외레브로(Oerebro), 스웨덴)를 사용하여 압착한다. 타비 압착기로부터 생성된 압착케이크를 용매 추출하여 임의의 남아있는 잔류 오일을 제거한다.

이어서 오일 종자 압착 단계로부터의 압착케이크를 용매 추출하여 임의의 남아있는 잔류 오일을 제거하고 수집한다. 압착케이크를 라살 글래스웨어(LaSalle Glassware) (?악?, 온타리오)의 주문 제작된 속실렛(Soxhlet)™ 추출기 내에 있는 스테인레스 스틸 팀블에 두었다. 헥산을 추출 용매로 사용할 수 있고, 속실렛™ 추출기 시스템을 9-10 시간 동안 작동하도록 둔다. 이어서 용매 추출된 압착케이크를 팀블로부터 제거하고, 1 인치 미만의 케이크 두께로 트레이에 펼친다. 용매 추출된 케이크를 분쇄 전에 24 시간 동안 통풍 탈용매화하도록 둔다. 이어서 탈용매화된 백색 박편을 예를 들어, 로봇 쿠페 R2N 울트라 B(Robot Coupe R2N Ultra B)(잭슨(Jackson), 미시시피)를 사용하여 분쇄한다.

실시예 4: 샘플 분석

ECM 및 기존의 캐놀라 샘플의 화학적 및 영양소 분석은 이하 약술된 바와 같은 방법을 사용하여 다양하게 수행될 수 있다. 캐놀라박 샘플을 건조물(방법 930.15; 문헌[AOAC International. 2007. Official Methods. Of Analysis of AOAC Int. 18th ed. Rev. 2. W. Hortwitz and G. W. Latimer Jr., eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD.](본원에서 이하 "AOAC Int., 2007")), 회분(방법 942.05; AOAC Int.) 및 봄베 열량계(모델 6300, 파르 인스트루먼츠(Parr Instruments), 몰린(Moline), 일리노이)에 의한 GE에 대해 분석하였다. 문헌[AOAC International (2007) Official Methods of Analysis of AOAC Int., 18th ed. Rev. 2., Hortwitz and Latimer, eds. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., Gaithersburg. MD]. 산 가수분해된 에테르 추출물(AEE)을, 3N HCl(샌더슨(Sanderson))을 사용한 산 가수분해에 이어서 속테크(Soxtec) 2050 자동화 분석기(포스 노스 아메리카(FOSS North America), 에덴 프레리(Eden Prairie), 미네소타) 상에서 석유 에테르(방법 954.02; AOAC Int.)를 사용하여 조 지방 추출로 측정하였다. 문헌[Sanderson (1986), "A new method of analysis of feeding stuffs for the determination of crude oils and fats," Pages 77-81, in Recent Advances in Animal Nutrition, Haresign and Cole, eds. Butterworths, London, U.K]. 조 단백질을 엘레멘타르 래피드 N-큐브(Elementar Rapid N-cube) 단백질/질소 기구 (엘레멘타르 아메리카스 인크(Elementar Americas Inc.), 마운트 로럴(Mt. Laurel), 뉴저지) 상에서 연소에 의해 측정하였고; 아미노산은 방법 982.30 E (A, B 및 C) [AOAC Int.]에 따라서; 조 섬유는 방법 978.10 (AOAC Int.)에 따라서; ADF 및 리그닌은 방법 973.18 (AOAC Int.)에 따라서; 및 NDF는 홀스트(Holst) (문헌[Holst, D. O. 1973. Holst filtration apparatus for Van Soest detergent fiber analysis. J. AOAC. 56:1352-1356])에 따라서 측정하였다. 당 프로파일(글루코스, 프럭토스, 수크로스, 락토스, 말토스)은 ??스(Churms) (문헌[Churms, 1982, Carbohydrates in Handbook of Chromatography. Zweig and Sherma, eds. CRC Press, Boca Raton, FL.]) 및 카케히(Kakehi)와 혼다(Honda) (문헌[1989. Silyl ethers of carbohydrates. Page 43-85 in Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. C. J. Biermann and G. D. McGinnis, eds. CRC Press, Boca Raton, FL])에 따랐다. 올리고당(라피노스, 스타키오스(stachyose), 버바스코스(verbascose))을 ??스에 따라 분석하였고; 무기질(Ca, P, Fe, Mg, Mn, Cu, Na, K, S, Mo, Zn, Se, Co, Cr)은 유도 결합 플라즈마-발광 광도분석기(Inductive Coupled Plasma-Optical Emission Spectoscopy, ICP-OES) [방법 985.01 (A, B 및 C); AOAC Int.]를 통해, 그리고 피테이트(phytate)는 엘리스(Ellis) 등 (문헌[1977. Quantitative determination of phytate in the presence of high inorganic phosphate. Anal.Biochem. 77:536-539])을 따라 분석하였다.

실시예 5: ECM 인디애나폴리스 백색 박편 샘플 및 기존의 캐놀라박에 대한 기준치(baseline) 분석 결과

파일럿 공장 제조된 토스팅된 ECM 및 기존의 캐놀라박의 영양소 조성. 여러 ECM 계통(44864, 121460, 121466 및 65620)을 상업적 캐놀라박 가공과 유사하되 종자로부터 오일을 용매 추출한 후 탈용매화/토스팅이라는 최종 단계를 제외한 과정을 사용하여 인디애나폴리스에 있는 다우 아그로사이언시즈(Dow AgroSciences) 연구소에서 가공하였다. 상기 공정 및 생성된 샘플을 "인디애나폴리스 백색 박편"으로 지칭한다. 가공 파라미터는 실시예 3에 약술되어 있다. 상기 ECM 인디애나폴리스 백색 박편 샘플을 일리노이 대학 및 미주리 대학에서 시험하였고, 그 결과가 표 2a, 2b 및 2c에 나타나 있다. 캐놀라박 대조군은 토스팅된 상업적으로-제조된 캐놀라박이다. 값은 오일을 포함하는 건조물 기준으로 표시된다.

<표 2a>

일리노이 대학 및 미주리 대학으로부터의 ECM 인디애나폴리스 백색 박편 샘플에 대한 분석 결과는 매니토바 대학으로부터의 전체 종자에 대한 결과와 유사하였다. 샘플 44864 (2010)는 2011년에 재배된 44864를 포함하는 다른 ECM 샘플보다 올리고당이 더 낮고, 단당은 더 높았다. 2010 샘플의 경우, 재배된 식물은 일부 수크로스와 올리고당을 수확 시기 무렵에 단당으로 분해한 것으로 보인다.

인디애나폴리스 백색 박편 프로토콜을 사용했을 때, 기존의 캐놀라박에 비해 ECM 계통에서 보이는 더 높은 단백질, 더 낮은 ADF 및 더 낮은 리그닌 ＆ 폴리페놀은 전체 종자에서 나타나는 결과와 유사하다. 상업적 박의 경우 33％ NDF 값은 통상 범위의 상한에 있다.

<표 2b>

전체 종자의 경우에서와 같이, 표 2b의 결과는 ECM 인디애나폴리스 백색 박편 샘플과 상업적 캐놀라박 모두에 대해 아미노산 조성(조 단백질의 백분율로서)이 유사함을 나타낸다. 이는 ECM 계통에 단백질이 증가함에 따라, 중요한 아미노산이 비례하여 증가함을 나타낸다.

<표 2c>

ECM 인디애나폴리스 백색 박편 샘플의 무기질 함량은 2 경우의 예외: 인 및 나트륨을 제외하고 기존의 캐놀라박과 유사하다. 전체 종자에 대한 매니토바 대학의 결과의 경우에서와 같이, ECM 계통의 인은 기존의 캐놀라박보다 지속적으로 더 높은 것으로 나타난다. 기존의 캐놀라박의 여분의 나트륨은 기존의 캐놀라 가공 중에 첨가된 나트륨에 의한 것임이 의심의 여지가 없다.

실시예 6: 상업적 가공을 모의실험하기 위한 캐나다 새스커툰의 POS 파일럿공장에서의 ECM의 가공

ECM의 동물 사료 평가에서, 영양소 값에 대한 가공의 영향을 고려할 때, 캐놀라박 샘플이 상업적 가공 조건 하에서 제조되어야 함이 결정되었다. 따라서 샘플을 새스커툰에 있는 POS 파일럿 공장에서 가공하였다. 2 종의 가공 조건이 사용되었다: 가공 조건이 영양소 값에 과도한 영향을 미치지 않도록 하기 위해, 탈용매화/토스터에는 보통의 온도(HT) 및 더 낮은 온도(LT). POS에서 사용된 가공 조건은 실시예 2에 약술되어 있다.

<표 3>

파일럿-가공된 박은 전체 종자 및 인디애나폴리스 백색 박편 샘플에 유사한 조성을 나타내었고, ECM 샘플과 기존의 캐놀라박 간의 차이는 표 2a 및 2b에 기재된 분석과 일치한다: 7％ 더 높은 단백질, 5％ 더 낮은 ADF, 4％ 더 낮은 리그닌 ＆ 폴리페놀 및 0.35％ 더 높은 인.

실시예 7: 가공되지 않은 ECM 및 기존의 캐놀라 종자의 완전한 분석

가공되지 않은 캐놀라 종자의 영양소 조성. 2010 및 2011 생산된 ECM 계통 중 5 종의 전체-종자 샘플을 매니토바 대학에서 분석하였다. 이들은 그 시즌 동안 서부 캐나다에서 재배된 현재의 상업적 캐놀라 품종의 평균 품질로 정해져 있는, 2011 생산된 공식 캐나다 곡물 위원회(Canadian Grain Commission, CGC) 복합 종자 샘플과 비교되었다. 영양소 조성 결과는 오일-무함유, 건조물 기초로 표현되어 있고, 표 4a 및 4b에 나타나 있다.

<표 4a>

결과는 ECM과 기존의 캐놀라 사이의 최대 차이점은 더 높은 단백질 함량이라는 것을 나타낸다. ECM은 오일-무함유 건조 물질을 기준으로 단백질 함량이 7.2％ 포인트 더 높고(51.1％ vs 43.9％) 3％ 오일, 88％ 건조 물질 기준(상업적인 캐놀라박에 대한 통상적인 규격 기준)으로 6.1％ 포인트 더 높다(43.5％ vs 37.4％)(표 4a, 4b 참조). 더 높은 단백질은 ECM에서 리그닌 및 폴리페놀이 2％ 더 낮고 ADF 잔여물(ADF - 리그닌/폴리페놀 - 셀룰로스)이 3％ 더 낮게 나타나는 것으로 보인다. ADF 잔여물은 당단백질 및 헤미-셀룰로스 성분의 조합인 것 같다. 섬유 성분은 주로 세포벽 및 외피에서 발견된다. ECM의 인 함량은 기존의 캐놀라보다 거의 30％ 더 높고, 피테이트 및 비-피테이트 형태 사이에서 고르게 분포하는 것으로 보인다. 인은 동물 사료에서 유용한 영양소이고 피테이트-결합 인이 가금류 및 돼지에 의해 잘 소화되지 않을지라도, 동물 사료에서의 피타아제 효소의 통상적인 사용은 동물이 상기 인을 이용할 수 있도록 할 것이다. 표 4b는 전체 종자 샘플에서 아미노산 조성의 유사한 비교를 제공한다.

<표 4b>

표 4b에서의 결과는 아미노산 조성(조 단백질의 백분율)이 ECM과 상업적인 캐놀라박 사이에서 유사하다는 것을 나타낸다. 이는 ECM 계통에서 단백질이 증가하면서, 중요 아미노산도 증가했다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 가금류 TME 및 아미노산 소화율

진정 대사 에너지(TME) 및 진정 가용 아미노산(TAAA) 분석이 오타와의 캐나다 농업부의 이안 시발드 박사(Dr. Ian Sibbald)에 의해, 각각 1976년 및 1981년에 개발되었다. 분석의 직접적이고 비파괴적인 특성으로 인해, 이 분석은 미국을 비롯한 세계 각국에서 가금류 사료 성분 내의 아미노산 및 에너지 가용성을 결정하기 위한 방법으로 선택되었다.

성숙한 단일 콤 백색 레그혼(single comb white leghorn, SCWL) 수평아리가 일리노이 대학 및 조지아 대학에서 수행한 별도의 연구에서 실험 동물로서 선택되어 사용되었다. 조류가 빠른 소화관 정리 시간(gut-clearance time)을 가진다는 것은 잘 알려져 있다. 24 시간 동안 사료를 제거함으로써, 시험 대상의 소화 기관은 이전에 섭취한 음식 잔여물이 없는 상태라고 신뢰성있게 가정된다.

각 조류(일반적으로 처리 당 8 개체)는, 삽관을 통해 모이주머니에 직접적으로 배치된, 시험 사료 35 그램을 정확히 공급받는다. 섬유 함량이 높은 성분은 보통 35 대신 25 그램 공급되고, 공간 규모는 유사하다. 삽관 후, 배설물이 정량적으로 수집되는, 40시간 동안, 조류는 물에 대한 접근이 허용되지만, 추가적인 사료는 제공되지 않는다. 수집 후, 배설물은 일반적으로 80℃에서, 강제 통풍 오븐(forced air oven)에서 건조된다. 이후 그것은 칭량되고 TME 분석에서의 총 에너지(GE)의 결정을 위해, 또는 아미노산 함량을 결정하기 위해 분쇄된다. 성분의 GE 및 아미노산 조성은 유사하게 결정된다. 일단 칭량되면, 배설물 샘플은 일반적으로 모아지고 단일 GE 또는 아미노산 결정을 위해 균질화된다. 조류 당 배설물의 질량은 특정 배설물의 GE 또는 아미노산 조성 보다 훨씬 더 많이 변화한다. 이러한 관찰, 및 GE 및 아미노산 결정의 비용 및 시간 지연은, 모으는 것을 정당화한다.

소화율은 개별적으로 에너지에 대한 또는 각 아미노산에 대한 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 계산된다. GE 및 아미노산의 내생 손실 추정치가 실험적 인위성을 보정하기 위해 사용된다.

실시예 9: 돼지 소화 에너지(DE), 대사 에너지(ME)

DE 및 ME. 48 마리의 성장한 수퇘지(초기 BW: 20 kg)가 일리노이 대학에서 무작위 완전 블록 디자인 연구에 할당될 것이다. 돼지는 먹이 당 8 마리의 복제 돼지로 구성되는 6 개의 먹이 중 하나에 할당될 것이다. 돼지는 피더(feeder) 및 니플 드링커(nipple drinker), 전체 슬레이트 바닥(fully slatted floor), 스크린 바닥, 및 소변 트레이를 갖추게 될 대사 우리에 배치될 것이다. 이는 각 돼지로부터의 소변 및 배설 물질의 총, 그러나 별도의, 수집을 허용할 것이다.

매일 돼지 당 제공되는 사료의 양은 각 복제의 가장 작은 돼지에 대한 유지 에너지(즉, kg^0.75 당 106 kcal ME; NRC, 1998)에 대한 추정된 요구사항의 3배로서 계산되고 2개의 같은 먹이로 나눌 것이다. 문헌[NRC 1998, Nutrient requirements of swine, Tenth Revised Edition. National Academy Press. Washington, DC]. 물은 항상 이용가능할 것이다. 실험은 14일 지속될 것이다. 초기 5일은 먹이에 대한 적응 기간으로 간주되고, 이후 5일 동안 마커 투 마커법(문헌[Adeola, O. 2001, Digestion and balance techniques in pigs, pages 903-916 in Swine Nutrition. 2^nd ed. A. J. Lewis and L. L. Southern, ed. CRC Press, New York, NY. NRC. 1998. Nutrient Requirements of Swine. 10^th rev. ed. Natl. Acad. Press, Washington DC.])을 사용한 표준 절차에 따라 대변 물질 및 소변이 수집될 것이다. 소변 샘플은 염산 50 mL의 보존제를 통해 소변 양동이에 수집될 것이다. 대변 샘플 및 수집된 소변의 10％는 수집 이후 바로 20℃에서 저장될 것이다. 실험의 마지막에, 소변 샘플을 동물 및 먹이 내에서 해동하고 혼합할 것이고, 서브 샘플을 화학 분석을 위해 취할 것이다.

대변 샘플을 분석 전에 강제 통풍 오븐에서 건조시키고 미세하게 분쇄할 것이다. 대변, 소변, 및 사료 샘플은 폭탄 열량측정법(bomb calorimetry)(파 인스트루먼트(Parr Instruments), 미국 일리노이주 몰린)을 사용하여 총 에너지 및 DM에 대해 이중으로 분석될 것이다. 화학 분석에 이어, 총 기관 소화율 값이 앞에서 설명한 절차(문헌[Widmer, M. R., L. M. McGinnis, and H. H. Stein. 2007. Energy, phosphorus, and amino acid digestibility of high-protein distillers dried grains and corn germ fed to growing pigs. J. Anim. Sci. 85:2994-3003. ])를 사용하여 각 먹이의 에너지에 대해 계산될 것이다. 대변에서 및 소변에서 손실된 에너지의 양이 각각 계산될 것이고, 24개 먹이 각각에서 DE 및 ME의 양이(위드머 등, 2007) 계산될 것이다. 옥수수 내의 DE 및 ME는 옥수수 먹이에 대한 DE 및 ME 값을 이 먹이의 옥수수 함유율로 나눔으로써 계산될 것이다. 이어서 이 값은 옥수수-캐놀라박 먹이의 및 옥수수-대두박 먹이의 DE 및 ME에 대한 옥수수의 기여를 계산하기 위해 사용될 것이고, 이어서 캐놀라박의 각 공급원의 및 대두박 샘플에서의 DE 및 ME가 앞에서 설명한 바와 같은(위드머 등, 2007) 차이에 의해 계산될 것이다.

데이터는 SAS의 프록 혼합 절차(Proc Mixed Procedure)(SAS 인스티튜트 인크.(SAS Institute Inc.), 미국 노쓰캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 분석될 것이다. 각 먹이에 대해 및 각 성분에 대해 얻어진 데이터는 ANOVA를 사용하여 비교될 것이다. 분산의 균질성이 혼합 프록에서의 일변량(UNIVARIATE) 절차를 사용하여 확인될 것이다. 먹이 또는 성분은 고정 효과일 것이고 돼지 및 복제는 무작위 효과일 것이다. 최소 자승 평균이 LSD 테스트를 사용해 계산될 것이고, 평균이 프록 혼합에서 pdiff 문(pdiff statement)을 사용하여 분리될 것이다. 돼지는 모든 계산에 대한 실험 유닛일 것이고, 평균 사이의 유의성을 평가하기 위해 0.05의 알파 레벨을 사용할 것이다.

실시예 10: 돼지 아미노산 소화율(AID ＆ SID)

돼지 AID 및 SID를 일리노이 대학의 연구에서 분석했다. 12 마리의 성장 수퇘지(초기 BW: 34.0 ± 1.41 kg)의 원위 회장 근처에 T-캐뉼라(T-cannula)를 설치하고 이를 각 스퀘어(square)가 6개의 먹이 및 6개의 기간으로 이루어지는 반복된 6 x 6 라틴 스퀘어 디자인에 할당했다. 돼지는 환경적으로 제어된 방 내의 1.2 x 1.5 m 우리에 개별적으로 수용했다. 우리는 단단한 판자 벽을 가지며, 전체 슬레이트 바닥, 및 피더 및 니플 드링커가 각각의 우리 내에 설치됐다.

6개의 먹이를 제조했다. 5개의 먹이는 옥수수전분, 설탕, 및 SBM 또는 캐놀라박에 기초했고, SBM 또는 캐놀라박은 이 먹이에서 유일한 AA의 공급원였다. 마지막 먹이는 CP 및 AA의 기초 회장 내생 손실을 추정하기 위해 사용된 N-무함유 먹이였다. 비타민 및 미네랄은 성장 돼지에 대한 현재 요구사항 추정치(NRC, 1998)를 만족하거나 초과하도록 모든 먹이에 포함되었다. 모든 먹이는 또한 소화되지 않는 마커로서 0.4％ 산화 크롬을 함유했다.

돼지의 무게를 각 기간의 시작 및 끝에서 기록했고, 날마다 공급한 사료의 양 또한 기록했다. 모든 돼지는 일일 유지 에너지 요구사항의 2.5배 수준으로 공급받았고, 물은 실험 동안 내내 이용가능하였다. 각 기간의 초기 5일은 먹이의 적응 기간으로 간주했다. 회장 소화물 샘플을 표준 절차를 사용하여 6 및 7일째에 8시간 동안 수집했다. 플라스틱 백(bag)을 케이블 타이를 사용하여 캐뉼라 배럴(cannula barrel)에 부착했고, 백으로 흐르는 소화물을 수집했다. 백은 소화물로 가득 찰 때마다, 또는 적어도 매 30분마다 제거되었고, 소화물 내의 아미노산의 박테리아 분해를 방지하기 위해 -20℃에서 즉시 동결했다. 일 실험 기간이 완료되면, 동물에게 하룻밤 동안 및 다음날 아침에 먹이를 공급하지 않았고, 새로운 실험 먹이를 제공했다.

실험의 마지막에, 회장 샘플을 해동하여 동물 및 먹이 내에서 모았고, 화학 분석을 위해 서브샘플을 수집했다. 각 먹이의 샘플 및 캐놀라박 및 SBM의 샘플 각각을 또한 수집했다. 소화물 샘플을 동결건조했고 화학 분석 전에 미세하게 분쇄했다. 먹이 및 소화물의 모든 샘플을 DM, 크롬, 조 단백질, 및 AA에 대해 분석했고 캐놀라박 및 SBM을 조 단백질 및 AA에 대해 분석했다.

각 먹이에서 AA의 외관상 회장 소화율(AID)의 값을 식 [1]을 사용하여 계산했다:

AID, (％) = [1 - (AAd/AAf) x (Crf/Crd)] x 100, [1]

여기서 AID는 AA의 외관상 회장 소화율 값이고(％), AAd는 회장 소화물 DM에서의 해당 AA의 농도, AAf는 사료 DM 내에서의 해당 AA의 농도, Crf는 사료 DM 내에서의 크롬 농도이고, Crd는 회장 소화물 DM 내에서의 크롬 농도이다. CP에 대한 AID 또한 이 식을 사용해 계산될 것이다.

각 AA의 원위 회장으로의 기초 내생 흐름을 식 [2]를 사용하여 N-무함유 먹이를 공급한 후 얻어진 흐름에 기초하여 결정했다:

IAA_end = AAd x (Crf/Crd) [2]

여기서 IAA_end는 AA의 기초 내생 손실이다(kg DMI 당 mg). CP의 기초 내성 손실을 같은 식을 사용하여 결정했다.

각 AA의 IAA_end에 대한 AID를 보정함으로써, 표준화된 회장 AA 소화율 값을 식[3]을 사용하여 계산했다:

SID, (％) = AID + [(IAA_end/AA_f) x 100] [3]

여기서 SID는 표준화된 회장 소화율 값(％)이다.

데이터를 SAS의 프록 GLM 절차(SAS 인스티튜트. 인크., 미국 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 분석했다. 캐놀라박 또는 SBM을 함유하는 5개의 먹이를 ANOVA를 사용하여 캐놀라박 공급원, 돼지, 및 기간을 주 효과로 하여 비교했다. LSD 시험을 평균을 구분하기 위해 사용했다. 평균 사이의 유의성을 평가하기 위해 0.05의 알파 수준을 사용했다. 개별적인 돼지는 모든 분석에 대한 실험 유닛이다.

실시예 11: 낙농 AA 분해성

ECM의 아미노산 분해성을, 젖소와 같은, 반추위에 캐뉼라가 삽입된 동물의 ECM박의 샘플의 현장(in-situ) 배양에 의해 평가하여 수용성 및 분해가능 단백질의 함량을 추정하고 분해 부분(fraction)의 분해속도(Kd)를 결정할 것이다.

소는 28.1％ 옥수수 사일리지, 13.0％ 알팔파 사일리지, 7.4％ 알팔파 건초, 20.4％ 분쇄된 옥수수, 14.8％ 젖은 맥주박, 5.6％ 전지면실, 3.7％ 대두 껍질, 및 7.0％ 보충제(단백질, 미네랄, 비타민)를 함유하는 총 혼합 사료(TMR)로서 혼합된 먹이를 공급받을 것이다. 대략 6 g의 대두박(SBM), 기존의 캐놀라박(CM), 또는 향상된 캐놀라박(ECM)의 건조물(DM)을 함유하는 표준 폴리에스테르 현장 백(R510, 5 cm x 10 cm, 50-마이크론 공극 크기)은 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48, 및 64 시간 동안 반추위에서 배양될 것이다. 복제 백이 각 시점에서 제거되고 유출물이 깨끗해질 때까지 수돗물로 세척될 것이다. 백은 3일 동안 55℃에서 건조될 것이고, 이어서 잔여물이 제거되고 칭량되어 건조물(DM) 소실을 결정할 것이다. 잔여물을 레코(Leco)의 연소 방법을 사용하여 N 함량에 대해 분석할 것이다. 0-시간 샘플은 반추위에서 배양하지 않을 것이지만, 반추위-배양 샘플과 동일한 방식으로 세척되고 처리될 것이다.

0-시간 잔여물 및 반추위 배양 16 시간 후 남아있는 잔여물의 샘플을 근접 성분(DM, 조 지방, 조 섬유, 및 회분) 및 아미노산(AA) 조성(트립토판 제외)에 대해 분석할 것이다. 젖소의 영양소 요구사항에 대한 국립 연구 위원회(2001) 지침에서 사용된 것처럼, 이러한 파라미터는 반추위에서 분해가능한 단백질(RDP) 및 반추위에서 분해 불가능한 단백질(RUP)의 추정치를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

각 시점에서 남은 원래의 샘플 N의 백분율을 계산할 수 있고, 암소의 각 시점에 대한 복제 값을 평균내었다. 3마리 암소로부터의 값은 오스코프(Ørskov) 및 맥도날드(1979)에 의해 설명된 비선형 방정식에 맞춰질 것이다. 이 접근에서, 반추위 CP 소실은 식, CP 소실 = A + B × (1 - e^{-Kd × t})(여기서 A는 수용성 CP 부분(CP의％), B는 잠재적으로 분해가능한 CP 부분(CP의％), Kd는 분해속도 상수(h^-1)이고, t는 반추위 배양 시간(h)이다)에 의해 정의된 1차 반응속도를 따르는 것으로 가정된다. C 부분(반추위에서 분해가능하지 않음)은 A 부분 빼기 B 부분으로서 계산된다. 식은 마쿼트(Marquardt) 계산법으로, SAS의 PROC NLIN(버전 9.2; SAS 인스티튜트 인크., 미국 노쓰캐롤라이나주 캐리)을 사용하여 맞춰질 것이다.

RDP 및 RUP 값을 계산하기 위한 식(CP의 백분율로)은 RDP = A + B[Kd/(Kd + Kp)], 및 RUP = B[Kp/(Kd + Kp)] + C이고, 여기서 Kp는 반추위으로부터의 통과 속도이다. 통과 속도는 이러한 데이터로부터 직접 계산할 수 없기 때문에(기질이 반추위 내에 함유되어 하부 기관으로 통과하는 것을 방지하는 경우), Kp에 대한 속도를 가정해야 한다. 본 연구에서, 0.07의 값이 Kp에 대해 사용될 것인데, 이는 통상적인 수유 먹이를 소비하는 고생산 낙농 암소에 대한 NRC의 식(2001)에 따라 계산된 값 과 유사하다. 이 프로젝트의 목표는 동일한 조건 하에서 반추위 분해성 추정치 및 단백질 공급원을 비교하는 것이기 때문에, RDP 및 RUP를 결정하기 위한 통과 속도의 선택은 임의적이다.

각 샘플에 대한 최종 식이 NRC(2001) 권장 사항에 따라 0, 2, 4, 8, 16, 24, 및 48 h동안 배양된 샘플을 사용하여 생성될 것이다. 본 연구에서 추가적인 배양 시점에 대한 데이터(즉, 12, 20, 32, 40, 및 64 h)를 사용하여 시스템의 반응속도를 확인하고 수정된 캐놀라박이 NRC(2001) 규격에서의 가정에 부합하는 것을 보장할 수 있다.

실시예 12: 일리노이, 미주리 및 매니토바대에서의 분석 결과에 기초한 실제 TME와 예상 TME의 비교를 포함하는 가금류 TME 및 TAAA

ECM 샘플에서의 가금류 진정 대사 에너지(TME) 평가를 일리노이 대학 및 조지아 대학 모두에서 수행했다. 프로토콜은 실시예 8에 설명된다.

<표 5>

POS 제조된 ECM 및 캐놀라박 샘플의 경우, 적절한 비교는 처리 효과를 제거하기 위해, 두 LT박을 비교하는 것이다. 결과는 일리노이 대학 및 조지아 대학 모두의 연구에서 동등했다. 가금류 TME는 기존의 캐놀라박(LT)보다 ECM(LT)에서 유의하게 더 높다 - 일리노이 대학의 연구에서는 9％ 더 높고 조지아 대학의 연구에서는 14％ 더 높다. 이러한 결과는 아래의 예측 식 결과를 확인한다(표 4). ECM 및 기존의 캐놀라박의 백색 박편 샘플을 또한 용매 추출 단계 직후 및 DT 단계 전 POS에서 취했다. 이러한 WF박에 대한 가금류 TME는 조지아 대학의 별도 연구에서 비교되었고, LT 샘플과 마찬가지로, ECM WF는 기존의 캐놀라박 WF보다 유의하게 더 높은 TME를 가졌다(표 4).

4 종류의 ECM을 실시예 3에 설명된 백색 박편 공정을 사용하여 인디애나폴리스의 다우 아그로사이언시즈 실험실에서 독립적으로 처리했다. 이어서 이러한 샘플에 대해 두대에서 가금류 TME 분석을 실시했다. 121460 계통이 121466 또는 65620 계통보다 더 낮은 TME를 가지는 것으로 나타난 것 이외에는, 시험한 ECM 계통들 사이에 TME에서의 유의한 차이는 없었다.

이러한 연구로부터 관찰된 TME 값은 다음의 예측된 대사 에너지 함량과 일치했다. 문헌[The National Research Council Nutrient Requirements of Poultry (NRC, 1984, Nutrient requirements of poultry. Ninth Revised Edition. National Academy Press. Washington, DC)]은 캐놀라박(더블제로(doublezero) 평지씨박)에서 ME에 대해 하기의 예측 식을 제시한다:

ME kcal/kg = (32.76 x CP％) + (64.96 x EE％) + (13.24 x NFE％)

계산에 의해 7％ 더 높은 CP는 7％ 더 낮은 NFE에 의해 상쇄되어야 하고, 그래서 CP에 대한 순 계수는 32.76 - 13.24 = 19.52이어야 한다. 이는 캐놀라박에서보다 ECM에서 137 kcal/kg 더 많은 ME를 초래한다(7％ x 19.52 = 137). 이 식의 문제는 NFE가 설탕 및 전분의 에너지 값에 대한 양호한 추정치가 아니라는 것이다.

다른 식은 가금류 ME(성체)에 대한 EEC 예측 식이다(문헌[Fisher, C and J.M. McNab. 1987. Techniques for determining the ME content of poultry feeds. In: Haresign and D.J.A. Cole (Eds), Recent Advances in Animal Nutrition - 1987. Butterworths, London. P. 3-17]):

ME, kcal/kg = (81.97 x EE％) + (37.05 x CP％) + (39.87 x 전분％) + (31.08 x 당류％)

EEC 식은, 단백질, 지방, 전분, 유리당과 같은, 캐놀라박에서의 소화가능한 영양소를 중히 여기는 "양의 기여" 식이다. ECM과 캐놀라박 사이의 유일한 분석적 차이점은 단백질이기 때문에, 계수 37.05를 사용하여 여분의 에너지를 계산할 수 있다:

37.05 x 7％ = 259 kcal/kg. EEC 식은 완전한 사료를 위해 설계되고, 이는 일반적으로 캐놀라박보다 더 높은 소화율을 가진다. 따라서, 37.05 계수는 너무 높다.

다른 접근은 단백질의 에너지 값에 대해 제1 원칙을 사용하는 것이다. 대략적인 추정치는 단백질의 그램당 4 칼로리 총 에너지 x 80％ 단백질 소화율 x 질소 배설에 대한 5％ 손실 = 그램당 대략 75％의 총 칼로리(그램당 3 칼로리의 대사 에너지 또는 30 x 단백질％)이다. 이는 ECM에서 30 x 7％ = 210 kcal/kg 여분 ME의 대사 에너지를 생산한다.

요약하자면, ECM박은 기존의 캐놀라박보다 140 내지 260 kcal/kg 더 많은 가금류 ME를 가질 것으로 예상된다. 140 kcal/kg 값은 많이 과소평가된 것 같고 260 kcal/kg는 높은 편일 수 있다. 200 내지 220 kcal/kg 더 많은 가금류 ME의 증가가 그럴 듯 하다. "있는 그대로"의 기준(표 1)에서 이를 표현하면, 상업적인 ECM은 기존의 캐놀라박의 2000 kcal/kg에 대해 2200 kcal/kg의 가금류 ME를 가질 것이다. 이는 에너지가 10％ 증가한 것이다.

가금류 진정 아미노산 소화율(TAAA) 또한 일리노이 대학 및 조지아 대학 모두에서 측정했다. 이 경우에서, 구운 캐놀라박보다 훨씬 더 높은 백색 박편의 아미노산 소화율은 상업적으로 적절하지 않은 것으로 간주되었기 때문에 POS-제조된 박 샘플만 분석했다(표 6).

<표 6>

여러 캐놀라박 샘플들 사이에서 가금류 진정 아미노산 가용성의 통계적으로 유의한 차이는 없었다(표 6).

실시예 13: 돼지 아미노산 소화율(AID 및 SID) 및 예상 NE

돼지 회장 아미노산 소화율 연구를 일리노이 대학에서 수행했다. POS 파일럿 공장에서 제조된 박을 비교로서 사용했다.

<표 7>

ECM과 캐놀라박 샘플 사이의 단백질 및 아미노산 소화율에서 일부 통계적으로 유의한 차이가 나타났다. ECM은 캐놀라박보다 높은 조 단백질 AID를 가졌지만 단백질 SID에서의 차이는 유의하지 않았다. AID 및 SID 모두에서, 라이신은 동일한 열처리를 겪었던 기존의 캐놀라박에서보다 ECM에서 더 소화되기 쉬웠다(표 7).

돼지의 경우, 돼지에서의 DE, ME, 및 NE를 예측하기 위해 일반적으로 수용된 식은 에바피그(EvaPig)(2008, 버전 1.0. INRA, AFZ, 아지노모토 유로리신) 및 돼지의 NRC 영양 요구사항(문헌[NRC, 1998, Nutrient requirements of swine; Tenth Revised Edition; National Academy Press. Washington, DC])에 설명된 바와 같은 노블렛(Noblet) 식이다:

식 1-4. DE, kcal/kg = 4151 - (122 x 회분％) + (23 x CP％) + (38 x EE％) - (64 x CF％)

식 1-14. NE, kcal/kg = 2790 + (41.22 x EE％) + (8.1 x 전분％) - (66.5 x 회분％) - (47.2 x ADF％)

노블렛 식은 양 및 음의 기여 요인 양자의 잡종이다: 회분, CF 및 ADF가 음의 계수를 가지는 반면, 지방, 단백질 및 전분은 양의 계수를 가진다. 단백질은 순 에너지(NE)에 대한 식에 사용되지 않지만, ADF의 차이에 의해 ECM과 캐놀라박 사이의 차이를 얻을 수 있다. 전분 및 회분이 ECM 및 캐놀라박에서 동일하기 때문에, 그 주요 차이점은 ADF이다. 5％ 포인트 더 낮은 ADF가 ECM에서 47.2 x 5％ = 236 kcal/kg 더 많은 NE를 초래한다. 이 예측 수치는 가금류 ME 수치와 유사하고, 또 "있는 그대로"의 기준(표 1)에서의 ECM의 200 kcal/kg의 돼지 순 에너지의 증가와 비슷하다. 이는 에너지가 대략 12％ 증가하는 것을 초래해야 한다.

실시예 14: 추가 ECM 잡종

새로운 캐놀라잡종 CL166102H 또한 향상된 박(ECM) 특성을 나타냈다. 2011 소 플롯 시험(small plot trial)으로부터 수확한, 이 잡종의 종자에서 측정한 성능 및 품질 특성은 오일, 박 단백질, ADF, 총 글루코시놀레이트(Tgluc)를 포함한다(표 8 참조).

표 8에서의 결과는 이 새로운 DAS ECM 계통이 박 속성에 관련하여 상업적인 품종보다 우수하다는 것을 명확하게 나타낸다.

<표 8>

ATCC PTA-12570 20120221

Claims (8)

1. 캐놀라 식물이며,
   45％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 단백질 함량,
   18% 이하의 오일-무함유 건조 물질의 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 함량,
   5.2％ 이하의 오일-무함유 건조 물질의 리그닌 및 폴리페놀의 합쳐진 함량, 및
   1.3％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 인 함량
   을 포함하는 캐놀라박, 및
   68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 포함하는 종자 오일 지방산 함량
   의 종자 특성을 포함하고;
   여기서,
   PTA-11696, PTA-11697, PTA-11698, PTA-11699 및 PTA-12570으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ATCC 기탁 번호로 입수가능한 어두운 캐놀라 종자로부터 성장한 제1 어두운 종자로부터의 캐놀라 식물(dark-seeded canola plant)을 제2 캐놀라 식물과 교배하는 단계,
   상기 종자 특성을 포함하는 F₁ 자손 잡종 캐놀라 식물을 선택하는 단계,
   그럼으로써 상기 캐놀라 식물을 생산하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 잡종 캐놀라 식물이 생산되는 것인,
   캐놀라 식물.
2. 제1항에 있어서,
   제1 어두운 종자로부터의 캐놀라 식물이 fad2 유전자 내의 불활성화 돌연변이 및 fad3 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 포함하고,
   상기 캐놀라 식물이, 상기 종자 특성을 포함하는 F₁ 자손 잡종 캐놀라 식물을 선택하는 단계가
   fad2 유전자 내의 불활성화 돌연변이 및 fad3 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 포함하는 F₁ 자손 잡종 캐놀라 식물을 선택하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인,
   캐놀라 식물.
3. 캐놀라 식물이며,
   45％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 단백질 함량,
   18% 이하의 오일-무함유 건조 물질의 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 함량,
   5.2％ 이하의 오일-무함유 건조 물질의 리그닌 및 폴리페놀의 합쳐진 함량, 및
   1.3％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 인 함량
   을 포함하는 캐놀라박, 및
   68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 포함하는 종자 오일
   의 종자 특성을 포함하고;
   여기서 캐놀라 식물이,
   제1항의 캐놀라 식물을 자가수분하여 F₂ 캐놀라 식물을 생산하는 단계,
   그럼으로써 상기 캐놀라 식물을 생산하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인,
   캐놀라 식물.
4. 캐놀라 식물이며,
   45％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 단백질 함량,
   18% 이하의 오일-무함유 건조 물질의 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 함량,
   5.2％ 이하의 오일-무함유 건조 물질의 리그닌 및 폴리페놀의 합쳐진 함량, 및
   1.3％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 인 함량
   을 포함하는 캐놀라박, 및
   68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 포함하는 종자 오일
   의 종자 특성을 포함하고;
   여기서 캐놀라 식물이,
   (1) 제1항의 캐놀라 식물을 자가수분하여 F₂ 캐놀라 식물을 생산하는 단계,
   (2) F₂ 캐놀라 식물을 반복친 식물로서의 제2 캐놀라 식물과 역교배하여 자손 캐놀라 식물을 생산하고, 상기 종자 특성을 포함하는 자손 캐놀라 식물을 선택하는 단계, 및
   (3) 선택된 자손 캐놀라 식물을 반복친 식물로서의 제2 캐놀라 식물과 역교배하여 다음 세대 자손 캐놀라 식물을 생산하고, 상기 종자 특성을 포함하는 다음 세대 자손 캐놀라 식물을 선택하는 단계, 및
   (4) 상기 종자 특성 및 반복친 식물의 원하는 형태학적 및 생리학적 특성의 본질적으로 전부를 포함하는 다음 세대 자손 캐놀라 식물이 생산될 때까지 단계 (3)을 반복하는 단계,
   그럼으로써 상기 캐놀라 식물을 생산하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인,
   캐놀라 식물.
5. 제4항에 있어서,
   제1 어두운 종자로부터의 캐놀라 식물이 fad2 유전자 내의 불활성화 돌연변이 및 fad3 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 포함하고,
   상기 캐놀라 식물이, 상기 종자 특성을 포함하는 다음 세대 자손 캐놀라 식물을 선택하는 단계가
   fad2 유전자 내의 불활성화 돌연변이 및 fad3 유전자 내의 불활성화 돌연변이를 포함하는 다음 세대 자손 캐놀라 식물을 선택하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인,
   캐놀라 식물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 캐놀라 식물이 황색 종자로부터의 캐놀라 식물(yellow-seeded canola plant)인 캐놀라 식물.
7. 45％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 단백질 함량,
   18% 이하의 오일-무함유 건조 물질의 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 함량,
   5.2％ 이하의 오일-무함유 건조 물질의 리그닌 및 폴리페놀의 합쳐진 함량, 및
   1.3％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 인 함량
   을 포함하는 캐놀라박, 및
   68％ 이상의 올레산 (C18:1) 및 3％ 미만의 리놀렌산 (C18:3)을 포함하는 종자 오일
   의 종자 특성을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 캐놀라 식물의 종자.
8. 45％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 단백질 함량,
   18% 이하의 오일-무함유 건조 물질의 산성 세제 불용성 섬유 (ADF) 함량,
   5.2％ 이하의 오일-무함유 건조 물질의 리그닌 및 폴리페놀의 합쳐진 함량, 및
   1.3％ 이상의 오일-무함유 건조 물질의 인 함량
   을 포함하는, 제7항의 캐놀라 종자로부터 생산된 캐놀라박.

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